PT1597282E - Moléculas de anticorpos com especificidade para a il-1beta humana - Google Patents

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Description

1
DESCRIÇÃO
"MOLÉCULAS DE ANTICORPOS COM ESPECIFICIDADE PARA A IL-1BETA HUMANA" A presente invenção refere-se a uma molécula de anticorpo com especificidade para determinantes antigénicos da IL-Ιβ. A presente invenção também se refere às utilizações terapêuticas da molécula de anticorpo e a métodos para a produção da molécula de anticorpo. A citoquina pró-inflamatória interleuquina-ΐβ (IL-Ιβ) é um membro da familia de genes IL-1, que também inclui IL-Ια e o antagonista do recetor da IL-1 (IL-1RA) (revisto por Dinarello, 1996, Blood, 8_7, 6, 2095-2147). A IL-Ιβ está principalmente envolvida em inflamação e tem efeitos diretos em células endoteliais e macrófagos, bem como em células T e B. Estimula células do estroma a produzirem IL-6, bem como alguns fatores estimuladores de colónias, e também induz a produção de TNFa. A IL-Ιβ está implicada em muitos estados patológicos que estão associados a inflamação. Estes incluem infeções (virais, bacterianas, fúngicas e parasitárias), choque endotóxico, artrite, artrite reumatoide, doença inflamatória pélvica, esclerose múltipla, asma, osteoartrite, psoriase, Doença de Alzheimer, doença de Crohn, doença de Peyronies, doença cardíaca (como aterosclerose), cancro do cólon, doença celíaca, doença da vesícula biliar, doença Pilonidal, peritonite, meningoencefalite, outras perturbações autoimunes, pancreatite, traumatismo (cirurgia), doença enxerto-versus-hospedeiro e rejeição de transplante. 2 A IL-Ιβ também está implicada em cancro, osteoporose e sinalização de dor. 0 envolvimento da IL-Ιβ em inflamação, dor e outros estados patológicos sugere que a IL-Ιβ é um bom alvo para fármacos e outras moléculas destinados à profilaxia e/ou tratamento destes estados. A forma madura de 17 kDa da IL-Ιβ exerce os seus efeitos biológicos por ligação ao recetor da IL-1 IL-1R. Existem dois tipos de IL-1R: o recetor do tipo I IL-1RI e o recetor do tipo II IL-1RII. A ligação da IL-Ιβ ao IL-1RI conduz a recrutamento da proteína acessória do recetor e sinalização. Por outro lado, o IL-1RII foi denominado de recetor "chamariz", pois a ligação da IL-Ιβ não procede à transdução de um sinal. Podem ser esperados pelo menos três tipos de anticorpos que se ligam à IL-Ιβ: (i) anticorpos que se ligam à IL-Ιβ mas que não neutralizam a atividade biológica do IL-1RI (um anticorpo não neutralizador); (ii) anticorpos que se ligam à IL-Ιβ e que neutralizam a atividade biológica do IL-1RI por bloqueio da ligação ao IL-1RI, e (iii) anticorpos que se ligam à IL-Ιβ e que neutralizam a atividade biológica do IL-1RI mas que não bloqueiam a ligação ao IL-1RI, como os anticorpos descritos em US 2003/0026806.
Anticorpos anti-IL-Ιβ foram identificados e propostos para utilização no tratamento de doenças e perturbações mediadas pela IL-Ιβ; ver, por exemplo, WO 95/01997. 3
Identificámos agora um anticorpo melhorado para a IL-Ιβ que é particularmente eficaz in vivo, por exemplo, nos modelos de inflamação in vivo descritos aqui. 0 anticorpo é um anticorpo neutralizador como definido na alternativa (ii), acima.
Resumo da invenção
Num primeiro aspeto, a presente invenção proporciona um anticorpo neutralizador com especificidade para a IL-Ιβ humana, compreendendo uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma CDR (região determinante de complementaridade) com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 5 para CDR-H1, uma CDR com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 6 para CDR-H2 e uma CDR com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 7 para CDR-H3, e uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende uma CDR (região determinante de complementaridade) com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 8 para CDR-L1, uma CDR com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 para CDR-L2 e uma CDR com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 10 para CDR-L3.
Os resíduos de domínios variáveis de anticorpos são convencionalmente numerados de acordo com um sistema concebido por Kabat et al. Este sistema está apresentado em Kabat et al. , 1987, em "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services, NIH, E.U.A. (daqui em diante "Kabat et al. (supra)"). Este sistema de numeração é utilizado na presente especificação, exceto quando indicado em contrário. 4
As designações de resíduos de Kabat nem sempre correspondem diretamente à numeração linear dos resíduos de aminoácidos. A sequência linear real de aminoácidos pode conter menos aminoácidos ou aminoácidos adicionais do que na numeração estrita de Kabat, correspondendo a um encurtamento de um componente estrutural ou inserção num componente estrutural, seja de arcabouço ou CDR, da estrutura básica do domínio variável. A numeração correta de resíduos de Kabat pode ser determinada para um dado anticorpo por alinhamento de resíduos de homologia na sequência do anticorpo com uma sequência numerada de Kabat "padrão".
As CDRs do domínio variável da cadeia pesada estão localizadas nos resíduos 31-35 (CDR-H1), resíduos 50-65 (CDR-H2) e resíduos 95-102 (CDR-H3) de acordo com o sistema de numeração de Kabat. No entanto, de acordo com Chothia (Chothia, C. e Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)), o equivalente em alça à CDR-H1 estende-se desde o resíduo 26 até ao resíduo 32. Assim, 'CDR-H1', como usado aqui, compreende os resíduos 26 até 35, como descrito por uma combinação do sistema de numeração de Kabat e da definição topológica de alças de Chothia.
As CDRs do domínio variável da cadeia leve estão localizadas nos resíduos 24-34 (CDR-L1), resíduos 50-56 (CDR-L2) e resíduos 89-97 (CDR-L3), de acordo com o sistema de numeração de Kabat. Como usado aqui, o termo "anticorpo neutralizador" descreve um anticorpo que é capaz de neutralizar a atividade de sinalização biológica da IL-Ιβ, em particular por bloqueio da ligação da IL-Ιβ ao IL-1RI.
Ainda mais preferivelmente, o anticorpo do primeiro aspeto da presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o 5 domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 3.
Ainda mais preferivelmente, o anticorpo do primeiro aspeto da presente invenção compreende uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 4. 0 anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 5 para CDR-H1, a sequência apresentada na SEQ ID NO: 6 para CDR-H2 e a sequência apresentada na SEQ ID NO: 7 para CDR-H3, e uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 8 para CDR-L1, a sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 para CDR-L2 e a sequência apresentada na SEQ ID NO: 10 para CDR-L3.
Numa forma de realização muito preferida da invenção, o anticorpo compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 3, e uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 4.
Noutro aspeto da presente invenção é proporcionado um anticorpo de acordo com o primeiro aspeto da invenção, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal.
Numa forma de realização preferida, o anticorpo monoclonal compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 3, e uma cadeia leve, em que o domínio variável da 6 cadeia leve compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 4 .
Numa forma de realização alternativamente preferida, o anticorpo monoclonal é um anticorpo monoclonal murino, em que o anticorpo monoclonal compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 3, e em que o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 4. Este anticorpo monoclonal murino é referido aqui como "IC8" ou como anticorpo "dador" ou como "anticorpo monoclonal murino". As sequências completas de nucleótidos e aminoácidos dos domínios variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo monoclonal de ratinho IC8 estão mostradas na Figura 1 e são apresentadas nas SEQ ID NOs: 1 até 4. As CDRs apresentadas nas SEQ ID NOs: 5 até 10 são derivadas do anticorpo monoclonal murino IC8 .
Noutro aspeto da invenção é proporcionada uma molécula de anticorpo com CDRs enxertadas, em que uma ou mais das CDRs foram obtidas do anticorpo monoclonal murino IC8. Como usado aqui, o termo "molécula de anticorpo com CDRs enxertadas" refere-se a uma molécula de anticorpo em que a cadeia pesada e/ou leve contém uma ou mais CDRs (incluindo, se desejado, uma ou mais CDRs modificadas) de um anticorpo dador (por exemplo, um anticorpo monoclonal murino) enxertadas num arcabouço da região variável da cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo aceitador (por exemplo, um anticorpo humano). Quanto a uma revisão ver Vaughan et al., Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998. 7
Quando as CDRs forem enxertadas, pode utilizar-se qualquer sequência de arcabouço apropriada de região variável aceitadora relativamente à classe/tipo do anticorpo dador de onde são derivadas as CDRs, incluindo regiões de arcabouço de ratinho, primata e humano. Preferivelmente, o anticorpo com CDRs enxertadas da presente invenção tem um domínio variável compreendendo regiões de arcabouço aceitadoras humanas, bem como uma ou mais das CDRs derivadas do anticorpo dador, como referido acima. Assim, é proporcionado um anticorpo neutralizador com CDRs enxertadas em que o domínio variável compreende regiões de arcabouço aceitadoras humanas e CDRs dadoras não humanas.
Exemplos de arcabouços humanos que podem ser utilizados na presente invenção são KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY e POM ('Kabat et al. , supra). Por exemplo, KOL e NEWM podem ser utilizados para a cadeia pesada, REI pode ser utilizado para a cadeia leve e EU, LAY e POM podem ser utilizados para a cadeia pesada e para a cadeia leve. Alternativamente podem ser utilizadas sequências da linha germinativa humana.
Num anticorpo com CDRs enxertadas da presente invenção, não é estritamente necessário que as cadeias aceitadoras pesada e leve sejam derivadas do mesmo anticorpo e, se desejado, podem compreender cadeias compostas possuindo regiões de arcabouço derivadas de cadeias diferentes. A região de arcabouço preferida para a cadeia pesada do anticorpo com CDRs enxertadas da presente invenção é derivada da sequência VH3 do subgrupo humano 3-11 (DP-35) apresentada na Figura 3 (SEQ ID NO: 12) em conjunto com JH4. Em conformidade, é proporcionado um anticorpo 8 neutralizador com CDRs enxertadas compreendendo pelo menos uma CDR dadora não humana em que a região de arcabouço da cadeia pesada é derivada da sequência do subgrupo humano 3-11 (DP-35) em conjunto com JH4. A sequência da JH4 humana é a seguinte: (VFDYJWSQGíTLVTVSSíSêQIDN0:74}, o motivo YFDY faz parte da CDR-H3 e não faz parte do arcabouço 4 (Ravetch, JV. et ai., 1981, Cell, 21_, 583-591). A sequência dadora é a sequência VH do IC8 (SEQ ID NO: 11) apresentada na Figura 3a. A região de arcabouço preferida para a cadeia leve do anticorpo com CDRs enxertadas da presente invenção é derivada da sequência VK1 do subgrupo da linha germinativa humana 012 (DPK9) apresentada na Figura 3 (SEQ ID NO: 17) em conjunto com JK1. Em conformidade, é proporcionado um anticorpo neutralizador com CDRs enxertadas compreendendo pelo menos uma CDR dadora não humana em que a região de arcabouço da cadeia leve é derivada da sequência do subgrupo humano 012 (DPK9) em conjunto com JK1. A sequência JK1 é a seguinte: (wnFSQCnxvEíKíseg ío no;7S), o motivo WT faz parte da CDR-L3 e não faz parte do arcabouço 4 (Hieter, PA., et ai., 1982, J. Biol. Chem., 257, 1516-1522) . A sequência dadora é a sequência VL do IC8 (SEQ ID NO: 16) apresentada na Figura 3b.
Além disso, num anticorpo com CDRs enxertadas da presente invenção, não é necessário que as regiões de arcabouço tenham exatamente a mesma sequência das do anticorpo aceitador. Por exemplo, resíduos invulgares podem ser alterados para resíduos de ocorrência mais frequente para essa classe ou tipo de cadeia aceitadora. Alternativamente, resíduos selecionados nas regiões de arcabouço aceitadoras podem ser alterados de modo a corresponderem ao resíduo 9 presente na mesma posição do anticorpo dador (ver Reichmann et al. Nature, 332, 323-324, 1988). Essas alterações devem ser mantidas no mínimo necessário para recuperar a afinidade do anticorpo dador. Um protocolo para selecionar resíduos das regiões de arcabouço aceitadoras que poderá ser necessário alterar está apresentado em WO 91/09967.
De preferência, numa molécula de anticorpo com CDRs enxertadas da presente invenção, se a cadeia pesada aceitadora tiver a sequência DP-35+JH4 humana, então as regiões de arcabouço aceitadoras da cadeia pesada compreendem, para além de uma ou mais CDRs dadoras, um resíduo dador na posição 44 (de acordo com Kabat et ai. (supra)) . 0 efeito surpreendente, na afinidade, da alteração do resíduo 44 para um resíduo dador não era esperado. Assim, em qualquer processo de humanização de anticorpos, valerá a pena examinar adicionalmente o efeito de ter o resíduo 44 como resíduo dador ou aceitador. Em conformidade, é proporcionado um anticorpo com CDRs enxertadas em que pelo menos o resíduo na posição 44 do domínio variável da cadeia pesada é um resíduo dador.
Em alternativa ou adicionalmente, se a cadeia pesada aceitadora tiver a sequência DP-35+JH4 humana, então as regiões de arcabouço aceitadoras da cadeia pesada compreendem preferivelmente, para além de uma ou mais CDRs dadoras, um resíduo dador na posição 89 (de acordo com Kabat et al., supra). Em conformidade, é proporcionado um anticorpo com CDRs enxertadas em que pelo menos o resíduo na posição 44 e/ou posição 89 do domínio variável da cadeia pesada é um resíduo dador. 10
De preferência, numa molécula de anticorpo com CDRs enxertadas de acordo com a presente invenção, se a cadeia leve aceitadora tiver a sequência DPK9+JK1 do subgrupo humano, então as regiões de arcabouço aceitadoras da cadeia leve compreendem resíduos dadores nas posições 45, 70 e 85 e podem compreender adicionalmente resíduos dadores nas posições 40 e 48 (de acordo com Kabat et al., supra) . Em conformidade, é proporcionado um anticorpo com CDRs enxertadas em que pelo menos o resíduo na posição 40, 45, 48, 70 e/ou 85 é um resíduo dador. Também é proporcionado um anticorpo com CDRs enxertadas em que os resíduos nas posições 45, 70 e 85 são resíduos dadores.
Resíduos dadores são resíduos do anticorpo dador, isto é, o anticorpo de onde foram originalmente derivadas as CDRs, o qual, no caso da presente invenção, é o anticorpo monoclonal murino IC8 .
Numa forma de realização alternativa da presente invenção, a cadeia pesada compreende preferivelmente a sequência de gHl (SEQ ID NO: 13), gH2 (SEQ ID NO: 14) ou gH3 (SEQ ID NO: 15) . As sequências dos domínios variáveis destas cadeias pesadas enxertadas estão apresentadas na Figura 3 a.
Numa forma de realização alternativa da presente invenção, a cadeia leve compreende preferivelmente a sequência de gLl (SEQ ID NO: 18), gL2 (SEQ ID NO: 19) ou gL3 (SEQ ID NO: 20) . As sequências dos domínios variáveis destas cadeias leves enxertadas estão apresentadas na Figura 3b.
Mais preferivelmente, uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de gHl (SEQ ID NO: 13) , gH2 (SEQ 11 ID NO: 14) ou gH3 (SEQ ID NO: 15) e uma cadeia leve compreendendo a sequência de gLl (SEQ ID NO: 18), gL2 (SEQ ID NO: 19) ou gL3 (SEQ ID NO: 20).
Ainda mais preferivelmente, a cadeia pesada da molécula de anticorpo da presente invenção compreende o domínio variável gH3 (SEQ ID NO: 15) e a cadeia leve da molécula de anticorpo da presente invenção compreende o domínio variável gL3 (SEQ ID NO: 20).
Além disso, é proporcionado um anticorpo de acordo com qualquer um dos aspetos da presente invenção que se liga ao mesmo epítopo do IC8. Em alternativa, é proporcionado um anticorpo neutralizador possuindo especificidade para a IL-1β humana que se liga ao mesmo epítopo de um anticorpo cuja cadeia pesada compreende a sequência gH3 (SEQ ID NO: 15) e cuja cadeia leve compreende a sequência gL3 (SEQ ID NO: 20) . A molécula de anticorpo da presente invenção pode compreender uma molécula de anticorpo completa com cadeias pesada e leve completas, ou um fragmento Fab, Fab', F(ab')2f Fv ou scFv. Alternativamente, pode compreender um monómero ou dímero da cadeia leve ou cadeia pesada ou um anticorpo de cadeia única, por exemplo, um Fv de cadeia única no qual os domínios variáveis das cadeias pesada e leve estão reunidos por um agente de ligação peptídico. De modo semelhante, as regiões variáveis das cadeias pesada e leve podem ser combinadas com outros domínios de anticorpos, consoante o apropriado. A molécula de anticorpo da presente invenção pode estar ligada a uma molécula efetora ou repórter. Por exemplo, 12 pode ter um macrociclo para a quelação de um átomo de metal pesado, ou uma toxina, como ricina, ligada àquela por uma estrutura em ponte covalente.
Preferivelmente, o anticorpo da presente invenção pode ser modificado para permitir a ligação de uma molécula efetora ou repórter. Muito preferivelmente, a molécula de anticorpo da presente invenção é um fragmento Fab modificado, como descrito em baixo.
Alternativamente, podem ser utilizados procedimentos de tecnologia de DNA recombinante para produzir uma molécula de anticorpo na qual o fragmento Fc (domínios CH2, CH3 e conetores) , os domínios CH2 e CH3 ou o domínio CH3 de uma molécula de imunoglobulina completa foi(foram) substituído(s) por, ou foi(foram) ligada(s) àquele por ligação peptídica, uma proteína não imunoglobulina funcional, como uma enzima ou molécula de toxina. Alternativamente, é preferido que a molécula de anticorpo da presente invenção seja um fragmento Fab modificado no qual a modificação consiste na adição, à extremidade do terminal C da sua cadeia pesada, de um ou mais aminoácidos, para permitir a ligação de uma molécula efetora ou repórter. Preferivelmente, os aminoácidos adicionais formam uma região conetora modificada contendo um ou dois resíduos cisteína aos quais pode ser ligada a molécula efetora ou repórter.
Também é proporcionada uma molécula de anticorpo neutralizador de acordo com a presente invenção tendo ligada uma molécula efetora ou repórter. Moléculas efetoras ou repórter incluem uma molécula tal como um agente citotóxico, um radionuclido ou uma fração de fármaco. 13
Outras moléculas que podem ser ligadas incluem uma toxina, como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas ou toxina da difteria, uma proteína, como um fator de necrose tumoral, interferão a, interferão β, fator de crescimento dos nervos, fator de crescimento derivado de plaquetas ou ativador do plasminogénio em tecidos, um agente trombótico ou um agente antiangiogénico, por exemplo, angiostatina ou endostatina, ou um modificador da resposta biológica, como uma linfoquina, interleuquina-1 (IL-1), interleuquina-2 (IL—2), interleuquina-6 (IL-6), fator estimulador de colónias de granulócitos macrófagos (GM-CSF), fator estimulador de colónias de granulócitos (G-CSF) , fator de crescimento dos nervos (NGF) ou outro fator de crescimento.
Um grupo efetor preferido é uma molécula polimérica, que pode ser ligada ao fragmento Fab modificado para aumentar a sua semivida in vivo.
Em geral, a molécula polimérica pode ser um polímero sintético ou de ocorrência natural, por exemplo, um polímero opcionalmente substituído de polialquileno, polialcenileno ou polioxialquileno de cadeia linear ou ramificada ou um polissacárido ramificado ou não ramificado, por exemplo, um homo- ou heteropolissacárido.
Substituintes opcionais particulares que podem estar presentes nos polímeros sintéticos mencionados acima incluem um ou mais grupos hidroxi, metilo ou metoxi.
Exemplos particulares de polímeros sintéticos incluem os polímeros opcionalmente substituídos de cadeia linear ou ramificada poli(etilenoglicol) , poli(propilenoglicol) , poli(álcool vinílico) ou respetivos derivados, 14 especialmente poli(etilenoglicol) opcionalmente substituído, como metoxipoli(etilenoglicol) ou respetivos derivados.
Polímeros particulares de ocorrência natural incluem lactose, amilose, dextrano, glicogénio ou respetivos derivados.
Pretende-se que "derivados", como usado aqui, inclua derivados reativos, por exemplo, grupos reativos seletivos para tiol, como maleimidas e afins. 0 grupo reativo pode ser ligado ao polímero diretamente ou através de um segmento de ligação. Será apreciado que o resíduo de um desses grupos irá fazer parte, nalguns casos, do produto como grupo de ligação entre o fragmento de anticorpo e o polímero. 0 tamanho do polímero pode ser variado como desejado, mas geralmente terá uma gama de pesos moleculares médios desde 500 Da até 50000 Da, preferivelmente desde 5000 até 40000 Da e mais preferivelmente desde 25000 até 40000 Da. O tamanho do polímero pode ser selecionado, em particular, com base na utilização pretendida do produto. Assim, por exemplo, quando o produto se destinar a abandonar a circulação e penetrar em tecido, por exemplo, para utilização no tratamento de um tumor, poderá ser vantajoso utilizar um polímero de baixo peso molecular, por exemplo, com um peso molecular de cerca de 5000 Da. Para aplicações em que o produto permanece na circulação pode ser vantajoso utilizar um polímero de maior peso molecular, por exemplo, com um peso molecular situado no intervalo desde 25000 Da até 40000 Da. 15
Polímeros particularmente preferidos incluem um polímero de polialquileno, como um poli(etilenoglicol) ou, especialmente, um metoxipoli(etilenoglicol) ou respetivo derivado, e especialmente com um peso molecular situado no intervalo desde cerca de 25000 Da até cerca de 40000 Da.
Cada molécula polimérica ligada ao fragmento do anticorpo modificado pode ser ligada de modo covalente ao átomo de enxofre de um resíduo cisteína localizado no fragmento. A ligação covalente será, em geral, uma ligação dissulfureto ou, em particular, uma ligação enxofre-carbono.
Quando desejado, o fragmento de anticorpo pode estar ligado a uma ou mais moléculas efetoras ou repórter. As moléculas efetoras ou repórter podem ser ligadas ao fragmento de anticorpo através de qualquer cadeia lateral de aminoácido disponível ou grupo funcional de aminoácido terminal localizado no fragmento, por exemplo, qualquer grupo amino, imino, hidroxilo ou carboxilo livre.
Um polímero ativado pode ser utilizado como material de partida na preparação de fragmentos de anticorpos modificados com polímero, como descrito acima. O polímero ativado pode ser qualquer polímero contendo um grupo reativo de tiol, como um ácido ou éster a-halocarboxílico, por exemplo, iodoacetamida, uma imida, por exemplo, maleimida, uma vinilsulfona ou um dissulfureto. Esses materiais de partida podem ser obtidos comercialmente (por exemplo, da Nektar, anteriormente Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, E.U.A.) ou podem ser preparados a partir de materiais de partida disponíveis no mercado utilizando procedimentos químicos convencionais. Moléculas de PEG particulares incluem 20K metoxi-PEG-amina (que pode ser 16 obtida da Nektar, anteriormente Shearwater; Rapp Polymere; e SunBio) e M-PEG-SPA (que pode ser obtida da Nektar, anteriormente Shearwater).
No que se refere à ligação de frações de poli (etilenoglicol) (PEG), referem-se "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (editor), Plenum Press, Nova Iorque; "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris e S. Zalipsky (editores), American Chemical Society, Washington DC, e "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam e A. Dent, Grove Publishers, Nova Iorque.
Quando for desejado obter um fragmento de anticorpo ligado a uma molécula efetora ou repórter, a preparação pode ser feita via procedimentos químicos ou de DNA recombinante comuns, nos quais o fragmento de anticorpo é ligado, diretamente ou via um agente de acoplamento, à molécula efetora ou repórter antes ou após reação com o polímero ativado, consoante o apropriado. Procedimentos químicos particulares incluem, por exemplo, os descritos em WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195 e WO 89/01476. Em alternativa, quando a molécula efetora ou repórter for uma proteína ou polipéptido, a ligação pode ser efetuada utilizando procedimentos de DNA recombinante, por exemplo, como descrito em WO 86/01533 e EP0392745.
Preferivelmente, o fragmento Fab modificado da presente invenção é PEGuilado (isto é, tem PEG (poli(etilenoglicol)) ligado àquele de modo covalente) de acordo com o método divulgado em EP-A-0948544. Preferivelmente, a molécula de 17 anticorpo da presente invenção é um fragmento Fab modificado PEGuilado como mostrado na Figura 12. Preferivelmente, o fragmento Fab modificado tem um grupo maleimida ligado de modo covalente a um único grupo tiol numa região conetora modificada. Um resíduo lisina é preferivelmente ligado de modo covalente ao grupo maleimida. A cada um dos grupos amina no resíduo lisina é preferivelmente ligado um polímero metoxipoli (etilenoglicol) com um peso molecular de aproximadamente 20 000 Da. Em consequência, o peso molecular total da molécula efetora completa é aproximadamente 40 000 Da. Em conformidade, é proporcionado um anticorpo neutralizador que tem ligado, a um dos resíduos cisteína na extremidade C-terminal da cadeia pesada, um grupo lisil-maleimida ou lisil-bismaleimida, em que a cada grupo amino do resíduo lisilo está ligado de modo covalente um resíduo metoxipoli(etilenoglicol) com um peso molecular de cerca de 20 000 Da. Por exemplo, o peso molecular pode ser 15 000 -25 000 Da, ou preferivelmente 18 000 - 22 000 Da, e ainda mais preferivelmente 19 000 - 21 000 Da.
Numa forma de realização preferida, a presente invenção proporciona uma molécula de anticorpo neutralizador com especificidade para a IL-Ιβ humana, que é um fragmento Fab modificado possuindo uma cadeia pesada compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 15 e uma cadeia leve compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 20 e possuindo, na extremidade do terminal C da sua cadeia pesada, uma região conetora modificada contendo um resíduo cisteína ao qual pode ser ligada uma molécula efetora ou repórter. 18
Numa forma de realização preferida é proporcionada uma molécula de anticorpo neutralizador com especificidade para a IL-Ιβ humana, que é um fragmento Fab modificado possuindo uma cadeia pesada compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 15 e uma cadeia leve compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 20 e possuindo, na extremidade do terminal C da sua cadeia pesada, uma região conetora modificada contendo um resíduo cisteína ao qual está ligada uma molécula efetora ou repórter.
Mais preferivelmente, é proporcionada uma molécula de anticorpo neutralizador com especificidade para a IL-Ιβ humana, que é um fragmento Fab modificado possuindo uma cadeia pesada compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 15 e uma cadeia leve compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 20 tendo ligado ao resíduo cisteína na extremidade do terminal C da cadeia pesada um grupo lisil-maleimida, em que a cada grupo amino do resíduo lisilo está ligado de modo covalente um resíduo metoxipoli(etilenoglicol) com um peso molecular de cerca de 20 000 Da.
Ainda mais preferivelmente, é proporcionada uma molécula de anticorpo neutralizador em que a sua cadeia pesada compreende ou consiste nos resíduos de aminoácidos números 22 até 251 da sequência apresentada na SEQ ID NO: 71, e em que a sua cadeia leve compreende ou consiste nos resíduos de aminoácidos números 22 até 235 da sequência apresentada na SEQ ID NO: 70. Os resíduos de aminoácidos números 1 até 21 das sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 70 e 71 representam a sequência líder de E. Coli que é muito preferivelmente clivada para dar origem a uma molécula de anticorpo neutralizador da presente invenção. 19
Muito preferivelmente, é proporcionada uma molécula de anticorpo neutralizador em que a sua cadeia pesada compreende ou consiste nos resíduos de aminoácidos números 22 até 251 da sequência apresentada na SEQ ID NO: 71, e em que a sua cadeia leve compreende ou consiste nos resíduos de aminoácidos números 22 até 235 da sequência apresentada na SEQ ID NO: 70 tendo ligado ao resíduo cisteína na extremidade do terminal C da cadeia pesada um grupo lisil-maleimida, em que a cada grupo amino do resíduo lisilo está ligado de modo covalente um resíduo metoxipoli (etilenoglicol) com um peso molecular de cerca de 20 000 Da.
Também é proporcionada uma molécula de anticorpo neutralizador com especificidade para a IL-Ιβ humana, que se liga ao mesmo epítopo de um anticorpo neutralizador que compreende uma cadeia leve compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 20.
Os domínios de regiões constantes da molécula de anticorpo da presente invenção, se estiverem presentes, podem ser selecionados no que se refere à função proposta da molécula de anticorpo, e em particular às funções efetoras que podem ser requeridas. Por exemplo, os domínios de regiões constantes podem ser domínios de IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM humana. Em particular podem ser utilizados domínios de regiões constantes de IgG humana, especialmente dos isotipos IgGl e IgG3 quando a molécula de anticorpo for destinada a utilizações terapêuticas e forem requeridas funções efetoras do anticorpo. Alternativamente, podem ser utilizados os isotipos IgG2 e IgG4 quando a molécula de anticorpo for destinada a finalidades terapêuticas e não 20 forem requeridas funções efetoras do anticorpo, por exemplo, simplesmente para bloquear a atividade da IL-Ιβ. A molécula de anticorpo da presente invenção tem preferivelmente uma afinidade de ligação de pelo menos 4,4 x 10“10 M, mais preferivelmente pelo menos 3,2 x IO-10 M. O presente requerimento também se refere a variantes das moléculas de anticorpo da presente invenção que têm uma afinidade melhorada para a IL-Ιβ. Essas variantes podem ser obtidas por alguns protocolos de maturação da afinidade, incluindo mutações nas CDRs (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), mistura de cadeias (Marks et al.,
Bio/Technology, K), 779-783, 1992), utilização de estirpes de mutação de E. colí (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), mistura de DNA (Patten et al., Curr. Opln.
Biotechnol., _8, 724-733, 1997), expressão em fagos (Thompson et al. , J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) e PCR sexual (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998).
Vaughan et al. (supra) discute estes métodos de maturação da afinidade. A presente invenção também proporciona uma sequência de DNA isolada que codifica a(s) cadeia(s) pesada e/ou leve da molécula de anticorpo da presente invenção. Preferivelmente, a sequência de DNA codifica a cadeia pesada ou a leve da molécula de anticorpo da presente invenção. A sequência de DNA da presente invenção pode compreender DNA sintético, por exemplo, produzido por processamento químico, cDNA, DNA genómico ou qualquer combinação destes. 21
Sequências de DNA que codificam a molécula de anticorpo da presente invenção podem ser obtidas por métodos bem conhecidos dos profissionais. Por exemplo, sequências de DNA que codificam parte ou a totalidade das cadeias pesada e leve do anticorpo podem ser sintetizadas, consoante o desejado, a partir das sequências de DNA determinadas ou com base nas sequências de aminoácidos correspondentes. DNA que codifica sequências de arcabouço aceitadoras está amplamente disponível para os profissionais e pode ser facilmente sintetizado com base nas suas sequências de aminoácidos conhecidas.
Podem ser utilizadas técnicas comuns de biologia molecular para preparar sequências de DNA que codificam a molécula de anticorpo da presente invenção. Sequências de DNA desejadas podem ser sintetizadas, completamente ou em parte, utilizando técnicas de síntese com oligonucleótidos. Técnicas de mutagénese dirigida a sítios e reação em cadeia de polimerase (PCR) podem ser utilizadas consoante o apropriado. A presente invenção também se refere a um vetor de clonagem ou expressão compreendendo uma ou mais sequências de DNA da presente invenção. Em conformidade, é proporcionado um vetor de clonagem ou expressão compreendendo uma ou mais sequências de DNA que codificam um anticorpo da presente invenção. Preferivelmente, o vetor de clonagem ou expressão compreende duas sequências de DNA que codificam a cadeia leve e a cadeia pesada da molécula de anticorpo da presente invenção, respetivamente. De preferência, um vetor de acordo com a presente invenção compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 69. 22 Métodos gerais de construção dos vetores, métodos de transfeção e métodos de cultura são bem conhecidos dos profissionais. A este respeito referem-se "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (editor), Wiley Interscience, Nova Iorque, e o Manual de Maniatis produzido pela Cold Spring Harbor Publishing.
Também é proporcionada uma célula hospedeiro compreendendo um ou mais vetores de clonagem ou expressão compreendendo uma ou mais sequências de DNA que codificam um anticorpo da presente invenção. Qualquer sistema adequado célula hospedeiro/vetor pode ser utilizado para expressão das sequências de DNA que codificam a molécula de anticorpo da presente invenção. Podem ser utilizados sistemas bacterianos, por exemplo, de E. coli, e outros sistemas microbianos, ou também podem ser utilizados sistemas de expressão de células hospedeiro eucarióticos, por exemplo, de mamífero. Células hospedeiro adequadas de mamífero incluem células CHO, de mieloma ou hibridoma. A presente invenção também proporciona um processo para a produção de uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção, que compreende cultivar uma célula hospedeiro contendo um vetor da presente invenção em condições adequadas para conduzir à expressão de proteínas a partir de DNA que codifica a molécula de anticorpo da presente invenção, e isolar a molécula de anticorpo.
Para a preparação de produtos compreendendo cadeias pesada e leve, a linha de células pode ser transfetada com dois vetores, um primeiro vetor codificando um polipéptido de cadeia leve e um segundo vetor codificando um polipéptido de cadeia pesada. Alternativamente, pode ser utilizado um 23 único vetor, em que o vetor inclui sequências que codificam polipéptidos de cadeia leve e cadeia pesada.
Uma vez que os anticorpos da presente invenção são úteis no tratamento e/ou profilaxia de um estado patológico, a presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula de anticorpo da presente invenção em combinação com um ou mais de um excipiente, diluente ou transportador farmaceuticamente aceitável. Em conformidade, é proporcionada a utilização de um anticorpo da invenção para a preparação de um medicamento. A composição será habitualmente fornecida como parte de uma composição farmacêutica esterilizada, que normalmente incluirá um transportador farmaceuticamente aceitável. Uma composição farmacêutica da presente invenção pode compreender adicionalmente um adjuvante farmaceuticamente aceitável. É adicionalmente proporcionado um processo para a preparação de uma composição farmacêutica ou de diagnóstico, que compreende adicionar e misturar a molécula de anticorpo da presente invenção em conjunto com um ou mais de um excipiente, diluente ou transportador farmaceuticamente aceitável. A molécula de anticorpo pode ser o único ingrediente ativo da composição farmacêutica ou de diagnóstico, ou pode ser acompanhada de outros ingredientes ativos, incluindo outros ingredientes de anticorpos, por exemplo, anticorpos anti-células T, anti-IFNY ou anti-LPS, ou ingredientes que não são anticorpos, como xantinas. 24
As composições farmacêuticas compreendem preferivelmente uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo da invenção. 0 termo "quantidade terapeuticamente eficaz", como usado aqui, refere-se a uma quantidade de um agente terapêutico necessária para tratar, melhorar ou prevenir uma doença ou estado alvo, ou para exibir um efeito terapêutico ou preventivo detetável. Para qualquer anticorpo, a quantidade terapeuticamente eficaz pode ser inicialmente estimada em ensaios de cultura de células ou em modelos animais, habitualmente em roedores, coelhos, cães, porcos ou primatas. 0 modelo animal também pode ser utilizado para determinar a gama de concentrações e via de administração apropriadas. Essas informações podem então ser utilizadas para determinar doses e vias de administração úteis em humanos. A quantidade terapeuticamente eficaz precisa para um sujeito humano dependerá da gravidade do estado de doença, do estado geral de saúde do sujeito, da idade, peso e sexo do sujeito, dieta, tempo e frequência da administração, combinação(combinações) de fármacos, sensibilidades a reações e tolerância/resposta à terapia. Esta quantidade pode ser determinada por experimentação de rotina e pertence à avaliação do clínico. Em geral, uma quantidade terapeuticamente eficaz será desde 0,01 mg/kg até 50 mg/kg, preferivelmente 0,1 mg/kg até 20 mg/kg. As composições farmacêuticas podem ser convenientemente apresentadas em formas galénicas unitárias, contendo uma quantidade predeterminada de um agente ativo da invenção por dose.
As composições podem ser administradas individualmente a um paciente, ou podem ser administradas em combinação (por 25 exemplo, simultânea, sequencial ou separada) com outros agentes, fármacos ou hormonas. A dose à qual é administrada a molécula de anticorpo da presente invenção depende da natureza do estado a ser tratado, da extensão da inflamação presente e de se a molécula de anticorpo está a ser utilizada de modo profilático ou para tratar um estado existente. A frequência da dose dependerá da semivida da molécula de anticorpo e da duração do seu efeito. Se a molécula de anticorpo tiver uma semivida pequena (por exemplo, 2 até 10 horas), poderá ser necessário administrar uma ou mais doses por dia. Em alternativa, se a molécula de anticorpo tiver uma semivida longa (por exemplo, 2 até 15 dias) , poderá ser apenas necessário administrar uma dosagem uma vez por dia, uma vez por semana ou uma vez a cada 1 ou 2 meses. O transportador farmaceuticamente aceitável não deve, por si próprio, induzir a produção de anticorpos nocivos para o indivíduo que recebe a composição, e não deve ser tóxico. Transportadores adequados podem ser macromoléculas grandes lentamente metabolizadas, como proteínas, polipéptidos, lipossomas, polissacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos e partículas de vírus inativos.
Podem ser utilizados sais farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, sais de ácidos minerais, como cloridratos, bromidratos, fosfatos e sulfatos, ou sais de ácidos orgânicos, como acetatos, propionatos, malonatos e benzoatos. 26
Transportadores farmaceuticamente aceitáveis em composições terapêuticas podem adicionalmente conter líquidos, tais como água, solução salina, glicerol e etanol. Adicionalmente, podem estar presentes nessas composições substâncias auxiliares, como agentes humedecedores ou emulsionantes ou substâncias de tamponamento do pH. Esses transportadores permitem a formulação das composições farmacêuticas na forma de comprimidos, pílulas, drageias, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas e suspensões, para ingestão pelo paciente.
Formas preferidas para administração incluem formas adequadas para administração parentérica, por exemplo, por injeção ou infusão, por exemplo, por injeção de bolus ou infusão contínua. Quando o produto se destinar a injeção ou infusão, pode tomar a forma de uma suspensão, solução ou emulsão num veículo oleoso ou aquoso, e pode conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, conservantes, estabilizadores e/ou dispersantes. Alternativamente, a molécula de anticorpo pode estar em forma seca, para reconstituição antes da utilização com um líquido esterilizado apropriado.
Depois de formuladas, as composições da invenção podem ser administradas diretamente ao sujeito. Os sujeitos a serem tratados podem ser animais. No entanto, é preferido que as composições sejam adaptadas para administração a sujeitos humanos.
As composições farmacêuticas desta invenção podem ser administradas por qualquer número de vias, incluindo mas não se limitando às vias oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, 27 transdérmica, transcutânea (por exemplo, ver WO 98/20734), subcutânea, intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual, intravaginal ou retal. Também podem ser utilizados hipopulverizadores para administrar as composições farmacêuticas da invenção. Tipicamente, as composições terapêuticas podem ser preparadas na forma de injetáveis, como soluções ou suspensões liquidas. Também podem ser preparadas formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em veículos líquidos antes da injeção. A distribuição direta das composições será geralmente efetuada por injeção, de modo subcutâneo, intraperitoneal, intravenoso ou intramuscular, ou distribuídas no espaço intersticial de um tecido. As composições também podem ser administradas numa lesão. O tratamento por dosagem pode consistir num calendário de dose única ou um calendário de múltiplas doses.
Será apreciado que o ingrediente ativo da composição será uma molécula de anticorpo. Como tal, será suscetível a degradação no trato gastrointestinal. Assim, se a composição se destinar a ser administrada por uma via utilizando o trato gastrointestinal, será necessário que a composição contenha agentes que protejam o anticorpo de degradação, mas que libertem o anticorpo depois de ter sido absorvido a partir do trato gastrointestinal.
Uma discussão extensa de transportadores farmaceuticamente aceitáveis está disponível em "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Publishing Company, N.J. 1991).
Também é considerado que o anticorpo da presente invenção seja administrado utilizando terapia genética. Para fazê- 28 lo, sequências de DNA que codificam as cadeias pesada e leve da molécula de anticorpo, sob o controlo de componentes de DNA apropriados, são introduzidas num paciente, de modo que as cadeias de anticorpo são expressas a partir das sequências de DNA e reunidas in situ. É adicionalmente proporcionada uma molécula de anticorpo para utilização no controlo de inflamação. Preferivelmente, a molécula de anticorpo pode ser utilizada para reduzir o processo inflamatório ou para prevenir o processo inflamatório.
Também é proporcionada a molécula de anticorpo da presente invenção para utilização no tratamento ou profilaxia de uma perturbação patológica que é mediada pela IL-Ιβ, ou que está associada a um nível aumentado de IL-Ιβ. Preferivelmente, o estado patológico é selecionado do grupo que consiste em infeções (virais, bacterianas, fúngicas e parasitárias), choque endotóxico associado a infeção, artrite, artrite reumatoide, doença inflamatória pélvica, Doença de Alzheimer, doença de Crohn, doença de Peyronies, doença celíaca, doença da vesícula biliar, doença Pilonidal, peritonite, meningoencefalite, outras perturbações autoimunes, pancreatite, traumatismo (cirurgia), doença enxerto-versus-hospedeiro, rejeição de transplante, cancro (tumores sólidos, tais como melanomas, hepatoblastomas, sarcomas, carcinomas de células escamosas, cancros de células transitórias, cancros do ovário e malignidades hematológicas, e em particular leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, cancro gástrico e cancro do cólon), doença cardíaca incluindo doenças isquémicas, como enfarte do miocárdio bem como 29 aterosclerose, coagulação intravascular, reabsorção óssea, osteoporose, periodontite e hipocloridia. 0 presente requerimento também proporciona uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção para utilização no tratamento ou profilaxia de dor. 0 presente requerimento também proporciona a utilização de uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção na preparação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de uma perturbação patológica que é mediada pela IL-Ιβ ou que está associada a um nível aumentado de IL-Ιβ. 0 presente requerimento também proporciona a utilização de uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção na preparação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de dor.
Uma molécula de anticorpo do presente requerimento pode ser utilizada em qualquer terapia na qual seja desejado reduzir os efeitos da IL-Ιβ no corpo humano ou animal. A IL-Ιβ pode estar em circulação no corpo ou pode estar presente, num nível indesejavelmente elevado, localizada num sítio particular do corpo, por exemplo, um sítio de inflamação. A molécula de anticorpo da presente invenção é preferivelmente utilizada para o controlo de inflamação. 0 presente requerimento também proporciona um método de tratamento de sujeitos humanos ou animais que sofrem ou estão em risco de sofrer de uma perturbação mediada pela IL-Ιβ, em que o método compreende administrar ao sujeito 30 uma quantidade eficaz da molécula de anticorpo da presente invenção. A molécula de anticorpo da presente invenção também pode ser utilizada em diagnóstico, por exemplo, no diagnóstico e imagiologia in vivo de estados de doença envolvendo a IL-1β. A presente invenção é adicionalmente descrita, apenas a titulo ilustrativo, nos exemplos seguintes, que se referem às Figuras adjuntas, nas quais: A Figura la) mostra as sequências de nucleótidos e aminoácidos (SEQ ID NOs: 1 e 3, respetivamente) dos domínios variáveis da cadeia pesada, e a Figura lb) mostra as sequências de nucleótidos e aminoácidos (SEQ ID NOs: 2 e 4, respetivamente) dos domínios variáveis da cadeia leve do anticorpo monoclonal murino IC8. A Figura 2 mostra os vetores MRR14 e pMRRIO. A Figura 3 mostra a conceção de enxerto para as sequências das cadeias pesada (Figura 3a; SEQ ID NOs: 11-15) e leve (Figura 3b; SEQ ID NOs: 16-20) do IC8. O símbolo (|) salienta diferenças entre sequências de arcabouço dadora:aceitadora:enxertada. As CDRs têm um sublinhado simples para as sequências do IC8. Estas são como definido por Kabat, excetuando a CDR-H1 que abrange definições de Kabat e Chothia. As sequências com um sublinhado duplo consistem em resíduos dadores retidos nos enxertos. Os resíduos com asterisco (*) são comuns em sequências da linha germinativa VH3 do subgrupo humano, mas não estão presentes nesta linha germinativa particular - não são 31 considerados resíduos de ratinho, apesar de estarem presentes na sequência dadora original. A Figura 4 mostra as sequências de nucleótidos e aminoácidos dos genes concebidos gHl (Figura 4a) e gLl (Figura 4b). A Figura 5 mostra os oligonucleótidos que foram utilizados para a construção genética. A Figura 6 mostra as cassetes oligonucleotídicas que foram utilizadas para enxertos adicionais. São apresentadas: a sequência do filamento sentido IC8gL2 (SEQ ID NO: 59) , a sequência do filamento reverso (SEQ ID NO: 72) e a sequência de aminoácidos correspondente (SEQ ID NO: 60) ; a sequência do filamento sentido IC8gL3 (SEQ ID NO: 61), a sequência do filamento reverso (SEQ ID NO: 73) e a sequência de aminoácidos correspondente (SEQ ID NO: 62); a sequência do filamento sentido IC8gH2 (SEQ ID NO: 63) , a sequência do filamento reverso (SEQ ID NO: 64) e a sequência de aminoácidos correspondente (SEQ ID NO: 65), e a sequência do filamento sentido IC8gH3 (SEQ ID NO: 66), a sequência do filamento reverso (SEQ ID NO: 67) e a sequência de aminoácidos correspondente (SEQ ID NO: 68). Os resíduos sublinhados designam aminoácidos alterados. A Figura 7 mostra os resultados do ensaio de neutralização da IL-Ιβ com enxertos de IC8. A Figura 8 mostra um mapa do vetor pTTOD(Fab'). A Figura 9 mostra os passos 1-4 da clonagem de genes da região V do IC8 no vetor intermediário pTTOD(Fab')· 32 A Figura 10 mostra um mapa do vetor pTTOD(gH3gL3 Fab' IGS-2) . A Figura 11 mostra a sequência codificadora e flanqueadora de pTTOD(gH3gL3 Fab' IGS-2); SEQ ID NO: 69. A Figura 12 mostra a estrutura de um fragmento Fab modificado derivado de um anticorpo para a IL-Ιβ ligado de modo covalente, via um resíduo cisteína, a um agente de ligação lisil-maleimida, em que cada grupo amino do resíduo lisilo tem um resíduo metoxi PEG ligado de modo covalente, em que n é cerca de 420.
Manipulações de DNA e métodos gerais
Utilizou-se a estirpe INVaF' de E. coli (Invitrogen) para transformação e crescimento por cultura de rotina. Enzimas de restrição e modificação de DNA foram obtidas da Roche Diagnostics Ltd. e New England Biolabs. Produziram-se preparações plasmídicas utilizando estojos de purificação Maxi Plasmid (QIAGEN, N° do catálogo 12165). Conduziram-se reações de sequenciação de DNA utilizando o estojo de sequenciação ABI Prism Big Dye terminator (N° do catálogo 4304149) , tendo sido processadas num sequenciador automático ABI 3100 (Applied Biosystems). Os dados foram analisados utilizando o programa AutoAssembler (Applied
Biosystems). Os oligonucleótidos foram obtidos da OSWEL. Determinou-se a concentração de Fab' utilizando ELISA de reunião de Fab'.
Exemplo 1: Clonagem de genes e expressão das regiões variáveis do anticorpo monoclonal murino IC8 33
Preparação de RNA total 0 hibridoma que expressa o IC8 foi gerado por Cistron utilizando tecnologia convencional de hibridoma após imunização de ratinhos com a proteína IL-Ιβ humana. 0 hibridoma foi depois obtido pela Celltech R&D Limited. Preparou-se RNA total a partir de células de hibridoma de IC8 utilizando o estojo QIAGEN RNeasy (QIAGEN Ltd, n° do catálogo 74104) . O RNA obtido foi transcrito de forma reversa em cDNA utilizando o estojo Clontech cDNA Advantage RT for PCR (n° do catálogo K1402).
Clonagem por PCR das regiões VH e VL do IC8 0 cDNA preparado a partir de células de hibridoma foi utilizado como modelo para PCR numa série de reações concebidas para amplificar as sequências das regiões V. As reações empregaram um conjunto de "primers" degenerados "diretos" concebidos para hibridizarem com DNA na sequência de sinal conservada, e um "primer" reverso hibridizando com DNA que codifica a junção arcabouço 4/região constante. Efetuou-se PCR utilizando Taq Plus Precision (Stratagene, N° do catálogo 600211) e uma concentração de 0,25 mM de dNTP. Os produtos de PCR resultantes foram clonados em vetores de sequenciação (estojo de clonagem para sequenciação In Vitrogen Zero Blunt TOPO PCR, N° do catálogo K2875) e determinou-se a sequência de DNA. Utilizou-se a sequenciação da proteína N-terminal do anticorpo IC8 purificado (do hibridoma) para confirmar que as sequências traduzidas correspondiam à sequência proteica observada. As sequências das regiões V estão apresentadas na Figura 1 e nas SEQ ID NOS: 1 até 4. 34
Os genes das regiões V murinas foram depois subclonados nos vetores de expressão pMRRIO e pMRR14 (Figura 2). Estes são vetores separados para expressão da cadeia leve e pesada, respetivamente, e contêm DNA genómico que codifica genes de regiões constantes para a cadeia leve capa humana e cadeia pesada gama-4, respetivamente. A molécula de anticorpo IC8 duplamente quimérica cHcL foi expressa por cotransfeção transitória dos vetores de expressão das cadeias pesada e leve descritos acima (pMRRIO e pMRR14 contendo VL e VH de IC8, respetivamente) em células CHO-L761. As transfeções foram realizadas utilizando o procedimento de lipofectamina de acordo com as instruções do fabricante (In Vitrogen, N° do catálogo 18324) .
Exemplo 2: Enxerto de IC8 com CDRs
As CDRs do IC8 foram enxertadas em arcabouços humanos, para reduzir a imunogenicidade potencial e para facilitar a expressão em E. coli. Arcabouços aceitadores da linha germinativa humana foram escolhidos dos subgrupos VH3 e VK1. A Figura 3 mostra um alinhamento entre a sequência dadora de ratinho e os arcabouços aceitadores humanos. 0 arcabouço aceitador da cadeia pesada é a sequência da linha germinativa humana VH3-11 (DP-35), com o arcabouço 4 provindo desta porção da linha germinativa da região JH humana JH4. 0 arcabouço aceitador da cadeia leve é a sequência da linha germinativa humana 012 (DPK9), com o arcabouço 4 provindo desta porção da linha germinativa da região JK humana JK1. 0 alinhamento na Figura 3 mostra que há 13 diferenças de arcabouço entre as cadeias pesadas dadora e aceitadora 35 (excluindo CDRs). Em cada uma destas posições efetuou-se uma análise do potencial desse resíduo para contribuir para a ligação de antigénios, através de um contacto direto com antigénio, através de um papel desempenhado no empacotamento de CDRs ou através de envolvimento na interface VL/VH; se considerado importante, o resíduo dador murino foi retido. 0 alinhamento de cadeias leves mostra que há 15 diferenças de arcabouço entre as sequências dadora e aceitadora (excluindo CDRs). 0 potencial do resíduo murino para contribuir para a ligação de antigénios foi analisado de novo. Deste modo foram concebidos três enxertos de VH e três enxertos de VL. Estes também estão apresentados na Figura 3 e correspondem à SEQ ID NO: 13 (gHl), SEQ ID NO: 14 (gH2), SEQ ID NO: 15 (gH3), SEQ ID NO: 18 (gLl), SEQ ID NO: 19 (gL2) e SEQ ID NO: 20 (gL3).
Exemplo 3: Conceção e construção de genes para sequências enxertadas
Conceberam-se genes para codificarem as sequências enxertadas, utilizando codões frequentemente utilizados em E. coli e evitando codões de E. coli "raros" (Wada et al. (1991), Nucl. Acids Res., 1_9, 1981-86). Introduziram-se sítios de restrição na sequência de DNA em intervalos, para facilitar a manipulação genética adicional. A Figura 4 mostra a conceção de genes para gHl e gLl, cujas sequências estão apresentadas nas SEQ ID NOs: 21 e 22. As sequências de aminoácidos correspondentes estão apresentadas nas SEQ ID NOs: 23 e 24, respetivamente.
Utilizaram-se oligonucleótidos completamente sobrepostos para construir os genes que codificam gHl e gLl (Figura 5; SEQ ID NOs: 27-58). Os oligonucleótidos que codificam os genes desejados foram hibridizados em conjunto por mistura 36 a uma concentração de 100 pmoles/pL em tampão (12,5 mM TrisHCl pH 7,5, 2,5 mM MgCl2, 25 mM NaCl, 0,25 mM ditioeritritol) e aquecimento para 95°C durante 3 minutos num bloco de PCR programado para arrefecimento para 30°C a uma taxa de -0,01°C cada 10 segundos. Adicionaram-se DNA ligase de T4 (5 U) e o seu tampão reacional apropriado, e os oligonucleótidos foram ligados em conjunto por incubação a 25°C durante 1 hora. Os genes das cadeias pesada e leve ligados foram depois amplificados por PCR após a adição de um excesso de 10 vezes de "primers" "terminais" TI (SEQ ID NO: 25) e BI (SEQ ID NO: 26) . Para esta amplificação utilizou-se uma DNA polimerase de verificação (Taq Plus Precision, Stratagene). Os produtos de amplificação foram processados num gel de agarose 1,5%. A banda 400-450 foi isolada e purificada por gel e depois foi clonada no vetor intermediário pCR4 blunt TOPO, de acordo com as instruções do fabricante (InVitrogen). Este procedimento criou os plasmideos intermediários pCR4(IC8gLl) e pCR4(IC8gHl). Estes plasmideos foram então utilizados como modelos para criar as formas enxertadas adicionais gL2, gL3, gH2 e gH3.
Utilizou-se um método de substituição de cassetes oligonucleotidicas para criar os enxertos humanizados gL2 e gL3. A Figura 6 mostra a conceção das cassetes oligonucleotidicas. Para construir cada variante, o vetor pCR4(IC8gLl) foi cortado com as enzimas de restrição Kpnl e Nhel. O fragmento vetorial grande resultante foi purificado por gel a partir de agarose e foi utilizado em ligação com a cassete oligonucleotidica. Pares de oligonucleótidos foram hibridizados em conjunto por mistura a uma concentração de 0,5 pmoles/pL num volume de 200 pL de tampão (12,5 mM TrisHCl pH 7,5, 2,5 mM MgCl2, 25 mM NaCl, 0,25 mM ditioeritritol) e aquecimento para 95°C durante 3 37 minutos num banho de água (volume 500 mL) , depois foram deixados arrefecer lentamente para a temperatura ambiente. A cassete oligonucleotidica hibridizada foi depois diluída dez vezes em água antes da ligação no vetor apropriadamente cortado. Utilizou-se sequenciação de DNA para confirmar a sequência correta, criando os plasmídeos pCR4(IC8gL2) e pCR4(IC8gL3) . A variante gH2 foi construída a partir de pCR4(IC8gHl) utilizando uma estratégia de PCR. O filamento reverso da cassete mostrada na Figura 6 (SEQ ID NO: 64) foi usado como "primer" reverso em PCR utilizando um "primer" direto 5' específico para o vetor para gerar um produto que representa a sequência gH2 parcial. Este foi digerido com as enzimas de restrição HindIII e BspEI e depois foi clonado em pCR4(IC8gHl) restringido com HindIII-BspEI para criar pCR4(IC8gH2). A variante gH3 foi construída utilizando uma estratégia de PCR diferente. Os dois oligos gH3 mostrados na Figura 6 foram utilizados em reações de PCR separadas: o filamento sentido (SEQ ID NO: 66) como "primer" direto utilizando um "primer" 3' reverso específico para o vetor, e o filamento não sentido (SEQ ID NO: 67) como "primer" reverso utilizando um "primer" 5' direto específico para o vetor. Nos dois casos, o modelo foi pCR4(IC8gHl). Os dois produtos de amplificação resultantes foram isolados e purificados, depois foram adicionados em conjunto com os "primers" 5' e 3' específicos para o vetor e submetidos a ciclos por amplificações adicionais por PCR, para gerar um produto gH3 completo. Este foi digerido com HindIII e Apal e foi inserido em pCR4(IC8gHl) restringido com HindIII-Apal, para 38 criar pCR4(IC8gH3). Todas as variantes foram confirmadas por sequenciação de DNA.
Cada um dos enxertos de cadeia pesada foi então subclonado no vetor de expressão pMRR14 na forma de fragmentos HindiII-Apal. Cada um dos 3 enxertos de cadeia leve foi subclonado no vetor de expressão de cadeia leve pMRRIO na forma de fragmentos SfuI-BsiWI.
Seleção da variante enxertada ótima
Os anticorpos enxertados foram expressos em células CHO-L761 por cotransfeção transitória dos vetores de expressão das cadeias pesada e leve enxertadas descritos acima (pMRRIO e pMRR14 contendo IC8 gLl, gL2 e gL3 e gHl, gH2 e gH3, respetivamente). As transfeções foram realizadas utilizando o procedimento de lipofectamina de acordo com as instruções do fabricante (InVitrogen, n° do catálogo 18324) .
Todas as combinações de cadeia enxertada e cadeia quimérica foram expressas e comparadas contra o anticorpo duplamente quimérico cHcL. A ligação foi avaliada num ensaio BIAcore e num ensaio de neutralização de IL-Ιβ.
Ensaio BIAcore 0 formato do ensaio empregou anticorpo anti-IL-Ιβ capturado por anti-hFc com uma titulação de IL-Ιβ humana recombinante na fase de solução. IgG anti-humana de ratinho, especifica para o fragmento Fc (Celltech) foi imobilizada na célula de fluxo 2 de um CM5 Sensor Chip via química de acoplamento de amina para um nível de 12757RU. Preparou-se uma superfície 39 de referência bloqueada na célula de fluxo 1 por ativação com EDC/NHS e desativação com etanolamina, utilizando os mesmos volumes da célula de fluxo 2. Utilizou-se tampão HBS-EP (10 mM HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% Surfactante P20, Biacore AB) como tampão de processamento, e os ensaios foram realizados a 25°C. Fez-se passar anticorpo anti-IL-Ιβ nas células de fluxo 1 e 2, tendo sido capturado na superfície anti-hFc imobilizada utilizando uma taxa de fluxo de 10 pL/minuto. Injetou-se IL-Ιβ, entre 400-0 nM, na superfície de anticorpo anti-IL-Ιβ bloqueada e capturada utilizando uma taxa de fluxo de 30 pL/minuto durante 3 minutos. A superfície anti-hFc foi regenerada com uma injeção de 30 pL de 40 mM HC1. Calcularam-se parâmetros cinéticos utilizando o "software" BIAevaluation 3.1.
Para Fab' de gIC8, o formato do ensaio empregou anticorpo anti-IL-Ιβ capturado por anti-h(Fab')2 (em que "h" indica que é um F(ab')2 humano) e depois IL-Ιβ foi titulada. IgG anti-humana de cabra Affinipure, específica para o fragmento F(ab')2 (Jackson ImmunoResearch Código 109-005-097) foi imobilizada na célula de fluxo 2 de um CM5 Sensor Chip via química de acoplamento de amina para um nível de 13025RU. Preparou-se uma superfície de referência bloqueada na célula de fluxo 1 por ativação com EDC/NHS e desativação com etanolamina, utilizando os mesmos volumes da célula de fluxo 2. Utilizou-se tampão HBS-EP (10 mM HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% Surfactante P20, Biacore AB) como tampão de processamento, e os ensaios foram realizados a 25°C. Fez-se passar anticorpo anti-IL-Ιβ nas células de fluxo 1 e 2, tendo sido capturado na superfície anti-h(Fab')2 imobilizada utilizando uma taxa de fluxo de 10 pL/minuto. Injetou-se IL-Ιβ (Strathmann), entre 400-0 nM, na superfície de anticorpo anti-IL-Ιβ bloqueada e capturada 40 utilizando uma taxa de fluxo de 30 μL/minuto durante 3 minutos. A superfície anti-h(Fab')2 foi regenerada com uma injeção de 30 pL de 40 mM HC1, seguida de uma injeção de 15 pL de 5 mM NaOH. Calcularam-se parâmetros cinéticos utilizando o "software" BIAevaluation 3.1. A Tabela 1 apresenta um resumo dos dados de afinidade de antigénios Biacore. Fica claro que o enxerto gHl, que tem resíduos dadores nas posições 44 e 89, tem maior afinidade do que gH2, que tem apenas um resíduo dador na posição 89. Em consequência, o enxerto gH2 foi rejeitado. Surpreendentemente, observou-se afinidade elevada no enxerto gH3, no qual apenas a posição 44 é um resíduo de arcabouço dador.
Tabela 1: Afinidade por BIAcore
Anti-IL-Ιβ Kd (nM) mIC8 0, 30 cHcL 0, 38 gHlgLl 0, 35 gHlgL2 0, 34 gHlgL3 0, 30 gH2gLl 1,27 gH2gL3 1,14 gH2gL3 1,07 gH3gLl 0,28 gH3gL2 0, 32 gH3gL3 0,28 gH3gL3 Fab' 0,32
Ensaio de neutralização in vitro 41
Fibroblastos cresceram até 80% de confluência em placas de 96 cavidades. Titularam-se anticorpos, em diluições de meio logaritmo, desde 1 pg/mL e adicionou-se IL-Ιβ para dar origem a uma concentração final de 20 pg/mL. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 30 minutos. Removeu-se meio de cultura das culturas de fibroblastos, adicionaram-se 100 pL de mistura anticorpo/IL-Ιβ às cavidades apropriadas e cultivou-se o sistema durante a noite a 37°C. Seguidamente estimou-se a quantidade de IL-6 produzida em resposta à IL-Ιβ o Estojo R&D Systems Human IL-6 Duoset DY206.
Os resultados do ensaio de neutralização estão apresentados na Figura 7, onde se comparam as formas enxertadas do anticorpo (excluindo gH2) com o anticorpo de ratinho paterno. Tal como com os dados de afinidade por Biacore, são muito pequenas as diferenças entre quaisquer dos enxertos remanescentes. Assim, selecionou-se gL3gH3 como sendo a variante com atividade ótima e o menor número de resíduos de arcabouço de ratinho. Como mostrado na Figura 3, a sequência gH3 tem 1 resíduo de arcabouço dador, ao passo que a sequência gL3 tem 3 resíduos de arcabouço dadores.
Ensaio de neutralização in vivo
Para determinar a eficácia da neutralização do gH3gL3Fab' in vivo, o gH3gL3Fab' foi testado em dois modelos in vivo de inflamação. gH3gL3Fab'-PEG(40K) intraperitoneal/hIL-l$ intraperitoneal em ratinhos 42
Ratinhos Balb/c machos (18-25 g) foram injetados de forma intraperitoneal (i.p.) com gH3gL3Fab'-PEG(4OK) (100 pL, em veiculo PBS) ou Fab'-PEG (40K) de controlo (100 pL, em veiculo PBS) 5 minutos antes da injeção i.p. com hIL-Ιβ (150 ng/kg) ou veiculo (100 pL de PBS). Passados 120 minutos, os ratinhos foram mortos por deslocamento cervical e efetuou-se a lavagem peritoneal (3 mL de HBSS (Sais Equilibrados de Hanks) + 0,25% BSA, 12 mM HEPES) . Efetuou-se uma contagem de leucócitos totais utilizando um Contador Coulter. Para a identificação de neutrófilos, 50 pL de fluido da lavagem peritoneal foram corados com uma diluição 1:300 de mAb anti-CD45-CyChrome e diluição 1:300 de mAb anti GR-1 etiquetado com ficoeritrina (anti-Ly6G/Ly6C) durante 20 minutos (4°C, no escuro). Os leucócitos foram lavados uma vez em HBSS (0,25% BSA, 12 mM HEPES), foram ressuspensos em 300 pL de HBSS (0,25% BSA, 12 mM HEPES) e analisados por citometria de fluxo. Os neutrófilos foram identificados como sendo CD45+GR-1HGH. Mediu-se a concentração da proteína-1 quimioatratora de monócitos murina (mMCP-1) nas amostras da lavagem peritoneal por ELISA de sanduíche, de acordo com as instruções do fabricante (BD Biosciences OPT-EIA mMCP-1). gH3gL3 Fab'-PEG(40K) intravenoso/hIL-1β intravenosa em ratinhos
Ratinhos Balb/c machos (18-25 g) foram anestesiados com halotano e injetados intravenosamente (i.v.) com gH3gL3Fab'-PEG(40K) (100 pL, em veiculo PBS) ou Fab-PEG de controlo (100 pL, em veiculo PBS) 15 minutos antes da injeção i.v. com hIL-Ιβ (37,5 ou 50 pg/kg) ou veiculo (100 pL de PBS). Passados 90 minutos recolheu-se uma amostra de sangue, por punção cardíaca, em heparina (20 pL, 100 U/mL) 43 e preparou-se plasma por centrifugação (14 000 x g, 2 minutos, temperatura ambiente). As amostras de plasma foram armazenadas a -20°C. As amostras de plasma foram analisadas quanto à interleuquina-6 murina (mIL-6) por ELISA de sanduíche, de acordo com as instruções do fabricante (BD Biosciences OPT-EIA mIL-6).
Os resultados demonstram que o pré-tratamento de ratinhos com gH3gL3Fab'-PEG(40K) i.p. foi eficaz na redução da acumulação i.p. de neutrófilos induzida por hIL-Ιβ (Tabela 2) e geração de mMCP-1 (Tabela 3) . O pré-tratamento de ratinhos com gH3gL3Fab'-PEG (40K) i.v. também foi eficaz na redução da geração i.v. de mIL-6 induzida por hIL-Ιβ. Os dados de 3 experiências separadas estão resumidos na Tabela 4 . Não se observaram efeitos prejudiciais a nenhuma das doses utilizadas em qualquer dos modelos. Em consequência, é de esperar que o anticorpo gH3gL3Fab' possa ser útil no tratamento de inflamação e outras doenças mediadas pela IL- 1β.
Tabela 2: Acumulação de neutrófilos
Dose hIL-Ιβ i.p. (ng/kg) gH3gL3Fab ' - PEG (40K) ED50 (mg/kg) Inibição máx. (%, dose, mg/kg) 150 0,02 96 (1) 150 0,02 97 (1) 150 0,03 95 (1) 150 0,06 86 (0,1) 150 0,03 89 (1) 150 0,03 98 (0,3) 44
Tabela 3: Geração de inMCP-1
Dose hIL-Ιβ i.p. (ng/kg) gH3gL3Fab'-PEG(40K) ED50 (mg/kg) Inibição máx. (%, dose, mg/kg) 150 0,02 98 (1) 150 0,01 100 (1) 150 0,02 98 (1) 150 0,04 92 (1) 150 0,02 98 (1) 150 NA 99 (0,3)
Tabela 4
Dose hIL-Ιβ i.v. gH3gL3Fab ' - PEG ( 4 0K) ED50 Inibição máx. (%, dose, (ng/kg) (mg/kg) mg/kg) 50 1,88 75 (10) 37,5 5,39 81 (10) 37,5 2,95 86 (10)
Exemplo 4: Clonagem e expressão de fragmentos Fab'
Clonagem de regiões V selecionadas no plasmídeo de expressão de Fab' de E. coli pTTOD(Fab') 0 vetor de expressão contendo um Fab' irrelevante, denominado pTTOD(Fab'), está apresentado na Figura 8. 0 DNA que codifica a cadeia leve e a cadeia pesada é precedido por DNA que codifica a sequência de sinal OmpA de E. coli (Movva NR, Nakamura K e Inouye M. "Amino acid sequence of the signal peptide of ompA protein, a major outer membrane protein of Escherichia coli". J Biol Chem. 1980; 255(1): 27-9) . As regiões V do IC8 foram clonadas neste vetor de modo a ser mantida esta sequência de sinal, dirigindo a translocação de ambas as cadeias para o periplasma de E. coli. O péptido de sinal é clivado pela translocação, de modo que não faz parte da sequência Fab' do produto, (nota; a sequência do péptido de sinal OmpA consiste nos resíduos de aminoácidos 1 até 21 da sequência apresentada na SEQ ID NO: 70. O plasmídeo pTTOD(Fab') foi digerido com as enzimas de restrição EcoRV e BsiWI (BsiWI e Spll são 45 isosquisómeros), para remover a sequência VL irrelevante, e a reqião V qL3 do IC8 foi inserida após o seu isolamento de pMRRIO(IC8qL3). Este procedimento criou o intermediário de clonaqem pTTOD(IC8gL3). 0 pTTOD(IC8gL3) foi então clivado com BsiWI e Apal, e 2 fragmentos foram inseridos numa ligação de 3 vias; um fragmento c-capa/IGS (IGS-2 ou IGS-3) e o fragmento IC8gH3 (ver a representação esquemática na Figura 9) . Deste modo foram construídas as 2 variantes vetoriais pTTOD(IC8gL3gH3 IGS-2) e pTTOD(IC8gL3gH3 IGS-3). Estas variam apenas na sequência de nucleótidos entre os genes das cadeias pesada e leve: IGS-2 confere acoplamento de tradução muito estreito entre os 2 genes, dando origem a uma taxa rápida de tradução da cadeia pesada, IGS-3 confere uma taxa mais lenta de tradução da cadeia pesada (ver requerimento de patente UK N° 0129105).
Expressão fermentadora de Fab’ em E. coli
Os plasmídeos pTTOD(IC8gL3gH3 IGS-2) e pTTOD(IC8gL3gH3 IGS-3) foram transformados na estirpe de E. coli W3110 utilizando protocolos comuns. 0 Fab' periplasmático solúvel de E. coli foi extraído utilizando tampão tris-EDTA a 50°C. Após extração e arrefecimento ajustou-se o pH do extrato e removeram-se as células por centrifugação e filtração. A corrente clarificada foi diluída com água (aproximadamente 2 vezes) para reduzir a condutividade. O Fab' foi capturado utilizando cromatografia de permuta catiónica (resina SP sefarose FF) e o Fab' ligado eluiu utilizando um passo de NaCl. A corrente eluída de produto foi concentrada, diafiltrada em tampão tris utilizando ultrafiltração e sujeita a cromatografia de permuta aniónica (resina Q sefarose FF), em que o Fab' ficou contido na fração não ligada. O Fab' purificado foi concentrado e diafiltrado 46 para tampão de redução (por ultrafiltração), seguido de redução utilizando 2-mercaptoetilamina para ativar a região conetora tiol. 0 redutor é então removido por permuta de tampões por ultrafiltração. A sequenciação N-terminal confirmou a sequência de aminoácidos correta e clivagem do líder OmpA. Comparou-se a expressão do Fab' por estes dois plasmídeos. A Tabela 5 mostra uma comparação de rendimentos de Fab' fermentador para as variantes IGS-2 e IGS-3. A construção IGS-2 tem um desempenho claramente superior ao da IGS-3 quanto à produtividade do Fab'. Em consequência, selecionou-se a variante IGS-2. 0 mapa do plasmídeo está apresentado na Figura 10. A Figura 11 mostra a sequência codificadora e flanqueadora de Fab' do pTTOD(gH3gL3 Fab' IGS-2) .
Tabela 5: Rendimentos de expressão do fermentador; uma comparação de rendimentos de Fab' periplasmático de gIC8 anti IL-Ιβ
Fermentações Data Construção ELISA de Fab' Peri. (mg/L) Proteína G A280 (mg/L) FM2 64 25/09/01 gIC8IGS2 602 588 FM2 65 25/09/01 gIC8IGS2 742 533 FM266 25/09/01 gIC8IGS3 243 FM2 67 25/09/01 gIC8IGS3 224
Atividade de Fab' produzido por E. coli
Em seguida, algum do Fab' produzido por E. coli purificado foi analisado quanto à afinidade no ensaio Biacore, como mostrado na Tabela 1. Como pode observar-se, este material retém efetivamente a atividade completa neste ensaio. PEGuilação do Fab 47 0 Fab modificado purificado é conjugado, de modo especifico para sítios, com uma molécula ramificada de PEG. Isto é efetuado por ativação de um único resíduo cisteína numa região conetora truncada do Fab modificado, seguido de reação com (PEG)-lisil-maleimida como previamente descrito (A. P. Chapman et ai., Nature Biotechnology 11_, 780-783, 1999). Uma molécula PEGuilada da invenção está representada na Figura 12. 0 PEG utilizado consistiu em 20K metoxi-PEG-amina (que pode ser obtido da Nektar, anteriormente Shearwater). 0 Fab'-PEG resultante foi purificado por cromatografia de permuta catiónica (SP sefarose HP) utilizando uma eluição com um gradiente linear de NaCl. O Fab'-PEG purificado foi concentrado e formulado por ultrafiltração em 50 mM acetato de sódio + 125 mM NaCl, pH 5,5, para produzir o anticorpo neutralizador terapêutico da invenção.
Será obviamente entendido que a presente invenção foi descrita apenas a título exemplificativo, não se pretendendo de modo nenhum que seja limitadora, e que podem ser feitas modificações em pormenores no âmbito das reivindicações aqui apresentadas a seguir.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
<110> CELLTECH R&D LIMITED <120> Anticorpo neutralizador com especificidade para a IL-1β humana <160> 75 <170> SeqWin99, versão 1.02 48
<210> 1 <211> 414 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> <220> <221> sequência de nucleótidos de VH de IC8 <400> 1 atggactttg ggctcagctt gattttcctt gtccttactt taaaaggtgt gcagtgtgat $0 gtgcagttgg tggagtctgg gggaggctta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcga tttcagtagg tatgacatgt cttgggttcg ccagactccg 180 gagaagaggc tggagtgggt cgcatatatt agtagtggtg gtggtagcac ctactttcca 240 gacactgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300 caaatgaaca atctgcagtc tgaggacaca gccatgtttt actgtgcaag acagaacaag 360 aaattaaect ggtttgatta ctggggccag gggactctgg tcactgtctc ttca 414 <210> 2 <211> 384 <212> DNA <213> <22 0> <221> sequência VL de IC8 <400> 2 atgagtgtgc tcactcaggt cctggcgttg ctgctgctgt ggcttgcagg tgccagatgt 60 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 120 atcacatgtc gaacaagtgg gaatattcac aattatttaa catggtatca acagaatttg 180 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat gcaaaaacct tagcagatgg tgtgccatca 240 aggttcagtg gcagtggatc aggaacacaa ttttctctca cgatcaacag cctgcagcct 300 gaagattttg ggaattatta otgtcaacat ttttggagto ttccattcac gttcggctcg 360 gggacaaagt tggaaataaa acgt 384 49 <210> 3 <211> 138 <212> PRT <213> <220> <221> sequência proteica de VH de IC8 <400> 3
Met Asp phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Vai Leu Thr Leu Lys Gly 1 5 10 15
Val Gin Cys Asp 20 Val Gin Leu Val Glu 25 Ser Gly Gly Gly Leu 30 val Lys Pro Gly Gly 35 Ser Leu Lys Leu Ser 40 Cys Ala Ala Ser Gly Phe 45 Asp Phe Ser Arg 50 Tyr Asp Met Ser Trp 55 Val Arg Gin Thr Pro 60 Glu Lys Arg Leu Glu 65 Trp Val Ala Tyr Ile 70 Ser Ser Gly Gly Gly Ser 75 Thr Tyr Phe Pro 80 Asp Thr Val Lys Gly 8 5 Arg Phe Thr Ile Ser 90 Arg Asp Asn Ala Lys 95 Asn Thr Leu Tyr Leu 100 Gin Met Asn Asn Leu 105 Gin Ser Glu Asp Thr 110 Ala Met Phe Tyr cys 115 Ala Arg Gin Asn Lys 120 Lys Leu Thr Trp Phe 125 Asp Tyr Trp Gly Gin 130 Gly Thr Leu Val Thr 135 Val Ser Ser <210> 4 <211> 128 <212> PRT <213> <220> <221> sequência proteica de VL de IC8 50 <400> 4
Met 1 Ser Vai Leu Thr 5 Gin Vai Leu Ala Leu 10 Leu Leu Leu Trp Leu 15 Ala Gly Ala Arg Cys 20 Asp Xle Gin Met Thr 25 Gin Ser Pro Ala Ser 30 Leu Ser Ala Ser Vai 35 Gly Glu Thr Vai Thr 40 Xle Thr Cys Arg Thr 45 Ser Gly Asn Ile His 50 Asn Tyr Leu Thr Trp 55 Tyr Gin Gin Asn Leu Gly 60 Lys Ser Pro Gin 65 Leu Leu Vai Tyr Asn 70 Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly 75 Vai Pro Ser 80 Arg Phe Ser Gly Ser 85 Gly Ser Gly Thr Gin 90 Phe Ser Leu Thr Ile 95 Asn Ser Leu Gin Pro 100 Glu Asp Phe Gly Asn 105 Tyr Tyr Cys Gin His 110 Phe Trp Ser Leu Pro 115 Phe Thr Phe Gly Ser 120 Gly Thr Lys Leu Glu 125 Ile Lys Arg <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> <220> <221> CDR1 de VH de IC8 <400>
Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr Asp Met Ser 15 10 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> <220> <221> CDR2 de VH de IC8 51 <4Ο0> 6
Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Phe Pro Asp Thr Vai Lys 1 Gly 5 10 15 <210> 7 <211> 10 <212> <213> PRT <22 0> <221> CDR3 de VH de IC8 <4 0 0> 7
Gin Aan Lys Lys Leu Thr Trp Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> <213> PRT <22 0> <221> CDR1 de VL de IC8 <400> 8
Arg Thr Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Thr 1 5 10 <210> 9 <211> 7
<212> PRT <213> 52 <22 0> <221> CDR2 de VL de IC8 <4 0 0> 9
Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> <213> PRT <22 0> <221> CDR3 de VL de IC8 <4 0 0> 10
Gin His Phe Trp Ser Leu Pro Phe Thr 1 5 <210> 11 <211> 119 <212> PRT <213>
<22 0> <221> conceção de enxerto de IC8 de VH 53 <400> 11
Asp 1 Vai Gin Leu Vai 5 Glu Ser Gly Gly Gly Leu 10 Vai Lys Pro Gly 15 Gly Ser Leu Lys Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Asp Phe Ser 30 Arg Tyr Asp Met Ser 35 Trp Vai Arg Gin Thr 40 Pro Glu Lys Arg Leu 45 Glu Trp Vai Ala Tyr 50 Ile Ser Ser Gly Gly 55 Gly Ser Thr Tyr Phe 60 Pro Asp Thr Vai Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ala 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 Leu Gin Met Asn Asn B5 Leu Gin Ser Glu Asp 90 Thr Ala Met Phe Tyr 95 Cys Ala Arg Gin Asn 100 Lys Lys Leu Thr Trp 105 Phe Asp Tyr Trp Gly 110 Gin Gly Thr Leu Vai 115 Thr Vai Ser Ser <210> 12 <211> 109 <212> PRT <213> <22 0> <221> conceção de enxerto de IC8 3.11 (DP-35) <400> 12
Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 54 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 30 Tyr Met Ser 35 Trp Ile Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Vai Ser Tyr 50 Ile Ser Ser Ser Gly 55 Ser Thr Ile Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Vai Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ala Lys 75 Asn Ser Leu Tyr 80 Leu Gin Met Asn Ser B5 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 90 Vai Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 100 105 <210> 13 <211> 119 <212> PRT <213> <220> <221> conceção de enxerto de IC8 gHl <4 00> 13
Glu 1 Vai Gin Leu Vai 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Asp Phe Ser 30 Arg Tyr Asp Met Ser 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Arg Leu 45 Glu Trp Val Ala Tyr 50 Ile Ser Ser Gly Gly 55 Gly Ser Thr Tyr Phe 60 Pro Asp Thr Val Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ala 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Met Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg Gin Asn 100 Lys Lys Leu Thr Trp 105 Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 110 Thr Leu Vai Thr Val Ser Ser 115 55 <210> 14 <211> 119 <212> PRT <213> <220> <221> conceção de enxerto de IC8 gH2 <400> 14
Glu 1 vai Gin Leu Vai 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser Gly 25 Phe Asp Phe Ser 30 Arg Tyr Asp Met Ser 35 Trp Vai Arg Gin. Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Vai Ala Tyr 50 Ile Ser Ser Gly Gly 55 Gly Ser Thr Tyr Phe 60 Pro Asp Thr Vai Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ala 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Met Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg Gin Asn 100 Lys Lys Leu Thr Trp Phe 105 Asp Tyr Trp Gly 110 Gin Gly Thr Leu Vai 115 Thr Vai Ser Ser <210> 15 <211> 119 <212> PRT <213> <22 0> <221> conceção de enxerto de IC8 gH3 56 <400> 15
Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Phe Pro Asp Thr Vai 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 6S 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gin Asn Lys Lys Leu Thr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110 Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser lis <210> 16 <211> 108 <212> PRT <213> <22 0>
<221> conceção de enxerto de IC8 VL <4 0 0> 16
Asp 1 Ile Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ala Ser 10 Leu Ser Ala Ser Vai 15 Gly Glu Thr Vai Thr 20 Ile Thr Cys Arg Thr 25 Ser Gly Asn Ile His 30 Asn Tyr Leu Thr Trp 35 Tyr Gin Gin Asn Leu 40 Gly Lys Ser Pro Gin 45 Leu Leu Vai Tyr Asn 50 Ala Lys Thr Leu Ala 55 Asp Gly Vai Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly Ser 65 Gly Ser Gly Thr Gin 70 Phe Ser Leu Thr Ile 75 Asn Ser Leu Gin Pro 80 Glu Asp Phe Gly Asn 85 Tyr Tyr Cys Gin His 90 Phe Trp Ser Leu Pro 95 Phe
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys leu Glu Ile Lys Arg 100 105 57 <210> 17 <211> 106 <212> PRT <213> <22 0> <221> conceção de enxerto de IC8 012 (DPK9) <400> 17
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 18 <211> 108 <212> PRT <213> <220> <221> conceção de enxerto de IC8 gLl 58 <400> 18
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15
Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr 20 25 30
Leu Thr Trp Tyr Gin Gin Lys Leu Gly Lys Ala Pro Gin Leu Leu Vai 35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Thr Leu Thr Xle Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asn Tyr Tyr Cys Gin His Phe Trp Ser Leu Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 19 <211> 108 <212> PRT <213> <22 0> <221> conceção de enxerto de IC8 gL2 <4 00> 19 Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gly Asn. Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Thr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gin Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Asn Tyr Tyr Cys Gin His Phe Trp Ser Leu Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Xle Lys Arg 100 105 59 <210> 20 <211> 108 <212> PRT <213> <22 0> <221> conceção de enxerto de IC8 gL3 <400> 20
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Thr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gin Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Asn Tyr Tyr Cys Gin Hls Phe Trp Ser Leu Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 21 <211> 458 <212> DNA <213> <22 0> <221> gHl de IC8 60 <400> 21 gaataaaagc ttgccgccac catggacttt gggctcagct tgattttcct tgtccttact 60 ttaaaaggtg tgcagtgtga ggtgcagctg gtcgagtctg gaggcgggct tgtccagcct 120 ggagggagcc tgcgtctctc ttgtgcagca agcggcttcg acttttcccg ttacgatatg 180 tcctgggtgc ggcaggcacc tgggaagcgc ctggagtggg tggcatacat tagctccgga 240 ggcggctcta catacttccc ggacaccgtc aagggccgtt tcaccatttc ccgggacaat 300 gcaaagaata ccctttacct ccagatgaac tctctccgcg cagaggacac agcaatgtat 360 tactgtgcac ggcagaacaa gaaactgacc tggtttgact actggggaca ggggaccctt 420 gtgacagtct cctctgcttc tacaaagggc ccaagaaa 458 <210> 22 <211> 414 <212> DNA <213> <220> <221> sequência de nucleótidos de gLl de IC8 <400> 22 ggatgattcg aagccgccac catgagtgtg ctcactcagg tcctggcgtt gctgctgctg 60 tggcttgcag gtgccagatg tgatatccag atgacccaga gtccaagcag tctctccgcc 120 agcgtaggcg atcgtgtgac tattacctgt cgtaccagtg gcaacatcca taattacctg 180 acgtggtacc agcaaaaact gggcaaagcc ccgcagctcc tggtctataa cgcgaaaacg 240 etagcagacg gtgtgccaag ccgtttcagt ggcagtggca gcggtactca gtttaccctc 300 acaatttcgt otctccagcc ggaagatttc gccaattact attgtcagca cttttggagc 360 ctgcctttca ccttcggtca gggcactaaa gtagaaatca aacgtacggc gtgc 414 <210> 23 <211> 144 <212> PRT <213> <220> <221> sequência de aminoácidos de gHl de IC8 61 <400> 23
Met 1 Asp Phe Gly Leu 5 Ser Leu Ile Phe Leu Vai 10 Leu Thr Leu Lys 15 Gly Vai Gin Cys Glu Vai 20 Gin Leu Vai Glu 25 Ser Gly Gly Gly Leu 30 Vai Gin Pro Gly Gly Ser Leu 35 Arg Leu Ser 40 Cys Ala Ala Ser Gly Phe 45 Asp Phe Ser Arg 50 Tyr Asp Met Ser Trp 55 Vai Arg Gin Ala Pro 60 Gly Lys Arg Leu Glu 65 Trp Vai Ala Tyr Ile 70 Ser Ser Gly Gly Gly 75 Ser Thr Tyr Phe Pro 50 Asp Thr Vai Lys Gly Arg Θ5 Phe Thr Ile Ser Arg 90 Asp Asn Ala Lys 95 Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 100 Met Asn Ser Leu 105 Arg Ala Glu Asp Thr 110 Ala Met Tyr Tyr Cys 115 Ala Arg Gin Asn Lys 120 Lys Leu Thr Trp Phe Asp 125 Tyr Trp Gly Gin 130 Gly Thr Leu Vai Thr 135 Vai Ser Ser Ala Ser 140 Thr Lys Gly Pro <210> 24 <211> 129 <212> PRT <213> <22 0> <221> sequência de aminoácidos de gLl de IC8 <400> 24
Met Ser Vai Leu Thr Gin Vai Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Ala 15 10 15
Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser 62 20 25 30 Ala Ser vai 35 Gly Asp Arg Vai Thr 40 Ile Thr Cys Arg Thr 45 Ser Gly Asn Ile HÍS 50 Asn Tyr Leu Thr Trp 55 Tyr Gin Gin Lys Leu Gly 60 Lys Ala Pro Gin 65 Leu Leu Vai Tyr Asn 70 Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly 75 Vai Pro Ser 80 Arg Phe Ser Gly Ser 85 Gly Ser Gly Thr Gin 90 Phe Thr Leu Thr Ile 95 Ser Ser Leu Gin Pro 100 Glu Asp Phe Ala Asn 105 Tyr Tyr Cys Gin His 110 Phe Trp Ser Leu Pro 115 Phe Thr Phe Gly Gin 120 Gly Thr Lys Vai Glu 125 Ile Lys Arg
Thr
<210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> "primer" oligonucleotidico <220>
<221> "Primer" terminal de gHl TI <400> 25 gaaítaaeasc ttgesgesss e 21
<210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> "primer" oligonucleotidico 63 <22 0>
<221> "Primer" terminal de gHl BI <400> 26 ctóttgtsga ag 22 <210> 27 <211> 54 <212> DNA <213> <22 0> <221> IC8 gHl F1 <400> 27 stggseíttg pifttcctt fíetM tesaggtgt fcag 54- <210> 28 <211> 54 <212> DNA <213> <22 0> <221> IC8gHl F2 <400> 28 tgtgaggígc sgcíggtsgs g&rtggsggc ggptigtee sgectggsgg: p.gs 54
<210> 29 <211> 54 <212> DNA <213> 64 <22 0> <221> IC8gHl F3 <4Ο0> 29
«Sgegte&et: dSglgeagí? ^asgatat g&se M <210> 30 <211> 54 <212> DNA <213> <22 0> <221> IC8gHl F4 <400> 30 tgggíge^e sggeseetgg gaísgcgcctg gsgtgggígg çatscaSg® etoe S4 <210> 31 <211> 54 <212> DNA <213> <22 0> <221> IC8gHl F5 <400> 31 ggsggcgsp': ctãcstã.ct! í^ggàcsíi: gtc&agggcc gHtssõHí í&ss 54
<210> 32 <211> 54 <212> DNA <213> 65 <22 0> <221> IC8 gHl F6 <4Ο0> 32 aas&g&stae wMssxtei «apitasses çts&xge^c si^sig S4 <210> 33 <211> 54 <212> DNA <213> <22 0> <221> IC8 gHl F7 <4O0> 33 gecscagcaa tgisttacíg: t^scggcag ascssgsa&c igsodggit ígsc 54 <210> 34 <211> 59 <212> DNA <213> <22 0> <221> IC8gHl F8 <400> 34 ttóggggas agg^aeeet tgftpeâgte ?K<3et§c& óseaagsââ S8
<210> 35 <211> 58 <212> DNA <213> 66 <22 0> <221> IC8gHl RI <4Ο0> 35 ^eacmgy gteojc^e css-agtsgte gaaosaggse ggjítet §& <210> 36 <211> 54 <212> DNA <213> <22 0> <221> IC8gHl R2 <400> 36 gescagíasí soa&gefgí ei?P§®!P$ teaí §4 <210> 37 <211> 54 <212> DNA <213> <22 0> <221> IC8 gHl R3 <400> 37 ctggaggtss agggtaSct rtgca%jta ccgggasstg: $gaaacggc ctót S4
<210> 38 <211> 54 <212> DNA <213> 67 <22 0> <221> IC8gHl R4 <4Ο0> 38 tagsgessjec ifâsgg^gefai atg$e?gcs;s «s» S4 <210> 39 <211> 54 <212> DNA <213> <22 0> <221> ICSgHl R5 <400> 39 «aseeggegç Secesggíg cetQísegcae «çsggacats tc-gíaaeggg assa $4 <210> 40 <211> 54 <212> DNA <213> <22 0> <221> IC8 gHl R6 <400> 40 ytssp&gceg cílgctgcac ssjpgsgaEg e&ggctecd Ecag^r^ge caag 54
<210> 41 <211> 54 <212> DNA <213> 68 <22 0> <221> IC8 gHl R7 <4Ο0> 41
ssegestesa gseíCKpss» gstjpasse acaelgeasa settttss&g teag M <210> 42 <211> 54 <212> DNA <213> <22 0> <221> IC8 gHl R8 <4O0> 42 gsçgagg&g® í^ggíjtgs gcessssgte eatggtggsg gcssagetltt sttc §4 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> <22 0> <221> "Primer" terminal de gLl TI <400> 43 gptgaKeg asg&sgssse .30
<210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> 69 <22 0> <221> "Primer" terminal de gLl BI <400> 44 geaegocgta e 21 <210> 45 <211> 55 <212> DNA <213> <22 0> <221> IC8 gLl F1 <400> 45
saigagíglg eíEasfeagg tecíggcgS pc^jcigc&j ígjpttgcsg: gtpcsc SS <210> 46 <211> 57 <212> DNA <213> <22 0> <221> IC8 gLl F2 <400> 46 sptgígala iseagalgae ee^sgfess agexsgtetet íxspcspig; agpgaí 57
<210> 47 <211> 57 <212> DNA <213> 70 <22 0> <221> IC8 gLl F3 <400> 47 egsipgâcta sacsigícg íseesgíggc a&cs&diais asaecíps gígcisaes 57 <210> 48 <211> 57 <212> DNA <213> <22 0> <221> IC8 gLl F4 <400> 48 çagcssesse tgggos.aíip; aggteMs aegqjaaaass gcsstgs» §? <210> 49 <211> 57 <212> DNA <213> <22 0> <221> IC8 gLl F5 <400> 49 gaeggigKjc casgscgtK: cagíggcagS ggeagqjgta ctaagiítae «áesea 57
<210> 50 <211> 57 <212> DNA <213> 71 <22 0> <221> IC8gLl F6 <4Ο0> 50 altt&gfefc teeagtsgip agaftteg>x aaftactstJ gtegsactt ttggage §7 <210> 51 <211> 54 <212> DNA <213> <22 0> <221> IC8 gLl F7 <400> 51 «çtt«ggs® «qqatjciaaa gSaga&ates aaogtsc^ glge §4 <210> 52 <211> 54 <212> DNA <213> <22 0> <221> IC8gLl RI <400> 52 tscSMgíg ecsKjseegs agg&paasgg eaggetcsss sagiígi% êc aaí& 54
<210> 53 <211> 57 <212> DNA <213> 72 <22 0> <221> IC8 gLl R2 <4Ο0> 53 gSasííggísg mafâtòxg ptggapxp «sgsasífgíg gaspsc S? <210> 54 <211> 57 <212> DNA <213> <22 0> <221> IC8 gLl R3 <4O0> 54 g<%se&etg ccâftígâass ggssStggeae aseg&Sge?: sgagSteg egftãts £7 <210> 55 <211> 57 <212> DNA <213> <22 0> <221> IC8 gLl R4 <4O0> 55 gBsK:8ggsgç; tpggg^stt tgessçsajp eaegtmgg: 3.3¾¾ S?
<210> 56 <211> 57 <212> DNA <213> 73 <22 0> <221> IC8gLl R5 <4Ο0> 56 gatgtSpxa ctggtssgsc aggfasãsgÊ cacacgatcg aâscgcis^ cggagag 57 <210> 57 <211> 57 <212> DNA <213> <22 0> <221> IC8gLl R6 <400> 57 sesísSgges eetgííasgcss aesgsag S? <210> 58 <211> 54 <212> DNA <213> <22 0> <221> IC8 gLl R7 <400> 58 cagesacge© a§gaect^g tgagessssi esíggíggçg gesespste ates §4
<210> 59 <211> 51 <212> DNA <213> 74 <22 0> <221> Sequência de IC8gL2 <4 0 0> 59 cageasaaac sgggcsasga isccgssgeí:* ctggtdaía ssgcfaasas g $ í <210> 60 <211> 21 <212> <213> PRT <22 0> <221> Sequência de IC8gL2 <4 0 0> 60
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gin Leu Leu Vai Tyr Asn 15 10 15
Ala Lys Thr Leu Ala 20 <210> 61 <211> 51 <212> <213> DNA <22 0> <221> Sequência de IC8 gL3 <400> 61 oegesesase egggeas^ge eccgeagetc ctgatsSals acgqpsass g <210> 62 <211> 21 75 <212> <213> PRT <22 0> <221> Sequência de IC8-gL3 <400> 62
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gin Leu Leu Xle Tyr Asn 15 10 15
Ala Lys Thr Leu Ala 20 <210> 63 <211> 48 <212> <213> DNA <22 0> <221> Sequência de IC8gH2 <4 0 0> 63 eesggggsg i geeíggâgSg aasgeteg §$§gsgge 4§ <210> 64 <211> 48 <212> <213> DNA <22 0> <221> Sequência Reversa de IC8gH2 <400> 64 ggscoc^cc cgpcctsac SK&scgtstg tsaícp&gjgcr ctecpcg : cqpcctsac ec&scatsLg ísstcap-qgc dscosca <58 76 <210> 65 <211> 16 <212> PRT <213> <22 0> <221> Sequência de IC8gH2 <4Ο0> 65
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 <210> 66 <211> 54 <212> DNA <213> <22 0> <221> Sequência de IC8gH3 <400> 66 g&sasispâs tpsítss&j: tpssgpag asssspâso ípssaggtt S4 <210> 67 <211> 54 <212> DNA <213> <22 0> <221> Sequência Reversa de IC8gH3 <400> 67 assEgaígac Ètgttett-g ssíggassaa astg 77 <210> 68 <211> 18 <212> PRT <213> <22 0> <221> Sequência de IC8gH3 <400> 68 Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Gin Asn Lys Lys Leu Thr Trp 1 5 10 IS Phe Asp <210> 69 <211> 2050 <212> DNA <213> <22 0> <221> Sequência codificadora e flanqueadora de pTTOD(gH3gL3
Fab' IGS-2) 78 <4Ο0> 69 aattctcatg tttgacagct tatcatcgac tgcacggtgc accaatgctt ctggcgteag . 60 gcagccatcg gaagctgtgg tatggctgtg caggtcgtaa atcactgcat aattcgtgtc 120 gctcaaggcg cactcccgtt ctggataatg ttttttgcgc cgacatcata acggttctgg 180 caaatattct gaaatgagct gttgacaatt aatcatcggc tcgtataatg tgtggaattg 240 tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gcgatgagct tggctgcagg tcgagttcta 300 gataacgagg cgtaaaaaat gaaaaagaca gctatcgcaa ttgcagtggc cttggctggt 360 ttcgctaccg tagcgcaagc tgatatccag atgacccaga gtccaagcag tctctccgcc 420 agcgtaggcg atcgtgtgac tattacctgt cgtaccagtg gcaacatcca taattacctg 480 acgtggtacc agcaaaaacc gggcaaagcc ccgcagctcc tgatctataa cgcgaaaacg 540 ctagcagacg gtgtgccaag ccgtttcagt ggcagtggea gcggtactca gtttaccctc 600 acaatttcgt ctctccagcc ggaagatttc gccaattact attgtcagca cttttggagc 660 ctgcctttca ccttcggtca gggcactaaa gtagaaatca aacgtacggt agcggcccca 720 tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg 780 tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc 840 ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac 900 agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc 960 tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctca ccagtaacaa aaagttttaa tagaggggag 1020 tgttaaaatg aagaagactg ctatagcaat tgcagtggcg ctagctggtt tegecaccgt 1080 ggcgcaagct gaggttcagc tggtcgagtc tggaggcggg cttgtccagc ctggagggag 1140 cctgcgtctc tcttgtgcag caagcggctt cgacttttcc cgttacgata tgtcctgggt 1200 gcggcaggca cctgggaagc gcctggagtg ggtggcatac attagctccg gaggcggctc 1260 tacatacttc ccggacaccg tcaagggccg tttcaccatt tcccgggaca atgcaaagaa 1320 taccctttac ctccagatga actctctccg cgcagaggac acagcagtgt attactgtgc 1380 acggcagaac aagaaactga cctggtttga ctactgggga caggggaccc ttgtgacagt 1440 ctcctctgct tctacaaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac 1500 ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac 1560 ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca 1620 gtcctcagga ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac 1680 ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtcg acaagaaagt 1740 tgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcgccgcg tgatgaggat ccaagcttgc 1800 ggocgcgaat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac 1860 ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tcgcgtaata gcgaagaggc 1920 ccgcaccgat cgccottocc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gcctgatgcg 1980 gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc ataaattccc tgttttggcg 2040 gatgagagaa 2050 <210> 70 <211> 235 <212> PRT <213> <400> 70
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Vai Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Vai Ala Gin Ala Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu 20 25 30 Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gly 35 40 45 Asn Ile His Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Vai Pro 65 70 75 80 79
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Asn Tyr Tyr Cys Gin His Phe 100 105 110 Trp Ser Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 14 S 150 155 150 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 155 170 175 Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser ΊΟ Λ 1U u 185 η βλ Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 Lys His Lys val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 210 215 220 Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235
<210> 71 <211> 251 <212> PRT <213> 80 <400> 71
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Xle Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gin Ala Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30 Vai Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Asp Phe Ser Arg Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Arg Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Phe Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gin Asn Lys Lys Leu Thr Trp Phe Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 145 150 155 160 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe pro Glu Pro 165 170 175 Vai Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 1B0 185 190 Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 195 20 0 205 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn 210 215 220 Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 225 230 235 240 Lys ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Ala Ala 245 250 <210> 72 <211> 59 <212> DNA <213> <220> <221> Sequência Complementar de IC8gL2 81 <4Ο0> 72 aeeagpgsfc gegsggeSi jscst tgct^tss §§ <210> 73 <211> 59 <212> DNA <213> <22 0> <221> Sequência Complementar de IC8gL3 <400> 73 «*ãgegt& âícsgp^t gegg^ettt gcesggsa t§6Çg$&e si <210> 74 <211> 15 <212> PRT <213> <400> 74
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 15 10 15 <210> 75 <211> 12 <212> PRT <213> <400> 75
Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Iso Lys 15 10
Lisboa, 15 de Dezembro de 2011

Claims (26)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo neutralizador com especificidade para a IL-Ιβ humana compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 5 para CDR-H1, a sequência apresentada na SEQ ID NO: 6 para CDR-H2 e a sequência apresentada na SEQ ID NO: 7 para CDR-H3, e em que o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 8 para CDR-L1, a sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 para CDR-L2 e a sequência apresentada na SEQ ID NO: 10 para CDR-L3.
2. Anticorpo neutralizador de acordo com a reivindicação 1, em que o referido anticorpo neutralizador é uma molécula de anticorpo com CDRs enxertadas.
3. Molécula de anticorpo da reivindicação 2, em que o domínio variável compreende regiões de arcabouço aceitadoras humanas e CDRs dadoras não humanas.
4. Anticorpo com CDRs enxertadas de acordo com a reivindicação 2 ou reivindicação 3, em que a cadeia pesada compreende a sequência gH3 apresentada na SEQ ID NO: 15.
5. Anticorpo com CDRs enxertadas de acordo com a reivindicação 2 ou reivindicação 3, em que a cadeia leve compreende a sequência gL3 apresentada na SEQ ID NO: 20.
6. Anticorpo com CDRs enxertadas de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 até 5, em que a cadeia pesada compreende a sequência gH3 apresentada na SEQ ID NO: 15 e a 2 cadeia leve compreende a sequência gL3 apresentada na SEQ ID NO: 20.
7. Anticorpo neutralizador de acordo com a reivindicação 1, possuindo uma cadeia pesada compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 3 e uma cadeia leve compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 4.
8. Molécula de anticorpo neutralizador de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 7, em que a molécula de anticorpo é uma molécula de anticorpo completa possuindo cadeias pesada e leve completas.
9. Molécula de anticorpo neutralizador de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 7, em que a molécula de anticorpo é um fragmento Fab, Fab', F(ab')2, Fv ou scFv.
10. Molécula de anticorpo neutralizador de acordo com a reivindicação 9 possuindo, na extremidade do terminal C da sua cadeia pesada, uma região conetora modificada contendo um ou dois resíduos cisteina aos quais pode ser ligada uma molécula efetora ou repórter.
11. Molécula de anticorpo neutralizador de acordo com a reivindicação 10, possuindo uma molécula efetora ou repórter ligada.
12. Molécula de anticorpo neutralizador de acordo com a reivindicação 11, em que a molécula efetora compreende um ou mais polímeros.
13. Molécula de anticorpo neutralizador de acordo com a reivindicação 12, em que o um ou mais polímeros consiste(m) 3 em polímero opcionalmente substituído de polialquileno, polialcenileno ou polioxialquileno de cadeia linear ou ramificada ou um polissacárido ramificado ou não ramificado.
14. Molécula de anticorpo neutralizador de acordo com a reivindicação 13, em que o um ou mais polímeros consiste(m) em metoxipoli(etilenoglicol) ou poli(etilenoglicol).
15. Molécula de anticorpo neutralizador de acordo com a reivindicação 11 tendo ligado, a um dos resíduos cisteína da extremidade do terminal C da cadeia pesada, um grupo lisil-maleimida ou lisil-bis-maleimida, em que cada grupo amino do resíduo lisilo está ligado de modo covalente a um resíduo metoxipoli(etilenoglicol) com um peso molecular de cerca de 20 000 Da.
16. Molécula de anticorpo neutralizador de acordo com a reivindicação 1, que é um fragmento Fab modificado possuindo uma cadeia pesada compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 15 e uma cadeia leve compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 20, e possuindo, na extremidade do terminal C da sua cadeia pesada, uma região conetora modificada contendo um resíduo cisteína ao qual pode ser ligada uma molécula efetora ou repórter.
17. Molécula de anticorpo neutralizador de acordo com a reivindicação 1, que é um fragmento Fab modificado possuindo uma cadeia pesada compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 15 e uma cadeia leve compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 20, e possuindo, na extremidade do terminal C da sua cadeia 4 pesada, uma região conetora modificada contendo um residuo cisteina ao qual está ligada uma molécula efetora ou repórter.
18. Molécula de anticorpo neutralizador de acordo com a reivindicação 17, em que a sua cadeia pesada compreende ou consiste nos resíduos de aminoácidos números 22 até 251 da sequência apresentada na SEQ ID NO: 71, e em que a sua cadeia leve compreende ou consiste nos resíduos de aminoácidos números 22 até 235 da sequência apresentada na SEQ ID NO: 70.
19. Molécula de anticorpo neutralizador de acordo com a reivindicação 17 ou reivindicação 18, tendo ligado ao resíduo cisteina da extremidade do terminal C da cadeia pesada um grupo lisil-maleimida, em que cada grupo amino do resíduo lisilo está ligado de modo covalente a um resíduo metoxipoli(etilenoglicol) com um peso molecular de cerca de 20 000 Da.
20. Sequência de DNA isolada que codifica a(s) cadeia (s) pesada e/ou leve de uma molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 19.
21. Vetor de clonagem ou expressão compreendendo uma ou mais sequências de DNA de acordo com a reivindicação 20.
22. Vetor de acordo com a reivindicação 21, em que o vetor compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 69.
23. Célula hospedeiro compreendendo um ou mais vetores de clonagem ou expressão de acordo com as reivindicações 21 ou 22 . 5
24. Processo para a produção da molécula de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 até 19, que compreende cultivar a célula hospedeiro da reivindicação 23 e isolar a molécula de anticorpo.
25. Composição farmacêutica compreendendo uma molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 19 em combinação com um ou mais de um excipiente, diluente ou transportador farmaceuticamente aceitável.
26. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 25, que compreende adicionalmente outros ingredientes ativos. Lisboa, 15 de Dezembro de 2011
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