CH662128A5 - Rekombinations-clonbildungstraeger. - Google Patents

Description

Diese Erfindung betrifft einen Rekombinations-Clonbil-dungsträger zur Transformation eines mikrobiellen Wirtsorganismus, enthaltend

(a) ein homologes Regulon und

(b) eine DNA-Einfügung, die Codone für ein vorbestimmtes funktionelles heterologes Polypeptid bzw. Polypep-tid-Vorprodukt enthält. Sie betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung solcher Clonbildungsträger, sodann einen transformierten Mikroorgansimus bzw. eine mikrobielle Kultur, die den Clonbildungsträger enthält, sowie ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung eines Polypeptids und das erhaltene Erzeugnis.

Genetische Information befindet sich auf dem Desoxy-ribonucleinsäure-Doppelstrang («DNA» oder «Gene») in Form der Reihenfolge, in der der eine spezifische Information, den Code, liefernde DNA-Strang die charakteristischen Basen seiner sich wiederholenden Nucleotidbestandteile darbietet. Die Merkmalsauslösung oder -ausbildung der spezifischen oder codierten Information zur Bildung von Polypeptiden erfolgt in einem zweiteiligen Prozess. Entsprechend den Befehlen bestimmter Regulationsbereiche (Regulationsgene oder «Regulone») im Gen kann RNA-Polymerase zur Bewegung entlang dem den Code liefernden Strang veranlasst werden, wobei Matrizen-RNA (m-RNA) oder Messenger-RNA (Ribonucleinsäure) in einem als Transkription oder «Herstellung einer Arbeitskopie» bezeichneten Prozess gebildet wird. In einer anschliessenden Translations-Stufe verwandeln die Ribosomen der Zelle in Verbindung mit der im Cytoplasma löslichen Ribonucleinsäure, der t-RNA oder Transfer-RNA, die Botschaft oder Information der m-RNA in Polypeptide. Zu der Information, die m-RNA von DNA transkribiert, gehören auch Signale für den Beginn und die Beendigung der Ribosomenübertragung sowie für die Identität und Sequenz der Aminosäuren, aus denen das Polypeptid besteht. Der codierende DNA-Strang enthält lange Sequenzen von Nucleotid-Tripletts, die als Codierungseinheiten oder Codone bezeichnet werden, weil die charakteristischen Basen der Nucleotide in jedem einzelnen Triplett oder Co-don spezifische Informationsbits zum Code beitragen. Beispielsweise ergeben drei als ATG (Adenin-Thymin-Guanin) bezeichnete Nucleotide ein m-RNA-Signal, das als ein Befehl «beginne mit der Übertragung» verstanden wird, während Beendigungscodone TAG, TAA und TGA als Befehle «beendige die Übertragung» verstanden werden. Zwischen den Beginn- und Beendigungscodonen liegen die sogenannten Strukturgene, deren Codone die schliesslich übertragene Aminosäuresequenz bestimmen oder definieren. Diese Definition verläuft nach dem allgemein gesicherten genetischen Code (vgl. z.B. J.D. Watson, Molecular Biology of the Gene, W.A. Benjamin Inc., N.Y., 3. Aufl. 1976), der die Codone für die verschiedenen Aminosäuren umschreibt. Der genetische Code ist in dem Sinn degeneriert, dass verschiede-

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ne Condone die gleiche Aminosäure ergeben können, aber insofern genau als es für jede Aminosäure ein Codon oder mehrere Codone für diese Säure und keine andere gibt. So beinhalten beispielsweise alle der Codone TTT, TTC, TTA und TTG, wenn als solche gelesen, die Information für Serin und keine andere Aminosäure. Während der Transkription muss die richtige Reihenfolge oder der richtige Ableserahmen aufrecht erhalten werden. In diesem Zusammenhang ist zum Beispiel zu bedenken, was geschieht, wenn die die Arbeitskopie erzeugende RNA-Polymerase verschiedene Basen als den Anfang eines Codons (unterstrichen) in der Sequenz .... GCTGGTTGTAAG.... liest:

... Ala-Gly-Cys-Lys ..

► ... Leü-Val-Leu ...

> ... Trp-Leu-(STOP).

... GCTGGTTGTAAG ... G CTG GTT GIÀ AG... ...GCTGGTTGTAAA...

Das schliesslich erzeugte Polypeptid hängt dann in ausschlaggebender Weise von der räumlichen Beziehung des Strukturgens zu dem Regulon ab.

Ein besseres Verständnis des Prozesses der genetischen Expression oder Merkmalsausbildung soll durch die Definition bestimmter Genbestandteile gefördert werden:

Operon - ein Gen'aus Strukturgen oder -genen für die Polypeptidsynthese und dem Regulationsbereich («Regulon»), der diese Synthese regelt.

Promotor - ein Gen innerhalb des Régulons, womit RNA-Polymerase eine Verbindung zum Beginn der Transkription eingehen muss.

Operator - ein Gen, mit dem Repressorprotein eine Verbindung eingeht und dadurch die Bindung von RNA-Poly-merase an dem benachbarten Promoter verhindert.

Induktor - eine Substanz, die Repressorprotein entaktiviert, indem sie den Operator freisetzt und eine Verbindung der RNA-Polymerase mit dem Promoter ermöglicht und damit den Beginn der Transkription einleitet.

Catabolitaktivatorprotein («CAP»)-Bindungsstelle - ein Gen, das zyklisches Adenosinmonophosphat («c AMP»)-vermitteltes CAP bindet und üblicherweise gleichfalls für die Einleitung der m-Transkription erforderlich ist. Die CAP-Bindungsstelle kann in besonderen Fällen unnötig sein. Beispielsweise beseitigt eine Promotermutation in dem Lak-toseoperon des Phagen X plac UV5 die Notwendigkeit von cAMP und CAP für die Expression; J. Beckwith et al, J. Mol. Biol. 69, ISS-160 (1972).

Promoter-Operator-System - wie hier gebraucht, ein brauchbarer Regelbereich eines Operon hinsichtlich des Vorhandenseins oder Fehlens einer CAP-Bindungsstelle oder der Fähigkeit, Information für Repressorproteinexpression zu liefern.

Zur Definition und für den Gebrauch in der nachfolgenden Erörterung von Rekombinations-DNA werden noch folgende Begriffe erläutert:

Regulon - steuert bzw. reguliert die Transkriptions- oder Translationskomponenten der Expression.

Clonbildungsträger - nicht aus Chromosomen stammende doppelsträngige DNA enthaltend ein intaktes «Repli-con», so dass der Träger verdoppelt wird, wenn es durch einen Prozess der «Transformation» in einen einzelligen Organismus («Mikrobe») eingebracht wird. Ein so transformierter Organismus wird als «Transformant» bezeichnet.

Plasmid - für die vorliegenden Zwecke ein Clonbildungsträger in Form eines Plasmids, der aus Viren oder Bakterien stammt, wobei es sich bei den letzteren um «bakterielle Plasmide» handelt.

Komplementarität - durch die Basensequenzen von DNA-Einzelsträngen, die die Bildung von doppelsträngiger DNA durch Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basen auf den betreffenden Strängen ermöglichen, übertragene Eigenschaft. Adenin (A) passt komplementär zu Thymin (T), während Guanin (G) komplementär zu Cytosin (C) ist.

Die Fortschritte auf dem Gebiet der Biochemie in den 5 letzten Jahren haben zu der Konstruktion von «Rekombina-tions»-Clonbildungsträgern geführt, worin beispielsweise Plasmide, die exogene DNA enthalten, gebildet werden. In besonderen Fällen kann der Rekombinationspartner «heterologe» DNA enthalten, worunter DNA verstanden wird, io die Informationen für Polypeptide liefert, die normalerweise von dem Organismus nicht erzeugt werden, der einer Transformation durch den Rekombinationsträger zugänglich ist. So werden Plasmide unter Bildung von linearer DNA mit verbindbaren Enden oder Termini gespalten. Diese werden i5 mit einem exogenen Gen mit verbindbaren Termini unter Bildung einer biologisch funktionsfähigen Gruppe mit einem intakten Replicon und einer angestrebten phänotypischen Eigenschaft verbunden. Die Rekombinationsgruppe wird durch Transformation in einen Mikroorganismus einge-20 bracht, und Transformanten werden isoliert und mit dem Ziel zur Clonbildung gebracht, grosse Populationen zu erhalten, die zur Expression der neuen genetischen Information fähig sind.

Methoden und Mittel zur Ausbildung von Rekombina-25 tionsclonbildungsträgern und zur Transformation von Organismen mit denselben sind in der Literatur ausführlich beschrieben, vgl. z.B. H.L. Heynecker et al. Nature 263, 748-752 (1976); Cohen et al, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 69, 2110 (1972); ibid., 70, 1293 (1973); ibid., 70, 3240 (1973); 30 ibid., 71, 1030 (1974); Morrow et al, Proc. Nat. Acad. Sei, USA 71, 1743 (1974); Novick, Bacteriological Rev., 33, 210 (1969); Hershfield et al, Proc. Soc. Nat. Acad. Sei. USA 71, 3455 (1974) and Jackson et al, ibid. 69, 2904 (1972). Eine verallgemeinerte Darstellung dieses Gegenstands gibt S. Co-35 hen in Scientific American 233, 24 (1975). Ausserdem wird auf den DTV-Atlas zur Biologie, 2. Auflage, Deutscher Taschenbuchverlag, München, 1968, Nachr. Chem. Tech. Lab. 26, 349 (1978) und die dort genannten Literaturstellen, Mo-lekular-Biologie, Umschau-Verlag Frankfurt a.M., 1967, 40 Pflanzenphysiologie von Dieter Hess, VTB, E. Ulmer GmbH Stuttgart, 1976, und Grundlagen der Biochemie, Otto Müller, Georg Thieme Verlag Stuttgart, 1978, verwiesen. Alle diese Veröffentlichungen bilden Teil der vorliegenden Beschreibung.

Es gibt verschiedene bekannte Arbeitsweisen für die DNA-Rekombination, wobei aneinander angrenzende Enden einzelner DNA-Bruchstücke oder Fragmente auf die eine oder andere Weise zur Erleichterung der Bindung zugeschnitten werden. Der Ausdruck Bindung oder Verbindung 50 bezieht sich auf die Ausbildung von Phosphodiester-Bindun-gen zwischen angrenzenden Nucleotiden, meist mit Hilfe des Enzyms T4-DNA-Ligase. So können unempfindliche Enden direkt miteinander verbunden werden. Fragmente mit komplementären Einzelsträngen an ihren angrenzenden Enden 55 können statt dessen aber auch durch Wasserstoffbindung aktiviert werden, die die jeweiligen Enden für eine anschliessende Verbindung in eine geeignete Lage bringt. Solche Einzelstränge, die als Bindeenden oder Cohäsivtermini bezeichnet werden, können durch das Anfügen von Nucleotiden an un-60 empfindliche Enden unter Verwendung von terminaler Transferase und manchmal einfach durch Abzwicken eines Strangs eines unempfindlichen Endes mit einem Enzym, wie /l-Exonuclease, ausgebildet werden. Wiederum kann man sich, und dies ist das üblichste, Restriktionsendonucleasen 65 bedienen, die Phosphodiesterbindungen in und um bestimmte Sequenzen von Nucleotiden mit einer Länge von etwa 4 bis 6 Basenpaaren spalten. Viele Restriktionsendonucleasen und ihre Erkennungsstellen sind bekannt, wobei die soge45

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nannte EcoRI-Endonuclease die am häufigsten angewandte ist. Restriktionsendonucleasen, die doppelsträngige DNA bei rotationssymmetrischen «Palindromen» spalten, lassen Cohäsivtermini zurück. Somit kann ein Plasmid oder ein anderer Clonbildungsträger unter Bildung von Termini gespalten werden, die jeweils die Hälfte der Erkennungsstellen der Restriktionsendonuclease aufweisen. Ein mit der gleichen Restriktionsendonuclease erhaltenes Spaltprodukt von exogener DNA weist zu den Plasmidtermini komplementäre Enden auf. Wie weiter unten noch gezeigt, kann synthetische DNA mit Cohäsivtermini statt dessen auch für den Einbau in den gespaltenen Träger vorgesehen werden. Zur Unterdrückung der Wiedervereinigung der Cohäsivtermini des Trägers während der Einfügung von exogener DNA können die Termini mit alkalischer Phosphatase aufgeschlossen werden, was zu einer Molekularselektion von Enden für den Einbau des exogenen Fragments führt. Der Einbau eines Fragments mit einer bezüglich anderer Merkmale des Trägers richtigen Orientierung kann eine Unterstützung erfahren, wenn sich das Fragment auf Träger-DNA befindet, die durch zwei verschiedene Restriktionsendonucleasen herausgeschnitten worden ist und selbst Termini aufweist, die jeweils die Hälfte der Erkennungssequenz der verschiedenen Endonucleasen darstellen.

Weitgespannte Bemühungen auf dem Gebiet der Rekom-binations-DNA-Forschung in den letzten Jahren haben nur zu wenigen Ergebnissen geführt, die sich direkt praktisch verwerten lassen. Dies hat sich besonders im Fall missglück-ter Versuche gezeigt, durch «synthetische DNA» codierte Polypeptide und dergleichen auszubilden, unabhängig davon, ob die synthetische DNA in üblicher Weise Nucleotid um Nucleotid aufgebaut oder durch Rücktranskription aus isolierter m-RNA (komplementäre oder «cDNA») erhalten worden ist. In dieser Beschreibung wird angegeben, was allem Anschein nach die erste Expression eines funktionellen Polypeptidprodukts aus einem synthetischen Gen darstellt, wobei auch damit zusammenhängende Entwicklungen mitgeteilt werden, die allgemeinere Anwendbarkeit verheissen. Das Produkt, auf das Bezug genommen wird, ist Somatosta-tin (US-PS 3 904 594), ein Inhibitor der Sekretion von Wachstumshormon, Insulin und Glucagon, dessen Wirkungen seine Anwendung bei der Behandlung von Acromegalie, akuter Pankreatitis und von insulinabhängigem Diabetes begründen (vgl. R. Guillemin et al, Annual Rev. Med. 27, 379, 1976). Das Somatostatinmodell lässt eindeutig die Anwendbarkeit der hier beschriebenen neuen Entwicklungen auf mehreren wichtigen Gebieten erkennen, wie dies auch aus den beigefügten Zeichnungen und der weiteren Beschreibung hervorgeht.

Die Erfindung ist mit ihren Aspekten in den unabhängigen Ansprüchen 1,12, 14, 16 und 17 definiert, während besondere Ausführungsformen den Gegenstand der abhängigen Ansprüche bilden.

Der erfindungsgemässe Rekombinations-Clonbildungs-träger kann ein bakterielles Plasmid sein. Das in ihm enthaltene Regulon kann mit einem Regulon praktisch identisch sein, das gewöhnlich in der Chromosomen-DNA des bakteriellen Wirts zugegen ist. Beispielsweise kann das Regulon das Promoter-Operator-System von E. coli lac-Operon oder E. coli Tryptophanoperon aufweisen.

Im erfindungsgemässen Rekombinations-Clonbildungs-träger (Plasmid) kann die mit dem Regulon in Lesephase befindliche DNA-Einfügung den Code für die Aminosäuresequenz eines solchen heterogenen Polypeptides liefern, das ein Säugetierhormon oder ein Zwischenprodukt dafür ist. Typische Beispiele für derartige heterogene Polypeptide, die ein Säugetierhormon oder ein Vorprodukt oder Zwischenprodukt eines derartigen Hormons sind, sind die folgenden:

Humanpreproinsulin, Humanproinsulin, die A-Kette von Humaninsulin, die B-Kette von Humaninsulin, Humanoder Rinderwachstumshormon, lutinisierendes Hormon, ACTH oder Pancreas. Das heterogene Polypeptid kann auch 5 Somatostatin sein.

Da die erfindungsgemässen Clonbildungsträger Plasmide sind, werden sie in der Folge auch so bezeichnet. Gemäss einer weiteren bevorzugten Ausführungsart der Erfindung weist das Regulon das Promoter-Operator-System von E. io coli lac-Operon auf.

Mit Hilfe der erfindungsgemässen Rekombinationsplasmide konnten erstmals Mikroorganismen dazu gebracht werden, dasjenige Produkt zu bilden, für das ein von aussen kommendes Gen in den Code des Organismus eingeführt 15 wurde. Es gelang also erstmals die Herstellung eines derartigen Produktes unter Verwendung eines Mikroorganismus der ober beschriebenen Art, d.h. eines solchen, in dem zwar das Regulon von dem Organismus in seinem unveränderten Zustand entnommen wurde, nicht jedoch die Gencodierung 20 für das gewünschte Produkt.

Bei einer erfolgreichen Auswertung des Erfindungsgegenstandes gelingt es erstmals mit Hilfe von Mikroorganismen, im grossen Ausmass solche Produkte herzustellen, die bisher nur durch mühsame Extraktionen aus ihren natürlichen 25 Quellen gewinnbar waren, oder in Form von niedrig molekularen Peptiden durch aufwendige chemische Synthesen.

Die beigefügten Zeichnungen erläutern Zusammenhänge, in welchen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung Anwendung finden, d.h. die Expression des Hormons Soma-30 tostatin durch bakterielle Transformanten mit Rekombina-tionsplasmiden, sowie die Erzeugung von Humaninsulin. Figur 1

Schematische Darstellung des Prozesses: Das durch chemische DNA-Synthese hergestellte Gen für Somatostatin 35 wird an das ß-Galactosidase-Gen von E. coli auf dem Plasmid pBR322 angelagert. Nach Transformation in E. coli dirigiert das Rekombinationsplasmid die Synthese eines Vorläuferproteins, das in vitro durch Bromcyan spezifisch an den Methioninresten unter Bildung von aktivem Säugerpoly-40 peptidhormon gespalten werden kann. Mit A, T, C und G werden die charakteristischen Basen (Adenin, Thymin, Cy-tosin und Guanin) der Desoxyribonucleotide in dem codierenden Strang des Somatostatingens bezeichnet.

Figur 2

45 Schematische Struktur eines synthetischen Gens, dessen Codierstrang (d.h. der «obere» Strang) Codone für die Aminosäuresequenz von Somatostatin (wie angegeben) aufweist.

Figur 3

50 Schematische Erläuterung der bevorzugten Methode zum Aufbau von Nucleotidtrimeren, die zum Aufbau von synthetischen Genen eingesetzt werden. Bei der angewandten üblichen Bezeichnung für die Darstellung von Nucleotiden in Figur 3 befindet sich das 5'-OH links und das 3'-OH rechts, 55 zum Beispiel

B

60

HO.

N

K

OH

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Figur 4

Fliessschema für den Aufbau eines Rekombinationsplas-mids (zum Beispiel pSOM 11-3), das zur Ausbildung eines Somatostatin («SOM») enthaltenden Proteins fähig ist, ausgehend von dem Stammplasmid pBR322. Das ungefähre

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Molekulargewicht eines jeden Plasmids wird in Dalton («d») angegeben. Apr bzw. Tcr bezeichnen Gene für Ampicillin-und Tetracyclinresistenz, und Tcs bedeutet Tetracyclin-empfindlichkeit infolge der Herausnahme eines Teils des Tcr-Gens. Die Verhältnisse der Orte der verschiedenen, für Restriktionsendonuclease spezifischen Spaltstellen auf den Plasmiden zueinander sind angegeben (zum Beispiel Eco RI, BamI, etc.).

Figuren 5A und 5B

Es sind die Nucleotidsequenzen der Schlüsselteile von zwei Plasmiden dargestellt sowie die Richtung der Messen-ger-RNA-(«mRNA»)-Transkription, die stets von dem 5'-Ende des Codierstrangs ausgeht. Die Restriktionsendo-nuclease-Substratstellen sind wie dargestellt. Jede wiedergegebene Sequenz enthält sowohl die Steuerelemente des lac-(Lactose)-Operons als auch Codone zur Expression der Aminosäuresequenz von Somatostatin (kursiv). Die Aminosäuresequenzzahlen für ß-Galactosidase («ß-gal») stehen in Klammern.

Figuren 6 bis 8

Wie weiter unten noch näher ausgeführt, sind in diesen Figuren die Ergebnisse vergleichender Radioimmunprü-fungsversuche dargestellt, die die Somatostatinaktivität des durch die Rekombinationsplasmide ausgebildeten Produkts zeigen.

Figur 9

Schematische Struktur von synthetischen Genen, deren codierende Stränge Codone für die Aminosäuresequenz des A- und B-Strangs von Humaninsulin aufweisen.

Figur 10

Fliessschema für den Aufbau eines Rekombinationsplas-mids, das zur Expression der B-Kette von Humaninsulin fähig ist.

1. Herstellung von Genen, die den Code für heterologe Polypeptide liefern

Den Code für ein beliebiges Polypeptide mit bekannter Aminosäuresequenz liefernde DNA kann durch Auswahl der Codone nach dem genetischen Code hergestellt werden. Zur Erleichterung der Reinigung und dergleichen werden Oligodesoxyribonucleotidfragmente aus beispielsweise etwa 11 bis 16 Nucleotiden gesondert zubereitet und dann in der 5 gewünschten Reihenfolge angeordnet. Man bereitet also erste und zweite Reihen von Oligodesoxyribonucleotidfrag-menten von zweckmässiger Grösse. Die Verbindung der ersten Reihen in der richtigen Sequenz führt zu einem DNA-Codierstrang zur Polypeptidexpression (vergleiche z.B. Figur io 2, Fragmente A, B, C und D). Die zweiten Reihen führen nach entsprechender Verbindung in der richtigen Reihenfolge zu einem Strang, der zu dem Codierstrang komplementär ist (zum Beispiel Figur 2, Fragmente E, F, G und H). Die Fragmente der jeweiligen Stränge überlappen vorzugsweise i5 derart, dass die Komplementarität ihre Selbstanordnung über Wasserstoffbindung der Cohäsivtermini von Fragmentblöcken begünstigt. Nach dieser Anordnung bzw. diesem Aufbau wird das Strukturgen durch Verbinden oder Verknüpfen in der üblichen Weise fertiggestellt. 20 Die Degeneration oder Entartung des genetischen Codes ermöglicht beträchtliche Freiheit bei der Wahl von Codonen für eine gegebene Aminosäuresequenz. Für die erfindungsgemässen Zwecke wird jedoch die Codonwahl durch drei Überlegungen erleichtert. Erstens werden Codone und Fragst mente ausgewählt, und die Zusammenstellung der Fragmente erfolgt stufenweise, um eine unzulässige Komplementarität der Fragmente untereinander zu vermeiden, abgesehen von den Fragmenten, die in dem angestrebten Gen nebeneinander liegen. Zweitens werden an AT-Basenpaaren 30 (z.B. etwa fünf oder mehr) reiche Sequenzen vermieden, insbesondere, wenn ihnen eine an GC-Basenpaaren reiche Sequenz vorangeht, wodurch eine vorzeitige Beendigung der Transkription vermieden wird. Drittens besteht wenigstens ein grösserer Teil der gewählten Codone aus solchen, die für 35 die Expression von mikrobiellen Genomen (vgl. zum Beispiel W. Fiers, et al, Nature 260, 500, 1976) bevorzugt sind. Als für die Expression von mikrobiellen Genomen bevorzugte Codone werden die folgenden bezeichnet:

Tabelle I

Bevorzugte Bedeutung von Codonen erste

Stellung

(5'-Ende)

40

Im Fall von Somatastin am stärksten bevorzugt sind folgende Aminosäure-(Codon)-beziehungen des Strukturgens: gly (GGT); cys (TGT); lys (AAG); trp (TGG); ala (GCT,

dritte

Stellung

(3'-Ende)

(von oben zweite

Stellung

(von links nach rechts)

(von oben nach unten)

T

C

A

G

nach unten)

phe

—

—

cys

T

T

phe ser tyr

—

C

leu

—

Stop

Stop

A

—

ser

Stop trp

G

leu pro his arg

T

leu pro his arg

C

leu pro gin

—

A

C

—

pro gin

—

G

ile thr asr

—

T

ile thr asn ser

C

A

A

met thr lys

A

G

(Start)

vai ala asp giy

T

vai

...

asp

—

C

vai

...

glu

—

A

G

vai ala glu

...

G

GCG); asn (AAT, AAC); phe (TTC, TTT); thr (ACT, ACG); und ser (TCC, TCG).

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Wenn das Strukturgen eines angestrebten Polypeptids in einen Clonbildungsträger zur Expression als solches eingeführt werden soll, wird dem Gen ein «Start»-Codon (zum Beispiel ATG) vorangestellt, und ihm folgen unmittelbar ein oder mehrere Beendigungs- oder Stop-Codone (vergleiche Figur 2). Die Aminosäuresequenz eines bestimmten Polypeptids kann jedoch, wie unten beschrieben, mit weiterem Protein ausgebildet werden, das ihr vorangeht und/oder folgt. Wenn der Verwendungszweck des Polypeptids Spaltung des weiteren Proteins erfordert, werden entsprechende Spaltstellen neben der Polypeptid- weiteres Protein-Codon-Bindung eincodiert. So ist beispielsweise in Figur 1 das Produkt der Expression ein Vorläufer-Protein aus Somatostatin und dem grössten Teil des ß-Galactosidase-Polypeptids. In diesem Fall ist ATG zum Codieren für den Start der Translation nicht erforderlich, weil die Ribosomenkonstruktion des zusätzlichen ß-gal-Proteins das Somatostatinstrukturgen durchliest. Der Einbau des ATG-Signals ergibt jedoch den Code für die Erzeugung von Methionin, eine Aminosäure, die durch Bromcyan spezifisch gespalten wird, woraus sich eine einfache Methode zur Umwandlung von Vorläuferpro-tein in das erstrebte Polypeptid ergibt.

Figur 2 erläutert ein weiteres bevorzugtes Merkmal für heterologe DNA, die zur Rekombination verwendet werden soll, d.h. dass Cohäsivtermini vorgesehen sind, die vorzugsweise einen der beiden Stränge einer Restriktionsendonu-clease-Erkennungsstelle umfassen. Aus den oben erörterten Gründen werden die Termini vorzugsweise dazu bestimmt, nach Rekombination einzelne verschieden Erkennungsstellen hervorzurufen.

Nachdem die beschriebenen Entwicklungen als in Verbindung mit dem Somatostatinmodell erfolgreich verlaufend nachgewiesen wurden, wird anerkannt werden, dass eine heterologe DNA-Codierung für praktisch jede bekannte Aminosäuresequenz mutatis mutandis angewandt werden kann. So sind die beschriebenen und noch zu beschreibenden Arbeitsweisen mutatis mutandis auf die Erzeugung von Po-lyaminosäuren, wie Polyleucin und Polyalanin, Enzymen, Serumproteinen und analgetischen Polypeptiden, wie ß-En-dorphinen anwendbar, die Schmerzschwellen etc. beeinflussen können. Die erzeugten Polypeptide sind vorzugsweise als solche Säugerhormone oder Zwischenprodukte dafür. Zu solchen Hormonen gehören u.a. Somatostatin, Humaninsulin, Human- und Rinderwachstumshormon, luteinisierendes Hormon, ACTH und Pankreaspolypeptid. Zu den Zwischenprodukten gehören u.a. Humanvorproinsulin, Humanproinsulin und die A- und B-Ketten von Humaninsulin. Ausser in vitro hergestellter DNA kann die heterologe DNA cDNA enthalten, die bei der Rücktranskription von mRNA gebildet wird, vergleiche z.B. Ullrich et al, Science 196, 1313, 1977.

2. Rekombinationsstoffe mit einem Code für die Expression von Vorläuferprotein

Bei dem in Figur 1 schematisch dargestellten Prozess liefert die Expression ein Vorläuferprotein, das durch ein spezifisches heterologes Strukturgen (Somatostatin) codiertes Polypeptid und ausserdem Protein (das einen Teil des ß-Ga-lactosidaseenzyms enthält) umfasst. Eine selektive Spaltstelle neben der Somatostatin-Aminosäuresequenz ermöglicht eine nachfolgende Abtrennung des angestrebten Polypeptids von überflüssigem Protein. Der erläuterte Fall ist für eine grosse Gruppe von Arbeitsweisen repräsentativ, die durch die Erfindung erschlossen worden sind.

In den meisten Fällen wird die Spaltung ausserhalb der replikativen Umgebung des Plasmids oder anderen Trägers, beispielsweise nach Gewinnung der mikrobiellen Kultur bewirkt. Auf diese Weise kann eine temporäre Konjugation von kleinen Polypeptiden mit überflüssigem Protein erstere,

zum Beispiel gegen einen in vivo erfolgenden Abbau durch endogene Enzyme, schützen. Gleichzeitig bringt das zusätzliche Protein gewöhnlich das angestrebte Polypeptid um seine Bioaktivität während der extracellulären Spaltung, wo-5 durch die biologische Gefahrlosigkeit des Vorgangs erhöht wird. In besonderen Fällen ist es natürlich zweckmässig, die Spaltung innerhalb der Zelle zu bewirken. Beispielsweise können mit DNA mit einem Code für Enzyme, die Insulinvorläufer in die aktive Form überführen, Clonbildungsträger io ausgebildet werden, die mit einer anderen DNA mit einem Code für die Expression der Vorläuferform zusammenarbeiten.

In einem bevorzugten Fall fehlen dem bestimmten angestrebten Polypeptid innere Spaltstellen entsprechend demje-i5 nigen, das zum Abwerfen von überflüssigem Protein verwendet wird, doch können, wie ohne weiteres ersichtlich, auch dann, wenn diese Bedingung nicht erfüllt ist, konkurrierende Reaktionen das angestrebte Produkt liefern, wenn auch in geringerer Ausbeute. Wenn das angestrebte Produkt methio-20 ninfrei sein soll, dann erweist sich eine Bromcyanspaltung beim Methionin neben der angestrebten Sequenz als hoch wirksam. In entsprechender Weise können arginin- und ly-sinfreie Produkte, zum Beispiel mit Trypsin oder Chymo-trypsin bei arg-arg, lys-lys oder ähnlichen Spaltstellen neben 25 der angestrebten Sequenz enzymatisch gespalten werden. Falls bei der Spaltung beispielsweise unerwünschtes Arginin an- das angestrebte Produkt gebunden bleibt, kann es durch Carboxypeptidaseaufschluss entfernt werden. Bei Verwendung von Typsin zur Spaltung bei arg-arg können Lysinstel-30 len innerhalb des angestrebten Polypeptids vorher geschützt werden, beispielsweise mit Maleinsäure- oder Citraconsäure-anhydrid. Die beispielsweise erörterten Spaltarbeitsweisen sind lediglich repräsentative Varianten der vielen verschiedenen Möglichkeiten, die für den Fachmann aufgrund der hier 35 angegebenen Lehre offensichtlich sind.

Abspaltbares Protein kann am C- oder N-Ende eines bestimmten Polypeptids oder sogar innerhalb des Polypeptids selbst ausgebildet werden, wie dies bei der Einschlusssequenz, durch die sich Proinsulin und Insulin voneinander 40 unterscheiden, der Fall ist. Wiederum kann der verwendete Träger den Code für die Expression von Protein mit sich wiederholenden Sequenzen des angestrebten Polypeptids liefern, die jeweils durch selektive Spaltstellen voneinander getrennt sind. Es ist jedoch besonders bevorzugt, wenn Codone 45 für überflüssiges Protein vor dem Strukturgen des angestrebten Produkts übertragen werden, wie bei dem in den Figuren erläuterten Fall. In allen Fällen soll für die Aufrechterhaltung des passenden Ableserahmens in bezug auf das Regulon gesorgt werden.

50 3. Expression von Immunogenen

Die Fähigkeit, sowohl ein spezifisches Polypeptid als auch überflüssiges Protein auszubilden, ergibt ein brauchbares Mittel für die Erzeugung von immunogenen Substanzen. Polypeptid-«Haptene» (d.h. Substanzen, die spezifisch durch 55 Antikörper und ähnliche Stoffe gebundene Determinanten enthalten, aber gewöhnlich zu klein sind, um eine Immunwirkung hervorzurufen) können als Konjugate mit zusätzlichem Protein ausreichender Grösse für eine Immunogenität ausgebildet werden. Das ß-gal-Somatostatin-Konjugat, des-60 sen Herstellung hierin beschrieben ist, ist tatsächlich von im-munogener Grösse und kann deshalb Antikörper erzeugen, die das Somatostatinhapten binden. Proteine mit mehr als 100 Aminosäuren, meist mit mehr als 200 Aminosäuren, zeigen immunogenen Charakter.

Wie vorstehend beschriebene hergestellte Konjugate können zur Bildung von Antikörpern verwendet werden, die sich in Radioimmun- oder anderen Prüfungen auf das Hapten und auch für die Erzeugung von Vaccinen eignen. Im folgen65

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den wird ein Beispiel für die letztgenannte Anwendung gegeben. Bromcyan- oder andere Spaltprodukte von viralem Mantelprotein ergeben Oligopeptide, die sich an Antikörper binden, der selbst zu dem Protein wird. Erhält sie die Aminosäuresequenz eines solchen Oligopeptidhaptens, kann daher heterologe DNA als Konjugat mit weiterem Protein ausgebildet werden, das Immunogenität beisteuert. Solche Konjugate können als Vaccinen verwendet werden, die geringere Nebenwirkungen zeigen, als sie mit der Verwendung von Mantelprotein selbst zur Erzielung von Immunität verbunden sind.

4. Die Kontrollelemente

In Figur 1 ist ein Prozess dargestellt, bei welchem ein Transformantorganismus ein Polypeptidprodukt aus hetero-loger DNA ausbildet, die unter die Kontrolle eines Régulons «homolog» zu dem Organismus in seinem nicht umgewandelten oder untransformierten Zustand gebracht worden ist. Chromosomen-DNA von lactoseabhängigem E. coli enthält als ein Lactose- oder «lac»-Operon, das den Lactoseauf-schluss u.a. durch Bildung des Enzyms ß-Galactosidase vermittelt. In dem erläuterten Fall werden die lac-Kontrollele-mente aus einem Bakteriophagen, X plac 5, erhalten, der für E. coli infektiös ist. Das lac-Operon des Phagen war seinerseits durch Überführung aus der gleichen bakteriellen Spe-cies erhalten worden, daher die «Homologie». Homologe Regulone, die sich zur Verwendung in dem beschriebenen Verfahren eignen, können statt dessen auch aus für den Organismus nativer Plasmid-DNA stammen.

Die Einfachheit und Wirksamkeit des lac-Promoter-Ope-rator-Systems begründen seine Verwendung in dem beschriebenen System genauso wie seine Fähigkeit, von IPTG (Iso-propylthio-ß-D-galactosid) induziert zu werden. Selbstverständlich können auch andere Operone oder Teile davon verwendet werden, zum Beispiel ^.-Promoter-Operator, Ara-binose-Operon (phi 80 dara) oder die Colicin El-, Galactose-, alkalische Phosphatase- oder Tryptophan-Operone. Aus dem letzteren, (d.h. «Tryp-Operon») stammende Promoter-Operatoren können 100-prozentige Repression während der Induktion (mit Indolacrylsäure) und Gewinnung vermitteln.

5. Plasmidaufbau, allgemein

Die Einzelheiten des in Figur 4 schematisch erläuterten Prozesses ergeben sich aus dem weiter unten folgenden experimentellen Teil. Bei diesem Punkt ist es jedoch von Nutzen, einige der zum Aufbau des Rekombinationsplasmids der bevorzugten Ausführungsform angewandten Arbeitsweisen kurz zu erörtern.

Bei der Clonbildung und Expression des synthetischen Somatostatingens werden zwei Plasmide verwendet. Jedes Plasmid hat eine EcoRI-Substrat-Stelle bei einem anderen Bereich des ß-Galactosidase-Strukturgens (vgl. Figur 4 und 5). Die Einfügung des synthetischen Somatostatin-DNA-Fragments in die EcoRI-Stellen dieser Plasmide bringt die Expression der genetischen Information in das Fragment ein, das sich unter der Kontrolle der lac-Operon-Kontrollele-mente befindet. Nach der Einfügung des Somatostatinfrag-ments in diese Plasmide sollte die Translation zu einem So-matostatinpolypeptid führen, dem entweder 10 Aminosäuren (pSOMl) oder praktisch die gesamte ß-Galactosidase-Untereinheitsstruktur (pSOMl 1-3) vorangestellt ist.

Das Schema des Plasmidaufbaus beginnt mit dem Plasmid pBR322, einem wohldefinierten Clonbildungsträger. Die Einführung der lac-Elemente in dieses Plasmid erfolgt durch Einfügung eines Haelll-Restriktions-Endonuclease-fragments (203 Nucleotide), das den lac-Promoter, die CAP-Bindungsstelle, den Operator, die Ribosomenbindungsstelle und die ersten 7 Aminosäurecodone des ß-Galactosidase-Strukturgens aufweist. Das Haelll-Fragment stammt aus X

plac5 DNA. Das EcoRI-gespaltene pBR322-Plasmid, dessen Termini mit T4 DNA-Polymersase und Desoxyribonucleo-tidtriphosphaten wieder hergestellt worden waren, wird stumpfendig mit dem Haelll-Fragment verbunden, wodurch 5 EcoRI-Termini an den Einfügungspunkten erzeugt werden. Durch Verbinden dieser Haelll- und wiederhergestellten EcoRI-Termini werden die EcoRI-Restriktionsstellen (vergleiche Figur 4 und 5) an jedem Terminus erzeugt. Transformanten von E. coli RR1 mit dieser DNA werden auf einem io 5-Brom-4-chlor-incolylgalactosid-(X-gal)-Madium auf Resistenz gegen Tetracyclin (Tc) und Ampicillin (Ap) selektio-niert. Auf diesem Indikatormedium können Kolonien, die für die Synthese von ß-Galactosidase aufgrund der erhöhten Anzahl von lac-Operatoren, die Repressor titrieren, verant-i5 wortlich sind, durch ihre blaue Farbe identifiziert werden. Zwei Orientierungen des Haelll-Fragments sind möglich, aber sie werden aufgrund der asymmetrischen Lage einer Hha-Restriktionsstelle in dem Fragment unterschieden. Das Plasmid pHBlO wird weiter modifiziert, wodurch die zu dem 20 lac-Operator (pB20) distale EcoRI-Endonuclease-Stelle eliminiert wird.

Die acht chemisch synthetisierten Oligodesoxyribonu-cleotide (Figur 2) werden an den 5'-Termini mit [32P]-gamma-ATP durch Polynucleotidkinase markiert und mit T4 DNA-25 Lignase verbunden. Durch Wasserstoffbindung zwischen den überlappenden Fragmenten erfolgt eine Selbstanordnung des Somatostatingens und schliesslich eine Polymerisation zu grossen Molekülen infolge der cohäsiven Restriktionsstellentermini. Die Ligaturprodukte werden mit EcoRI-30 BamHI-Restriktionsendonucleasen behandelt, wodurch das Somatostatingen, wie in Figur 2 dargestellt, erzeugt wird.

Das synthetische Somatostatingenfragment mit EcoRI-und Baml-Termini wird an das pBH20-Plasmid gebunden, das mit den Eco RI- und BamHI-Restriktionsendonucleasen 35 und alkalischer Phosphatase vorbehandelt worden ist. Die Behandlung mit alkalischer Phosphatase führt zu einer Molekularselektion von Plasmiden mit dem eingefügten Fragment. Mit dieser gebundenen DNA erhaltene ampicillinresistente Transformanten werden hinsichtlich Tetracyclin-40 empfmdlichkeit aussortiert, und mehrere werden bezüglich der Einfügung eines EcoRI-BamHI-Fragments passender Grösse untersucht.

Beide Stränge der EcoRI-BamHI-Fragmente von Plasmiden aus zwei Clonen werden einer Nucleotidsequenzanalyse, 45 beginnend mit den BamHI- und EcoRI-Stellen, unterworfen. Die Sequenzanalyse wird bis in die lac-Regelelemente ausgedehnt. Die lac-Fragmentsequenz erweist sich als intakt, und in einem Fall werden die Nucleotidsequenzen pSOMl beider Stränge unabhängig voneinander bestimmt, wobei jede die 50 in Figur 5A angegebene Sequenz ergibt.

Das EcoRI-Pst-Fragment des pSOMl-Plasmids mit dem lac-regelnden Element wird entfernt und durch das EcoRI-Pst-Fragment von pBR322 ersetzt, wodurch das Plasmid pSOMl 1 erzeugt wird. Das EcoRI-Fragment von X plac5, 55 das den lac-Operonkontrollbereich und den grössten Teil des ß-Galactosidase-Strukturgens aufweist, wird in die EcoRI-Stelle von pSOM 11 eingefügt. Zwei Orientierungen des Eco-RI-lac-Fragments von X plac5 sind zu erwarten. Eine davon würde den richtigen Ableserahmen bis in das Somatostatin-60 gen hinein behalten und die andere nicht. Die Analyse von für sich allein isolierten Clonen auf Somatostatinaktivität ergibt dann Clone, die das richtig orientierte Gen enthalten, und einer dieser Clone wird als pSOM 11-3 bezeichnet.

6. Der Mikroorganismus 65 Als mögliche Organismen für die Transformation sind verschiedene einzellige Mikroorganismen vorgeschlagen worden, beispielsweise Bakterien, Fungi und Algen. Dabei handelt es sich um solche einzelligen Organismen, die in

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Kulturen oder durch Fermentation gezüchtet werden können. Bakterien sind grösstenteils die für das Arbeiten damit am besten geeigneten Organismen. Zu einer Transformation zugänglichen Bakterien gehören Enterobacteriaceae, zum Beispiel Stämme von Escherichia coli und Salmonella; Bacil-laceae, wie Bacillus subtitis; Pneumococcus; Streptococcus und Haemophilus influenzae.

Der für die im folgenden beschriebenen experimentellen Arbeiten gewählte Organismus ist E. coli, Stamm RR1, Genotyp: Pro-Leu~Thi~RB-MB ree A+ Strr Lac y~. E. coli RR1 wird aus E. coli HB101 (H. W. Boyer et al, J. Mol.

Biol. (1969) 41, 459^472) durch Paarung mit E. coli K12 Stamm KL16 als Hfr-Donor, vgl. J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York, 1972) [Kulturen von Coli RR1 und E. Coli RR1 (pBR322) sind am 8. November 1977 bei der American Type Culture Collection ohne irgendwelche Beschränkung hinsichtlich der Zugänglichkeit hinterlegt worden und haben die ATCC-Nummern 31 343 und 31 344 erhalten].

Der Somatostatin erzeugende Organismus ist am 28. Oktober 1978 gleichfalls bei der American Type Culture Collection, 12 301, Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20 852 -US, mit der Hinterlegungsnummer ATCC Nr. 31 447 hinterlegt worden.

Im Fall von Humaninsulin werden A- und B-Ketten-Ge-ne in E. coli K-12 Stamm 294 (Ende A, thi~, Hsr-, hsmk+), der seit dem 28. Oktober 1978 ebenfalls bei der American Type Culture Collection hinterlegt ist, und zwar mit der Hinterlegungsnummer ATCC Nr. 31 446 geclont, und dieser Organismus wird zur Expression der A-Kette E. coli K-12 Stamm 294 [pIAl], der ebenfalls seit dem 28. Oktober 1978 bei der American Type Culture Collection hinterlegt ist, und zwar mit der Hinterlegungsnummer ATCC Nr. 31 448, verwendet. Die B-Kette von Humaninsulin wird zuerst in einem Derivat von HB101, d.h. E. coli K-12 Stamm Dl210, ein lac+ (iQo+z'y+), ausgebildet, und dieser B-Gen enthaltender Organismus ist gleichfalls am 28. Oktober 1978 bei der American Type Culture Collection hinterlegt worden, und zwar mit der Hinterlegungsnummer ATCC Nr. 31 449. Das B-Gen kann aber auch in den zuerst genannten Organismen, d.h. Stamm 294, eingeführt und davon ausgebildet werden.

Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung weiter erläutert.

I. Somatostatin

1. Aufbau von Somatostatingenfragmenten

Zuerst werden acht Oligodesoxyribinucleotide, die in Figur 2 mit A bis H bezeichnet sind, nach der modifizierten Triestermethode von K. Itakura et al, J. Am. Chem. Soc. 97, 7327 (1975) aufgebaut. Im Fall der Fragmente C, E und H wird jedoch eine verbesserte Arbeitsweise angewandt, wobei zunächst vollständig geschützte Trimere als Grundeinheiten für den Aufbau längerer Oligodesoxyribonucleotide hergestellt werden. Die verbesserte Arbeitsweise ist schematisch in Figur 3 dargestellt, worin B Thymin, N-benzoyliertes Adenin, N-benzoyliertes Cytosin oder N-isobutyraliertes Guanin bedeutet. Unter Bezugnahme auf Figur 3 verläuft mit einem Überschuss von I (2 mmolar) die Kupplungsreaktion II (1 mmolar) mit Hilfe eines starken Kupplungsreagens 2,4, 6-Triisopropylbenzolsulfonyltetrazolid (TPSTe, 4 mmolar; 2) in 60 Minuten nahezu vollständig. Nach Entfernung der 5'-Schutzgruppe mit einer 2-prozentigen Benzolsulfonsäure-lösung kann das 5'-Hydroxydimere V durch einfache Lösungsmittelextraktion mit wässriger NaHC03-Lösung in CHC13 von einem Überschuss des 3'-Phosphodiestermono-meren IV abgetrennt werden. Der vollständig geschützte Tri-merblock wird danach aus dem 5'-Hydroxydimeren V, I (2 mmolar) und TPSTe (4 mmolar) hergestellt und durch Chromatographie an Kieselgel nach B. T. Hunt et al, Chem. and Ind. 1868 (1967) isoliert. Die Ausbeuten der nach der verbesserten Arbeitsweise hergestellten Trimeren sind in Tabelle II angegeben.

Tabelle II

Ausbeute an vollständig geschützten Trimeren

Sequenz

Ausbeute

Sequenz

Ausbeute

TTT

81%

ATG

69%

TTT

75%

GCC

61%

GGA

41%

CCA

72%

AGA

49%

CAA

72%

ATC

71%

TT A

71%

CCT

61%

CAT

52%

ACA

63%

CCC

73%

ACC

65%

AAC

59%

CGT

51%

GAT

60%

Die acht Oligodesoxyribonucleotide werden nach der Entfernung aller Schutzgruppen durch Hochdruckflüssigchromatographie an Permaphase AAX (R.A. Henry et al J. Chrom. Sci. II, 358 (1973) ) gereinigt. Die Reinheit jedes Oli-gomeren wird durch Homochromatographie an Dünn-schicht-DEAE-Cellulose und auch durch Gelelektrophorese in 20-prozentiger Acrylamidplatte nach Markieren der Oligomeren mit [gamma-32P]-ATP in Gegenwart von Poly-nucleotid-Kinase kontrolliert. Aus jedem DNA-Fragment wird ein markiertes Hauptprodukt erhalten.

2. Verknüpfung und Acrylamidgelanalyse von Somato-statin-DNA

Die 5'-OH-Termini der chemisch synthetisierten Fragmente A bis H werden getrennt mit T4-Polynucleotid-Kinase phosphoryliert. Zur Phosphorylierung wird [32P]-gamma-ATP verwendet, wodurch die Reaktionsprodukte autoradiographisch verfolgt werden können, obwohl, wie ersichtlich, auch unmarkiertes ATP verwendet werden kann, wenn eine Autoradiographie weggelassen wird. Unmittelbar vor der Kinasereaktion werden 25 uCi [gamma-32P]ATP (etwa 1500 Ci/mmolar) (Maxam and Gilbert, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 74, 1507 (1977) ) in 0,5 ml Eppendorf-Rohren zur Trockne eingedampft. 5 Mikrogramm Fragment werden mit zwei Einheiten T4-DNA-Kinase (Hydroxylapatitfraktion, 2500 Einheiten/ml; 27) in 70 mm Tris-HCl pH 7,6, 10 mm MgCl2, 5 mm Dithiothreitol in einem Gesamtvolumen von 150 |il 20 Minuten bei 37 °C inkubiert. Zur Gewährleistung maximaler Phosphorylierung der Fragmente für Verknüpfungszwecke werden 10 (xl einer Mischung aus 70 mm Tris-HCl pH 7,6, 10 mm MgCl2, 5 mm Dithiothreitol, 0,5 mm ATP und zwei Einheiten DNA-Kinase zugegeben, und die Inkubation noch weitere 20 Minuten bei 7 °C fortgesetzt. Die Fragmente (250 ng/jil) werden ohne weitere Behandlung bei —20 °C aufgehoben. Jeweils 1,25 ng der mit Kinase versehenen Fragmente A, B, E und F werden in einem Gesamtvolumen von 50 jj.1 in 20 mm Tris-HCl pH 7,6, 10 mm MgCl2, 10 mm Dithiothreitol, 0,5 mm ATP und 2 Einheiten T4 DNA-Ligase (Hydroxylapatitfraktion, 400 Einheiten/ml; 27) während 16 Stunden bei 4 C verknüpft. Die Fragmente

C, D, G und H werden unter vergleichbaren Bedingungen verknüpft. Proben von jeweils 2 ml werden zur Analyse durch Elektrophorese auf einem 10-prozentigen Polyacryl-amidgel und anschliessend durch Autoradiographie (H.L. Heyneker et al, Nature 263, 748 (1976) entnommen, wobei nicht umgesetzte DNA-Fragmente durch rasch wanderndes Material dargestellt werden und die monomere Form der verknüpften Fragmente mit Bromphenolblau (BPB) wandert. Aufgrund der kohäsiven Enden der verknüpften Fragmente A, B, E und F sowie der verknüpften Fragmente C,

D, G und H erfolgt auch eine gewisse Dimerisierung. Diese

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Dimeren stellen das am langsamsten wandernde Material dar und können durch Restriktionsendonuclease EcoRI bzw. Bam HI gespalten werden. Die zwei Halbmoleküle (verknüpftes A + B + E + F und verknüpftes C + D + G + H) werden in einer weiteren Verknüpfungsstufe verbunden, die 16 Stunden bei 4 °C in einem Endvolumen von 150 jLil durchgeführt wird. Zur Analyse wird 1 Mikroliter entnommen. Das Reaktionsgemisch wird 15 Minuten auf 65 °C erwärmt, wodurch die T4-DNA-Ligase entaktiviert wird. Die Wärmebehandlung hat auf das Wanderungsbild der DNA-Mischung keinen Einfluss. Dem Reaktionsgemisch wird für die Spaltung der multimeren Formen der Somato-statin-DNA in 30 Minuten bei 37° ausreichende Restriktionsendonuclease BamHI zugesetzt. Nach Zugabe von NaCl auf 100 mMol wird die DNA mit EcoRI-Endonu-clease aufgeschlossen. Der Restriktionsendonucleaseauf-schluss wird durch Phenol-Chloroform-Extraktion der DNA beendet. Das Somatostatin-DNA-Fragment wird durch preparative Elektrophorese auf einem 10-prozentigen Polyacryl-amidgel von nichtumgesetzten und teilweise verknüpften DNA-Fragmenten befreit. Die das Somatostatin-DNA-Fragment enthaltende Bande wird aus dem Gel ausgeschnitten, und die DNA wird durch Zerschneiden des Gels in kleine Stücke und Extraktion mit Elutionspuffer (0,5 m Ammo-niumacetat, 10 mm MgCl2, 0,1 mm EDTA, 0,1% SDS) über Nacht bei 26 °C eluiert. Die DNA wird mit 2 Volumen Ethanol gefällt, zentrifugiert, in 200 |xl 10 mm Tris-HCl pH 7,6 wieder gelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert, wodurch eine Somatostatin-DNA-Konzentration von 4 |xg/ml erhalten wird.

3. Aufbau von Rekombinationsplasmiden

In Figur 4 ist schematisch die Art und Weise dargestellt, in der das Somatostatingen enthaltende Rekombinationsplasmide aufgebaut werden, weshalb in Verbindung mit der folgenden Erörterung darauf Bezug genommen wird.

A. Das StammplasmidpBR 322

Das für die experimentelle Somatostatinclonbildung gewählte Plasmid ist pBR 322, ein kleines Plasmid (Molekulargewicht etwa 2,6 Megadalton) mit gegen die Antibiotika Ampicillin (Ap) und Tetracyclin (Tc) resistenten Genen. Wie in Figur 4 angegeben, weist das ampicillinresistente Gen eine Spaltstelle für die Restriktionsendonuclease Pst I und das tetracyclinresistente Gen eine entsprechende Stelle für Restriktionsendonuclease Bam HI auf, und eine EcoRI-Stelle befindet sich zwischen den Apr und TCr-Genen. Das Plasmid pBR322 stammt aus pBR313, einem 5,8 Megadalton AprTcrColimm-Plasmid (R.L. Rodriquez et al, ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology 5, 471-77 (1976), R.L. Rodriques et al, Construction and Characteri-zation of Cloning Vehicles, in Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expression, S. 471-77, Academic Press, Inc. (1976). Das Plasmid pBR322 und die Art seiner Gewinnung sind ausführlich in F. Bolivar et al, «Construction and Characterization of New Cloning Vehicles II. A Multi-purpose Cloning System», Gene (November 1977) beschrieben.

B. Aufbau des Plasmids pBHIO

5 Mikrogramm Plasmid pBR322-DNA werden mit 10 Einheiten der Restriktionsendonuclease EcoRI in 100 milli-molarer Tris-HCl pH 7,6, 100 millimolarem NaCl, 6 milli-molarem MgCl2 bei 37 °C 30 Minuten lang aufgeschlossen. Die Reaktion wird durch Phenol-Chloroform-Extraktion beendet; die DNA wird dann mit 2'/2 Volumina Ethanol gefallt und in 50 jo.1 T4 DNA Polymerase-Puffer wieder suspendiert (67 mm Tris-HCl pH 8,8, 6,7 mm MgCl2, 16,6 mm (NH4)2S04, 167 ng/ml Rinderserumalbumin, je 50 |xm der einzelnen dNTP; A. Panet et al, Biochem. 12, 5045 (1973) ). Die Reaktion wird durch Zugabe von zwei Einheiten T4

DNA-Polymerase eingeleitet. Nach 30 Minuten langem Inkubieren bei 37 C wird die Reaktion durch eine Phenol-Chloroform-Extraktion der DNA beendet, worauf mit Ethanol gefällt wird. 3 Mikrogramm X plac5 DNA (Shapiro et al Nature 224, 768 (1969) ) werden 1 Stunde bei 37 C mit dem Restriktionsenzym Haelll (3 Einheiten) in 6 mm Tris-HCl pH 7,6, 6 mm MgCl2, 6 mm ß-Mercaptoethanol in einem Gesamtvolumen von 20 |rl aufgeschlossen. Die Reaktion wird durch 10 Minuten langes Erwärmen auf 65 C abgebrochen. Die pBR322-behandelte DNA wird mit der Ha-elll-aufgeschlossenen X plac5-DNA vermischt und in einem Gesamtvolumen von 30 ml mit 1,2 Einheiten T4 DNA-Liga-se (Hydroxylapatitfraktion; A. Panet et al, supra) in 20 mm Tris-HCl pH 7,6, 10 mm MgCl2, 10 mm Dithiothreitol, 0,5 mm ATP in 12 Stunden bei 12 r C stumpfendig verknüpft. Die verknüpfte DNA-Mischung wird gegen 10 mm Tris-HCl pH 7,6 dialysiert und zur Transformation von E. coli Stamm RR1 verwendet. Transformanten werden hinsichtlich Tetracyclin- und Ampicillin-Resistenz auf Minimalmediumplatten ausgewählt, die 40 (xg/ml 5-Brom-4-chlor-incolylgalactosid-(X-gal)-Medium (J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, New York, 1972) enthalten. Zur Synthese von ß-Galactosidase fähige Kolonien werden durch ihre blaue Farbe identifiziert. Nach der Durchsicht von 45 unabhängig voneinander isolierten blauen Kolonien erweisen sich drei davon als zwei EcoRI-Stellen enthaltende Plasmid-ENA, die durch etwa 200 Basenpaare voneinander getrennt sind. Die Lage eines asymmetrisch angeordneten Hhal-Fragments in dem HaeIII-lac-Kontrollfragment, b.p. 203, (W. Gilbert et al, in Protein-Li-gand Interactions, H. Sand und G. Blauer, Herausgeber (De Gruyter, Berlin (1975) S. 193-210) ermöglicht die Bestimmung der Orientierung des Haelll-Fragments, nun ein Eco-RI-Fragment, in diesen Plasmiden. Es zeigt sich, dass das Plasmid pBHIO das Fragment in der angestrebten Orientierung trägt, d.h. die lac-Transkription geht in das Tcr Gen des Plasmids ein.

C. Aufbau des Plasmids pBH20

Plasmid pBHIO wird dann modifiziert, um die zu dem lac-Operator distale EcoRI-Stelle zu eliminieren. Dies wird durch die bevorzugt verlaufende EcoRI-Endonucleasespal-tung an der distalen Seite unter teilweisem Schutz durch RNA-Polymerase der anderen EcoRI-Stelle bewirkt, die sich zwischen dem Tcr- und dem lac-Promoter befindet, zwischen denen nur etwa 40 Basenpaare angeordnet sind. 5 |ig DNA werden nach Bindung der RNA-Polymerase mit einer Einheit EcoRI in einem Gesamtvolumen von 10 (j.1 10 Minuten bei 37 °C aufgeschlossen. Die Reaktion wird durch 10 Minuten langes Erwärmen auf 65 C abgebrochen. Die EcoRI-Cohäsivtermini werden mit S1 Nuclease in 25 mm Na-acetat pH 4,5, 300 mm NaCl, 1 mm ZnCl2 5 Minuten lang bei 25 °C aufgeschlossen. Die Reaktion wird durch Zugabe von EDTA bis 10 mm und Tris-HCl pH 8 (bis 50 mm) abgebrochen. Die DNA wird mit Phenol-Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefallt und in 100 |il T4-DNA-Verknüpfungspuffer wieder suspendiert. Nach Zugabe von 1 jj.1 T4 DNA-Ligase wird die Mischung 12 Stunden bei 12 C inkubiert. Die verknüpfte DNA wird in E. coli Stamm RR1 transformiert, und AprTcr-Transformanten werden auf X-gal-Antibiotikummedium selektioniert. Durch Restriktionsenzymanalyse von DNA aus 10 isolierten blauen Kolonien ergibt sich, dass diese Clone Plasmid-DNA mit einer EcoRI-Stelle enthalten. Sieben dieser Kolonien haben die EcoRI-Stelle, die sich zwischen dem lac- und Tcr-Promotor befindet, behalten. Die Nucleotidsequenz von der EcoRI-Stelle bis in den lac-Regel-bereich eines dieser Plasmide, pBH20, wird bestätigt gefunden. Dieses Plasmid wird dann zur Clonbildung des Somatostatingens verwendet.

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D. Aufbau von Plasmid pSOM 1

20 Mikrogramm Plasmid pHB20 werden mit Restriktionsendonuclease EcoRI und BamHI in einem Gesamtvolumen von 50 nl vollständig aufgeschlossen. Nach Zugabe von bakterieller alkalischer Phosphatase (0,1 Einheit von Worthington BAPF) wird die Inkubation 10 Minuten bei 65 °C fortgesetzt. Die Reaktion wird durch Phenol-Chloroform-Extraktion beendet, und die DNA wird mit 2 Volumen Ethanol gefallt, zentrifugiert und in 50 p.110 mm Tris-HCl pH 7,6,1 mm EDTA gelöst. Die alkalische Phosphatasebe-handlung verhindert mit guter Wirkung eine Selbstverknüpfung der EcoRI-BamHI-behandelten pBH20-DNA, aber kreisförmige Rekombinationsplasmide, die Somatostatin-DNA enthalten, können auch nach Verknüpfung noch ausgebildet werden. Da E. coli RR1 durch linerare Plasmid-DNA nur mit sehr geringer Wirksamkeit transformiert wird, enthält der grösste Teil der Transformanten Rekombinationsplasmide. 50 Mikroliter Somatostatin-DNA (4 ng/ml) werden mit 25 ml der BamHI-EcoRI alkalische Phospha-tase-behandelter pBH20 DNA in einem Gesamtvolumen von 50 p.1, enthaltend 20 mm Tris-HCl pH 7,6,10 mm MgCl2, 10 mm Dithiothreitol, 0,5 mm ATP und 4 Einheiten T4 DNA-Ligase bei 22 °C verknüpft. Nach 10, 20 und 30 Minuten werden dem Reaktionsgemisch weitere 40 ng Somatostatin-DNA zugesetzt (die allmähliche Zugabe von Somatostatin-DNA kann die Verknüpfung mit dem Plasmid anstelle einer Selbstverknüpfung begünstigen). Die Verknüpfungsreaktion wird noch 1 Stunde fortgesetzt, worauf die Mischung gegen 10 mm Tris-HCl pH 7,6 dialysiert wird. Bei einem Vergleichsversuch wird BamHI-, EcoRI-, alkalische Phosphadase-behandelte pBH20-DNA unter vergleichbaren Bedingungen, aber in Abwesenheit von Somatostatin DNA verknüpft. Beide Präparate werden ohne weitere Behandlung zum Transformieren von E. coli RR1 verwendet. Die Transformationsversuche werden in einem P3-physikalischen Behältergerät National Institutes of Health, USA, Recombinant DNA Research Guidelines, 1976) durchgeführt. Transformanten werden auf Platten aus Minimalmedium, das 20 (ig/ml Ap und 40 jxg/ml X-gal enthält, selektioniert. Es werden 10 Transformanten, von denen alle Tc-empfindlich sind, isoliert. Zur Bezugnahme werden sie als pSOMl, pSOM2, etc.... pSOMIO bezeichnet. Bei dem Vergleichsversuch werden keine Transformanten erhalten. Vier der 10 Transformanten enthalten Plasmide mit sowohl einer EcoRI- als auch einer BamHI-Stelle. Die Grösse des kleinen EcoRI, BamHI-Fragments dieser Rekombinationsplasmide ist in allen 4 Fällen der Grösse der in vitro hergestellten Somato-statin-DNA vergleichbar. Basensequenzanalyse nach Ma-xam und Gilbert Proc. Nat. Acad. Sei. USA 74, 560 (1977) ergibt, dass das Plasmid pSOMl das gewünschte Somato-statin-DNA-Fragment als Einfügung enthält.

Die DNA-Sequenzanalyse des Clons mit Plasmid pSOMl lässt erwarten, dass damit ein Somatostatin enthaltendes Peptid erzeugt wird. Somatostatinradioimmunaktivi-tät lässt sich jedoch in Extrakten von Zellkörnern oder überstehenden Kulturflüssigkeiten nicht nachweisen. Die Gegenwart von Somatostatin lässt sich auch nicht nachweisen, wenn die wachsende Kultur direkt zu 70-prozentiger Ameisensäure und Bromcyan gegeben wird. Es ist beobachtet worden, dass E. coli RRl-Extrakte exogenes Somatostatin sehr rasch abbauen. Das Fehlen von Somatostatinaktivität in Clonen, die Plasmid pSOMl enthalten, kann sehr wohl eine Folge eines intracellulären Abbaus durch endogene proteolytische Enzyme sein. Plasmid pSOMl wird daher zum Aufbau eines Plasmids verwendet, das den Code für ein Vorläuferprotein liefert, das Somatostatin enthält und gross genug ist, um einem proteolytischen Abbau zu widerstehen.

E. Der Aufbau der Plasmide pSOM 11 und pSOM 11-3

Es wird ein Plasmid aufgebaut, worin das Somatostatin-gen am C-Terminus des ß-Galactosidasegens angeordnet werden kann, das die Translation in Phase hält. Das Vorhandensein einer EcoRI-Stelle nahe dem C-Terminus dieses Gens und die verfügbare Aminosäuresequenz dieses Proteins (B. Polisky et al, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 73, 3900 (1976), A.V. Fowler et al, ibid. 74, 1507 (1976), A.I. Bukhari et al, Nature New Biology 243, 238 (1973) und K.E. Lang-ley, J. Biol. Chem. 250, 2587 (1975) ) ermöglichen die Einführung des EcoRI, BamHI-Somatostatingens in die EcoRI-Stelle unter Aufrechterhaltung des richtigen Leserahmens. Zum Aufbau eines solchen Plasmids werden 50 ng pSOMl -DNA mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Pstl in einem Gesamtvolumen von 100 |il aufgeschlossen. Ein präpa-ratives 5-prozentiges Polyacrylamidgel wird zur Abtrennung des grossen Pst-EcoRI-Fragments verwendet, das das So-matostatingen des kleinen Fragments mit den lac-Regelele-menten aufweist. Die grosse Bande wird aus dem Gel ausgeschnitten, und die DNA wird durch Aufteilen des Gels in kleine Stücke und Extraktion bei 65 °C über Nacht eluiert. In vergleichbarer Weise werden 50 ng des Plasmids pBR322 DNA mit Pstl- und EcoRI-Restruktionsendonuclease aufgeschlossen, und die beiden erhaltenen DNA-Fragmente werden durch präparative Elektrophorse auf einem 5-prozenti-gen Polyacrylamidgel gereinigt. Das kleine Pstl-EcoRI-Frag-ment von pBR322 (1 (ig) wird mit dem grossen Pstl-EcoRI-DNA-Fragment (5 jxg) aus pSOMl in einem Gesamtvolumen von 50 |il mit einer Einheit T4-DNA-Ligase in 12 Stunden bei 12 °C verknüpft. Das Verknüpfungsgemisch wird zum Transformieren von E. coli RRI verwendet, und Transformanten werden auf X-gal-Medium auf Ampicillinresi-stenz selektioniert. Erwartungsgemäss ergeben nahezu alle der Apr-Transformanten (95%) weisse Kolonien (kein lac-Operator) auf X-gal-Indikatorplatten. Das erhaltene Plasmid, pSOMl 1, wird für den Aufbau des Plasmids pSOM 11-3 verwendet. Eine Mischung aus 5 ng pSOM 11 -DNA und 5 |ag X plac5-DNA wird mit 10 Einheiten EcoRI 30 Minuten bei 37 °C aufgeschlossen. Der Restriktionsendo-nucleaseaufschluss wird durch Phenol-Chloroform-Extrak-tion beendet. Die DNA wird dann mit Ethanol gefallt und in 50 (j.1 T4-DNA-Ligase-Puffer erneut suspendiert. Eine Einheit T4-DNA-Ligase wird zu der Mischung gegeben, worauf 12 Stunden bei 12 °C inkubiert wird. Die Verknüpfungsmischung wird gegen 10 mM Tris-HCl (pH 7,6) dialysiert und zum Transformieren von E. coli, Stamm RRI, verwendet. Transformanten werden auf X-gal-Platten, die Ampicillin enthalten, auf Apr selektioniert und auf wesentliche ß-Ga-lactosidaseerzeugung ausgelesen. Etwa 2% der Kolonien sind blau (pSOMl 1-1, 11-2 etc.). Restriktionsenzymanalyse von aus diesen Clonen erhaltener Plasmid-DNA ergibt, dass alle Plasmide ein neues EcoRI-Fragment von etwa 4,4 Megadalton aufweisen, das die lac-Operon-Regelstellen und der grössten Teil des ß-Galactosidasegens aufweist. Da zwei Orientierungen des EcoRI-Fragments möglich sind, wird die asymmetrische Lage einer Hindlll-Restrictionsstelle dazu benutzt, festzustellen, welche dieser Kolonien dieses EcoRI-Fragments mit fortschreitender lac-Transkription bis in das Somatostatingen aufweist. Hindlll-BamHI-Doppelauf-schlüsse zeigen, dass nur die Clone, die die Plasmide pSOMl 1-3, pSOMl 1-5, pSOMl 1-6 und pSOMll-7 aufweisen, das EcoRI-Fragment in dieser Orientierung enthalten.

4. Radioimmunprüfung auf Somatostatinaktivität

Die standardisierte Radioimmunprüfung (RIA) auf Somatostatin (A. Arimura et al, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 148, 784 (1975) ) wird durch Verringerung des Prüfvolumens und durch Verwendung von Phosphatpuffer modifiziert.

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11

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Tyr1 '-Somatostatin wird unter Anwendung einer Chlor-amin-T-Arbeitsweise (ibid.) iodiert. Für die Prüfung auf Somatostatin wird die Probe, gewöhnlich in 70-prozentiger Ameisensäure, die 5 mg/ml Bromcyan enthält, in einem konischen Polypropylenrohr (0,7 ml, Sarstedt) über feuchtem KOH im Vakuum getrocknet. Nach Zugabe von 20 Mikroliter PBSA-Puffer (75 mm NaCl; 75 mm Natriumphosphat, pH 7,2; 1 mg/ml Rinderserumalbumin und 0,2 mg/ml Natri-umazid) werden 40 |il eines [125J]-Somatostatin-«Cocktails» und 20 (il einer 1000-fachen Verdünnung von Kaninchen-antisomatostatinimmunserum S39 (Vale et al, Metabolism 25, 1491 (1976) ) in PBSA zugegeben. Der [l25J]-Somatosta-tin-Cocktail enthält je Milliliter PBSA-Puffer 250 (ig normales Kaninchen-gamma-Globulin (Antibodies, Inc.), 1500 Einheiten Proteaseinhibitor («Trasylol», Calbio-chem.) und ca. 100 000 Zählungen [l25J]Tyr''-Somatostatin. Nach wenigstens 16 Stunden bei Zimmertemperatur werden 0,333 ml Ziegen-Antikaninchen-gamma-Globulin (Antibodies, Inc., P=0,03) in PBSA-Puffer zu den Proberöhrchen gegeben. Die Mischung wird 2 Stunden bei 37 °C inkubiert, auf 5 °C abgekühlt und dann bei 10 000 x g 5 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird entfernt, und das Korn wird in einem gamma-Zähler gezählt. Mit der verwendeten Menge an Antiserum werden 20% der Zählungen ohne unmarkiertes konkurrierendes Somatostatin gefallt. Der Hintergrund mit unendlichem Somatostatin (200 ng) macht gewöhnlich 3% aus. Die Hälfte der maximalen Konkurrenz wird mit 10 pg Somatostatin erhalten. Vorversuche mit Extrakten von E. coli Stamm RRI (Empfängerstamm) ergaben, dass weniger als 10 pg Somatostatin in Gegenwart von 16 ng oder mehr bromcyanbehandeltem bakteriellen Protein ohne weiteres erkennbar sind. Mehr als 2 jrg Protein aus mit Ameisensäure behandelten bakteriellen Extrakten wirken sich durch Verstärkung des Hintergrunds etwas störend aus, aber diese Störung wird durch Bromcyanspaltung weitgehend kompensiert. Rekonstruktionsversuche zeigen, dass Somatostatin in mit Bromcyan behandelten Extrakten stabil ist.

A. Konkurrenz durch bakterielle Extrakte

Die Stämme E. coli RRI (pSOMl 1-5) und E. coli RRI (pSOMl 1-4) werden in Luria-Brühe bei 37 °C bis 5 x 108 Zellen/ml gezüchtet. Nach Zugabe von IPTG bis auf 1 mm wird die Züchtung noch 2 Stunden fortgesetzt. Aliquote Anteile von je 1 ml werden in einer Eppendorf-Zentrifuge einige Sekunden zentrifugiert, und die Körner werden in 500 (il 70-prozentiger Ameisensäure, die 5 mg/ml Bromcyan enthält, suspendiert. Nach etwa 24 Stunden bei Zimmertemperatur werden die aliquoten Anteile mit Wasser auf das 10-fache verdünnt, und die in Figur 6 angegebenen Volumina werden dreimal auf Somatostatin geprüft. In Figur 6 bedeutet «B/B0» das Verhältnis von in Gegenwart der Probe gebundenem [125J]-Somatostatin zu dem in Abwesenheit von konkurrierendem Somatostatin gebundenem. Jeder Punkt entspricht dem Durchschnitt von drei Rohren. Der Proteingehalt der unverdünnten Proben wird mit 2,2 mg/ml für E. coli RRI (pSOMl 1-5) und mit 1,5 mg/ml für E. coli RRI (pSOM-4) bestimmt.

B. Das Auslesen von pSOMl 1-Clonen auf Somatostatin

Wie oben in Verbindung mit Figur 6 beschrieben, werden mit Bromcyan behandelte Extrakte von 11 Clonen (pSOMl 1-2, pSOMl 1-3, etc.) hergestellt. Dreimal 30 Mikroliter jedes Extrakts werden zur Radioimmunprüfung entnommen , deren Ergebnisse in Figur 7 erscheinen. Der Bereich der Prüfpunkte ist angegeben. Die Werte für pico-gramm Somatostatin sind von einer Standardkurve abgelesen, die als Teil des gleichen Versuchs erhalten wurde.

Die oben angegebenen Ergebnisse der Radioimmunprüfung können folgendermassen zusammengefasst werden: Im

Gegensatz zu den Ergebnissen der Versuche mit pSOMl zeigen vier Clone (pSOM 11-3, 11-5, 11-6 und 11-7) ohne weiteres nachweisbare Somatostatinradioimmunaktivität (Figuren 6 und 7). Restriktionsfragmentanalyse ergibt, dass s pSOM 11-3, pSOM 11-5, pSOM 11-6 und pSOM 11-7 die gewünschte Orientierung des lac-Operon aufweisen, wohingegen pSOMl 1-2 und 11^4 die entgegengesetzte Orientierung zeigen. Es besteht somit eine einwandfreie Beziehung zwischen der richtigen Orientierung des lac-Operon und der Erio zeugung von Somatostatin-Radioimmunaktivität.

C. Wirkungen von IPTG-Induktion und CNBr-Spaltung auf positive und negative Clone

Die Ausgestaltung des Somatostatinplasmids lässt darauf schliessen, dass die Synthese von Somatostatin unter der Kontrolle des lac-Operon steht. Das lac-Repressorgen ist nicht in dem Plasmid enthalten, und der Empfänger- oder Rezipientenstamm (E. coli RRI) enthält das Wildtyp-Chromosomen-lac-Repressorgen, das nur 10 bis 20 Repres-sormoleküle je Zelle (15) erzeugt. Die Anzahl der Plasmidko-20 pien (und damit die Anzahl an lac-Operatoren) beläuft sich auf etwa 20 bis 30 pro Zelle, so dass eine vollständige Repression unmöglich ist. Wie aus der folgenden Tabelle III hervorgeht, wird die Aktivität von Somatostatin in E. coli RRI (pSOMl 1-3) durch IPTG, einem Induktor des lac-Ope-25 rons, erhöht. Wie erwartet ist der Grad der Induktion gering und liegt zwischen dem 2,4- bis 7-fachen. Im Versuch 7 (Tabelle III) wird a-Aktivität, ein Mass der ersten 92 Aminosäuren von ß-Galactosidase gleichfalls um einen Faktor von 2 induziert. In mehreren Versuchen kann eine nachweisbare 30 Somatöstatinradioimmunaktivität vor der Bromcyanspaltung des gesamten cellularen Proteins nicht festgestellt werden. Da das bei der Radioimmunprüfung verwendete Antiserum S 39 ein freies N-terminales Alanin erfordert, ist vor der Bromcyanspaltung eine Aktivität nicht zu erwarten.

35

Tabelle III

Somatostatinradioimmunaktivität Abkürzungen:

LB = Luriabrühe 40 IPTG = Isopropylthiogalactosid CNBr = Bromcyan SS = Somatostatin

Protein wird nach der Methode von Bradford, Anal. Bio-chem. 72, 248 (1976) bestimmt. 45 IPTG CNBr pg SS/ng

Versuch Stamm Medium 1 mmolar 5 mg/ml Protein

1

11-2

LB

+

+

< 0,1

11-3

LB

+

+

12

11-4

LB

+

+

A o

4^

11-5

LB

+

+

15

2

11-3

LB

+

+

12

11-3

LB

+

—

< 0,1

3

11-3

LB

+

+

61

11-3

LB

—

+

8

11-3

LB

+

—

< 0,1

4

11-3

LB

+

+

71

11-3

VB + Glycerin*

: +

+

62

5

11-3

LB + Glycerin

+

+

250

6

11-3

LB

+

+

320

11-2

LB

+

+

< 0,1

7

11-3

LB

+

+

24

11-3

LB

—

+

10

*Vogel-Bonner-Minimalmedium plus Glycerin

65

D. Gelfiltration von mit Bromcyan behandelten Extrakten Mit Ameisensäure und Bromcyan behandelte Extrakte der positiven Clone (pSOM 11-3, 11-5, 11-6 und 11-7) wer

662 128

12

den vereinigt (Gesamtvolumen 250 |il), getrocknet und in 0,1 ml 50-prozentiger Essigsäure wieder suspendiert. Nach Zugabe von [3H]Leucin wird die Probe auf eine 0,7 x 47-cm-Säule aus Sephadex G-50 in 50prozentiger Essigsäure aufgebracht. Aliquote Anteile von jeweils 50 Mikroliter der Kolonnenfraktionen werden auf Somatostatin geprüft. Vereinigte negative Clonextrakte (11-2, 11-4 und 11-11) werden genauso behandelt. Die Ergebnisse sind der Figur 8 zu entnehmen. Auf der gleichen Säule wird bekanntes Somatostatin (Beckman Corp.) wie angegeben (SS) eluiert. In diesem System wird Somatostatin von ausgeschlossenen grossen Peptiden und vollständig eingeschlossenen kleinen Molekülen gut getrennt. Nur Extrakte von für Somatostatin positiven Clonen zeigen Radioimmunaktivität in den Säulenfraktionen, und diese Aktivität wird in der gleichen Position wie chemisch synthetisiertes Somatostatin eluiert. Zusammenfassung der Aktivitätsinformation

Die Daten für den Beweis der Synthese eines Polypeptids mit der Somatostatinaminosäuresequenz sind wie folgt zusammenzufassen:

(1) Somatostatinradioimmunaktivität liegt vor in E. coli-Zellen mit dem Plasmid pSOMl 1-3, das ein Somatostatin-gen mit erwiesener richtiger Sequenz enthält und die richtige Orientierung des lac-EcoRI-DNA-Fragments hat. Zellen mit dem verwandten Plasmid pSOMl 1-2, das das gleiche So-matostatingen enthält, aber eine entgegengesetzte Orientierung des lac-EcoRI-Fragments hat, erzeugen keine nachweisbare Somatostatinaktivität.

(2) Wie aufgrund des Gestaltungsschemas vorherzusehen, ist bis zur Bromcyanbehandlung des Zellextrakts eine nachweisbare Somatostatinradioimmunaktivität nicht zu beobachten.

(3) Die Somatostatinaktivität steht unter der Kontrolle des lac-Operons, was durch Induktion durch IPTG, einen Induktor des lac-Operons, nachgewiesen wird.

(4) Die Somatostatinaktivität ergibt auf Sephadex G-50 ein gemeinsames Chromatogramm mit bekanntem Somatostatin.

(5) Die DNA-Sequenz des geclonten Somatostatingens ist richtig. Wenn die Translation nicht in Phase ist, wird ein Peptid gebildet, das sich in jeder Stellung von Somatostatin unterscheidet. Es wird eine Radioimmunaktivität festgestellt, die anzeigt, dass ein dem Somatostatin nahestehendes Peptid gebildet worden ist, und die Translation muss in Phase sein. Da Translation in Phase erfolgt, bestimmt der genetische Code, dass ein Peptid mit der genauen Sequenz von Somatostatin gebildet wird.

(6) Schliesslich inhibieren die obigen Proben von E. coli RRI (pSOMl l-3)-Extrakt die Freisetzung von Wachstumshormon aus Hypophysenzellen von Ratten, wohingegen parallel und mit identischer Proteinkonzentration hergestellte Proben von E. coli RRI (pSOMl 1-2) keine Wirkung auf Wachstumshormonfreisetzung ausüben.

Stabilität, Ausbeute und Reinigung von Somatostatin

Die Stämme mit dem EcoRI-lac-Operon-Fragment (pSOMl 1-2, pSOMl 1-3 etc.) trennen sich hinsichtlich des Plasmidphänotyps. Beispielsweise ist nach etwa 15 Generationen etwa die Hälfte der E. coli RRI (pSOMl l-3)-Kultur für ß-Galactosidase verantwortlich, d.h. weist den lac-Opera-tor auf, und etwa die Hälfte hiervon ist ampicillinresistent. Für Somatostatin positive (pSOMl 1-3) und negative (pSOMl 1-2) Stämme sind unbeständig, und deshalb rührt der Wachstumsnachteil vermutlich von der Überproduktion der grossen, aber unvollständigen und inaktiven Galacto-sidase her. Die Ausbeute an Somatostatin schwankt von 0,001 bis 0,03% des gesamten cellularen Proteins (Tabelle I), vermutlich infolge der Selektion von Kulturzellen mit Plasmiden mit einem fehlenden lac-Bereich. Die höchsten Ausbeuten an Somatostatin werden mit Präparaten erzielt, bei deren Herstellung das Wachstum von einer einzigen ampicillinresistenten richtunggebenden oder konstitutiven Kolonie ausgegangen ist. Selbst in diesen Fällen haben 30% der Zellen bei der Gewinnung oder Ernte Verluste an lac-Bereichen. Lagerung in gefrorenem Zustand (Lyophilisierung) und Wachstum bis zur Gewinnung aus einer einzigen derartigen Kolonie ist daher für das beschriebene System angezeigt. Ausbeuten können beispielsweise durch Verwendung von Bakterienstämmen erhöht werden, die lac-Repressor überproduzieren, so dass eine Expression von Vorläuferprotein vor Induktion und Ernte praktisch völlig unterdrückt wird. Wie bereits erörtert, kann aber auch ein Tryptophan- oder anderes Operatorpromotersystem angewandt werden, das gewöhnlich vollständig unterdrückt ist.

In dem rohen Extrakt, der beim Aufbrechen der Zellen in zum Beispiel einer Eaton-Presse erhalten wird, ist das ß-Ga-lactosidase-Somatostatinvorläuferprotein unlöslich und findet sich in dem Korn der ersten Zentrifugierung mit geringer Geschwindigkeit. Die Aktivität kann in 70prozentiger Ameisensäure, 6m Guanidiniumhydrochlorid oder 2prozen-tigem Natriumdodecylsulfat gelöst werden. Vorzugsweise wird jedoch der Rohextrakt aus der Eaton-Presse mit 8m Harnstoff extrahiert und der Rückstand mit Bromcyan gespalten. Bei den anfanglichen Versuchen ist Somatostatinaktivität aus E. coli Stamm RRI (pSOMl 1-3) durch Alkoholextraktion des gespaltenen Produkts und Chromatographie an Sephadex G-50 in 50prozentiger Essigsäure etwa lOOfach angereichert worden. Wird das Produkt erneut an Sephadex G-50 chromatographiert und dann einer Hochdruckflüssigchromatographie unterworfen, kann praktisch reines Somatostatin erhalten werden.

II. Humaninsulin

Die oben beschriebenen Arbeitsweisen werden als nächstes auf die Erzeugung von Humaninsulin angewandt. So werden die Gene für die Insulin B Kette (104 Basenpaare) und für die Insulin A Kette (77 Basenpaare) aus der Aminosäuresequenz der Humanpolypeptide jeweils mit einzelsträn-gigen Kohäsivtermini für die EcoRI- und BamHI-Restrik-tionsendonuclease und jeweils für die getrennte Einführung in pBR322-Plasmide bestimmt, gestaltet. Die synthetischen Fragmente, Deca- bis Pentadecanucleotide, werden durch die Blockphosphotriestermethode unter Verwendung von Trinucleotiden als Baublöcke synthetisiert und schliesslich mit einer Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) gereinigt. Die synthetischen Gene für Humaninsulin A- und B-Ketten werden dann getrennt in Plasmid pBR322 zur Clon-bildung gebracht. Die synthetischen Gene werden dann in Clonform an E. coli-ß-Galactosidasegen wie oben angelagert, wodurch eine wirksame Transkription und Translation und ein stabiles Vorläuferprotein erhalten wird. Insulinpepti-de werden vom ß-Galactosidasevorläufer gespalten, durch Radioimmunprüfung nachgewiesen und gereinigt. Insulinra-dioimmunprüfungsaktivität wird dann durch Vermischen der E. coli-Produkte erzeugt.

1. Ausgestaltung und Synthese von Humaninsulingenen

Die für Humaninsulin aufgebauten Gene sind in Figur 9 dargestellt. Die Gene für Humaninsulin, B-Kette und A-Kette, werden aus der Aminosäuresequenz von Humanpoly-peptiden gestaltet. Die 5'-Enden jedes Gens haben einsträn-gige kohäsive Termini für die EcoRI- und BamHI-Restrik-tionsendonuclease für die richtige Einfügung jedes Gens in das Plasmid pBR322. In die Mitte des ß-Ketten-Gens für die Aminosäuresequenz Alu-Ala wird eine Hindlll-Endonu-clease-Erkennungsstelle eingebaut, um Verbreitung und Nachweis jeder Hälfte des Gens gesondert vor dem Aufbau

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

13

662 128

des gesamten B-Kettengens zu ermöglichen. Die B-Ketten-und A-Ketten-Gene werden so gestaltet, dass sie von 29 verschiedenen Oligodesoxyribonucleotiden, vom Decameren bis zu den Pentadecameren, aufgebaut werden. Jeder Pfeil bezeichnet das Fragment, das durch die verbesserte Phosphotriestermethode synthetisiert wird, Hl bis H8 und B1 bis B12 für das B-Kettengen und Al bis Al 1 für das A-Kettengen.

2. Chemische Synthese von Oligodesoxyribonucleotiden

Die für die Synthese von Oligodesoxyribonucleotiden angewandten Materialien und Methoden sind im wesentlichen die in Itakura, K. et al (1975) J. Biol. Chem. 250, 4592 und Itakura, K. et al (1975) J. Amer. Chem. Soc. 97, 7327 beschriebenen, mit Ausnahme der folgenden Modifikationen:

a) Die vollständig geschützten Mononucleotide 5'-0-Di-methoxytrityl-3'-p-chlorphenyl-ß-cyanethyl-phosphate werden aus den Nucleosidderivaten unter Verwendung des monofunktionellen Phosphorylierungsmittels p-Chlorphenyl-ß-cyanethyl-phosphorochloridat (1,5 Moläquivalente) in Acetonitril in Gegenwart von 1-Methylimi-dazol, Van Boom, J.H. et al (1975) Tetrahedron 31, 2953, synthetisiert. Die Produkte werden in grossem Massstab (100 bis 300 g) durch präparative Flüssigchromatographie (Prep 500 LC, Waters Associates) isoliert.

b) Unter Anwendung der Lösungsmittelextraktionsmethode [Hirose, T. et al (1978) Tetrahedron Letters, 2449] werden 32 bifunktionelle Trimere (vergleiche Tabelle IV) in einem Massstab von 5 bis 10 mm und 13 Trimere, 3 Tetramere und 4 Dimere als 3'-Terminusblöcke in einem Massstab von 1 mMol synthetisiert. Die Homogenität der vollständig geschützten Trimeren wird durch Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel in zwei Methanol/Chloroform-Lösungsmittelsystemen: Lösungsmittel a 5% Vol./Vol. und Lösungsmittel b 10% Vol./Vol. (vgl. Tabelle IV) kontrolliert. Ausgehend von diesen verschiedenen Verbindungen werden 29 Oligodesoxyribonucleotide mit definierter Sequenz syntheti-5 siert, 18 für das B-Ketten- und 11 für das A-Ketten-Gen.

Als Grundeinheiten für den Aufbau von Polynucleotiden werden zwei Arten von Trimerblöcken, d.h. die bifunktionellen Trimerblöcke von Tabelle IV und entsprechende an der 3'-Hydroxygruppe durch eine Anisoylgruppe geschützte io 3'-Terminus-Trimere verwendet. Das bifunktionelle Trimere wird mit einer Mischung aus Pyridin, Triethylamin und Wasser (3:1:1, Vol./Vol.) zu der entsprechenden 3'-Phospho-diesterkomponente und mit 2% Benzolsulfonsäure zu der entsprechenden 5'-Hydroxykomponente hydrolysiert. Der i5 bereits erwähnte 3'-Terminus-Block wird mit 2prozentiger Benzolsulfonsäure behandelt, wodurch die entsprechende 5'-Hydroxylverbindung gebildet wird. Die Kupplungsreaktion eines Überschusses des 3'-Phosphodiestertrimeren (1,5 Moläquivalente) mit der 5'-Hydroxylkomponente (1 Mol-20 äquivalent) in Gegenwart von 2,4,6-Triisopropylbenzolsulfo-nyltetrazolid (TPSTe, 3 bis 4 Äquivalente) ist nach drei Stunden nahezu vollständig abgelaufen. Zur Entfernung des Überschusses des 3'-Phosphodiesterblocks wird das Reaktionsgemisch durch eine kurze Kieselgelsäule auf einem Sin-25 terglasfilter geleitet. Die Säule wird zuerst mit CHC13 zum Eluieren einiger Nebenprodukte und des Kupplungsreagens und dann mit CHCl3:MeOH (95:5 Vol./Vol.), worin nahezu das gesamte, vollständig geschützte Oligomere eluiert wird, gewaschen. Unter diesen Bedingungen bleibt der eingesetzte 30 3'-Phosphodiesterblock-Reaktionsteilnehmer in der Säule. In entsprechender Weise werden Blockkupplungen wiederholt, bis die gewünschte Länge aufgebaut ist.

Tabelle IV

Synthese von Trimerbaublöcken

Verbin

Ausbeute

**

Rf

Reinheit***

zugegen in

Nr.

dung*

(%)

a.

b.

(%)

(siehe Fig. 9)

1.

AAG

47

0,15

0,40

93

B5, B6

2.

AAT

49

0,25

0,52

95

Hl, Al, A6

3.

AAC

52

0,28

0,55

93

H5, B6, A2, A8

4.

ACT

43

0,27

0,53

91

B4, B5, A6

5.

ACC

56

0,33

0,60

96

B7

6.

ACG

39

0,18

0,45

90

H5, B7

7.

AGG

45

0,10

0,26

89

H6, H7, B9

8.

AGT

33

0,14

0,40

96

B9, A2, All

9.

AGC

50

0,19

0,48

92

H8, Bl, A5, AIO

10.

AGA

48

0,24

0,50

91

A9

11.

TTC

44

0,26

0,52

95

B4, B7, A3

12.

TTC

49

0,11

0,31

94

H3, H5, A2, A3, A5

13.

TCT

58

0,24

0,49

96

A4

14.

TCA

' 45

0,28

0,53

92

Hl, H2, H4, AI

15.

TCG

39

0,12

0,34

91

A2

16.

TGG

32

0,10

0,28

87

H3, Al, AIO

17.

TGC

51

0,18

0,47

93

H6, B2, A4, A7, A8

18.

TGA

46

0,12

0,37

94

H7

19.

TAC

61

0,22

0,50

90

B4, All

20.

TAA

55

0,17

0,44

95

B5, AIO

21.

CCT

53

0,30

0,55

97

H3, H4, BIO

22.

CAC

47

0,25

0,51

92

A3

23.

CAA

58

0,25

0,51

93

H2, H6, H8, A7

24.

CTT

41

0,28

0,54

92

B2, B9, A4

25.

CGA

40

0,27

0,52

93

A7

26.

CGT

75

0,25

0,50

89

H2, H4, B3, Bl

27.

GGT

35

0,09

0,26

90

B3

28.

GTT

46

0,18

0,45

93

B2

29.

GTA

38

0,25

0,50

95

B6, B8, A6

30.

GAA

39

0,15

0,39

88

H7, B3, B8, A5

662 128

14

Verbin

Ausbeute

**

Rf

Nr.

dung*

(%)

a.

b.

31.

GAT

52

0,22

0,49

32.

GCA

42

0,14

0,39

Tabelle IV (Fortsetzung)

Synthese von Trimerbaublöcken

Reinheit*** zugegen in (%) (siehe Fig. 9)

89 BIO, A9

93 A9

* vollständig geschützte Tridesoxynucleotide; 5-09-Dimethoxytrityl-3'-p-chlorphenyl-ß-cyanethylphosphat ** Gesamtausbeute, bezogen auf die 5'-Hydroxylmonomeren *** Aufgrund der HPLC-Analyse

Während der Oligonucleotidsynthese wird ausgiebig von ampicillinresistenten, tetracyclinempfmdlichen Transfor-der Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) Gebrauch manten (pBHl bis pBH3) werden analysiert. Dabei wird gemacht, und zwar für die Analyse von a) jedem Trimer- is festgestellt, dass die kleinen EcoRI-Hindlll-Fragmente die und Tetramerblock, b) den als Zwischenprodukte auftreten- erwartete Nucleotidsequenz aufweisen.

den Fragmenten (Hexamere, Nonamere und Decamere), c) Das A-Kettengen wird aus drei Teilen zusammengestellt,

der letzten Kupplungsreaktion und d) zur Reinigung der Die vier linken, vier mittleren und vier rechten Oligonucleo-

Endprodukte. Für die HPLC wird ein Spectra-Physics tide (vergleiche Figur 9) werden gesondert verknüpft, dann

3500B Flüssigchromatograph verwendet. Nach Entfernung 20 vermischt und verknüpft (die Oligonucleotide AI und A12 aller Schutzgruppen mit konzentriertem NH4OH bei 50 °C sind unphosphoryliert). Das zusammengestellte A-Kettengen (6 Stunden) und 80-prozentiger Essigsäure bei Zimmertem- wird phosphoryliert, durch Gelelektrophorese gereinigt und peratur (15 Minuten) werden die Verbindungen an einer Per- in pBR322 an den EcoRI-BamHI-Stellen geclont. Die maphase AAX (DuPont) [Van Boom, J. et al (1977) J. Chro- EcoRI-BamHI-Fragmente von zwei ampicillinresistenten, matography 131, 169] Säule (1 m • 2 mm) unter Anwendung 25 tetracyclinempfmdlichen Clonen (pAlO, pAll) enthalten die eines linearen Gradienten des Lösungsmittels B (0,05 m angestrebte A-Gensequenz.

KH2P04 — 1,0 m KCl, pH 4,5) in Lösungsmittel A (0,01 m - 4. Aufbau von Plasmiden zur Expression von A- und KH2P04, pH 4,5) analysiert. Der Gradient verläuft folgen- B-Insulingenen dermassen: Es wird mit Puffer A begonnen, und dann wer- Figur 10 zeigt den Aufbau des lac-Insulin B Plasmids den 3% Puffer B in der Minute angewandt. Die Elution wird 30 (pIBl). Die Plasmide pBHl und PBB101 werden mit EcoRI-bei 60 °C mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/Mi- und Hindlll-Endonuclease aufgeschlossen. Das kleine BH-nute durchgeführt. Auch die Reinigung der 29 End-Oligo- Fragment von pBHl und das grosse Fragment von pBBlOl nucleotide wird an Permaphase AAX unter den gleichen (enthaltend das BB-Fragment und den grössten Teil von oben angegebenen Bedingungen durchgeführt. Die Materia- pBR322) werden durch Gelelektrophorese gereinigt, ver-lien mit dem gewünschten Peak werden vereinigt, durch Dia- 35 mischt und in Gegenwart von mit EcoRI gespaltenen X plac5 lyse entsalzt und lyophilisiert. Nach Markieren der 5'-Ter- verknüpft. Das Megadalton-EcoRI-Fragment von X plac5 mini mit (gamma-32P) ATP unter Verwendung von T4-Poly- enthält den lac-Regelbereich und den grössten Teil des ß-nucleotidkinase wird die Homogenität jedes Oligonucleotids Galactosidase-Strukturgens. Die Konfiguration der Restrik-durch Elektrophorese auf einem 20-prozentigen Polyacryl- tionsstellen gewährleistet die richtige Verbindung von BH an amidgel kontrolliert. 40 BB. Das lac-EcoRI-Fragment kann sich in zwei Orientierun-

3. Anordnung und Clonbildung von B-Kettengen und gen einfügen; deshalb hat nur eine Hälfte der nach Transfor-

A-Ketten-Gen mation erhaltenen Clone die angestrebte Orientierung. Die

Das Gen für die B-Kette von Insulin weist eine EcoRI- Orientierung von 10 ampicillinresistenten ß-Galactosidase Restriktionsstelle am linken Ende, eine Hindlll-Stelle in der bildenden Clonen wird durch Restriktionsanalyse kontrol-Mitte und eine BamHI-Stelle am rechten Ende auf. Dadurch 45 liert. Fünf dieser Kolonien enthalten die gesamte B-Genist es möglich, beide Hälften, die linke EcoRI-Hindlll-Hälf- sequenz und den richtigen Leserahmen aus dem ß-Galacto-te (BH) und die rechte Hindlll-BamHI-Hälfte (BB), in dem sidasegen in das B-Kettengen. Eine Kolonie, pIBl, wird für gut geeigneten Clonbildungsträger pBR322 getrennt zu clo- anschliessende Versuche ausgewählt.

nen und nach Feststellung ihrer Sequenzen zu dem vollstän- Bei einem vergleichbaren Versuch wird das 4,4-Megadal-

digen B-Gen zu verbinden (Figur 1Ö). Die BB-Hälfte wird 50 ton-lac-Fragment X plac5 an der EcoRI-Stelle in das pAl 1-durch Verknüpfen aus 10 Oligodesoxyribonucleotiden, in Fi- Plasmid eingeführt, wodurch pIAl erhärten wird. Letzteres gur 9 mit Bl bis BIO bezeichnet, zusammengestellt, die durch erweist sich als mit pIBl identisch mit der Ausnahme, dass chemische Phosphotriestersynthese gebildet wurden. Bl und das B-Gen-Fragment durch das A-Gen-Fragment ersetzt ist. BIO sind nicht phosphoryliert, wodurch eine unerwünschte Die DNA-Sequenzanalyse zeigt, dass die korrekten A- und Polymerisation dieser Fragmente über ihre Cohäsivenden 55 B-Kettengensequenzen in pIAl bzw. pIBl erhalten geblieben (Hindlll und BamHI) vermieden wird. Nach Reinigung sind.

durch präparative Acrylamidgelelektrophorese und Elution 5. Expression der grössten DNA-Bande wird das BB-Fragment in das mit Die Stämme mit den in richtiger Weise an ß-Galacto-

Hindlll und BamHI gespaltene Plasmid pBR322 eingefügt. sidase gebundenen Isulingenen erzeugen beide grosse Men-Etwa 50% der von der DNA stammenden ampicillinresi- 60 gen eines Proteins mit der Grösse von ß-Galactosidase. Etwa stenten Kolonien sind tetracyclinempfindlich, was zeigt, dass 20% des gesamten Zellproteins bestehen aus diesem ß-ein Nichtplasmid-Hindlll-BamHI-Fragment eingeführt wor- Galactosidase-Insulin A- oder B-Ketten-Hybrid. Die Hy-den ist. Die kleinen Hindlll-BamHI-Fragmente aus vier die- bridproteine sind unlöslich und finden sich in dem ersten bei ser Kolonien (pBBlOl bis pBB104) erweisen sich bei der Se- geringer Geschwindigkeit erhaltenen Korn, worin sie etwa quenzprüfung als richtig gestaltet. 65 50% des Proteins ausmachen.

Das BH-Fragment wird in entsprechender Weise herge- Zum Nachweis der Expression der Insulin-A- und -B-

stellt und in mit EcoRI- und Hindlll-Restriktionsendonu- Ketten wird eine Radioimmunprüfung (RIA) angewandt, clease gespaltenes pBR322 eingefügt. Plasmide aus drei die auf der Bildung von vollständigem Insulin aus den ge-

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sonderten Ketten beruht. Die Insulinbildungsmassnahmen von Katsoyannis et al (1967) Biochemistry 6, 2642-2655, ergeben, angepasst an ein Prüfvolumen von 27 Mikroliter, eine sehr gut geeignete Prüfung. Nach Vermischen und Bildung von S-sulfonierten Derivaten der Insulinketten wird ohne weiteres nachweisbare Insulinaktivität erhalten. Die getrennten S-sulfonierten Ketten von Insulin reagieren nach Reduktion und Oxidation nicht merklich mit dem verwendeten Antiinsulin-Antikörper.

Für die Insulinbildungsprüfung wird das ß-Galacto-sidase-A- oder B-Ketten-Hybridprotein teilweise gereinigt, mit Bromcyan gespalten und in S-sulfonierte Derivate übergeführt.

Der Nachweis dafür, dass die richtige Expression von chemisch synthetisierten Genen für Humaninsulin erzielt worden ist, kann folgendermassen zusammengefasst werden:

a) Radioimmunaktivität ist für beide Ketten nachgewiesen worden.

b) Die nach Clonbildung und Plasmidaufbau erhaltenen DNA-Sequenzen sind direkt als der Gestaltung entsprechend

5 nachgewiesen worden. Da Radioimmunaktivität erhalten wird, muss die Translation in Phase sein. Der genetische Code bestimmt daher, dass Peptide mit der Sequenz von Humaninsulin erzeugt werden.

c) Nach der Bromcyanspaltung verhalten sich die E. coli-io Produkte in drei verschiedenen chromatographischen Systemen, bei denen die Trennung auf verschiedenen Prinzipien beruht (Gelfiltration, Ionenaustausch und Umkehrphasen-HPLC) als Insulinketten.

d) Die von E. coli erzeugte A-Kette ist durch HPLC in i5 einem kleinen Massstab gereinigt worden und hat die richtige Aminosäurezusammensetzung.

C

10 Blatt Zeichnungen

Claims (17)

1. 662 128

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   PATENTANSPRÜCHE

   1. Rekombinations-Clonbildungsträger zur Transformation eines mikrobiellen Wirtsorganismus, enthaltend

   (a) ein homologes Regulon und

   (b) eine DNA-Einfügung, die Codone für ein vorbestimmtes funktionelles heterologes Polypeptid bzw. Polypep-tid-Vorprodukt enthält, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Einfügung in richtiger Lesephase mit dem Regulon ist, so dass der hiermit transformierte Wirtsorganismus unter dem steuernden Einfluss des Régulons zur Expression des gewählten heterologen Polypeptids bzw. dessen Vorprodukt in gewinnbarer Form befähigt ist.
2. 2. Clonbildungsträger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der mikrobielle Wirtsorganismus ein Bakterium ist, und dass das Regulon mit einem in der Chromosomen-DNA des Bakteriums natürlich vorkommenden Regulon im wesentlichen identisch ist.
3. 3. Clonbildungsträger nach Anspruch 1, welcher ein Re-kombinationsplasmid ist, das zur Transformation eines bakteriellen Wirtes befähigt ist und (a) ein zum bakteriellen Wirt in vortransformiertem Zustand homologes Regulon und (b) eine DNA-Einfügung aufweist, die für die Aminosäurensequenz eines heterologen Polypeptids codiert, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Einfügung in Lesephase mit dem Regulon ist und das plasmid-transformierte Bakterium demnach dazu befähigt ist, die Expression der genannten Aminosäurensequenz in gewinnbarer Form zu bewirken.
4. 4. Clonbildungsträger nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Regulon mit einem Regulon identisch ist, das in der Chromosomen-DNA des bakteriellen Wirts natürlich vorkommt.
5. 5. Clonbildungsträger nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass er ein bakterielles Plasmid ist.
6. 6. Clonbildungsträger nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Regulon das Promotor- ■ Operator-System von Escherichia coli-lac oder Escherichia coli-Tryptophan ist.
7. 7. Clonbildungsträger nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das heterologe Polypeptid ein Säugerhormon oder ein Säugerhormon-Vorprodukt ist.
8. 8. Clonbildungsträger nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das heterologe Polypeptid die A-Kette oder die B-Kette des menschlichen Insulins ist.
9. 9. Clonbildungsträger nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das heterologe Polypeptid Somatostatin ist.
10. 10. Clonbildungsträger nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das heterologe Polypeptid Humanprepro-insulin, Humanproinsulin, Human- oder Bovinwachstums-hormon, luteinisierendes Hormon, ACTH oder Pancreatin-Polypeptid ist.
11. 11. Clonbildungsträger nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Regulon das Promotor-Operator-System von E. coli-lac ist.
12. 12. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Clon-bildungsträgers nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass ein Abschnitt doppelsträngiger DNA, der (a) ein mit einem mikrobiellen Wirt homologes Regulon und (b) eine Erkennungsstelle für Restriktions-Endonuclease aufweist, mit einer Restriktions-Endonuclease unter Bildung eines DNA-Fragmentes umgesetzt und daran eine DNA-Einfügung angesetzt wird, die für ein vorgewähltes heterologes Polypeptid mit einer terminalen Nucleotidgruppierung codiert, die an das genannte DNA-Fragment ansetzbar ist, wobei der genannte rekombinante Clonierungsträger erhalten wird, bei dem die DNA-Einfügung in richtiger Lesephase mit dem Regulon ist.
13. 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der mikrobielle Wirt ein Bakterium ist.
14. 14. Transformierter Mikroorganismus, enthaltend einen Clonbildungsträger nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
15. 15. Transformierter Mikroorganismus nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass er als mikrobielle Kultur vorliegt.
16. 16. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung eines vorbestimmten funktionellen heterologen Polypeptids oder Poly-peptid-Vorproduktes, dadurch gekennzeichnet, dass ein Clonbildungsträger nach einem der Ansprüche 1 bis 11 in einem transformierten Mikroorganismus exprimiert wird.
17. 17. Erzeugnis, erhalten nach dem Verfahren gemäss Anspruch 16.