JPH06135998A - ヒトおよびマウスの膵炎関連タンパク質 - Google Patents
ヒトおよびマウスの膵炎関連タンパク質Info
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- JPH06135998A JPH06135998A JP4284765A JP28476592A JPH06135998A JP H06135998 A JPH06135998 A JP H06135998A JP 4284765 A JP4284765 A JP 4284765A JP 28476592 A JP28476592 A JP 28476592A JP H06135998 A JPH06135998 A JP H06135998A
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- Japan
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- pap
- pancreatitis
- dna
- rna
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 マウスＰＡＰをコードするＤＮＡおよびヒト
ＰＡＰをコードするＤＮＡが得られた。 【効果】 マウスＰＡＰをコードするＤＮＡおよびヒト
ＰＡＰをコードするＤＮＡは、強力な細菌凝集活性を有
し、タンパク性抗菌剤として作用し得るＰＡＰの製造に
有用である。さらに、ＰＡＰは、膵炎の炎症マーカーと
なり得る。
ＰＡＰをコードするＤＮＡが得られた。 【効果】 マウスＰＡＰをコードするＤＮＡおよびヒト
ＰＡＰをコードするＤＮＡは、強力な細菌凝集活性を有
し、タンパク性抗菌剤として作用し得るＰＡＰの製造に
有用である。さらに、ＰＡＰは、膵炎の炎症マーカーと
なり得る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトの膵炎関連タンパ
ク質（Pancreatitis-Associated Protein,ＰＡＰ）；該
ヒトＰＡＰをコードするＤＮＡ；マウスのＰＡＰ；およ
び該マウスＰＡＰをコードするＤＮＡに関する。
ク質（Pancreatitis-Associated Protein,ＰＡＰ）；該
ヒトＰＡＰをコードするＤＮＡ；マウスのＰＡＰ；およ
び該マウスＰＡＰをコードするＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】ＰＡＰは、急性膵炎の動物の膵液中に分
泌されるタンパク質である。このタンパク質の存在は、
Keimらのラットモデルを用いた実験によって発見された
（Keimら、Digestion 29:242-249 (1984)）。この実験
において、Keimらは、ラットにセルレイン静注およびタ
ウロコール酸の膵管内注入を行い、ラット急性膵炎モデ
ルを作成し、その膵組織、膵臓のZymogen顆粒、および
膵液をゲル電気泳動にかけ、正常なラットでは検出され
ないタンパク質のバンドを見いだした。このバンドは、
膵炎の誘発の１２時間後より検出され、３〜４日間持続
し、膵炎が治癒されていくと検出されなくなる。
泌されるタンパク質である。このタンパク質の存在は、
Keimらのラットモデルを用いた実験によって発見された
（Keimら、Digestion 29:242-249 (1984)）。この実験
において、Keimらは、ラットにセルレイン静注およびタ
ウロコール酸の膵管内注入を行い、ラット急性膵炎モデ
ルを作成し、その膵組織、膵臓のZymogen顆粒、および
膵液をゲル電気泳動にかけ、正常なラットでは検出され
ないタンパク質のバンドを見いだした。このバンドは、
膵炎の誘発の１２時間後より検出され、３〜４日間持続
し、膵炎が治癒されていくと検出されなくなる。
【０００３】その後、KeimらによりさらにラットＰＡＰ
の研究が進められ、ＰＡＰが分子量17,000、等電点（ｐ
Ｉ）８．２のタンパク質であることが予測された（Keim
ら、Gastroenterology 100:775-782 (1991)）。さら
に、ラット膵組織よりＰＡＰのｍＲＮＡに対応するｃＤ
ＮＡクローンが単離され、塩基配列も決定された（Iova
nnaら、J. Biolog. Chem. 266:24664-24669 (1991)）。
の研究が進められ、ＰＡＰが分子量17,000、等電点（ｐ
Ｉ）８．２のタンパク質であることが予測された（Keim
ら、Gastroenterology 100:775-782 (1991)）。さら
に、ラット膵組織よりＰＡＰのｍＲＮＡに対応するｃＤ
ＮＡクローンが単離され、塩基配列も決定された（Iova
nnaら、J. Biolog. Chem. 266:24664-24669 (1991)）。
【０００４】ラットＰＡＰには、膵液中に分泌されるホ
スホリパーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、トリプシン、キ
モトリプシン、あるいはエラスターゼなどのような酵素
活性はない（Keimら、Gastroenterology 100:775-782
(1991)）。さらにＰＡＰはレクチンと構造的に非常に類
似しているが、レクチンが有している血液凝集活性も有
していない。ラットＰＡＰの有している活性のうち、確
認されているのは、大腸菌の凝集活性である。従って、
ＰＡＰは、細菌感染の危険が増加する炎症や壊死の期間
中に細菌感染に対して組織を防御する重要な成分として
出現する可能性もある。
スホリパーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、トリプシン、キ
モトリプシン、あるいはエラスターゼなどのような酵素
活性はない（Keimら、Gastroenterology 100:775-782
(1991)）。さらにＰＡＰはレクチンと構造的に非常に類
似しているが、レクチンが有している血液凝集活性も有
していない。ラットＰＡＰの有している活性のうち、確
認されているのは、大腸菌の凝集活性である。従って、
ＰＡＰは、細菌感染の危険が増加する炎症や壊死の期間
中に細菌感染に対して組織を防御する重要な成分として
出現する可能性もある。
【０００５】ＰＡＰに関する研究は、これまでラットに
おいて行われているのみである。従って、ＰＡＰのさら
なる解明と利用を図るため、ヒトを含む他の動物におけ
るＰＡＰの研究が望まれている。
おいて行われているのみである。従って、ＰＡＰのさら
なる解明と利用を図るため、ヒトを含む他の動物におけ
るＰＡＰの研究が望まれている。
【０００６】
【発明の目的】本発明の目的は、ヒト由来のＰＡＰおよ
び該ＰＡＰをコードするＤＮＡ配列を提供することにあ
る。本発明の他の目的は、マウス由来のＰＡＰおよび該
ＰＡＰをコードするＤＮＡ配列を提供することにある。
び該ＰＡＰをコードするＤＮＡ配列を提供することにあ
る。本発明の他の目的は、マウス由来のＰＡＰおよび該
ＰＡＰをコードするＤＮＡ配列を提供することにある。
【０００７】
【発明の構成】発明者らは、ヒトはもちろんマウスでも
膵炎モデルが確立されていないため、ヒトおよびマウス
由来の正常膵臓細胞からＰＡＰを得ようと種々の検討を
行った。しかし、正常な膵臓中ではＰＡＰのｍＲＮＡ量
が低いためクローニングができなかった。ところが予想
外にも、ヒトおよびマウスの小腸および大腸で、ＰＡＰ
が大量に発現されていることを見いだし、本発明を完成
するに至った。
膵炎モデルが確立されていないため、ヒトおよびマウス
由来の正常膵臓細胞からＰＡＰを得ようと種々の検討を
行った。しかし、正常な膵臓中ではＰＡＰのｍＲＮＡ量
が低いためクローニングができなかった。ところが予想
外にも、ヒトおよびマウスの小腸および大腸で、ＰＡＰ
が大量に発現されていることを見いだし、本発明を完成
するに至った。
【０００８】本発明のポリペプチドは、配列表の配列番
号１の２７位のＧｌｕから１７５位のＧｌｙまでのアミ
ノ酸配列を含む。
号１の２７位のＧｌｕから１７５位のＧｌｙまでのアミ
ノ酸配列を含む。
【０００９】本発明のＤＮＡ配列は、上記ポリペプチド
をコードする。
をコードする。
【００１０】好適な実施態様によれば、上記ＤＮＡ配列
は、配列表の配列番号１の７９位のＧから５２５位のＴ
まででなる塩基配列を有する。
は、配列表の配列番号１の７９位のＧから５２５位のＴ
まででなる塩基配列を有する。
【００１１】本発明のポリペプチドは、配列表の配列番
号１の１位のＭｅｔから１７５位のＧｌｙまでのアミノ
酸配列を含む。
号１の１位のＭｅｔから１７５位のＧｌｙまでのアミノ
酸配列を含む。
【００１２】本発明のＤＮＡ配列は、上記ポリペプチド
をコードする。
をコードする。
【００１３】好適な実施態様によれば、上記ＤＮＡ配列
は、配列表の配列番号１の１位のＡから５２５位のＴま
ででなる塩基配列を有する。
は、配列表の配列番号１の１位のＡから５２５位のＴま
ででなる塩基配列を有する。
【００１４】本発明のポリペプチドは、配列表の配列番
号２の２７位のＧｌｕから１７５位のＡｓｐまでのアミ
ノ酸配列を含む。
号２の２７位のＧｌｕから１７５位のＡｓｐまでのアミ
ノ酸配列を含む。
【００１５】本発明のＤＮＡ配列は、上記ポリペプチド
をコードする。
をコードする。
【００１６】好適な実施態様によれば、上記ＤＮＡ配列
は、配列表の配列番号２の７９位のＧから５２５位のＣ
まででなる塩基配列を有する。
は、配列表の配列番号２の７９位のＧから５２５位のＣ
まででなる塩基配列を有する。
【００１７】本発明のポリペプチドは、配列表の配列番
号２の１位のＭｅｔから１７５位のＡｓｐまでのアミノ
酸配列を含む。
号２の１位のＭｅｔから１７５位のＡｓｐまでのアミノ
酸配列を含む。
【００１８】本発明のＤＮＡ配列は、上記ポリペプチド
をコードする。
をコードする。
【００１９】好適な実施態様によれば、上記ＤＮＡ配列
は、配列表の配列番号２の１位のＡから５２５位のＣま
ででなる塩基配列を有する。
は、配列表の配列番号２の１位のＡから５２５位のＣま
ででなる塩基配列を有する。
【００２０】本発明のマウスＰＡＰをコードするＤＮＡ
配列の決定方法の一例を、工程の順に説明する。
配列の決定方法の一例を、工程の順に説明する。
【００２１】（１）マウス各組織におけるＰＡＰｍＲＮ
Ａの存在 種々の正常マウスの組織からｍＲＮＡを単離し、プロー
ブとして公知のラットＰＡＰをコードする放射能標識し
たＤＮＡ断片を用いて、ノーザンブロットハイブリダイ
ゼーションを行った。マウスＰＡＰのｍＲＮＡは、従来
報告されていた膵臓だけでなく、小腸および大腸により
多く発現していることが発見された。膵臓では、クロー
ニングに用いられるほどのＰＡＰｍＲＮＡは検出され
ず、ごくわずかに検出されたのみであった。従って、目
的のマウスＰＡＰは、マウス小腸から以下の方法で得ら
れる。
Ａの存在 種々の正常マウスの組織からｍＲＮＡを単離し、プロー
ブとして公知のラットＰＡＰをコードする放射能標識し
たＤＮＡ断片を用いて、ノーザンブロットハイブリダイ
ゼーションを行った。マウスＰＡＰのｍＲＮＡは、従来
報告されていた膵臓だけでなく、小腸および大腸により
多く発現していることが発見された。膵臓では、クロー
ニングに用いられるほどのＰＡＰｍＲＮＡは検出され
ず、ごくわずかに検出されたのみであった。従って、目
的のマウスＰＡＰは、マウス小腸から以下の方法で得ら
れる。
【００２２】（２）マウスＰＡＰをコードするＤＮＡ配
列の決定 まず、マウス小腸組織細胞から、ｍＲＮＡを単離し、常
法、例えばスーパースクリプトプラスミドシステム（Ｂ
ＲＬ社製）により、ｃＤＮＡライブラリーを作成する。
次に、このｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行
って、ＰＡＰｃＤＮＡを有するプラスミドクローンを得
る。スクリーニングは、例えば上述のラットＰＡＰｃＤ
ＮＡ配列をもとに作成したプローブを標識して用いた、
ハイブリダイゼーションにより行われ得る。この陽性の
クローンに含まれるｃＤＮＡインサートをそれぞれ適当
な制限酵素で切り出し、サブクローニングを行った後、
ジデオキシ法などの公知のＤＮＡシークエンス法で塩基
配列の決定を行う。このようにして、１つのｃＤＮＡイ
ンサートから得られたマウスＰＡＰの塩基配列およびそ
れに対応するアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示
す。
列の決定 まず、マウス小腸組織細胞から、ｍＲＮＡを単離し、常
法、例えばスーパースクリプトプラスミドシステム（Ｂ
ＲＬ社製）により、ｃＤＮＡライブラリーを作成する。
次に、このｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行
って、ＰＡＰｃＤＮＡを有するプラスミドクローンを得
る。スクリーニングは、例えば上述のラットＰＡＰｃＤ
ＮＡ配列をもとに作成したプローブを標識して用いた、
ハイブリダイゼーションにより行われ得る。この陽性の
クローンに含まれるｃＤＮＡインサートをそれぞれ適当
な制限酵素で切り出し、サブクローニングを行った後、
ジデオキシ法などの公知のＤＮＡシークエンス法で塩基
配列の決定を行う。このようにして、１つのｃＤＮＡイ
ンサートから得られたマウスＰＡＰの塩基配列およびそ
れに対応するアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示
す。
【００２３】（３）ヒトＰＡＰをコードするＤＮＡ配列
の決定 ヒトＰＡＰをコードするＤＮＡ配列の決定を、例えば以
下の方法で行う。
の決定 ヒトＰＡＰをコードするＤＮＡ配列の決定を、例えば以
下の方法で行う。
【００２４】まず、ＰＡＰをコードするｍＲＮＡが豊富
に存在すると考えられるヒト小腸由来のｃＤＮＡライブ
ラリーを、上記のマウス小腸由来ｃＤＮＡライブラリー
を作成するのと同様の方法で作成する。具体的には、例
えばヒト小腸のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（クローンテック社
製）から、逆転写酵素によりｃＤＮＡを調製し、スーパ
ースクリプトプラスミドシステム（ＢＲＬ社）により、
ｃＤＮＡライブラリーを作成する。
に存在すると考えられるヒト小腸由来のｃＤＮＡライブ
ラリーを、上記のマウス小腸由来ｃＤＮＡライブラリー
を作成するのと同様の方法で作成する。具体的には、例
えばヒト小腸のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（クローンテック社
製）から、逆転写酵素によりｃＤＮＡを調製し、スーパ
ースクリプトプラスミドシステム（ＢＲＬ社）により、
ｃＤＮＡライブラリーを作成する。
【００２５】次に、公知のラットＰＡＰのｃＤＮＡ配列
および上記（２）項で得られたマウスＰＡＰのｃＤＮＡ
配列とを比較して、その配列が保存されている部分を選
択し、それをもとに一対のプライマーを合成する。この
プライマーの配列を配列表の配列番号３および４に示
す。
および上記（２）項で得られたマウスＰＡＰのｃＤＮＡ
配列とを比較して、その配列が保存されている部分を選
択し、それをもとに一対のプライマーを合成する。この
プライマーの配列を配列表の配列番号３および４に示
す。
【００２６】ヒト小腸のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（クローン
テック社製）から、逆転写酵素によって作成したｃＤＮ
Ａを鋳型として、上記プライマーを起点にＰＣＲ反応を
行い、増幅された断片のｃＤＮＡ配列を決定後、これを
標識して、上記のようにして作成したヒト小腸由来のｃ
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングする際のプローブ
として用いる。
テック社製）から、逆転写酵素によって作成したｃＤＮ
Ａを鋳型として、上記プライマーを起点にＰＣＲ反応を
行い、増幅された断片のｃＤＮＡ配列を決定後、これを
標識して、上記のようにして作成したヒト小腸由来のｃ
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングする際のプローブ
として用いる。
【００２７】得られた陽性のクローンに含まれるｃＤＮ
Ａインサートを含むプラスミドを精製後、ジデオキシ法
などの公知のＤＮＡシークエンス法で塩基配列の決定を
行う。このようにして、１つのｃＤＮＡインサートから
得られたヒトＰＡＰの塩基配列およびそれに対応するア
ミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。
Ａインサートを含むプラスミドを精製後、ジデオキシ法
などの公知のＤＮＡシークエンス法で塩基配列の決定を
行う。このようにして、１つのｃＤＮＡインサートから
得られたヒトＰＡＰの塩基配列およびそれに対応するア
ミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。
【００２８】
【実施例】本発明を以下の実施例によりさらに説明す
る。
る。
【００２９】（実施例１）マウス各組織におけるＰＡＰ
ｍＲＮＡの発現分布の確認 ＤＳマウスの各臓器（腎臓、胃、小腸、大腸、脳、およ
び膵臓）から、全ＲＮＡをＡＧＰＣ法（Analytical Bio
chemistry 162, pp156-159 (1987)）で単離した。全Ｒ
ＮＡをそれぞれ１０μｇずつ取り、１％アガロースゲル
で分離し、緩衝液中でそれぞれのバンドをナイロンメン
ブレン（BIODYNER NYLON MEMBRANES；PALL BioSupport,
East Hills, N.Y.）に移した。
ｍＲＮＡの発現分布の確認 ＤＳマウスの各臓器（腎臓、胃、小腸、大腸、脳、およ
び膵臓）から、全ＲＮＡをＡＧＰＣ法（Analytical Bio
chemistry 162, pp156-159 (1987)）で単離した。全Ｒ
ＮＡをそれぞれ１０μｇずつ取り、１％アガロースゲル
で分離し、緩衝液中でそれぞれのバンドをナイロンメン
ブレン（BIODYNER NYLON MEMBRANES；PALL BioSupport,
East Hills, N.Y.）に移した。
【００３０】メンブレンを、５０％ホルムアミド、４×
ＳＳＣ、５×デンハート溶液、０．５％ＳＤＳ、１０％
デキストラン硫酸、２５０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮ
Ａおよびプローブとして公知のラットＰＡＰｃＤＮＡ断
片（コーディング領域のすべてを含む断片）（メガプラ
イムで標識）を含む溶液中で、６５℃にて１６時間ハイ
ブリダイゼーションを行った。メンブレンを室温で１５
分ずつ、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液で
４回洗浄し、さらに６５℃で２回（３０分ずつ）０．２
×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳとを含む溶液で洗浄した。
ＳＳＣ、５×デンハート溶液、０．５％ＳＤＳ、１０％
デキストラン硫酸、２５０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮ
Ａおよびプローブとして公知のラットＰＡＰｃＤＮＡ断
片（コーディング領域のすべてを含む断片）（メガプラ
イムで標識）を含む溶液中で、６５℃にて１６時間ハイ
ブリダイゼーションを行った。メンブレンを室温で１５
分ずつ、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液で
４回洗浄し、さらに６５℃で２回（３０分ずつ）０．２
×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳとを含む溶液で洗浄した。
【００３１】コダックＸ−ＯマットＡＲフィルム（Koda
k, Rochester, NY）とデュポン社のエンハンシングスク
リーンを用い、−７０℃で一夜放置して、オートラジオ
グラフィーを行った。その結果を図１Ａに示す。マウス
膵臓組織以外の小腸および大腸組織中にバンドが認めら
れ、ＰＡＰｍＲＮＡの発現量が小腸および大腸の組織中
に多いことが確認された。この発見により、実験用の膵
炎動物モデルを作成しなくても、小腸あるいは大腸か
ら、マウスＰＡＰｃＤＮＡのクローニングが可能である
ことが推定できた。なお、正常マウスの膵臓中のＰＡＰ
ｍＲＮＡの量は、容易にクローニングできない程微量で
あることが判った。
k, Rochester, NY）とデュポン社のエンハンシングスク
リーンを用い、−７０℃で一夜放置して、オートラジオ
グラフィーを行った。その結果を図１Ａに示す。マウス
膵臓組織以外の小腸および大腸組織中にバンドが認めら
れ、ＰＡＰｍＲＮＡの発現量が小腸および大腸の組織中
に多いことが確認された。この発見により、実験用の膵
炎動物モデルを作成しなくても、小腸あるいは大腸か
ら、マウスＰＡＰｃＤＮＡのクローニングが可能である
ことが推定できた。なお、正常マウスの膵臓中のＰＡＰ
ｍＲＮＡの量は、容易にクローニングできない程微量で
あることが判った。
【００３２】（実施例２）マウスＰＡＰｃＤＮＡの塩基
配列の決定 ＤＳマウスの小腸から、ＡＧＰＣ法で抽出した全ＲＮＡ
１００μｇを、スーパースクリプトプラスミドシステム
（ＢＲＬ社製）により、ｃＤＮＡを合成した後、プラス
ミドにクローニングし、マウス小腸由来のｃＤＮＡライ
ブラリーを作成した。次に、上記（１）項の発現分布の
確認に用いたラット由来のｃＤＮＡプローブを用いて、
コロニーをスクリーニングした。
配列の決定 ＤＳマウスの小腸から、ＡＧＰＣ法で抽出した全ＲＮＡ
１００μｇを、スーパースクリプトプラスミドシステム
（ＢＲＬ社製）により、ｃＤＮＡを合成した後、プラス
ミドにクローニングし、マウス小腸由来のｃＤＮＡライ
ブラリーを作成した。次に、上記（１）項の発現分布の
確認に用いたラット由来のｃＤＮＡプローブを用いて、
コロニーをスクリーニングした。
【００３３】まず、コロニーがレプリカされたフィルタ
ーを、３０％（ｗ／ｖ）ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１
×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエ
ン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を含む）、１×デンハー
ト溶液（０．０２％ウシ血清アルブミン、０．０２％フ
ィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン）、５ｍＭ
ＮａＨ2ＰＯ4、０．１％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍ
ｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中にいれ、上記プロー
ブを用いて、６５℃で１８時間ハイブリダイゼーション
を行った。次に、上記フィルターを０．１％ＳＤＳを含
む２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）溶液で、室温で１５分間ず
つ４回洗浄し、その後０．１％ＳＤＳを含む０．２×Ｓ
ＳＣ（ｐＨ７．０）溶液で、６５℃で３０分間ずつ２回
洗浄した。コダックＸ線フィルムとデュポンエンハンシ
ングスクリーン（デュポン社製）とを用いて、−８０℃
に１６時間放置してオートラジオグラフィーを行った。
ーを、３０％（ｗ／ｖ）ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１
×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエ
ン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を含む）、１×デンハー
ト溶液（０．０２％ウシ血清アルブミン、０．０２％フ
ィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン）、５ｍＭ
ＮａＨ2ＰＯ4、０．１％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍ
ｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中にいれ、上記プロー
ブを用いて、６５℃で１８時間ハイブリダイゼーション
を行った。次に、上記フィルターを０．１％ＳＤＳを含
む２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）溶液で、室温で１５分間ず
つ４回洗浄し、その後０．１％ＳＤＳを含む０．２×Ｓ
ＳＣ（ｐＨ７．０）溶液で、６５℃で３０分間ずつ２回
洗浄した。コダックＸ線フィルムとデュポンエンハンシ
ングスクリーン（デュポン社製）とを用いて、−８０℃
に１６時間放置してオートラジオグラフィーを行った。
【００３４】その結果、プローブにハイブリダイズされ
ているクローンが見いだされた。このうちのひとつのｃ
ＤＮＡインサートの塩基配列を、dsDNA Cycle Sequenci
ng System（GIBCO BRL LIFE TECHNOLOGIES, INC.）を用
いて、決定した。このようにして確認されたマウスＰＡ
ＰをコードするＤＮＡ断片の塩基配列およびそれに対応
するアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。マウス
ＰＡＰは、１７５個のアミノ酸タンパク質をコードする
５２５ｂｐのオープンリーディングフレームを有してい
る。ラットＰＡＰのアミノ酸配列との比較により、コー
ドされたアミノ酸のうち、Ｎ末端から２６残基は、シグ
ナルペプチドであると考えられる。
ているクローンが見いだされた。このうちのひとつのｃ
ＤＮＡインサートの塩基配列を、dsDNA Cycle Sequenci
ng System（GIBCO BRL LIFE TECHNOLOGIES, INC.）を用
いて、決定した。このようにして確認されたマウスＰＡ
ＰをコードするＤＮＡ断片の塩基配列およびそれに対応
するアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。マウス
ＰＡＰは、１７５個のアミノ酸タンパク質をコードする
５２５ｂｐのオープンリーディングフレームを有してい
る。ラットＰＡＰのアミノ酸配列との比較により、コー
ドされたアミノ酸のうち、Ｎ末端から２６残基は、シグ
ナルペプチドであると考えられる。
【００３５】（実施例３） ａ．ヒト小腸由来のＰＡＰｃＤＮＡライブラリーの作成 ＰＡＰをコードするｍＲＮＡが豊富に存在すると考えら
れるヒト小腸由来のｃＤＮＡライブラリーを、上記のマ
ウス小腸由来ｃＤＮＡライブラリーを作成したのと同様
の方法で作成した。
れるヒト小腸由来のｃＤＮＡライブラリーを、上記のマ
ウス小腸由来ｃＤＮＡライブラリーを作成したのと同様
の方法で作成した。
【００３６】ヒト小腸のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（クローン
テック社製）に、逆転写酵素を作用させ、ｃＤＮＡを調
製し、スーパースクリプトプラスミドシステム（ＢＲＬ
社）により、ｃＤＮＡライブラリーを作成した。
テック社製）に、逆転写酵素を作用させ、ｃＤＮＡを調
製し、スーパースクリプトプラスミドシステム（ＢＲＬ
社）により、ｃＤＮＡライブラリーを作成した。
【００３７】ｂ．クローンのスクリーニングの為のプロ
ーブの作成 次に、公知のラットＰＡＰのｃＤＮＡ配列および上記実
施例２で得られたマウスＰＡＰのｃＤＮＡ配列とを比較
して、その配列が保存されている部分のオリゴヌクレオ
チドを選択した。それをもとに、配列表の配列番号３お
よび４に示す一対のプライマーを合成した。
ーブの作成 次に、公知のラットＰＡＰのｃＤＮＡ配列および上記実
施例２で得られたマウスＰＡＰのｃＤＮＡ配列とを比較
して、その配列が保存されている部分のオリゴヌクレオ
チドを選択した。それをもとに、配列表の配列番号３お
よび４に示す一対のプライマーを合成した。
【００３８】次にヒト小腸のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（クロ
ーンテック社製）から、逆転写酵素によって作成したｃ
ＤＮＡを鋳型として、上記プライマーを起点にＰＣＲ増
幅させ、得られた断片を標識して、上記のようにして作
成したヒト小腸由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリー
ニングする際のプローブとした。
ーンテック社製）から、逆転写酵素によって作成したｃ
ＤＮＡを鋳型として、上記プライマーを起点にＰＣＲ増
幅させ、得られた断片を標識して、上記のようにして作
成したヒト小腸由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリー
ニングする際のプローブとした。
【００３９】ｃ．ヒトＰＡＰのｃＤＮＡ配列決定 まず、上記のａで得られたｃＤＮＡライブラリーを大腸
菌に導入し、培地に蒔いてコロニーを形成させた。この
コロニーをナイロンメンブレン（BIODYNER NYLON MEMBR
ANES;PALL BioSupport, East Hills, N.Y.）にレプリカ
させた。コロニーがレプリカされたメンブレンを、３０
％（ｗ／ｖ）ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ
は、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナト
リウム（ｐＨ７．０）を含む）、１×デンハート溶液
（０．０２％ウシ血清アルブミン、０．０２％フィコー
ル、０．０２％ポリビニルピロリドン）、５ｍＭＮａＨ
2ＰＯ4、０．１％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌ変性
サケ精子ＤＮＡを含む溶液中にいれ、上記ｂで得られた
プローブを用いて、６５℃で１８時間ハイブリダイゼー
ションを行った。次に、上記フィルターを０．１％ＳＤ
Ｓを含む２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）溶液で、室温で１５
分間ずつ４回洗浄し、その後０．１％ＳＤＳを含む０．
２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）溶液で、６５℃で３０分間ず
つ２回洗浄した。コダックＸ線フィルムとデュポンエン
ハンシングスクリーン（デュポン社製）とを用いて、−
８０℃に１６時間放置してオートラジオグラフィーを行
った。
菌に導入し、培地に蒔いてコロニーを形成させた。この
コロニーをナイロンメンブレン（BIODYNER NYLON MEMBR
ANES;PALL BioSupport, East Hills, N.Y.）にレプリカ
させた。コロニーがレプリカされたメンブレンを、３０
％（ｗ／ｖ）ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ
は、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナト
リウム（ｐＨ７．０）を含む）、１×デンハート溶液
（０．０２％ウシ血清アルブミン、０．０２％フィコー
ル、０．０２％ポリビニルピロリドン）、５ｍＭＮａＨ
2ＰＯ4、０．１％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌ変性
サケ精子ＤＮＡを含む溶液中にいれ、上記ｂで得られた
プローブを用いて、６５℃で１８時間ハイブリダイゼー
ションを行った。次に、上記フィルターを０．１％ＳＤ
Ｓを含む２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）溶液で、室温で１５
分間ずつ４回洗浄し、その後０．１％ＳＤＳを含む０．
２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）溶液で、６５℃で３０分間ず
つ２回洗浄した。コダックＸ線フィルムとデュポンエン
ハンシングスクリーン（デュポン社製）とを用いて、−
８０℃に１６時間放置してオートラジオグラフィーを行
った。
【００４０】その結果、プローブにハイブリダイズされ
ているクローンが見いだされた。このうちのひとつのｃ
ＤＮＡインサートの塩基配列をdsDNA Cycle Sequencing
Systemを用いて、決定した。このようにして確認され
たヒトＰＡＰをコードするＤＮＡ断片の塩基配列および
それに対応するアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示
す。
ているクローンが見いだされた。このうちのひとつのｃ
ＤＮＡインサートの塩基配列をdsDNA Cycle Sequencing
Systemを用いて、決定した。このようにして確認され
たヒトＰＡＰをコードするＤＮＡ断片の塩基配列および
それに対応するアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示
す。
【００４１】ヒトＰＡＰｃＤＮＡは、１７５個のアミノ
酸タンパク質をコードする５２５ｂｐのオープンリーデ
ィングフレームを有している。コードされた１７５個の
アミノ酸のうち、Ｎ末端から２６残基は、シグナルペプ
チドであると考えられる。
酸タンパク質をコードする５２５ｂｐのオープンリーデ
ィングフレームを有している。コードされた１７５個の
アミノ酸のうち、Ｎ末端から２６残基は、シグナルペプ
チドであると考えられる。
【００４２】（実施例４）ヒト各組織におけるＰＡＰｍ
ＲＮＡの発現分布の確認 ヒト各組織（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎
臓、膵臓、および小腸）からの全ＲＮＡ（すべてクロー
ンテック社製）をそれぞれ１０μｇずつ取り、１％アガ
ロースゲルで分離し、緩衝液中でそれぞれのバンドをナ
イロンメンブレンに移した。
ＲＮＡの発現分布の確認 ヒト各組織（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎
臓、膵臓、および小腸）からの全ＲＮＡ（すべてクロー
ンテック社製）をそれぞれ１０μｇずつ取り、１％アガ
ロースゲルで分離し、緩衝液中でそれぞれのバンドをナ
イロンメンブレンに移した。
【００４３】ブロットを、５０％ホルムアミド、４×Ｓ
ＳＣ、５×デンハート溶液、０．５％ＳＤＳ、１０％デ
キストラン硫酸、２５０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ
およびプローブとして上記実施例３で得られたヒトＰＡ
ＰｃＤＮＡ断片（コーディング領域のすべてを含む断
片）（メガプライムで標識）を含む溶液中で、６５℃に
て１６時間ハイブリダイゼーションを行った。ブロット
を室温で１５分ずつ、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ
を含む溶液で４回洗浄し、さらに６５℃で２回（３０分
ずつ）０．２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳとを含む溶液で
洗浄した。
ＳＣ、５×デンハート溶液、０．５％ＳＤＳ、１０％デ
キストラン硫酸、２５０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ
およびプローブとして上記実施例３で得られたヒトＰＡ
ＰｃＤＮＡ断片（コーディング領域のすべてを含む断
片）（メガプライムで標識）を含む溶液中で、６５℃に
て１６時間ハイブリダイゼーションを行った。ブロット
を室温で１５分ずつ、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ
を含む溶液で４回洗浄し、さらに６５℃で２回（３０分
ずつ）０．２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳとを含む溶液で
洗浄した。
【００４４】コダックＸ−ＯマットＡＲフィルム（Koda
k, Rochester, NY）とデュポン社のエンハンシングスク
リーンを用い、−７０℃で一夜放置して、オートラジオ
グラフィーを行った。その結果を図１Ｂに示す。ヒトの
小腸組織中にバンドが認められ、ＰＡＰｍＲＮＡの発現
量が小腸組織中に多いことが確認された。膵臓ＰＡＰｍ
ＲＮＡは、クローニングに用いられ得る量ではないこと
が判った。
k, Rochester, NY）とデュポン社のエンハンシングスク
リーンを用い、−７０℃で一夜放置して、オートラジオ
グラフィーを行った。その結果を図１Ｂに示す。ヒトの
小腸組織中にバンドが認められ、ＰＡＰｍＲＮＡの発現
量が小腸組織中に多いことが確認された。膵臓ＰＡＰｍ
ＲＮＡは、クローニングに用いられ得る量ではないこと
が判った。
【００４５】ヒトＰＡＰは、腸組織において著しく多く
発現していることから、その生理活性としては、腸内細
菌に対する抗菌物質としての働きが予想される。
発現していることから、その生理活性としては、腸内細
菌に対する抗菌物質としての働きが予想される。
【００４６】
【発明の効果】本発明によれば、このように、新規なマ
ウスＰＡＰ、該ＰＡＰをコードするＤＮＡ配列、ヒトＰ
ＡＰ、該ＰＡＰをコードするＤＮＡ配列が提供される。
このように、マウス由来およびヒト由来のＰＡＰをコー
ドするＤＮＡが単離されたのはこれが初めてである。得
られたヒトおよびマウスＰＡＰは、ラットＰＡＰが強力
な細菌凝集活性を有することから、タンパク性抗細菌剤
として利用され得る。さらに、ラット急性膵炎の膵液中
には、分泌タンパク質の約５％を占める程の多量のＰＡ
Ｐが存在していること；および膵炎の完治に伴いＰＡＰ
の検出ができなくなることから、マウスやヒトにおいて
も膵臓の炎症マーカーとして用いられ得る。
ウスＰＡＰ、該ＰＡＰをコードするＤＮＡ配列、ヒトＰ
ＡＰ、該ＰＡＰをコードするＤＮＡ配列が提供される。
このように、マウス由来およびヒト由来のＰＡＰをコー
ドするＤＮＡが単離されたのはこれが初めてである。得
られたヒトおよびマウスＰＡＰは、ラットＰＡＰが強力
な細菌凝集活性を有することから、タンパク性抗細菌剤
として利用され得る。さらに、ラット急性膵炎の膵液中
には、分泌タンパク質の約５％を占める程の多量のＰＡ
Ｐが存在していること；および膵炎の完治に伴いＰＡＰ
の検出ができなくなることから、マウスやヒトにおいて
も膵臓の炎症マーカーとして用いられ得る。
【００４７】
【００４８】
【配列番号：１】 配列の長さ：528 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：マウス 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..525 特徴を決定した方法：S 配列 ATG CTG CCT CCA ACA GCC TGC TCC GTC ATG TCC TGG ATG CTG CTC TCC 48 Met Leu Pro Pro Thr Ala Cys Ser Val Met Ser Trp Met Leu Leu Ser 1 5 10 15 TGC CTG ATG CTC TTA TCT CAG GTT CAA GGT GAA GAC TCC CTG AAG AAT 96 Cys Leu Met Leu Leu Ser Gln Val Gln Gly Glu Asp Ser Leu Lys Asn 20 25 30 ATA CCC TCC GCA CGC ATT AGT TGC CCC AAG GGC TCC CAG GCT TAT GGC 144 Ile Pro Ser Ala Arg Ile Ser Cys Pro Lys Gly Ser Gln Ala Tyr Gly 35 40 45 TCC TAC TGC TAT GCC TTG TTT CAG ATA CCA CAG ACC TGG TTT GAT GCA 192 Ser Tyr Cys Tyr Ala Leu Phe Gln Ile Pro Gln Thr Trp Phe Asp Ala 50 55 60 GAA CTG GCC TGC CAA AAG AGG CCT GGA GGA CAC CTC GTA TCT GTG CTC 240 Glu Leu Ala Cys Gln Lys Arg Pro Gly Gly His Leu Val Ser Val Leu 65 70 75 80 AAT AGC GCT GAG GCT TCA TTC TTG TCC TCC ATG GTG AAG AGA ACA GGA 288 Asn Ser Ala Glu Ala Ser Phe Leu Ser Ser Met Val Lys Arg Thr Gly 85 90 95 AAC AGC TAC CAA TAC ACT TGG ATT GGG CTC CAT GAC CCC ACT CTG GGT 336 Asn Ser Tyr Gln Tyr Thr Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Leu Gly 100 105 110 GCA GAA CCC AAT GGC GGT GGA TGG GAA TGG AGT AAC AAT GAC GTG ATG 384 Ala Glu Pro Asn Gly Gly Gly Trp Glu Trp Ser Asn Asn Asp Val Met 115 120 125 AAT TAC TTT AAC TGG GAG AGG AAC CCA TCT ACT GCC TTA GAC CGT GCT 432 Asn Tyr Phe Asn Trp Glu Arg Asn Pro Ser Thr Ala Leu Asp Arg Ala 130 135 140 TTC TGT GGC AGC TTG TCA AGA GCT TCT GGA TTT CTA AAA TGG AGA GAT 480 Phe Cys Gly Ser Leu Ser Arg Ala Ser Gly Phe Leu Lys Trp Arg Asp 145 150 155 160 ATG ACA TGT GAG GTG AAG TTG CCC TAT GTC TGC AAA TTT ACT GGT TAA 528 Met Thr Cys Glu Val Lys Leu Pro Tyr Val Cys Lys Phe Thr Gly 165 170 175
【００４９】
【配列番号：２】 配列の長さ：528 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：マウス 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..525 特徴を決定した方法：S 配列 ATG CTG CCT CCC ATG GCC CTG CCC AGT GTA TCT TGG ATG CTG CTT TCC 48 Met Leu Pro Pro Met Ala Leu Pro Ser Val Ser Trp Met Leu Leu Ser 1 5 10 15 TGC CTC ATG CTG CTG TCT CAG GTT CAA GGT GAA GAA CCC CAG AGG GAA 96 Cys Leu Met Leu Leu Ser Gln Val Gln Gly Glu Glu Pro Gln Arg Glu 20 25 30 CTG CCC TCT GCA CGG ATC CGC TGT CCC AAA GGC TCC AAG GCC TAT GGC 144 Leu Pro Ser Ala Arg Ile Arg Cys Pro Lys Gly Ser Lys Ala Tyr Gly 35 40 45 TCC CAC TGC TAT GCC TTG TTT TTG TCA CCA AAA TCC TGG ACA GAT GCA 192 Ser His Cys Tyr Ala Leu Phe Leu Ser Pro Lys Ser Trp Thr Asp Ala 50 55 60 GAT CTG GCC TGC CAG AAG CGG CCC TCT GGA AAC CTG GTG TCT GTG CTC 240 Asp Leu Ala Cys Gln Lys Arg Pro Ser Gly Asn Leu Val Ser Val Leu 65 70 75 80 AGT GGG GCT GAG GGA TCC TTC GTG TCC TCC CTG GTG AAG AGC ATT GGT 288 Ser Gly Ala Glu Gly Ser Phe Val Ser Ser Leu Val Lys Ser Ile Gly 85 90 95 AAC AGC TAC TCA TAC GTC TGG ATT GGG CTC CAT GAC CCC ACA CAG GGC 336 Asn Ser Tyr Ser Tyr Val Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly 100 105 110 ACC GAG CCC AAT GGA GAA GGT TGG GAG TGG AGT AGC AGT GAT GTG ATG 384 Thr Glu Pro Asn Gly Glu Gly Trp Glu Trp Ser Ser Ser Asp Val Met 115 120 125 AAT TAC TTT GCA TGG GAG AGA AAT CCC TCC ACC ATC TCA AGC CCC GGC 432 Asn Tyr Phe Ala Trp Glu Arg Asn Pro Ser Thr Ile Ser Ser Pro Gly 130 135 140 CAC TGT GCG AGC CTG TCG AGA AGC ACA GCA TTT CTG AGG TGG AAA GAT 480 His Cys Ala Ser Leu Ser Arg Ser Thr Ala Phe Leu Arg Trp Lys Asp 145 150 155 160 TAT AAC TGT AAT GTG AGG TTA CCC TAT GTC TGC AAG TTC ACT GAC TAG 528 Tyr Asn Cys Asn Val Arg Leu Pro Tyr Val Cys Lys Phe Thr Asp 165 170 175
【００５０】
【配列番号：３】 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TGGCCTGCCA GAAGAGACC
【００５１】
【配列番号：４】 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＡＧＡＣＧＴＡＧ ＧＧＣＡＡＣＴＴＣＡ
【図１】マウスおよびヒトの各組織から単離した全ＲＮ
Ａを、それぞれラットおよびヒトのＰＡＰのＤＮＡをプ
ローブとして、ノーザンブロット分析を行った結果を示
す図である。
Ａを、それぞれラットおよびヒトのＰＡＰのＤＮＡをプ
ローブとして、ノーザンブロット分析を行った結果を示
す図である。
Claims (12)
- 【請求項１】配列表の配列番号１の２７位のＧｌｕから
１７５位のＧｌｙまでのアミノ酸配列を含むポリペプチ
ド。 - 【請求項２】請求項１に記載のポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列。 - 【請求項３】配列表の配列番号１の７９位のＧから５２
５位のＴまででなる塩基配列を有する、請求項２に記載
のＤＮＡ配列。 - 【請求項４】配列表の配列番号１の１位のＭｅｔから１
７５位のＧｌｙまでのアミノ酸配列を含むポリペプチ
ド。 - 【請求項５】請求項４に記載のポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列。 - 【請求項６】配列表の配列番号１の１位のＡから５２５
位のＴまででなる塩基配列を有する、請求項５に記載の
ＤＮＡ配列。 - 【請求項７】配列表の配列番号２の２７位のＧｌｕから
１７５位のＡｓｐまでのアミノ酸配列を含むポリペプチ
ド。 - 【請求項８】請求項７に記載のポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列。 - 【請求項９】配列表の配列番号２の７９位のＧから５２
５位のＣまででなる塩基配列を有する、請求項８に記載
のＤＮＡ配列。 - 【請求項１０】配列表の配列番号２の１位のＭｅｔから
１７５位のＡｓｐまでのアミノ酸配列を含むポリペプチ
ド。 - 【請求項１１】請求項１０に記載のポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列。 - 【請求項１２】配列表の配列番号２の１位のＡから５２
５位のＣまででなる塩基配列を有する、請求項１１に記
載のＤＮＡ配列。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4284765A JPH06135998A (ja) | 1992-10-22 | 1992-10-22 | ヒトおよびマウスの膵炎関連タンパク質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4284765A JPH06135998A (ja) | 1992-10-22 | 1992-10-22 | ヒトおよびマウスの膵炎関連タンパク質 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06135998A true JPH06135998A (ja) | 1994-05-17 |
Family
ID=17682724
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4284765A Withdrawn JPH06135998A (ja) | 1992-10-22 | 1992-10-22 | ヒトおよびマウスの膵炎関連タンパク質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06135998A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0903147A2 (en) * | 1997-09-17 | 1999-03-24 | Medical Research Council | Use of REG-2 as a Schwann cell mitogen |
| EP1007647A1 (en) * | 1996-10-30 | 2000-06-14 | Eastern Virginia Medical School of the Medical College of Hampton Roads | High level of expression of ingap |
-
1992
- 1992-10-22 JP JP4284765A patent/JPH06135998A/ja not_active Withdrawn
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1007647A1 (en) * | 1996-10-30 | 2000-06-14 | Eastern Virginia Medical School of the Medical College of Hampton Roads | High level of expression of ingap |
| EP1007647A4 (en) * | 1996-10-30 | 2001-09-26 | Eastern Virginia Med School | PRODUCTION OF THE INGAP PROTEIN WITH A HIGH EXPRESSION RATE |
| EP0903147A2 (en) * | 1997-09-17 | 1999-03-24 | Medical Research Council | Use of REG-2 as a Schwann cell mitogen |
| EP0903147A3 (en) * | 1997-09-17 | 2002-02-27 | University College London | Use of REG-2 as a Schwann cell mitogen |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20000104 |