JPH04501505A - Ａ型人体モノアミンオキシダーゼのｄｎａの構造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ａ型人体モノアミンオキシダーゼのＤＮＡの構造発明の背景 本発明は、人体モノアミンオキシダーゼＡ及び組換えＤＮＡ技術に関する。

モノアミンオキシダーゼ（モノアミン：　０２オキシドレダクターゼ、ＥＣ［１ ，４，３，４，コ　、ＭＡＯ）は、幅広く種々のダイエタリアミンや、ドーパミ ン、ルピネフリン及びセロトニン等の神経伝達物質の酸化的脱アミノ反応を触媒 する。ＭＯＡは、ミトコンドリア外側膜において必須なタンパク質であり、全種 類の細胞に存在している。等酵素型（Ａ型及びＢ型）のものが確認されており、 これらは近似してはいるが互いに異なるタンパク質がら構成されていると信じら れている。

ＭＡＯは、数多くの神経生理系疾患の状態に関わっており、ＭＡＯ抑制剤は抗欝 薬として用いられてきた。ＭＡＯ−Ｂは、神経毒（二二一口トキシン）１−メチ ル−４−フェニル−１，２，３，６−チトラハイドロピリジン（ＭＰＴＰ）を、 パーキンソン症候群を顕現させる活性状態に代謝させる（Ｍａｒｋｅｙ　ｅｔａ 　１．．１９８４）。また、種々の精神異常患者において、ＭＡＯ活性が正常レ ベル以下になっていることが見いだされている。

人体ＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ−Ｂの遺伝情報は、おそらくＸ染色体上のそれぞれ近 接した別個の遺伝子上に存在していると見られる。顕微鏡で検出できないほどの 小さな欠失が人体Ｘ染色体上のＸｐＨ，３領域でおこると、人体内でのＭＡＯ− Ａ及びＭＡＯ−Ｂの生理活性が損なわれることになる。

発明の要約 略言すれば、本発明は、人間の完全なモノアミンオキシダーゼの遺伝情報を有す るＤＮＡを含むベクターに関するものである。以下の詳細な説明より明らがとな ろうが、「人間の完全なモノアミンオキシダーゼＡ」とは、生理活性を示すＭＡ Ｏ−Ａ分子を指す。従って、それがここで意味する範躊は広く、次のようなりＮ Ａ配列を十分に含む：　即ち、少なくとも人間の完全なＭＡＯ−Ａの遺伝情報を 有し、かつ人間あるいは人間以外（例えばウシ、イーストまたはバクテリアの） のり−ダ配列及びハイブリッドリーダ配列をもコード化可能なりＮＡ配列（ゲノ ムまたは、より好適にはｃＤＮＡ）を十分に含むものである。

大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）にＭＡＯ−Ａポリペプチドを生産させるにおいては、Ｍ ＡＯ−Ａの遺伝情報を有するＤＮＡは、調１ＤＮＡの制御かにあるのが好ましい 。そして、それはプロモータとタンパク質を合成させる信号を作成するものであ る。最も好適であるのは、プロモータがｌａｃで信号がＯｍｐＡまたはｐｈ。

Ａ１またはｐｅｌＢである場合である。イーストの場合には、ＭＡＯ−Ａ　ＤＮ ＡはＭＦ（アルファ）１プロモ一タ信号の制御下にある。哺乳動物の場合は、Ｍ ＡＯ−Ａ　ＤＮＡは干渉を受ける長い繰り返し配列の制御下にある。

ＭＡＯ−Ａ　ＤＮＡは、ＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ−Ｂ遺伝子生成物が関わった疾病 に対し、治療及び診断両面で利用可能である。例えば、ＭＡＯ−Ａ遺伝子は、精 神障害や精神病の候補遺伝子であるから、ＤＮＡまたはＲＮＡは、診断面ではＭ ＡＯ−Ａ遺伝子変異または点突然変異の検出手段（プローブ）として使用するこ とができる。或は、そう欝病やＭＡＯ抑制剤による処置を必要とするようなもの を含む精神状態に伴うことのある、ＭＡＯＲＮＡレベルの変動検出手段としても 使用可能である。ＭＡＯ−Ａ遺伝子はまた、治療面においてＭＡＯ欠失を矯正す るための遺伝子治療用としても使用できる。

本発明のベクターは、Ｅ、ｃｏｌｉ細胞やイースト細胞（好適には５ａｃｃｈａ ｒｏｉｖｃｅｓ　ｃｅｒｃｖｉｓｆａｅ）の変換、或は生物学的に活性な人体Ｍ ＡＯ−Ａの生成を目的として、ＮＩＨ３Ｔ３またはＢＨＫ２１細胞等の哺乳動物 細胞を感染させるためにも用いられる。ＭＡＯ−Ａポリペプチドは、治療面では 精神異常の治療に有効なＭＡＯ抑制剤の開発に使用することができ、また或種の 食物の消化中放出されるモノアミンを代謝するためにも用いられる。後者の場合 、モノアミンオキシダーゼが薬剤によって抑制されている患者の体内では、モノ アミンは色伝達物質として作用する。更に、純粋再結合ＭＡＯ−Ａは、ＭＡＯ不 全患者の治療用としても使用可能である。ＭＡＯ−Ａは、更にまた診断面では、 人体の疾病に伴って変動するＭＡＯ酵素レベルを調べるために有用な単クローン 抗体を生成するためにも使用できる。

本発明の他の特徴及び利点は、好適な実施例に係る以下の説明及びクレームより 明らかとなろう。

好適な実施例の説明 まず、各図面の簡単な説明する。

図面 第１図は、その派生（ＤＥＤＵＣＥＤ）　Ｄ　Ｎ　Ａ配列が合成４７−ｓｅｒの 検出手段を生成するために使用されるペプチドである。

第２図は、人体ＭＡＯ−Ａ　ｃＤＮＡＳＨＭＩ　１の完全核酸配列及び対応アミ ノ酸配列である。

ＭＡＯ−Ａ遺伝子複製の一般的手法 人体ＭＡＯ−Ａ　ｃＤＮＡは、人体肝臓ｃＤＮＡ及び人体胎盤ｃＤＮＡのライブ ラリーから分離され、これがその後人体の通常のゲノムライブラリーからゲノム ＭＡＯ−Ａ遺伝子を分離するために用いられる。人体ＭＡＯ−Ａのゲノム及びｃ ＤＮＡ配列を得るための手法は次のようになる。まず、ウシのＭＡＯ−Ｂペプチ ドフラグメントを精製し、配列する。この配列を用いてウシｃＤＮＡライブラリ ーの検出手段が生成される。ウシｃＤＮＡライブラリーから、ウシｃＤＮＡが得 られる。そして、このウシｃＤＮＡは人体ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニン グ（ふるいわけ）するために使用される。こうして得られた人体ｃＤＮＡにより 、人体ゲノム配列が把握できることになる。

ウシＭＡＯｃＤＮＡの分離 ウシＭＡＯｃＤＮＡクローン、Ｇ１の分離は、Ｘ０Ｂ３と指定されたウシＭＡＯ −Ｂの精製フラグメントから得たアミノ酸配列情報を用いて、ジョンパラエルに より達成された。第１図はＸ０Ｂ３ペプチドのアミノ酸配列を示したものである 。これより、合成４７−ｍａｒウシ　ＭＡＯ−Ｂ　オリゴ核酸のＤＮＡ配列が導 きだされるＧ４７−ｍｅｒオリゴ核酸は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｔｏｓｙｓｔｅｍ ｓ　３８０Ａ合成機を用いた燐酸アミジン（ａｍｉ　ｄ　ｉ　ｔ　ｅ）法により 合成され、ＰＡＧＥにより精製される。１１００ｎのオリゴ核酸が、Ｔ４−ポリ 核酸キナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌ ｉｓ。

ＩＮ）を用いたＹ　［３２Ｐ］　ＡＴＰ　（７０００Ｃｉ／ｍＭｏ　ｌ、ＮＥＮ 、Ｂｏｓ　ｔｏｎ、ＭＡ）により標識される。オリゴ核酸は、適切なアミノ酸用 の最も一般的な慣用コードを用い、変性を生じさせることなく合成される（Ｇｒ ａｈｔｈａｍｅｔ　ａｌ、、１９８０．Ｎｕｃｌｃｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 、　８：４９）。こうして、４７−ｍａｒはウシｃＤＮＡライブラリーをふるい わけするためのプローブとして用いられることになる。

ｃＤＮＡライブラリーは、ウシ副腎髄質ＲＮＡを用いて構成され、その後４７− ｍｅｒオリゴ核酸によりふるいわけされ、ウシＭＡＯクローンが見い出されるこ とになる。

ポリ（Ａ）ＲＮＡは、ウシ副腎髄質から分離されると共に、ＬｏＭｅｄｉｃ。

ａｎｄ　５ａｕｎｄｅｒｓ法に従って精製される（１９７６、　Ｎｕｃ　ｌ　ｅ 　ｉ　ｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　３：　３８１）、ｃＤＮＡライブラリーは、Ｑ ｕｂｌｅｒ　ａｎｄ　Ｈｏｆｆｍａｎ法に従ってｐＢＲ３２２内で構成される（ １９８３、Ｇｅｎｅ　２５：　２６３）、ここでは、総計的１４０００の異なる コロニーがふるいわけられた。この７０００の各コロニーは２０Ｘ２０ｃｍのニ トロセルロースフィルターへ転送され、そこてＧｒｕｎｓｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｈ ｏｇｎｅｓｓ法に従って分離される（、１９７５、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａ、 Ｓｃｉ。

７２　：　３９６１）。

そして、各フィルターはハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ　ｔ。

ｎ）を行うバッファ中において３７度Ｃで４時間に亘すハイブリダイゼーション される（６ｘＳＳＣ；５ｘＤｅｈａｒｄｔ；５０ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｐｈｏｓ ｐｈａｔｅ、ｐＨ６，５；　１００　ｇ／ｍｌ　煮沸へリングＤＮＡ；　２０％ （ｖ　／　ｖ　）脱イオン化フォーママイト；　０．Ｉｇ／ｍｌデキストラン硫 酸塩、ｍｏｌ、ｗｔ、５００．０００）。その後、各フィルターはこのバッファ 内におＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションされる。ニトロセルロースフィルタ ーは、１ｘＳＳＣ１０，１％　ＳＤＳ中において３７度Ｃで３０分間に亘りバッ ファを数回取り替えながら洗浄され、−７０Ｃで強化スクリーンを用いて一夜放 置される。そしてポジティブコロニーが抽出され、同様の条件下で、再ふるいわ けされる。

１４．０００のｃＤＮＡクローンのフィールドから強力にハイブリダイゼーショ ンされた唯一のクローン（Ｇ１）が得られる。そして、制限酵素Ｐｓｔｌをプラ スミドＤＮＡに作用させることによって、５００の核酸がインサートされている ことが明らかとなった。ウシ及び人体のＭＡＯは約５９．６５０ダルトンの分子 量を有しており、これは約５２７のアミノ酸または１５８１の核酸の仮想ＤＮＡ の長さに匹敵する。このように、ウシＧ１クローンは、ウシＭＡＯタンパク質全 体をエンコードしなかったのである。

より長いウシＭＡＯクローンを得るため、Ｇ１クローンノＲＮＡ転写を行った。

このＲＮＡは、他のウシ副腎髄質ｃＤＮＡライブラリーを検査するための検査手 段として使用されているものである。（Ｉｃａｎｇｅｌｏ　ｅｔ　ａｌ、−，１ ９８６、Ｎａｔｕｒｅ　３２３：８２から得られ、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａ ｌ。

１９８２、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇに従ってふるいわけされたもの ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ、ＮＹ）、５００ｋｂから成るＧ１のインサートはｐＧＥＭ２ベクター のＰｓｔ１位置で行われ（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ　Ｗ り、ＳＰ６フアージブロモータから下流へ移動する。そして、再結合プラスミド は、ＲＮＡプローブのＳＰ６ブロモータからインサート領域までの転写のための 鋳型として用いられることになる。

ＲＮＡプローブからより大きなウシｃＤＮＡライブラリーへのハイブリダイゼー ションは、次の溶質を含有する溶液中で遂行される；即ち、２０％のフォーママ イト、６ｘＳＳＣ，５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ、（１，１ ％ＳＤＳ、０．２ｍｇ／ｍｌ　ｄｅｎａｔｕｒｅｄ　サケ精子ＤＮＡ、　０．２ ｍｇ／ｍｌイーストｔＲＮＡ、１ｍＭ　ＥＤＴＡである。培養は、５０　Ｃで４ ８時間に亘り行われる。各フィルターは２ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ中において 室温で各１０分ずつ３度洗浄され、しかるのち龜　５ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ 中において５０度Ｃで各３０分ずつ２度洗浄される。

２００．０００コロニーのライブラリーから得た全８個のポジティブは、２゜７ ｋｂまたは１．２ｋｂのインサート領域を含有していた。レストリクンヨンマッ ピングにより、１．２ｋｂのクローンは２．７ｋｂクローンのサブセットである ことが判明した。２．７ｋｂクローンの一つである３４−３Ａは、一層深い研究 のために使用された。

ウシクローンＧ１及び３４−３ＡからのレストリクジョンフラグメントはＭ１３ ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９にサブクローンされ、ＤＮＡ配列は３５Ｓ−標識ｄ ＡＴＰを用いたｄｉｄｅｏｘｙ法にて決定される（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ｅｔａｌ 、、１９８６．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４：１３８；Ｒｅｅｄ　ｅｔａｌ 、、１９８６．Ｂｉｏｔｅｅｈｎｉｑｕｅｓ　４：３０６）、Ｈｅｎ１ｋｏｆ　 ｅｔ　ａｉ、、１９８４．Ｇｅｎｅ　２８：３５１に記載されているように、エ キソヌクレアーゼＩＩＩ処理は、配列分析のために更にクローンを発生させる目 的で使用される。４７−ｍｅｒオリゴ核酸プローブと相補性の０．　５ｋｂイン サート領域は、３個のミスマツチを除き、対応するウシ肝臓ＭＡＯペプチドと同 じ配列で暗号化されていた。これら２個のウシＭＡＯクローンからの予測された アミノ酸配列とウシ肝臓ＭＡＯ−Ｂにおけるトリプシンペプチドのタンパク質配 列から得られたアミノ酸配列とを比較した結果、全体として７３９６が一致して いた。これにより次のようなことか推察される。即ち、Ｇ１及び３４−３Ａクロ ーンはＭＡＯ−Ｂペプチド配列から導き出されたオリゴ核酸プローブを用いて確 認されたが、分離されたｃＤＮＡクローンはＭＡＯ−Ａクローンである、という ことである。

人体ＭＡＯ−Ａ　ｃＤＮＡの分離 人体ＭＡＯ−Ａ　ｃＤＮＡクローンを分離するために、３４−３ＡウウシＡＯｃ ＤＮＡクローンをプローブとして用いて、人体肝臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｋｗ ｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、１９８５．Ｂｉｏｃｈｅｍ、２４：５５６）及び人体胎ｆ ｉｃＤＮＡライブラリーがふるいわけされた。人体肝臓はＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ −Ｂ双方が存在するのに対して、人体胎盤ではＭＡＯ−Ａのみである。人体肝臓 ライブラリーからは２．０キロベース（ｋ　ｂ）インサート領域を含みポジティ ブクローンの一種であるＨＭＩＩが得られた。一方、人体胎盤ライブラリーから は、２．８ｋｂ、２．５ｋｂ、０．５ｋｂ及び０．２ｋｂの各インサート領域を 含有した４個のポジティブクローンがウシｃＤＮＡプローブを用いて確認された 。これらは、これらのポジティブクローンからのインサートＭ１３ｍｐ１８のベ クターにサブクローンされ、さらにｄｉｄｅｏｘｙ法により配列が決定される（ Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ｅｔ　ａｌ、、５ｕｐｒａ；Ｒｅｅｄ　ｅｔ　ａｌ、、５ｕ ｐｒａ）。そして、肝臓ｃＤＮＡクローンの配列決定を容易化するために方位性 除去処理が施され、不明瞭領域を解読するために合成位置特定ｐｒｉｍｅｒを用 いて解決される。

人体肝臓からの２．０ｋｂ　ｃＤＮＡであるＨＭｌｌの完全配列を第２図に示す 。これには５２７のアミノ酸の開放読み出しフレーム（ｏｐｅ、ｎ　ｒｅａｄｉ ｎｇ　ｆｒａｍｅ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ）が含まれている。これらのア ミノ酸は、核酸５１におけるＡＴＧから始まり、核酸１６３２におけるＴＧＡで 終っている。導き出されたタンパク質における１６１のアミノ酸のうち１５６を 人体胎盤ＭＡＯ−Ａからのタンパク質分解ペプチドと比較してみると、その９７ ％が全く同じであった。更に、人体胎盤からの４個のｃＤＮＡの部分配列によっ て、ｒＨＭｌｌはＭＡＯ−Ａクローンである」という確証が得られた：即ち、比 較された１、２領域におけるＨＭＩＩと人体胎盤クローンとの間には、９９％以 上の同一性があったのである。そして、ＨＭｌｌとＭＡＯ−Ａペプチド（Ａｓｐ −１５０，Ａｓｐ−１５３，Ｇｌｙ　２２４．Ｇｌｎ−２２５及びＭｅｔ−２３ １）との間にミスマツチが生じた位置では、長いほうの２個の胎盤クローンとＨ Ｍｌｌ肝臓クローンとは互いに等しいアミノ酸を含有していたのである。従って 、これらのミスマツチがＤＮＡのクローニング及び配列技術が原因で発生したと は殆ど考えられないのであり、そうではなくてＤＮＡの多形性または不均質性Ｍ ＡＯ−Ａサブユニットの存在により説明がつくと思われる。

ＨＭＩコ肝臓クローンは、高等な真核細胞における翻訳の最適開始のために最適 なコンセンサス配列と同一の配列を有する核酸を含有している（Ｋｏｚａｋ。

１９８６、Ｃｅ１ｌ　４４：２８３）：即ち、ヒトＨＭＩＩの第１ＡＴＧ周囲の ２個の核酸、Ａ配置された３個のベース上流（第２図における核酸４８）、及び Ｇ直下流（核酸５４）である。ＨＭｌｌの核酸配列は、全暗号領域を通じてその 約８８％がウシＭＡＯ−ＡのｃＤＮＡと相同である。これに対して、第１　ＡＴ Ｇから上流側の配列は著しい放散状を呈しており、２６の核酸の内、僅か１１だ けがマツチしている。このことは、５°の未翻訳領域の存在とも合致している。

ＨＭｌｌの第１フレーム内のストップコドンは、更に２個のストップコドンであ るＴＧＡ及びＴＡＡより下流側に約６０の核酸が続いている。３の端に現れたＡ のストリング（ｓｔｒｉｎｇ）は、位置１８７０周囲においてポリアゾニレ−ジ ョン信号（ｐｏ　１　ｙａｄｅｎｙ　ｌａ　ｔ　ｉ　ｏｎｓ　ｉ　ｇｎａ　１） ＡＡＴＡＡＡから始まっている。導き出されたタンパク質５９．６７７において 検出された分子量は、生化学的にめられた値と合致していた（Ｃａｗｔｈｏｎ　 ｅｔ　ａｌ、、１９８１、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、３７：３６３）、このような特 徴は、ＨＭＩＩがＭＡＯ−Ａ用の暗号化領域を完全に含んでいることを示してい る（Ｅ、ｃｏｌｉｃｅｌｌｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ＨＭＩＩ　ｈａｖｅ　ｂ ｅｅｎ　ｄｅｐ。

５ｉｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ａｎｄ　ａｓｓｉｇｎｅｄ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕ ｍｂｅｒ　６７７４０．）。

人体ＭＡＯ−Ａ　ゲノムＤＮＡの分離 ＭＡＯ−Ａを暗号化したゲノムクローン（Ａ２）は、プローブとしてのＨＭｌｌ から得たＭＡＯ−Ａ暗号化インサートを用いることにより、人体ゲノムコスミド ライブラリーから分離された。ライブラリーは、コスミドベクターＣ２ＸＢに挿 入された人体ゲノムＤＮＡから構成された（Ｂａｔｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８ ３、Ｇｅｎｅ２６：１３７；　Ｂａｔｅｓ　ｅｔ　ａｔ、、１９８７．Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５３：８２）、Ａ２クローンは約３０ｋｂのゲノム ＤＮＡインサート領域を含み、その内部には同時にＭＡＯ−Ａを暗号化するエク ソンが配置されている（Ｅ、ｃｏｌｉ　ｃｅｌｌｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＡ２ ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａ ｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、ａｎｄ　ａｓｓｉｇｎ ｅｄ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ　６７７４１．）。

Ｅ、ｃｏｌｉにおける人体ＭＡＯの発現人体ＭＡＯ−Ａ遺伝子は、プラスミドの ｐＵＣ族に基づくベクターを用いることにより、バクテリアホスト細胞すなわち 、Ｅ、ｃｏｌｔにおいて好適に発現する（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　ｅｔ 　ａｌ、、　１９８５．Ｇｅｎｅ　３３：１０３）。これらのプラスミドはｌａ ｃ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｏｐｅｒａｔｏｒ（ｌａｃ　Ｐｌｏ）を含む。これは、 イソプロピル−ベーター〇−ジオガラクトシド（ＩＰＴＧ）により誘引される（ Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｕｐｒａ）。処理されたタ ンパク質の膜をＥ、ｃｏｌｉの原形質周囲へ転座させて培地へ分泌させるために 、次のような遺伝子のり−ダ配列が用いられる：　（１）外膜タンパク質Ａ　（ ｏｍｐＡ）（Ｍｏｖｖａ　ｅ　ｔ　ａ　１．．１９８０、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ、２５５：２７）、（２）アルカリンフォスファターゼ（ｐｈｏＡ）（Ｉｎｏ ｕｙｅ　ｅｔ　ａｌ、、１９８２．Ｊ、Ｂａｃｔ。

、１４９：４３４）、または（３）ベクターゼ　リアーゼ（ｐ、ｅ　ＩＢ）　（ Ｌｅ　ｉｅｔ　ａｌ、、１９８７．Ｊ、Ｂａｃｔ、１６９：４３７９）、ｃＤＮ ＡクローンであるＨＭｌｌからのＭＡＯ−Ａ暗号領域は、標準ＤＮＡ方法に従っ てＤＮＡフラグメントを正確に融合して信号配列を暗号化することができる。リ ボゾーム結合位置は、効率よく翻訳開始させるために暗号領域に先行している。

結合ＤＮＡは従来の技術に従ってＥ、ｃｏｌｔへ変換させることができ、再結合 プラスミドを含有する変換体は制限酵素分析により証明することができる。そし て、人体ＭＡＯ−Ａポリペプチドはプラスミド担持株により生成され、培地また は細胞ライザーテから精製される。もし人体ＭＡＯ−ＡポリペプチドがＥ、ｃｏ ｌｉブロテオリティク酵素により変性することが見いだされたならば、ポリペプ チドの有効表式は、Ｓｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７．Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　 Ｅｎｚｕｍｏｌｏｇｙ　１５３：３８５に記述されているように、抗プロテアー ゼアミノ酸リーグ配列の形式で小さな保護「キャップ」を設定することで得るこ とができる。

イースト中における人体ＭＡＯ−Ａの発現ＭＡＯ−Ａ遺伝子は、イースト中では イーストのベクターｐアルファＣ３を用いて発現する。ｐアルファＣ３は、ＭＦ 　１構造遺伝子を含む１．７ｋｂイーストゲノムフラグメント、そのｐｒｏｍｏ ｔｅｒ、及びｐＢＲ３２２に基づくベクターから成る（Ｚｓｅｂｏ　ｅｔ　ａｌ 、、１９８６＋　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２６１　：　５８５８）。ＭＡＯ−Ａ　（、その両端は、必要に応じて適切なア ダプタまたはりインカー配列で変更することができる（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ 　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ））を暗号化するＨＭＩＩからのフラ グメント（断片）を、ファクター下流側におけるｐ　Ｃ３のＨｉｎｄｌｌｌ−３ ａｉｌフラグメントの代わりに挿入することが可能である。これにより、Ｌｙｓ −Ａｒｇジペプチドが、ＭＡＯ−Ａの第１コドンの直上流側に位置することにな る。Ｌｙ　ｓ　−Ａ　ｒ　ｇユニットはＫＲエンドプロテアーゼのための認怠位 置を形成すると共に、ファクター配列がファクターペプチドと人体ＭＡＯ−Ａと の間のハイブリッドタンパク質から離れられるように導入される。ＭＡＯ−Ａ遺 伝子に融合されたＭＦ　１配列を含有するＢａｍＨＩイーストフラグメントは、 イースト中における表式のため、唯一のＢａｍＨＩを含むｐＹＥベクターなどの イーストに基づくベクターへ転写されなければならない。

再結合ＤＮＡをイースト、好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｖｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ種のイーストへ変換した後、変換体は、ＭＦ　１−人体ＭＡＯ−Ａ融 合ペプチドを生成するために適切な条件下で培養することができる。暗号化され た生成物は、ネイティブファクター前駆物質の最初の８３アミノ酸を含む。この 前駆物質は、イースト中の融合ポリペプチドを分泌するための信号ペプチド配列 を含む。この融合ポリペプチドはＫＲプロテアーゼ認識配列を含むので、８３ア ミノ酸前駆物質は当然細胞中においてＭＡＯ−Ａポリペプチドから処理されるこ とになる。Ｃ０ＯＨｔｅｒｍｉｎｕｓは成熟させるためのプロテオリティク処理 を必要としない。理由は、翻訳終末コドンがＭＡＯ−Ａ遺伝子の端末に存在して いるからである。

哺乳動物細胞における人体ＭＡＯ−Ａの発現人体ＭＡＯ−Ａは、レトロウィルス シャトルベクター　ｐＺＩＰ−ＮｅｏＳＶＸなどの適切な哺乳動物細胞ベクター を用いて、Ｎ　Ｉ　Ｈ３Ｔ　３またはＢＨＫ２１細胞等の哺乳動物細胞内で発現 することが出来る（Ｃｅｐｋｏ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８４、Ｃｅ１ｌ　３７：　１０５３）、更に、メタロテイオネインｐｒｏｍ ｏｔｅｒ　（Ｃｈｏｏ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６．ＤＮＡ５：５２９）もまたＭ ＡＯ−Ａ遺伝子の上側へ挿入可能であり、これによってＭＡＯ−Ａ表式を誘導で きる。

ＨＭｌ、１クローンからのＭＡＯ−Ａ暗号化抑制（制限）フラグメント（制限酵 素によってきられたフラグメント）は、適切なアダプタ配列を用いることにより ＳＶＸベクターの長期反復配列（ＬＴＲ）から下流側のＢａｍＨＩ位置に挿入す ることができる。例えば、人体ＭＡＯ−Ａ遺伝子をＨＭＩＩ細胞から除去し、制 限酵素ＥｃｏＲＩ、Ｄｒａｌを用いた第１消化（ｄｉｇｅｓｔ）によりＳＶＸへ 挿入してＭＡＯ−Ａ暗号化フラグメントを分離することが可能である。フラグメ ントのＥｃｏＲＩ−ＤｒａＩ端はその後ＤｒａＩ／ＢａｍＨＩアダプタを用いて ＢａｍＨＩ端へ変換され、そしてＢａｍＨＩ　ＭＡＯ−ＡインサートはＢａｍＨ Ｉが作用（ｄｉｇｅｓｔ）にＳＶＸへ結合されることとなる（ＨＭＩＩクローン またはＳｖＸベクター内における任意の他の適切な制限位置が使用可能）。結合 ＤＮＡはＥ、ｃｏｌｔへ変換（形質変換）可能である。理由は、ＳＶＸベクター はＥ、ｃｏｌｉと哺乳動物細胞との間で往復してＭＡＯ−Ａ−８ＶＸ再結合クロ ーンを選択し、その後ＮＩＨ３Ｔ３またはＢＨＫ２１細胞へ感染可能であるがら である。１０％のｃａｌｆ　ｓｅｒｕｍにより補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏの改 良されたＥａｇｌｅの媒体中に保持されたＮＩＨ３７３細胞は、Ｐａ　ｒｋｅ　 ｒａｎｄ　５ｔａｒｋ　（１９７９，Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、３１：３６０）により改 良されたＧｒａｈａｍ　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂのカルシウム燐酸塩技術 を用いてＭＡＯ−Ａ−８ＶＸシヤトルベクターに感染させることが可能である。

同様に、ＢＨＫ２１細胞はＷｉｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、のカルシウム燐酸塩法（ １９７８、Ｃｅ　１１１４　：　７２５）を用い、ＧＩＢＣＯ媒体内の６４１８ 抵抗を選択することにより、感染させることができる。

ＭＯＡ−Ａタンパク質の精製 上述したシステム内で表現（発現）された再結合ＭＡＯ−Ａは、Ｗｅｙｌｅｒａ ｎｄＳａ　１　ａｃｈの処理方法（１９８５、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｂ、ｅｍ、　２ ６０：　１３１９９）に従って、細胞上澄から精製することができる。

診断及び治療上の使用 人体ＭＡＯ−Ａ遺伝子またはその補足ＲＮＡは、Ｐ、ＩＡＯ−ＡＳＭＡＯ−Ｂ遺 伝子及び遺伝子生産物に関わる疾病の診断及び治療に使用できる。例えば、人体 のＭＡＯ−Ａ遺伝子が変性すると変化したタンパク質の遺伝子表式または遺伝子 生産に変化が現れ、この結果精神障害、そう欝病、精神病などの異常や、再配列 、点突然変異、またはＭＡＯ−Ａ　ＲＮＡのレベルに変化を来す調節変異、等が ＭＡＯ−Ａ　ＤＮＡ　またはＲＮＡを診断上使用することで検出できる。遺伝子 変化を検出するための３通りのシステムを次に述べる。

ＭＡＯ−Ａ　プローブ ＭＡＯ−Ａ　ＤＮＡまたはＲＮＡは放射線標識可能であり、Ｍａｎｉａｔｉｓｅ ｔ　ａｌ、、５ｕｐｒａにより記述されているように、全人体ＤＮＡ中のＭＡＯ −Ａ遺伝子を検出するために５ｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔにおけるプローブとし て使用できる（ＭＡＯ−Ｂ遺伝子は、もし例えばハイブリダイゼーション温度ま たは塩分濃度などの或種のパラメータが変化した場合にこの技術を利用して検出 することができる）。ＭＡＯ−Ａ　ＤＮＡプローブを準備するため、ＨＭｌｌの ＥｃｏＲＩフラグメントを暗号化するＭＡＯ−Ａは周知の手順で分離しまたＭａ ｎｉａｔｔｓ　ｅｔ　ａｌ、、５ｕｐｒａに記載されているような方法で放射線 標識することが可能である。ＭＡＯ−Ａ　ＲＮＡ　プローブをＴ＄備するため、 ＭＡＯ−Ａ　ＥｃｏＲＩ　ＤＮＡ　フラグメントはベクターＳＰ６　（Ｐｒｏｍ ｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈにより得られる）へ挿入可能であり、ＭＡＯ−Ａ　ＤＮ Ａのセンス　ストランドは放射性核酸の存在下における転写のための鋳型として 使用することができる。

ＤＮＡプロット分析 放射性ＤＮＡまたはＲＮＡプローブは、−または複数の制限酵素により解析され た全人体ＤＮＡ中におけるＭＡＯ−Ａ遺伝子の検出に使用できる。このプローブ は、ＭＡＯ−Ａ遺伝子の一部または全部を含む−または複数の制限酵素フラグメ ントを確認する。ＭＡＯ−Ａ遺伝子の粗再配列は、遺伝子内または近傍の２つま たはそれ以上位置においてＤＮＡを開裂させる制限酵素を用いても検出可能であ る。一方、遺伝子の微小領域に関する再配列は、もし遺伝子内部またはその近傍 の多くの位置でＤＮＡを開裂する制限酵素が使用された場合には検出される可能 性が高い。ＭＡＯに関する異常が疑われる個体からのサンプル人体ＤＮＡは健唐 な個体からの人体ＤＮＡと比較され、異常な消化パターンが現れている場合にＭ ＡＯに関わる異常が生じていることが確認されることになる。

ＲＦＬＰ及び結合分析 ランダムに抽出された各ＤＮＡサンプルは異なる制限酵素を用いることにより、 ＭＡＯ−Ａの発現配列と介在配列とにおける単一の核酸の相違を見いだすために スクリーンすることができる。即ち、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、５ｕｐ ｒａに示されるように酵素によってＤＮＡサンプルを開裂（ｄｉｇｅｓｔ）させ 、生じた制限フラグメントを５ｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ　上に分離させるので ある。ＭＡＯ−Ａ　ｃＤＮＡクローンは、ＭＡＯ−Ａ位置と病状との関係を調べ るために使用されるＥｃｏＲＶ　ＲＦＬＰを検出する。ＭＡＯ−Ａゲノムクロー ンは、例えばＭｓｐｌ　ＲＦＬＰ等のＭＡＯ−Ａ遺伝子中の制限フラグメント長 さポリモルフィスムス（ＲＦＬＰｓ）を検出するためにも使用可能である。Ａ２ ゲノムクローンは、繰り返し配列が除去された後に、プローブとして使用できる 。

繰り返し配列の除去は、まずＥｃｏＲＩまたはＰｓｔｌ及び５ａｕ３ＡによりＡ ２クローンを消化（ｄｉｇｅｓｔ）させることにより達成できる（または、クロ ーンからのＭＡＯ−Ａインサートを除去可能な酵素とこれをフラグメント状態に 消化する酵素との適切な組み合せでもよい）。消化されたＭＡＯ−Ａ暗号化ＤＮ Ａは、その後ＥｅｏＲＩまたは（ＰｓｔＩ）及ＢａｍＨ１が消化されたｐＢＲ３ ２２ヘサブクローン化される。そして、サブクローン化されたフラグメントは放 射性人体ＤＮＡによりスクリーンされる。繰り返しＤＮＡを含むサブクローンは 強力に交雑され、排除されることになる：ネガティブサブクローンはＨＭＩＩク ローンにより再スクリーンされ、これにより得られたポジティブサブクローンが 保持され、ＲＦＬＰプローブとして用いられることになる。ＲＦＬＰ処理は、Ｄ ｒａｙｎａ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４：　４ １２　ａｎｄ　Ｗａｔｋｔｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８８．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ ｉｑｕｅｓ　６：　３１．０に記載されているような方法で遂行可能である。

リボヌクレアーゼ　Ａ　分裂アッセイ ＭＡＯ−Ａ遺伝子の欠失、挿入、転位等の変異や、５ｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌ。

ｔｔｉｎｇでは検出不可能な点突然変異でも、ＭＡＯ−Ａ　ＲＮＡ：ＤＮＡ　ま たはＲＮＡ：ＲＮＡの各二重鎖におけるミスマツチしたベース対（塩基対）での りボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅ　Ａ）により、検出可能である。人体皮膚の繊 維芽細胞やリンパ細胞は、それぞれＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ−Ｂの各ＲＮＡの源と して使用することができる。ＲＮａｓｅ　Ａの分裂アッセイは、ＲＮＡ中におけ るＲＮＡまたはＤＮＡとのハイブリダイゼーションのミスマツチ位置がＲＮａｓ ｅＡにより分裂（ｃｌｅａｖａｇｅ）されるという事実に基づくものである。

単一のＲＮＡプローブはベース交換の存在を確認するために用いることが出来、 あるいはまた一対のオーバーラツププローブは変異位置を明瞭に設定するために 使用できる。ＲＮａｓｅ　Ａの攻撃に対する感応性のための正確や必要条件は未 だ明らかではないが、ミスベアリングした潜在単一ベースの３０−５０％が分裂 （開裂）することではないかと見られている。欠失、挿入、または再配列に起因 するミスマツチの場合に、ＲＮａｓｅ　Ａ分裂が生じる可能性が大幅に高くなる 。

理由は、交雑中の単一ストランド領域が大きく拡張されるからである。ＲＮａｓ ｅＡ分裂アッセイ（Ｇｉｂｂｓ　ｅｔ　ａｌ、、により１９８７、Ｓｃ　ｉ　ｅ ｎｃｅ２３６：３０３に詳述された）は、ＨＭＩＩ　ＭＡＯ−Ａ　ｃＤＮＡから の人体ＭＡＯ−Ａ遺伝子を含む放射線標識された制限フラグメントまたはこのＤ ＮＡから合成され標識されたアンチセンスＲＮＡにより、次のように実行される 。

アンチセンスＲＮＡは、まずＭＡＯ−Ａ制限フラグメントをｐＳＰ６ベクター及 びセンスストランドからの転写ＲＮＡへ挿入することにより合成可能である。

ＤＮＡは、ＤＮａｓｅを施す処置により除去される。放射線標識されたＭＡＯ− Ａプローブは、周知の方法にて分離されたｐｏ　ｌ　ｙ　（Ａ）−ＲＮＡに交雑 される（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、５ｕｐｒａ）ｏ交雑体は、その後Ｒ ＮａｓｅＡが施されて単一ストランド領域及び内部ミスマツチ位置が消化される 。そして、これにより生じたフラグメントは、変性ポリアクリルアミドゲル電気 泳動及び放射線写真により分析される。ＲＮａ　ｓ　ｅ　アッセイの更に進めた 改良は、Ｗｉｎｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８５．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａ、 Ｓｃｉ。

８２：　７５７５．及びＭｙｅｒｓ　ｅｔ　ａｔ、１９８５．５ｃｉｅｎｃｅ　 ２３０：１２４２に開示されている。

ゲノムＤＮＡの配列 ＭＡＯ−Ａ　ｃＤＮＡ配列は、ＭＡＯ−Ａ領域における変異を走査するために用 いられる。まず、５ａＬｋｉ　ｅｔ　ａｌ、（１９８５，５ｃｉｅｎｃｅ　２３ ０　：１３５０）のＤＮＡポリメラーゼ　チェーン反応（Ｐ　ＣＲ）及びこれを 更に改良したＬｅｅ　ｅｔ　ａｌ、（１９８８，５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：１２ ８８）は、ｐｒｉｍｅｒであるＨＭＩＩからのオリゴ核酸配列を用いて、ゲノム ＤＮＡからのＭＡＯ−Ａ暗号化配列を酵素作用で増幅するために使用可能である 。

−のｐｒｉｍｅｒはＭＡＯ−Ａ遺伝子の（−）ストランドへそして他方のｐｒｉ ｍｅｒは（＋）ストランンドへそれぞれ補足しなければならない。第２に、増幅 されたＤＮＡは、ｄｉｄｅｏｘｙ法により配列される（Ｓａｗｙｅｒ、１９７７ ＰＮＡＳ　７４：５４６３；Ｒｅａｄ　ｅｔ　ａｌ、１９８６．Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｉｑｕｅｓ４：３０６）。一旦ＭＡＯ−Ａ内の変異位置における配列が決まる と、この変異位置にわたっている合成オリゴ核酸が合成され、これが、ゲノムプ ロットを選択的にハイブリダイゼーションすることにより同様の変異に対するル ーティンなスクリーニングを行うためのプローブとして用いることが可能となる 。

制限位置プローブ もし変異した配列が制限酵素認識位置内に存在しているならば、サンプルＤＮＡ は以下に述べるようにスクリーンされ得る。ゲノムＤＮＡまたは細胞ＲＮＡ内に 生じるＭＡＯ−Ａ変異は、まずＤＮＡまたはＲＮＡをハイブリダイゼーションす ることで、その配列がＭＡＯ−Ａ配列だけに固有である合成オリゴ核酸ｐｒｉｒ ｎｅｒに増幅される。野生型ＭＡＯ−Ａ遺伝子に補足する放射線標識された合成 オリゴ核酸プローブ、またはＤＮＡフラグメントは、次いで増幅ＤＮＡに／Ｘイ ブリダイゼーションされる。プローブ配列は、遺伝子変異をスパンするように選 択される。第２の参照制限酵素分裂位置もまたプローブ配列内にあるが、ここに は遺伝子変異は含まれていない。プローブが野生型ＤＮＡによってハイブリダイ ゼーションを形成した時、２個の各酵素分裂部位はそれぞれの対応酵素により消 化され、ポリアクリルアミドまたはアガローゼゲル上で視ることができるフラグ メントが生成される。しかし、プローブが変異ＤＮＡとの間でハイブリダイゼー ションした時には、このハイブリダイゼーションにはミスマツチが含まれること となり、ミスマツチを含む制限部位は制限酵素により分裂されることはなく、参 照部位だけが分裂（開裂）する。このようにして、変異ハイブリダイゼーション の消化（ｄｉｇｅｓｔ）により生成された制限フラグメントは、野生型のフラグ メントにみられるものとは違った視覚パターンをゲル上に形成することとなる。

ＲＮＡプロット分析 ＭＡＯ−Ａ　ＤＮＡまたはＲＮＡプローブは、またＭａｎｔａｔｉｓ　ｅｔａｌ 、、５ｕｐｒａに示されているように、Ｎｏｔｈｅｒｎプロットを用いて異常Ｍ ＡＯ−Ａ遺伝子発現を検出するために使用して、ＭＡＯ−Ａを暗号化するＲＮＡ を確認することができる（ハイブリダイゼーション温度または溶液濃度が調整さ れれば、ＭＡＯ−Ｂ　ＲＮＡもまたこの技術を用いたＭＡＯ−Ａ　ＲＮＡＩＩ： より検出され得る）。レギュレートリー変異または遺伝子再配列などのＭＡＯ− Ａ遺伝子異常は、異常サンプルと正常サンプルにおけるＭＡＯ−Ａ−固有ＲＮＡ 量を比較するか、または変化した転写サイズを検出することにより把握できる。

ＭＡＯ制限のアッセイ 上述したように発現し精製されるＭＡＯ−Ａポリペプチドは、成極の精神障害治 療に潜在的にを効なＭＡＯ抑制剤としてのテスト合成物として使用することがで きる。このような合成物は、アミンの酸化脱アミノ作用のＭＡＯ促進触媒に関わ る反応が生じるような条件下で、サンプルに付加することができる。この方法は 、Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｄ、　１９８６．　Ｃｅ １１．Ｍｏ１．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、６：１２１に記載されている。

ＭＡＯのアッセイ ＭＡＯ−Ａもまた診断用として使用可能であり、ＭＡＯ−Ａタンパク質またはタ ンパク質フラグメントから単クローン抗体を生成し、人体の疾病に伴う変化ＭＡ Ｏ酵素レベルを調べることができる。ＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ−Ｂ、またはＭＡＯ −Ａ単独の検出が可能な単クローン抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔ ｅｉｎ、１９７６、Ｅｕｒｏ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、６：５１１に開示されてい るような周知の方法で準備することができる。単クローン抗体は従来のＥＬＩＳ Ａに用いられ、血球や皮膚細胞等人体組織サンプルにおけるＭＡＯ酵素レベルを 検出し量子化するために用いることができる。ＭＡＯレベルが異常に高かったり 低かったりするような場合には、ＭＡＯ遺伝子に関わる遺伝子異常や成極のＭＡ Ｏにともなう疾病の徴候であると考えられる。

ＭＡＯ−Ａの治療用投薬 ＭＡＯ−Ａポリペプチドは、例えば胃など局部における食物から放出されたモノ アミンの脱アミノ化に触媒として作用し得、いわゆる「偽伝達体」と呼ばれる。

ＭＡＯ抑制剤投薬による治療をうけている患者には異常に低いＭＡＯ活性レベル が確認されており、これのために治療中はモノアミンを脱アミノ化することはで きない。この結果、モノアミンを含む食品に対する欲求が高まる。

ＭＡＯ−Ａは、０．１　５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で、必要とする患者に対して抗 酸性カプセルに充填して経口投与あるいは静脈内注射により投与できる。

ＭＡＯ−Ａ遺伝子または再結合ＭＡＯ−Ａポリペプチドは、例えばそう欝病或は Ｎｏｒｒｉｅ病を煩う患者等のＭＡＯ不全の治療のために使用できる。Ｎｏｒｒ ｉｅ病においては、ＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ−Ｂ遺伝子の双方が完全に欠落してし まっている症例がみられることがある。人体ＭＡ、Ｏ−Ａ用のｃＤＮＡクローン を、Ｎｏ　ｒ　ｒ　ｉ　ｅ病を患っている２人の男性いとこから対応遺伝子を除 去するために使用した。その結果、彼らの繊維芽細胞からは全（ＭＡＯ−Ａ活性 が検出されなかった。また、ＭＯＡ−Ｂ活性に関しては、これら両患者の血小板 及び繊維芽細胞から検出されなかった。更に、バニリルマンデリック酸（ＶＭＡ ）、ホモバニリック酸（ＨＶＡ）及び３−メトキシ−４−ハイドロキシフェニル グリコール（ＭＨＰ　Ｇ）を含有する主カテコルアミン代謝産物の彼らの尿中で 低減していたのである。このような発見により、ＭＯＡ−Ａ及びＭＯＡ−Ｂ活性 に必要な遺伝子は、患者から除去されていることが確認された。この遺伝子除去 作用は、Ｘ染色体のＸｐＨ，３領域において生じるものと信じられている。再結 合人体ＭＡＯ−Ａポリペプチドは、ＭＯＡ−Ａ不全の患者に対して投与可能であ る。或はまた、人体ＭＡＯ−Ａ遺伝子をＭＡＯ−Ａ源として、遺伝子治療に使用 することも出来る。ＭＡＯ−Ａ不全に伴う病気を引き起こし得る代謝障害が継続 して再発することに対処するため、遺伝子配列は、組織を増殖または再生するに 十分な活力をもつ細胞の内部へ発現状態で導入されなければならない。

遺伝子の形質転換（Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　）生きている動物の遺伝子形 質転換においては、非常に多くの数のセル（細胞）を効率よく形質転換する方法 が要求される。ＤＮＡ仲介（メゾイエイト）による遺伝子形質転換技術は、培養 された細胞における遺伝子形質転換実験に有用であるが、この技術は、いきてい る動物、初期培養の細胞（ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｅｒｕｓ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ）の 実験には不適当である。このため、他の非常に効率的な技術が開発された。すな わち、組み替え遺伝子は工学的ビールス個体（エンジニアード・ビールス・パー ティクル）内にパッケージされる。そして、組み替えビールスの感染（Ｉｎｒｅ ｃｔＩｏｎ　）によって細胞内に導入される。この技術は、ビールス仲介遺伝子 形質転換と呼ばれ、組み替えビールスはビールスベクターと呼ばれる。特定のケ ースにおいては、形質転換される遺伝子の特定のティッシュ（組織）にのみ発現 することが有利であり、また遺伝子の発現のレベルを調節（レギュレート）する ことが、有利である。発現ベクターは、すべてのセルにおいて機能するプロモー タまたは選択されたセルにおいて機能可能なプロモータ、すなわちシミアンビー ルス４０、またはアデノビールス　プロモータなど実質上すべてのセルにおいて ハイレベルの転写を指揮することができる（ダイレクトできる）プロモータを用 いてデザインすることができる。いくつかのプロモータは、もともと組織特定方 式（ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｌｆｌｃ　ｍａｎｎｅｒ）において、発現を指揮す る。ヘモグロビン遺伝子からのプロモータは、ある種の骨髄からのセルにおいて のみ転写を指揮する。一方、神経繊維、チイクジンＱｙｒｏｓｉｎｅ）　、ハイ ドロキシラーゼ（ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ　）　、グリアルフィプリラリイ　ア シディック　プロティン軸１１ａｌｒｉｂｒｌｌｌａｒｙ　ａｃｉｄｉｃ　ｐｒ ｏｔｅｉｎＧＦＡＰ）遺伝子からのプロモータは、神経システムのある種のセル においてのみ転写を指揮する。他のプロモータは、種々のホルモンや薬剤の存在 下でのみ活動する。このようなプロモータの発現ベクターにおける使用は、組み 替え遺伝子の転写が生体（ｖｉｖｏ）において調節（レギュレート）されている ことを許す。ＭＡＯ−Ａ欠失の患者治療法としては、ＭＡＯ−Ａ遺伝子を含むビ ールスによって、感染されている培養セルを対象領域（部位）へ移植するとよい 。

デポジット（寄託） ＨＭｌｌおよびＡ２を含む大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｔ）細胞は、１９８８年６月３０ 日にアメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション　ＡＴＣＣ（ロックビル、 メリーランド）に寄託された。ＡＴＣＣＮ０受は付は番号は、６７７４０および ６７７４１である。この寄託ブダペスト条約に基づくものである。

特表千４−５０１５０５　（７）

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）人体モノアミンオキシダーゼＡ型を暗号化する精製されたＤＮＡ。
2. （２）請求項（１）のＤＮＡであって、前記ＤＮＡはゲノミックＤＮＡを起源と する。
3. （３）請求項（１）のＤＮＡであって、前記ＤＮＡはｃＤＮＡを起源とする。
4. （４）人体モノアミンオキシダーゼＡ型を暗号化するＤＮＡを含むベクター。
5. （５）請求項（４）のベクターであって、前記ＤＮＡはブロモ−タおよびシグナ ルペプチド暗号化シーケンスを含む調節ＤＮＡのコントロールの下にある。
6. （６）請求項（５）のベクターにより形質転換された細胞。
7. （７）請求項（６）の細胞であって、細胞は細菌の細胞である。
8. （８）請求項（６）の細胞であって、細胞は哺乳動物の細胞である。
9. （９）請求項（６）細胞であって、細胞は酵母の細胞である。
10. （１０）組み替え人体モノアミンオキシダーゼＡ型を生産する方法であって、請 求項（６）の細胞を用意する工程と、培地内において、前記細胞を培養する工程 と、前記培地または培養細胞空組み替え人体モノアミンオキシダーゼＡ型を分離 する工程と、 を有する。
11. （１１）ＡＴＣＣ受け付け番号６７７４０である請求項（４）のベクターによっ て、形質転換された細菌細胞。
12. （１２）ＡＴＣＣ受け付け番号６７７４１である請求項（４）のベクターによっ て、形質転換された細菌細胞。