SE501005C2 - Rekombinantplasmid avsedd för produktion av däggdjurspolypeptid i bakterie, samt förfarande för dess framställning - Google Patents

Description

501 085 venser av nukleotidtripletter, kallade "kodon", enär de karakte- ristiska baserna av nukleotiderna i varje triplett eller kodon utgör kod för specifika informationsbitar. Exempelvis kan näm- nas, att de tre nukleotiderna ATG (där nukleotidbaserna således är adenin-tymin-guanin) ger en mRNA-signal, vilken tolkas som "start för översättning" medan däremot de för avslutning kodan- de tripletterna TAG, TAA och TGA tolkas som "stopp för över- sättning". Mellan start- och stoppkodonen ligger den s.k. struk- turgenen; kodonen i denna definierar aminosyrasekvensen i den slutliga översättningen. Denna definition försiggår enligt den numera välkända genetiska koden (se t. ex. J.D. Watson, "Molecu- lar Biology of the Gåne", W.A. Benjamin Inc., N.Y., šdje uppl. 1976), som ger kodonen för de olika aminosyrorna. Det är här frå- ga om en "degenererad" kod, i det att (i en del fall) mer än ett kodon utgör kod för en och samma aminosyra. Koden äremeller- tid en precis kod i den bemärkelsen, att det för varje amino- syra finns ett eller flera bestämda kodon, som vart och ett av- ser enbart den syran. Exempelvis utgör vart och ett av kodonen TTT, TTC, TTA och TTG läst som sådant kod för serin och icke för någon annan aminosyra. Under transkriptionen måste den korrekta avläsningsfasen eller "läsramen" bibehållas. Vad skulle icke kunna hända, exempelvis, om det transkriberande RNA-polymeraset vid avläsningen tar antingen en eller också en annan bas som början på ett kodon (understruket) i sekvensen ...GCTGGTTGTAAG...

. . . GcT GGT TGT AAG . . . __; . . . Ala-Giy-cys-Lys .

. . . G CTG GTT GTA AG .«. .__> . . . Leu-Val-Leu . . .

. . . GC TGG TTG TAA G . . .__§ . . . Trp-Leu-(STOP).

Vilken polypeptid som till sist framställes beror således i helt avgörande grad på hur strukturgenen är anordnad rums- ligt i förhållande till regulon-regionen.

Nedan skall vissa genkomponenter definieras för att under- lätta förståelsen av den genetiska uttrycksprocessen.

Operon: En gen, omfattande strukturgen(er) för polypeptid- bildning och kontrollregionen ("regulon"), som reglerar i vad mån süwmturgenen resp. -generna kommer till uttryck i form av nämnda polypeptidbildning.

Promotor: En gen inom regulon-regionen, till vilken RNA- 501 005 -polymeras måste binda för transkriptionens initiering.

Operator: En gen till vilken repressorprotein kan binda, varigenom förhindras, att RNA-polymeras binder vid den intill be- lägna promotorn.

Inducer: En substans som avaktiverar repressorproteinet, varigenom operatorn frigöres och RNA-polymeraset kan få binda vid promotorn och påbörja transkriptionen. "cA1="-b1nan1ngsstä11e (gataboiite gcuivacor grotein binding site): En gen vilken binder ett med cAMP (=cykliskt adenosin-~ monofosfat) som mediator erhållet CAP, som vanligtvis likaledes erfordras för transkriptionens initiering. CAP-bindningsstället kan i vissa fall vara onödigt. Som ett exempel kan nämnas att det genom en promotormutation i fagens)\plac UV5 laktos-operon blir onödigt att ha cAMP och CAP för att geninformationen skall komma till uttryck; J.Beckwith et al., J. Mol. Biol. §2¿ ISS-160 (1972)- Promotor-operatorsystem: Härvid avses i föreliggande be- skrivning och krav en operabel kontrollregion av ett operon, med eller utan avseende på dess innefattande av ett CÄP-bind- ningsställe eller förmåga att koda för repressorprotein.

Nedan anges dessutom några ytterligare definitioner, som kan komma till användning t. ex. vid diskussionen av rekombinant-DNA.

Kloniggsbärare: Tvâsträngs-DNA, som icke härrör från någon kromosom och omfattar ett intakt "replikon", så att bäraren re- plikeras vid inplacering i en encellig organism ("mikrob") i enligthet med en s.k. tranformationsprocess (omvandlingsprocess).

En på detta sätt transformerad organism kallas "transformant".

Plasmid: I föreliggande sammanhang avses härmed en klonings- bärare, som härstammar från virus eller bakterier; i det sist- nämnda fallet är den en "bakteriell plasmid".

Komplementaritet: En egenskap baserad på bassekvenserna i ensträngs-DNA, som medger bildning av tvåsträngs-DNA genom väte- bindning mellan komplementära baser på vardera strängen. Adenin (A) är komplementär till tymin (T), medan guanin (G) är komple- mentär till cytosin (C).

Tack vare de framsteg, som under senare år gjorts på bio- kemins område, har man kunnat konstruera "rekombinant"-klonings- bärare, där exempelvis plasmider bringas att innehålla exogenv 501 005 DNA. I speciella fall kan rekombinanten innefatta "heterolog" DNA.

Med "heterolog" DNA avses en DNA, vilken kodar för sådana poly- peptider, som vanligtvis icke produceras av den organism, som kan transformeras av rekombinantbäraren. Exempelvis kan plasmi- der uppspjälkas så, att man får linjär DNA med ligerbara (ligat- able) ändar. Dessa är bundna vid en exogen gen med ligerbara än- dar, så att man får en biologiskt funktionell molekyldel med ett intakt replikon och en önskad fenotypegenskap. Rekombinant-mole- kyldelen insättes i en mikroorganism medelst transformations- teknik, och transformanterna isoleras och klonas i syfte att er- hålla stora populationer, vilka har förmåga att uttrycka den nya genetiska informationen. Förfaranden och medel för beredning av rekombinant-kloningsbärare och för transformering av organismer med dessa bärare har ofta beskrivits i litteraturen, se exempel- vis H.L. Heynecker et al., Nature g§3, 748-752 (l976); Cohen et al., Proc. Nat. Acad. Soi. USA Qg, 2110 (l972); ibid.,_ZQ¿ 1293 (l973); ibid., ZQ¿ 3240 (l973); ibid., Zl¿ 1030 (l974); Morrow et al., Proc. Nat. Acad. Soi. USA, Zl¿ l743 (l974); Novick, Bacteriological Rev., 33¿ 210 (l969); Hersfield et al., Proc.Soc.

Nat'l. Acad. Soi. USA Il¿ 3455 (1974) och Jackon et al., ibid. §9¿ 2904 (1972). Beträffande en mera generell diskussion av detta ämne se S. Cohen, Scientific American 233, 24 (1975).

Innehållet i dessa publikationer och andra publikationer, som anges i denna beskrivning, skall anses vara inkluderade i be- skrivningen.

Ett antal metoder finns tillgängliga för DNA-rekombination, enligt vilka intill varandra belägna ändar av separata DNA-frag- ment "skräddarsys" på ett eller annat sätt i och för underlät- tande av ligering. Med "ligering" avses bildning av fosfodiester- bindningar mellan intill varandra belägna nukleotider; detta sker oftast genom inverkan av enzymet T4-DNA-ligas. På så sätt kan "stumt avskurna" eller "stumt utlöpande" ändar (blunt ends) di- rekt ligeras. Alternativt kan vid fragment, innehållande inbör- des komplementära singelsträngar vid sina intill varandra be- lägna ändar, sådana tillstånd komma att gynnas, där det utbil- das vätebindningar som placerar de respektive ändarna i lägen passande för efterföljande ligering. Sådana ensträngsändar, kal- lade "kohesiva ändar", kan bildas genom att man med användning 501 ons av terminaltransferas adderar nukbotider till stumt utlöpande ändar, och i vissa fall genom att man helt enkelt hos ett sträng- par med stumt utlöpande ände avkortar en av strängarna med an- vändning av ett enzym, t. ex._Å-exonukleas. Ytterligare ett till- vägagängssätt - och detta är vanligast - är att anlita restrik- tionsendonukleaser, som spjälkar upp fosfodiesterbindningar'i och runt unika sekvenser av nukleotider vars längd uppgår till ca 4-6 baspar. Man känner till många restriktionsendonukleaser och deras igenkänningsställen; det vanligast använda restrik- tionsendonukleast är Eco RI. Restriktionsendonukleaser, som spjälkar upp tvåsträngs-DNA rotationssymmetriska "palindromer", ger därvid kohesiva ändar. Sålunda kan exempelvis en plasmid el- ler annan kloningsbärare spjälkas, varvid erhålles ändar, vilka var och en innefattar halva igenkänningsstället för restriktions- endonukleaset. En spjälkningsprodukt av exogen DNA, vilken er- hållits med samma restriktionsendonukleas, kommer att uppvisa ändar, som är komplementära till plasmidändarna. Alternativt (se nedan) kan syntetisk DNA med kohesiva ändar åstadkommas för in- sättning av den uppspjälkade bäraren. För att motverka att bä- rarens kohesiva ändar åter "går ihop? innan exogen DNA insatts, kan ändarna omsättas med alkaliskt fosfatas. Härvid erhålles mo- lekylär selektion för sådana molekylsammanslutningar, vid vilka det exogena fragmentet inkorporeras. Inkorporeringen añïâtšâššššä ment med den rätta orienteringen relativt andra aspekter«kan ut- ökas när fragmentet ersätter bärar-DNA, som utskurits av två oli- ka restriktionsendonukkaser, och fragmentet självt omfattar än- dar, utgörande var och en halva igenkänningssekvensen för re- spektive olika endonukleas.

Trots att man under senare år arbetat extensivt på DNA-om- rådet avseende forskning beträffande rekombinant-DNA, har hit- tills icke många resultat framkommit, som kan användas direkt och praktiskt. Detta gäller speciellt i fråga om misslyckade försök att få sådana polypeptider o.dyl. uttryckta, som har sin kod i syntetisk DNN- antingen sådan syntetisk DNA, som upp- byggts nukleotid för nukleotid på konventionellt sätt, eller sådan syntetisk DNA, som erhållits genom reverterad transkrip- tion från isolerad mRNA och kallas cDNA (complementary DNA).

I föreliggande patent beskrives vad som antas vara det första U'- D _; CD CD U' l O\ uttryckandet av en funktionell polypeptidprodukt utgående från en syntetisk gen jämte därmed besläktade utvecklingsaspekter, som verkar vara lovande för vidsträckt användning. Den angivna produk- ten är somatostatin (U.S.-patentskriften 3.904.594), en inhibitor för utsöndring av tillväxthormon, insulin och glukagon; dess verkningar ger vid handen, att det torde kunna användas för be- handling av akromegali, akut pankreatit och insulinberoende dia- betes. Se Guillemin et al. Annual Rev. Med. gl, 379 (1976).

Somatostatinmodellen visar tydligt, att det i föreliggande patent- skrift beskrivna utvecklingsstegen är tillämpbara på många områ- den och till stort gagn - såsom kommer att framgå av bif. rit- ningar och nedanstående detaljbeskrivning.

På bif. ritningar åskådliggöres en av de olika aspekterna för användning av föredragna utföringsformer av uppfinningen, nämligen uttryckandet (bildandet) av hormonet somatostatin genom bakteriella transformanter, som innehåller rekombinantplasmider.

Fig. 1 visar processen i stora drag, schematiskt: Genen för somatostatin, som frammällts medelst kemisk DNA-syntes, samman- svetsas med den på plasmid pBR322 befintliga genen för E. coli [5-galaktosidas. Efter transformation in i E. coli kommer re- kombinantplasmiden att styra syntes av ett prekursorprotein, som medelst cyanogenbromid kan specifikt spjälkas in vitro vid me- tioninrester, varvid man erhåller aktivt, av polypeptid bestå- ende däggdjurshormon. Bokstäverna A, T, C, G anger de karakteris- tiska baserna (adenin resp. tymin resp. cytosin resp. guanin) av deoxiribonukleotiderna i somatostatingenens kodande sträng.

Fig. 2 visar schematiskt strukturen av en syntetisk gen, vars kodande sträng (d.v.s. den "övre") omfattar kodtripletter för den likaledes i fig. 2 angivna aminosyrasekvensen hos soma- tostatin.

Fig. 3 visar schematiskt den föredragna metoden för konstruk- tion av nukleotidtrimerer, vilka användes vid uppbyggandet av syntetiska gener. I fig. 5 anges på för nukleotider konventio- nellt sätt 5'-OH till vänster och 3'-OH till höger, exempelvis B ' 3' Ho H 7 501 005 Fig. Ä visar ett flytschema för konstruktion av en rekombi- nantplasmid (t. ex. pSOMll-5) med förmåga att ge uttryck åt ett somatostatinhaltigt protein ("somatostatin"betecknas "SOM").

Härvid börjar man med förälderplasmiden pBR322. I fig. 4 anges den ungefärliga molekylvikten av varje plasmid i dalton ("d").

Med Apr och Tor betecknas gener för ampicillinresistens resp. tetracyklinresistens, medan Tcs anger tetracyklinkänslighet er- hållen genom att en del av Tor-genen skurits bort. Figuren vi- sar även de relativa lägena för olika specifika spjälknings- ställen på plasmiderna, d.v.s. sådana ställen som är uppspjälk- ningsbara med specifika restriktionsendonukleas, t. ex. ställen för Eco RI, Bam I etc.

Fig. 5A och 5B visar nukleotidskevenser hos viktiga av- snitt (key portions) av två plasmider. Dessutom anges riktnin- gen för transkriptionen till mRNA; transkriptionen sker alltid utgående från kodningssträngens 5'-ände. Substratets ställen för restriktionsendonukleaser visas ävenledes. Varje visad sek- vens innehåller både kontrollelementen av lac-operonet (laktos- -operon) och kodonen för somatostatinets aminosyrasekvens. Dessa- aminosyror är angivna i kursivstil. Aminosyrasekvensnumren för [S-galaktosidas ("{3-gal") är angivna inom klamrar.

Fig. 6-8: Såsom mera utförligt beskrives längre fram, i beskrivningens experimentella del, visar fig. 6-8 resultaten från jämförande radioimmuntest; dessa åskådliggör somatostatin- aktiviteten hos produkter bildade av rekombinantplasmider.

Fig. 9 visar den schematiska strukturen av syntetiska ge- ner, vars kodningssträngar omfattar kodon för aminosyrasekvenser- na i A- och B-kedjorna av humant insulin. fFig.lO är ett flytsohema för konstruktion av en rekombi- nantplasmid med förmåga att ge uttryck åt B-kedjan i humant in- sulin.

Nedan följer en detaljbeskrivning. l. Framställning av gener, som kodar för heterolog poly- peptid.

DNA, som kodar för vilken som helst polypeptid med känd ami- nosyrasekvens, kan framställas genom att man väljer kodon enligt den genetiska koden. För att underlätta reningen etc. framställer man separat oligodeoxiribonukleotidfragment av t. ex. ca lq- ca UI _\ ...A CI) CD 01 16 nukloetider, varpå dessa fragment sammansättes i önskad sek- vens. Sålunda kan man framställa en första och en andra serie oligodeoxiribonukleotidfragment med lämplig storlek. Den första serien ger, om den är hopfogad 1 korrekt sekvens, en DNA-kod- ningssträng för polypeptid (se t. ex. fragmenten A, B, C, D i fig. 2). Den andra serien, om den likaledes är hopfogad i kor- rekt sekvens, ger en sträng som är komplementär till kodnings- strängen (t.ex. fragmenten E, F, G, H i fig. 2). De båda strän- garnas fragment skall företrädesvis överlappa, så att komplemen- tariteten befrämjar deras tendens att "av sig själva" binda till va- randra genom vätebindning mellan fragmentblockens kohesiva ändar.

Efter det att strängarna hopsatts med varandra fullbordas struk- turgenen genom ligering på konventionellt sätt.

Genom att den genetiska koden är degenererad har man en av- sevärd grad av frihet vid valet av kodon för en vilken som helst given aminosyrasekvens. För här ifrågavarande ändamål har det emellertid varit lämpligt att vid valet av koden hålla sig till följande tre moment: l) Val av kodon, val av fragment och hop- sättning av fragmenten sker på ett sådant sätt att icke-önskvärd komplementaritet av fragmenten inbördes undviks, med undantag för fragment, vilka i den avsedda genen skall ligga intill varandra. 2) Man undviker sekvenser, som är rika på AT-baspar (t.ex. ca 5 eller fler), och detta särskilt när de föregås av en sekvens, som är rik på GC-baspar; detta för att undvika förtidigt upphörande av transkriptionen. 3) Åtminstone en större andel (a majority) av de valda kodonen är sådana, som föredras vid uttryckandet av mikrobiella genomer (se t. ex. W. Fiers et al Nature QÉQ, 500 (1976). För vad som anges i kraven skall i det följande "kodon som föredras för uttryckandet av mikrobiella genomer" definieras på följande sätt: 9 501 D05 Tabell I Föredragen kodning Första pfisition Andra position Tredje position (5'-ände) T C A G (3'- ände) phe --- --- cys T T phe ser tyr --- C leu --- Stopp Stopp A --- ser Stopp trp G 'lèu pro his arg T leu pro his arg C leu pro gln --- A C --- pro, gln --- G :ile thr asn ---- T ile thr asn ser C A ma, '" '" m' ^ (Start) thr lys ---- G val ala asp gly T val --- asp --- C val -__ glu --- A G val ala glu ---- G När det gäller somatostatin föredrar man mest följande ami- nosyrakodningssystem i strukturgenen: gly (GGT); cys (TGT); lys (AAG); trp (TGG); ala (GCT,GCG); asn (AAT,AAC);'phe"(TTc,TTT); :nr (AcT,AcG); ooh ser (Tcc, Too).

Därest strukturgenen till en önskad polypeptid skall insät- tas i en kloningsbärare för uttryckande som sådan föregås genen av ett startkodon (t.ex. ATG) och efterföljes denna gen omedel- bart av ett eller flera stoppkodon eller avslutning angivande ko- don (se fig. 2). Dock kan, såsom nedan beskrives, aminosyrasekven- sen av en viss bestämd polypeptid uttryckas även med ytterligare föregående och/elleflefterföljande protein. Om den avsedda använd- ningen av polypeptiden nödvändiggör avvspjälkning av det ytterli- gare proteinet, kan en kod för lämpliga spjälkningsställen anordnas intill de ställen, där kodonen för polypeptiden och för det ytter- ligare proteinet angränsar till varandra. I exempelvis fig. l är den produkt, som bildats genom att genen kommit till uttryck, ett prekursorprotein som omfattar både somatostatin och största delen _,.,__ 501 uüb lo “ av[5-galaktosidaspolypeptiden. Här krävs icke någon ATG som kod för översättningens start, eftersom läskoden vid det medelst ribosomer skeende uppbyggandet av det ytterligare proteinetlš- -gal sträcker sig rakt in i strukturgenen för somatostatin. Inkorpo-« reringen av ATG-signalen ger emellertid kod för bildning av me- tionin - en aminosyra som spjälkas specifikt av cyanogenbromid; man får på så sätt en lätt och behändig metod för att överföra prekursorproteinet till den önskade polypeptiden.

I fig. 2 åskådliggöres ytterligare ett moment, som föredras när det gäller heterolog DNA, avsedd att användas för rekombinant- bildning: Anordnandet av kohesiva ändar. Dessa skall företrädesvis omfatta en av de båda strängarna av ett igenkänningsställe för ett restriktionsendonukleas. Av ovan förklarade skäl är ändarna (termini) företrädesvis så utformade, att de vid rekombination ger inbördes olika igenkänningsställen (d.v.s. varje ände skall helst ge ett igenkänningsställe som skiljer sig från det, som fås hos den andra änden). ' Här beskrivna utvecklingsförlopp har visats kunna användas framgångsrikt hos det som modell valda proteinet somatostatin; givetvis kan man emelkâtid mutatis mutandis använda heterologa DNA, som kodar för praktiskt taget vilka som helst kända amino- syrasekvenser. Sålunda är t. ex. ovan och nedan redovisade metoe,: der mutatis mutandis användbara för framställning av poly(amino)- syror, såsom polyleucin och polyalanin; enzymer; serumproteiner; analgetiska polypeptider, t. ex. ß-endorfiner, som modulerar smärttrösklar, etc. I de mest föredragna fallen är de framställ- da polypeptiderna som sådana däggdjurshormoner eller mellanpro- dukter för dessa. Bland dylika hormoner kan nämnas exempelvis somatostatin, humant insulin, humant tillväxthormon, nötkreaturs- tillväxthormon, leutiniseringshormon, ACTH, pankreaspolypeptid etc. Mellanprodukter är bl.a. humant preproinsulin, humant pro- insulin, A- och B-kedjorna i humant insulin etc. Förutom in vitro framställd DNA kan den heterologa DNA omfatta cDNA, erhållen ge- nom omvänd (reverterad) transkription från mRNA; se t. ex. Ull- rich et al. Science l2§, 1313 (I977). 2. Rekombinanter, som kodar för prekursorprotein.

Såsom framgår schematískt av fig. l får man, när geninfor- mationen kommer till uttryck, ett prekursorprotein som omfattar 11 501 005 a) en polypeptid (somatostatin) enligt koden i en specifik he- terolog strukturgen och b) ytterligare protein (omfattande en del av enzymet Û-galaktosidas). Ett ställe för selektiv spjälkning intill somatostatinets aminosyrasekvens möjliggör efterföljande separering av den önskade polypeptiden från det överflödiga pro- teinet. Vad som här åskådliggöres skall anses vara ett represen- tativt exempel på många olika tillvägagångssätt, som blivit dis- ponibla genom de i föreliggande beskrivning angivna teknologier- na.

Det vanligaste är att spjälkningen utföres utanför miljön för plasmidens eller annan bärares replikering, exempelvis efter det att mikrobkulturerna skördats. På detta sätt kan en tempo- rär konjugering av små polypeptider med överflödigt protein skydda de små polypetiderna t. ex. mot afiznedbrytas in vivo under inverkan av endogena enzymer. Samtidigt kommer det ytter- ligare proteinet vanligtvis att beröva den önskade polypeptiden dess bioaktivitet, så länge den extracellulära spjälkningen icke ägt rum; därigenom ökas förfarandets biologiska isäkerhet.

I speciella fall kan det naturligtvis visa sig vara önskvärt att företa spjälkningen inuti själva cellen. Exempelvis kan man åstadkomma kloningsbärare med DNA kodande för enzymer, som över- för insulinprekursorer till den aktiva formen, samarbetande i tandem med annan DNA, som kodar för bildning av prekursorformen.

Det föredras att den i varje enskilt fall önskade polypep- tiden icke i sitt inre skall uppvisa några spjälkningsställen svarande mot det spjälkningsställe, vilket användes i och för av- lägsnande av överflödigt protein. Det bör dock beaktas att även om detta villkor icke är uppfyllt kommer den önskade produkten att erhållas - fastän i mindre utbyten - nämligen tack vare kon- kurrerande reaktioner. I de fall då den önskade produkten är fri från metionin har spjälkning med cyanogenbromid vid en metionin intill den önskade sekvensen visat sig vara utomordentligt effek- tiv. På liknande sätt kan arginin- och lysinfria produkter spjäl- kas enzymatiskt med t. ex. trypsin eller kymotrypsin vid arg- -arg, lys-lys eller liknande spjälkningsställen intill den öns- kade sekvensen. Därest efter spjälkningen någon oönskad rest kvar- lämnas invid den önskade produkten, t. ex. icke-önskad arginin sitter kvar på den önskade produkten, kan denna rest avlägsnas 50? G05 12 genom omsättning med karboxipeptidas. När trypsin användes för spjälkning vid arg-arg, kan man förfara så, att man först skyd- dar lysinställen i den önskade polypeptiden, t. ex. med malein- syraanhydrid eller citrakonsyraanhydrid. De spjälkningsmetoder, som här diskuteras, anges endast som exempel och skall endast anses som representanter för de många varianter, som ter sig na- turliga för en fackman, när han läser denna beskrivning.

Avspjälkningsbart protein kan komma att bildas intill an- tingen C- eller N-ändarna hos en specifik polypeptid, eller t.o.m. inuti själva polypeptiden, såsom är fallet meddn inneslutna sek- vens, som utgör skillnaden mellan proinsulin och insulin. Också i detta fall gäller, att den använda bäraren ev. är en sådan, som kodar för uttryckandet av protein, vilket omfattar upprepade sek- venser av den önskade polypeptiden, varvid dessa sekvenser är in- bördes åtskilda av ställen för selektiv spjälkning. Man föredrar dock - såsom detta också är illustrerat i ritningarna - att kodon för överflödigt protein översättes före strukturgenen för den önskade produkten. I samtliga fall bör man noga se till, att den korrekta läsramen, relativt regulonet, upprätthålles.

. Bildning ("expression") av immunogener.

Förmågan att bilda (express) både en specifik polypeptid och överflödigt protein kan umnmtjas på ett mycket värdefullt sätt för framställning av immunogena ämnen. Polypeptid-haptener (d.v.s. ämnen, som innehåller determinanter specifikt Hndnings- bara av antikroppar och liknande men som i regel är alltför små för att själva ge upphov till en immunrespons) kan få komma till uttryck i form av konjugat med ytterligare protein, som har tillräcklig storlek för att åt konjugatet förläna immunogenici- tet. I själva verket utgör det konjugat av ß-gal och somatostatin, som här framställs i exemplifierande syfte, ett konjugat av im- munogenstorlek; detta konjugat kan väntas "uppodla" anükroppar, som binder vid somatostatinhaptenet. Proteiner med fler än 100, oftast fler än 200 aminosyror uppvisar immunogen karaktär.

Pâ ovan beskrivet sätt framställda konjugat kan användas för uppodling av antikroppar, som är värdefulla för radioimmun- testning eller annan testning avseende haptenet, och alternativt för framställning av vacciner. Ett exempel på detta sistnämnda användningssätt är följande: Cyanogenbromid eller andra spjälk- 501 005 13 ningsprodukter från virushöljeprotein ger oligopeptider, vilka binder vid sådan antikropp, som uppkommit som respons till själva proteinet. Om aminosyrasekvensen hos detta oligopeptidhapten är given, kan heterolog DNA för detta hapten bringas att komma till uttryck i form av ett konjugat med ytterligare protein, som för- länar immunogenicitet. Användning av dylika konjugat såsom vacci- ner kan väntas minska sådana bireaktioner, som annars uppkommer när man använder själva virushöljeproteinet i och för åstadkomman- de av immunitet. 4. Kontrollelementen.

Fig. l visar en process, där en transformerad organism bil- dar polypeptidprodukt enligt instruktioner från heterolog DNA, som bragts under kontrollen av ett regulon, vilket är "homologt" med organismen i dennasicke-transformerade tillstånd. Den laktosbe- roende E.coli-kromosom-DNA omfattar sålunda ett laktos-operon (kallat "lac-operon), som utgör en mediator för laktosomsättning genom bl.a. bildning av enzymet/3-galaktosidas. I det speciella fall, som här visas, har lac-kontrollelementen erhållits från en bakteriofag, nämligen}\plac5, som har förmåga att infektera E. coli. Fagens operon i sin tur har erhållits genom transduktion från samma bakterieart, vilket är förklaringen till "homologin".

Homologa regulon, som är lämpliga för användning vid det angivna förfarandet, kan alternativt härstamma från i organismen nativ plasmid-DNA.

Eftersom lac-promotor-operatorsystemet är så enkelt och ef- fektivt är det mycket lämpligt att använda detsamma i de beskriv- na processerna. Ytterligare en faktor, som gör nämnda system mycket lämpligt för detta ändamål, är dess förmåga att induoeras _ av IPTG (isopropyltio-ß-D-galaknsid). Givetvis kan man även använ- da andra operon eller delar därav, t. ex. Å-promotor-operator, ara- binosoperon (phi 80 dara), eller kolicin El-, galaktos-, alka- liskt fosfatas- eller tryptofanoperonen. Promotor-operatorer bil- dade med detta sistnämnda (d.v.s. "tryp-operon") kan väntas ge 100% repression ända fram till induktion (med indolakrylsyra) och skörd.

. Plasmidkonstruktion (allmänt).

Detaljerna beträffande den i fig. 4 schematiskt åskådlig- gjorda processen redovisas längre fram under rubriken "EXBERI- 501 oss 14 MENTELIT". Redan nu skall emellertid ges en kort redogörelse för ett fleratal av de använda metoderna vid konstruktionen av rekom- binantplasmiden enligt den föredragna utföringsformen.

Vid kloning och expression av den syntetiska genen för soma- tostatin användes två plasmider, var och en med ett EcoRI-sub- stratställe i ß-galaktosidas-strukturgenen. Den ena plasmiden har därvid Eco-RI-substratstället i en annan region i sin ß-ga- laktosidas-strukturgen än den andfilplasmiden (se fig. 4 och 5).

Genom att det syntetiska för somatostatin kodande DNA-fragmentet insättes i dessa plasmiders EcoRI-ställen kommer "vidarebehand- lingen" av den genetiska informationen i detta fragment att ske under kontroll av lac-operon-kontrollelementen. Efter insättandet av somatostatinfragmentet i dessa plasmider bör kodöversättningen resultera i en somatostatinpolypeptid föregången av antingen lO aminosyror (pSOMl) eller prakti skt taget hela ß-galaktosidas-un- derenheten (pSOMll-3).

Plasmidkonstruktionsschemat börjar med plasmid pBR322; denna utgör en klart karakteriserad kloningsbärare, Lac-elementens in- förande i denna plasmid åstadkoms genom insättning av ett HaeIII- -restriktionsendonukleasfragment (205 nukleotider), som innehöll lac-promotor, CAP-bindningsställe, operator, ribosom-bindnings- ställe samt de första 7 aminosyrakodonen av strukturgenen för F>-galaktosidas. HaeIII-fragmentet hade erhållits ur A plac5-DNA.

Den med EcoRI spjälkade plasmiden pBR522, vars ändar reparerats med T4-DNA-polymeras och deoxiribonukleotid-trifosfater, ligerades "stumt" ände mot ände med HaeIII-fragmentet till bildning av EcoRI-ändar vid .insättningsställena. Genom hopfogning av ifrågava- rande HaeIII-fragment och reparerade EcoRI-fragment erhålles EcoRI- -restriktionsstället vid varje ände (terminus); se fig. 4 och 5.

Bland transformanter av E.coli RR1, som erhållits med denna DNA, utvaldes sådana; som uppvisade resistens mot tetracyklin (Te) och ampicillin (Ap) på 5-brom-4-klor-indolylgalaktosidmedium (X-gal).

På detta indikatormedium kan koknier, som är konstitutiva för syn- tesen avlß-galaktosidas, tack vare ett ökat antal repressortit- rerande lao-opgratorer (lac operators titrating repressor), iden- tifieras genom att de har blå färg. Två orienteringar av HaeIII- fragmentet är möjliga; de kunde särskiljas genom osymmetriskt lä- ge av ett Hha-restriktionsställe i fragmentet. Plasmiden pBHlO 501 ons modifierades ytterligare för eliminering av det EcoRI-endonukleas- ställe, som var distalt i förhållande till lac-operatorn (pBH20).

De 8 kemis t s tetiserade oligodeoxiribonukleotiderna (fig. 2) märktes medÅšä2;§ïÄTP vid sina 5'-ändar med tillhjälp av poly- nukleotidkinas, och de hopfogades medelst TÄDNA-ligas. Genom vä- tebindningar mellan deöverlappande fragmenten kommer somatostatin- -genen att hopsätta sig själv, och den polymeriserar sedan till bildning av större molekyler tack vare de kohesiva ändarna, som har en restriktionsställen bildande konstruktion. De ligerade pro- dukterna behandlades med restriktions-endonukleaserna EcoRI och BamHI, till bildning av somatostatin-genen såsom visas i fig. 2.

Det syntetiska somatostatin-genfragmentet med EcoRI- och BamI-ändar ligerades till plasmiden pBH20, vilken dessförinnæïbe- handlats med restriktions-endonufleaserna EcoRI och BamHI och med alkaliskt fosfatas. Genom behandlingen med alkaliskt fosfatas får man ett molekylärt urval av plasmider, som uppbär det insatta frag- mentet. Ampicillinresistenta transformanter, som erhållits med den- na ligerade DNA, undersöktes medelst screening-test beträffande tetracyklinkänslighet, och flera bland dem undersöktes beträffan- de insats av ett EcoRI-BamHI-fragment med den rätta storleken.

Båda strängarna av EcoRI-BamHI-fragmenten av plasmider från två kloner underkastades nukleotidsekvensanalys, varvid man star- tade vid BamHI- och EQORI-ställena. Sekvenanalysen fortsattes in i lac-kontrollelementen; lac-fragmentsekvensen befanns vara in- takt, och i ett fall, pSOMl, företogs oberoende bestämningar av båda strängarnas nukleotidsekvens; man fick då fram de sekvenser, som visas i fig. 5A.

EcoRI-Pst-fragmentet i plasmiden pSOMl, med lac-kontrollele- mentet, avlägsnades och ersattes med EcoRI-Pst-fragmentet av pBR322 till bildning av plasmiden pSOMll, EcoRI-fragmentet av ,Åplac5, som innehöll lac-operonkontrollregionen och största de- len av strukturgenen förfï-galaktosidas, insattes i plasmidens pSOMll EcoRI-ställe. Man väntade sig kunna finna två orienterin- gar av EcoBI-lac-fragmentet av Å plac 5. Den ena av dessa orien- teringar skulle då vara den, som bibehöll den rätta läsramen med fortsättning rakt in i somatostatin-genen, medan den andra icke skulle bibehålla denna läsram. Då sedan på oberoende sätt isole- rade kloner analyserades beträffande somatostatinaktivitet kunde 501 005 16 man identifiera kloner, som innehöll genen med den rätta orien- teringen. En av dessa sistnämnda kloner var den, som betecknas pSOM11-3. 6. Mikroorganismen.

För transformation har många olika encelliga mikroorganis- mer föreslagits, däribland t. ex. bakterier, svampar och alger; här avses sådana encelliga organismer, som kan bringas att till- växa i kulturer eller genom jäsning. De mest lätthanterliga or- ganismerna är vanligtvis bakterier. Bland bakterier, som kan trans- formeras, kan nämnas sådana tillhörande Enterobacteriaceae, t. ex. stammar av Escherichia coli och Salmonella; sådana tillhörande Bacillaceae, t. ex. Bacillus subtilis; sådana tillhörande Pneu- mococcus- eller Streptococcussläktena, och Haemophilus influenzae.

För de nedan diskuterade processerna avseende somatostatin hade man valt mikroorganismen E. coli stam RRl, genotyp Pro'Leu_ Thi-RB_MB rëc A+StrrLac Y-, Organismen E.coli RRl har erhållits från E. coli HBlOl (H.W. Boyer et al. J. Mol. Biol. (1969), 41, 459-472) genom att denna organism parats med E. coli Kl2, stam KLl6, som Hfr-donator. Se J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York 1972). Kulturer av både E. coli RRl och E. coli RR1 (pBR322) har deponerats hos American Type Culture Collection utan förbehåll beträffande deras till- gänglighet; de har tilldelats numren ATCC nr 31343 resp. ATCC nr 31344. Även den somatostatin-producerande organismen har deponerats (ATCC nr 31447).

När det gäller processerna avseende humant insulin har gener för A- och B-kedjorna klonats i E. coli K-12 stam 294 (ände A, thi',hsr-, hsmk+), ATCC nr 31446, och denna organism har då an- vänts för bildning av A-kedjan (E. coli K-12 stam 294 ¿§IA17, ATCC nr 31448). Information för B-kedjan av humant insulin ut- trycktes först i ett derivat av HBlO1, nämligen E. coli K-12 stam D12lO, en 1ac+ (iQb+zty+), och denna, B-kedjegenen innehål- lande organism har likaledes deponerats (ATCC nr 31449). Alterna- tivt kan B-kedjegenen insättas i den först angivna organismen, d.v.s. stam 294, och sålunda bringas till uttryck utgående från denna organism.

EXPERIMENTELLT I. SOMATOSTATIN 1. Konstruktion av somatostatin-genfragment Åtta oligodeoxiribonukleotider, betecknade A, B, C, D, 17 501 ons E, F, G, H i fig. 2, framställdes först. Detta skedde i huvudsak enligt den modifierade triestermetoden av K. Itakura et al., J.

Am. Chem. Soc. 91, 7527 (1975). När det gäller fragmenten C, E och H anlitades emellertid ett förbättrat förfarande; härvid fram- ställes först fullständigt skyddade trimerer som basenheter, i och för uppbyggande av längre oligodeoxiribonukleotider. Den för- bättrade metoden visas schematiskt i fig. 5, där B betecknar ty- min, N-bensoylerad adenin, N-bensoylerad cytosin eller N-iso- butyrulerad guanin. Under hänvisning till fig. 5 kan processen i korthet beskrivas på följande sätt: Med användning av ett över- skott av I (2 mmol) blev kopplingsreaktionen med II (l mmol) näs- tan fullständigt fullbordad inom 60 min., med tillhjälp av 2,4,6- -triisopropylbensensulfonyltetrazolid (TPSTe, 4 mm0l).TPSTe är ett kraftigt verkande kopplingsmedel. Efter avlägsnande av den i '-ställningen befintliga skyddsgruppen med 2%-ig bensensulfon- syralösning kunde 5'-hydroxyldimeren V lätt separeras från ett överskott av 5'-fosfodiestermonomeren IV, nämligen medelst enkel lösningsmedelsextraktion med vattenhaltig NaHC05-lösning i CHCl3.

Det fullständigt skyddade trimerblocket framställdes successivt av 5'-hydroxyldimeren V, föreningen I (2 mmol) och TPSTe (4 mmol) samt isolerades genom kromatografering på silikagel, såsom be- skrivits av B.T. Hunt et al. i Chem. and Ind. l2§1, 1868 (1967).

De trimerutbyten, som erhållits medelst det förbättrade förfaran- det, anges i tabell II nedan.

Tabell II Utbyten av fullständigt skyddade trimerer Sekvens Utbyte Sekvens Utbyte TTT 81% ATG 69% TTT 75% Gcc 61% GGA 41% CCA 72% AGA 49% CAA 72% ATC 71% TTA 71% CCT 61% CAT 52% ACA 63% CCC 75% ACC 65% AAC 59% CGT 51% GAT 60% De åtta oligodeoxirfibonukleotiderna underkastades efter av- 501 005 18 lägsnande av alla skyddsgrupperna rening genom högtrycks-vätske- kromatografi på Panmphase AAX (R.A. Henry et al. J. Chrom. Sci. ll, 558 (l97})),Renheten av varje oligomer kontrollerades medelst homokromatografi på tunnskikts-DEAE-cellulosa och även medelst gelelektrofores i en 20% akrylamidskiva efter märkning av oligo- meregumed [;7-Egg?-ATP 1 närvaro av polynukleotidkinas. En större P-märkt produkt (major product) erhölls från varje DNA-fragment. 2. Ligering och akhylamiggelanalys av somatostatin-DNA.

'-OH-ändarna av de kemiskt syntetiserade fragmenten A-H fosforylerades se arat med T4-polynukleotidkinas. Vid fosforyle- ringen användes Zšëg/-J”-ATP så att reaktionsprodukterna kunde kontrolleras autoradiografiskt.(Emellertid skulle man naturligt- vis lika väl kunna använda icke-32P-märkt ATP, om man skulle av- stå från autoradiografi). Omedelbart före kinasreaktionen in- dunscades 25 /uci (ca 1500 ci/mmol) Û-æj-ATP (Maxam och G11- bert, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 13, 1507 (l977))till torrt tillstånd i 0,5 ml Eppendorfrör. 5,ug fragment inkuberades 20 min. vid 3700 med 2 enheter T4-DNA-kinas (hydroxylapatitfraktion, 2500 enheter/ml; 27) i 70 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol i en total volym av 150/ul. För säkerställande av maximal fosforylering av fragmenten i och för ligering tillsatte man l0/ul av en blandning bestående av 70 mM Tris-HCl, pH 7,6, mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 0,5 mM ATP och 2 enheter DNA-ki- nas och fortsatte inkubationen i ytterligare 20 minuter vid 700.

Fragmenten 250 ngául) lagrades vid -2000 utan ytterligare behand- ling. De kinasbehandlade fragmenten A, B, E och F (vart och ett vägande 1,25/ug) ligerades 16 timmar vid 400 i en total volym av 50(ul i 20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl2, lO mM ditiotreitol, 0,5 mM ATP och 2 enheter T4-DNA-ligas (hydroxylapatitfraktion, 400 enheter/ml; 27). Fragmenten C, D, G och H ligerades under liknande betingelser. Prov om 2/ul uttogs för analys medelst elek- trofores på en 10%-ig polyakrylamidgel jämte efterföljande auto- radiografi (H.L.Heyneker et al., Nature 2§2, 748 (1976)), varvid oreagerade DNA-fragment representeras av snabbt migrerande ma- terial och varvid den monomera formen av de ligerade fragmenten migrerar med färgämnet bromfenolblått (BPB). I viss mån förekom- mer även dimerisering; den uppkommer på grund av de kohesiva än- darna av de ligerade fragmenten A, B, E och F och på grund av de 19 501 005 kohesiva ändarna av de ligerade fragmenten C, D, G och H. Dessa dimerer utgör det material, som migrerar långsammast, och de kan spjälkas upp medelst restriktionsendonukleaserna EcoRI resp. BamHI.

De bägge halvmolekylerna (ligerat A+B+E+F och ligerat C+D+G+H) sammanfogades genom att man företog ett ytterligare ligeringssteg.

Detta utfördes i en slutlig volym av 150/ul under 16 tim. vid 400.

Man tog ut ett prov av l,ml för analys. Reaktionsblandningen upp- nettaaes 15 min. vid 65°c för inakfiivering av T4;DNA-ligaset. DNA- -blandningens migreringsmönster påverkas icke av denna värmebehand- ling. Till reaktionsblandningen sattes restriktionsendonukleaset BamHI i tillräcklig mängd för spjälkning av de multimera formerna av somatostatin-DNA-materialet; denna behandling pågick i 30 min. vid 37OC. Efter tillsättning av NaCl till 100 mM omsattes DNA-ma- terialet med EcoRI-endonukleas. Omsättningarna med restriktions- endonukleas stoppades genom extrahering av den erhållna DNA med fenol-kloroform. Somatostatin-DNA-fragmentet renades från oreagerat material genom preparativ elektrofores på en 10%-ig polyakrylamid- gel. Det band, som innehöll somatostatin-DNA-fragmentet, skars ut ur gelen; och DNA eluerades därur genom att gelen skars sönder till små skivor eller stycken och DNA extraherades över natten vid 6500 med elueringsbuffert (O,5M ammoniumacetat, 10 mM MgC12, 0,1 mM EEEA, O,l% SDS). Sedan utfälldes DNA med 2 volymer etanol, var- på den centrifugerades, áterupplöstes i 200/ul 10 mM Tris-HCl, pH 7,6, och dialyserades mot samma buffert. Pâ så sätt erhölls en so- matostatin-DNA-koncentration av Äjmg/ml. 3. Konstruktion av rekombinantplasmider.

Fig. 4 visar schematiskt hur man konstruerade rekombinant- plasmider, som innehöll somatostatin-genen. I samband med nedan- stående detaljbeskrivning kan fig. 4 tjäna som ledning.

A. Förälderplasmiden pB}22 Den för experimentell somatostatin-kloning valda plasmiden var pB322, en liten plasmid (molekylvikt ca 2,6 megadalton) som innehåller resistensgener mot antibiotikumämnena ampicillin (Ap) och tetracyklin (Tc). Såsom framgår av fig. 4 innefattar genen för ampicillinresistens ett spjälkningsställe för restriktionsendonuk- leaset PstI; ett liknande ställe för restriktionsendonukleaset BamHI ingår i genen för tetracyklinresistens; och mellan dessa Apr- och Tcr-gener ligger ett ECORI-ställe. Piasmiaen pB322 här- 501 005 2o leder sig från pBR}l3, en 5,8 megadalton AprTcrColun"'~p1asm1d (R.L. Rodriguez et al., ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cel- lular Biology¿â, 471-A77 (1976), R.L. Rodriguez et al., Con- struction and Characterization of Cloning Vehicles, i Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expression, sid. 471-477, Aca- demic Press, Inc. (1976). Plasmiden pBR322 och sättet för dess erhållande; ' (har beskrivits i detalj av F. Bolivar et al., Construction and Characterization of New Cloning Vehicles II.

A Multipurpose Cloning System, i tidskriften Gene, november 1977.

B. Konstruktion av plasmiden pBH1O /ug av plasmidens pBR322 DNA omsattes i 30 min. vid 3700 med 10 enheter av restriktionsendonukleaset EcoRI 1 100 mM Tris- -H01, pH 7,6, 100 mM NaCl, 6 mM MgCl2. Reaktionen stoppades ge- nom extrahering med fenol-kloroform; sedan ufälldes DNA med 2,5 volymer etanol och återsuspenderades i 50/ul T4-DNA-poly- merasbuffert (67 mM Tris-H01, pH 8,8, 6.7 mM MgCl2, 16,6 mM (NH¿)2SO¿, l67lpg/ml oxserumalbumin, 50,uM av vart och ett av dnukleosidtrifosfaterna, "dNTP" (A. Panet et al., Biochem. lg, 5045 (1973). Reaktionen igångsattes genom tillsättning av 2 en- heter TÅ-DNA-polymeras. Efter 30 min. inkubering vid 37°C stoppades reaktionen genom extrahering av DNA med fenol-kloro- form, varefter DNA utfälldes medelst etanol. Under 1 timme vid 37°c emsabbee jpg DNA franlplae 5 (sbapn-e eb al. Nature _2_2_g, 768 (1969) med restriktionsenzymet HaeIII (5 enheter) i 6 mM Tris-HCl. pH 7,6, 6 mM MgCl2, 6 mM ß-merkaptoetanol i en slutlig volym av 20/ul. Reaktionen stoppades genom 10 min. upphettning vid 65°c. Den behandlade pßnfizz-DNA blandades med den med Haelll behandlade Aplaes-DNA. een llgering "stunt" 'ande me: ände före- togs i en slutlig volym av 30/ul med 1.2 enheter T4-DNA-ligas (hydroxylapatitfraktion; A. Panet et al.. loc, cit.) i 20 mM Tris-HC1, pH 7.6, 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol. 0.5 mM ATP, 12 timmar vid 1200. Den ligerade DNA-blandningen dialyserades mot 10 mM Tris-H01. pH 7.6, och användes för transformation av E. coli stam RR1. Man valde ut transformantermed tetracyklin- och ampicillinresistens på plattor med minimalt medium - inne- hållande 40/ug/ml45-brom-Ä-klor-indolylgalaktosidmedium (X-gal), 501 005 21 se J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York 1972). Kolonier, som var konstitutiva för syn- tes av ß-galaktosidas. identifierades genom sin blåa färg. Vid undersökning (screening) av 45 blå kolonier, som isolerats obe- roende av varandra, befanns tre av dem innehålla sådan plasmid- -DNA, som innefattade två EcoRI-ställen med ett avstånd av ca 200 baspar mellan dessa båda ställen. Genom att det finns ett asymmetriskt placerat HhaI-fragment i det 203 baspar långa HaeIII lac-kontrollfragmentet (W. Gilbert et al., Protein-Li- gand Interactions, H. Sand and G. Blauer Eds., De Gruyter. Ber- lin 1975, sid. 193-210) blir det möjligt att bestämma hur HaeIII~fragmentet. som nu är ett EcoRI-fragment, är orienterat i dessa plasmider. Man kunde visa att plasmiden pBHlO uppbar fragmentet i den önskade orienteringn1d.v.s. så att lac-tran«~ skriptionen gick rakt in i plasmidens Tor-gen.

C. Konstruktion av plasmiden pBH2O Som nästa steg företogs en modifiering av plasmiden pBHlO på sådant sätt att det EcoRI-ställe, som låg distalt i förehål- lande till lac-operatorn, eliminerades. Detta åstadkoms genom preferentiell spjälkning medÉboRI-endonukleas vid det distalt belägna stället, varvid man partiellt skyddade (med RNA-poly- meras) det andra EcoRI-stället, som låg mellan Ten- och lac- -promotorerna; dessa ligger på ett inbördes avstånd av endast ca 40 baspar. Efter det att RNA-polymeraset hade bundits, om- sattes denna DNA (5/ug) med EcoRI (1 enhet) 1 en slutlig volym av 10/ul under en tid av 10 min. vid 57°C. Reaktionen stoppa- des genom 10 min. upphettning vid 65°C. De kohesiva av EcoRI bildade ändarna omsactes 1 5 min. vid 25°c med s1-nukleas 1 mM-Na-acetat, pH Ä,5, 300 mM NaCl, 1 mM ZnCl2. Reaktionen stoppades genom tillsättning av EDTA (slutvärde 10 mM) och Tris- -HCI, pH 8 (slutvärde 50 mM). Den erhållna DNA extraherades med fenol-kloroform. utfälldes med etanol och återsuspenderades i 100/ul T4-DNA-ligeringsbuffert. T4-DNA-ligas (l/ul) tillsat- tes, och blandningen inkuberades 12 tim. vid l2°C. Den ligerade DNA infördes i och för transformation i E. coli stam RRI, och man valde ut transformanter med Apr och Tcr.vilken selektion verk- ställdes på ett X-gal-antibiotikummedium. När de vid screening 501 0Û5 22 av 10 isolerade blå kolonier erhållna DNA-materialen underkas- tades restriktionsenzymanalys, befanns dessa kloner innefatta plasmid-DNA med ett (ett enda) EcoBI-ställe. Sju av dessa kolo- nier hade bibehållit EcoRI-stället i läget mellan lac- och Tor- -promotorerna. Man erhöll .belcräftelse på att nukleotidsekvensen från EcoRI-stället gick rakt in i lac-kontrollregionen hos en av dessa plasmider, pBH20. Denna plasmid användes då 1 fortsätt- ningen för kloning av somatostatin-genen.

D. Konstruktion av plasmiden pSOM 1 ,ug av plasmiden pBH20 omsattes fullständigt med re- striktionsendonukleaserna EcoRI och BamHI i en slutlig volym av 50/ml. Man tillsatte bakteriellt alkaliskt fosfatas (0,1 enhet Worthington BAPF), och inkubationen fortsattes i 10 min. vid 65°C, Reaktionen avbröts genom extrahering med fenol-klo- roform och erhållen DNA utfälldes med 2 volymer etanol, centri- fugerades och löstes i 50,ul 10 mM Tris-HCI, pH 7,6, l mM EDTA.

Självligering av den med EcoRI, BamHi behandlade pBH20-DNA förhindras effektivt genom behandlinglnæd alkaliskt fosfatas, men cirkulära rekombinantplasmider, innehållande somatostatin- -DNA, kan fortfarande bildas vid ligering. Eftersom E.coli RR1 transformeras med mycket ringa effektivitet av linjär DNA, kom- mer de flesba transformanter att innehålla rekombinantplasmider. 50/ul somatostatin-DNA (Å-pg/ml) ligerades vid 22°C med 25/ul av den med BamHI, EcoRI och alkaliskt fosfatas behandlade pBH20-DNA i en total volym av 50,ul, innehålland:20 mM Tris-H01, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol. 0,5 mM NTP och Ä enhe- ter T4-DNA-ligas. Efter 10, 20 och 30 min. sattes ytterligare somatostatin-DNA (40 ng) till reaktionsblandningen. (Genom den gradvisa tillsättningen av somatostation-DNA kan ligering vid plasmiden gynnas i konkurrens med självligering). Ligeringeg fortsattes i l timme, varefter blandningen dialyserades mot/mM Tris-HCl, pH 7,6. I ett kontrollförsök ligerades den med BamHI, EcoRI och alkaliskt fosfatas behandlade pBH20-DNA i frånvaro av somatostatin-DNA, under eljest liknande betingelser. Båda de er- hållna preparaten användes sedan utan ytterligare behandling i och för transformering av E. coli RRI. Transformationsexperimen- ten utfördes i en lokal som uppfyllde säkerhetsföreskrifterna 23 501 005 enligt P3 (National Institutes of Health, U.S.A., Recombinant DNA Research Guidelines. (1976). Urval av transformanter skedde på plattor med minimalt medium, innehållande 20,ug/ml Ap och 40/ug/ml X-gal. Man isolerade 10 tranformanter, vilka alla var Tc-känsliga. Dessa betecknades pSOMl, pSOM2,...etc..... pSOMlO. I kontrollförsöket erhölls inga tranformanter. Bland de tranformanterna var det 4, som innehöll plasmider med såväl ett Ecofil-ställe som ett BamHI-ställe. Storleken av det lilla EcoRI-, BamHI-fragmentet hos dessa rekombinantplasmider var i alla fyra fallen ungefärligen lika med storleken av den flwvitro framställda somatostatin-DNA. Bassekvensanalys enligt Maxam och ~f Gilbert, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. IQ, 560 (1977), visade att det önskade somatostatin-DNA-fragmentet var infört i plasmiden pSOMl. ” 0 Resultatet från DNA-sekvensanalys av den klon, som innehål- ler plasmiden pSOMl, förutsäger att denna klon bör producera en peptid som innefattar somatostatin. Emellertid har ingen somatos- tatin-radioimmunaktivitet kunnat iakttas hos extrakt från cell- pelletmaterial eller överstàende vätska från odlingar; närvaro av somatostatin kan heller icke fastställas när den växande kul- turen sättes direkt till 70% myrsyra och cyanogenbromid. Extrakt från E.coli RBI har befunnits åstadkomma en mycket snabb nedbryt- ning av exogent somatostatin. Den omständigheten att kloner inne- hållande plasmiden pSOMl icke visat somatostatinaktivitet kan mycket väl tänkas bero på intracellulär nedbrytning, verkställd av endogena proteolytiska enzymer. Plasmiden pSOMl användes där- för i och för konstruktion av en plasmid, som kodar för ett pre- kursorprotein, omfattande somatostatin och tillräckligt stort för att detta protein skall kunna väntas vara motståndskraftigt mot proteolytisk nedbrytning.

E. Konstruktion av plasmiderna pSOMll och pSOMll-5 Man konstruerade en plasmid, i vilken somatostatin-genen kun- de bestämmas ligga vid ß-galaktosidasgenens C-ände, med bibehållen korrekt fas för översättningen. Tack vare närvaron av ett EcoRI- -ställe nära C-änden av denna gen och tack vare det att man kände till aminosyrasekvensen hos detta protein (B. Polisky et al., Proc. Nat. Acad. Soi. U.S.A.,_Z2 3900 (1976), A.V. Fowler et al.,Id. 501 005 2,, Zï, 1507 (1976), A.I. Bukhari et al., Nature New Biology 243, 238 (1975) samt LE. Langley, J. 13101. cnem._2¿, 2587 (1975)) var det möjligt att insätta EcoRI-, BamHI-somatostatin-genen 1 detta EcoRI-ställe med bibehållande av den korrekta läsramen.

För konstruerandet av en sådan plasmid omsattes 50/ug pSOMl- -DNA med restriktionsenzymerna EcoRI och PstI i en slutlig vo- lym av 100/ul. För att separera det stora Pst-EcoRI-fragment, som innehåller somatostatin-genen,från det lilla fragment, som innehåller lac-kontrollelementen, användes en preparativ 5% polyakrylamidgel. Det stora bandet skars ut ur gelen och denna DNA eluerades genom att gelen sönderskars till småbitar och DNA extraherades därur vid 6500 under natten. På liknande sätt om- sattes plasmid pBR322DNA (50/ug) med PstI- och EcoRI-restrik- tionsendonukbaserna, och de båda på så sätt erhállnaDNA-frag- menten renades genom preparativ elektrofores på en 5% polyakryl- amidgel. Det lilla PstI-EcoRI-fragmentet från pBR322 (l/ug) li- gerades med det storaPstI-EcoRI-DNA-fragmentet (5,Mg) från pSOMl i en slutlig volym av 50/ul, med användning av l enhet T4-DNA- -ligas vid l2°C under 12 timmar. Den ligerade blandningen använ- des för transformering av E.coli RRI, och ampicillinresistenta transformanter utvaldes på ett X-gal-medium. Som väntat: gav näs- tan alla (95%) Apr-transformanterna vitakolonier (ingen lac-opera- tor) på X-gal-indikatorplattor. Den resulterande plasmiden, pSOM1l, användes vid bildandet av plasmid pSOMll-3. En blandning av 5,g psomli-DNA een 5 /ug Åplaes-DNA omsattes med neon: (lo enheter, min., 3700). Omsättningen med restriktionsendonukleaset av- bröts genom extraktion med fenol-kloroform. Sedan utfälldes DNA med etanol, varpå den àtersuspenderades i TÅ-DNA-ligasbuffert (50,ul). T4-DNA-ligas ( 1 enhet) sattes till blandningen och in- kuberades i 12 timmar vid l2°C. Den ligerade blandningen dialy- serades mot lO mM Tris-HCl, pH 7,6, och användes för trämformering av E.coli stam RRI. Transformanterna underkastades selektion med avseende på Apr på X-gal-plattor, innehållande ampicillin, och undersöktes beträffande förmågan att producera ß-galaktosidas (screened for constitutive B-galactosidase production). Ca 2% av kolonierna var blå (pSOMll-l, ll-2 etc). När plasmid-DNA, som erhållits från dessa kloner, underkastades restriktionsenzym- analys, visade det sig att samtliga plasmider hade ett nytt 501 ÛÛ5 EcoRI-fragment av ca 4,4 megadalton, vilket innehåller lac- -operonkontrollställena och huvuddelen av ß-galaktosidasgenen.

Eftersom tvà orienteringar av EcoRI-fragmentet är möjliga ut- nyttjades den omständigheten, att ett HindIII-restriktionsstäl- le hade ett asymmetriskt läge, för att bestämma vilka kolonier som var de, i vilka EcoRI-fragmentet låg orienterat på sådant sätt att lac-transkriptionen går rakt in i somatostatin-genen.

Tvávfaldiga omsättningar med HindIII och BamHI visade, att det var endast klonerna innehållande plasmiderna pSOMll-3, pSOMll-5, pSOMll-6 och pSOMll-7, som hade EcoRI-fragmentet i denna ori- entering. _ 4. Radioimmuntestning betr. somatostatinaktivitet.

Standardradioimmuntesten - radioimmune assays, förkortat RIA - för somatostatin (A. Arimura et al., Proc. Soc. Exp.

Biol. Med. l4§, 784 (l975))modifierades genom att den för test- ning :avsedda volymen minskades ned och fosfatbuffert användes.

Tyrll-somatostatin joderades med användning av en kloramin-T- -metod (idem). För testning med avseende på somatostatin under- kastades provet, vanligen i 70%-ig myrsyra innehållande 5 mg/ml cya- _nogenbromid, torkning i ett koniskt polypropenrör (0,7 ml, Sar- stedt) över fuktig KOH under vakuum. Man tillsatte först 20/ul PBSA-buffert (75mM NaCl; 75 mM natriumfosfat, pH 7,2; l mg/ml oxsergmalbumin; och 0,2 mg/ml natriumazid), sedan 40,ul av en “ Åïêsl/ísomatostatinïëocktail" och 20/ul av en 1000 ggrs utspäd- ning, i PBSA, av kaninantisomatostatin-i nserum S 39 (Vale et al., metabolism gå, 1491 (1976)). Nämnda fiBÜ-somatostatin- cocktail innehöll per ml PBSA-buffert följande: 250/ug normalt kaningammaglobulin (Antibodies, Inc),l500 enheter proteasin- hibitor ("Trasylol", Calbiochem) och ca 10,000 counts Åçêsï -Tyrll- -somatostatin. Efter minst 16 tim. vid rumstemperatur sattes 0,353 ml get-antikaningammaglobulin (Antibodies, Inc. P=0,0}) 1 PBSA-buffert till provrören. Blandningen inkuberades 2 tim. vid 3700, kyldes till 5°C samt centrifugerades sedan 5 min; vid .000 x g. Den överstående vätskan avskildes och pellet-återstoden räknades i en gammaräknare. Det visade sig att vid den använda mängden antiserum 20% av ovannämnda counts utfällts utan konkur- rerande omärkt somatostatin. "Bakgrunden", med obegränsat soma- 501 005 26 tostatin (200 ns), var vanligtvis 3%. Halva den maximala kon- kurrensen erhölls med lO pg somatostatin. Inledande försök med extrakt av E.coli stam RR1 (mottagarstammen) gav vid handen, att mindre än 10 pg somatostatin lätt kunde detekteras i närvaro av 16/ug eller mera cyanogenbromidbehandlat bakteriellt protein.

Om mer än 2/ug protein från myrsyrabehandlade bakterieextrakt fanns närvarande, var detta i viss mån störande genom att bak- grundsvärdet då ökade, men denna störning kunde i mycket stor utsträckning undanröjas genom spjälkning med cyanogenbromid.

Rekonstruktionsförösk visade, att somatostatin är stabilt i cyanogenbromidbehandlade extrakt.

A. Konkurrens från bakterieextrakt.

Stammarna E. coli RRI (pSOMll-5) och E.coli RRI (pSOMll-4) odlades 1 Luriabuljong vid }7°C till en koncentration av 5 x 108 celler/ml. Sedan tillsattes IPTG till lmM och odlingen fort- sattes 1 2 timmar. Portioner med l ml centrifugerades några få sekunder 1 en Eppendorfcentrifug och pelletmaterialen suspende- rades 1 500/ul 70%-ig myrsyra innehållande 5 mg/ml cyanogenbro- mid. Efter ca 24 tim. vid rumstemperatur utspäddes proven 10 ggr i vatten och de i fig. 6 angivna volymerna testades (tre- faldiga test för varje volym) med avssende på somatostatin. I fig. 6 betecknar "B/Bg förhållandet [ïë5;Lfimfibåatin bundet i närvaro av prov [š2öš}amgbQätin bundet 1 frånvaro av prov, d.v.s. 1 frånvaro av konkurrerande somatostatin.

Varje punkt 1 kurvdiagrammet 1 fig. 6 är genomsnittsvärdet från 3 rör. Proteinhalten i de outspädda proven bestämdes' och befanns vara 2,2 mg/ml i fallet E. coli RRI (pSOMll-5) och 1,5 mg/ml 1 fallet E. coli RRI (pSOM-4).

B. Första undersökning i syfte att sortera pSOMll-klonerna med avseende på deras somatatostatinproduktionsförmåga Cyanogenbromidbehandlade extrakt av ll kloner (pSOMll-2, pSOMll-3, etc) bereddes på samma sätt som beskrivits ovan i samband med fig. 6. Av varje extrakt togs 30/ul (vart och ett 27 sm 005 av dessa prov trefaldigt) för radioimmuntestning. Resultaten framgår av fig. 7. Värdena för pikogram somatostatin erhölls med hjälp av en standardkurva, som upprättades i samma experiment- serie. -p--t-n--u--u___-_-___-__--__--____-_____-_ Resultaten från de hittills beskrivna radioimmuntesten kan sammanfattas på följande sätt: I motsats till vad som var fallet vid försök med pSOMl uppvisade fyra kloner, nämligen pSOMll-3, ll-5, ll-6, ll-7, en lättdetekterbar somatostatin-radioimmun- aktivitet: Se fig. 6 och 7. Restriktionsfragmentanalys visade, att pSOMll-3, pSOMll-5, pSOMll-6 och pSOMll-7 hade den rätta lac-operonorienteringen medan däremot orienteringen var den mot- satta hos pSOMll-2 och ll-4. Det föreligger således en perfekt korrelation mellan å ena sidan korrekt orientering av lac-opero- net och à andra sidan somatostatin-radioimmunaktivitet.

C. Effekter av IPQG-induktion och CNBr-spjälkning pà positiva och negativa kloner Vad som kan förutsägas med ledning av somatostatinplasmi- dens uppbyggnad är att syntesen av somatostatin kommer att vara under kontroll av lac-operonet. Lac-repressorgenen ingår icke i plasmiden, och mottagarstammen (E.coli RRI) innehåller; vild- typskromosomgenen för lac-repressor, vilken gen producerar en- dast 10-20 repressormolekyler per cell (15). Antalet plasmidko- pior ( och således antalet lac-operatorer) är ca 20-50 per cell; fullständig repression är därför omöjlig. Såsom framgår av ta- bell III nedan ökades den specifika aktiviteten av somatostatin i E. coli RRl (pSOMll-3) under inverkan av IPTG, en s.k. indu- cer för lac-operonet. Induktionsgraden var som väntat låg; den varierade från 2,4 ggr till 7 ggr. I försöket 7 (tabell III) inducerades även d-aktiviteten med en faktor av 2; a-aktivi- teten är ett mått på de första 92 aminosyrorna i;&galaktosi- das. I flera bland de ifrågavarande försöken kan ingen somatosta- tinradioimmunaktivitet detekteras innan hela det av cellen pro- ducerade proteinet spjälkats med cyanogenbromid. Eftersom det vid radioimmuntestet använda antiserumet, S 39, behöver en ala- nin med fri N-ände (a free N-terminal alanine) förväntades ingen aktivitet före spjälkningen med cyanogenbromid. 28 Tabell III Specifik somatostatinradioimmunaktivitet Förkortningar : Luriabuljong = LB; isopropyltiogalaktosid = IPTG; cyanogenbromid = CNBr; somatostatin = SS.

Proteinmätningar har verkställts enligt metoden av Bradford, Anal. Biochem. E, 248 (1976).

.. .. IPTG CNBr Forsok nr. Stam Medium l_mM 5 mg/ml pgtsšáug prO_ e n 1 11-2 LB + + 40,1 11-3 LB + + 12 11-4 LB + + 40,4 ll-5 LB + + 15 2 ll-3 LB + + 12 11-3 LB + - 40,1 11-3 LB + + 61 ll-3 LB - + 8 4 11-3 LB + - 40,1 11-3 LB _ + + 71 ll-3 VB + glycerolï + + 62 11-3 LB + glycerol + + 250 6 ll-3 LB + + 320 11-2 LB + + « 7 11-3 LB + +1 24 11-3 LB - +~ 10 a Vogel-Bonners minimala medium plus glycerol D. Gelfiltrering av cyanogenbromidbehandlade extrakt ' Myrsyre- och cyanogenbehandlade extrakt av de positiva klonerna pSOMll-3, ll-5, 11-6 och ll-7 sammanslogs (total volym 250/ul), torkades och àtersuspenderades i 0,1 ml 50%-ig ättik- syra. Man tillsatte låg?-leucin och provet applicerades på en 0,7 x 47 cm kolonn av Sephadex G-50 i 50%-ig ättiksyra. Av de från kolonnen erhållna fraktionerna tog man ut portioner om 50/ul och testade dem med avseende på somatostatin. Extrakten av de negativa klonerna, likaledes sammanslagna (ll-2,11-4 och 11-ll), behandlades på identiskt samma sätt. Resultaten fram- går av fig. 8. På samma kolonn ger känt somatostatin (Beckman Corpà de visade elueringsresultaten (SS). I detta system är somatostatinet klart oxh tydligt skilt från utestängda stora peptider och från helt inneslutna små molekyler. Endast extrakt 29 501 005 av för somatostatin positiva kloner visade radioimmunaktivitet i kolonnfraktionerna, och denna aktivitet visar sig bli eluerad i samma läge som kemiskt syntetiserat somatostatin.

Kommentar till information med avseende på aktiviteten De data, av vilka framgår att en polypeptid innehållande somatostatinets aminosyrasekvens syntetiseras, kan sammanfattas på följande sätt: l)Somatostatinradioimmunaktivitet finns i så- dana celler av E. coli, som har plasmiden pSOMll-3. Denna inne- håller en somatostatin-gen med bevisligen korrekt sekvens och har sitt lac-EcoRI-DNA-fragment i korrekt orientering. Celler med den besläktade plasmiden pSOMll-2, som har samma somatosta- tin-gen men vari lac-EcoRI-fragmentet har motsatt orientering, ger icke någon detekterbar somatostatinaktivitet. 2) Såsom kan förutsägas på basis av strukturmönstret kan någon somatostatin- radioimmunaktivitet icke observeras förrän efter cyanogenbromid- behandling av cellextraktet. 3) Somatostatin-aktiviteten ligger under kontroll av lac-operonet; ett belägg härpå är induktionen med IPTG, som är en inducer för lac-operonet. 4) Somatostatin- aktivitetens kromatografiresultat är sammanfallande med de för känt somatostatin på Sephadex G-50; 5) DNA-sekvensen av den klo- nade somatostatin-genen är korrekt. Om översättningen (transla- tionen) försiggår i otakt med läsramen, d.v.s. icke är "i fas", framställes en peptid som på vaflænda ställe är olik somatosta- tinet. Radioimmunaktivitet har detekterats, som ger vid handen att en med somatostatin nära besläktad peptid framställes; över- sättningen måste således vara "i fas". Eftersom den är "i fas", förhåller det sig enligt den genetiska kodens diktat så, att en peptid med den exakta sekvensen av _Söm&t0St&tin framställes- 6) Slutligen inhiberar ovan angivna prover av E. coli RRI (pSOMll-3)-extrakt frigörandet av tillväxthormon från rått-hypo- fysceller, medan prover av E. coli RRI (pSOMll-2), framställda parallellt och med identisk proteinkoncentration, icke har någon inverkan på frigörandet av tillväxthormonet.

Stabilitet, utbyte och rening av somatostatin De stammar, som uppbär EcoRI-lacoperonfragmentflipSOMll-2, 50? 005 pSOMll-5 etc), uppvisar segregation vad beträffar plasmidfeno- typen. Exempelvis kan nämnas att efter ca 15 generationer om- kring hälften av E. coli RRl (pSOMl5)-kulturen var konstitutiv för/3-galaktosidas, d.v.s. innehöll lac-operatorn, och av dessa organismer var omkring hälften resistenta mot ampicillin. Både stammar som är positiva (pSOMll-3) och stammar som är negativa (pSOMll-2)för somatostatin är instabila , varför nackdelen i fråga om tillväxten troligen härrör från överproduktion av den stora men ofullständiga och inaktiva galaktosidasmolekylen. Ut- bytet av somatostatin har varierat från 0,001 till 0,03% av det totala cellproteinet, troligen på grund av urval av sådana cel- ler i kulturerna, som har plasmider med en deleterad lac-re- gion. De högsta somatostatinutbytena har erhållits från prepa- rat, där odlingen startat med en enda ampicillinresistent kon- stitutiv koloni. T.o.m. i dessa fall uppvisade 50% av cellerna när kulturen skördades deletioner av lac-regionen. När det gäller det beskrivna systemet synes det därför vara tillrådligt att anlita lagring i fryst tillstånd (lyofilisering) och odling med utgångspunkt från en enda dylik koloni ända fram till skörd- andet. Utbytena kan ökas exempelvis genom användning av bakterie- stammar som överproducerar lac-repressor, så att bildning av pre- kursorprotein i huvudsak helt undertryckes före induktionen och skördandet. Alternativt kan man såsom ovan diskuterats använda ett tryptofan- eller annat operator-promotorsystem, som normalt är helt undertryckt.

I det orena extrakt, som erhålles genom cellernas sönder- slitande i t. ex. en Eatonpress, är ß-galaktosidas-somatostatin- prekursorproteinet olösligt; det återfinnas i den första centri- fugeringspelleten, som erhållits efter centrifugering med låg has- tighet. Aktiviteten kan lösliggöras i 70%-ig myrsyra¿ 6M guani- diniumhydroklorid, eller 2%-igt natriumdodecylsulfat. Mest före- draget äreflmilertid att man extraherar det orena extraktet från Eatonpressen med BM karbamid, varpå återstoden spjälkas med cyano- genbromid.I förberedande försök har somatostatinaktivitet från E.coli stam RRI (pSOMll-5) anrikats ca 100 ggr medelst alkoholex- trahering av spjälkningsprodukten och kromatografering på Sephadex G-50 i 50%-ig ättiksyra. När produkten igen kromatograferas på 501 005 51 Sephadex G-50 och sedan underkastas högtrycks-vätskekromatogra- fi, kan i huvudsak rent somatostatin erhållas.

II. HUMANT INSULIN De ovan beskrivna metoderna tillämpades även på produk- tion av humant insulin. Generna för insulinets B-kedja (104 baspar) och för insulinets A-kedja (77 baspar) uppbyggdes sä- ledes på basis av de humana polypeptidernas aminosyrasekvenß, varje gen med kohesiva ensträngsändar för EcoRI- och BamHI-re- striktionsendonukleaserna; och varje gen konstruerades så, att den kunde insättas separat i pBR322-plasmider. De syntetiska fragmenten, som utgjordes av deka- till pentadekaflUk1e°t1deP» syntetiserades enligt blockfosfotriestermetoden med användning av trinukleotider som byggstenar och renades slutligen medelst högeffektiv vätskekromatografi (high performance liquid chro- matography, förkortat HPLC). De syntetiska generna för A- och B-kedjorna i humant insulin klonades sedan separat in i plasmid pBR322. De klonade syntetiska generna sammansvetsades med en }3-galaktosidasgen av E. coli på ovan beskrivet sätt, varvid man erhöll effektiv transkription, översättning (translation) och ett stabilt prekursorprotein. Insulinpeptiderna avspjälka- des frånfå-galaktosidasprekursorn, detekterades medelst radio- immuntestning och renades. RIA-insulinaktivitet àstadkoms sedan genom sammanblandning av E. coli-produkterna. l. Konåtruktionsschema för och syntes av gener .för humant insulin.

De för humant insulin konstruerade generna visas i fig. 9.

Konstruktionsschemat för dessa gener, d.v.s. genen för B-kedjan och genen för A-kedjan i humant insulin, upprättades på grundval av aminosyrasekvenserna i dessa humana polypeptider. I 5'-ändar- na har varje gen kohesiva ensträngs-ändpartier för EcoRI- och BamHI-restriktionsendonukleaserna i och för korrekt inplacering av vardera genen i plasmid pBR322. Ett HindIII-endonukleasigen- känningsställe inkorponrades i mitten på B-kedjegenen för amino- syrasekvensen Glu-Ala för att möjliggöra amplifikation och veri- fiering av varje genhalva separat före konstruerandet av hela B- -kedjegenen. De för B-kedjegenen och A-kedjegenen upprättade 501 005 32 konstruktionsschemata var sådana att dessa gener kunde byggas upp med 29 olika oligodeoxiribonukleotider med ett antal merer per oligomer varierande från 10 till l5(sâEdes dekamerer till pentadekamerer). Varje pil anger det fragment, som syntetise- rats enligt den förbättrade fosfotriestermetoden, varvid H1- -H8 och Bl-B12 avser B-kedjegenen, medan A1-All avser A-ked- Jegenen. 2. Kemisk syntes av oligodeoxiribonukleotider.

De för syntes av oligodeoxiribonukleotider använda mate- rialen och metoderna var i huvudsak de, som beskrivits av Ita- kura, K. et al. (1975) J. Biol. Chem. g§_, 4592 och Itakura, K. et al. (1975) J. Amer. Chem. Soc. 21, 7327, med undantag för följande modifikationer: a) De fullständigt skyddade mononukleotiderna, d.v.s. '-0-dimetoxitrityl-3'-p-klorfenyl-f5-cyanoetylfosfaterna, syntetiserades från nukleosidderivaten med användning av det monofunktionella fosforyleringsmedlet p-klorfeny1-/3-cyano- etylfosforokloridat (1,5 molekvivalenter) 1 acetonitril 1 när- varo av 1-metylimidazol; se Van Boom, J.H. et al. (1975), Tetrahedron Zl, 2953. Produkterna isolerades 1 stor skala (100 - 300 g) genom preparativ vätskekromatografi (Prep 500 LC, Waters Associates). b) Med användning av lösningsmedelsextraktionsförfarandet [Ei-rose, T. et al. (1978) Tetrahedron Letters 24427 syntetise- rades dels 32 bifunktionella trfimerer (se tabell IV) 1 5 - 10 mmolskala och dels 15 trimerer, 3 tetramerer och 4 dimerer som '-ändblocken 1 1 mmolskala. De fullständigt skyddade trimerer- nas homogenitet kontrollerades medelst tunnskiktskromatografi på silikagel 1 två metanol/kloroformlösningsmedelssystem : Lösningsmedel a, 5% v/v, samt lösningsmedel b, 10% v/v, se ta- bell IV. Utgående från den sålunda erhållna "kollektionen" eller "biblioteket" av föreningar syntetiserade man 29 oligode- oxiribonukleotider med definierad sekvens, nämligen 18 för B- -kedjegenen och ll för A-kedjegenen. I tabell IV anger spalten längst till höger, 1 vilka bland de i fig. 9 angivna fragmenten de ifrågavarande trimererna l-32 ingick. 501 005 53 Tabell IV Syntes av som byggstenar avsedda trimerer Nr. Förening* U0byce**, nr Rennet***, I fragm. enl. % 8. b. % f1g_ 9 1. AAC 47 0,15 0,40 93 05,06 2. 400 49 0,25» 0,52 95 01,A1,A6 3. AAC 52 0,20, 0,55 93 05,06,A2,A0 4. ACT 43 ~ 0,27-~ 0,53 0 91 04,05,A6 . ACC 56 0,33 “ 0,60 96' 07 6- ACC 39 0,10 0,45. 90 05,07 7. AGC 45 0,10 0,26 ' 09 06,07,09 0. AGT 33 0,14 0,40 1 96 09,A2,A11 . 9. AGC 50 0.19 0,40- 92 00,01,A5,A10 . AGA 40 0,24 0,50 91 A9; 11. TTC 44 0,26 0,52 95 04,07,A3 12. TTC 49 0,11 0,31 94 03,05,A2,A3,A5 13.-~ TCT 50 0,24 0,49 96 A4 14. TCA 45 0,20 0,53 92* ' 01,H2,04,A1 . TCG . ' 39 0,12 0,34 91 42 16.4 TCC 32 0,10 0,20 07 03,A1,A10 17. Tec- 51 0,10 0,47 93 06,02,A4,A7,A0 . 004 46 0,12 0,37 94 07 19. TAC 61 0,22 - 0,50 90 04,A11_ . 344 55 0,17 0,44 95 05,410 21. CCT 53 1 0130 _ 0,55 97 03,04,010 22. CAC 47 0,25 0,51 92 A3' 23. C04, 50 0,25 0,51 93 02,06,00,A7 24. C11 41 0,20 0,54 92 02,09;A4 . C00 40 ~0,27 0,52 93 47 26. CCT 4 75 0,25 0.50 09 02,04,03,01 27. CGT 35 0,09 0126 90. 03 . CTT 46 0,10 0,45 93 02' 29. GTA 30 0,25 0,50 95 06,00,A6- . GAA 39 0,15 0,39 00 07,03,00,A5 31. 040 52 0,22, _ 0,49¿ _,09 010,49 32. CCA 742 “ '0,14 0,39 93 . A9 * Fullständigt skyddade trideoxinukleotider; 5'-O-dimetoxi- trityl-}'- p-klorfienyl-/3-cyanoetylfosfater.

** Detta var det totala utbytet räknat på basis av 5'-nyaroxy1- monomererna.

*** Värden baserade pà HPLC-analys. 501 005 54 De som byggstenar för polynukleotidernas uppbyggande använ-- da enheterna var två typer av trimerblock, nämligen dels de bi- funktionella trimerblock, som anges i tabell IV, dels motsvaran- de 3'-ändtrimerer, skyddade med en anisoylgrupp vid jf- hydroxyl- gruppen. Den bifunktionella trimeren hydrolyserades till motsva- rande }'- fosfodiesterkomponent medelst en blandning av pyridin- -trietylamin-vatten (}:l:l v/v) och även till motsvarande 5'- -hydroxylkomponent med 2%-ig bensensulfonsyra. Ovannämnda 3'- -ändblock behandlades med 2%-ig bensensulfonsyra, så att man er- höll motsvarande 5'-hydroxyl.Kopplingsreaktionen mellan ett över- skott av 3'-fosfodiestertrimeren (1,5 molekwà och 5'-hydroxy1- komponenten (1 molekvivalent) i närvaro av 2,4,6-triisopropyl- bensensulfonyltetrazolid(TPSTe, 3-4 ekv.) gick nästan till full- bordande inom 3 timmar; detta oberoende av hur 5'-hydroxylkompo- nenten hade erhållits. För att avlägsna överskottet av 3'-fosfodiester- blocket leddes raaktionsblandningen genom en kort silikagelkolonn, vilken anordnats på ett filter av sintrat glas. Man tvättade ut kolonnen först med CHCl3 för eluering av några biprodukter och kopplingsreagenset, samt sedan med CHCl3:MeOH (95:5 v/v), vilket resulterade i att nästan hela den fullständigt skyddade oligomeren eluerades. Under dessa betingelser kom det införda 3'- fosfodi- esterblockreagenset att stanna kvar i kolonnen. På liknande sätt upprepades sedan blocksammankopplingar tills man fått den önska- de längden. ' Högeffektiv vätskekromatografi (HPLC) användes i stor ut- sträckning under oligonukleotidsyntesen för a) analys av varje trimer- och tetramerblock, b) analys av de som mellanprodukter bildade fragmenten (hexamerer, nonamerer och dekamerer), c) ana- lys av den sista kopplingsreaktionen och d) rening av slutpro- dukterna, HPLC-kromatograferingen utfördes med användning av en vätskekromatograf av märket Spectra-Physics 35003. Efter av- lägsnande av allaskyddsgrupper medelst konc. NHÅOH vid 50°C (6 tim.) och 80%-ig AcOH vid rumstemperatur (15 min.) analyse- rades produkterna på en kolonn ( 1 m x 2 mm) av Permaphase AAX (DuPont), jfr. Van Boom, J. et al. (1977), J. Chromatography lâl, l69. Härvid användes en linjär gradient av lösningsmedel B (0,05 M KH2PO¿ - l,0M KCl, pH 4,5) i lösningsmedel A (0,0lM KHEPO4, pH 4,5).

Gradienten bildades i det att man startade med buffert A och till- 55 501 G05 förde 3% buffert B per minut. Elueringen genomfördes vid 60°C, med en genomströmningshastighet uppgående till 2 ml per minut. Även reningen av de slutliga 29 oligonukleotiderna utfördes på Permaphase AAX, under samma betingelser. Materialenm från den önskade toppen sammanslogs, avsaltades medelst dialys och lyofi- liserades. Efter det att 5'-ändarna märkts med ((-32P)-ATP med användning av Tu-polynukleotidkinas kontrollerades homogeniteten av varje oligonukleotid medelst elektrofores på en 20% polyakryl- amidgel. 3. Sammansättning_och kloning av B-kedjegenen och A-ked- Jegenen.

Genen för insulinets B-kedja konstruerades så, att den fick ett EcoRI-restriktionsställe vid vänstra änden, ett HindIII- -ställe i mitten odhetfißamfll-ställe vid högra änden. Detta gjor- des pà sådant sätt att båda halvorna, d.v.s. vänstra EcoRI- -HindIII-halvan (BH) och högra HindIII-BamHI-halvan (BB) kunde klonas separat in 1 den lämpliga kloningsbäraren pBB322 och efter verifiering av sina sekvenser sammanfogas i och för bild- ning av den kompletta B-genen (fig. 10). BB-halvan hopsattes ge- nom ligering, varvid man utgick från de 10 oligodeoxiribonnkleo- tider, som är betecknade Bl-B10 i fig. 9. De hade framställts genom kemisk fosfotriestersyntes. Bl och B10 fosforylerades ej, varigenom man undvek oönskad polymerisering av dessa fragment via deras kohesiva ändar (HindIII- och Bam HI-ändarna). Efter re- ning genom preparativ akrylamidgelelektrofores och eluering av det största DNA-bandet insattes BB-fragmentet i plasmiden pBR322, som spjälkats medelst HindIII och BamHI. Ca 50% av de från denna DNA härleddda ampicillinresistenta kolonierna var känsliga för tetracyklin; detta ^visade att ett icke-plasmidiskt HindIII- -BamHI-fragment hade insatts. De små HindIII-Bamfií-fragmenten från fyra av dessa kolonier (pBBl0l - pBBl0#) analyserades med avseende på sin sekvens och befanns vara korrekta, d.v.s. hade den avsedda konstruktionen.

BH-fragmentet bereddes på liknande sätt och insattes i pBR322, som hade spjälkats med EcoRI- och HindIII-restriktions- endonukleaserna. Plasmider från 3 ampicillinresistenta, tetra- cyklinkänsliga transformanter (pBHl - pBH3) analyserades. De små 501 nos 56 EcoRI-HindIII-fragmenten befanns ha den väntade nukleotidsekven- sen.

A-kedjegenen hopsattes i 5 delar. De fyra vänstra, fyra mellersta och fyra högra oligonukleotiderna (fig. 9) ligerades separat, varefter de blandades och ligerades (oligonukleotider- na Al och Ai¿_ var ofosforylerade). Den hopsatta A-kedjegenen fosforylerades, renades medelst gelektrofores och klonades in i pBR322 vid EcoRI-BamHI-ställena. EcoRI-BamHI-fragmenten från två ampicillinresistenta, tetracyklinkänsliga kloner (pAlO, pAll) innehöll den önskade A-gensekvensen. 4. Konstruktion av plasmider, i vilka A- och B-insulin- -generna skall komma till uttryck.

Konstruktionen av plasmiden lac-insulin B, betecknad pIBl, visas i fig. 10. Plasmiderna pBHl och pBBlOl omsattes med EcoRI- och HindIII-endonukleaser. Det lilla BH-fragmentet av pBHl och det stora fragmentet av pBBlOl (innehållande BB-fragmentet och största delen av pBR522) renades medelst gelelektrofores, blan- dades och ligerades i närvaro av Äplac 5, som spjälkats med EcoRI.

Ett fragment (Eco-RI-fragment) av Aplac 5 innehåller lac-kontroll- regionen och största delen av strukturgenen för{5-galaktosidas.

Restriktionsställenas konfiguration säkerställer, att BH bindes vid BB på korrekt sätt. Lac-EcoRI-fragmentet kan vid insättningen lägga sig i antingen den ena eller den andra av två möjliga orien- teringar. Man väntar sig därför att det är endast hälften av de efter transformationen erhållna klonerna, som har den önskade ori- enteringen. Medelst restriktionsanalys kontrollerade man orienterin- gen av 10 ampicillinresistenta, 5-galaktosidaskonstitutiva kloner.

Av dessa lO kolonier var det 5 stycken, som innehöll hela B-gensek- vensen och den korrekta läsramen från ß-galaktosidasgenen in i B- -kedjegenen. En av dessa, pIBl, valdes för efterföljande experiment.

I ett liknande försök infördes det lac-fragment fran,äplac5, vars molekylvikt var 4,4 megadalton, i pAll-plasmiden vid EcoRI- -stället till bildning av pIAl. Denna pIAl är identisk med pIBl med undantag av att B-genfragmentet är ersatt med A-genfragmentet.

DNA-sekvensanalys visade, att i PIAl resp. PIBl de korrekta A- resp. B-kedjegensekvenserna hade bibehållits. 37 501 005 . Proteinbildning (expression).

Båda de stammar, som innehåller insulingenerna korrekt bund- na vid ß-galaktosidasgenen, producerar stora mängder av ett pro- tein med samma storlek som ß-galaktosidas. Ungefär 20% av det to- tala cellulära proteinet utgjordes av denna hybrid av å ena sidan /5-galaktosidas och å andra sidan A- resp. B-kedjan av insulin.

Hybridproteinerna är olösliga; de återfanns vid centrifugering i den första, vid låg hastighet erhållna pelleten, där de utggorde ca 50% av proteinet.

För att detektera 1 vad mån geninformationen kom till uttryck i form av insulinets A- och B-kedjor använde man ett radioimmun- test (radioimmunoassay, förkortat RIA) baserat på rekonsitution av komplett insulin medelst de bägge separata kedjorna. Mycket lämp- ligt för detta test är det insulinrekonstitutionsförfarande,som an- givits av Katsoyannis et al. (1967) Biochemistry §, 2642-2655, tillämpat så att det passar för en 27/ul testvolym.Lättdetekter- bar insulinaktivitet erhålles efter sammanblandning och rekonstitu- ering av S-sulfonerade derivat av insulinkeudiorna. De separata S- Å -sulfonerade kedjorna av insulinet reagerar efter reduktion och oxidation icke i någon nämnvärd utsträckning med den använda anti- -insulin-antikroppen.

För utförandèav rekonstitutionstestet underkastades det av ß-galaktosidas och A- eller B-kedja bestående hybridproteinet partiell rening, varefter man spjälkade med cyanogenbromid och bil- dade S-sulfonerade derivat.

De belägg, som visar att man lyckats förmå de kemiskt synteti- serade generna för humant insulin att komma till uttryck på ett korrekt sätt, kan sammanfattas enligt följande: a) Radioimmunakti- vitet. har fastställts för båda kedjorna, b) De efter kloning och plasmidkonstruktion erhållna DNR-sekvenserna har direkt verifierats_> och då befunnits vara korrekta, d.v.s. sådana som planerats. Efter- som radioimmunaktivitet erhålles, måste översättningen (translatio- nen) vara "i fas". Följaktrligen måste på grund av den genetiska ko- dens diktat peptider produceras med de för humant insulin karakteri- stiska sekvenserna. c) De med ifrågavarande E. coli erhållna produk- terna uppvisar efter spjälkning med cyanogenbromid insulinkedjebe- teende i tre olika kromatografisystem, där separeringen sker en- enligt olika principer (gelfiltrering, jonbyte och HPLC i omkastad fas). d) Den av E. coli producerade A-kedjan har renats i liten skala medelst HPLC och har den korrekta aminosyrasammansättningen.

Claims (12)

38 P a t e.n t k r a v

1. Rekombinantplasmid, lämpad för transformation av en bakte- rievärd och innefattande ett homologt regulon och en heterolog DNA-insats, vilken kodar för en önskad funktionell däggdjurs- polypeptid eller mellanprodukt därför som icke nedbrytes av endogena proteolytiska enzymer och som icke föregås och/eller efterföljes av ytterligare protein, varvid DNA-insatsen föregås av ett startkodon och omedelbart efterföljes av ett eller flera stoppkodoner och är belägen i rätt läsram i förhållande till det homologa regulonet mellan detta och stoppkodonet (eller stoppkodonerna), varigenom den resulterande expressionsproduk- ten vid translation av transkriptionsprodukten av den hetero- loga DNA-insatsen i en lämplig bakterie utgöres av nämnda funk- tionella däggdjurspolypeptid eller mellanprodukt därför i ut- vinningsbar form.

2. Rekombinantplasmid enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d a v att regulonet är i huvudsak identiskt med ett regulon som normalt finns närvarande i bakterievärdens kromosom-DNA.

3. Rekombinantplasmid enligt krav 1 eller 2, k ä n n e - t e c k n a d a v att den heterologa DNA-insatsen innefattar cDNA.

4. Rekombinantplasmid enligt krav 1 eller 2, k ä n n e - t e c k n a d a V att den heterologa DNA-insatsen innefattar DNA framställd genom organisk syntes.

5. Rekombinantplasmid enligt något av kraven 1-4, k ä n n e - t e c k n a d a v att den utgöres av en bakteriell plasmid.

6. Rekombinantplasmid enligt något av kraven 1-5, k ä n n e - t e c k n a d a v att regulonet omfattar lac promotor-opera- torsystemet i Escherichia coli eller tryptofan-promotor-opera- torsystemet i Escherichia coli.

7. Rekombinantplasmid enligt något av kraven 1-6, k ä n n e - t e c k n a d a v att den heterologa DNA-insatsen kodar för en funktionell däggdjurspolypeptid såsom sådan och omedelbart föregås av ett translationsstartkodon.

8. Rekombinantplasmid enligt något av kraven 1-6, k ä n n e - t e c k n a d a v däggdjurspolypeptiden är ett däggdjurshor- mon eller en mellanprodukt därför. 39 ; 501 ons

9. Förfarande för framställning av en rekombinantplasmid enligt något av kraven 1-8, k ä n n e t e c k n a t a v att ett stycke dubbelsträngad DNA innefattande i följd (a) ett regulon för kontroll av transkription och translation i en bakterievärd och (b) ett restriktionsendonukleas-igenkännings- ställe, behandlas med ett lämpligt restriktionsendonukleas till bildning av ett DNA-fragment innefattande regulonet, och att detta fragment ligeras till en heterolog DNA-insats, vil- ken kodar för en önskad funktionell däggdjurspolypeptid eller mellanprodukt därför som icke nedbrytes av endogena proteoly- tiska enzymer och som icke föregås och/eller efterföljes av ytterligare protein, varvid DNA-insatsen föregås av ett start- kodon och omedelbart efterföljes av ett eller flera stoppkodo- ner och har en ändstående nukleotidgrupp som kan ligeras till DNA-fragmentet, så att DNA-insatsen i den resulterande rekombi- nantplasmiden kommer i rätt läsram i förhållande till regulonet.

10. Bakterie, k ä n n e t e c k n a d a v att den är trans- formerad med en rekombinantplasmid enligt något av kraven 1-8.

11. Bakteriekultur, k ä n n e t e c k n a d a v att den omfattar en transformerad bakterie enligt krav 10.

12. Förfarande för bakteriell framställning av en funktionell däggdjurspolypeptid eller en mellanprodukt för denna, k ä n - n e t e c k n a t a v att en bakteriekultur enligt krav 11 odlas för åstadkommande av expression av rekombinantplasmiden under bildning av polypeptiden eller mellanprodukten därför i utvinningsbar form, och att polypeptiden elelr mellanprodukten utvinnes.