FI80719C - Foerfarande foer framstaellning av maenniskointerferonpolypeptider. - Google Patents

Description

Menetelmä ihmisen interferonipolypeptidien valmistamiseksi - Förfarande för framställning av människointerferonpolypepti- der 8071 9 Tämä keksintö koskee menetelmää ihmisen interferonipoly-peptidien valmistamiseksi. Menetelmässä käytetään DNA-sek-venssejä, jotka ovat johdettavissa ihmisen lymfoblastoidi-soluista, ja jotka koodittavat interferoninkaltaisia poly-peptidejä, sekä yhdistelmä-DNA-molekyylejä (vektoreita), jotka sisältävät vastaavia DNA-sekvenssejä liitännäisinä, sekä mainituilla yhdistelmä-DNA-molekyyleillä transformoituneita isäntäsoluja. Keksintö tarjoaa menetelmiä, joilla voidaan valmistaa mainittuja DNA-sekvenssejä, mainittuja yhdistelmä-DNA-molekyylejä ja mainittuja isäntäsoluja, ja joissa käytetään yhdistelmä-DNA-tekniikkaa. Tämän keksinnön mukaisesti valmistettavat polypeptidit ovat hyödyllisiä immunomodulaattoreita ja soveltuvat varsinkin virus-, kasvain- ja syöpälääkkeiksi.

Rakenteeltaan interferonit ("IFN") ovat useimmiten glyko-syloituneita polypeptidejä, joiden molekyylipaino on alueella 10 000 - 40 000. Selkärankaisten solut tuottavat niitä jouduttuaan IFN-indusoijan vaikutuksen kohteeksi, joita ovat esim. virukset, kaksisäikeinen RNA, solunsisäi-set mikrobit, mikrobituotteet tai erilaiset kemialliset aineet (1). Interferoneja ei yleensä tavata normaaleissa terveissä soluissa. Ne avustavat selkärankaisten ter- 2 80719 veitä soluja niiden puolustautuessa virusinfektioita ja muita hyökkäyksiä vastaan. Interferoneilla on havaittu olevan immunomodulaattorivaikutusta.

Interferonipolypeptidien nimistö ei vielä ole täysin 5 vakiintunut. Äskettäin ilmestyneiden suositusten (2) mukaan luokittelu perustuu eläinalkuperään (esim.

"Hu" tarkoittaa ihmisestä peräisin olevaa), antigeeniseen spesifisyyteen (tyypit α, β,γ jne., jotka perustuvat niiden antigeeni-vasta-ainereaktioihin α-, β- tai γ-IFN-10 vasta-aineiden kanssa, vastaavasti), rakenteellisiin ja fysiologisiin eroihin (alatyypit ilmoitetaan arabialaisin numeroin, esim. , «2 jne.) ja solutyyppialkuperään (Le johdettu leukosyyteistä,Ly johdettu lymfoblastoidiso-luista, F johdettu fibroblasteista jne.). Niinpä esim.

15 HuIFN-α^ (Ly) tai HuLyIFN-α^ tarkoittaa alatyyppiä 1 olevaa α-tyypin interferonia, joka on peräisin ihmisen lymfo-blastoidisoluista. Näiden nimitysten lisäksi saattaa olla tarpeen spesifioida, onko interferoni saatu suoraan kanta-solusta vai syntetisoimalla mikro-organismissa, ja lisäksi, 20 onko interferoni tiettyä alatyyppiä tai kahden tai useamman alatyypin seosta.

Interferonipolypeptidejä koodittavien DNA-sekvenssien, yhdistelmä-DNA-molekyylien ja niitä sisältävien isäntäsolu-jen nimitykset eivät myöskään ole vielä täysin vakiintu-25 neita. DNA-sekvensseille käytetty nimitystäpä heijastaa niiden koodittamaa interferonia lyhennetyssä muodossa.

Esim. Escherichia coli HB 101 (Z-pBR 322 (Pst)/HcIF-2h) tarkoittaa bakteerikantaa (E. coli HB 101), joka sisältää yhdistelmäplasmidi-DNA:n Z-pBR 322 (Pst)/HcIF-2h, so.

30 plasmidi pBR 322, jonka Pst I-kohdassa on (vieraan DNA:n liitäntäkohta) HcIF- -liitännäinen, joka on peräisin Zurichistä (Z). Kirjain "H" tarkoittaa ihmisalkuperää, "c" tarkoittaa komplementääristä DNA:ta ja tarkoittaa alatyyppiä (vrL. C. Weissmann (3)). Tässä nimitystapaesi-35 merkissä ei interferonigeenien lähdettä (leukosyytit) ole ilmoitettu. Nyt käsillä olevassa patenttihakemuksessa 3 80719 sovelletaan tämänkaltaista nimitysjärjestelmää, mutta interferonigeenien lähde (lymfoblastoidisolut) ilmoitetaan myös.

Tähän mennessä on identifioitu kolme HuIFN-luokkaa: 5 HuIFN-a, HuIFN-8 ja HuIFN-γ. HuIFN-α -muotoa (aikaisemmin käytetty nimitystä LelFN, leukosyytti-interferoni, tai LylFN, lymfoblastoidi-interferoni) valmistavat ihmisen leukosyytit (luovuttajien verestä saadut tuoreet solut) ja lymfoblastoidisolut, kun indusoidaan esim. viruksella 10 (E.A. Havell et ai (4) ja A.D. Sagar et ai. (5)). Se on pysyvä pH-arvossa 2 (happostabiileista interferoneista käytettiin ennen nimitystä "tyyppi I") ja koostuu yksittäisten interferonipolypeptidien seoksesta, jotka eroavat toisistaan pääasiassa glykosyloitumisasteensa (esim.

15 m. Rubinstein et ai. (6)) ja aminohappokoostumuksensa (vrt. jäljempänä) suhteen. Tähän mennessä eristetyistä ja puhdistetuista kahdesta komponentista toinen, jonka mole-kyylipaino on 15 000 - 18 000, ei ole glykosyloitunut, kun taas toinen, jonka molekyylipaino on 21 000 - 22 000, 20 on glykosyloitunut. W.E. Stewart, II et ai.(7) ovat ilmoittaneet, että glykosyloitumaton interferoni on säilyttänyt suurimman osan HuIFN-a-aktiivisuudestaan tai koko aktiivisuuden. Lymfoblastoidisoluista saadun HuIFN-a- muodon aminohapposekvenssin osia on myös ilmoitettu (K.C.

25 Zoon et ai. (8)). Ennestään tunnetaan erilaisia HuIFN-α -muotoja, jotka eroavat toisistaan rakenteellisesti ja fysiologisesti. Eri ihmiset saattavat tuottaa alleeli-sia HuIFN-a-muunnoksia.

HuIFN-8-muotoa (ennen FIFN tai FilFN, "tyyppi I") 30 tuottavat ihmisen fibroblastit (esim. vastasyntyneen esinahan solut), kun indusoidaan kaksisäikeisellä RNArlla, ja pienemmässä määrin, yhdessä HuIFN-a-muodon kanssa, ihmisen lymfoblastoidisolut, kun indusoidaan viruksella. HuIFN-8 on myös pysyvä pH-arvossa 2 (tästä syystä se kuu-35 luu "tyyppiin I"). Tähän mennessä on kuvattu vähintään 4 80719 kahta HuIFN-B-tyyppiä (33, 48). Molekyylipainot ovat noin 20 000 ja 22 000. Aminohappojärjestys tunnetaan osittain.

HuIFN-y-muotoa (ennen IIFN (immuuni-interferoni tai 5 "tyypin II" interferoni) tuottavat T-lymfosyytit antigeenien tai mitogeenien vaikutuksesta. Se on happolabiili pH-arvossa 2 ja eroaa serologisesti HuIFN-α- ja HuIFN-6-muodosta.

HuIFN-muodot ovat hyödyllisiä virus-, kasvain- ja 10 syöpälääkkeinä. Viruslääkkeinä niitä voidaan käyttää esim. hoidettaessa virusperäisiä heingitystieinfektioita, herpes simplex-sarveiskalvontulehdusta, akuuttia vertavuotavaa sidekalvontulehdusta, varicella zoster- sairautta, maksatulehdus B:tä, sytomegalista sulkeumasairautta tms.

15 Kasvain- ja syöpälääkkeinä voidaan HuIFN-muotoja käyttää hoidettaessa esim. luusarkoomaa, akuuttia myeloidileukemiaa, multippelimyelomaa, Hodkins-sairautta, melanomaa,rintasyöpää, lymfosarkoomaa ja syyliä tms.

HuIFN-muotoja voidaan käyttää oraalisina tai parente-20 raalisina farmaseuttisina valmisteina, kuten paikallisesti, intravenoosisesti, intramuskulaarisesti, intra-nasaalisesti, intradermaalisesti tai subkutaanisesti annettavina farmaseuttisina valmisteina, esim. tabletteina, pieninä lääkepulloina, siirappeina, liuoksina 25 tai suspensioina suun kautta tapahtuvaa antoa varten, tai jauheina, injektio- tai infuusioliuoksina tai -suspensioina, silmätippoina, voiteina, suihkeina tms.

Valmisteet annetaan tavallisesti esim. intramuskulaarisesti yhdestä kolmeen kertaan vuorokaudessa noin 30 10-10 yksikön suuruisina annoksina hoidon riippuessa sairauden laadusta, antotavasta ja potilaan tilasta. Virusinfektioita lääkitään tavallisesti päivittäin korkeintaan kolmesti vuorokaudessa useiden vuorokausien tai useiden viikkojen ajan, kun taas kasvaimia ja syöpälaje-35 ja lääkitään useiden kuukausien tai vuosien ajan joko 5 80719 kerran tai useammin vuorokaudessa tai kahdesti tai useammin viikossa.

Tähän mennessä HuIFN-α-muotoa on valmistettu vain riittämättömiä määriä indusoitujen ihmisen solujen kaut-5 ta, esim. käyttämällä ihmisen lymfoblastoidisoluja (esim. Burkitt-lymfoman "Namalwa"-soluja) tai ihmisen leukosyyttejä, jotka on saatu luovuttajien tuoreesta verestä.

HuIFN-β-muotoa saadaan pääasiassa ihmisen fibroblasteista. On ilmoitettu, että 800 litrasta viljeltyjä Namalwa- 9 10 soluja saadaan vain 2,6 x 10 IU epäpuhdasta HuIFN-a- muotoa, ja että hyvin suurissa verikeskuksissa, kuten

Punaisen Ristin veripalvelussa Helsingissä, saadaan νησί 1 sittain vain noin 10 IU epäpuhdasta HuIFN-a-muotoa.

HuIFN-a:n ominaisaktiivisuus on suuruusluokkaa noin 8 9 15 4x10 -10 IU/mg. Laajoihin ja kaupallisiin käyttö tarkoituksiin vaadittava HuIFN-a-määrä olisi hyvin pieni muihin farmaseuttisiin yhdisteisiin verrattuna.

100 g puhdasta HuIFN-a-muotoa riittäisi 10-30 miljoonaan annokseen. Tällaisia määriä ei kuitenkaan voida 20 valmistaa teollisesti järkevin kustannuksin käyttämällä apuna ihmisen kudosviljelmiä ja ihmisen leukosyyttitekno-logiaa.

Näihin suurimittakaavaisiin tuotantomenetelmiin liittyy lisäksi se haittapuoli, että niillä saadaan vain in-25 terferoniseoksia ja on hyvin työlästä ja kallista erottaa ne yksittäisiin alatyyppeihin. Näin ollen puhtaiden yksittäisten interferonilajien terapeuttiset käyttötarkoitukset on ollut mahdollista tähän mennessä määrittää vain epätyydyttävästi.

30 Näiden menetelmien teollinen käyttö rajoittuu lisäksi sellaisiin HuIFN-muotoihin, joita voidaan tuottaa viljeltävissä olevilla ihmissoluilla (kuten ihmisen kasvain-solut ja eräät fibroblastisolut) tai sellaisilla ihmissoluilla, joita on saatavissa suhteellisen suuria mää-35 riä (kuten leukosyytit ja lymfosyytit). Kaikki nämä menetelmät ovat kuitenkin kalliita ja monimutkaisia.

6 80719

Sittemmin on havaittu, että suuria määriä yksittäisiä interferonilajeja voitaisiin syntetisoida teollisesti käyttämällä apuna molekyylibiologian kehityksen mukanaan-tuomia mahdollisuuksia, sillä tätä kautta tuli mahdolli-5 seksi saada tietty ei-bakteriaalinen eukaryoottinen geeni ilmentymään bakteerisoluissa. Äskettäin S.N. Cohen ja H.W. Boyer (9) ovat kuvanneet yleistä menetelmää, jolla biologisesti funktionaaliset DNA-sekvenssit saadaan toi-siintumaan. Tämä menetelmä käsittää vaiheet, joissa 10 rengasmainen plasmidi-DNA katkaistaan niin, että saadaan aikaan ensimmäinen lineaarinen DNA-jakso, tähän ensimmäiseen segmenttiin liitetään toinen lineaarinen DNA-jakso, joka sisältää fenotyyppisen piirteen geenin, ja saadaan yhdistelmä-DNA-molekyyli (modifioitu rengasmainen plasmidi), yksisoluinen mikro-organismi transformoidaan tällä yh-distelmä-DNA-molekyylillä; transformantteja kasvatetaan yhdessä transformoitumattcmien mikro-organismien kanssa sopivissa ravinneolosuhteissa ja transformantit eristetään yksisoluisista kantaorganismeista. Transformantit saatta-20 vat sitten tuottaa haluttua proteiinia.

Cohen ja Boyer eivät ratkaisseet sitä ongelmaa, joka liittyy interferonia koodittavan lineaarisen DNA-sekvens-sin tuottamiseen ja yhdistelmä-DNA:n tuottamiseen siitä.

Eri patenttihakemuksissa ja muissa julkaisuissa 25 on kuvattu ihmisen leukosyyteistä ja fibroblasteista johdettuja DNA-sekvenssejä, jotka koodittavat polypeptidejä, joilla on HuIFN-a:n tai HuIFN-$:n kaltainen aktiivisuus, sekä mainittuja DNA-sekvenssejä sisältäviä yhdistelmä-DNA-molekyylejä, mainituilla yhdistelmä-DNA-molekyyleiliä 30 transformoituneita isäntäsolu ja, polypeptide jä tai viljely-liuoksia, jotka sisältävät mainittuja polypeptidejä, ja näiden aineseosten valmistusmenetelmiä.

C. Weissmann ((3), vrt. myös S. Nagata et ai. (10), N. Mantei et ai. (11) ja M. Streuli et ai. (12)) ovat 35 kuvanneet useita aktiivisuudeltaan HuIFN-a:a kaltaisia polypeptidejä, DNA-sekvenssejä, yhdistelmä-DNA-molekyylejä ^ 80719 ja niiden valmistuksessa käytettyjä isäntäsoluja, kun on käytetty lähtämateriaalina Sendai-viruksella indusoituja ihmisen leukosyyttejä.

D.V. Goeddel et ai. (13, 14) ovat kuvanneet osittain 5 puhdistettua HuIFN-α:n kaltaista polypeptidiä, jonka molekyylipaino on 21 000, vastaavia DNA-sekvenssejä sekä kahdeksaa erilaista ihmisen LelFNsn cDNArta, jotka on myös johdettu leukosyyteistä ja varsinkin ihmisen myeloblastoidi-solulinjasta KG-1, joka on indusoitu Sendai-viruksella.

10 Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa no. 34 307 (15) selostetaan yleisesti, mainitsematta kuitenkaan mitään konkreettisia tietoja tai yksityiskohtia, menetelmää sellaisen polypeptidin valmistamiseksi, jolla on HuIFN-ct:n kaltainen aktiivisuus, lähtemällä ihmisen Namalwa-lymfoblas-15 toidisoluista tai ihmisen veren leukosyyteistä, jotka kumpikin on indusoitu Newcastle-sairausviruksilla.

Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 28 033 ((16); vrt. myös Taniguchi et ai. (17), Derynck et ai. (18) ja Goeddel et ai. (19)).on selostettu DNA-sekvenssejä, 20 yhdistelmä-DNA-molekyylejä, jotka koodittavat HuIFN-a- muotoa, ja näitä sisältäviä mikro-organismeja lähtemällä ihmisen fibroblasteista ja varsinkin vastasyntyneiden esinahasta saaduista fibroblasteista indusoimalla ne poly(I):poly(C):llä.

25 Yhdistyneessä kuningaskunnassa jätetyssä patentti hakemuksessa no. 2.063.882 (20) on geenitekniikalla saatu aikaan mRNA-molekyylejä, DNA-sekvenssejä, yhdistelmä-DNA-molekyylejä ja bakteerikantoja, jotka kykenevät tuottamaan HuIFN-8 .-muotoa ja HuIFN-82-nmotoa, 30 lähtemällä ihmisen fibroblasteista ja varsinkin esinahka-soluista FS11 tai SV80, jotka on indusoitu kaksisäikei-sellä poly(I):poly(C);llä.

BE-patentissa no. 887 397 (21) selostetaan myös DNA-sekvenssejä, yhdistelmä-DNA-molekyy-35 lejä, näitä sisältäviä E. coli-kantoja ja polypeptidejä, joilla on HuIFN-8-aktiivisuutta, ja jotka on valmistettu 8 80719 mRNA:n välityksellä, joka on saatu ihmisen fibroblasteista, varsinkin ihmisen esinahkasoluista FS-4, jotka on indusoitu poly(I):poly(C):llä, sekä näiden valmistusmenetelmiä .

5 Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa no. 34 306 (22) selostetaan yleisesti, antamatta mitään yksityiskohtaisia tietoja, sellaisen polypeptidin valmistusta, jolla on HuIFN-8:n kaltainen aktiivisuus, lähtemällä ihmisen fibroblasteista (vastasyntyneen esinahka), jotka on indusoitu 10 poly(I):poly(C):llä.

Ihmisen lymfoblastoidi-interferonia "HuIFN(Ly)" voidaan valmistaa eri määriä Namalwa-soluilla, kun niitä stimuloidaan erilaisilla indusoreilla (M.D. Johnston et ai.

(24) ). On osoitettu, että HuIFN(Ly), joka on tuotettu 15 Namalwa-soluilla, jotka on indusoitu Sendai-viruksella, sisältää HuIFN-α(Ly)-muotoa (70-90%) ja HuIFN-3(Ly)-muotoa (10-30%). Se muodostuu vähintään seitsemästä komponentista. (K.C. Zoon et ai. (8) ja G. Allen et ai.

(25) , vrt. myös E.A. Havell et ai. (4) ja A.D. Sagar 20 et ai. (5)). Vaikka lymfoblastoidi-interferonin poly- peptidien kokonaisrakennetta ei vielä tunnetakaan täysin, on kuitenkin ilmeistä, että HuIFN-ct(Ly) ja HuIFNct-(Le) ovat rakenteeltaan erilaisia. Lymfoblastoidi-interferonin pääkomponenteissa näyttää esiintyvän vain vähän, jos lain-25 kaan, glykosyloituneisuutta. Eri komponentteja ei ole vielä erotettu eikä puhdistettu.

Koska lymfoblastoidi-HuIFN-muotojen seoksilla tehdään kliinisiä kokeita, on toivottavaa, että eri komponentit saataisiin erotetuiksi toisistaan ja niitä voitaisiin tuottaa 30 yksinään, jotta niiden terapeuttiset ominaisuudet voitaisiin määrittää. Mikään ennestään kuvattu yhdistelmä-DNA-menetelmä ei kohdistu ihmisen lymfoblastoidi-interfe-ronien syntetisointiin. Tämä keksintö koskee tämän ongelman ratkaisua yhdistelmä-DNA-tekniikan menetelmillä. Li-35 säksi keksintö koskee erilaisten HuIFN-alatyyppien rakenteen (aminohapposekvenssien) selvittämistä ja sellaisten 9 80719 menetelmien tarjoamista, joilla voidaan valmistaa yksittäisiä interferoneja riittävän suuria määriä, jotta suurten potilasmäärien hoito olisi mahdollista.

Tämä keksintö ratkaisee ongelman, joka koskee sel-5 laisten yksittäisten polypeptiden tuottamista, myös suurina määrinä, joilla on samanlainen biologinen aktiivisuus kuin lymfoblastoidi-HuIFN-muodoilla. Yksittäiset poly-peptidit ovat joko samanlaisia tai erilaisia kuin tähän mennessä tunnetut HuIFN-α(Le)- ja HuIFN-3-komponentit.

10 Keksinnön mukaisesti valmistettavia polypeptidejä, joilla on HuLyIFN-α:n tai HuLyIFIT-β:n biologinen tai immunologinen aktiivisuus, voidaan käyttää farmaseuttisissa valmisteissa.

Selostuksessa käytetyt termit ja lyhenteet 15 Klooni: Solupopulaatio, joka on johdettu suvuttomasti yhdestä solusta. Tällaisen populaation katsotaan olevan geneettisesti identtinen.

Operoni; Geneettinen yksikkö, joka muodostuu vierekkäisistä geeneistä, jotka ilmentyvät rinnakkaisesti ope-20 raattorin ja repressorin säädön alaisina.

Ilmentymisenohjaussekvenssi; Nukleotidisekvenssi, joka ohjaa ja säätelee rakennegeenien ilmentymistä ollessaan tpiminnallisesti kytkettynä näihin geeneihin. Se sisältää mm. promoterin ja ribosomaalisen sidoskohdan.

25 Promoter! (= promoottori): DNA-jakso, johon RNA-polymeraasi sitoutuu ja saattaa alulle transkription.

Ribosomaalinen sidoskohta: Sekvenssit, jotka sallivat mRNA:n sitoutumisen ribosomeille mikä on välttämätön edellytys translaation eli luennan tapahtumiselle.

30 Ilmentyminen: Tapahtuma, joka koostuu transkriptiosta ja translaatiosta.

Transkriptio: Emäsparienmuodostusta koskeva prosessi, jossa DNA:n sisältämää geneettistä informaatiota käytetään RNA-rihman komplementaarisen emässekvenssin jär-35 jestämiseen.

10 80719

Translaatio: Prosessi, jossa mRNA-molekyylin sisältämä geneettinen informaatio ohjaa spesifisten aminohappojen järjestäytymistä proteiinisynteesissä.

Nukleotidi: Nukleiinihappojen rakenneyksikkö, joka koostuu 5 puriini- tai pyrimidiiniemäksestä, riboosi- tai 2-deoksiri-boositähteestä ja fosforihappotähteestä. Ribonukleoti-diemäkset ovat A, G, C ja U, kun taas deoksiribonukleoti-deissa U on korvattu T:llä.

Vektori (tai kloonausväline): DNA-sekvenssi, esim. plas- 10 midi- tai faagi-DNA, joka kykenee toisiintumaan autonomisesti isäntäsolussa ja sisältää merkin, jota voidaan käyttää apuna transformoituneiden solujen identifioinnissa, kuten tetrasykliinin vastustuskyvyn tai ampisilliinin vastustuskyvyn, ja johon toinen DNA-jakso voidaan liit- 15 tää keinotekoisesti niin, että saadaan tapahtumaan liitetyn jakson toisiintuminen.

Plasmidi: Ekstrakromosomaalinen, rengasmainen, kaksisäi- keinen DNA, joka kykenee toisiintumaan isäntäsolussa. Yhdistelmä-DNA: DNA-molekyyli, joka koostuu DNA-jaksoista, 20 jotka ovat peräisin eri geeneistä ja liitetty yhteen elävien solujen ulkopuolella, ja joka kykenee infektoimaan isäntäsoluun ja säilymään sen sisällä.

Nukleaasit: Entsyymejä, jotka katkovat nukleiinihappo- ketjujen fosfodiesterisidoksia.

25 Ribonukleaasit (RNAaasit): Entsyymejä, jotka katkovat RNA:n fosfodiesterisidoksia.

Deoksiribonukleaasit (DNAaasit): Entsyymejä, jotka katkovat DNA:n fosfodiesterisidoksia.

Restriktioendonukleaasit: Entsyymejä, jotka leikkaavat 30 polynukleotidit spesifisistä polymeeriketjun sisällä olevista sekvenssikohdista. Katkaisussa syntyy DNA-jaksoja, joilla on tylpät päät (blunt, flushed) tai lomittaiset (staggered, sticky) päät.

Ekronnkleaasit: Entsyymejä, jotka lohkovat DNA-rihmoja 35 loppupäistä käsin.

Lysotsyymit: Entsyymejä, jotka hajottavat eräiden bak- 11 80719 teerien solunseinissä esiintyviä polysakkarideja. Käänteiskopioijaentsyymi: RNA-kasvainvirusten koodit- tama entsyymi, joka kykenee valmistamaan komplementaarisia yksisäikeisiä DNA-rihmoja KNA-templaateista ja sen jälkeen inuun-5 tamaan nämä DNA-säikeet kaksoishelikaaliseen muotoon.

DNA-nolymeraasit: Entsyymejä, jotka katalysoivat DNA:n 3'-5'-fosfodiesterisidosten muodostumista.

DNA-ligaasi: Entsyymi, joka katalysoi endonukleaasin kat kaisemaa tyyppiä olevan katkenneen yksisäikeisen DNA:n 10 fosfodiesterisidoksen korjaamista.

Polynukleotidikinaasi: Entsyymi, joka katalysoi DNA:n 5'- hydroksyyliryhmien fosforyloitumista.

Transformaatio: Eksogeenisen DNA:n, esim. plasmidi- tai hybridi-DNA:n siirtäminen soluun niin, että mainittu 15 DNA sen jälkeen pysyy vakituisesti solun sisällä.

Lyhenteet: A adenosiini tai deoksiadenosiinimonofosfaattitähde U uridiinimonofosfaattitähde T deoksitymidiinimonofosfaattitähde 20 c sytidiini tai deoksisytidiinimonofosfaattitähde G guanosiini tai deoksiguanosiinimonofosfaatti- tähde I inosiinimonofosfaattitähde dATP deoksiadenosiinitrifosfaatti 25 dTTP deoksitymidiinitrifosfaatti dCTP deoksisytidiinitrifosfaatti dGTP deoksiguanosiinitrifosfaatti dCMP deoksisytidiinimonofosfaati dGMP deoksiguanosiinimonofosfaatti 30 rna ribonukleiinihappo mRNA lähettiribonukleiinihappo tRNA siirtäjäribonukleiinihappo rRNA ribosomaalinen ribonukleiinihappo ds RNA kaksisäikeinen ribonukleiinihappo 35 DNA deoksiribonukleiinihappo 12 8071 9

ApPr β-laktamaasigeenin ilmentymisen ohjaussekvenssit IFN interferoni

HuLy ihmisen lymfoblastoidisoluista peräisin oleva Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään DNA:ta, erityisesti yhdistelmä-DNA:ta, joka sisältää ihmisen lymfoblastoidisoluista johdettavissa olevan DNA-sek-venssin tai mainitun sekvenssin osan, variantin tai mutan-tin, joka koodittaa interferoninkaltaista polypeptidiä, tai DNA:ta, joka hybridisoituu mainituksi DNA:ksi, isäntäsolua, joka on transformoitunut vähintään yhdellä mainitunlaisella yhdistelmä-DNA:11a, polypeptidin, jolla on ihmisen lymfoblastoidi-interferonin immunologinen ja biologinen aktiivisuus, tai sen fragmentin tai johdannaisen valmistamiseksi.

Farmaseuttisella seoksella, joka sisältää mainittua polypeptidiä voidaan hoitaa ihmisen virusinfektioita, syöpämuotoja ja kasvaimia siten, että mainituille ihmisille annetaan tehokas määrä mainittua polypeptidiä mainitun ·. farmaseuttisen seoksen muodossa.

Erityisesti keksintö koskee menetelmää sellaisen polypeptidin valmistamiseksi, jolla on ihmisen lymfoblastoi-I di-interferonin immunologinen ja biologinen aktiivisuus, ja menetelmälle on tunnusomaista se, että isäntäsolua, joka on transformoitunut vähintään yhdellä mainitunlaisella yhdistelmä-DNA:lla, viljellään ja haluttu polypeptidi otetaan talteen.

Isäntämikro-organismin transformointimenetelmän vaiheet ovat seuraavat: (1) ihmisen lymfoblastoidinen poly(A) RNA eristetään indu-:·. soiduista ihmisen lymfoblastoidisoluista ja rikastetaan • * HuLyIFN-mRNA:n suhteen; 13 8071 9 (2) tästä templaatista valmistetaan yksisäikeinen komplementaarinen DNA ja siitä kaksisäikeinen cDNA, (3) kaksisäikeinen cDNA liitetään sopivaan vektoriin, (4) sopiva isäntäsolu transformoidaan saadulla yhdis-5 telmä-DNA:11a, (5) isäntämikro-organismeja viljellään ja valitaan ne kloonit, jotka ovat transformoituneet ihmisen lymfoblas-toidi-interferonin cDNA:11a tai DNA-jakeilla ja mahdollisesti 10 eristetään yhdistelmä-DNA:t transformoituneista isäntäso-luista ja tarvittaessa modifioidaan yhdistelmä-DNA:t, jotta saataisiin aikaan suurempia määriä interferoniaktii-visuuden omaavia polypeptidejä, ja suoritetaan vaiheet (4) ja (5) uudelleen.

15 1. Ihmisen lymfoblastoidisolujen indusointi ja HuLylFN-mRNArn suhteen rikastetun ihmisen lymfoblastoidi-poly(A)-RNA:n eristäminen 20 HuLyIFN-mRNA:n suhteen rikastettu ihmisen lymfoblas toidi-poly (A) -RNA voidaan eristää erilaisia tunnettuja menetelmiä käyttämällä. Tässä keksinnössä käytetty menetelmä koostuu seuraavista vaiheista: a. Ihmisen lymfoblastoidisolut indusoidaan syntetisoi-25 maan lymfoblastoidi-interferonia (LylFN).

b. Indusoidut solut rikotaan.

c. Lymfoblastoidi-poly(A)-RNA erotetaan epäpuhtauksina olevista proteiineista, lipoproteiineista ja erilaisista DNA- ja RNA-tyypeistä.

30 d. LylFN:lie spesifinen mRNA rikastetaan.

a. Ihmisen lymfoblastoidisolujen indusointi LylFN-tuotantoon

Kun ihmisen lymfoblastoidisolut saatetaan alttiiksi IFN-indusoijän vaikutukselle, ne tuottavat LyIFN-mRNA:ta 35 ja sen jälkeen ihmisen lymfoblastoidi-interferonia (LylFN).

14 8071 9

Sopivia IFN-indusoijia ovat esim. erilaiset kemialliset aineet, kaksisäikeinen RNA, esim. poly(I):poly(C), tai varsinkin eräät virukset ja ennen kaikkea para-myxovirukset, pseudomyxovirukset ja reoviridiaaliset 5 ryhmät, kuten Newcastle-sairausvirus (esim. kannat 110, B1, La Sota tai Texas), Sendai virus, afrikkalainen kinokuumevirus, tuhkarokkovirus, sikotautivirus, parainfluenssavirustyypit I, II tai m tai Semliki Forest-virus .

10 Ihmisen lymfoblastoidisolut on edullista ottaa sel laisilta potilailta joilla on Burkitt-lymfoma. Tällaisessa solulinjassa on Namalwa-solujen osoitettu tuottavan suuria IFN-pitoisuuksia viruksella stimuloitaessa (26). Paitsi Namalwa-soluja voidaan käyttää myös muita lymfo-15 blastoidisoluja, kuten esim. Daudi-soluja, Akuba-soluja, NC-37-soluja, RN-2-soluja ja muita alalla tunnettuja soluja.

Ennen indusointia voidaan lymfoblastoidisolut esikäsi-tellä alemmalla alkaanihapolla, kuten esim. voihapolla tai 20 sen suolalla, jonka tiedetään lisäävän lymfoblastoidiso-lujen interferonintuotantoa (27, 28). Lisäksi voidaan lymfoblastoidisolut tarpeen mukaan herkistää käsittelemällä ne pienellä määrällä homologista interferonia.

Lymfoblastoidisolujen indusointi suoritetaan sellai-25 silla menetelmillä, jotka tunnetaan kirjallisuudesta analogisten menetelmien yhteydestä. Lymfoblastoidisoluja, esim. Namalwa-soluja, kasvatetaan tavanomaisessa ravinne-alustassa (esim. RPMI 1640-alusta), johon on lisätty 10% sikiökautista vasikan seerumia, riittävään solutiheyteen 30 (esim. 10 - 10 solua/ml). Solut otetaan talteen kas- vuliemestä sentrifugoimalla ja suspendoidaan uudelleen ravinneliemeen ja niitä indusoidaan riittävä aika, esim.

5-16 tuntia, lisäämällä sopivaa virusta, esim. Newcastle-sairausvirusta, niin, että väkevyydeksi tulee noin 200 35 hemagglutinaatioyksikköä per 10^ solua. Heti kun indusoidut solut tuottavat interferonia riittävän suurena is 8071 9 tiitterinä, ne kerätään talteen ja jatkokäsitellään jäljempänä kuvatulla tavalla. Interferoniaktiivisuus voidaan määrittää esim. värinottomenetelmällä, jonka Armstrong (29) on kehittänyt.

5 b) Indusoitujen solujen rikkominen

Nukleiinihapon eristämisen ensimmäisessä vaiheessa se erotetaan muista solukomponenteista siten, että solut rikotaan ja epäpuhtausproteiinit poistetaan. So-lujenrikkomisessa käytettäviä menetelmiä ovat mm. tois-10 tuva jäädytys ja sulatus, mekaaninen rikkominen, esim. homogenoimalla moottorikäyttöisellä teflonsurvimella lasihomogenisaattorissa, halkaiseminen osmoottisen Sokin avulla, rikkominen ultraäänivärähtelyn avulla tai lyyttisten kemiallisten aineiden käyttö, joita ovat 15 mm. anioniset pinta-aktiiviset aineet, esim. natrium-dodekyylisulfaatti (SDS), litiumdodekyylisulfaatti, natrium-4-aminosalisylaatti, natrium-dodekyylisarkosi-naatti tai natrium-tri-isopropyylinaftaleenisulfonaatti. Joissakin tapauksissa anionisten pinta-aktiivisten ainei-20 den käyttö johtaa myös nukleiinihappojen osittaiseen vapautumiseen proteiinikomplekseista ja RNAaasiaktiivisuu-den osittaiseen inhiboitumiseen. Toimenpide on edullista suorittaa käyttämällä suurta pinta-aktiivisen aineen väkevyyttä ja lyhyttäaltistusaikaa, jotta nukle-25 iinihapot, ja varsinkin RNA, vapautuvat täydellisesti ja samalla hajoaminen jää mahdollisimman vähäiseksi.

Indusoidut solut on edullista hajottaa sopivan anionisen pinta-aktiivisen aineen, esim. natriumdodekyyli-sulfaatin, vaikutuksesta tavanomaisessa puskuriliuoksessa, 30 esim. TNE:ssä. Lyhyen käsittelyäjän jälkeen suspensio käsitellään deproteinisointiaineella, kuten jaksossa c on esitetty.

ie 8071 9 c) Lymfoblastoidi-poly(A)-RNA:n erottaminen epäpuhtauksina olevista proteiineista, lipoproteiineista ja erilaisista DNA- ja RNA-tyypeistä

Saadun nukleiinihapposeoksen deproteinisointi voi-5 daan suorittaa kemiallisten aineiden avulla, esim. käyttämällä kloroformia, joka sisältää 1-4 % -pentanolia, tai varsinkin fenolia. Proteiinit voidaan myös poistaa hajottamalla proteaasilla, esim. pronaasilla tai proteaasi P:llä, jotka hajottavat lähes kaikki mahdolli-10 set proteiinit aminohapoiksi. Täydellisen proteiinien poistumisen varmistamiseksi voidaan myös käyttää kahden kemiallisen deproteinisointiaineen, esim. fenolin ja kloroformin, yhdistelmää tai voidaan käsitellä ensin proteaasilla ja sen jälkeen kemiallisella deproteini-15 sointiaineella, esim. fenolilla.

Erityisesti voidaan nukleiinihapposeoksen deproteinisointi suorittaa siten, että inkuboidaan proteaasin, esim. pronaasin, kanssa ja saatu seos uutetaan useaan kertaan fenolilla ja sen jälkeen kloroformilla. Fenoli-20 systeemiä käytettäessä lähes kaikki denaturoituneet ja hajonneet proteiinit siirtyvät fenoliin ja interfaasiin.

Tätä ja seuraavia poly(A)-RNA:n talteenottovaiheita voidaan seurata mRNA:n hajoamisen suhteen lisäämällä pieni määrä radioaktiivisesti merkittyä merkki-mRNA:ta, esim.

125 25 I-merkittyä globiini-mRNA:ta.

Puhdistettua (RNAaasista vapaata) deoksiribonukle-aasia voidaan käyttää DNA-epäpuhtauksen hajottamiseen.

Vaihtoehtoisesti voidaan RNA vapauttaa DNA-epäpuh-tauksista tasapainosentrifugoimalla CsCl-gradienteissa.

30 Lisäksi voidaan RNA erottaa DNArsta kromatografisilla menetelmillä, esim. hydroksiapatiittipylväskromatografisesti.

Puhdistetun liuoksen sisältämät mRNA-molekyylit eroavat muista RNA-lajeista, esim. tRNA tai rRNA, 3'-päässä sisältämänsä keskeytymättömän adenosiininukleotidisek-35 venssin (100 - 200 tähdettä pitkä) suhteen. Näitä poly(A)-ketjuja voidaan käyttää hyväksi mRNA:n valinnassa tunnetulla tavalla, esim. adsorboimalla toistuvasti 17 8071 9 oligo(dT)-selluloosaan tai poly(U)-sefaroosiin. Sitten sidottu poly(A)-RNA eluoidaan pesemällä joitakin kertoja sellaisella liuoksella, jolla on pieni ionivahvuus, kuten vedellä.

5 Erittäin edullisessa poly(A)-RNA:n eristämistavassa voidaan esim. indusoitujen solujen hajottamisen (vaihe 1b) jälkeen saatu nukleiinihapposeos käsitellä proteaa-silla, uuttaa ensin fenolilla ja sen jälkeen kloroformilla denaturoituneiden ja hajonneiden proteiinien poistami-10 seksi, suorittaa saadulle liuokselle oligo(dT)-selluloosan avulla kromatografinen erottaminen ja eluoida sidottu poly(A)-RNA vedellä. Tarpeen vaatiessa tai haluttaessa voidaan adsorptio oligo(dT)-selluloosaan suorittaa useaan kertaan.

Tässä vaiheessa voidaan mitata poly(A)-RNA:n 15 kyky ohjata sellaisten polypeptidien synteesiä, joilla on HuIFN-aktiivisuus, käyttämällä in vitro- translaatiosysteemiä (esim. retikulosyyttitranslaatiosys-teemi, Xenopus laevis). IFN-spesifiset polypeptidit voidaan identifioida käyttämällä radioimmuunimääritystä tai 20 varsinkin sytopaattista biomääritystä. Tätä tarkoitusta varten liuotetaan talteenotettu poly(A)-RNA-näyte sopivaan liuottimeen, esim. veteen, laimennettuni(esim. 1mM) EDTA-liuokseen tai tavaomaiseen puskuriseokseen, mikro-injektoidaan afrikkalaisen Xenopus laevis-sammakon 25 varhaismunasoluihin menetelmällä Colman et ai. (30).

Varhaismunasolujen tuottama interferoni voidaan määrittää sytopaattisella biomäärityksellä, esim. käyttämällä värinsitomismääritystä Armstrongin mukaan (29) tai syto-paattisen vaikutuksen vähenemistä Stewart et ai. mukaan 30 (31) käyttämällä sopivaa ärsytysvirusta, esim. vesiku- läärisen stomatitiksen virusta (VSV), ihmisen solulinjaan, esim. CCL-23- tai Hep-2-soluja. Haluttaessa missä tahansa tässä kuvatun menetelmän vaiheessa voidaan RNA:n HuIF-mRNA-aktiivisuus, olipa se sitten eristetty missä tahansa 35 puhtausästeessa tai johdettu vastaavasta DNA:sta, esim.

ie 8071 9 kaksisäikeisestä cDNA:sta, määrittää millä tahansa mainituista määritysmenetelmistä.

d) LylFNrlle spesifisen mRNA:n rikastaminen

Kun muut epäpuhtauksiksi katsottavat RNA-lajit, 5 esim. tRNA, rRNA, tai DNA (vrt. kohta 1c) on poistettu, voidaan poly(A)-RNA:n liuos, joka on tehty 0,5 - 1 mM EDTA:han, jatkopuhdistaa uuttamalla vielä useaan kertaan fenolilla ja laskemalla "Chelex"-pylvään läpi kaksivalens-sisten kationien poistamiseksi.

10 Tämä poly(A)-RNA-jae voidaan rikastaa lymfoblastoidi-

HuIFN-mRNA:n suhteen erilaisilla kirjallisuudesta tunnetuilla menetelmillä. Erottaminen perustuu oleellisesti yksittäisten mRNA-laatujen erilaisiin molekyylikokoihin.

Poly(A)-RNA:n fraktiointi koon mukaan voidaan suorit-15 taa esim. käyttämällä dektraanijohdannaisilla tai polyak-ryyliamidilla täytettyjä geelisuodatuspylväitä, joissa pienemmät RNA-molekyylit tunkeutuvat geelihiukkasten läpi eri nopeuksilla, kun taas suuret molekyylit eivät pidäty, vaan kulkeutuvat suoraan läpi. Poly(A)-RNA-lajien seos 20 voidaan myös fraktioida vyöhyke-elektroforeesilla käyttämällä polyakryyliamidi-, tärkkelys- tai agaroosigeelejä.

Poly(A)-RNA-lajit voidaan myös erottaa sedimentoitumis-nopeutensa mukaan vyöhykesentrifugoinnin avulla sakkaroosin tiheysgradienteilla käyttämällä gradientteina sakka-25 roosiliuoksia, joiden väkevyydet ovat välillä noin 5 - 23 %.

Poly(A)-RNA-seoksen fraktiointi voidaan suorittaa esim. seuraavalla tavalla. Poly(A)-RNA-liuos, josta on poistettu muut epäpuhtauksiksi katsottavat DNA- ja RNA-lajit, 30 fraktioidaan koon mukaan sentrifugoimalla sakkaroositiheys-gradienttien läpi (esim. 5 - 23 %) tavallisessa puskuri-syteemissä, joka sisältää pienen määrän EDTA:ta. Jakeet kerätään talteen ja niiden IFN-mRNA-aktiivisuudet voidaan määrittää edelläkuvatulla tavalla (kohta 1c). Ne jakeet, 35 joiden IFN-mRNA-aktiivisuus on korkein, kootaan yhteen 19 8071 9 ja siirretään oligo(dT)-selluloosa- tai poly(U)-sefaroosi-pylvääseen. Sitoutunut poly(A)-RNA, joka on huomattavasti rikastunut HuLylFN-mRNA:n suhteen, eluoidaan vedellä ja saostetaan etanolilla.

5 Tässä vaiheessa voidaan HuLylFN-mRNA-aktiivisuus määrittää vielä kerran käyttämällä edellämainittua menettelyä (vrt. kohta 1c). Yleensä sakkaroosigradientti-sentrifugointi johtaa HuLyIFN-mRNA:n 10- - 20-kertaiseen rikastumiseen.

10 2. Sellaisen kaksisäikeisen lymfoblastoidi-cDNA:n val mistus, joka sisältää HuLyIFN:n kaksisäikeisen cDNA;n

HuLyIFN-mRNA:n suhteen rikastettua poly(A)-RNA:ta, joka on saatu edelläkuvatulla tavalla (kohta 1d), voidaan käyttää templaattina eli mallina kaksisäikeisen cDNA:n 15 valmistuksessa. Tässä muuntotoimenpiteessä valmistetaan yksisäikeinen cDNA, syntetisoidaan toinen DNA-säie ja rikotaan alunperin syntynyt päässä sijaitseva "hius-neularakenne".

a. Yksisäikeisen cDNA:n valmistus 20 Yksisäikeinen DNA, joka on komplementaarinen edellä- kuvatun poly(A)-RNA:n suhteen (kohta 1d), voidaan valmistaa käänteiskopioimalla mainittu RNA. Synteesiä katalysoi RNA:sta riippuvainen DNA-polymeraasi (käänteisko-pioijaentsyymi), esim. lintumyeloblastosisvirus (AMV).

25 AMV-käänteiskopioijaentsyymi ei aloita DNA-synteesiä yksisäikeisellä RNA:11a. Se muistuttaa DNA-polymeraasia siinä suhteessa, että se vaatii prinerin eli aluk-keen, jolla on vapaa 3'-hydroksyyliryhmä muodostamassa emäsparin RNA-mallisäikeen kanssa. Koska mRNA-lajien 30 3'-päissä on poly(A)-hännät, on edullista käyttää alukkeena esim. oligodeoksitymidylaattia (oligo(dT)) tai poly(U):ta. Jos sekvenssitiedot ovat saatavissa, on myös mahdollista aloittaa cDNA-synteesi selektiivisesti juuri halutulle geenille.

20 8071 9

Yksisäikeinen cDNA voidaan syntetisoida esim. seu-raavalla tavalla. Edelläkuvatulla tavalla eristetty ja puhdistettu poly(A)-RNA saatetaan tavanomaisessa puskuri-seoksessa reagoimaan alukkeen esim. oligo(dT), mag-5 nesiumsuolan, esim. MgC^r merkaptaanin, esim. ditiotreitoli (DTT), dATP:n, dGTP:n, dCTPrn, dTTP:n ja AMV-käänteikopioi-jaentsyymin kanssa. On edullista käyttää suuria deoksi-nukleosiditrifosfaattimääriä, koska näin voidaan edesauttaa täysikokoisten kopioiden syntymistä. Yksisäikeisen 10 cDNA:n myöhemmät puhdistusvaiheet helpottuvat, jos yksi käytetyistä neljästä deoksinukleosiditrifosfaatista on 32 merkitty, esim. P:llä. Reaktio voidaan katkaista lisäämällä inhibointiseosta, joka sisältää esim. EDTA:ta ja SDS:ää. Reaktion päättämisen jälkeen tuote deproteini-15 soidaan esim. uuttamalla liuos fenolilla ja kloroformilla ja sen jälkeen kromatografoidaan Sephadex-pylväässä suolojen ja jäännösdeoksinukleosiditrifosfaattien poistamiseksi. Syntetisoitua cDNA:ta sisältävät jakeet (edellyttäen, että yksi deoksinukleosiditrifosfaateista 20 on merkitty P:llä, koska tällöin käyttökelpoiset jakeet voidaan helposti identifioida mittaamalla Cerenkov-säteily) yhdistetään ja nukleiinihapot (RNA ja cDNA) voidaan eristää esim. etanolilla saostamalla. Malli-RNA poistetaan ribonukleaasin, esim. RNAaasi A tai 25 RNAaasi T1, avulla tai mielellään hydrolysoimalla alkalilla, kuten natriumhydroksidilla. Jäljellejääneen cDNArn koko voidaan määrittää esim. sen elektroforeettisena liikkuvuutena alkalisessa agaroosigeelissä tai polyakryy-liamidigeelissä suhteessa tunnetunpituisiin DNA-merkki-30 aineisiin (esim. 32).

b) Kaksisäikeisen cDNA:n valmistus

Edelläkuvatulla tavalla valmistettu yksisäikeinen cDNA sisältää 3'-päässä olevan "hiusneularakenteen”.

Tämä "hiusneularakenne" muodostuu lyhyestä kaksisäikei-35 sestä jaksosta, joka tekee cDNA:n itsealkavaksi 21 8071 9 seuraavaa toisen DNA-säikeen synteesiä varten. Tästä syystä ei tarvita mitään muuta aluketta.

Kaksisäikeinen cDNA voidaan syntetisoida RNA:sta riippuvaisella DNA-polymeraasilla, esim. AMV-käänteisko-5 pioijaentsyymillä, samoin kuin edellä on kuvattu yksi-säikeisen cDNA:n syntetisoinnin yhteydessä, mutta nyt poly(A)-RNA korvataan yksisäikeisellä cDNA:11a ja alu-ke jätetään pois. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää myös muita sellaisia ensyymejä, jotka katalysoivat DNA:n synte-10 tisoitumista deoksiribonukleotidiprekursoreista, kuten T4-DNA-polymeraasia, E. coli-DNA-polymeraasia (Klenow-fragmentti) tai mielellään E. coli-DNA-polymeraasia I. Toisen säikeen syntetisointi voidaan suorittaa käyttämällä puskuriseosta, joka sisältää yksisäikeisen cDNA:n, 15 magnesiumsuolan, esim. MgC^* merkaptaanin, esim.

ditiotreitolin, neljä deoksinukleosiditrifosfaattia, joista yksi on radioaktiivisesti merkitty, esim. ^Hrlla, ja DNA-polymeraasin, esim. E. coli DNA polymeraasi I. Kun reaktio on lopetettu ja seos deproteinisoitu (vrt. kohta 2a), DNA saostetaan etanolilla.

20 Saatu kaksisäikeinen DNA sisältää molemmat DNA-säikeet yhdistävän "hiusneula"-silmukan. Silmukka voidaan katkaista Sl-nukleaasilla, jolloin saadaan kaksisäikeinen DNA, jossa on emäsparipäät. Rikkominen voidaan suorittaa tavanomaisessa seoksessa käsittelemällä toisen säikeen syntetisoin-25 nissa saatu tuote S1-nukleaasilla sinkkisuolan, esim.

sinkkisulfaatin, läsnäollessa. Hajotus voidaan katkaista lisäämällä SDS:ää ja EDTA:ta. Liuos deproteinisoidaan fenolilla ja kromatografoidaan Sephadex-pylväässä. Ja-keet, jotka sisältävät cDNA:n (voidaan määrittää esim. mit-30 taamalla jokaisen jakeen Cerenkov-säteily) yhdistetään ja kaksisäikeinen cDNA saostetaan etanolilla.

Syntetisoitu kaksisäikeinen cDNA, joka vielä sisältää monia eri lajeja, on edullista tässä vaiheessa rikastaa täysikokoisen kaksisäikeisen cDNA:n suhteen. Tähän 22 80719 tarkoitukseen sopivia menetelmiä ovat mm. geelisuodatus, elektroforeesi polyakryyliamidigeelillä tai agaroosigee-lillä tai vyöhykesentrifugointi sakkaroosigradientissa.

Kun suoritetaan rinnakkaiselektroforeesit ja rinnakkais-5 sentrifugoinnit käyttämällä molekyylipainoltaan tunnettuja DNA-molekyylejä, voidaan paikallistaa ne kaksisäikeiset cDNA-molekyylit, joiden molekyylikoko vastaa odotettua IFN ds cDNA:n molekyylikokoa (700 - 1200 emäsparia aikaisemmin julkaistujen tietojen mukaan: 14, 16, 18, 33).

10 Esimerkiksi tavalliseen puskuriaineeseen liuotettu kaksisäikeinen cDNA vyöhykesentrifugoidaan sakkaroosi-gradienttien läpi (esim. 5 - 23 %). Ne DNA-lajit, jotka sedimentoituvat nopeammin kuin rinnakkaisissa gradienteis-sa ajettu sopiva DNA-merkkiaine (esim. 700 - 800 emäsparia 15 sisältävä merkkiaine), eristetään.

3. Kaksisäikeisen HuLyIFN-cDNA:n suhteen rikastetun kaksisäikeisen cDNA:n kloonaus a. Yleisiä näkökohtia i Edelläkuvatulla tavalla (kohta 2b) saadun kaksisäi- 20 keisen cDNA:n kloonaus voidaan suorittaa sinänsä tunnetuilla menetelmillä.

Toimenpiteessä *- - liitetään kaksisäikeinen cDNA sopivaan vektori-DNA:han ja siirretään saatu yhdistelmä-DNA sopivaan isäntäsoluun 25 (transformointi), jossa se kykenee toisiintumaan.

Vektori-DNA on sellainen DNA-molekyyli, jonka sisältämät geneettiset funktiot takaavat sen oman toisiintumi-sen isäntäsoluun siirrettynä. Lisäksi on toivottavaa, että vektori-DNA sisältää geenin, jonka avulla plasmidin 30 sisältävät isäntäsolut (transformantit) voidaan valita suuresta solujoukosta, joista suurin osa ei sisällä plasmidia. Yhdistelmä-DNA-tekniikassa tavallisesti käytettyjä DNA-vek-toreja ovat esim. rengasmainen plasmidi DNA ja eräiden bakte-riofaagien DNA, joihin kaksisäikeinen cDNA voidaan liittää 35 kokeellisesti, kuten bakteriofaagi-λ:n johdannaiset ja varsinkin plasmidi col El tai sen johdannaiset, esim.

23 80719 pMB 9, pSF 2124, pBR 317 ja varsinkin pBR 322. Mainitut plasmidit sisältävät geenejä, jotka antavat ampisillii-ninvastustuskyvyn ja jotkut myös tetrasykliinin vastustuskyvyn antavia geenejä. Näin ollen tällaisen plasmi-5 din sisältävien isäntäsolujen fenotyyppi tekee mahdolliseksi transformanttien erottamisen kantasoluista.

Yhdi s te Imä-DNA-molekyyIin valmistamiseksi voidaan esim. sopiva plasmidi, esim. pBR 322, katkaista, liittää kaksisäikeinen cDNA linearisoituun plasmidiin ja sulkea rengas jälleen 10 niin, että muodostuu aikaisempaa suurempi yhdistelmäplas-midi, joka sisältää liitetyn kaksisäikeisen cDNA-jakson. Plasmidi on edullista katkaista tietyistä kohdista. Tätä tarkoitusta varten on tarjolla suuri määrä restriktio-endonukleaaseja, jotka tunnistavat tiettyjä DNA-sekvens-15 sejä. Jotkut restriktioendonukleaasit katkaisevat molemmat DNA-rihmat samasta kohdasta tuottaen tylppiä päitä. Toiset katalysoivat sidosten katkeamisen muutaman nukleotidin päästä toisistaan niin, että katkaistun molekyylin kumpaankin päähän muodostuu vapaita yksisäikeisiä 20 alueita (lomittaiset päät).

DNA-jaksot yhdistetään tavallisesti yksisäikeisten kohesiivisten päidensä välityksellä ja sulkemalla kovalentti-sesti DNA-ligaasin avulla, esim. T4-DNA-ligaasi. Komplementaariset päät voidaan muodostaa kahdella erillisellä 25 tavalla, nimittäin joko katkaisemalla restriktioentsyymeil-lä, jotka muodostavat lomittaisia päitä, ja saamalla aikaan kohesiiviset päät tai lisäämällä tiettyjä yksisäikeisiä sekvenssejä (esim. homopolymeerisiä häntiä). Vaihtoehtoisesti voidaan kaksisäikeiset DNA:t, joissa 30 on täydelliset emäsparit, siis tylpät päät, yhdistää T4- ligaasilla. Esimerkiksi plasmidi, esim. pBR 322, katkaistaan sopivalla restriktioendonukleaasilla, esim. Pst I, lineari-soitu plasmidi ja liitettävä kaksisäikeinen cDNA pidennetään kumpikin yksisäikeisillä homopolymeerisillä hännillä käyttä-35 mällä sopivaa entsyymiä, esim. terminaalista deoksinukleo- tidyylitransferaasia. Esim. poly(dC)-hännät voidaan liittää 24 8071 9 toiseen DNA-valmisteeseen ja poly(dG)-hännät voidaan liittää toiseen ( vaihtoehtoisesti voidaan yhtä hyvin valita dA- ja dT-hännät). Nämä kaksi DNA-tyyppiä voidaan sitten liittää komplementaaristen päidensä välityksellä.

5 Sopivia isäntäsoluja ovat mm. hiivat ja varsinkin sellaiset bakteerit, jotka ovat alttiita transformaatiolle eivätkä sisällä restriktioentsyymejä eivätkä modifikaa-tioentsyymejä, kuten esim. E. coli-kannat, esim. E. coli X 1776 tai E. coli HB 101 tai Bacillus substilis-, 10 Bacillus stearothermophilus-, Pseudomonas-, Haemophilus- ja Streptococcus-kannat ja muut bakteerit ja niiden mutan-tit.

Edelläkuvatulla tavalla valmistettu yhdistelmä-DNA-molekyyli voidaan siirtää sopivaan isäntäsoluun tavalli-15 siä transformointimenetelmiä käyttäen, mukaanluettuna esim. isäntäsolujen esikäsittely Ca2+-ioneilla. Solut, jotka sisältävät yhdistelmä-DNA-plasmidin, joka antaa isäntäso-lulle tietyn fenotyyppisen ominaisuuden, esim. vastustuskyvyn tetrasykliinin suhteen, valitaan viljelemällä soluja 20 agar-levyillä selektiivisessä , esim. tetrasykliinipitoi-sessa, ravinnekoostumuksessa.

Tässä keksinnössä etusijalle asetettava vektori-DNA on plasmidi pBR 322, joka sopivalla restriktioendo-nukleaasilla, varsinkin Pst I, tapahtuneen katkaisun jäl-25 keen liitetään kaksisäikeiseen cDNA:han komplementaaristen homopolymeeristen häntien, varsinkin dG:dC-hännät, kautta. Saatu yhdistelmä-DNA siirretään E. coli HB 101-kantaan.

Edelläolevien kappaleiden mukaisesti synteettisin keinoin kaksisäikeisen cDNA.-n kautta valmistettujen 30 IFN-geenien tilalla voidaan yhtä hyvin käyttää vastaavaa kromosomaalista DNA:ta tehtäessä klooneja, jotka kykenevät tuottamaan polypeptidejä, joilla on IFN-aktiivisuut-ta.

Kromosomaalinen DNA voidaan saada ihmisen lymfoblas- 35 toidisoluista, kuten Namalwa-soluista, sinänsä tunnetuilla 25 8071 9 menetelmillä, esim. hajottamalla koko kromosomaalinen DNA osittain Alu Iillä ja liittämällä saadut jakeet EcoR I-liittäjillä λ Charon 4A-varsiin tai hajottamalla kromosomaalinen DNA restriktioentsyymillä, esim. Κρη I 5 tai Hind III, ja liittämällä saadut jakeet DNA-vektoriin, kuten plasmidiin pBR 322 tai DNA-kosmidiin. Yhdistelmä-DNA-vektori voidaan siirtää isäntäsoluun, kuten E. coliin. Ne pesäkkeet, jotka sisältävät kromosomaaliset IFNin a- ja β-geenit, identifioidaan pesäkehybridisoinnilla 10 (vrt. kohta 4a) joko käyttämällä radioaktiivisesti merkittyä synteettistä oligodeoksinukleotidia tai radioaktiivisesti merkittyä a- ja β-spesifistä IFN-cDNA:ta koettimena. Alajakeita voidaan saada rajaamalla identifioidut jakeet sopivalla endonukleaasilla tai hajottamalla 15 ne sopivalla eksonukleaasilla.

Näin ollen keksinnön toteuttamiseksi tarvitaan myös menetelmää, jolla voidaan valmistaa DITAita, joka sisältää ihmisen lymfoblastoidisoluista saatavissa olevan DNA-sek-venssin, mainitun sekvenssin osan, variantin tai nutantin, 20 joka koodittaa interferoninkaltaista polypeptidiä, tai DNA:ta, joka hybridisoituu mainituksi DNAiksi, ja menetelmälle on tunnusmerkillistä se, että (1) HuLylFN-mRNA:sta valmistetaan yksisäikeinen komplementaarinen DNA ja tästä tarvittaessa edelleen kaksi- 25 säikeinen cDNA, tai (2) hajotetaan osittain ihmisen lymfoblastoidisolujen kromosomaalinen DNA ja valitaan jakeet, jotka sisältävät kromosomaalisia LylFN-geenejä, ja jos halutaan mainitun sekvenssin osa, rajataan mainittu DNA sopivalla endo- 30 nukleaasilla tai hajotetaan mainittu DNA osittain sopivalla eksonukleaasilla, tai jos halutaan yhdistelmä-DNA, mainittu DNA liitetään sopivaan DNA-vektoriin.

b. Linearisoidun, deoksinukleotideilla pidennetyn pBR 322:n valmistus 35 Tässä keksinnössä käytettäväksi sopiva edullinen 26 80 71 9 vektori, plasmidi pBR 322, on pieni plasmidi, joka koos- £ tuu 4361 emäsparista. Se sisältää kaksi geeniä (amp , tetr) , jotka antavat vastaavasti vastaanottajabakteerisoluille vastustuskyvyn ampisilliinin ja tetrasykliinin suhteen, 5 ja joita voidaan käyttää hyväksi transformoitujen solujen valinnassa ja identifioinnissa. pBR 322:ssa on useita 37 restriktiokohtia. Ainut Pst I-kohta on amp -geenissä, kun taas ainoat BamH I-, Hind III- ja SAI I-kohdat ovat tetr-geenissä. Yksi ainut EcoR I-kohta sijaitsee muual-10 la (34). Kun käytetään vain yhtä mainituista restrik-tioendonukleaaseista, joko ampr- tai tetr-geeni tai molemmat geenit säilyvät vahingoittumattomina. Näin ollen jompikumpi mainituista entsyymeistä sopii pBR 322:n katkaisuun ja linearisointiin.

15 Kun plasmidi pBR 322 on linearisoitu, molempiin 3'-päihin voidaan lisätä deoksinukleotidiketjuja terminaalisen deoksinukleotidyylitransferaasin läsnäollessa.

On edullista lisätä noin 20 - 50 deoksinukleotiditähdettä, jotta voidaan varmistaa pysyvä liitos kaksisäikeisen 20 cDNA:n kanssa, jota on pidennetty komplementaarisilla deoksinukleotideilla. Plasmidi pBR 322 käsitellään esi-: merkiksi sopivasti puskuroidussa vesiliuoksessa, joka sisältää MgC^^ta, merkaptaania, esim. 2-merkaptoetanolia, : ja kantajaproteiinilähdettä, esim. naudan seerumialbu- 25 miinia tai gelatiinia, restriktioendonukleaasilla, esim. Pst I. Kun hajotus on lopetettu, liuos deproteini-soidaan esim. fenolilla. Deoksinukleotidyylitähteiden lisääminen päihin suoritetaan tavanomaisessa puskurisys-teemissä, joka sisältää MgC^^ta, natriumkakodylaattia 30 ja kantajaproteiinia, esim. naudan seerumialbumiinia, riittävän määrän kanssa deoksinukleosiditrifosfaatteja, esim. dGTP, ja terminaalista deoksinukletidyylitransferaasia.

c. Deoksinukleotideilla pidennetyn kaksisäikeisen cDNArn valmistus 27 80719

Edelläkuvatulla tavalla (kohta 2b) saatu kaksisäi-keinen cDNA voidaan pidentää samalla tavalla kuin syntetisoitiin linearisoitu, deoksinukleotideilla pidennetty plasmidi pBR 322 (vrt. kohta 3b) käyttämällä komple-5 meataarista deoksinukleosiditrifosfaattia (esim. dCTP

dGTP:n tilalla) ja mielellään käyttämällä MgCl2:n tilalla CoCl2:ta. Esimerkiksi kaksisäikeistä cDNArta inkuboidaan puskuriliuoksessa, joka sisältää natriumkakodylaattia, CoCl2:ta, proteiinia, esim. naudan seerumialbumiinia, 10 vastaavaa deoksinukleosiditrifosfaattia, esim. dCTP, ja terminaalista deoksinukleotidyylitransferaasia.

d. Linearisoidun, pidennettyketjuisen pBR 322:n ja piden-nettyketjuisen kaksisäikeisen cDNA:n yhteenliittäminen

Linearisoitu, pidennettyketjuinen plasmidi pBR 15 322 ja pidennettyketjuinen kaksisäikeinen cDNA voi daan liittää yhteen ja muodostaa rengas tavalliseen tapaan, so. muodostaa emäsparit komplementaaristen deoksi-nukleotidiketjujen välille.

Renkaanmuodostamisen edistämistarkoituksessa ja konka-20 torreerien (eri lineaaristen hybridiplasmidien yhteenliittyminen) muodostumisen estämistarkoituksessa reaktio pitää suorittaa käyttämällä sekä pidennettyketjuista kaksisäikeistä cDNArta että linearisoitua pBR 322:ta pieninä väkevyyksinä.

25 Esimerkiksi seosta, joka sisältää deoksinukleotideilla pidennetyn (esim. dCMPrllä pidennetyn) kaksisäikeisen cDNArn ja linearisoidun, deoksinukleotideilla pidennetyn (esim. dGMPrllä) pBR 322:n, inkuboidaan 4 peräkkäisen tunnin ajan eri lämpötiloissa (esim. 65 °C, 46 °C, 37 °C 30 ja 20 °C). Yhteenliitettyä DNA:ta voidaan käyttää suoraan sopivan bakteerin, esim. E. coli HB 101, transformoinein.

Tässä vaiheessa on syytä mainita, että yhteenliittä-misessä tuotteiksi saaduista yhdistelmä-DNA-molekyyleistä vain hyvin harvat liittyvät HuLylFNriin, sillä useimmat 35 yhdistelmät sisältävät sellaisen cDNA-liitännäisen, joka 28 8071 9 on johdettu muusta mRNA:sta kuin LyIFN-mRNA.

e. E. coli HB 101:n transformointi yhteenliitetyillä hybridiplasmideilla

Saatuja yhteenliitettyjä hybridiplasmideja voidaan 5 käyttää E. coli HB 101:n transformoinnissa. Plasmidit toi-siintuvat solun sisällä ja toisiintuneet plasmidit jakaantuvat sitten tytärsoluihin, kun solu jakautuu.

E. coli HB 101:n transformointi yhteenliitetyillä hybridiplasmideilla voidaan suorittaa kirjallisuudesta 10 tunnetuilla menetelmillä. Toimenpide sisältää solujen esikäsittelyn Ca^+-ioneilla, jotta DNA:n sisäänotto voisi tapahtua (esim. (35)) ja inkuboinnin hybridiplasmidin kanssa. Sitten solut voidaan siirtää selektiiviseen ravinneseokseen, joka mahdollistaa transformoituneiden so-15 lujen erottamisen kantasoluista. Koska hybridiplasmidi sisältää vielä tetr-geenin, on edullista valita sellainen agarkasvualusta, joka sisältää tetrasykliiniä kasvua estävänä tekijänä.

: Esimerkiksi hybridiplasmidia ja E. coli HB 101 soluja, 20 jotka on esikäsitelty Ca^+-ioneilla, inkuboidaan puskuri- väliaineessa, joka sisältää Ca^+-suolaa, esim. CaCl~, 2+ 1 ja Mg -suolaa, esim. MgCl2· Riittävän inkubointiajan (esim. 10-40 min) jälkeen bakteereihin kohdistetaan lämpöpulssi (35 - 42 °C) tavallisesti lyhyen aikaa (1-5 25 min), solut jäähdytetään ja levitetään agar-kasvualus-talle, esim. tryptoniagar tai McConkey-agar, johon on lisätty riittävä määrä tetrasykliiniä. Ne solut, jotka säilyvät elossa tällaisessa kasvualustassa, sisältävät uudestaan renkaan muotoon liittyneen plasmidin tai 30 hybridiplasmidi-DNA:n. Tästä syystä kasvaneet pesäkkeet seulotaan mielenkiinnon kohteena olevien kloonien suhteen.

29 8071 9 4. Lymfoblastoidi-IFN-cDNA:ta sisältävien kloonien identifiointi a. LylFN-cDNA:ta sisältävien kloonien identifiointiin sopivat menetelmät 5 Tiettyjä geenejä sisältävät pesäkkeet voidaan identi fioida erilaisilla menetelmillä, esimerkiksi toisaalta RNA-valintahybridisaatiolla, differentiaalisella hybridi-saatiolla tai synteettisellä koettimella tapahtuvalla hybridisaatiolla tai toisaalta immunologisilla tai biolo-10 gisilla määrityksillä.

Immunologiset ja biologiset lähestymistavat perustuvat immunologisesti ja biologisesti ilmaistavissa olevaan geenin aikaansaamaan tuotteeseen, kun taas ensin-mainittu menetelmäryhmä on riippuvainen sellaisen so-15 pivan koettimen saatavuudesta, joka on riittävän puhdas, jottei muodostu epäspesifisiä hybridejä. Sopivia ovat sellaiset mRNA-molekyylit, jotka ovat komplementaarisia halutulle geenille, tai vastaava cDNA.

Tunnetaan useita mahdollisuuksia seuloa bakteeri- 20 klooneja, jotka sisältävät ihmisen leukosyyttien ja fibroblastien interferonia. Esimerkiksi Goeddel et ai.

(13) ja Sugano et ai. (16) identifioivat IFN-geenit vertaamalla visuaalisesti kahta hybridisaatioryhmää.

Ensimmäinen ryhmä hybridisoitiin radioaktiivisella 25 cDNA:lla, joka syntetisoitiin indusoiduista soluista saadusta mRNA-seoksesta käänteiskopioimalla käyttäen 32 P:llä merkittyä CTP:tä merkkiaineena ja oligo(dT):tä (Sugano) tai synteettistä deoksiundekanukleotidia (Goeddel) alukkeena. Toinen ryhmä hybridisoitiin sel-30 laisella radioaktiivisella cDNAzlla, joka oli valmistettu samoinkuin edellä, mutta käyttämällä indusoimattomista soluista saatua mRNA-seosta. Tästä menetelmästä puuttuvat spesifisyys ja toistettavuus, kuten esitetyistä tuloksista selvästi ilmenee. Toisessa lähestymistavassa, 35 jota Weissmann (3) on selostanut, käytetään hyväksi RNA-valintahybridisaatiota, joka sisältää halutun kloonin 30 8071 9 hankalan ja työlään monivaiheisen etsinnän.

Mainittuja menetelmiä ei voida soveltaa tässä keksinnössä tarvittavaan sekä LyIFN-α että -β-geenin erottamiseen, koska IFN-6:n pitoisuus on vain noin 10 % 5 ihmisen LyIFN:n sisältämästä IFN-a-pitoisuudesta. Tämä pieni määrä on näiden menetelmien ilmaisurajan alapuolella .

Koska ennen tätä keksintöä on esitetty vain epätyydyttäviä menetelmiä, on nyt kehitetty uusi seulontatapa, 10 jossa sekä IFN-α- että IFN-3~mRNA-molekyyleille syntetisoidaan komplementaarinen 5'-päästään merkitty oligo-deoksinukleotidi, LyIFN-mRNA:n suhteen rikastettu poly(A)RNA käänteiskopioidaan käyttämällä mainittua oligo-deoksinukleotidia alukkeena ja suodattimeen sidotut 15 plasmidi-DNA:t pesäkehybridisoidaan in situ käyttä mällä merkittyä cDNA-koetinta. Tällä menettelyllä on mahdollista spesifisesti, nopeasti ja suoraan ilmaista sekä IFN-α- että -β-geenit, jotka sisältävät syntetisoidun alukeoligodeoksinukleotidin emässekvenssin, 20 eikä nyt tarvita työläitä hybridisaatio-translaatiomää-rityksiä, joita aikaisemmin kuvatuissa menetelmissä on tarvittu. In situ-pesäkehybridisointi perustuu siihen yleiseen menetelmään tai sen muunnoksiin, jota Grunstein ja Hogness (36) ovat selostaneet. Tässä mene-25 telmässä pesäkkeitä kasvatetaan nitroselluloosasuodatti-milla tai ne siirretään tällaisille suodattimille, hajotetaan alkalikäsittelyllä ja kiinnitetään suodattimiin in situ. Sitten halutulle geenille komplementaarinen ;; radioaktiivisesti merkitty nukleiinihappokoetin hybridi- 30 soidaan suodattimeen sidottuun DNA:hän. Koska hybridi-soitunut koetin voidaan ilmaista autoradiografisesti, vastaavat pesäkkeet, jotka sisältävät hybridisoituvaa DNA:ta voidaan poimia nitroselluloosasuodattimien vertailuryhmästä.

35 Kun kloonattua ihmisen IFN-a-muotoa ja IFN-6-muotoa 31 8071 9 koodittavia cDNA-palasia on verrattu toisiinsa, on paljastunut kummallekin cDNA-muodolle (ja ilmeisesti myös vastaaville mRNA-muodoille) yhteinen 13 nukleotidin muodostama jakso (23). Näin ollen synteettistä 13 oligo-5 deoksinukleotidin muodostamaa ketjua, jolla on edellämainittu viereinen emässekvenssi, voidaan käyttää aloittamaan cDNA:n synteesi ihmisen lymfoblastoidi-IFN-a-ja -β-mRNArsta.

32 b. P:llä merkityn, ihmisen IFN-ot- ja IFN-g-muodolle 10 spesifisen cDNA-koettimen valmistus

On olemassa useita tapoja, joilla voidaan syntetisoida rakenteeltaan tietty oligodeoksinukleotidi (37). Oli-godeoksinukleotidisynteesi voidaan suorittaa esim. käyttämällä kemiallisia menetelmiä, kuten diesteri- tai tries-15 terimenetelmää. Diesterimenetelmän perusvaihe on kahden sopivan suojatun deoksinukleotidin yhteenliittäminen niin, että muodostuu dideoksinukleotidi, joka sisältää fosfodi-esterisidoksen. Triesterimenetelmä eroaa diesterimene- telmästä siinä suhteessa, että fosfaattiryhmissä on läsnä 20 orgaaninen lisäsuojaryhmä, joka tekee deoksinukleotidit ja oligodeoksinukleotidit orgaanisiin liuottimiin liukeneviksi. Vaihtoehtoisesti voidaan synteesi suorittaa entsymaattisesti käyttämällä polynukleotidi-fosforylaasia, joka ohjatuissa olosuhteissa lisää pääasiassa yhden deoksinukleotidin 25 lyhyeen oligodeoksinukleotidiin. Reaktiot voidaan suorittaa liuoksessa tai viime aikoina suosiota saavuttaneilla kiinteäfaasimenetelmillä.

Esimerkiksi seuraavan kaavan mukainen 13-meerinen oligodeoksinukleotidi 5'-CCTTCTGGAACTG-3' 30 joka on komplementaarinen ihmisen IFN-α- ja -β-mRNAin suhteen, voidaan saada aikaan triesterimenetelmällä, jota Itakura (38) ja de Rooij (39) ovat selostaneet, käyttämällä lähtöaineina suojattuja mono-, di- ja trideoksi- 32 8071 9 nukleotideja. Seuraava kaavio esittää menetelmän yhtä vaihetta, jolla syntetisoidaan dinukleotidi

Ri° —L· 0 njN ro \/ 0 sf V -> 0 sf Ι-r * ki-r Hr ° ° (-0«®) ° 0=P-0~ 0=P-0-R 0=P-0—J o dN* 1 1 1 |\l l/i °R2 or2 or2 \-\ 0 0=P-0R3 0R2 jossa , R2 ja R^ ovat suojaryhmiä, dN ja dN' ovat puriini- ja pyrimidiiniemäksiä ja kond. on konden-‘ · 5 sointiaine.

Tässä synteesissä käytetyt lähtöaineet (suojatut tai ; - osittain suojatut mono-,di- tai trideoksinukleotidit) tun netaan kirjallisuudesta.

Suojaryhmät on edullista valita niin, että voidaan 10 myöhemmin poistaa miedoissa olosuhteissa katkaisematta nukleotidin sisältämiä 3'-5'-sidoksia. Sopivia -suoja-ryhmiä ovat esim. monometoksitrityyli tai dimetoksitrityyli, R2 voi olla esim. 2-kloorifenyyli ja R^ esimerkiksi 2-syanoetyyli.

15 Adeniini-, guaniini- ja sytosiinitähteen sisältämät eksosykliset aminoryhmät suojataan varsinkin asyyliryhmillä, esim. bentsoyyli- tai isobutyryyliryhmällä. Kondensointi-aineena voidaan käyttää esim. 2,4,6-tri-isopropyylibentsee-nisulfonihappoa.

33 8071 9

Yksittäisten suojaryhmien spesifinen poistaminen (esim. R3, ja R2) välituotteista ja kaikkien suoja-ryhmien poistaminen täysin suojatusta 13-meerisestä oligodeoksinukleotidista voidaan suorittaa tunnetuilla 5 menetelmillä. Esimerkiksi 2-syanoetyyliryhmä R^ voidaan poistaa alkalikäsittelyllä, monometoksitrityyliryhmä R^ voidaan poistaa käsittelemällä 80 % etikkahapolla ja 2-kloorifenyyliryhmä R2 voidaan poistaa tetrabutyyliammo-niumfluoridilla. Yhtä hyvin voidaan käyttää muita alalla 10 tunnettuja menetelmiä. Synteesin eri vaiheet on esitetty pääpiirteissään kuvassa 2.

Valmistettu 13-meerinen oligodeoksinukleotidialuke voidaan puhdistaa tavanomaisilla kromatografisilla menetelmillä, esim. DEAE-Sephadex-kromatografiällä ja/tai 15 korkean suorituskyvyn nestekromatografiällä (HPLC).

32

Aluke on 5'- P-merkitty, jotta hybridisoitunut koetin olisi mahdollista havaita seuraavassa hybridisointitoi-menpiteessä. Merkitseminen suoritetaan saattamalla syntetisoitu aluke reagoimaan merkityn fosforylointiaineen, 20 esim. ^γ- P7-ATP, kanssa T4-polynukleotidikinaasin läsnäollessa tavanomaisessa puskuriseoksessa. Saatu seos, joka 32 sisältää P:llä merkityn alukkeen, puhdistetaan depro-teinisoimalla, esim. fenolilla, ja käyttämällä apuna kromatografisia menetelmiä, esim. Sephadex-kromatografiaa tai 25 polyakryyliamidigeelielektroforeesia. Haluttaessa nukleo-tidisekvenssi voidaan tässä vaiheessa varmistaa kaksi-dimensionaalisella homokromatografiällä.

LyIFN-mRNA:n suhteen rikastettua poly(A)RNA:ta (vrt. kohta 1d) käytetään mallina IFN-a:n ja -β:η suhteen spe-30 sifisen cDNA-koettimen syntetisoinnissa seuraavasti: cDNA:n synteesi suoritetaan oleellisesti ottaen samalla tavalla kuin edellä on kuvattu (kohta 2a), mutta aluk-keena käytetään 5'-merkittyä synteettistä oligodeoksinuk-leotidia eikä oligo(dT):tä. Merkitty cDNA-tuote depro-35 teinisoidaan, esim. fenolilla, ja otetaan talteen etanolilla saostamalla. cDNA-tuote voidaan jatkopuhdistaa esim.

34 8071 9 polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Tuote voidaan visualisoida autoradiografisesti.

Geelistä uutetaan yksi DNA-kaista, joka on spesifinen indusoiduista soluista saadulle poly(A)RNA:lie, mutta jota 5 ei ole läsnä siinä tuotteessa, joka saatiin käyttämällä indusoimattomista soluista saatua poly(A)RNA:ta. Sen koko voidaan määrittää esim. suhteellisen liikkuvuuden perusteella verrattuna pituudeltaan tunnettuihin merkit- 3 2 tyihin DNA-jaksoihin. Tuote on P:llä merkitty ihmisen 10 LyIFN-α- ja -β-muodolle spesifinen cDNA-koetin.

c. Lymfoblastoidi-IFN-cDNA:ta sisältävien kloonien seulonta

Ne pesäkkeet, jotka pysyvät elossa ja kasvavat tetra-sykliinillä täydennetyssä agaralustassa (vrt. kohta 3e), 15 seulotaan niiden pesäkkeinen suhteen, jotka sisältävät lymfoblastoidi-IFN-cDNA:ta. Tähän tarkoitukseen valitaan - edelläkuvattu (kohta 4a) in situ-pesäkehybridisointime- netelmä. Transformanttipesäkkeet siirretään nitrosellu-; loosasuodattimille ja sitten niistä otetaan vertailuryh- 20 mäksi toisinnot toisille agarlevyille. Suodattimilla olevien pesäkkeiden solut hajotetaan, niiden DNA denaturoidaan ja kiinnitetään suodattimiin in situ (36) .

Ennen hybridisointitoimenpidettä on suodattimilla oleva DNA edullista esihybridisoida seoksella, joka sisältää mm.

25 vierasperäistä DNA:ta, jotta saataisiin aikaan matalampi tausta ja epäspesifiset hybridisoitumiskohdat tulisivat . kyllästetyiksi. Sitten edelläkuvatulla tavalla (kohta 4b) valmistettu radioaktiivisesti merkitty cDNA hybridi-- ' soidaan suotimeen sidottuun DNArhan, joka on peitetty ...· 30 mineraaliöljyllä. Kun suodattimista on poistettu mineraa liöljy ja muut epäpuhtaudet, voidaan hybridisointitoimen-piteen tulosta seurata autoradiografisella analyysillä röntgenfilmillä. Ne pesäkkeet, jotka osoittavat positii- 35 8071 9 vista vastetta röntgenfilmillä, voidaan poimia erilleen vertailuryhmästä ja tutkia tarkemmin.

Mielellään vain osa transformanttipesäkkeistä siirretään nitroselluloosasuodattimille. Loput pesäkkeet 5 käytetään jatkoseulonnassa, jota on selostettu jäljempänä (kohta 4d). Esimerkiksi nitroselluloosasuodattimiin kiinnitetty DNA käsitellään tavanomaisella esihybridi-sointiseoksella, joka sisältää mm. denaturoitua DNA:ta, esim. denaturoitu vasikan thymus-DNA, naudan seerumialbu-10 miinia, "Ficoll'ia" ja polyvinyylipyrrolidonia, ja sen jälkeen hybridisoidaan radioaktiivisesti merkityllä cDNA-koettimella (vrt. kohta 4b) paraffiiniöljyn alla käyttämällä tavallisia hybridisointitoimenpiteitä (ks.

36). Kun hybridisointi on katkaistu, suodattimet pes-15 tään peräkkäisesti kloroformilla ja puskuriseoksella, joka sisältää SDS:ää ja pienen suolapitoisuuden, jotta paraffiiniöljy ja vastaavasti hydridisoitumaton cDNA saadaan poistetuksi. Suodattimet kuvataan röntgenfilmeille autoradiografiaa varten. Hybridisoituneilla pesäkkeillä 20 on positiivinen vaste ja ne voidaan poimia vertailuryhmästä .

Identifioidut pesäkkeet sisältävät yhdistelmä-DNA-molekyylejä, joissa olevat liitännäiset ovat komplementaarisia cDNA-koettimen suhteen, so. DNA-jaksoja, jotka 25 vastaavat ihmisen lymfoblastoidigeenejä tai niiden osia.

Koska transformoituneiden solujen primääriset kloonit silloin tällöin sisältävät useampaa kuin yhtä yhdistelmä-DNA-molekyylilajia, hybridiplasmidi-DNA:t eristetään positiivisesti hybridisoituneista klooneista ja käytetään 30 E. coli HB 101:n transformointiin edelläkuvatulla tavalla (kohta 3e). Hybridiplasmidi-DNA:t voidaan eristää esim. seuraavalla tavalla. Ensin jokaista identifioitua pesäkettä viljellään sopivassa ravinnealustassa, esim. tryptonialustassa, tetrasykliinin läsnäollessa, jotta saa-35 täisiin eliminoiduiksi ne kontaminoivat solut, jotka eivät sisällä plasmidia. Eloonjääneet solut kerätään 36 8071 9 talteen, liuotetaan tavanomaiseen puskurisysteemiin ja rikotaan varovaisella tavalla niin, että kromosomit pysyvät soluvaipan (cell envelope) sisällä. Tässä toimenpiteessä lisätään esim. peräkkäisesti lysotsyy-5 miä, EDTA:ta ja ionoitumatonta pinta-aktiivista ainetta, esim. "Triton". Sitten solupirstaleet ja kromosomaali-nen DNA poistetaan suodattamalla. Emäliuos deproteini-soidaan esim. fenolilla ja RNA hajotetaan RNAaasilla, esim. RNAaasi A:11a. Hydridiplasmidi-DNA voidaan 10 erottaa RNA-jakeista saostamalla polyetyleeniglykolilla ja puhdistaa etanolisaostuksella.

Tässä vaiheessa voidaan jokaisen eristetyn hydridi-DNA:n 1reaktiokartta määrittää sopivalla restriktio-endonukleaasilla ja varsinkin sillä, jota käytettiin 15 plasmidin pBR 322 linearisointiin siitä kohdasta, johon kaksisäikeinen cDNA on liitetty (vrt. kohta 3b). Restrik-:tio fragmenttien koko voidaan määrittää esim. niiden liikkuvuuden perusteella agaroosigeelillä suhteessa pituudeltaan tunnettuihin merkki-DNA-paloihin.

20 Jokainen eristetty hydridi-DNA siirretään uudes taan E. coli HB 101 reen ja kasvatetaan sopivalla agar-kasvualustalla (kohta 3e), joka sisältää tetrasykliiniä. Jokaisesta uude 1 leentransformaatiosta poimitaan joitakin pesäk-keitä ja jokaisen kloonin sisältämä hydridiplasmidi-25 DNA eristetään edelläkuvatulla tavalla. Hydridiplasmi-di-DNA-molekyyleille suoritetaan jälleen restriktioana-lyysi ja cDNA-liitännäisen mukleotidisekvenssi analysoidaan täysin tai osittain, jotta voidaan valita sellaiset hydridi-DNA-molekyylit, jotka soveltuvat jatkokä-30 sittelyyn. Lisäksi osittainen sekvenssianalyysi saattaa paljastaa, vastaavatko liitetyt IFN-cDNA-jaksot ihmisen lymfoblastoidi-IFN-a- vai.-β-geenejä.

Tällä hetkellä on saatavissa useita nopeita DNA-sek-venssinmääritysmenetelmiä. Sytytetyissä synteesimene-35 telmissä, jotka erityisesti Sanger (40) on kehittänyt, käytetään hyväksi DNA-polymeraasien kykyä syntetisoida 37 8071 9 tarkasti komplementaarinen kopio yksisäikeiselle DNA-mallille käyttämällä alukkeina restriktioendonukleaa-sihajotuksella aikaansaatuja radioaktiivisesti merkittyjä DNA-jaksoja. Vaihtoehtoisesti voidaan valita kemial-5 linen DNA-sekvenssinmääritysmenetelmä, jonka Maxam ja Gilbert (41) ovat kehittäneet. Tässä menetelmässä DNA, jonka sekvenssi on tarkoitus määrittää, merkitään päästään, katkaistaan osittain kukin neljän emäksen kohdalta neljässä eri reaktiossa ja tuotteet fraktioi-10 daan koon mukaan esim. geelielektroforeesilla denaturoivissa olosuhteissa. DNA-sekvenssi voidaan lukea radioaktiivisten kaistojen kaaviosta. Jotta voitaisiin määrittää halutun DNA-jakson täydellinen nukleotidisekvenssi, tarvitaan restriktioendonukleaasi, joka katkaisee DNA:n 15 tältä alueelta. Maxamin ja Gilbertin menetelmällä voidaan yhdellä kokeella määrittää 100 - 150 emäsparin muodostama sekvenssi kumpaankin suuntaan katkaisukohdasta.

Esimerkiksi eristetyt hydridi-DNA:t voidaan katkaista sopivilla restriktioendonukleaaseilla,esim. Pst I, EcoR I, 20 Bgl II, Pvu II tai Alu I, kohdista, jotka sijaitsevat cDNA-liitännäisen sisällä. Saadut DNA-jaksot merkitään päistään esim. ^γ- zP7“ATP:llä polynukleotidikinaasin läsnäollessa ja katkaistaan toisella restriktioendonuk-leaasilla niin, että vain yksi kaksisäikeisen DNA:n 25 rihma jää päästään merkityksi. Mielenkiinnon kohteena olevat DNA-jaksot eristetään esim. polyakryyliamidigeeli-elektroforeesilla. Sitten DNA-jaksoille suoritetaan emäs-spesifiset katkaisureaktiot Maxamin ja Gilbertin (41) mukaan. Tuotteet fraktioidaan elektroforeesilla, esim.

30 polyakryyliamidigeelillä, denaturoivissa olosuhteissa, esim.

7 M ureassa, ja DNA-jaksot visualisoidaan autoradiografi-sesti.

38 80719 d. Lymfoblastoidi-IFN-cDNA:ta sisältävien lisäkloonien identifiointi

Kuten edellä selostettiin (kohta 4c), osa transfor-manttipesäkkeistä siirretään nitroselluloosasuodattiraille 5 ja niiden kiinnitetylle DNA:lie suoritetaan in situ- pesäkehybridisointi käyttämällä radioaktiivisesti merkittyä cDNArta koettimena, esim. IFN:n suhteen spesifistä cDNA-koetinta. Positiivisesti hybridisoituneiden pesäkkeiden yhdistelmä-DNA-molekyylejä voidaan käyttää sellais-10 ten lisäkloonien seulontaan, joiden yhdistelmä-DNA-mole-kyylit sisältävät saman tai samantyyppisen DNA-liitännäi-sen (esim.IFN:lie sukua olevan sekvenssin).

Tätä tarkoitusta varten jokaisesta ensimmäisessä seulonnassa (kohta 4c) identifioidusta pesäkkeestä eris-15 tetään plasmidi-DNA:t (vastaavat erilaisia IFN-geenejä tai -geenien osia) edelläkuvatulla tavalla ja katkaistaan sellaisilla restriktioendonukleaaseilla, että saadaan aikaan plasmidinosia, jotka sisältävät IFN-cDNA-liitännäi-sen tai sen osan. Kun nämä plasmidiosat on merkitty 20 5'-päistään ja mielenkiinnon kohteena olevat DNA-jaksot (esim. ne, jotka sisältävät radioaktiivisesti merkityn IFN-liitännäisen tai sen osan) eristetty, esim. polyakryyli-amidigeelielektroforeesilla, ne voidaan käyttää joko yksin tai seoksena. Hybridisointia varten transformanttipe-25 säkkeet siirretään nitroselluloosasuodattimille (ks.

edellä) ja hajotetaan. Niiden DNA denaturoidaan ja kiinnitetään suodattimiin in situ ja hybridisoidaan IFN:n suhteen spesifisillä, radioaktiivisesti merkityillä DNA-jaksoilla Grunsteinin ja Hognessin (36) mukaan. Hybridisoituneet 30 pesäkkeet voidaan voidaan visualisoida autoradiografisesti ja poimia erilleen vertailuryhmästä.

Identifioidut pesäkkeet sisältävät sellaisia yhdistel-mä-DNA-molekyylejä, joissa on käytetyn koettimen kanssa identtinen tai samankaltainen cDNA-liitännäinen. Tällä 35 seulonnalla voidaan identifioida sellaisia lisäklooneja 39 8071 9 jotka sisältävät lymfoblastoidi-IFN-a-muodon tai -B-rauodon geenejä tai niiden osia. Jokaisen identifioidun pesäkkeen plasmidi-DNA voidaan eristää ja tunnistaa restrik-tioanalyysillä ja (osittaisella) sekvenssianalyysillä, 5 kuten edellä on kuvattu (kohta 4c).

5. Sellaisten polypeptidien syntetisointi, joilla on HuLylFN:n kaltainen aktiivisuus, käyttämällä E. coli-kantaa, joka sisältää HuLyIFN:n suhteen spesifisiä vhdistelmä-DNA-molekvvleiä 10 Tässä keksinnössä kyseessä olevat HyLylFN-cDNA- liitännäiset on liitetty hybridisoimalla pBR 322:n (ks. edellä) Pst I-kohtaan. Koska pBR 322:n Pst I-kohta on β-laktamaasigeenin sisällä, saattaa olla tuloksena fuusioitunut proteiini, jos cDNA-liitännäinen liitetään 15 tuohon kohtaan oikeassa suunnassa transkription kannalta ja oikeaan lukukehykseen translaation kannalta. Jos liitetyn cDNA:n oma aloitussignaali ja/tai lopetussignaa-li ovat faasissa B-laktamaasisekvenssin kanssa, aloitus ja/tai uudelleenaloitus voi tapahtua myös toisessa 20 aloitussignaalissa ja tuloksena saattaa olla fuusioituma-ton proteiini. Kuitenkin myös ne kloonit ovat arvokkaita, joilla ei ole mitään IFN-aktiivisuutta, vaikka HuLylFN-cDNA on läsnä. Tässä tapauksessa cDNA-liitännäinen voidaan eristää ja liittää ilmnentymisenohjausalueeseen asianmu-25 kaisella tavalla (ks. kohta 7), jotta saadaan tuotetuksi haluttua polypeptidiä suurina pitoisuuksina.

Sellaiset kloonit, jotka sisältävät yhdistelmä-DNA-molekyylin, jossa on HuLylFN-cDNA-liitännäinen, voidaan testata IFN-aktiivisuuden suhteen tavanomaisilla mene-30 telmillä. Esimerkiksi viljelmiä voidaan kasvattaa riittävään solutiheyteen. Solut otetaan talteen, suspendoidaan uudelleen ja hajotetaan (vrt. kohta 1b). Soluista vapautetut uutteet voidaan mitata IFN-aktiivisuuden suhteen käyttämällä esim. sytopaattista biomääritystä (esim. 29).

40 8071 9

Kloonit, jotka tuottavat HuLylFN-aktiivisuuden omaa-via polypeptidejä tyydyttävässä määrin, soveltuvat laajamittaiseen tuotantoon. Klooneja voidaan viljellä ja polypeptidit voidaan ottaa talteen kappaleissa 7 ja 5 8 kuvatulla tavalla.

6. Sellaisten yhdistelmäplasmidien rakentamimen, jotka kykenevät ilmentämään HuLylFN-aktiivisuuden omaavia polypeptidejä suurina pitoisuuksina

Jotta geeni voisi ilmentyä tehokkaasti, sen pitää 10 sijaita oikein ohjausalueen suhteen, transkription aloittaja (promoteri) ja translaation aloittaja (riboso-maalinen sidoskohta) mukaanlukien.

Kuten edellä on selostettu (kohta 3d), plasmidi pBR 322 katkaistiin sopivalla restriktioendonukleaasilla ja 15 liitettiin HuLycDNA:han. Saatua yhdistelmäplasmidi-DNA:ta käytettiin E. coli HB 101:n transformointiin. Jos esimerkiksi restriktioendonukleaasina on käytetty Pst I:tä, tapahtuu HuLycDNArn liittyminen pBR 322:n 8-laktamaasi-geenin sisällä. Lisäksi, jos liittyminen on tapahtunut 20 oikeaan suuntaan ja oikeaan lukukehykseen, voi syntyä fuusioitunut proteiini, joka muodostuu β-laktamaasiket-jun osasta ja sitä seuraavasta HuLylFN-aminohapposekvens-sistä. Jos cDNA ei ole liittynyt oikeaan lukukehykseen ja/tai suuntaan, ei tuloksena olevalla proteiinilla ole 25 mitään IFN-aktiivisuutta. Jos suunta on sopimaton, voidaan plasmidi suunnata uudelleen leikkaamalla cDNA-liitännäi-nen irti sopivalla restriktioendonukleaasilla (tässä keksinnössä voidaan kaikki liitännäiset leikata irti Pst I:llä) ja liittää cDNA ja linearisoitu plasmidi yh-30 teen uudelleen. Saatu hydridiplasmidi voidaan siirtää E. coli HB 101:een, joka puolestaan voidaan tutkia IFN-aktiivisuuden suhteen tavalliseen tapaan.

Jotta HuLylFN-cDNA-liitännäisen ilmentymisteho saataisiin paremmaksi, on tarpeen sijoittaa HuLylFN-cDNA- 41 8071 9 liitännäinen edellämainitun ilmentymisenohjaussekvenssin välittömään läheisyyteen, jotta mitään ylimääräisiä nukleotideja (ja näin ollen aminohappoja) ei edellä geeniä (ja näin ollen HuLylFN-aktiivisuuden omaavaa polypep-5 tidiä). Lisäksi HuLylFN-molekyylien ollessa kyseessä, primääriset translaatiotuotteet ovat esi-interferoneja, jotka sisältävät signaalipeptidejä, jotka ovat liittyneet kypsien interferonien N-päihin. Signaalipeptidisekvens-sit poistuvat translaation jälkeen alkuperäisessä kanta-10 solussa. E. coli ei kuitenkaan pysty poistamaan esi- sekvenssejä proteolyyttisesti. Näin ollen esisekvenssit on edullista poistaa cDNA-liitännäisestä sopivilla menetelmillä (ks. myöhempää selostusta) niin, että primäärinen translaatiotuote on kypsä, interferoninkaltäinen 15 polypeptidi. Tätä tarkoitusta varten kypsää HuLy-interfe-ronia koodittava geeni rekonstruoidaan in vitro ja liitetään uudelleen plasmidiin (liitetään toimivasti) lähelle ilmentymisenohjaussekvenssiä, esim. 6-laktamaasigeenin ilmentymisenohjaussekvenssiä. Yhtä hyvin voidaan käyttää 20 muita ilmentymisenohjaussekvenssejä, mukaanluettuina mm. promoteri ja ribosomaalinen sidoskohta, ja joista voidaan mainita esim. laktoosioperonin, tryptofaanioperonin, arabinoosioperonin tms. ohjaussekvenssi ja λ -faagin N-geeni ja fd-faagin kalvo(ooat)proteiinigeenin vastaavat sek-25 venssit ja muut alalla tunnetut sekvenssit. Ilmentymi-senohjaussekvenssi voidaan liittää plasmidiin, joka jo sisältää cDNA-liitännäisen, tai cDNA voidaan liittää plasmidiin, joka jo sisältää ilmentymisenohjaussekvenssin tai molemmat DNA-jaksot voidaan liittää plasmidi-30 diin perättäisesti.

Esimerkiksi kypsä HuLylFN-cDNA voidaan aäettaä β-laktamaasin ilmentymisenohjausjärjestelmän ohjauksen alaisena. Koska kypsä cDNA-liitännäinen, joka koodittaa kypsää HuLy-interferoninkaltaista polypeptidiä, ei ala ATG-kodonilla, 42 8071 9 joka on tarpeellinen translaation aloittamisen kannalta, pitää ATG-tripletti lisätä synteettisesti. Koska sekä pBR 322:n että HyLyIFN-cDNA:n nukleotidiemässekvenssit ja näin ollen restriktioendonukleaasikaaviot tunnetaan, 5 voidaan soveltaa seuraavaa lähestymistapaa. Plasmidi pBR 322 katkaistaan Pst l:llä β-laktamaasigeenin sisältä ja hajotetaan eksonukleaasilla, esim. Bal 31, jotta β-lak-tamaasia koodittava sekvenssi lyhenee. Vaihoehtoisesti voidaan käyttää E. colin λ-eksonukleaasin (5'-eksonukle-10 aasi) tai 3'-eksonukleaasin ja S1-nukleaasin yhdistelmää yhtä hyvin. Rajattuun plasmidiin liitetään kaksisäikei-nen DNA-sekvenssi, joka voidaan syntetisoida esim. edelläkuvatulla triesterimenetelmällä (kohta 4b). Liitettävä sekvenssi sisältää tarvittavan restriktioendonukleaasin, 15 esim. Bel I (Sau 3A), tunnistuskohdan sekvenssin. Saatu plasmidi jakso katkaistaan liitetylle sekvenssille ominaisella restrik-tioendonukleaasilla (esim. Bel I) ja sen jälkeen EcoR I:llä (plasmidissa pBR 322 on EcoR I-kohta β-laktamaasinilmenty-: misenohjaussekvenssin välittömässä läheisyydessä). Saatu : 20 DNA-jakso, esim. EcoR I - Bel I DNA-jakso, joka oleelli- - sesti ottaen koostuu β-laktamaasin ilmentymisen ohjaus-sekvenssistä (ApPr)ja liitetystä DNA-sekvenssistä, voidaan - eristää polyakryyliamidielektroforeesilla.

Toisaalta HuLylFN-cDNA-liitännäinen voidaan leikata 25 sen sisältävästä yhdistelmä-DNA-molekyylistä (kohta 4d), esim. hajottamalla restriktioendonukleaasilla Pst I. Eristetty HyLylFN-cDNA-liitännäinen katkaistaan vielä toisella restriktioendonukleaasilla (tai tarvittaessa kahdella muulla restriktioendonukleaasilla ja liitetään osittain yhteen), ; : 30 jotta saataisiin poistetuksi se DNA-sekvenssi, joka koodittaa signaalipeptidiä. Saadulla kypsällä HuLylFN-cDNA:11a on lomittainen pää, joko on komple-; mentaarinen edellämainitun ApPr-DNA-jakson suhteen (esim.

lomittainen Sau 3A-pää). Kypsä HuLylFN-cDNA ja ApPr-DNA-35 jakso liitetään yhteen ligaasin avulla tavalliseen tapaan (ks. kohta 3d). Liitoksessa pitää muodostua ATG-kodoni 43 80719 kypsän cDNA:n ensimmäisen kodonin eteen, jotta lukukehys olisi oikea. Saatu hydridi-DNA sisältää β-laktamaa-sin ilmentymisenohjausalueen, ATG-translaationaloituskodo-nin, täydellistä HuLy-interferonia koodittavan DNA-sek-5 venssin ja kaksi restriktioendonukleaasipäätä (esim.

EcoR I-ja Pst I-päät), jotka soveltuvat yhdistelmä-DNA:n liittämiseen plasmidi pBR 322:een, joka on katkaistu vastaavasti.

Saatua hydridiplasmidia voidaan käyttää E. coli 10 HB 101:n transformointiin ja ohjaamaan sellaisten suurten polypeptidipitoisuuksien syntetisoitumista, joilla on HuLylFN-aktiivisuus.

7. Sellaisten kloonien viljely, jotka sisältävät HuLy-interferonin suhteen spesifisiä yhdistelmä-DNA-molekyylejä 15 Tämän keksinnön mukaisesti transformoituja isäntä- soluja voidaan käyttää sellaisten polypeptidien tuotantoon, joilla on HuLy-interferoniaktiivisuus. Mainittujen polypeptidien tuotantomenetelmällä on tunnusomaista se, että transformoitunutta isäntäsolua, varsinkin transformoitua 20 E. coli-kantaa, viljellään nestemäisessä ravinneliemessä, joka sisältää assimiloituvia hiili- ja typpilähteitä sekä epäorgaanisia suoloja.

Voidaan käyttää erilaisia hiililähteitä. Sopivia hii-lilähteitä ovat assimiloituvat hiililähteet, kuten glukoo-25 si, maltoosi, mannitoli tai laktoosi,tai asetaatti, joita voidaan käyttää yksin tai sopivina seoksina. Sopivia typpilähteitä ovat esim. aminohapot, kuten kasaminohapot, peptidit ja proteiinit ja niiden hajoamistuotteet, kuten tryptoni, peptoni tai lihauutteet, ja edelleen hiivauute, 30 mallasuute, maissinliuotusvesi sekä ammoniumsuolat, kuten ammoniumkloridi, -sulfaatti tai -nitraatti, joita voidaan käyttää joko yksin tai sopivina seoksina. Sopivia epäorgaanisia suoloja ovat esim. natriumin, kaliumin, magnesiumin ja kalsiumin sulfaatit, kloridit, fosfaatit ja karbo-35 naatit.

44 8071 9

Ravinneliemi voi sisältää lisäksi kasvua edistäviä aineita ja/tai aineita, jotka aiheuttavat valintapainetta, jotta HuLyIFN:n suhteen spesifistä yhdistelmä-DNA-mole-kyyliä ei menetettäisi. Sopivia kasvunedistämisaineita 5 ovat esim. hivenaineet, kuten rauta, sinkki, mangaani tms., tai yksittäiset aminohapot. HuLylFN-aktiivisuuden omaavan polypeptidiä koodattavan geenin lisäksi tässä keksinnössä käytettävät yhdistelmä-DNA-molekyylit sisältävät mielellään myös sellaisen geenin, joka antaa vastustuskyvyn antibiootin suh-10 teen, esim. ampisilliinin ja/tai tetrasykliinin suhteen. Jos ravinneliemeen lisätään tällaista antibioottia, kyseessä olevan yhdistelmä-DNA:n sisältävät solut säilyvät hengissä ja kasvavat, kun taas mainitun yhdistelmä-DNA:n menettäneet solut tai vieraat, antibiootille sensitiivi-15 set kontaminoivat solut eivät säily elossa.

Viljely suoritetaan tavanomaisilla menetelmillä. Viljelyolosuhteet, kuten lämpötila, ravinneliemen pH ja käymisaika valitaan siten, että interferoninkaltaisten polypeptidien tuotanto saavuttaa maksimaalisen tason.

20 Valittua E. coli-kantaa kasvatetaan mielellään aerobisissa olosuhteissa pinnanalaisviljelmänä ravistellen tai sekoittaen lämpötilassa, joka on välillä noin 20 - 40 °C, mielellään noin 30 °C, pH-arvossa 4-9, mielellään 7, noin 4-20 tuntia, mielellään 8-12 tuntia. Viljelyn 25 tuloksena interferoninkaltaiset polypeptidit kertyvät solujen sisälle.

8. IFN-aktiivisuuden omaavien polypeptidien eristäminen ja puhdistaminen Tämän keksinnön mukaiset ihmisen lymfoblastoidi-30 interferonit voidaan ottaa talteen kasvuliemestä siten, että mainitut polypeptidit vapautetaan transformoituneista isäntäsoluista ja puhdistetaan.

Kun transformoituneita E. coli-soluja on kasvatettu tyydyttävään solutiheyteen, vapautetaan talteenoton en- 45 8071 9 siitunäisessä vaiheessa ilmentyneet polypeptidit solujen sisältä. Tätä tarkoitusta varten solut rikotaan käsittelemällä pinta-aktiivisella aineella, kuten SDS tai Triton. Vaihtoehtoisesti voidaan solujen rikkomi-5 sessa käyttää mekaanisia voimia, kuten hankausvoimia (esim. X-puristin, French press-puristin) tai ravistelua lasikuulien tai alumiinioksidin kanssa. Saatu poly-peptidiseos voidaan rikastaa ihmisen LyIFN:n suhteen tavallisilla menetelmillä, kuten saostamalla ammoniumsulfaa-10 tiliä tai trikloorietikkahapolla, tai käyttämällä apuna geelielektroforeesia, dialyysiä, kromatografiaa, esim. ioninvaihtokromabografiaa, geelisuodatusta (size exclusion chromatography) tai käänteisfaasi-HPLC:tä tms. Esipuhdistetun tuotteen lopullinen puhdistus voidaan suorittaa esim. käyttämällä 15 vasta-aineaffiniteettikromatografiaa. Periaatteessa puhdisti® voidaan suorittaa menetelmällä, jonka Staehelin et ai. (51) ovat kehittäneet ihmisen leukosyytti-interferonin puhdistusta varten.

Ihmisen LylFN voidaan eristää ja puhdistaa esim.

20 seuraavissa vaiheissa: (1) E. coli-solut lyysoidaan.

(2) Osa muusta kuin proteiiniluonteisesta materiaalista poistetaan polyetyleeni-imiinikäsittelyllä.

(3) Polypeptidit saostetaan kyllästämällä liuos ammonium-25 sulfaatilla.

(4) Dialysoidaan sopivassa puskuriseoksessa.

(5) Suoritetaan pylväskromatografinen erotus DEAE-sellu-loosalla.

(6) Suoritetaan affiniteettikromatografinen erotus mono-30 klonaalisessa vasta-ainepylväässä.

(S) (7) Molekyylit erotetaan koon mukaan sopivassa Sephadex^-pylväässä.

Jotta saataisiin aikaan riittävän puhdas tuote, voivat lisäpuhdiStusvaiheet osoittautua tarpeellisiksi, ku-35 ten kationin- tai anioninvaihtokromatografia, adsorptio 46 8071 9 hydroksyyliapatiitille, käänteisfaasi-HPLC jne. Toisaalta voidaan yksi tai useampia edellämainituista vaiheista jättää pois, mikäli mahdollista, tai vaiheiden järjestystä voidaan muuttaa.

Tämän keksinnön mukaisesti valmistettujen polypepti-dien osia ja johdannaisia, esim. proteolyyttisesti hajotettuja polypeptidejä, täysin tai osittain suojattuja, esim. asyloituja, silyloituja ja varsinkin glykosyloituja polypeptidejä ja niiden suoloja valmistetaan tavanomaisilla menetelmillä.

Erityisesti keksintö koskee menetelmää olennaisesti puhtaassa muodossa olevien polypeptidien valmistamiseksi käyttäen DNA-molekyylejä, jotka ovat oleellisesti ottaen puhtaassa muodossa, ja varsinkin esimerkeissä esitettyä menetelmää polypeptidien valmistamiseksi käyttäen esimerkeissä esitettyjä DNA-sekvenssejä ja transformoituneita isäntäsoluj a.

Tämän keksinnön mukaisia polypeptidejä ja niiden sopivia johdannaisia, esim. glykosyloituja tuotteita, käyte-: tään samaan tapaan kuin tunnettuja interferoneja ihmisen virusinfektioiden, kasvainten ja syöpämuotojen hoidossa mahdollisesti yhdessä muiden virus-, kasvain- tai syöpälääkkeiden kanssa mielellään farmaseuttisten valmisteiden muodossa, jotka sisältävät tehokkaan määrän vaikuttavaa ainetta yhdessä epäorgaanisten tai orgaanisten, kiinteiden tai nestemäisten kantaja-aineiden kanssa, jotka soveltuvat mielellään parenteraaliseen antomuotoon.

Mainittuja farmakologisesti aktiivisia yhdisteitä käytetään mielellään parenteraaliseen antotapaan, esim. intramuskulaariseen tai intravenoosiseen antotapaan, soveltuvina valmisteina tai infuusioliuoksina. Tällaiset liuokset ovat mielellään isotonisia vesiliuoksia tai suspensioita, jotka voidaan valmistaa käyttömuotoon esim. lyofilisoiduista valmisteista, jotka sisältävät vaikutta- 47 8071 9 vaa ainetta yksin tai yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantaja-aineen kanssa. Farmaseuttiset valmisteet voidaan steriloida ja/tai ne voivat sisältää lisäaineita, esim. säilöntäaineita, stabilointiaineita, kostutusainei-ta ja/tai emulgointiaineita, liuotusaineita, osmoottisen paineen säätöaineita ja/tai puskurointiaineita. Nämä farmaseuttiset valmisteet, jotka voivat haluttaessa sisältää myös muita farmakologisesti arvokkaita aineita, valmistetaan sinänsä tunnetulla tavalla esim. tavanomaisilla liuotus- tai lyofilisointimenetelmillä ja ne sisältävät noin 0. 1 - 100 %, varsinkin noin 1 - noin 50 %, ja lyofilisaat-tien tapauksessa korkeintaan 100 % vaikuttavaa ainetta.

Riippuen sairauden laadusta ja potilaan tilasta annetaan valmisteita tavallisesti esim. intramuskulaarises-ti, 1 - 3 kertaa vuorokaudessa annoksina, joiden suuruus on noin 10® - 107 yksikköä.

Keksintöä valaistaan seuraavilla esimerkeillä.

Esimerkeissä käytetään seuraavia lyhenteitä:

EtBr: etidiumbromidi BSA: naudan seerumialbumiini DTT: 1,4-ditiotreitoli (1,4-dimerkapto-2,3-butaani- dioli) EDTA: etyleenidiamiinitetraetikkahappo SDS: natriumdodekyylisulfaatti

TNE: liuos, joka sisältää 100 mM NaCl, 50 mM

Tris-HCl (pH 7,5) ja 5 mM EDTA Tris (Trizma): tris-/hydroksimetyyli)aminometaani Tris*HCl: Tris:n monohydrokloridi 1. Poly(A)-RNA:n suhteen rikastetun HuIFN-mRNA:n eristäminen (kuva 1) a) Namalwa-solujen indusointl 4β 8071 9

Namalwa-soluja kasvatetaan 37 °C:ssa RPMI 1640-ravinne-liemessä, joka sisältää 10 % vasikan sikiön seerumia.

g

Kun solutiheys on saavuttanut arvon 3*10 solua/ml, suspensiota sentrifugoidaan 10 minuuttia nopeudella 5 800 x g. Talteenotetut solut suspendoidaan uudelleen 200 ml:aan ravinnelientä, joka sisältää glutamiinia (0,027 ti-lavuus-%), penisilliiniä (200 yks./ml) ja streptomysiiniä (50 yg/ml). Soluja inkuboidaan 90 minuuttia 37 °C:ssa Newcastle-sairausviruksen (NDV 110) kanssa suhteessa 10 190 HAU/10^ solua (HAU: hemagglutinaatioyksikköä). Li säämällä tuoretta ravinnelientä solutiheys säädetään arvoon 1,3*10^ solua/ml ja solususpensiota ravistellaan 34°C:ssa nopeudella 100 1/min. 12 tunnin kuluttua kerätään tal- 9 teen 6*10 solua ja suspendoidaan uudelleen 50 ml:aan fos-15 faatilla puskuroitua suolaliuosta ("PBS": 1 1 PBS:ää sisältää 80 g NaCl, 2 g KC1, 14,4 g Na2HPC>4 ja 2 g KH2PO4). Ennen solujen talteenottoa otetaan näyte ja siitä määritetään interferoniaktiivisuus Armstrongin (29) menetelmällä käyttämällä ihmisen CCL-23-soluja ja 20 vesikuläärisen stomatitiksen virusta (VSV) ärsytysviruksena. Aktiivisuudeksi saadaan 4300 IFN-yksikköä/ml.

b) Solujen rikkominen ja deproteinisointi

Solususpensio (6*10 solua 50 ml:ssa PBS) lisätään huoneenlämpötilassa 800 ml:aan hajotuspuskuria, joka si-25 sältää 0,05 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 M NaCl, 5 mM EDTA

ja 2 % SDS (kiteinen tutkimuslaatu, Serva). Lysaatti hajotetaan huoneenlämpötilassa sekoittamalla 1 tunti esi-inkuboidun (2 tuntia 37 °C:ssa) proteaasin (0,2 mg/ml) (Protease P, type VI, Sigma) kanssa. Liuos deproteini-30 soidaan uuttamalla 3 kertaa 500 ml :11a fenolia, joka on kyllästetty TNE:llä, ja 5 kertaa 500 ml:11a kloroformia.

Näin saadaan 500 mg nukleiinihappoja, kun määritetään mittaamalla absorbanssi allonpituudella 260 nm.

49 8071 9 c) Epäpuhtauksina olevan DNA;n ja RNA:n poistaminen

Edellä saadun (kohta 1b) hieman viskoosisen vesi-liuoksen NaCl-pitoisuus säädetään 0,3 M:ksi ja lisätään 1 g oligo(dT)-selluloosaa (tyyppi 7, P-L Biochemicals).

5 Kun suspensiota on sekoitettu 30 minuuttia huoneenlämpö-tilassa, suspensiota sentrifugoidaan 1 1 Sorvall-pulloissa Sorvali RC-3-sentrifugissa huoneenlämpötilassa nopeudella 4000 1/min 10 minuuttia ja oligo(dT)-selluloosaliete pestään kahdesti 40 ml:11a 2 x TNE:tä, joka sisältää 0,5 % 10 SDStää. Sitten sitoutunut poly(A)-RNA eluoidaan pesemällä 5 kertaa peräkkäisesti 2,5 ml :11a vettä. Saanto on 720 yg poly(A)-RNA:ta optisen tiheyden perusteella määritettynä. Kun ensimmäisessä adsorptiossa saadun emäliuo-sen sisältämä RNA adsorboidaan toisen kerran 1 g:aan 15 oligo(dT)-selluloosaa ja eluoidaan edelläkuvatulla tavalla, saadaan 320 yg poly(A)-RNA:ta. Eluaatit kerätään yhteen, TNE-pitoisuus säädetään ja poly(A)-RNA saostetaan 67-prosenttisella etanolilla käsittelemällä 10 tuntia -20°C:ssa. RNA otetaan talteen sentrifugoimalla tO minuuttia 0°C:ssa 20 nopeudella 10 000 1/min Sorwall RC-5B-sentrifugissa.

Sakka (1 mg) liuotetaan uudestaan 1 ml:aan 1mM EDTA.

RNA:n HuIFN-mRNA-aktiivisuus määritetään injektoimalla Xenopus laevis-sammakon varhaismunasoluihin seu-raavalla tavalla.

25 50 nl RNA-liuosta injektoidaan jokaiseen 20 varhais- munasoluun. Varhaismunasoluja inkuboidaan Barth-liemes-sä (2mM Tris, 88 mM NaCl, 1 mM KC1, 0,33 mM Ca(N03) 2-Η,,Ο, 0,41 mM CaCl2-2H20, 0,82 mM MgSC>4*7H20, 2,4 mM NaHCC>3, 0,01 mg/ml penisilliiniä, 0,01 mg/ml streptomysiiniä; 30 liuoksen pH on säädetty suolahapolla arvoon 7,6) menetelmän Gurdon (42) , Barth (43) ja Colman et ai. (30) mukaisesti. Injektoituja varhaismunasoluja inkuboidaan 42-48 tuntia ja inkubointiväliaine poistetaan sentrifugoimalla 5 minuuttia Eppendorf-sentrifugissa ja emäliuosta 35 säilytetään -20 - - 80 °C:ssa, kunnes se käytetään määritykseen. IFN-aktiivisuus määritetään oleellisesti ottaen so 8071 9

Armstrongin menetelmän (29) mukaisesti, mutta VSV-virusta käytetään ärsytysviruksena Hep-2-solujen suhteen (Flow Laboratories). Varhaismunasolu-uutteen ominaisaktiivi-suus on 600 IU interferonia per yg injektoitua RNA:ta.

5 d) Poly(A)-RNA:n rikastaminen HuIFN-mRNA;n suhteen Poly(A)-RNA lasketaan Chelex-100-pylvään läpi (200-400 mesh, Bio-Rad) , jonka pakattu tilavuus on 0,5 ml. Pylväs huuhdotaan 1 ml:11a 1 mM EDTA:ta.

Eluaattia (1 mg poly(A)-RNA:ta per 2 ml EDTA:ta) kuu-10 mennetaan 2 minuuttia 100 °C:ssa ja sen jälkeen sentri-fugoidaan sakkaroositiheysgradientin läpi (6 kpl 14 ml:n sakkaroosiliuoksia, joiden sakkaroosipitoisuus on välillä 5 - 23 % (paino/tilav.), ja jotka sisältävät 50 mM Tris.HCl (pH 7,5), 0,2 M NaCl ja 1mM EDTA). Sentrifu-15 gointi suoritetaan TST 41-roottorissa (Kontron AG) nopeudella 35 000 1/min 16 tuntia 5 °C:ssa. 0,3 ml:n jakeet kootaan ISCO-gradientinkerääjällä. Jokaiseen ja-keeseen lisätään 2 tilavuutta etanolia ja liuosten annetaan seisoa 10 tuntia -20°C:ssa. Saostunut mRNA : 20 sentrifugoidaan talteen (Sorvali, HB-4-roottori, 0°C, : 10 000 1/min, 10 min). Jokaisen jakeen sakka liuotetaan uudelleen 25 yl:aan 1mM EDTA:ta ja jokainen jae tut-: kitaan IFN-mRNA-aktiivisuuden suhteen edelläkuvatulla ta valla (kohta 1c), mutta RNA-näytettä kohti injektoidaan 25 10 varhaismunasolua eikä 20. Saadut tulokset on esitetty taulukossa 1.

si 8071 9

Taulukko 1;

Sakkaroositiheysgradienttifraktioinnissa saatujen jakeiden HuIFN-mRNA-aktiivisuudet jae no IFN-aktiivisuus __(yksikköä/ml)_ 1-18 19 162 20 162 21 162 22 162 23 ei tutkittu 24 729 25 ei tutkittu 26 405 27 ei tutkittu 28 486 29 ei tutkittu 30 162 31 ei tutkittu 32 162 33 ei tutkittu 34 54 35 - 40 ei tutkittu __

Jakeet 23-29 kootaan yhteen ja poly(A)-RNA puhdis-5 tetaan seuraavalla tavalla:

Poly(A)-RNA-liuos säädetään 2 x TNE-pitoisuuteen 0,5 % SDSrssä ja siirretään 200 yl:n oligo(dT)-selluloo-sapylvääseen. Pylväs pestään 2 ml:11a 2 x TNE:tä (0,5 % SDS:ssä) ja poly(A)-RNA eluoidaan pesemällä 5 kertaa 10 0,5 ml:11a vettä. Eluaatti säädetään TNE-pitoisuuteen 52 8071 9 ja liuos uutetaan kahdesti yhtä suurella tilavuudella fenolia (kyllästetty TNErhen) ja kahdesti yhtä suurella tilavuudella kloroformia. Poly(A)-RNA saostetaan 2 tilavuudella etanolia käsittelemällä 10 tuntia - 20 °C:ssa 5 ja kerätään talteen sentrifugoimalla HB-4-roottorilla samoin kuin edellä.

Poly(A)-RNA liuotetaan 100 yl:aan 0,5 mM EDTA:ta. Saanto on 40 yg optisen tiheyden perusteella mittaamalla. Osa poly(A)-RNA:sta käytetään ihmisen IFN-aktiivisuu-10 den määritykseen edelläkuvatulla tavalla käyttämällä 20 varhaismunasolua mittausta kohden. Poly(A)-RNA-valmisteen ominaisaktiivisuus on 8100 IU interferonia per yg RNA:ta.

2. Kaksisäikeisen cDNA:n valmistus (kuva 1) 15 HuIFN-mRNA:n suhteen rikastettua poly(A)-RNA:ta (Ks. vaihe 1d) käytetään mallina valmistettaessa kaksi-säikeistä cDNA:ta oleellisesti ottaen siten, kuin Efstratiadis et ai. (44), Maniatis et ai. (45) ja Hoeijmakers et ai. (46) ovat kuvanneet.

20 a) Ensimmäisen säikeen syntetisointi 250 yl reaktioseosta, joka sisältää 40 mM Tris-HCl (pH 7,5), 30 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT (Calbiochem.), 1 mM dGTP, dCTP, dTTP (P-L Biochemicals) ja 1 mM 3 2 P-dATP (Amersham, ominaisaktiivisuus 50 000 1/min per 25 nmol), 20 yg/ml oligo(dT)^2_^g (P-L Biochemicals), 40 y g/ml poly(A)-RNA ja 100 yksikköä lintumyeloblastosis-viruksen (AMV) käänteiskopioijaentsyymiä (life Sciences, Inc., St. Petersburg, Florida), inkuboidaan 80 minuuttia 37 °C:ssa. Reaktio katkaistaan säätämällä liuoksen pitoi-30 suudeksi 10 mM EDTA ja 0,1 % SDS. Seos uutetaan kerran 1 tilavuudellaan fenolia. Vesifaasi uutetaan uudelleen 1 tilavuudellaan kloroformia ja siirretään 3 ml:n Sephadex G-50-pylvääseen (Pharmacia, hieno). Kerätään 0,1 ml jakeet. Jokaisen jakeen radioaktiivisuus mitataan 53 8071 9 mittaamalla Cerenkov-säteily. Radioaktiiviset jakeet kerätään yhteen ja nukleiinihapot seostetaan 2 tilavuudella etanolia käsittelemällä 10 tuntia - 20 °C:ssa. Näytettä sentrifugoidaan HB-4-roottorilla 20 minuuttia 5 0°C:ssa 10 000 1/min nopeudella. Sakka liuotetaan 95 Uljaan vettä. Lisätään 5 μΐ 10N natriumhydroksidia ja seosta inkuboidaan 40 minuuttia 25 °C:ssa. Neutraloidaan 5M etikkahapolla, lisätään 50u1 vettä ja 2 tilavuutta etanolia ja näytettä säilytetään 10 tuntia - 20 °C:ssa.

10 Sakka otetaan talteen sentrifugoimalla edelläkuvatulla tavalla ja liuotetaan uudelleen 200 yl:aan 0,1 mTT EDTA. Yksisäikeisen cDNA:n saanto on 3,7 yg. cDNA:n pituudeksi saatiin 700 - 1500 nukleotidia, kun määritys suoritettiin elektroforeettisen liikkuvuuden perusteella 15 6-prosenttisessa polyakryyliamidigeelissä Tris-boraatti-EDTArssa (108 g Tris, 9,3 g dinatriumEDTA ja 55 g boori-happoa per 1 1 liuosta, pH 8,3), joka sisälsi 7 M virtsa-ainetta, suhteessa tunnetunpituisiin DNA-merkkei-hin (32) .

20 b) Toisen säikeen syntetisointi ja S^-endonukleaasilla tapahtuva hajotus

Saatu cDNA-liuos kuumennetaan 90 sekunniksi 100 °C:een, jäähdytetään ja inkuboidaan 400 ylrssa reaktioseosta, jossa on 0,1 mM kaliumfosfaattipuskuria (pH 6,9),

25 10 mM MgCl2, 10 mM DTT (Calbiochem), 1 mM dATP, 1 mM

dCTP, 1 mM dTTP (P-L Biochemicals), 1 mM 3H-dGTP (Amersham, ominaisaktiivisuus 94 000 1/min per nmol) ja 165 yksikköä/ml E. coli:n DNA-polymeraasi I:tä (Biolabs,

New England), 8 tuntia 15 °C:ssa. Reaktio katkaistaan 30 lisäämällä EDTA:ta ja SFS:ää niin, että loppuväkevyyk-siksi tulee 10 mM ja 0,1 % vastaavasti. Seos uutetaan fenolilla ja kloroformilla, kromatografoidaan Sephadex G-50:llä (Pharmacia, hieno, pakattu tilavuus 2 ml) ja saostetaan etanolilla kuten edellä on kuvattu (vaihe 2a).

54 8071 9

Saatua DNA:ta käsitellään 50 yl:ssa inkubointiseosta, joka sisältää 0,25 M NaCl, 50 mM natriumasetaattia (pH

4,5) ja 1 mM ZnSO^, 6 yksiköllä -endonukleaasia (P-L Biochemicals) 37 °C:ssa 30 minuuttia. Reaktio katkais-5 taan säätämällä liuoksen pitoisuudeksi 0,1 % SDS ja 10 mM EDTA. Reaktioseos deproteinisoidaan 1 tilavuudella fe nolia (kyllästetty natriumasetaattiin (50 mM), pH 4,5) ja kloroformia. Vesifaasi kromatografoidaan 2 ml:n Sephadex G-50-pylväässä (Pharmacia, hieno) TNE:ssä.

10 Kerätään 100 pl jakeet ja jokaisesta jakeesta määritetään Cerenkov-säteily. Valitut jakeet kerätään yhteen ja DNA saostetaan 2 tilavuudella etanolia käsittelemällä 10 tuntia - 20 °C:ssa,kuten edellä on kuvattu. Sakka sentri-fugoidaan HB-4-roottorissa (ks. edellä) ja liuotetaan 15 100 yl:aan liuosta, joka sisältää 10 mM Tris*HCl (pH 7,5) ja 0,5 mM EDTA. Näin saadaan 4 yg DNA:ta.

DNA fraktioidaan sakkaroositiheysgradientin (5 - 23 %) läpi liuoksessa, jossa on 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) ja 1 mM EDTA, TST-60 roottorissa (Kontron AG). Sentrifu-20 gointi tapahtuu nopeudella 55 000 1/min 5 tunnissa 15 °C:ssa. DNA, joka laskeutuu nopeammin kuin merkkinä käytetty 800 emäsparia sisältävä DNA, joka ajetaan rinnakkaisgra-dientissa, kootaan yhteen, säädetään TNE-pitoisuuteen ja saostetaan 67-prosenttisella etanolilla käsittelemällä 25 10 tuntia -20 °C:ssa. Näin saadaan 0,4 yg kaksisäikeistä cDNA:ta.

3. Yhteenliitetyn pBR 322-cDNA-yhdistelmän valmista-minen (kuva 1) a) dCMP:llä pidennetyn cDNA:n valmistaminen 30 0,1 yg:aan saatua kaksisäikeistä cDNA:ta liitetään ' 3'-päihin poly(dc)-hännät 10 yl:n reaktiotilavuudessa,

jossa on 100 mM natriumkakodylaattia (pH 7,2), 2,5 mM

55 8071 9

CoCl2, 50 yg BSA (Calbiochem.) per ml, 1 mM cCTP ja 10 yksikköä terminaalista deoksinukleotadyylitransfe-raasia (P-L Biochemicals) per yg kaksisäikeistä cDNArta. Kun οή:’. inkuboitu 20 minuuttia 27 °C:ssa, lisätään- EDTA: 5 ta 10 mM pitoisuuteen ja näytettä säilytetään" -20 °C:ssa käyttöön asti.

b) Pst I:llä katkaistun, dGMP:llä pidennetyn pBR 322;n valmistus 10 yg pBR 322-plasmidi-DNA:ta hajotetaan 1 tunnin 10 ajan 37 °C:ssa 10 yksiköllä Pst I-endonukleaasia (Biolabs) 100 yl:ssa liuosta, jossa on 50 mM NaCl, 6 mM Tris. HC1 (pH 7,5), 6 mM MgCl2, 6 mM 2-merkaptoetanolia ja 100 yg/ml gelatiinia. Liuos uutetaan 1 tilavuudella fenolia ja kloroformia. Liuos säädetään TNE-pitoisuu-15 teen ja linearisoitunut DNA saostetaan 2 tilavuudella etanolia -20 °C:ssa 5 tunnin aikana.

Linearisoitu plasmidi-DNA pidennetään dGMPrllä 200 yl:n reaktiotilavuudessa, jossa on 100 mM natriumkako-dylaattia (pH 7,2) , 5 mM MgCl2, 20 mM NaH^O^, 50yg 20 BSA per ml, 1 mM dGTP ja 100 yksikköä terminaalista deoksinukleotidyylitransferaasia (P-L Biochemicals).

Kun on inkuboitu 20 minuuttia 37 °C:ssa, lisätään EDTA:ta pitoisuuteen 10 mM ja reaktioseos jäädytetään - 20 °C:een myöhempää käyttöä varten.

25 c) dGMP:llä pidennetyn pBR 322:n liittäminen dCMPillä pidennettyyn kaksisäikeiseen cDNA:han

Seosta, jossa on dCMPillä pidennettyä kaksisäikeistä cDNA:ta (0,1 yg) ja dGMP-hännillä varustettua lineari-soitua pBR 322:ta (0,5 yg) 500 yl:ssa TNE-puskuria, in-30 kuboidaan 1 tunti 65 °C:ssa, 1 tunti 46 °C:ssa, 1 tunti 37 °C:ssa ja 1 tunti 20 °C:ssa. pBR 322-cDNA-yhdistel-män sisältävä liuos sijoitetaan jäähän ja käytetään välittömästi transformointiin.

56 8071 9 4. E. coli HB 101:n transformointi hydridiplasmidilla

Kalsiumilla käsitelty E.coli HB 101 valmistetaan transformointiin menetelmällä Mandel et ai. (35).

10 yl reaktioseosta, joka sisältää pBR 322-DNA-5 yhdistelraäplasmidit (valmistettu edellä vaiheessa 3c), lisätään seokseen, joka sisältää 150 yl kalsiumilla käsiteltyä E. coli HB 101:tä 200 yl:n kokonaistilavuudessa, jossa on 10 mM MgC^# 01 mM CaC^ ja 10 mM Tris.HCl (pH 7,5).

10 Seosta jäähdytetään jäässä 20 minuuttia, kuumenne taan 42 °C:een 1 minuutin ajaksi ja inkuboidaan 10 minuuttia 20 °C:ssa. Seokseen lisätään 1 ml tryptonilientä (tryptoniliemi sisältää 10 g Bacto-Tryptonia (Difco); 1 g hiivauutetta (Dufco); 1 g glukoosia, 8 g NaCl ja 15 294 mg CaCl2*2H20 1 litrassa tislattua vettä) ja inku boidaan 30 minuuttia 37 °C:ssa nopeudella 300 1/min ravistellen. Seos levitetään 2 agarlevylle (McConKey-agar, Difco; 0,6 ml/levy), joihin on lisätty 10 yg/ml tetrasykliiniä (Sigma). Levyjä inkuboidaan 12 - 17 20 tuntia 37 °C;ssa. Näin saadaan noin 5600 tetrasyklii-nille resistanttia E. coli HB 101-pesäkkettä.

5. HuIFN-DNA;ta sisältävien kloonien identifiointi a) 13-meerisen oligodeoksinukleotidialukkeen synteti-sointi (kuva 2) 25 Oligodeoksinukleotidi, joka on komplementaarinen sille 13 nukleotidin ketjulle, joka on sama sekä HulFN-a^:n että HuIFN-β:n mRNA:ssa, syntetisoidaan kemiallisesti fosfodiesterimenetelmällä (vrt. Itakura et. ai (38), de Rooij et ai. (39)). Synteesin yksittäisvaiheet 30 on esitetty kaaviollisesti kuvassa 2. Kuvan 2 rivillä 1 esitetyt lähtöaineet (mono- ja dideoksinukleotidit, joissa on suojaryhmät) tunnetaan ennestään kirjallisuudesta. Suojaryhmät lohkaistaan Itakura et al:n kuvaamalla menetelmällä: 5'-monometoksitrityylillä (M) tai 35 dimetoksitrityylillä (D) substituoiduista hydroksyyli- ryhmistä poistetaan suojau's etikkahapolla (80 %) huoneen- 57 8071 9 lämpötilassa ja B-syanoetyylifosfaattiryhmät lohkaistaan 0,1 N natriumhydroksidilla dioksaani-vesiseoksessa (4:1) huoneenlämpötilassa. Rakenneryhmien kondensointi suoritetaan käyttämällä tri-isopropyylibentseenisulfonyyli-5 kloridia aktivointiaineena aina täydelliseen suojattuun 13-meeriseen alukkeeseen asti, joka on esitetty kuvan 2 rivillä 7. Viimeinen vaihe (kaikkien suojaryhmien täydellinen poisto) suoritetaan seuraavalla tavalla:

Liuokseen, jossa on 64,6 mg täysin suojattua 13-10 meeristä oligodeoksinukleotidia dioksaanin (3 ml) ja asetonitriilin (1 ml) seoksessa, lisätään 200 mg syn-p- 113 3 nitrobentsaldoksiimia ja 124 mg N ,N ,N ,N -tetrametyyli-guanidiinia ja annetaan seisoa 27 tuntia. Lisätään 10 ml ammoniakkia (25 %) ja liuosta säilytetään 24 tun-15 tia 50 °C:ssa. Kun liuotin on haihdutettu pois vakuumis-sa, jäännös liuotetaan veteen, pH säädetään etikkahapolla arvoon 4 ja uutetaan 20 kertaa kloroformilla. Vesiliuos haihdutetaan vakuumissa ja jäännös liuotetaan 1 ml:aan etikkahappoa (80 %). Liuoksen annetaan seisoa 1 tunti, 20 laimennetaan 6 ml:11a vettä, uutetaan 3 kertaa kloroformilla ja lyofilisoidaan. Kol^sosa saadusta raakatuot-teesta puhdistetaan kromatografisesti DEAE-Sephadex A 25:llä (pylvään koko 10 x 1,3 cm) käyttämällä 200 ml 0,2 - 1,2 M trietyyliammoniumbikarbonaattigradienttia.

25 Pääjae eluoituu gradienttikonsentraatiossa 0,87 M. Pää-jae, joka muodostuu puhtaasta tuotteesta HPLC-testin mukaan, haihdutetaan 3 kertaa veden kanssa, suodatetaan Dowex 50 W:n (NH^-suola) (10 ml) läpi ja lyofilisoidaan. HPLC (permaphase AAX, pylvään koko 90 x 0,3 cm, 60 °C, 30 2 ml/min; gradientti: A = 0,005 M KH2PC>4, B = 0,5 KH2P04, 0,5 M KC1, pH 4,5; 20 % A-> 100 % B 30 mi nuutissa) : tn 11,8 min.

32 b) P:llä merkityn, ihmisen IFN-ot- ja IFN-B-muodolle spesifisen cDNA-koettimen valmistus (kuva 3) 35 40 pmol synteettistä 13-meeristä oligodeoksinukleo- - 32 - tidialuketta (vrt. vaihe 5a) ja 40 pmol (_γ- P/-ATP:tä 58 8071 9 (5700 Ci/mmol, Aitiersham) liitetään yhteen 100 yl:ssa reaktioseosta, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 9,5), 10 mM MgCl2 ja 5 mM DTT. Lisätään 50 yksikköä T4~polynuk-leotidikinaasia (P-L Biochemicals), ja kun on inkuboitu 5 30 minuuttia 37 °C:ssa, lisätään vielä 20 yksikköä ent

syymiä ja inkubointia jatketaan vielä 15 minuuttia 37 °C:ssa. Vesiliuos, joka sisältää P:llä merkityn alukkeen, puhdistetaan fenolilla uuttamalla. Jatko-puhdistus suoritetaan kromatografisesti 4 ml:n Sephadex 10 G-50-pylväässä (Pharmacia, fine) 1 mM Tris.HCl:ssä (pH

8,0). Kerätään 0,1 ml jakeet. Jokaisen jakeen radioaktiivisuus määritetään mittaamalla Cerenkov-säteily.

Ominaiskatiivisuudeksi saadaan 4.10^ Cerenkov-sykäystä 32

minuutissa per pmol oligodeoksinukleotidia. P:llä 15 merkitty aluke (40 pmol) lyofilisoidaan, suspendoi-daan uudestaan 91 yl:aan vettä, joka sisältää 14 yg poly(A)-RNA:ta (indusoiduista Namalwa-soluista, valmistettu vaiheessa 1 kuvatulla tavalla) ja kuumennetaan 60 sekuntia 100 °C:ssa. 9 yl 4 M KCl lisätään ja seosta 20 inkuboidaan 60 minuuttia 25 °C:ssa. Lisätään 450 yl käänteiskopioijaentsyymiseosta niin, että reaktiotila-vuus sisältää 40 mM Tris.HCl (pH 8), 4 mM MgC^» 1mM f DTT (Calbiochem, Inc.). 74 mM KCl, dATP, dGTP, dCTP, dTTP

(P-L Biochemicals) 1mM kutakin ja 90 yksikköä linnun ' 25 myeloblastosisviruskäänteiskopioijaentsyymiä (AMV). In- kubointia jatketaan 1 tunti 37 °C:ssa. Liuos uutetaan 1 tilavuudella fenolia (kyllästetty TNErhen) ja nukleiinihapot saostetaan 2 tilavuudella etanolia -20 °C:ssa 10 tunnin kuluessa. Sakka sentrifugoidaan talteen 30 (HB-4-roottori, 20 min, 10 000 1/min, 0°C) ja liuotetaan 20 yl:aan väriaineseosta, joka sisältää 90 % (tilav/tilav) formamidia (Merck, pro analysis), 1 mM EDTA, 0,05 % bromi-fenolisinistä ja 0,05 % ksyleenisyanolisinistä. Näy-... tettä kuumennetaan 2 minuuttia 90 °C:ssa ja sitten se 35 siirretään 5 % polyakryyliamidigeelille, joka on tehty

Tris-boraatti-EDTA:han (ks. Peacock et ai. (32)). Auto- 59 8071 9 radiogrammissa voidaan nähdä yksi kaista, joka liikkuu 32 267 ja 435 emäsparia sisältävien P:lla merkittyjen DNA-merkkiainejaksojen välissä, jotka on saatu hajottamalla plasmidi pBR 322 Hae 111:11a. ^2P:llä merkitty 5 cDNA-jakso uutetaan geelistä ja puhdistetaan Mueller et ai:n (47) kuvaamalla tavalla. Näin saadaan 32 P:llä merkitty ihmisen IFN-α- ja IFN-8-muodon suhteen spesifinen cDNA-koetin.

c) HuIFN-cDNA:ta sisältävien pesäkkeiden seulonta 10 (kuva 3) 1650 edelläkuvatulla tavalla (vaihe 4) valmistettua transformanttipesäkettä siirrettiin nitroselluloosa-suotimille BA 85 (Schleicher & Schuell, halkaisija 8 cm). Solut hajotetaan ja niiden DNA denaturoidaan ja kiinni-15 tetään suotimiin in situ noudattamalla Grunsteinin ja Hognessin menetelmää (36). Suotimilla olevat pesäkkeet esihybridisoidaan liuoksella, jossa on 4 x SET (liuos, joka sisältää 0,15 M NaCl, 30 mM Tris.HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA), 0,1 % (paino/tilav.) Ficoll 400 (Pharmacia), 20 0,1 % /paino/tilav.) polyvinyylipyrrolidonia (PVP-360,

Sigma), 0,1 % (tilav./tilav.) BSA, 0,5 % SDS, 50 yg/ml denaturoitua vasikan thymus-DNA:ta (valmistettu seuraavasti: 5 mg vasikan thymus-DNA:ta (tyyppi I, Sigma) keitetään 10 minuuttia 0,5 M natriumhydroksidissa 25 DNA:n leikkaamiseksi, neutraloidaan 5 M etikkahapolla ja saostetaan 2 tilavuudella etanolia -20 °C:ssa. Sakka otetaan talteen sentrifugoimalla 10 minuuttia 60 °C:ssa HB-4-roottorissa ja liuotetaan uudestaan 500 yl:aan 0,5 M EDTA), inkuboimalla 4 tuntia 65 °C:ssa ja käyttä-30 mällä 20 ml seosta suodinta kohti ja sen jälkeen hybri- ridisoidaan käyttämällä nitroselluloosasuodinta kohden 3 32 10 Cerenkov-sykäystä/min sisältävän määrän P-merkit- tyä koetinta liuoksessa, jossa on 5 x SET, 0,02 % (piano/tilav.) Ficollia, 0,01 % polyvinyylipyrrolido- 35 nia, 0,02 % (tilav./tilav.) BSA, 0,2 % SDS ja 50 yg/ml 60 8071 9 denaturoitua vasikan thymus-DNA:ta. Hybridisointi kestää 36 tuntia 65 °C:ssa.

Suotimet huuhdotaan kerran kloroformissa, kahdesti SET+0,5 % SDS:ssä huoneenlämpötilassa ja kahdesti 5 SET + 0,5 % SDS:ssä 1 tunti 60 °C:ssa ja kerran 3 mM

Trizmaemäksellä huoneenlämpötilassa 1 tunti. Suotimet kuivataan imemällä 3 MM-paperilla (Whatman) ja rönt-genfilmiä(Fuji) valotetaan suotimien vaikutuksella käyttämällä varjostinta (Ilford-vahvistusvarjostin) -80 °C:ssa 10 72 tuntia.

Autoradiogrammilta löytyy yhdeksän positiivista pesäkettä, jotka käytetään jatkotutkimuksiin.

Koska transformoitujen solujen primääriset kloonit sisältävät joskus useampaa kuin yhtä yhdistelmä-DNA-15 molekyylilajia, eristetään hydrldiplasmidi-DNA:t yhdeksästä positiivisesti hybridisoituneesta kloonista ja käytetään E. coli HB 101:n uudelleentransformointiin edelläkuvatulla tavalla.

Hydridiplasmidi-DNA eristetään seuraavalla tavalla: 20 Yksi pesäke siirrostetaan 25 ml:n Erlenmeyer-pullossa 10 ml:aan tryptonilientä, johon on lisätty 10 yg/ml tetrasykliiniä, edelläkuvatulla tavalla. Viljelmää ravistellaan 15 - 18 tuntia 37 °C:ssa nopeudella 300 1/min. Solut kootaan talteen sentrifugoimalla (Sovall 25 HS-5-roottori, 10 minuuttia, 4000 1/min, 4 °C). Näin

saadaan noin 0,1 g soluja, jotka suspendoidaan uudelleen 1 ml:aan 50 mM Tris.HCl (pH 8,0). Lisätään 0,25 ml lysot-syymiliuosta (10 mg/ml 50 mM Tris.HClrssä (pH 8,0), ly-sotsyymi on saatu Sigma-firmasta), ja kun on inkuboitu 30 10 minuuttia 0 °C:ssa, lisätään 0,15 ml 0,5 M EDTA

(pH 7,5). Inkuboidaan vielä 10 minuuttia 0°C:ssa ja sen jälkeen lisätään 60 yl 2% Triton X-100 (Merck). Kun on inkuboitu 30 minuuttia 0 °C:ssa näytettä sentrifugoi-daan 30 minuuttia Sorvali SA-600-roottorissa 4 °C:ssa 35 15 000 1/min. Emäliuoksesta poistetaan proteiini 1 tilavuudella fenolia (kyllästetty TNE:hen). Faasit erotetaan sentrifugoimalla 10 minuuttia nopeudella 5000 61 8071 9 1/min 4 °C:ssa (Sorvali HB-4-roottori). Ylempi faasi uutetaan kahdesti 1 tilavuudella kloroformia. Haiman RNAaasia (Sigma; 10 mg/ml TNA:ssä, esikuumennettu 10 minuuttia 85 °C:ssa) lisätään loppuväkevyyteen 25 5 yg/ml ja saatua seosta inkuboidaan 40 minuuttia 37 °C:ssa. Sitten liuoksen väkevyys säädetään 1 M:ksi natriumklo-ridin suhteen ja 1O-prosenttiseksi polyetyleeniglyko-li 6000:n suhteen (Fluka, autoklavoitu 20 minuuttia 120 °C:ssa) ja inkuboidaan 2 tuntia - 10 °C:ssa. Sakka 10 otetaan talteen Sorvali HB-4-roottorilla (20 min nopeudella 10 000 1/min, 0 °C) ja liuotetaan uudestaan 100 yl :aan TNE:tä. DNA-liuos uutetaan 1 tilavuudella fenolia ja DNA saostetaan 2 tilavuudella etanolia 10 minuutin kuluessa -80 °C:ssa.

15 Sakka kerätään talteen sentrifugoimalla Eppendorf- sentrifugilla ja DNA liuotetaan uudestaan 20 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) ja 0,5 mM EDTA. 10 ml:n viljelmästä saadaan talteen 8-10 yg hydridiplasmidi-DNA:ta.

20 E. coli HB 101 transformoidaan kullakin näillä yhdeksällä eristetyllä hydridi-DNA:11a ja transformoituja soluja viljellään agar-levyillä, jotka sisältävät tetrasykliiniä, kuten edellä on kuvattu (vaihe 4). Jokaisesta transformaatiosta poimitaan 3 tetrasykliinin 25 suhteen vastustuskykyistä kloonia, niistä tehdään 10 ml:n viljelmät ja hydridi-DNA:t eristetään viljelmistä edelläkuvatulla tavalla.

Kaikki DNA-näytteet analysoidaan ennen transformoin-tia ja sen jälkeen suorittamalla katkaisu Pst I-endo-30 nukleaasilla ja erotus elektroforeesilla 1 % agaroosi-geelin läpi liuoksessa, jossa on 50 mM Tris-asetaattia (pH 7,8) ja 1 mM EDTA. Kaikkien näytteiden katkeamis-kaaviot ovat identtiset ennen transformointia ja trans-formoinnin jälkeen.

35 Yksi uudelleenkloonatuista yhdistelmä-DNA-molekyy- leistä antaa 2 kaistaa, joista yhden liikkuvuus vastaa 62 8071 9

Pst I:llä katkaistun pBR 322:n liikkuvuutta, ja toisen liikkuvuus vastaa noin 1000 emäsparia. Sille annetaan nimitys CG-pBR 322/HLycIFN-1’b.

Eräs toinen yhdistelmä-DNA antaa 3 kaistaa, joista 5 yhdellä on Pst I:llä katkaistun pBR 322:n liikkuvuus, yhdellä noin 600 emäsparin liikkuvuus ja yhdellä noin 150 emäsparin liikkuvuus. Tämän kloonin yhdistelmä-DNA-molekyylille annetaan nimitys CG-pBR 322/HlycIFN-B^.

d. Kloonien CG-pBR 322/HLvcIFN-1'b ja CG-pBR 322/HlycIFN^ 10 karakterisointi

Yhdistelmäplasmidi-DNA:t eristetään klooneista CG-pBR 322/HLycIFN-1'b ja CG-pBR 322/HLycIFN-31 edelläkuvatulla tavalla (vaihe 5c) ja tunnistetaan määrittämällä cDNA-liitännäisen nukleotidisekvenssi Maxamin ja 15 Gilbertin kuvaamalla menetelmällä (41). Tässä noudatetaan periaatteessa seuraavaa lähestymistapaa:

Eristetty yhdistelmäplasmidi-DNA hajotetaan erilaisilla restriktioendonukleaaseilla. Entsyymejä käytetään oleellisesti ottaen toimittajan kuvaamalla tavalla (New 20 England Biolabs), mutta BSA korvataan gelatiinilla ent-syymipuskureissa. Restriktioentsyymeillä pilkotun DNA:n sisältävä liuos deproteinisoidaan fenolilla (kyllästetty TNEshen). DNA saostetaan etanolilla, liuotetaan uudestaan 50 mM Tris-HCl:iin (pH 8,0) niin, että 25 DNA:n väkevyydeksi tulee 50yg/ml, ja inkuboidaan 30 minuuttia 37 °C:ssä käyttämällä 0,1 yksikköä vasikan intes-tinaalista alkalista fosfataasia (Boehringer) per pmol DNA:n 5’-päitä. Entsyymi inaktivoidaan kuumentamalla liuosta 60 minuuttia 65 °C:ssa. DNA puhdistetaan'DEAE-30 selluloosakromatografisesti Mueller et ai:n (47) kuvaa malla tavalla ja saostetaan etanolilla. Sitten DNA merkitään 5'-päistään /γ- ^P7-ATP:llä (> 5000 Ci/mmol, Amersham), ja T4-polynukleotidikinaasilla (P-L Biochemicals) oleellisesti ottaen Maxamin ja Gilbertin 35 (41) kuvaamalla tavalla, mutta DNA:ta ei denaturoida ennen kinaasireaktiota. Yleensä ominaisaktiivisuudet 63 8071 9 ovat 1 - 3*10^ sykäystä minuutissa per pmol 5'-päitä.

Merkityt DNA-jaksot hajotetaan toisella restrik-tioendonukleaasilla ja tuotteet erotetaan elektroforeesilla käyttämällä 6 %, 8 % tai 10 % polyakryyliamidigee-5 liä Tris-boraatti-EDTA-puskurissa. DNA-jaksot uutetaan geelistä ja puhdistetaan Mueller et al:n (47) kuvaamalla tavalla. Nukleotidisekvenssien määrittämistä varten DNA-jaksot hajotetaan kemiallisesti ja tuotteet erotetaan polyakryyliamidigeelielektroforeesilla Maxamin ja 10 Gilbertin (41) kuvaamalla tavalla.

Erityisesti kloonista CG-pBR 322/HLycIFN-1'b eristetyt plasmidi-DNA:t käsitellään seuraavasti: Toisaalta 5 yg plasmidi-DNA:ta hajotetaan Bgl II:11a, merkitään 5'-päistään ja hajotetaan Pvu II:lla. Pvu II-Bgl II*-15 ja Bgl II-Pvu II*-DNA-jaksot (* tarkoittaa merkittyä kohtaa) eristetään 6 % polyakryyliamidigeelillä. Toisaalta 5 yg plasmidia hajotetaan Alu I:llä, merkitään 5'-päistään ja hajotetaan Pst I:llä. Pst I - Alu I*-DNA-jakso eristetään 8% polyakryyliamidigeelillä. Sitten yksittäiset 20 fragmentit hajotetaan ja niiden sekvenssit määritetään

Maxamin ja Gilbertin menetelmällä. Saadut nukleotidisek-venssit on esitetty kuvassa 4. cDNA-liitännäisen 5'-päässä on edeltävä noin 25 - 35 deoksiguanosiinitähteen muodostama jakso. Kuvattu nukleotidisekvenssi on jossa-25 kin määrin samanlainen kuin IFN-a:n (tyyppi F) cDNA, jota Goeddel et ai. ovat kuvanneet /M 14), ks, myös Weissmann (3j_7» mutta siinä on kuitenkin paljon selviä eroja (pistemutaatioita), joista jotkut vaikuttavat syntyviin aminohappoihin (ks. kuva 4).

30 Kloonin CG-pBR 322/HLycIFN-B^ eristetty plasmidi-DNA

käsitellään samalla tavalla. 5 yg plasmidia hajotetaan Pvu II:11a ja merkitään 5'-päistään. Puolet seoksesta hajotetaan Pst I:llä ja loput Bgl II:11a. Pst I - Pvu II*-ja Bgl II - Pvu II*-jakeet eristetään elektroforeesilla 35 6% polyakryyliamidigeelillä ja hajotetaan edellämainitul- la tavalla. Nukleotidisekvenssi (N-pään sekvenssi) on 80719 esitetty kuvassa 5 ja osoittaa, että cDNA-liitännäi-nen alkaa IFN-6^-cDNA:n nukleotidista no. 102, kuten Taniguchi et ai. (17) ovat kuvanneet. Näin ollen cDNA-liitännäinen kykenee koodittamaan sellaista ihmisen 5 IFN-β^-muotoa, josta puuttuu 11 aminohappoa N-päästä.

cDNA -liitännäisen kyljessä on 5' -päässä noin 20 - 25 deoksiguano-siinitähteen muodostama jakso ja siinä on pistemutaatio kohdassa 153 siten, että C muuttuu T-tähteiksi, mutta tällä ei ole vaikutusta syntyvään aminohappoon.

10 e. Sellaisten kloonien identifiointi, joiden sisältämät vhdistelmä-DNA-molekvvlit ristikkäishvbridisoituvat CG-pBR 322/HLycIFN-1'b- ja CG-pBR 322/HLycIFN-ei-liitännäisen kanssa

Kloonien CG-pBR 322/HLycIFN-1'b ja CG-pBR 322/

15 HLycIFN-β^ yhdistelmäplasmidi-DNA:t eristetään viljelmistä edelläkuvatulla tavalla (vaihe 5c). CG-pBR 322/HLycIFN-1' b-plasmidi-DNA (5 yg) hajotetaan Bgl II:lla, merkitään 5'-päistään ja hajotetaan Pvu II:11a. Toi-' saalta eristetty CG-pBR 322/HLycIFN-B^-plasmidi-DNA

20 (5 yg) hajotetaan Pvu 11:11a, merkitään 5'-päästään ja hajotetaan Bgl II:lla. Pvu II -Bgl II*-DNA-jakso (351 emäsparia) (koetin A) ja Pvu II*-Bgl II-DNA-jakso (368 emäsparia) (koetin B) eristetään 8% polyakryyliami-digeelistä edelläkuvatulla tavalla (vaihe 5d) ja käyte-25 tään in situ pesäkehybridisoinnissa (ks. jäljempänä).

Plamidi-DNA-molekyylien hajotus restriktioentsyymeillä, merkintä ja DNA-jakeiden puhdistus suoritetaan edelläkuvatulla tavalla (vaihe 5d).

4000 kpl edelläkuvatulla tavalla valmistettua trans-30 formanttipesäkettä (vaihe 4) siirretään nitroselluloosa-suotimille BA 85 (Schleicher & Schuell, halkaisija 8 cm). Solut lysoidaan ja niiden DNA denaturoidaan ja kiinnitetään suotimiin in situ Grunsteinin ja Hognessin (36) mukaan. Hybridisoitumiset koettimiin A ja B (koettimet 65 8071 9 ovat seoksena) suoritetaan edelläkuvatulla tavalla (vaihe 5c). Autoradiografisesti identifioidaan 6 positiivista pesäkettä, joista 3 nimetään seuraavasti E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-41, 5 E.coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-51 ja E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-8^ ja käytetään jatkotutkimuksissa. Näiden kloonien plasmi-di-DNA:t eristetään, transformoidaan uudelleen ja eristetään uudelleen edelläkuvatulla tavalla (vaiheet 5c ja 10 5d) .

Jotta voitaisiin todeta yhdistelmä-DNA-molekyylien sisältämien liitännäisten luonne, cDNA-liitännäisten nukleotidisekvenssit määritetään (osittain tai kokonaan) noudattamalla edelläkuvattua yleismenetelmää (vaihe 5 d). 15 Varsinkin eristetyistä CG-pBR 322/HLycIFN-41- ja CG-pBR 322/HLycIFN-8.j-plasmidi-DNA: sta hajotetaan kummastakin 5 yg Pvu II:11a, merkitään 5'-päistään ja hajotetaan Pst I:llä. DNA-jaksot fraktioidaan 8% polyak-ryyliamidigeelillä ja ja 8,j-DNA:sta peräisin oleva Pst I-20 Pvu II* (noin 120 emäsparia ) ja 4^-DNA:sta peräisin oleva Pst Ι-Pvu II* (82 emäsparia) eristetään tavalliseen tapaan.

Eristetty plasmidi-DNA CG-pBR 322/HLycIFN-51 käsitellään seuraavasti. Toisaalta 5 yg plasmidi-DNA:ta 25 hajotetaan Hae III:11a, merkitään 5'-päästään ja katkaistaan Pst I:llä. Pst I - Hae III*-DNA-jakso (57 emäsparia) eristetään 10 % plyakryyliamidigeelillä. Toisaalta 5 yg plasmidia hajotetaan EcoR I:llä, merkitään 5'-päästään ja katkaistaan Pst I:llä. Pst I - EcoR I*-30 (235 emäsparia) ja EcoR I* - Pst I-DNA-jae (n. 700 emäs- paria) eristetään 8 % polyakryyliamidigeelillä. DNA-jaksojen sekvenssit analysoidaan Maxamin ja Gilbertin menetelmällä (41).

66 8071 9 cDNA-liitännäisten nukleotidisekvenssi on esitetty kuvissa 6-8. Kuvassa 6 esitetään CG-pBR 322/HLycIFN-4^:n cDNA-liitännäisen nukleotidisekvenssi. Liitännäisessä on 5'-päässä 23 lisädeoksiguanosiinitähdettä sisältävä 5 jakso ja se sisältää osan IFN-a2(Le)-muodon cDNA:ta

Streuli et al:n kuvauksen mukaan (12). 3'-pään ekstra-kistronisessa alueesssa on joitakin pieniä poikkeamia (pistemutaatioita) ja 318 lisänukleotidin muodostama jakso. CG-pBR 322/HLycIFN-8.j :n sisältämän cDNA-liitännäisen 10 nukletodisekvenssi on esitetty kuvassa 7. Liitännäisessä on 5'-päässä 20 - 35 lisädeoksiguanosiinitähteen muodostama jakso ja se on samantapainen, muttei identtinen IFN-a(tyyppi D)-muodon cDNA:n kanssa, jota Geoddel et ai.

/T14) ; ks. myös Mantei et ai. (lihovat selostaneet. In-15 terferonia koodittavan sekvens-sin edessä ja jäljessä olevien eroavien cDNA-alueiden lisäksi IFN-geeni sisältää asemissa 28 - 30 GCC-tripletin ja asemissa 409 - 411 GCG-tripletin, jotka koodittavat alaniinia sensijaan, että se sisältäisi vastaavasti GTC- ja GTG-tripletin, jotka 20 koodittavat valiinia. Viimein on CG-pBR 322/HlycIFN-5^:n cDNA-liitännäisen nukleotidisekvenssissä (ks. kuva 8) 17 deoksiguanosiinitähteen jakso 5'-päässä. Nukleotidisekvenssi muistuttaa IFN-a(tyyppi B)-muodon cDNA:ta, jota Goeddel et ai. (14) ovat selostaneet. Kuitenkin 25 HLycIFN-5^:n cDNA-liitännäisen 5'-päässä on vielä lisä-nukleotideja ja ekstrakistronisessa alueessa sekä interferonia koodittavassa sekvenssissä on pistemutaatioita, poistumia ja lisäyksiä, varsinkin asemissa 22 ja 361 -372.

30 6. Ihmisen interferonien syntetisointi sellaisten E.

coli-kantojen avulla,jotka sisältävät ihmisen interferonien suhteen spesifisiä yhdistelmä-DNA-molekyylejä 5 kloonia, joiden oli osoitettu sisältävän ihmisen interferonin suhteen spesifisiä yhdistelmä-DNA-molekyy-35 lejä, nimittäin 67 80719 E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-l'b, E. coll HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-^, E. coll HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-51# E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-8'χ, ja 5 E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-g1, testataan interferoniaktiivisuuden suhteen, joka kussakin tapauksessa saadaan selville seuraavalla tavalla:

Kyseessäolevaa E. coli-kloonia (30 ml:n suspensiot) viljellään tryptoniliemessä, kunnes optinen tiheys i°Dg5Q^ 10 on noin 1. Solut otetaan talteen ja suspendoidaan uudestaan 0,5 ml:aan vesiliuosta, jossa on 30 mM NaCl ja 50 mM Tris.HCl (pH 8,0). Lisätään lysotsyymiä (Sigma) 1 mg/ml. Kun suspensioita on pidetty 30 minuuttia 0 °C:ssa, ne jäädytetään (nestemäisessä typessä) ja sulatetaan 15 (37 °c) 5 kertaa ja sentrifugoidaan 20 minuutin ajan 4 °C:ssa nopeudella 20 000 1/min SS 34 Sorvall-roottorissa. Emä-liuosten interferoniaktiivisuus määritetään sympaattisella biomäärityksellä, jonka Arsmtrong on esittänyt (29), ja jota on selostettu vaiheessa 1c. Seuraavat ak-20 tiivisuudet löydettiin:

Uutelähde IFN-aktiivisuus E. coli HB 101, joka sisältää yhdistelmä-DNA:n (IU/ml) CG-pBR 322/HLycIFN-l'b 0;0 25 CG-pBR 322/HLycIFN-41 0;0 CG-pBR 322/HLycIFN-51 10 000;10 000 CG-pBR 322/HLycIFN-8'1 100; 100 CG-pBR 322/HLycIFN-β1 0;0

Mahdollisesti sellaiset kloonit, jotka eivät osoita 30 mitattavaa IFN-aktiivisuutta, sisältävät yhdistelmä-DNA-molekyylejä, joissa HuLylFN-cDNA-liitännäinen on väärässä suunnassa transkription suuntaan nähden. Tästä syystä yhden tällaisen kloonin (CG-pBR 322/HLycIFN-1'b), jossa on täyspitkä cDNA-liitännäinen, sisältämä yhdis-35 telmä-DNA suunnataan uudestaan seuraavalla tavalla: 68 8071 9 E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-1'b:n plasmidi-DNA eristetään edelläkuvatulla tavalla (vaihe 5c) ja katkaistaan Pst I:llä. 0,5 yg katkaistua DNA:ta 20 yl:ssa puskurisesota, joka sisältää 20 mM Tris.HCl 5 (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 25 mM NaCl ja 50 yg/ml gelatiinia, käsitellään 2 tuntia 15 °C:ssa 0,2 yksiköllä T4 DNA-ligaasia (Biolabs) ja 0,5 mM ATP:llä. E. coli HB 101 transformoidaan cDNA-seoksella edelläkuvatulla tavalla (vaihe 4). Transformoidut pe-10 säkkeet valitaan McConkey-agarlevyiltä, joihin on lisätty tetrasykliiniä ja sen jälkeen kopioidaan nitroselluloosasuotimille. Neljä bakteeripesäkette, jotka hybridisoituvat CG-pBR 322/HLycIFN-1'b:n 32 yhdistelmä-DNA:n sisältämän P:llä merkityn PvuII -15 Bgl II*-jakson (351 emäsparia) suhteen, nimetään kannoiksi E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-1*b1 - 1'b4· Näistä 4 kloonista valmistetaan uutteet ja IFN-aktiivi-suus testataan edelläkuvatulla tavalla. Seuraavat aktiivisuudet löydetään: 20 Uutelähde IFN-aktiivisuus E. coli HB 101, joka sisältää yhdistelmä-DNA:n (IU/ml) CG-pBR 322/HLycIFN-l'b1 0;0 CG-pBR 322/HLycIFN-l'b2 0;0 25 CG-pBR 322/HLycIFN-l'b3 0;0 CG-pBR 322/HLycIFN-l'b4 30;30 Näin ollen plasmidi CG-pBR 322/HLycIFN-1'b4 sisältää cDNA-liitännäisen, joka kykenee ohjaamaan sellaisen polypeptidin synteesiä, jolla on IFN-aktiivisuus.

«9 80719 7. Sellaisten yhdistelmäplasmidien rakentaminen, jotka kykenevät tuottamaan suuret määrät polypeptidejä, joilla on interferoniaktiivisuus/ ja E. coli HB 101-kannan transformointi näillä plasmideilla 5 A. CG-pBR (AP)/LyIFN-a-1-yhdistelmäplasmidin rakentaminen

Jotta kloonin E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFNl'b tuottama interferonin suhteen spesifisen proteiinin määrä saataisiin kohoamaan, suoritetaan seuraava rakennus-10 toimenpide, joka on esitetty kaaviollisesti kuvassa 9.

a. cDNA-liitännäisen valmistaminen

Kloonin E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-1'b:n yhdistelmäplasmidi-DNA (150 yg) katkaistaan Pst I:llä (Biolabs) käyttämällä standardimenetelmiä (ks. vaihe 5d) . 15 Kun on uutettu fenolilla ja saostettu etanolilla, ir- roitettu liitännäinen eristetään sentrifugoimalla sakka-roositiheysgradientissa (5 - 23 %), jossa oli 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) ja 1 mM EDTA. Sentrifugointi suoritetaan nopeudella 35 000 1/min TST 41-roottorissa (Kontron 20 AG) 15 °C:ssa 16 tunnin aikana. 0,3 ml:n jakeet kerätään ISCO-gradienttikerääjällä nopeudella 1 ml/min. Ne jakeet, jotka sisältävät pienen jakson (so. liitännäisen), kootaan yhteen. DNA seostetaan etanolilla tavalliseen tapaan ja sakka kootaan talteen sentrifugoimalla HB-4-25 roottorissa (Sorvali) nopeudella 10 000 1/min 10 minuuttia 0°C:ssa. Sakka liuotetaan uudestaan 60 ylraan liuosta, jossa on 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) ja 0,05 mM EDTA. Näin saadaan talteen 30 yg DNA:ta, kun mitataan optisen tiheyden perusteella.

30 DNA-liitännäinen (10 yg) hajotetaan Hae III:11a (Biolabs) ja jaksot fraktioidaan 2 % agaroosigeelissä liuoksessa, jossa on 50 mM Tris, 50 mM boorihappoa, 1 mM EDTA ja 0,5 g/ml etidiumbromidia. Pisimmät jaksot eli Hae III - Pst I (869 emäsparia) ja Hae III -35 Hae III (82 emäsparia, vrt. kuva 9, jaksot 3 ja 4 vastaa- ™ 80719 vasti) leikataan kumpikin geelistä, ruiskutetaan ruiskun neulan läpi 5 ml:aan liuosta, jossa on 0,15 M NaCl, 50 mM Tris.HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA ja eluoidaan ravistelemalla yön yli. DNA adsorboidaan laskemalla eluaatti 5 100 yl:n DE-52 (Whatman) Pasteur-pipettipylvään läpi.

Pylväs pestään 2 ml:11a samaa puskuria ja DNA eluoidaan 400 ul:lla liuosta, jossa on 1,5 M NaCl, 50 mM Tris (pH 8,0) ja 1 mM EDTA. DNA saostetaan 2 tilavuudella etanolia -20 °C:ssa yön aikana. Sakka sentrifugoidaan 10 talteen Eppendorf-sentrifugilla.

Hae III - Hae III DNA-jakso (82 emäsparia) liuotetaan uudestaan ja hajotetaan Sau 3A:lla (Biolabs). Entsyymiä inaktivoidaan 30 minuuttia lämmön avulla 65 °C:ssa. 1 yg Hae III - Pst I DNA-jaksoa (869 emäsparia) lisätään, 15 liuoksen pitoisuudeksi säädetään 10 mM MgC^» 10 mM * DTT ja 0,5 mM ATP ja lisätään T4 DNA-ligaasia (Biolabs), kunnes pitoisuudeksi tulee 30 yksikköä/yl reaktioliuosta. Liuosta inkuboidaan 10 tuntia 15 °C:ssa. Kun on uutettu fenolilla ja kloroformilla, seos fraktioidaan 2 % agaroo-20 sigeelillä Tris-boraatti-EDTA:ssa etidiumbromidin läsnäol-: lessa. Sau 3A - Pst I DNA-jakso (vrt. kuva 9, jakso 5) : uutetaan edelläkuvatulla tavalla, saostetaan etanolilla ja liuotetaan uudestaan 10 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) ja 0,05 mM EDTA.

25 b. Sellaisen DNA-jakson valmistaminen, joka sisältää pBR 322:n β-laktamaasin säätelyalueen (ApPr) β-laktamaasia koodittavan segmentin poistamiseksi plasmidi pBR 322 katkaistaan Pst I:llä (vrt. vaihe 3b) ja käsitellään 4-10 minuutin ajan 30 °C:ssa 4 30 yksiköllä/ml eksonukleaasia Bal 31 (Bethesda Research Lab.).

Kemiallinen DNA-liitospolymeeri, jonka kaava on 5'-ATGTGTGATCACACAT-3' 71 8071 9 syntetisoidaan edelläkuvatulla tavalla (vaihe 5a). Liitospolymeeri lisätään Bal 31:llä käsiteltyyn pBR-322-DNA:han tavallisella liittämistoimenpiteellä. Saatu hydridimolekyyli katkaistaan restriktioendonukleaa-5 seilla Bel I (Biolabs) ja EcoR I. Hajotustuotteet fraktioidaan 8 % polyakryyliamidigeelillä Tris-boraatti-EDTArssa edelläkuvatulla tavalla (vaihe 2a). Ne DNA-jaksot (ApPr-DNA-jaksot), jotka liikkuvat merkkinä käytettyjen 184 ja 234 emäsparia sisältävien DNA-jaksojen 10 välissä, eristetään edelläkuvatulla tavalla (vaihe 7a) ja saostetaan etanolilla tavalliseen tapaan. Sakka liuotetaan uudestaan liuokseen, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) ja 0,05 mM EDTA.

c. ApPr-DNA-jakson liittäminen cDNA-liitännäiseen ja 15 plasmidin CG-pBR(AP)/LyIFN-a-1 valmistaminen

Liuokset, jotka sisältävät ApPr-DNA-jaksot ja cDNA-liitännäisen, yhdistetään. Seoksen pitoisuudeksi säädetään 10 mM MgCl2f 10 mM DTT ja 0,5 mM ATP ja inkuboi-daan T4 DNA-ligaasin (Biolabs) (30 yksikköä/ yl) kanssa 20 12 tuntia 15 °C:ssa. Kun on uutettu fenolilla ja kloro formilla, seos fraktioidaan 1-prosenttisella matalalla-sulavalla agaroosigeelillä (Biorad). Saatu ApPr-cDNA-jakso liitetään isoon pBR 322 jaksoon, joka on saatu katkaisemalla sekä Pst I:llä (Biolabs) että EcoR I:llä 25 (Biolabs) seuraavalla tavalla: Kun geelipala, joka si sältää ApPr-cDNA jakson (noin 20 yl) sekoitetaan pBR 322:n Pst I - EcoR I-jakson kanssa, sulatetaan 2 minuuttia 65 °C:ssa, jäähdytetään 37 °C:een, pitoisuudeksi säädetään 0,5 mM ATP, 10 mM DTT ja 10 mM MgCl2 ja inkuboidaan 12 30 tuntia 15 °C:ssa T4 DNA-ligaasin kanssa (30 yksikköä/ yl), saadaan liuos, joka sisältää yhdistelmäplasmidin, jonka nimi on CG-pBR (AP)/LyIFN-ot-1.

72 80719 d. E. coli HB 101:n transformointi plasmidilla CG-pBR(AP) /LyIFN-ot-1

Kymmenesosa tilavuutta liuosta, jossa on 100 mM Tris.HCl (pH 7,5), 100 mM CaC^ ja 100 mM MgC^. lisä-5 tään liuokseen, joka sisältää plasmidin CG-pBR (AP)/

LyIFN-a-1. Yhdistettyjä liuoksia kuumennetaan 10 minuuttia 65 °C:ssa ligaasin inaktivoimiseksi ja jäähdytetään 37 °C:een. Sitten liuoksella transformoidaan Ca^+:lla käsitelty E. coli HB 101 edelläkuvatulla ta-10 valla (vaihe 4) ja suoritetaan viljelyt McConkey-agar-levyillä, joihin on lisätty 10ug/ml tetrasykliiniä. Transformoidut pesäkkeet seulotaan IFN-aktiivisuuden suhteen (vrt. vaihe 6). Klooni, joka saa aikaan korkeimman IFN-aktiivisuuden valitaan ja nimetään kannaksi 15 E. coli HB 101 CG-pBR(AP)/LyIFN-a-1. Mitattu aktiivisuus on 40 000 (IU/ml), mikä merkitsee 1300-kertaista stimuloitumista alkuperäiseen klooniin E. coli HB 101 CG-pBR322/HLycIFN-1'b verrattuna.

Kloonin CG-pBR(AP)/LyIFN-a-1 sisältämä yhdistelmä-20 plasmidi-DNA eristetään viljelmästä edelläkuvatulla tavalla (vaihe 3c) ja karakterisoidaan määrittämällä cDNA-liitännäisen (IFN-geeni) ja β-laktamaasin säätelyauleen nukleotidisekvenssit. Tuloksesta on esitetty yhteenveto kuvasssa 10.

25 B. CG-pBR(AP)/LyIFN-g-3-yhdistelmäplasmidin rakentaminen E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-8.j-kloonin inter-feroniproteiinisaantoja parannetaan seuraavalla tavalla (vrt. kuva 11): a. Sellaisen DNA-jakson valmistaminen, joka sisältää 30 CG-pBR(AP)/LyIFN-a-1:n β-laktamaasin säätelyalueen CG-pBR(AP)/LyIFN-a-1:n DNA (100 yg) katkaistaan Hind III:lla (Biolabs) ja Bgl 11:11a (Biolabs). Kun on uutettu fenolilla ja saostettu etanolilla, leikattu DNA-fragmentti eristetään sentrifugoimalla sakkaroositiheysgradientissa 73 8 0 7 1 9 (5 - 23 %) liuoksessa, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 8,0) ja 1 mM EDTA. Sentrifugointi suoritetaan nopeudella 58 000 1/min TST 60-roottorissa (Kontron AG) 4 tunnissa 15 °C:ssa. 0,2 ml jakeet kerätään edelläkuvatulla tavalla. Pienen 5 jakson (Hind III - Bgl II) sisältävät jakeet kootaan yhteen ja DNA saostetaan etanolilla tavalliseen tapaan.

Sakka liuotetaan uudestaan 80 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) ja 0,05 mM EDTA. Näin saadaan talteen 16 yg DNA:ta, kun mittaus suoritetaan optisen 10 tiheyden perusteella.

DNA-jakso (Hind III - Bgl II) (4 yg) katkaistaan Sau 3A:lla (Biolabs) ja hajoamistuotteet fraktioidaan 6 % polyakryyliamidigeelillä Tris-boraatti-EDTA:ssa edelläkuvatulla tavalla. DNA-jaksot värjätään EtBr:llä 15 (0,5 yg/ml), Hind III - Sau 3A-DNA-jakso (239 emäsparia) uutetaan ja eristetään samoin kuin edellä. DNA saostetaan etanolilla tavalliseen tapaan. Sakka liuotetaan uudestaan 20 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) ja 0,05 mM EDTA.

Z'j b. cDNA-liitännäisen valmistaminen cDNA-liitännäinen leikataan CG-pBR 322/HLycIFN-8.j -yhdistelmäplasmidista Pst I:llä edelläkuvatulla tavalla (kohta 7a).

cDNA-liitännäinen (2 yg) hajotetaan 2,5 yksiköllä 25 Sau 3A:ta (Biolabs) liuoksessa, jossa on tO yg/ml EtBr, ja inkuboidaan 60 minuuttia 37 °C:ssa. Hajoamistuotteet uutetaan fenolilla ja DNA saostetaan etanolilla samoin kuin edellä. DNA-jaksot fraktioidaan 1,2 % agaroosigee-lillä liuoksessa, jossa on 50 mM Tris, 50 mM boorihappoa, 30 1 mM EDTA ja 0,5 yg/ml etidiumbromidia.

Toiseksi suurin DNA-jakso (Sau 3A - Pst I: 693 emäs-paria) uutetaan geelistä ja puhdistetaan kohdassa 7a kuvatulla tavalla. DNA liuotetaan uudestaan 20 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) ja 0,05 mM 35 EDTA.

74 8071 9 c. Hind III - Sau 3A-DNA-jakson liittäminen cDNA-liitän-näiseen (Sau 3A - Pst I).

Yhtä suurta määrää kumpaakin DNA-jaksoa (n. 50 ng) inkuboidaan 3 tuntia 15 °C:ssa liuoksessa, jossa on 10 5 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP ja 30 yksikköä/ yl T4 DNA-ligaasia (Biolabs). Seosta inkuboidaan 15 minuuttia 80 °C:ssa ja pitoisuudeksi säädetään 50 mM NaCl. DNA-seosta hajotetaan 20 minuuttia 37 °C:ssa 0,5 yksiköllä Pst I:tä (Biolabs) ja 1 yksiköllä Hind III (Biolabs). 10 DNA uutetaan fenolilla, saostetaan etanolilla ja liuotetaan uudestaan 20 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) ja 0,05 mM EDTA.

Puolet saadusta seoksesta liitetään plasmidin pBR 322 suureen Hind III - Pst I-DNA-jaksoon (n. 100 ng) in-15 kuboimalla 2 tuntia 15 °C:ssa liuoksessa, jossa on 10 mM MgCl2» 10 mM DTT, 0,5 mM ATP ja 30 yksikköä/yl T4 DNA-ligaasia (Biolabs), ja näin saadaan liuos, joka sisältää CG-pBR(AP)/LyIFN-a-3-yhdistelmäplasmidin.

d. E. coli HB 101-kannan transformointi plasmidilla : 20 CG-pBR(AP)/LyIFN-g-3

Kymmenesosa edelläsaadun liuoksen tilavuudesta käytetään E. coli HB 101:n transformointiin edelläkuvatulla tavalla (vaihe 4). Transformanttipesäkkeiden interferoni-aktiivisuudet testataan edelläkuvatulla tavalla (vrt.

25 vaihe 6).

Suurimman interferoniaktiivisuuden aikaansaanut klooni valitaan ja nimetään E. coli HB 101 CG-pBR (AP)/LylFN-α-3-kannaksi.

Interferoniaktiivisuus määritetään edelläkuvatulla 30 tavalla (vaihe 6). Mitattu aktiivisuus on 70 000 (IU/ml), joka merkitsee 700-kertaista stimuloitumista, kun ver-rataan alkuperäiseen klooniin E. coli HB 101 CG-pBR 322/ ’ HLycIFN-8^.

CG-pBR (AP)/LyIFN-a-3-kloonin yhdistelmäplasmidi-DNA 35 eristetään viljelmästä edelläkuvatulla tavalla (vaihe 3c) 75 8071 9 ja tunnistetaan määrittämällä cDNA-liitännäisen (IFN-geeni) ja β -laktamaasin säätelyalueen nukleotidisekvenssit. Tuloksesta on esitetty yhteenveto kuvassa 12.

Plasmidin CG-pBR (AP) /LyIFN-ct-3 rakentamisperiaa-5 tetta voidaan käyttää kaikkiin α-IFN-muodon cDNA-geeneihin tai sopivalla tavalla leikattuihin kromosomaalisiin a-iFN-geeneihin yleensä.

Esimerkiksi lähtemällä CG-pBR 322/HLycIFN-5^-plas-midista, voidaan CG-pBR (AP)/LyIFN-a-2-plasmidi valmis-10 taa vastaavalla tavalla kuin edellä CG-pBR (AP)/LyIFN-α-3-plasmidi. Uusi plasmidi sisältää CG-pBR 322/ HLycIFN-51:n DNA-liitännäisen ja CG-pBR (AP)/LyIFN-a-1:stä saadun β-laktamaasin säätelyalueen. Klooni, jolle annetaan nimi E. coli HB 101 CG-pBR (AP)/LyIFN-a-2. valitaan 15 edelläkuvatulla tavalla. Mitattu interferoniaktiivisuus on 50 000 (IU/ml), joka merkitsee 5-kertaista stimuloitu-mista, kun verrataan alkuperäiseen E. coli HB 101 CG-pBR 322/LycIFN-51-kantaan. CG-pBR (AP)/LylFN·-a-2-plasmidin cDNA-liitännäisen ja β-laktamaasin säätely-20 alueen nukleotidisekvenssit määritetään ja ne on esitetty kuvassa 13.

8. E. coli HB 101 CG-pBR (AP) /LylFN- ct-3-kannan viljely fermentorimittakaavassa E. coli HB 101 CG-pBR (AP)/LylFN-or3-kantaa viljellään 25 liemessä no. X, joka sisältää seuraavat aineosat litraa kohti: 76 8071 9

Na2HP04-7H20 13,25 g KH2P04 3,0

NaCl 0,5 nh4ci 1,0 5 CaCl2-2H20 0,015

MgS04-7H20 0,25 rauta(3)sitraatti 0,006 kasaminohappoja 18,0 hiivauute 2,0 10 "cerelose" 8,0 tetrasykliini 0,01

Muusta ravinnekoostumuksesta erillään steriloidaan "cerelose" lämmön avulla ja tetrasykliini steriilisuoda-tuksella. 2 litran ravistelupulloihin, jotka sisältävät 15 500 ml ravinnelientä no. X, siirrostetaan kuhunkin soluja hyväkasvuiselta agarvinopinnalta. Ravistelupullot on varustettu neljällä ohjauslevyllä ja niitä inkuboidaan j kiertoravistelula.itteessä nopeudella 120 1/min 30 °C:ssa 11 tuntia. 1,5 litraa tätä esiviljelmää siirretään 1,5 20 litran fermentoriin, jossa on 300 1 ravinnelientä no. X, ja kasvatetaan seuraavissa olosuhteissa: sekoitus 350 - 500 1/min litteäsiipiturbiinilla, ilmastus 0,3 - 1,0 1/1.min, fermentorin yläosan paine 30 kPa (0,3 bar ), lämpötila 30 °C. Liuenneen hapen pitoisuuden putoaminen 25 50 % kyllästymisasteen alapuolelle estetään kohottamal la ilmastus ja tarpeen vaatiessa myös sekoitusnopeus maksimiarvoihin. pH pidetään arvon 6,8 yläpuolella lisäämällä natriumhydroksidia. Noin 10 tunnin viljelyn jälkeen viljelmä on saavuttanut maksimaalisen inter-30 feronitiitterin (määritetty Armstrongin menetelmällä (29)) ja suoritetaan talteenotto.

77 8071 9 9. HLyIFN-ot-3;n eristäminen ja puhdistaminen a. Polypeptidiliuoksen valmistus monoklonaalista vasta-ainepylvästä varten 280 litraa viljelmää, jonka pH on 7,2, jäähdytetään 5 10 °C:een ja solut erotetaan Alfa-Laval BRPX-207- lietteenpoistolaitteella. Kirkas emäliuos ei sisällä lainkaan interferoniaktiivisuutta. Ennenkuin lietteen- poistolaitteen kiinteälle aineelle varattuun astiaan kertynyt solumassa otetaan talteen, emäliuos korvataan 10 20 litralla "Lysis Buffer A:ta" (50 mM Tris.HCl, 50 mM EDTA, 0,2 M NaCl, 10 mM PMSF (fenyylimetyylisulfonyyli-fluoridi); 1 mM L-kysteiiniä, pH säädetty arvoon 8,2 suolahapolla) ja sentrifugointiastian sisältö (7 1) syöstään täydellä lietteenpoistoteholla. Lietteenpoisto-15 laite pestään kolme kertaa 2 litralla "Lysis Buffer A:ta". Saadun solumassan tilavuus säädetään 20 litraksi puskurilla A ja sen pH on 6,9. Suspensio jäähdytetään 5-10 °C:een ja lasketaan nopeudella 5 1/h DYNO -Mill-laitteen (tyyppi KDL-Pilot, 1,41) läpi, joka on varustettu polyuretaani-20 sekoituslautasilla ja sisältää 1170 ml lasikuulia (halkaisija 0,5 - 0,75 mm), sekoitusnopeuden ollessa 3350 1/min, jolloin solut särkyvät. Saatuun rikottujen solujen suspensioon lisätään 2 °C:ssa varovaisesti sekoittaen 800 ml "Lysis Buffer A:ta" (sisältää vielä 100 g poly-25 etyleeni-imiiniä, pH säädetty arvoon 8,2 suolahapolla). Suspensio, jonka pH on noin 7,6, jäähdytetään kolmeksi tunniksi -2 °C:een ja sentrifugoidaan. Emäliuokseen (17,2 1) lisätään 3028 g) ammoniumsulfaattia. 1 tunnin ajan 6 °C:ssa seisotettu hieman samea seos sentri-30 fugoidaan. Emäliuos käsitellään 4324 g:11a ammoniumsulfaattia, annetaan seisoa yön yli ja sentrifugoidaan nopeudella 3000 1/min. Kun märkä sentrifugoimalla saatu massa (noin 1224 g) liuotetaan puskuriin B (25 mM Tris.HCl, 10 μΜ PMSF, pH säädetty suolahapolla arvoon 8,5), saadaan 35 2800 ml liuosta, joka sisältää halutun polypeptidin.

700 ml:n erä tästä polypeptidiluoksesta diasuodate-taan huoneenlämpötilassa H1P10 Hollow-suodatinkasetin ’s 8071 9 läpi käyttämällä Amicon DC-2 Hollow Fibre Systemiä ja 7 1 puskurisysteemiä B. Suodatinkasetti pestään puskurilla B, diasuodatettu liuos ja pesuliuokset yhdistetään (1440 ml) ja lasketaan virtausnopeudella 5 200 ml/h DEAE-pylvääseen (TrisacrylR M DEAE, LKB 2205- 300), jonka pakattu tilavuus on 450 ml, ja joka on tasapainotettu puskurilla B. Ensimmäinen polypeptidijae, jossa on UV-absorptio allonpituudella 280 nm heitetään pois. Pylväs pestään vielä puskurilla B, kunnes vä-10 hintään viidellä pulvään tilavuudella pesuliuosta on perusviiva-absorptio 280 nm. Sitten adsorboituneet po-lypeptidit eluoidaan 2,8 litralla puskuria C. (0,2 M NaCl, 25 mM Tris.HCl, pH 8,5). Pylväskromatografia suoritetaan 4 °C:ssa. Kun eluaatin IFN-aktiivisuus-mita-15 taan Armstrongin menetelmällä (29), saadaan tulokseksi 5 1,4*10 IU/mg polypeptidiä. Eluaatin pH säädetään 2M suolahapolla arvoon 7,4 ja siitä jäädytetään 100 ml:n erä -20 °C:een monoklonaalista vasta-ainepylvästä varten.

b)Ihmisen LyIFN-a-3-muodon puhdistaminen monoklonaali-20 sessa vasta-ainepylväässä

Monoklonaalinen vasta-ainepylväs 1K2-20 (täytetty tilavuus 0,8 ml, ks. jäljempänä) tasapainotetaan PBS:llä (fosfaatilla puskuroitu suolaliuos: 0,137 M NaCl, 0,0027 M KC1, 0,0077 M Na2HPC>4 12H20, 0,0015 M KH2PC>4,

25 pH 7,4) ja siihen lisätään edelläsaatua polypeptidiliuosta 10 ml erissä huoneenlämpötilassa virtausnopeuden ollessa 10 ml/h. Ensimmäiset jakeet, jotka sisältävät adsor-boitumattomat polypeptidit ja 3 ml PBS-pesuliuosta heitetään pois. Muut epäspesifiset, sitoutuneet polypepti-’ 30 dit eluoidaan 3 ml:11a PBS:ää, jossa on vielä 0,5 M

NaCl ja 0,2 % Triton X 100. Pylväs pestään 3 ml:11a PBS:ää ja sen jälkeen spesifisesti adsorboituneet polypeptidit eluoidaan 3 ml:11a puskuria D (0,1 M sitruuna-happoa, 0,3 M NaCl, pH 2). Tämä jae ja 4 ml PBS-pesussa 35 saatua liuosta yhdistetään, pH säädetään 2N natriumhydrok- 79 8071 9 sidilla arvoon 6,3 ja väkevöidään kymmenkertaiseksi 4 °C:ssa käyttämällä apuna upotettavaa CXTf*-molekyyli- n

erotinta (Millipore ). Konsentraatti siirretään Sephadex G-25 fine-pylvääseen (2,6x34 cm, täytetty 5 tilavuus 200 ml), joka on tasapainotettu 0,025 M

histidiini.HCl:llä, jonka pH on 6,3. Pylväs eluoidaan samalla histidiini.HCl-liuoksella (pH 6,3) 4 °C:ssa virtausnopeudella 42 ml/h ja kerätään 20 jaetta, joiden kunkin tilavuus on 10,5 ml. Polypeptidejä sisältävät 10 jakeet ilmaistaan niiden optisella absortiolla 280 nm:ssä. Jakeet 7 ja 8 sisältävät interferonipolypepti-din, joka voidaan paikallistaa Armstrongin määritysmenetelmällä (29). Aktiiviset jakeet, jotka sisältävät LyIFN-a-3-muodon, säilytetään -20 °C:ssa tai jäähauteel-15 la myöhempää käyttöä varten. Jakeiden interferoniaktii-

O

visuus on 1,8*10 IU/mg polypeptidiä (29).

Kun nämä jakeet lyofilisoidaan, saadaan 1 millilit-rasta luosta 20 - 40 pg polypeptidiä.

SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesissa (vrt.

20 (49)) saadaan tämän LyIFN-a-3-muodon molekyylipainoksi noin 18 kilodaltöniä.

Kun suoritetaan ultraohutkerrosisoelektrinen fokusointi (100 yM) B.J. Radiolan menetelmällä (50) pH-alueella 4,5 - 6,5, paljastuu puhdas aktiivinen ihmisen 25 LyIFN-a-3-muoto, jonka isoelektrinen piste on kohdassa 5,3 - 5,4 pH-yksikköä.

c) Monoklonaalisen vasta-ainepylvään 1K2-20 valmista-minen (A) Hiirten immunisointi 30 Balb/c-hiiriin (8 viikon ikäisiä, toimittanut Tier- farm Sissein, Sveitsi) injektoidaan 4 jalkapohjaan kaikkiaan 3 x 10^ yksikköä ihmisen leukosyytti-IFN-a-muotoa (puhtausaste 1 %) täydellisessä Freund-apuaineessa(Difco).

30. päivänä injektoidaan sama määrä interferonia epätäy-35 dellisessä Freund-apuaineessa samalla tavalla. Kolmas 5 äo 80719 injektio tehdään 85. päivänä, jolloin annetaan 4 x 10 yksikköä ihmisen leukosyytti-interferonia intraperito-neaalisesti suolaliuoksessa. Neljä vuorokautta myöhemmin pernat otetaan fuusiota varten.

5 (B) Hybridomien valmistaminen

Kaikki fuusiokokeet, joissa käytetään X63-Ag8-653- myeloomalinjaa (52), suoritetaan oleellisesti ottaen Köhlerin ja Milsteinin menetelmällä (53) sekoitta- 8 7 maila keskenään 10 pernasolua ja 10 myeloomasolua 10 käyttämällä apuna 1 ml 50 % polyetyleeniglykolia (PEG 1500, Serva) (54). Pesun jälkeen solut suspendoidaan uudelleen 48 ml:aan standardityyppistä Dulbeccon minimaaliset olennaiset ravinteet sisältävää lientä (Gibco). Fuusiota kohti lisätään 15 % vasikan sikiön 15 seerumia ja 3 x 10° normaaleja hiiren peritoneaalisia tulehdusnestesoluja syöttösoluiksi. Solut jaetaan Costar-koloihin (48 x 1 ml). Viljelmiin lisätään kahdesti viikossa ravinteeksi standardityyppistä selek-: tiivistä ravinnetta (53) 3-6 viikon ajan. Kun hyb- 20 ridit ovat kasvaneet, ne jäädytetään ja emäliuoksista mitataan anti-interferoniaktiivisuus jäljempänä kuvatulla tavalla. Hybridomasolujen kloonaus suoritetaan ra-jaavalla laimennuksella miktotitrauslevyillä.

(C) Vasta-ainemääritykset 25 Emäliuoksen anti-interferoniaktiivisuuden määrittä miseksi 50 μΐ IFN-a-muotoa (lopullinen pitoisuus 10 -20 yksikköä interferonia/ml) inkuboidaan 50 μ1:η kanssa viljelmän emäliuosta huoneenlämpötilassa ja 30 - 60 minuutin kuluttua mitataan jäljellejäänyt IFN-aktiivi-30 suus normaalilla IFN:n määritysmenetelmällä. Tämä menetelmä, joka toimii tavallisten vasta-aineiden ollessa kyseessä, joko ei toimi tai ei anna toistettavia tuloksia hybridomaemäliuosten määrityksissä. Näin ollen tätä tarkoitusta varten kehitettiin seuraava 35 yhdistetty immuunisaostusbiomääritys. 50 yl epäpuhdasta si 8071 9 4

IFN-a-muotoa (10 U/ml) sekoitetaan (mikroputkissa 3810, Eppendorf) yhtä suuren määrän kanssa viljelmän emä-liuosta ja saatua seosta inkuboidaan 2-4 tuntia 37 °C:ssa. Sitten lisätään 50 μΐ aikaisemmin titrattua 5 kanin antihiiri-Ig-vasta-ainetta (Nordic) ja seosta inkuboidaan ensin 1 tunti 37 °C:ssa ja sen jälkeen 16 tuntia +4 °C:ssa, jotta muodostuu immuunikomplekseja. Sitten putkia sentrifugoidaan kylmähuoneessa 5 minuuttia nopeudella 12 000 1/min. Emäliuos säästetään ja sakka 10 pestään kerran 1 ml:11a puskuroitua suolaliuosta, pH

7,2. Pesun jälkeen sakka liuotetaan 200 ylraan suolaliuosta, pH 2,2. IFN-aktiivisuus määritetään Armstrongin menetelmällä (29).

(D) Vesivatsanesteestä eristetyn anti-IFN-vasta-aineen 15 puhdistus

Balb/c-hiiret esikäsitellään 0,4 ml:lla "Pristania" (Carl Roth) intraperitoneaalisesti. Viikkoa myöhemmin hiiriin injektoidaan i.p. 2-5x10° hybridomasolua. Jokaisesta hiirestä kerätään toistuvasti talteen vesivatsanestettä.

20 Nesteet yhdistetään ja jäähdytetään -80 °C:een. Sulatuksen jälkeen nestettä sentrifuogidaan 30 minuuttia nopeudella 16 000 1/min. Pinnassa oleva rasva imetään pois ja rikkoutuneista solujätteistä vapaa emäliuos säästetään. Tarpeen vaatiessa sentrifugointi toistetaan. Vesivatsa-25 nesteestä saadaan epäpuhdas immunoglobuliinijae saosta-malla huoneenlämpötilassa 18 % natriumsulfaatilla. Sitten tämä jae lasketaan Sephacryl G 200:n (Pharmacia) läpi valmistajan ohjeiden mukaan noudattamalla valmistajan ohjeita käyttämällä 0,1 M Tris.HCl-puskuria, 30 pH 8,2. Aktiiviset jakeet yhdistetään ja väkevöidään

Amicon XM 50-suotimilla (Amicon). Proteiinimääritys suoritetaan OD2gg-mittauksella olettaen, että 1 mg proteiinia aiheuttaa adsorbanssin 1,2, kun allonpituus on 280 nm 1 cm kyvetissä.

82 8071 9 (E) Immuuniadsorbenttipylväs 1K2-20 1 ml laskeutunutta "Affi-Gel 10:tä" (Bio-Rad) liitetään 15 mg:aan monoklonaalisen anti-IFN-vasta-aineen immunoglobuliinia valmistajan ohjeita noudattaen: 5 "Affi-Gel 10" pestään huokoslasisuotimella varustetussa suppilossa ensin kylmällä tislatulla vedellä ja sitten 0,1 M NaHCO^:lla, pH 8,0 (liittämispuskuri). Liittämis-puskuriin tehty 50 % geeli siirretään muoviputkeen, sekoitetaan yhtä suuren tilavuuden kanssa puhdistetun vas-10 ta-aineen liuosta ja pyöritetään 4 tuntia huoneenlämpö- tilassa. Liittämisen jälkeen geeli pestään liittämispusku-rilla ja, jotta reagoimattomat kohdat tukkeutuvat, se käsitellään 0,1 ml:11a 1M etanoliamiini.HCl-liuosta (pH 8,0) per ml geeliä 1 - 2 tuntia huoneenlämpötilassa.

15 Geeli pestään fosfaatilla puskuroidulla luolaliuoksella 10 mM NaN^:n läsnäollessa ja pidetään siinä 4 °C:ssa.

0,8 ml näin saatua geeliä käytetään sen monoklonaalisen vasta-ainepylvään valmistukseen (nimi 1K2-20', jonka avulla ihmisen LylFN valmistetaan (ks. edellä).

20 10. Farmaseuttiset valmisteet (parenteraalinen antotapa) 2 mg lymfoblastoidi-interferonia, joka on esim. kloonista E. coli HB 101 CG-pBR(AP)/LylFN- -3 (ks. esim. 9) esitetty LyIFN-a-3-muoto, ja jonka ominais-

Q

aktiivisuus on 1,8*10 yksikköä/mg, liuotetaan 30 ml:aan 25 5 N ihmisen seerumialbumiinia. Saatu liuos lasketaan bakteriologisen suotimen läpi ja suodatettu liuos jaetaan aseptisissa olosuhteissa 100 lääkepulloon, joista jokaiseen tulee 3,6 x 10b yksikköä puhdasta lymfoblastoidi-interferonia. Lääkepullot soveltuvat parenteraaliseen 30 lääkitykseen ja niitä on edullista säilyttää kylmässä, esim. - 20°C:ssa.

Samalla tavalla voidaan valmistaa lääkepulloja, 6 7 jotka sisältävät 7,2 x 10 tai 1,08 x 10 yksikköä, käyttämällä vastaaavasti 4 tai 6 mg edellämainittua 35 lymfoblastoidi-interferonia.

83 8071 9

Valmistettujen mikro-organismien talletus Tässä kuvatuilla menetelmillä valmistetuista mikro-organismeista ja yhdistelmä-DNA-molekyyleistä ovat käytännön esimerkkeinä viljelmät, jotka on talletettu 5 Agricultural Research Culture Collection (NRRL)-kokoelmiin 14. syyskuuta 1981, jossa niille on annettu seu-raavat tunnusnumerot: E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-31s NRRL B-12528 E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-41: NRRL B-12529 10 E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-l·b: NRRL B-12530 E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-Sj^: NRRL B-12531 E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-8^: NRRL B-12532 84 8071 9

Kirjallisuusluettelo 1. W.E. Stewart, II, The Interferon System, Springer Verlag, Wien (1979) 2. Interferon nomenclature, Nature 286, 110 (1980) 5 3. C. Weissmann, "DNA Sequences, recombinat DNA molecules and processes for producing human interferon-like polypeptides", Euroopp. patenttihakemus no 32134 (Biogen N.V.) 4. E.A. Havell et al., "Characteristics of Human Lymphoblas-toid (Namalva) Interferon", J. Gen. Virol. j38, 51-59 10 (1977) 5. A.D. Sagar et al., "Heterogeneity of interferon mRNA species from Sendai virus-induced human lymphoblastoid (Namalva) cells and Newcastle disease virus-induced : murin fibroblastoid (L) cells", Nucl. Acids Res. 9, 149- 15 160 (1981) 6. M. Rubenstein et al., "Human Leukocyte Interferon: Production, Purification to Homogeneity and Initial Characterization", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76., 640-644 (1979) 20 7. W.E. Steward, II et al., "Effect of Glycosylation

Inhibitors on the Production and Properties of Human : Leukocyte Interferon", Virology 91_, 473-476 (1979) ‘ ’ 8. K.C. Zoon et al., "Amino Terminal Sequence of the Major

Component of Human Lymphoblastoid Interferon", Science ;·; 25 207, 527-528 (1980) **: 9. S.N. Cohen and H.W. Boyer, "Process for Producing Bio logically Functional Molecular Chimeras", U.S. patentti no 4,237,244 (Leland Stanford Jr. University) 85 8071 9 10. S. Nagata et ai., "Synthesis in E. coli of a polypeptide with human leukocyte interferon activity", Nature 284, 316-320 (1980) 11. N. Mantei et al., "The nucleotide sequence of a cloned 5 human leukocyte interferon cDNA", Gene 1(), 1-10 (1980) 12. M. Streuli et al., "At least Three Human Type a Inter ferons: Structure of a2", Science 209, 1343-1347 (1980) 13. D.V. Goeddel et al, "Human leukocyte interferon produced by E. coli is biologically active", Nature 287, 411-416 10 (1980) 14. D.V. Goeddel et al., "The structure of eight distinct cloned human leukocyte interferon cDNAs", Nature 290, 20-26 (1981) 15. J. Groneberg et al., "Mikrobiologisch hergestelltes 15 Polypeptid mit der Aminosäuresequenz des menschlichen

Interferons, DNA und Plasmide, die fiir diese Sequenz codieren, Mikroorganismen, die diese genetische Information enthalten, und Verfahren zu deren Herstellung", Eurooppalainen patenttihakemus no 34307 (Hoechst Aktien-20 gesellschaft) 16. H. Sugano et al., "Novel DNA, cloned DNA, recombinant plasmid containing the DNA, microorganism containing the recombinant plasmid and process for their production", Eurooppalainen patenttihakemus no 28033 (Japanese 25 Foundation of Cancer Research) 17. T. Taniguchi et al., "The nucleotide sequence of human fibroblast interferon cDNA", Gene Γ0, 11-15 (1980) 18. R. Derycnk et al., "Isolation and structure of a human fibroblast interferon gene", Nature 285, 542-547 (1980) 86 8071 9 19. D.V. Goeddel et al., "Synthesis of human fibroblast interferon by E. coli", Nucl. Acids Res. 8, 4057-4075 (1980) 20. M. Revel et al., "Production of interferon by genetic 5 engineering", GB-patenttihakemus no 2,063,882 (Yeda

Research and Development Company) 21. "Gene for expressing protein similar to human interferon, derived plasmid recombinants, and modified bacterial cells", BE-patentti no 887,397 (Searle & Co.) 10 22. J. Groneberg et al., "Mikrobiologisch hergestelltes

Polypeptid mit der Aminosäuresequenz des menschlichen Interferons, DNA und Plasmide, die fiir diese Sequenz codieren, Mikroorganismen, die diese genetische Information enthalten, und Verfahren zu ihrer Herstellung" 15 Eurooppalainen patenttihakemus no 34306 (Hoechst Aktien- : gesellschaft) 23. T. Taniguchi et al., "Human leukocyte and fibroblast interferons are structurally related", Nature 285, 547-549 (1980) 20 24. M.D. Johnston et al., "Factors influencing production of interferon by human lymphoblastoid cells", Adv. Exp. Med. Biol. 110, 61-74 (1978) - 25. G. Allen et al., "A family of structural genes for human lymphoblastoid (leukocyte-type) interferon", Nature 287, 25 408-411 (1980) ;· 26. H. Strander et al., "Production of human lymphoblastoid interferon", J. Clin. Microbiol. JL, 116-117 (1975) 27. M.D. Johnston, "Improvement in or relating to a process for producing interferon", Eurooppalainen patenttihake- 87 8071 9 mus no 520 (Wellcome Foundation) 28. P. Swetly et al.f "Verbessertes Verfahren zur Herstellung von Humaninterferon aus lymphoblastoiden Zellen", DE-OS no 2,946,275 (Thomae) 5 29. J.A. Armstrong, "Semi-Micro Dye-Binding Assay for Rabbit

Interferon", Appi. Microbiol. 21, 723-725 (1971) 30. A. Colman et al., "Export of Proteins from Oocytes of Xenopus laevis", Cell Γ7, 517-526 (1979) 31. W.E. Stewart, II et al., "Interferon Production in 10 Hamsters Experimentally Infected With Rabies Virus",

Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 123, 650-653 (1966) 32. A.C. Peacock et al., "Resolution of Multiple Ribonucleic Acid Species by Polyacrylamide Gel Electrophoresis", Biochemistry 6, 1818-1827 (1967) 15 33. P.B. Sehgal et al., "Heterogeneity of poly(I)*poly(C)- induced human fibroblast interferon in RNA species", Nature 288, 95-97 (1980) 34. J.G. Sutcliffe, "pBR 322 restrictions map derived from the DNA sequence: accurate DNA sizw markers up to 4361 20 nucleotide pairs long", Nucl. Acids Res. 5, 2721-2728 (1978) 35. M. Mandel et al., "Calcium-dependent Bacteriophage DNA Infection", J. Mol. Biol. j^3, 159-162 (1970) 36. M. Grunstein and D.S. Hogness, "Colony hybridization: 25 A method for the isolation of cloned DNAs that contain a specific gene", Proc. Natl. Acad. Sci. Ύ2, 3961-3965 (1979) 88 8071 9 37. K. Itakura et ai., "Chemical DNA Synthesis and Recombinant DNA studies", Science 209, 1401-1405 (1980) 38. K. Itakura et ai., "Improved Triester Approach for the Synthesis of Pentadecathymidylic Acid", J. Am. Chem.

5 Soc. 97, 7327-7332 (1975) 39. J.F.M. de Rooij et ai., "Synthesis of complementary DNA fragments via phosphotriester intermediates", Reel. Trav. Chim. Pays-Bas 9J3, 537-548 (1979) 40. F. Sanger et ai., DNA sequencing with chain-terminating 10 inhibitors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 5463-5467 (1977) 41. A.M. Maxam and W. Gilbert, "A new method for sequencing DNA”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560-564 (1977); vrt. myös Meth. Enzym. ^5, 499-559 (1980) 15 42. J.B. Gurdon, J. Embryol. Exp. Morph. 20, 401-414 (1968) 43. Barth, J. Embryol. Exp. Morph. ]_, 210-222 (1959) 44. A. Efstratiadis et al., Full Length and Discrete Partial Reverse Transcripts of Globin and Chorion mRNAs, Cell 4, 367-378 (1975) 20 45. T. Maniatis et al., "Amplification and Characterization of a β-Globin Gene Synthesized in Vitro", Cell j), 163-182 (1976) 46. J.H.J. Hoeijmakers et al., "The isolation of plasmids containing DNA complementary to messenger RNA for 25 variant surface glycoproteins of Trypanosoma brucei",

Gene 8, 391-417 (1980) 89 8 0 7 1 9 47. W. Mueller et al., "Site-directed Mutagenesis in DNA: Generation of Point Mutations in Cloned B Globin Complementary DNA at the Positions Corresponding to Amino Acids 121 to 123", J. Mol. Biol. 124, 343-358 5 (1978) 48. J. Weissenbach et al., "Two interferon mRNAa in human fibroblasts: In vitro translation and Escherichia coli cloning studies", Proc. Natl. Acad. Sci. USA TJ_, 7152-7156 (1980) 10 49. U.K. Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970).

50. B.J. Radola, "Electrophoresis", s. 79-94, Walter de Gruyter, Berlin - New York 1980 51. T. Staehelin et al., J. Biol. Chem. 256, 9750-9754 (1981) 52. J.F. Kearney et al., J. Immunolog. 123, 1548 (1979) 15 53. G. Köhler and C. Milstein, Nature 256, 459 (1975) 54. G. Galfre et al., Nature 266, 550 (1977)

Claims (9)

90 8071 9

1. Menetelmä ihmisen interferonipolypeptidin valmistamiseksi, joka on HLycIFN-1'b, jota koodittaa DNA-liitännäi-nen, jolla on sekvenssi ATGGCCCTGTCCTTTTCTTTACCGATGGCCGTGCTGGTGCTCAGCCACAAATCCATCTGT TCTCTGGGCTGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGGTAATAGGAGGGCCTTGATACTCCTGGCACA AATGGGAAGAATCCCCCCTTTCTCCTGCCTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGT TTGATGGCAACCAGTTCCAGAAGGCTCAAGCCATCTCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGACCTTC AATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTACTTGGGAACAGAGCCTCCTAGAAAAATTTTCCACTGA ACTTAACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGCGTGATACAGGAGGTTGGGGTGGAAGAGACTCCCC TGATGAATGTGGACTCCATCCTGGCTGTGAAGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTTTATCTGACAGAG AAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCCTTCTCTTTATCAAA AATTTTTCAAGAAAGATTAAGGAGGAAGGAATGA, HLycIFN-5^, jota koodittaa DNA-liitännäinen, jolla on sekvenssi ATGGCCTTGACTTTTTATTTACTGGTGGCCC TAGTGGTGCTCAGCTACAAGTCATTCAGCTCTCTGGGCTGTGATCTGCCTCAGACTCACAGCCTGGG TAACAGGAGGGCCTTGATACTCCTGGCACAAATGCGAAGAATCTCTCCTTTCTCCTGCCTGAAGGAC AGACATGACTTTGAATTCCCCCAGGAGGAGTTTGATGATAAACAGTTCCAGAAGGCTCAAGCCATCT CTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAACCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTT GGATGAGACCCTTCTAGATGAATTCTACATCGAACTTGACCAGCAGCTGAATGACCTGGAG TCCTGTGTGATGCAGGAAGTGGGGGTGATAGAGTCTCCCCTGATGTACGAGGACTCCATCCTGGCTG TGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTATATCTGACAGAGAAGAAATACAGCTCTTGTGCCTGGGA GGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCCTTCTCTTTATCAATCAACTTGCAAAAAACATTGAAGAGT AAGGAATGA, LyIFN-α-ΐ, jota koodittaa DNA-liitännäinen, jolla on sekvenssi ATGTGTGATCTGCCTCA GACCCACAGCCTGGGTAATAGGAGGGCCTTGATACTCCTGGCACAAATGGGAAGAATCCCCCCTTTC TCCTGCCTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCAGA AGGCTCAA GCCATCTCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGG ACTCATCTGCTACTTGGGAACAGAGCCTCCTAGAAAAATTTTCCACTGAACTTAACCAGCAGCTGAA TGACCTGGAAGCCTGCGTGATACAGGAGGTTGGGGTGGAAGAGACTCCCCTGATGAATGTGGACTCC ATCCTGGCTGTGAAGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTTTATCTGACAGAGAAGAAATACAGCCCTT GTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCCTTCTCTTTATCAAAAATTTTTCAAGAAAG ATTAAGGAGGAAGGAATGA 91 8071 9 tai LyIFN-a-2, jota koodittaa DNA-liitännäinen, jolla on sekvenssi ATGTGTGATCTGCCTC agactcacagcctgggtaacaggagggccttgatactcctggcacaaatgcgaagaatctctcctt TCTCCTGCCTGAAGGACAGACATGACTTTCAATTCCCCCAGGAGGAGTTTGATGATAAACAGTTCC AGAAGGCTCAAGCCATCTCTGTCCTCCATCAGATGATCCAGCAGACCTTCAACCTCTTCAGCACAA AGGACTCATCTGCTGCTTTGGATGAGACCCTTCTAGATGAATTCTACATCGAACTTGACCAGCAGC tgaatgacctgcactcctgtgtgatgcagcaagtgggggtcatagagtctcccctcatctaccacg actccatcctggctgtgaggaaatacttccaaagaatcactctatatctcacagagaacaaataca CCTCTTCTGCCTGGCACGTTGTCAGAGCACAAATCATGAGATCCTTCTC7TTATCAATCAACTTCC aaaaaacattgaagactaaccaatca , tunnettu siitä, että viljellään hiiva- tai E. coli-isäntää, joka on transformoitunut vähintään yhdellä yhdistel-mä-DNA:lla, joka sisältää minkä tahansa mainituista DNA-lii-tännäisistä, ja kyseinen polypeptidi otetaan talteen vilje-lyalustasta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan HLycIFN-1'b, jolla on sekvenssi MET ALA LEU SEK PHE SER LEU LED MET AU VAL UO VAL LEU SER TYR LYS SER ILE CYS SER LEU CLY CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS SER LEU GLY AS N ARG ARG ALA LEU ILE LEU LEU ALA GLN MET GLY ARG ILE PRO PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HI S ASP PHE GLY PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP CLY ASN GLN PHE GLN LYS ALA GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GLN THR PHE ASN LEU PHE SER THR LYS ASP SER SER ALA THR TRP GLU GLN SER LEU LEU GLU LYS PHE SER THR GLU LEU ASN GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU ALA CYS VAL ILE GLN GLU VAL GLY VAL GLU GLU THR PRO LEU MET ASN VAL ASP SER ILE LEU ALA VAL LYS LYS TYR PHE GLN ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR SER PRO CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER PHE SER LEU SER LYS ILE PHE GLN GLU ARG LEU ARG ARG LYS GLU

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan HLycIFN-5i, jolla on sekvenssi 92 8071 9 MET ALA LEU THR PHE TYR LEU LEU VAL ALA LEU VAL VAL LEU SER TYR LYS SER PHE SER SER LEU GLY CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS SER LEU CLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU LEU ALA GLN MET ARG ARC ILE SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GLN THR PHE ASN LEU PHE SER THR LYS ASP SER SER ALA ALA LEU ASP GLU THR LEU LEU AS? GLU PHE TYR ILE GLU LEU ASP GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU SER CYS VAL MET GLN GLU VAL GLY VAL ILE GLU SER PRO LEU MET TYR GLU ASP SER ILE LEU ALA VAL ARG LYS TYR PHE GLN ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR SER SER CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER FHE SER LEU SER ILE ASN LEU GLN LYS ARG LEU LYS SER LYS GLU

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan LyIFN-a-1.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan LyIFN-a-2.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että transformoitunut isäntä on E. coli HB 101 CG-pBR322/HLycIFN-l'b (NRRL B-12530).

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että transformoitunut isäntä on E. coli HB 101 CG-pBR322/HLycIFN-51 (NRRL B-12531).

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että transformoitunut isäntä on E. coli HB 101 CG-pBR(AP)/LyIFN-a-1.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että transformoitunut isäntä on E. coli HB 101 CG-pBR(AP)/LyIFN-a-2. 93 8071 9