JP2003522534A - インターフェロン−アルファに誘導された遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、インターフェロン−α投与によりアップレギュレートされる遺伝子としてすでに知られている遺伝子の同定に関し、特にｇ４７５８３０３、ｇ５４５３８９７、ｇ４５０５１８６、ｇ２３６６７５１、ｇ３３９１７、ｇ４５０４９６２、ｇ３９７８５１６、ｇ５９２４３９６、ｇ４５０５６５６、ｇ１５０４００７、ｇ３７０２４４６、ｇ４００１８０２、ｇ２９２２８９、ｇ４５５７２２６、ｇ４５０７６４６、およびｇ４５０７１７０と指定されたジーンバンク（GenBank）のｃＤＮＡ配列に対応するヒト遺伝子に関する。これらの遺伝子の発現生成物の測定は、インターフェロン−αや１型インターフェロン受容体で作用する他のインターフェロンによる治療に対する応答性を予測するのに有用であるとされている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）投与によりアップレギュレー
トされる遺伝子としてすでに知られている遺伝子の同定に関する。すなわちこれ
らの遺伝子の発現生成物の検出は、ＩＦＮ−αや１型インターフェロン受容体で
作用する他のインターフェロンに対する応答性を予測するための手段として提唱
される。

【０００２】 （発明の背景） ＩＦＮ−αは、多くの疾患の治療に広く使用されている。ＩＦＮ−αを使用し
て治療される疾患には、新生物疾患、例えば白血病、リンパ腫、および固形腫瘍
、ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫、およびウイルス感染症（例えば、慢性肝炎）がある
。ＩＦＮ−αはまた、自己免疫疾患、マイコバクテリウム（Mycobacterium）疾
患、神経変性疾患、寄生体疾患およびウイルス疾患の治療のために、口腔粘着経
路による投与が提唱されている。特にＩＦＮ−αは、例えば多発性硬化症、らい
病、結核、脳炎、マラリア、子宮頚癌、陰部ヘルペス、肝炎ＢとＣ、ＨＩＶ、Ｈ
ＰＶ、およびＨＳＶ−１と２の治療について提唱されている。またこれは、関節
炎、ループスおよび糖尿病の治療について示唆されている。新生物疾患、例えば
、多発性骨髄腫、ヘアリーセル白血病、慢性骨髄性白血病、低グレードリンパ腫
、皮膚T細胞リンパ腫、カルチノイド腫瘍、子宮頚癌、肉腫（例えばカポジ肉腫
）、腎腫瘍、癌（腎細胞癌、肝細胞癌、上咽頭癌、血液癌、結腸直腸癌、神経膠
芽細胞腫、喉頭パピローマ、肺癌、結腸癌、悪性黒色腫、および脳腫瘍を含む）
もまた、口腔粘着経路（すなわち、経口および鼻内経路）によるＩＦＮ−αの投
与により治療可能であることが示唆されている。

【０００３】 ＩＦＮ−αは、１型インターフェロンファミリーのメンバーであり、１型イン
ターフェロン受容体との相互作用を介して、その特徴的な生物活性を示す。他の
１型インターフェロンには、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ω、およびＩＦＮ−τがある
。

【０００４】 残念ながら、インターフェロン−αのような１型インターフェロンによる治療
の必ずしもすべての患者（例えば、慢性ウイルス肝炎、新生物疾患、および再発
性弛緩性多発性硬化症の患者）が、１型インターフェロン療法に良好に応答せず
、応答する者のうちほんの一部のみが長期的効果を示す。医師が１型インターフ
ェロンの治療の結果を自信を持って予測できないことは、そのような治療のコス
ト−利益比に関して、治療の膨大な生物薬学的時間と失われた時間の無駄と、患
者が受ける重大な副作用の点から、重大な問題を提起している。さらに、ＩＦＮ
−αの異常産生は、多くの自己免疫疾患を引き起こすことが証明されている。こ
れらの理由のために、１型インターフェロンは、多くの遺伝子の発現を調節して
治療作用を示すため、１型インターフェロン応答性遺伝子の同定に大きな関心が
寄せられている。実際、患者が治療にうまく応答するかいなかを決定するのは、
１型インターフェロン治療により誘導される遺伝子発現の特異的パターンである
。

【０００５】 （発明の要約） ジーンバンク（GenBank）で割り当てられた受け入れ番号ｇ４７５８３０３、
ｇ５４５３８９７、ｇ４５０５１８６、ｇ２３６６７５１、ｇ３３９１７、ｇ４
５０４９６２、ｇ３９７８５１６、ｇ５９２４３９６、ｇ４５０５６５６、ｇ１
５０４００７、ｇ３７０２４４６、ｇ４００１８０２、ｇ２９２２８９、ｇ４５
５７２２６、ｇ４５０７６４６、およびｇ４５０７１７０中のｃＤＮＡ配列に対
応するヒト遺伝子は、口腔粘着経路または静脈内投与によるＩＦＮ−αの投与に
よりアップレギュレートされるマウス遺伝子に対応することがわかった。

【０００６】 ジーンバンク（GenBank）で割り当てられた受け入れ番号ｇ４７５８３０３中
のｃＤＮＡ配列に対応するヒト遺伝子は、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ
関連タンパク質（ＥＲＰ−７０）をコードするとしてジーンバンク（GenBank）
で以前認識されていたが、１型インターフェロン投与に関連するとしては注目さ
れていなかった。これは今、ＩＦＮ−αでアップレギュレートされる遺伝子とも
呼ばれる。

【０００７】 ジーンバンク（GenBank）で割り当てられた受け入れ番号ｇ５４５３８９７中
のｃＤＮＡ配列に対応するヒト遺伝子は、ペプチジル−プロリルシス／トランス
イソメラーゼＮＩＭＡ相互作用性１（ＰＩＮ−１）と呼ぶタンパク質をコードす
るとしてジーンバンク（GenBank）で以前認識されていたが、１型インターフェ
ロン投与に関連するとしては注目されていなかった。これは今、ＩＦＮ−αでア
ップレギュレートされる遺伝子とも呼ばれる。

【０００８】 ジーンバンク（GenBank）で割り当てられた受け入れ番号ｇ４５０５１８６中
のｃＤＮＡ配列に対応するヒト遺伝子は、ガンマインターフェロンにより誘導さ
れるモノカイン（ＭＩＧ）をコードするとしてジーンバンク（GenBank）で以前
認識されていたが、１型インターフェロン投与に関連するとしては注目されてい
なかった。これは今、ＩＦＮ−αでアップレギュレートされる遺伝子とも呼ばれ
る。

【０００９】 ジーンバンク（GenBank）で割り当てられた受け入れ番号ｇ２３６６７５１中
のｃＤＮＡ配列に対応するヒト遺伝子は、リジルｔＲＮＡシンセターゼ（ＬＴＳ
）をコードするとしてジーンバンク（GenBank）で以前認識されていたが、１型
インターフェロン投与に関連するとしては注目されていなかった。これは今、Ｉ
ＦＮ−αでアップレギュレートされる遺伝子とも呼ばれる。

【００１０】 ジーンバンク（GenBank）で割り当てられた受け入れ番号ｇ３３９１７中のｃ
ＤＮＡ配列に対応するヒト遺伝子は、血小板タンパク質と相同性を有する、ガン
マインターフェロン誘導性早期応答遺伝子（ＩＰ−１０）をコードするとしてジ
ーンバンク（GenBank）で以前認識されていたが、１型インターフェロン投与に
関連するとしては注目されていなかった。これは今、ＩＦＮ−αでアップレギュ
レートされる遺伝子とも呼ばれる。

【００１１】 ジーンバンク（GenBank）で割り当てられた受け入れ番号ｇ４５０４９６２中
のｃＤＮＡ配列に対応するヒト遺伝子は、リポラカン（Lipocalin）１をコード
するとしてジーンバンク（GenBank）で以前認識されていたが、１型インターフ
ェロン投与に関連するとしては注目されていなかった。これは今、ＩＦＮ−αで
アップレギュレートされる遺伝子とも呼ばれる。

【００１２】 ジーンバンク（GenBank）で割り当てられた受け入れ番号ｇ３９７８５１６中
のｃＤＮＡ配列に対応するヒト遺伝子は、ＳＥＣ６３をコードするとしてジーン
バンク（GenBank）で以前認識されていたが、１型インターフェロン投与に関連
するとしては注目されていなかった。これは今、ＩＦＮ−αでアップレギュレー
トされる遺伝子とも呼ばれる。

【００１３】 ジーンバンク（GenBank）で割り当てられた受け入れ番号ｇ５９２４３９６中
のｃＤＮＡ配列に対応するヒト遺伝子は、スルフェイト（surfeit）６をコード
するとしてジーンバンク（GenBank）で以前認識されていたが、１型インターフ
ェロン投与に関連するとしては注目されていなかった。これは今、ＩＦＮ−αで
アップレギュレートされる遺伝子とも呼ばれる。

【００１４】 ジーンバンク（GenBank）で割り当てられた受け入れ番号ｇ４５０５６５６中
のｃＤＮＡ配列に対応するヒト遺伝子は、ｃＧＭＰ刺激ホスホジエステラーゼ２
Ａ（ＤＥ２Ａ）をコードするとしてジーンバンク（GenBank）で以前認識されて
いたが、１型インターフェロン投与に関連するとしては注目されていなかった。
これは今、ＩＦＮ−αでアップレギュレートされる遺伝子とも呼ばれる。

【００１５】 ジーンバンク（GenBank）で割り当てられた受け入れ番号１５０４００７中の
ｃＤＮＡ配列に対応するヒト遺伝子は、ＫＩＡＡ０２１２をコードするとしてジ
ーンバンク（GenBank）で以前認識されていたが、１型インターフェロン投与に
関連するとしては注目されていなかった。これは今、ＩＦＮ−αでアップレギュ
レートされる遺伝子とも呼ばれる。

【００１６】 ジーンバンク（GenBank）で割り当てられた受け入れ番号ｇ３７０２４４６中
のｃＤＮＡ配列に対応するヒト遺伝子は、ホスファチジルイノシトール４−キナ
ーゼ（ＮＰＩＫ−Ｂ）をコードするとしてジーンバンク（GenBank）で以前認識
されていたが、１型インターフェロン投与に関連するとしては注目されていなか
った。これは今、ＩＦＮ−αでアップレギュレートされる遺伝子とも呼ばれる。

【００１７】 ジーンバンク（GenBank）で割り当てられた受け入れ番号ｇ４００１８０２中
のｃＤＮＡ配列に対応するヒト遺伝子は、ＢＡＦ５３ａをコードするとしてジー
ンバンク（GenBank）で以前認識されていたが、１型インターフェロン投与に関
連するとしては注目されていなかった。これは今、ＩＦＮ−αでアップレギュレ
ートされる遺伝子とも呼ばれる。

【００１８】 ジーンバンク（GenBank）で割り当てられた受け入れ番号ｇ２９２２８９中の
ｃＤＮＡ配列に対応するヒト遺伝子は、ＭＡＤＳ／ＭＥＦ２ファミリー転写因子
（ＭＥＦ２Ｃ）をコードするとしてジーンバンク（GenBank）で以前認識されて
いたが、１型インターフェロン投与に関連するとしては注目されていなかった。
これは今、ＩＦＮ−αでアップレギュレートされる遺伝子とも呼ばれる。

【００１９】 ジーンバンク（GenBank）で割り当てられた受け入れ番号ｇ４５５７２２６中
のｃＤＮＡ配列に対応するヒト遺伝子は、アリールアセトアミドデアセチラーゼ
（ＡＡＤＡＣ）をコードするとしてジーンバンク（GenBank）で以前認識されて
いたが、１型インターフェロン投与に関連するとしては注目されていなかった。
これは今、ＩＦＮ−αでアップレギュレートされる遺伝子とも呼ばれる。

【００２０】 ジーンバンク（GenBank）で割り当てられた受け入れ番号ｇ４５０７６４６中
のｃＤＮＡ配列に対応するヒト遺伝子は、αトロポミオシン１（ＴＰＭ１）をコ
ードするとしてジーンバンク（GenBank）で以前認識されていたが、１型インタ
ーフェロン投与に関連するとしては注目されていなかった。これは今、ＩＦＮ−
αでアップレギュレートされる遺伝子とも呼ばれる。

【００２１】 ジーンバンク（GenBank）で割り当てられた受け入れ番号ｇ４５０７１７０中
のｃＤＮＡ配列に対応するヒト遺伝子は、酸性でありシステインの多い分泌され
るタンパク質（ＳＰＡＲＣ）をコードするとしてジーンバンク（GenBank）で以
前認識されていたが、１型インターフェロン投与に関連するとしては注目されて
いなかった。これは今、ＩＦＮ−αでアップレギュレートされる遺伝子とも呼ば
れる。

【００２２】 従って、例えば口腔粘着経路または静脈内経路で、１型インターフェロンで治
療される患者（例えば、ＩＦＮ−αで治療される患者）の細胞試料中の、ＥＲＰ
−７０、ＰＩＮ−１、ＭＩＧ、ＬＴＳ、ＩＰ−１０、リポカリン１、ＳＥＣ６３
、スルフェイト６、ＰＤＥ２Ａ、ＫＩＡＡ０２１２、ＮＰＩＫ−Ｂ、ＢＡＦ５３
ａ、ＭＥＦ２Ｃ、ＡＡＤＡＣ、ＴＰＭ１もしくはＳＰＡＲＣタンパク質、または
その天然に存在する変種、または対応するｍＲＮＡのレベルの測定は、そのよう
な治療に対する応答性を予測するのに使用できる。さらに、このような応答性は
、代替的におよびより好ましくは、例えばヒト末梢血単核細胞の試料をインビト
ロで１型インターフェロンで処理し、同じ遺伝子に対応する発現生成物（好まし
くはｍＲＮＡ）のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを探す
ことにより、判定されることがわかった。

【００２３】 （配列の簡単な説明） 配列番号１は、以下に示す、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ４７５
８３０３のｃＤＮＡの配列と、対応するコードされたポリペプチド配列である。

【００２４】 配列番号２は、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ４７５８３０４に対
応するＥＲＰ−７０のアミノ酸配列のみである。

【００２５】 配列番号３は、以下に示す、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ５４５
３８９７のｃＤＮＡの配列と、対応するコードされたポリペプチド配列である。

【００２６】 配列番号４は、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ５４５３８９８に対
応するＰＩＮ−１のアミノ酸配列のみである。

【００２７】 配列番号５は、以下に示す、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ４５０
５１８６のｃＤＮＡの配列と、対応するコードされたポリペプチド配列である。

【００２８】 配列番号６は、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ４５０５１８７に対
応するＭＩＧのアミノ酸配列のみである。

【００２９】 配列番号７は、以下に示す、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ２３６
６７５１のｃＤＮＡの配列と、対応するコードされたポリペプチド配列である。

【００３０】 配列番号８は、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ２３６６７５２に対
応するＬＴＳのアミノ酸配列のみである。

【００３１】 配列番号９は、以下に示す、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ３３９
１７のｃＤＮＡの配列と、対応するコードされたポリペプチド配列である。

【００３２】 配列番号１０は、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ３３９１８に対応
するＩＰ−１０のアミノ酸配列のみである。

【００３３】 配列番号１１は、以下に示す、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ４５
０４９６２のｃＤＮＡの配列と、対応するコードされたポリペプチド配列である
。

【００３４】 配列番号１２は、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ４５０４９６３に
対応するリポカリン１のアミノ酸配列のみである。

【００３５】 配列番号１３は、以下に示す、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ３９
７８５１６のｃＤＮＡの配列と、対応するコードされたポリペプチド配列である
。

【００３６】 配列番号１４は、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ３９７８５１７に
対応するＳＥＣ６３のアミノ酸配列のみである。

【００３７】 配列番号１５は、以下に示す、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ５９
２４３９６のｃＤＮＡの配列と、対応するコードされたポリペプチド配列である
。

【００３８】 配列番号１６は、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ５９２４３９６に
対応するスルフェイト６のアミノ酸配列のみである。

【００３９】 配列番号１７は、以下に示す、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ４５
０５６５６のｃＤＮＡの配列と、対応するコードされたポリペプチド配列である
。

【００４０】 配列番号１８は、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ４５０５６５６に
対応するＰＤＥ２Ａのアミノ酸配列のみである。

【００４１】 配列番号１９は、以下に示す、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ１５
０４００７のｃＤＮＡの配列と、対応するコードされたポリペプチド配列である
。

【００４２】 配列番号２０は、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ１５０４００８に
対応するＫＩＡＡ０２１２のアミノ酸配列のみである。

【００４３】 配列番号２１は、以下に示す、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ３７
０２４４６のｃＤＮＡの配列と、対応するコードされたポリペプチド配列である
。

【００４４】 配列番号２２は、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ３７０２４４７に
対応するＮＰＩＫ−Ｂのアミノ酸配列のみである。

【００４５】 配列番号２３は、以下に示す、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ４０
０１８０２のｃＤＮＡの配列と、対応するコードされたポリペプチド配列である
。

【００４６】 配列番号２４は、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ４００１８０３に
対応するＢＡＦ５３ａのアミノ酸配列のみである。

【００４７】 配列番号２５は、以下に示す、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ２９
２２８９のｃＤＮＡの配列と、対応するコードされたポリペプチド配列である。

【００４８】 配列番号２６は、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ２９２２９０に対
応するＭＥＦ２Ｃのアミノ酸配列のみである。

【００４９】 配列番号２７は、以下に示す、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ４５
５７２２６のｃＤＮＡの配列と、対応するコードされたポリペプチド配列である
。

【００５０】 配列番号２８は、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ４５５７２２６に
対応するＡＡＤＡＣのアミノ酸配列のみである。

【００５１】 配列番号２９は、以下に示す、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ４５
０７６４６のｃＤＮＡの配列と、対応するコードされたポリペプチド配列である
。

【００５２】 配列番号３０は、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ４５０７６４７に
対応するＴＰＭ１のアミノ酸配列のみである。

【００５３】 配列番号３１は、以下に示す、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ４５
０７１７０のｃＤＮＡの配列と、対応するコードされたポリペプチド配列である
。

【００５４】 配列番号３２は、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号ｇ４５０７１７１に
対応するＳＰＡＲＣのアミノ酸配列のみである。

【００５５】 （詳細な説明） 本発明は、１型インターフェロン、例えばＩＦＮ−αによる治療（例えば、口
腔粘膜経路または非経口的経路（例えば、静脈内、皮下、または筋肉内経路）に
よるＩＦＮ−α治療）に対する患者の応答性を予測する方法であって、該患者の
細胞試料中の、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１
０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０
、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、
または配列番号３２に記載の配列により定義されるタンパク質から選択される、
１つ以上のタンパク質、またはその天然に存在する変種（例えば、アレレ変種）
、または１つ以上の対応するｍＲＮＡ、のレベルを測定することを含んでなり、
該試料は、１型インターフェロンが投与された後に該患者から得られるか、また
は該測定前に１型インターフェロン(例えば、ＩＦＮ−α）でインビトロで処理
される、上記方法を提供する。このような測定は、その発現が、１型インターフ
ェロン投与（例えば、ＩＦＮ−α投与）によりヒト細胞中で影響を受けることが
知られている、任意の他のタンパク質またはｍＲＮＡの測定と組合せてもよい。

【００５６】 好ましくは、応答性を試験するための１型インターフェロンは、治療用に選択
された１型インターフェロンであろう。これは、提唱された治療経路および提唱
された治療用量で投与される。好ましくは、以後の分析される試料は、例えば血
液試料または血液試料から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）の試料であ
る。

【００５７】 より便利で好ましくは、血液から単離したＰＢＭＣｓを含む患者から得られた
試料を、インビトロで１型インターフェロン（例えば、約１〜１０，０００IU/m
lの用量範囲）で処理する。そのような処理は、数時間（例えば、約７〜８時間
）の長さである。そのようなインビトロ試験の好適な処理条件は、正常ドナーか
ら取ったＰＢＭＣｓを同じインターフェロンで試験し、適切な発現生成物のアッ
プレギュレーションを調べることにより決定される。再度、使用される１型イン
ターフェロンは、好ましくは患者の治療に提唱された１型インターフェロン（例
えば、組換えＩＦＮ−α）である。そのような試験のＰＢＭＣｓは、従来法で血
液試料からフィコール−ヒペーク（Ficoll-Hypaque）密度勾配を使用して単離さ
れる。１型インターフェロン応答性のそのようなインビトロ試験の適切なプロト
コールの例を、以下の例１８に示す。

【００５８】 試料は、適宜、１型インターフェロンによるインビトロ処理の後に、ＥＲＰ−
７０、ＰＩＮ−１、ＭＩＧ、ＬＴＳ、ＩＰ−１０、リポカリン１、ＳＥＣ６３、
スルフェイト６、ＰＤＥ２Ａ、ＫＩＡＡ０２１２、ＮＰＩＫ−Ｂ、ＢＡＦ５３ａ
、ＭＥＦ２Ｃ、ＡＡＤＡＣ、ＴＰＭ１もしくはＳＰＡＲＣタンパク質の１つ以上
、またはその天然に存在する変種のレベルについて分析される。これは、ＥＲＰ
−７０、ＰＩＮ−１、ＭＩＧ、ＬＴＳ、ＩＰ−１０、リポカリン１、ＳＥＣ６３
、スルフェイト６、ＰＤＥ２Ａ、ＫＩＡＡ０２１２、ＮＰＩＫ−Ｂ、ＢＡＦ５３
ａ、ＭＥＦ２Ｃ、ＡＡＤＡＣ、ＴＰＭ１もしくはＳＰＡＲＣタンパク質の１つ以
上、およびはその天然に存在する変種（例えば、そのアレレ変種）に特異的に結
合することができる１つまたは複数の抗体を使用して行われる。しかし好ましく
は試料は、ＥＲＰ−７０、ＰＩＮ−１、ＭＩＧ、ＬＴＳ、ＩＰ−１０、リポカリ
ン１、ＳＥＣ６３、スルフェイト６、ＰＤＥ２Ａ、ＫＩＡＡ０２１２、ＮＰＩＫ
−Ｂ、ＢＡＦ５３ａ、ＭＥＦ２Ｃ、ＡＡＤＡＣ、ＴＰＭ１もしくはＳＰＡＲＣタ
ンパク質、またはその天然に存在する変種をコードするｍＲＮＡについて分析さ
れる。そのようなｍＲＮＡ分析は、ｍＲＮＡの検出について公知の任意の方法（
例えば、ノーザンブロット検出またはｍＲＮＡ差別ディスプレイ（differentioa
l display））を使用してもよい。検出前に、試料中に存在する目的のｍＲＮＡ
またはその一部を増幅するのに、種々の公知の核酸増幅プロトコールが使用でき
る。目的のｍＲＮＡまたは対応する増幅核酸は、固体支持体に結合した核酸プロ
ーブを使用して、プローブ結合してもよい。そのような固体支持体は、１型イン
ターフェロンでアップレギュレートされた遺伝子（例えばＩＦＮ−αの口腔粘膜
または静脈内投与に応答してアップレギュレートされたとして同定された遺伝子
）に対応する、さらなるｍＲＮＡまたはその増幅生成物のレベルを測定するため
のプローブを有する前記のミクロアレイでもよい。そのようなミクロアレイ（一
般に、核酸、プローブまたはＤＮＡチップとも呼ぶ）を構築する方法は、公知で
ある（例えば、アフィマックス・テクノロジーズ・エヌ・ブイ（Affymax Techno
logies N.V.）のＥＰ−Ｂ０４７６０１４号および０６１９３２１号と、Nature
Genetics 増刊、１９９９年１月、標題「チッピング予測（Chipping Forecast）
」を参照されたい）。

【００５９】 以下の例は本発明を例示する。 例

【００６０】 例１ 正常な成体マウスの各鼻孔に、Ｐ２０エッペンドルフマイクロピペットを使用
して、５μlのクリスタルバイオレットを適用すると、ほとんど直後に口咽頭腔
の全表面にわたって色素が分布することが、以前の実験で証明されている。口咽
頭腔の染色は、色素の適用後約３０分後もまだ明らかであった。これらの結果は
、同じ方法で適用された¹²⁵Ｉ−標識組換えヒトＩＦＮ−α１−８を使用して確
認された。同じ投与法を使用して、以下に示す試験で口腔粘膜投与を行った。

【００６１】 ６週齢の雄のＤＢＡ／２マウスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のラ
イフテクノロジーズ社（Life Technologies Inc.）から購入した１００，０００
IUの組換えマウスインターフェロンα（ＩＦＮα）、プロテインインスチチュー
ト社（Protein Institute Inc.）から購入した１０μgの組換えヒトインターロ
イキン１５（ＩＬ−１５）、１００μg/mlのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
有するＰＢＳで処理したか、または未処理のままとした。８時間後、マウスを頚
部脱臼により屠殺し、口咽頭腔から外科的にリンパ組織を取り出し、液体窒素中
で急速凍結し、−８０℃で保存した。チョムクジンスキー（Chomczynski）とサ
ッチ（Sacchi）の方法（Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159）によりリンパ組
織からＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ差別ディスプレイ分析を行った（ラング・ピー
（Lang. P.）とパルディー・エー・ビー（Pardee, A.B.）, Science 257, 967-9
71）。

【００６２】 差別ディスプレイ分析 差別ディスプレイ分析は、ゲンフンター・コーポレーション（GenHunter Corp
oration）の「メッセージクリーン（Message Clean）」と「ＲＮＡイメージ（RN
A image）」キットを、基本的に製造業者が記載するように使用して行った。簡
単に説明すると、ＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅで処理し、１μg
を、３つの１塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡ、Ｃ、またはＧのい
ずれかを使用して、１００μlの反応緩衝液中で逆転写した。ＲＮＡはまた、９
個の２塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、Ｃ
Ａ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＣのいずれかを使用して逆転写した。比較すべきすべ
て試料を、同じ実験で逆転写し、アリコートに分けて凍結した。ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼとα−³³Ｐ ｄＡＴＰ（３，０００Ci/mmol）を含有する１０μlの増
幅混合物中のわずかに１μlのみの逆転写試料を用いて、増幅を行った。８０の
５'末端（ＨＡＰ）ランダム配列プライマーを、（ＨＴ１１）Ａ、Ｃ、Ｇ、ＡＡ
、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、ＣＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、またはＧＣプライマーのそれぞ
れと組合せて使用した。次に試料を、７％変性ポリアクリルアミドゲルで流し、
オートラジオグラフィーに暴露した。推定の差別的に発現されたバンドを切り取
り、供給業者の説明書に従って再増幅し、ＩＦＮ処理、ＩＬ−１５処理、および
賦形剤処理動物の口咽頭腔から抽出したＲＮＡのノーザンブロットとハイブリダ
イズするプローブとしてさらに使用した。

【００６３】 クローニングと配列決定 差別ディスプレイスクリーニングからの再増幅バンドを、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉ
ｐｔＳＫ（＋）プラスミド（ストラタジーン（Stratagene））のＳｆｒ１部位に
クローン化し、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅から増幅されたｃＤＮＡを、ｐＣＲ３プ
ラスミド（インビトロゲン（Invitrogen））中のＴＡクローニングにより単離し
た。自動ジデオキシシーケンサー（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）ＡＢＩ
ＰＲＩＳＭ３７７）を使用して、ＤＮＡを配列決定した。

【００６４】 ヒトｃＤＮＡの同定 差別ディスプレイスクリーニングから同定した差別的に発現されたマウス３'
配列を、米国ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメ
ーション（ＮＣＢＩ、National Center for Biotechnology Information）のジ
ーンバンク（GenBank）（登録商標）のｄｂＥＳＴデータベース中に存在するラ
ンダムなヒトの発現配列標識物（ＥＳＴ）と比較した。差別ディスプレイスクリ
ーニングから単離されたマウスＥＳＴと関連するかも知れない配列をコンチグ（
contig）で組合せて、推定ｃＤＮＡに対応するヒトコンセンサス配列を構築する
のに使用した。

【００６５】 そのようなｃＤＮＡの１つは、ジーンバンク（GenBank）ｃＤＮＡ配列ｇ４７
５８３０３に対応することがわかった。対応するポリペプチド配列は、ジーンバ
ンク（GenBank）配列ｇ４７５８３０４であり、これは、ＥＲＰ−７０に対応す
るとしてジーンバンク（GenBank）で認められている。

【００６６】 上記したようにＩＦＮ−αの口腔粘着投与に応答してリンパ組織中でアップレ
ギュレートされた他のマウス遺伝子もまた、ＩＦＮ−αの静脈内投与に応答して
マウスの脾臓中でアップレギュレートされることがわかっている。ＩＦＮ−αの
静脈内投与を以下の例１７に記載のように行うと、ジーンバンク（GenBank）ｃ
ＤＮＡ受け入れ番号ｇ４７５８３０３により同定されるヒト遺伝子に対応するマ
ウス遺伝子について、同様の結果が予測される。

【００６７】 さらに、ＩＦＮ−αの口腔粘着および静脈内投与に応答してアップレギュレー
トされることがわかったマウス遺伝子のヒト遺伝子類似体に対応するｍＲＮＡは
、ＩＦＮ−αのインビトロの処理後にヒトの末梢血単核細胞中で増加することが
わかっている。ヒト末梢血単核細胞を以下の例１８に記載のようにＩＦＮ−αで
処理すると、配列番号１に示すｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡについて、同じ結果
が予測される。

【００６８】 例２ 正常な成体マウスの各鼻孔に、Ｐ２０エッペンドルフマイクロピペットを使用
して、５μlのクリスタルバイオレットを適用すると、ほとんど直後に口咽頭腔
の全表面にわたって色素が分布することが、以前の実験で証明されている。口咽
頭腔の染色は、色素の適用後約３０分後もまだ明らかであった。これらの結果は
、同じ方法で適用された¹²⁵Ｉ−標識組換えヒトＩＦＮ−α１−８を使用して確
認された。同じ投与法を使用して、以下に示す試験で口腔粘膜投与を行った。

【００６９】 ６週齢の雄のＤＢＡ／２マウスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のラ
イフテクノロジーズ社（Life Technologies Inc.）から購入した１００，０００
IUの組換えマウスインターフェロンα（ＩＦＮα）、プロテインインスチチュー
ト社（Protein Institute Inc.）から購入した１０μgの組換えヒトインターロ
イキン１５（ＩＬ−１５）、１００μg/mlのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
有するＰＢＳで処理したか、または未処理のままとした。８時間後、マウスを頚
部脱臼により屠殺し、口咽頭腔から外科的にリンパ組織を取り出し、液体窒素中
で急速凍結し、−８０℃で保存した。チョムクジンスキー（Chomczynski）とサ
ッチ（Sacchi）の方法（Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159）によりリンパ組
織からＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ差別ディスプレイ分析を行った（ラング・ピー
（Lang. P.）とパルディー・エー・ビー（Pardee, A.B.）, Science 257, 967-9
71）。

【００７０】 差別ディスプレイ分析 差別ディスプレイ分析は、ゲンフンター・コーポレーション（GenHunter Corp
oration）の「メッセージクリーン（Message Clean）」と「ＲＮＡイメージ（RN
A image）」キットを、基本的に製造業者が記載するように使用して行った。簡
単に説明すると、ＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅで処理し、１μg
を、３つの１塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡ、Ｃ、またはＧのい
ずれかを使用して、１００μlの反応緩衝液中で逆転写した。ＲＮＡはまた、９
個の２塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、Ｃ
Ａ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＣのいずれかを使用して逆転写した。比較すべきすべ
て試料を、同じ実験で逆転写し、アリコートに分けて凍結した。ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼとα−³³Ｐ ｄＡＴＰ（３，０００Ci/mmol）を含有する１０μlの増
幅混合物中のわずかに１μlのみの逆転写試料を用いて、増幅を行った。８０の
５'末端（ＨＡＰ）ランダム配列プライマーを、（ＨＴ１１）Ａ、Ｃ、Ｇ、ＡＡ
、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、ＣＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、またはＧＣプライマーのそれぞ
れと組合せて使用した。次に試料を、７％変性ポリアクリルアミドゲルで流し、
オートラジオグラフィーに暴露した。推定の差別的に発現されたバンドを切り取
り、供給業者の説明書に従って再増幅し、ＩＦＮ処理、ＩＬ−１５処理、および
賦形剤処理動物の口咽頭腔から抽出したＲＮＡのノーザンブロットとハイブリダ
イズするプローブとしてさらに使用した。

【００７１】 クローニングと配列決定 差別ディスプレイスクリーニングからの再増幅バンドを、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉ
ｐｔＳＫ（＋）プラスミド（ストラタジーン（Stratagene））のＳｆｒ１部位に
クローン化し、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅から増幅されたｃＤＮＡを、ｐＣＲ３プ
ラスミド（インビトロゲン（Invitrogen））中のＴＡクローニングにより単離し
た。自動ジデオキシシーケンサー（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）ＡＢＩ
ＰＲＩＳＭ３７７）を使用して、ＤＮＡを配列決定した。

【００７２】 ヒトｃＤＮＡの同定 差別ディスプレイスクリーニングから同定した差別的に発現されたマウス３'
配列を、米国ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメ
ーション（ＮＣＢＩ、National Center for Biotechnology Information）のジ
ーンバンク（GenBank）（登録商標）のｄｂＥＳＴデータベース中に存在するラ
ンダムなヒトの発現配列標識物（ＥＳＴ）と比較した。差別ディスプレイスクリ
ーニングから単離されたマウスＥＳＴと関連するかも知れない配列をコンチグ（
contig）で組合せて、推定ｃＤＮＡに対応するヒトコンセンサス配列を構築する
のに使用した。

【００７３】 そのようなｃＤＮＡの１つは、ジーンバンク（GenBank）ｃＤＮＡ配列ｇ５４
５３８９７に対応することがわかった。対応するポリペプチド配列は、ジーンバ
ンク（GenBank）配列ｇ５４５３８９８であり、これは、ＰＩＮ−１に対応する
としてジーンバンク（GenBank）で認められている。

【００７４】 上記したようにＩＦＮ−αの口腔粘着投与に応答してリンパ組織中でアップレ
ギュレートされた他のマウス遺伝子もまた、ＩＦＮ−αの静脈内投与に応答して
マウスの脾臓中でアップレギュレートされることがわかっている。ＩＦＮ−αの
静脈内投与を以下の例１７に記載のように行うと、ジーンバンク（GenBank）ｃ
ＤＮＡ受け入れ番号ｇ５４５３８９７により同定されるヒト遺伝子に対応するマ
ウス遺伝子について、同様の結果が予測される。

【００７５】 さらに、ＩＦＮ−αの口腔粘着および静脈内投与に応答してアップレギュレー
トされることがわかったマウス遺伝子のヒト遺伝子類似体に対応するｍＲＮＡは
、ＩＦＮ−αのインビトロの処理後にヒトの末梢血単核細胞中で増加することが
わかっている。ヒト末梢血単核細胞を以下の例１８に記載のようにＩＦＮ−αで
処理すると、配列番号３に示すｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡについて、同じ結果
が予測される。

【００７６】 例３ 正常な成体マウスの各鼻孔に、Ｐ２０エッペンドルフマイクロピペットを使用
して、５μlのクリスタルバイオレットを適用すると、ほとんど直後に口咽頭腔
の全表面にわたって色素が分布することが、以前の実験で証明されている。口咽
頭腔の染色は、色素の適用後約３０分後もまだ明らかであった。これらの結果は
、同じ方法で適用された¹²⁵Ｉ−標識組換えヒトＩＦＮ−α１−８を使用して確
認された。同じ投与法を使用して、以下に示す試験で口腔粘膜投与を行った。

【００７７】 ６週齢の雄のＤＢＡ／２マウスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のラ
イフテクノロジーズ社（Life Technologies Inc.）から購入した１００，０００
IUの組換えマウスインターフェロンα（ＩＦＮα）、プロテインインスチチュー
ト社（Protein Institute Inc.）から購入した１０μgの組換えヒトインターロ
イキン１５（ＩＬ−１５）、１００μg/mlのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
有するＰＢＳで処理したか、または未処理のままとした。８時間後、マウスを頚
部脱臼により屠殺し、口咽頭腔から外科的にリンパ組織を取り出し、液体窒素中
で急速凍結し、−８０℃で保存した。チョムクジンスキー（Chomczynski）とサ
ッチ（Sacchi）の方法（Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159）によりリンパ組
織からＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ差別ディスプレイ分析を行った（ラング・ピー
（Lang. P.）とパルディー・エー・ビー（Pardee, A.B.）, Science 257, 967-9
71）。

【００７８】 差別ディスプレイ分析 差別ディスプレイ分析は、ゲンフンター・コーポレーション（GenHunter Corp
oration）の「メッセージクリーン（Message Clean）」と「ＲＮＡイメージ（RN
A image）」キットを、基本的に製造業者が記載するように使用して行った。簡
単に説明すると、ＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅで処理し、１μg
を、３つの１塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡ、Ｃ、またはＧのい
ずれかを使用して、１００μlの反応緩衝液中で逆転写した。ＲＮＡはまた、９
個の２塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、Ｃ
Ａ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＣのいずれかを使用して逆転写した。比較すべきすべ
て試料を、同じ実験で逆転写し、アリコートに分けて凍結した。ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼとα−³³Ｐ ｄＡＴＰ（３，０００Ci/mmol）を含有する１０μlの増
幅混合物中のわずかに１μlのみの逆転写試料を用いて、増幅を行った。８０の
５'末端（ＨＡＰ）ランダム配列プライマーを、（ＨＴ１１）Ａ、Ｃ、Ｇ、ＡＡ
、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、ＣＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、またはＧＣプライマーのそれぞ
れと組合せて使用した。次に試料を、７％変性ポリアクリルアミドゲルで流し、
オートラジオグラフィーに暴露した。推定の差別的に発現されたバンドを切り取
り、供給業者の説明書に従って再増幅し、ＩＦＮ処理、ＩＬ−１５処理、および
賦形剤処理動物の口咽頭腔から抽出したＲＮＡのノーザンブロットとハイブリダ
イズするプローブとしてさらに使用した。

【００７９】 クローニングと配列決定 差別ディスプレイスクリーニングからの再増幅バンドを、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉ
ｐｔＳＫ（＋）プラスミド（ストラタジーン（Stratagene））のＳｆｒ１部位に
クローン化し、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅から増幅されたｃＤＮＡを、ｐＣＲ３プ
ラスミド（インビトロゲン（Invitrogen））中のＴＡクローニングにより単離し
た。自動ジデオキシシーケンサー（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）ＡＢＩ
ＰＲＩＳＭ３７７）を使用して、ＤＮＡを配列決定した。

【００８０】 ヒトｃＤＮＡの同定 差別ディスプレイスクリーニングから同定した差別的に発現されたマウス３'
配列を、米国ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメ
ーション（ＮＣＢＩ、National Center for Biotechnology Information）のジ
ーンバンク（GenBank）（登録商標）のｄｂＥＳＴデータベース中に存在するラ
ンダムなヒトの発現配列標識物（ＥＳＴ）と比較した。差別ディスプレイスクリ
ーニングから単離されたマウスＥＳＴと関連するかも知れない配列をコンチグ（
contig）で組合せて、推定ｃＤＮＡに対応するヒトコンセンサス配列を構築する
のに使用した。

【００８１】 そのようなｃＤＮＡの１つは、ジーンバンク（GenBank）ｃＤＮＡ配列ｇ４５
０５１８６に対応することがわかった。対応するポリペプチド配列は、ジーンバ
ンク（GenBank）配列ｇ４５０５１８７であり、これは、ＭＩＧに対応するとし
てジーンバンク（GenBank）で認められている。

【００８２】 上記したようにＩＦＮ−αの口腔粘着投与に応答してリンパ組織中でアップレ
ギュレートされた他のマウス遺伝子もまた、ＩＦＮ−αの静脈内投与に応答して
マウスの脾臓中でアップレギュレートされることがわかっている。ＩＦＮ−αの
静脈内投与を以下の例１７に記載のように行うと、ジーンバンク（GenBank）ｃ
ＤＮＡ受け入れ番号ｇ４５０５１８６により同定されるヒト遺伝子に対応するマ
ウス遺伝子について、同様の結果が予測される。

【００８３】 さらに、ＩＦＮ−αの口腔粘着および静脈内投与に応答してアップレギュレー
トされることがわかったマウス遺伝子のヒト遺伝子類似体に対応するｍＲＮＡは
、ＩＦＮ−αのインビトロの処理後にヒトの末梢血単核細胞中で増加することが
わかっている。ヒト末梢血単核細胞を以下の例１８に記載のようにＩＦＮ−αで
処理すると、配列番号５に示すｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡについて、同じ結果
が予測される。

【００８４】 例４ 正常な成体マウスの各鼻孔に、Ｐ２０エッペンドルフマイクロピペットを使用
して、５μlのクリスタルバイオレットを適用すると、ほとんど直後に口咽頭腔
の全表面にわたって色素が分布することが、以前の実験で証明されている。口咽
頭腔の染色は、色素の適用後約３０分後もまだ明らかであった。これらの結果は
、同じ方法で適用された¹²⁵Ｉ−標識組換えヒトＩＦＮ−α１−８を使用して確
認された。同じ投与法を使用して、以下に示す試験で口腔粘膜投与を行った。

【００８５】 ６週齢の雄のＤＢＡ／２マウスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のラ
イフテクノロジーズ社（Life Technologies Inc.）から購入した１００，０００
IUの組換えマウスインターフェロンα（ＩＦＮα）、プロテインインスチチュー
ト社（Protein Institute Inc.）から購入した１０μgの組換えヒトインターロ
イキン１５（ＩＬ−１５）、１００μg/mlのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
有するＰＢＳで処理したか、または未処理のままとした。８時間後、マウスを頚
部脱臼により屠殺し、口咽頭腔から外科的にリンパ組織を取り出し、液体窒素中
で急速凍結し、−８０℃で保存した。チョムクジンスキー（Chomczynski）とサ
ッチ（Sacchi）の方法（Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159）によりリンパ組
織からＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ差別ディスプレイ分析を行った（ラング・ピー
（Lang. P.）とパルディー・エー・ビー（Pardee, A.B.）, Science 257, 967-9
71）。

【００８６】 差別ディスプレイ分析 差別ディスプレイ分析は、ゲンフンター・コーポレーション（GenHunter Corp
oration）の「メッセージクリーン（Message Clean）」と「ＲＮＡイメージ（RN
A image）」キットを、基本的に製造業者が記載するように使用して行った。簡
単に説明すると、ＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅで処理し、１μg
を、３つの１塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡ、Ｃ、またはＧのい
ずれかを使用して、１００μlの反応緩衝液中で逆転写した。ＲＮＡはまた、９
個の２塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、Ｃ
Ａ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＣのいずれかを使用して逆転写した。比較すべきすべ
て試料を、同じ実験で逆転写し、アリコートに分けて凍結した。ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼとα−³³Ｐ ｄＡＴＰ（３，０００Ci/mmol）を含有する１０μlの増
幅混合物中のわずかに１μlのみの逆転写試料を用いて、増幅を行った。８０の
５'末端（ＨＡＰ）ランダム配列プライマーを、（ＨＴ１１）Ａ、Ｃ、Ｇ、ＡＡ
、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、ＣＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、またはＧＣプライマーのそれぞ
れと組合せて使用した。次に試料を、７％変性ポリアクリルアミドゲルで流し、
オートラジオグラフィーに暴露した。推定の差別的に発現されたバンドを切り取
り、供給業者の説明書に従って再増幅し、ＩＦＮ処理、ＩＬ−１５処理、および
賦形剤処理動物の口咽頭腔から抽出したＲＮＡのノーザンブロットとハイブリダ
イズするプローブとしてさらに使用した。

【００８７】 クローニングと配列決定 差別ディスプレイスクリーニングからの再増幅バンドを、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉ
ｐｔＳＫ（＋）プラスミド（ストラタジーン（Stratagene））のＳｆｒ１部位に
クローン化し、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅から増幅されたｃＤＮＡを、ｐＣＲ３プ
ラスミド（インビトロゲン（Invitrogen））中のＴＡクローニングにより単離し
た。自動ジデオキシシーケンサー（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）ＡＢＩ
ＰＲＩＳＭ３７７）を使用して、ＤＮＡを配列決定した。

【００８８】 ヒトｃＤＮＡの同定 差別ディスプレイスクリーニングから同定した差別的に発現されたマウス３'
配列を、米国ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメ
ーション（ＮＣＢＩ、National Center for Biotechnology Information）のジ
ーンバンク（GenBank）（登録商標）のｄｂＥＳＴデータベース中に存在するラ
ンダムなヒトの発現配列標識物（ＥＳＴ）と比較した。差別ディスプレイスクリ
ーニングから単離されたマウスＥＳＴと関連するかも知れない配列をコンチグ（
contig）で組合せて、推定ｃＤＮＡに対応するヒトコンセンサス配列を構築する
のに使用した。

【００８９】 そのようなｃＤＮＡの１つは、ジーンバンク（GenBank）ｃＤＮＡ配列ｇ２３
６６７５１に対応することがわかった。対応するポリペプチド配列は、ジーンバ
ンク（GenBank）配列ｇ２３６６７５２であり、これは、ＬＴＳに対応するとし
てジーンバンク（GenBank）で認められている。

【００９０】 上記したようにＩＦＮ−αの口腔粘着投与に応答してリンパ組織中でアップレ
ギュレートされた他のマウス遺伝子もまた、ＩＦＮ−αの静脈内投与に応答して
マウスの脾臓中でアップレギュレートされることがわかっている。ＩＦＮ−αの
静脈内投与を以下の例１７に記載のように行うと、ジーンバンク（GenBank）ｃ
ＤＮＡ受け入れ番号ｇ２３６６７５１により同定されるヒト遺伝子に対応するマ
ウス遺伝子について、同様の結果が予測される。

【００９１】 さらに、ＩＦＮ−αの口腔粘着および静脈内投与に応答してアップレギュレー
トされることがわかったマウス遺伝子のヒト遺伝子類似体に対応するｍＲＮＡは
、ＩＦＮ−αのインビトロの処理後にヒトの末梢血単核細胞中で増加することが
わかっている。ヒト末梢血単核細胞を以下の例１８に記載のようにＩＦＮ−αで
処理すると、配列番号７に示すｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡについて、同じ結果
が予測される。

【００９２】 例５ 正常な成体マウスの各鼻孔に、Ｐ２０エッペンドルフマイクロピペットを使用
して、５μlのクリスタルバイオレットを適用すると、ほとんど直後に口咽頭腔
の全表面にわたって色素が分布することが、以前の実験で証明されている。口咽
頭腔の染色は、色素の適用後約３０分後もまだ明らかであった。これらの結果は
、同じ方法で適用された¹²⁵Ｉ−標識組換えヒトＩＦＮ−α１−８を使用して確
認された。同じ投与法を使用して、以下に示す試験で口腔粘膜投与を行った。

【００９３】 ６週齢の雄のＤＢＡ／２マウスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のラ
イフテクノロジーズ社（Life Technologies Inc.）から購入した１００，０００
IUの組換えマウスインターフェロンα（ＩＦＮα）、プロテインインスチチュー
ト社（Protein Institute Inc.）から購入した１０μgの組換えヒトインターロ
イキン１５（ＩＬ−１５）、１００μg/mlのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
有するＰＢＳで処理したか、または未処理のままとした。８時間後、マウスを頚
部脱臼により屠殺し、口咽頭腔から外科的にリンパ組織を取り出し、液体窒素中
で急速凍結し、−８０℃で保存した。チョムクジンスキー（Chomczynski）とサ
ッチ（Sacchi）の方法（Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159）によりリンパ組
織からＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ差別ディスプレイ分析を行った（ラング・ピー
（Lang. P.）とパルディー・エー・ビー（Pardee, A.B.）, Science 257, 967-9
71）。

【００９４】 差別ディスプレイ分析 差別ディスプレイ分析は、ゲンフンター・コーポレーション（GenHunter Corp
oration）の「メッセージクリーン（Message Clean）」と「ＲＮＡイメージ（RN
A image）」キットを、基本的に製造業者が記載するように使用して行った。簡
単に説明すると、ＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅで処理し、１μg
を、３つの１塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡ、Ｃ、またはＧのい
ずれかを使用して、１００μlの反応緩衝液中で逆転写した。ＲＮＡはまた、９
個の２塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、Ｃ
Ａ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＣのいずれかを使用して逆転写した。比較すべきすべ
て試料を、同じ実験で逆転写し、アリコートに分けて凍結した。ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼとα−³³Ｐ ｄＡＴＰ（３，０００Ci/mmol）を含有する１０μlの増
幅混合物中のわずかに１μlのみの逆転写試料を用いて、増幅を行った。８０の
５'末端（ＨＡＰ）ランダム配列プライマーを、（ＨＴ１１）Ａ、Ｃ、Ｇ、ＡＡ
、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、ＣＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、またはＧＣプライマーのそれぞ
れと組合せて使用した。次に試料を、７％変性ポリアクリルアミドゲルで流し、
オートラジオグラフィーに暴露した。推定の差別的に発現されたバンドを切り取
り、供給業者の説明書に従って再増幅し、ＩＦＮ処理、ＩＬ−１５処理、および
賦形剤処理動物の口咽頭腔から抽出したＲＮＡのノーザンブロットとハイブリダ
イズするプローブとしてさらに使用した。

【００９５】 クローニングと配列決定 差別ディスプレイスクリーニングからの再増幅バンドを、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉ
ｐｔＳＫ（＋）プラスミド（ストラタジーン（Stratagene））のＳｆｒ１部位に
クローン化し、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅から増幅されたｃＤＮＡを、ｐＣＲ３プ
ラスミド（インビトロゲン（Invitrogen））中のＴＡクローニングにより単離し
た。自動ジデオキシシーケンサー（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）ＡＢＩ
ＰＲＩＳＭ３７７）を使用して、ＤＮＡを配列決定した。

【００９６】 ヒトｃＤＮＡの同定 差別ディスプレイスクリーニングから同定した差別的に発現されたマウス３'
配列を、米国ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメ
ーション（ＮＣＢＩ、National Center for Biotechnology Information）のジ
ーンバンク（GenBank）（登録商標）のｄｂＥＳＴデータベース中に存在するラ
ンダムなヒトの発現配列標識物（ＥＳＴ）と比較した。差別ディスプレイスクリ
ーニングから単離されたマウスＥＳＴと関連するかも知れない配列をコンチグ（
contig）で組合せて、推定ｃＤＮＡに対応するヒトコンセンサス配列を構築する
のに使用した。

【００９７】 そのようなｃＤＮＡの１つは、ジーンバンク（GenBank）ｃＤＮＡ配列ｇ３３
９１７に対応することがわかった。対応するポリペプチド配列は、ジーンバンク
（GenBank）配列ｇ３３９１８であり、これは、ＩＰ−１０に対応するとしてジ
ーンバンク（GenBank）で認められている。

【００９８】 上記したようにＩＦＮ−αの口腔粘着投与に応答してリンパ組織中でアップレ
ギュレートされた他のマウス遺伝子もまた、ＩＦＮ−αの静脈内投与に応答して
マウスの脾臓中でアップレギュレートされることがわかっている。ＩＦＮ−αの
静脈内投与を以下の例１７に記載のように行うと、ジーンバンク（GenBank）ｃ
ＤＮＡ受け入れ番号ｇ３３９１７により同定されるヒト遺伝子に対応するマウス
遺伝子について、同様の結果が予測される。

【００９９】 さらに、ＩＦＮ−αの口腔粘着および静脈内投与に応答してアップレギュレー
トされることがわかったマウス遺伝子のヒト遺伝子類似体に対応するｍＲＮＡは
、ＩＦＮ−αのインビトロの処理後にヒトの末梢血単核細胞中で増加することが
わかっている。ヒト末梢血単核細胞を以下の例１８に記載のようにＩＦＮ−αで
処理すると、配列番号９に示すｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡについて、同じ結果
が予測される。

【０１００】 例６ 正常な成体マウスの各鼻孔に、Ｐ２０エッペンドルフマイクロピペットを使用
して、５μlのクリスタルバイオレットを適用すると、ほとんど直後に口咽頭腔
の全表面にわたって色素が分布することが、以前の実験で証明されている。口咽
頭腔の染色は、色素の適用後約３０分後もまだ明らかであった。これらの結果は
、同じ方法で適用された¹²⁵Ｉ−標識組換えヒトＩＦＮ−α１−８を使用して確
認された。同じ投与法を使用して、以下に示す試験で口腔粘膜投与を行った。

【０１０１】 ６週齢の雄のＤＢＡ／２マウスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のラ
イフテクノロジーズ社（Life Technologies Inc.）から購入した１００，０００
IUの組換えマウスインターフェロンα（ＩＦＮα）、プロテインインスチチュー
ト社（Protein Institute Inc.）から購入した１０μgの組換えヒトインターロ
イキン１５（ＩＬ−１５）、１００μg/mlのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
有するＰＢＳで処理したか、または未処理のままとした。８時間後、マウスを頚
部脱臼により屠殺し、口咽頭腔から外科的にリンパ組織を取り出し、液体窒素中
で急速凍結し、−８０℃で保存した。チョムクジンスキー（Chomczynski）とサ
ッチ（Sacchi）の方法（Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159）によりリンパ組
織からＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ差別ディスプレイ分析を行った（ラング・ピー
（Lang. P.）とパルディー・エー・ビー（Pardee, A.B.）, Science 257, 967-9
71）。

【０１０２】 差別ディスプレイ分析 差別ディスプレイ分析は、ゲンフンター・コーポレーション（GenHunter Corp
oration）の「メッセージクリーン（Message Clean）」と「ＲＮＡイメージ（RN
A image）」キットを、基本的に製造業者が記載するように使用して行った。簡
単に説明すると、ＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅで処理し、１μg
を、３つの１塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡ、Ｃ、またはＧのい
ずれかを使用して、１００μlの反応緩衝液中で逆転写した。ＲＮＡはまた、９
個の２塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、Ｃ
Ａ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＣのいずれかを使用して逆転写した。比較すべきすべ
て試料を、同じ実験で逆転写し、アリコートに分けて凍結した。ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼとα−³³Ｐ ｄＡＴＰ（３，０００Ci/mmol）を含有する１０μlの増
幅混合物中のわずかに１μlのみの逆転写試料を用いて、増幅を行った。８０の
５'末端（ＨＡＰ）ランダム配列プライマーを、（ＨＴ１１）Ａ、Ｃ、Ｇ、ＡＡ
、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、ＣＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、またはＧＣプライマーのそれぞ
れと組合せて使用した。次に試料を、７％変性ポリアクリルアミドゲルで流し、
オートラジオグラフィーに暴露した。推定の差別的に発現されたバンドを切り取
り、供給業者の説明書に従って再増幅し、ＩＦＮ処理、ＩＬ−１５処理、および
賦形剤処理動物の口咽頭腔から抽出したＲＮＡのノーザンブロットとハイブリダ
イズするプローブとしてさらに使用した。

【０１０３】 クローニングと配列決定 差別ディスプレイスクリーニングからの再増幅バンドを、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉ
ｐｔＳＫ（＋）プラスミド（ストラタジーン（Stratagene））のＳｆｒ１部位に
クローン化し、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅から増幅されたｃＤＮＡを、ｐＣＲ３プ
ラスミド（インビトロゲン（Invitrogen））中のＴＡクローニングにより単離し
た。自動ジデオキシシーケンサー（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）ＡＢＩ
ＰＲＩＳＭ３７７）を使用して、ＤＮＡを配列決定した。

【０１０４】 ヒトｃＤＮＡの同定 差別ディスプレイスクリーニングから同定した差別的に発現されたマウス３'
配列を、米国ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメ
ーション（ＮＣＢＩ、National Center for Biotechnology Information）のジ
ーンバンク（GenBank）（登録商標）のｄｂＥＳＴデータベース中に存在するラ
ンダムなヒトの発現配列標識物（ＥＳＴ）と比較した。差別ディスプレイスクリ
ーニングから単離されたマウスＥＳＴと関連するかも知れない配列をコンチグ（
contig）で組合せて、推定ｃＤＮＡに対応するヒトコンセンサス配列を構築する
のに使用した。

【０１０５】 そのようなｃＤＮＡの１つは、ジーンバンク（GenBank）ｃＤＮＡ配列ｇ４５
０４９６２に対応することがわかった。対応するポリペプチド配列は、ジーンバ
ンク（GenBank）配列ｇ４５０４９６３であり、これは、リポカリン１に対応す
るとしてジーンバンク（GenBank）で認められている。

【０１０６】 上記したようにＩＦＮ−αの口腔粘着投与に応答してリンパ組織中でアップレ
ギュレートされた他のマウス遺伝子もまた、ＩＦＮ−αの静脈内投与に応答して
マウスの脾臓中でアップレギュレートされることがわかっている。ＩＦＮ−αの
静脈内投与を以下の例１７に記載のように行うと、ジーンバンク（GenBank）ｃ
ＤＮＡ受け入れ番号ｇ４５０４９６２により同定されるヒト遺伝子に対応するマ
ウス遺伝子について、同様の結果が予測される。

【０１０７】 さらに、ＩＦＮ−αの口腔粘着および静脈内投与に応答してアップレギュレー
トされることがわかったマウス遺伝子のヒト遺伝子類似体に対応するｍＲＮＡは
、ＩＦＮ−αのインビトロの処理後にヒトの末梢血単核細胞中で増加することが
わかっている。ヒト末梢血単核細胞を以下の例１８に記載のようにＩＦＮ−αで
処理すると、配列番号１１に示すｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡについて、同じ結
果が予測される。

【０１０８】 例７ 正常な成体マウスの各鼻孔に、Ｐ２０エッペンドルフマイクロピペットを使用
して、５μlのクリスタルバイオレットを適用すると、ほとんど直後に口咽頭腔
の全表面にわたって色素が分布することが、以前の実験で証明されている。口咽
頭腔の染色は、色素の適用後約３０分後もまだ明らかであった。これらの結果は
、同じ方法で適用された¹²⁵Ｉ−標識組換えヒトＩＦＮ−α１−８を使用して確
認された。同じ投与法を使用して、以下に示す試験で口腔粘膜投与を行った。

【０１０９】 ６週齢の雄のＤＢＡ／２マウスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のラ
イフテクノロジーズ社（Life Technologies Inc.）から購入した１００，０００
IUの組換えマウスインターフェロンα（ＩＦＮα）、プロテインインスチチュー
ト社（Protein Institute Inc.）から購入した１０μgの組換えヒトインターロ
イキン１５（ＩＬ−１５）、１００μg/mlのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
有するＰＢＳで処理したか、または未処理のままとした。８時間後、マウスを頚
部脱臼により屠殺し、口咽頭腔から外科的にリンパ組織を取り出し、液体窒素中
で急速凍結し、−８０℃で保存した。チョムクジンスキー（Chomczynski）とサ
ッチ（Sacchi）の方法（Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159）によりリンパ組
織からＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ差別ディスプレイ分析を行った（ラング・ピー
（Lang. P.）とパルディー・エー・ビー（Pardee, A.B.）, Science 257, 967-9
71）。

【０１１０】 差別ディスプレイ分析 差別ディスプレイ分析は、ゲンフンター・コーポレーション（GenHunter Corp
oration）の「メッセージクリーン（Message Clean）」と「ＲＮＡイメージ（RN
A image）」キットを、基本的に製造業者が記載するように使用して行った。簡
単に説明すると、ＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅで処理し、１μg
を、３つの１塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡ、Ｃ、またはＧのい
ずれかを使用して、１００μlの反応緩衝液中で逆転写した。ＲＮＡはまた、９
個の２塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、Ｃ
Ａ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＣのいずれかを使用して逆転写した。比較すべきすべ
て試料を、同じ実験で逆転写し、アリコートに分けて凍結した。ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼとα−³³Ｐ ｄＡＴＰ（３，０００Ci/mmol）を含有する１０μlの増
幅混合物中のわずかに１μlのみの逆転写試料を用いて、増幅を行った。８０の
５'末端（ＨＡＰ）ランダム配列プライマーを、（ＨＴ１１）Ａ、Ｃ、Ｇ、ＡＡ
、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、ＣＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、またはＧＣプライマーのそれぞ
れと組合せて使用した。次に試料を、７％変性ポリアクリルアミドゲルで流し、
オートラジオグラフィーに暴露した。推定の差別的に発現されたバンドを切り取
り、供給業者の説明書に従って再増幅し、ＩＦＮ処理、ＩＬ−１５処理、および
賦形剤処理動物の口咽頭腔から抽出したＲＮＡのノーザンブロットとハイブリダ
イズするプローブとしてさらに使用した。

【０１１１】 クローニングと配列決定 差別ディスプレイスクリーニングからの再増幅バンドを、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉ
ｐｔＳＫ（＋）プラスミド（ストラタジーン（Stratagene））のＳｆｒ１部位に
クローン化し、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅から増幅されたｃＤＮＡを、ｐＣＲ３プ
ラスミド（インビトロゲン（Invitrogen））中のＴＡクローニングにより単離し
た。自動ジデオキシシーケンサー（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）ＡＢＩ
ＰＲＩＳＭ３７７）を使用して、ＤＮＡを配列決定した。

【０１１２】 ヒトｃＤＮＡの同定 差別ディスプレイスクリーニングから同定した差別的に発現されたマウス３'
配列を、米国ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメ
ーション（ＮＣＢＩ、National Center for Biotechnology Information）のジ
ーンバンク（GenBank）（登録商標）のｄｂＥＳＴデータベース中に存在するラ
ンダムなヒトの発現配列標識物（ＥＳＴ）と比較した。差別ディスプレイスクリ
ーニングから単離されたマウスＥＳＴと関連するかも知れない配列をコンチグ（
contig）で組合せて、推定ｃＤＮＡに対応するヒトコンセンサス配列を構築する
のに使用した。

【０１１３】 そのようなｃＤＮＡの１つは、ジーンバンク（GenBank）ｃＤＮＡ配列ｇ３９
７８５１６に対応することがわかった。対応するポリペプチド配列は、ジーンバ
ンク（GenBank）配列ｇ３９７８５１７であり、これは、ＳＥＣ６３に対応する
としてジーンバンク（GenBank）で認められている。

【０１１４】 上記したようにＩＦＮ−αの口腔粘着投与に応答してリンパ組織中でアップレ
ギュレートされた他のマウス遺伝子もまた、ＩＦＮ−αの静脈内投与に応答して
マウスの脾臓中でアップレギュレートされることがわかっている。ＩＦＮ−αの
静脈内投与を以下の例１７に記載のように行うと、ジーンバンク（GenBank）ｃ
ＤＮＡ受け入れ番号ｇ３９７８５１６により同定されるヒト遺伝子に対応するマ
ウス遺伝子について、同様の結果が予測される。

【０１１５】 さらに、ＩＦＮ−αの口腔粘着および静脈内投与に応答してアップレギュレー
トされることがわかったマウス遺伝子のヒト遺伝子類似体に対応するｍＲＮＡは
、ＩＦＮ−αのインビトロの処理後にヒトの末梢血単核細胞中で増加することが
わかっている。ヒト末梢血単核細胞を以下の例１８に記載のようにＩＦＮ−αで
処理すると、配列番号１３に示すｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡについて、同じ結
果が予測される。

【０１１６】 例８ 正常な成体マウスの各鼻孔に、Ｐ２０エッペンドルフマイクロピペットを使用
して、５μlのクリスタルバイオレットを適用すると、ほとんど直後に口咽頭腔
の全表面にわたって色素が分布することが、以前の実験で証明されている。口咽
頭腔の染色は、色素の適用後約３０分後もまだ明らかであった。これらの結果は
、同じ方法で適用された¹²⁵Ｉ−標識組換えヒトＩＦＮ−α１−８を使用して確
認された。同じ投与法を使用して、以下に示す試験で口腔粘膜投与を行った。

【０１１７】 ６週齢の雄のＤＢＡ／２マウスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のラ
イフテクノロジーズ社（Life Technologies Inc.）から購入した１００，０００
IUの組換えマウスインターフェロンα（ＩＦＮα）、プロテインインスチチュー
ト社（Protein Institute Inc.）から購入した１０μgの組換えヒトインターロ
イキン１５（ＩＬ−１５）、１００μg/mlのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
有するＰＢＳで処理したか、または未処理のままとした。８時間後、マウスを頚
部脱臼により屠殺し、口咽頭腔から外科的にリンパ組織を取り出し、液体窒素中
で急速凍結し、−８０℃で保存した。チョムクジンスキー（Chomczynski）とサ
ッチ（Sacchi）の方法（Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159）によりリンパ組
織からＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ差別ディスプレイ分析を行った（ラング・ピー
（Lang. P.）とパルディー・エー・ビー（Pardee, A.B.）, Science 257, 967-9
71）。

【０１１８】 差別ディスプレイ分析 差別ディスプレイ分析は、ゲンフンター・コーポレーション（GenHunter Corp
oration）の「メッセージクリーン（Message Clean）」と「ＲＮＡイメージ（RN
A image）」キットを、基本的に製造業者が記載するように使用して行った。簡
単に説明すると、ＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅで処理し、１μg
を、３つの１塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡ、Ｃ、またはＧのい
ずれかを使用して、１００μlの反応緩衝液中で逆転写した。ＲＮＡはまた、９
個の２塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、Ｃ
Ａ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＣのいずれかを使用して逆転写した。比較すべきすべ
て試料を、同じ実験で逆転写し、アリコートに分けて凍結した。ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼとα−³³Ｐ ｄＡＴＰ（３，０００Ci/mmol）を含有する１０μlの増
幅混合物中のわずかに１μlのみの逆転写試料を用いて、増幅を行った。８０の
５'末端（ＨＡＰ）ランダム配列プライマーを、（ＨＴ１１）Ａ、Ｃ、Ｇ、ＡＡ
、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、ＣＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、またはＧＣプライマーのそれぞ
れと組合せて使用した。次に試料を、７％変性ポリアクリルアミドゲルで流し、
オートラジオグラフィーに暴露した。推定の差別的に発現されたバンドを切り取
り、供給業者の説明書に従って再増幅し、ＩＦＮ処理、ＩＬ−１５処理、および
賦形剤処理動物の口咽頭腔から抽出したＲＮＡのノーザンブロットとハイブリダ
イズするプローブとしてさらに使用した。

【０１１９】 クローニングと配列決定 差別ディスプレイスクリーニングからの再増幅バンドを、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉ
ｐｔＳＫ（＋）プラスミド（ストラタジーン（Stratagene））のＳｆｒ１部位に
クローン化し、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅から増幅されたｃＤＮＡを、ｐＣＲ３プ
ラスミド（インビトロゲン（Invitrogen））中のＴＡクローニングにより単離し
た。自動ジデオキシシーケンサー（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）ＡＢＩ
ＰＲＩＳＭ３７７）を使用して、ＤＮＡを配列決定した。

【０１２０】 ヒトｃＤＮＡの同定 差別ディスプレイスクリーニングから同定した差別的に発現されたマウス３'
配列を、米国ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメ
ーション（ＮＣＢＩ、National Center for Biotechnology Information）のジ
ーンバンク（GenBank）（登録商標）のｄｂＥＳＴデータベース中に存在するラ
ンダムなヒトの発現配列標識物（ＥＳＴ）と比較した。差別ディスプレイスクリ
ーニングから単離されたマウスＥＳＴと関連するかも知れない配列をコンチグ（
contig）で組合せて、推定ｃＤＮＡに対応するヒトコンセンサス配列を構築する
のに使用した。

【０１２１】 そのようなｃＤＮＡの１つは、ジーンバンク（GenBank）ｃＤＮＡ配列ｇ５９
２４３９６に対応することがわかった。対応するポリペプチド配列は、ジーンバ
ンク（GenBank）配列ｇ５９２４３９７であり、これは、スルフェイト６に対応
するとしてジーンバンク（GenBank）で認められている。

【０１２２】 上記したようにＩＦＮ−αの口腔粘着投与に応答してリンパ組織中でアップレ
ギュレートされた他のマウス遺伝子もまた、ＩＦＮ−αの静脈内投与に応答して
マウスの脾臓中でアップレギュレートされることがわかっている。ＩＦＮ−αの
静脈内投与を以下の例１７に記載のように行うと、ジーンバンク（GenBank）ｃ
ＤＮＡ受け入れ番号ｇ５９２４３９６により同定されるヒト遺伝子に対応するマ
ウス遺伝子について、同様の結果が予測される。

【０１２３】 さらに、ＩＦＮ−αの口腔粘着および静脈内投与に応答してアップレギュレー
トされることがわかったマウス遺伝子のヒト遺伝子類似体に対応するｍＲＮＡは
、ＩＦＮ−αのインビトロの処理後にヒトの末梢血単核細胞中で増加することが
わかっている。ヒト末梢血単核細胞を以下の例１８に記載のようにＩＦＮ−αで
処理すると、配列番号１５に示すｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡについて、同じ結
果が予測される。

【０１２４】 例９ 正常な成体マウスの各鼻孔に、Ｐ２０エッペンドルフマイクロピペットを使用
して、５μlのクリスタルバイオレットを適用すると、ほとんど直後に口咽頭腔
の全表面にわたって色素が分布することが、以前の実験で証明されている。口咽
頭腔の染色は、色素の適用後約３０分後もまだ明らかであった。これらの結果は
、同じ方法で適用された¹²⁵Ｉ−標識組換えヒトＩＦＮ−α１−８を使用して確
認された。同じ投与法を使用して、以下に示す試験で口腔粘膜投与を行った。

【０１２５】 ６週齢の雄のＤＢＡ／２マウスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のラ
イフテクノロジーズ社（Life Technologies Inc.）から購入した１００，０００
IUの組換えマウスインターフェロンα（ＩＦＮα）、プロテインインスチチュー
ト社（Protein Institute Inc.）から購入した１０μgの組換えヒトインターロ
イキン１５（ＩＬ−１５）、１００μg/mlのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
有するＰＢＳで処理したか、または未処理のままとした。８時間後、マウスを頚
部脱臼により屠殺し、口咽頭腔から外科的にリンパ組織を取り出し、液体窒素中
で急速凍結し、−８０℃で保存した。チョムクジンスキー（Chomczynski）とサ
ッチ（Sacchi）の方法（Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159）によりリンパ組
織からＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ差別ディスプレイ分析を行った（ラング・ピー
（Lang. P.）とパルディー・エー・ビー（Pardee, A.B.）, Science 257, 967-9
71）。

【０１２６】 差別ディスプレイ分析 差別ディスプレイ分析は、ゲンフンター・コーポレーション（GenHunter Corp
oration）の「メッセージクリーン（Message Clean）」と「ＲＮＡイメージ（RN
A image）」キットを、基本的に製造業者が記載するように使用して行った。簡
単に説明すると、ＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅで処理し、１μg
を、３つの１塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡ、Ｃ、またはＧのい
ずれかを使用して、１００μlの反応緩衝液中で逆転写した。ＲＮＡはまた、９
個の２塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、Ｃ
Ａ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＣのいずれかを使用して逆転写した。比較すべきすべ
て試料を、同じ実験で逆転写し、アリコートに分けて凍結した。ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼとα−³³Ｐ ｄＡＴＰ（３，０００Ci/mmol）を含有する１０μlの増
幅混合物中のわずかに１μlのみの逆転写試料を用いて、増幅を行った。８０の
５'末端（ＨＡＰ）ランダム配列プライマーを、（ＨＴ１１）Ａ、Ｃ、Ｇ、ＡＡ
、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、ＣＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、またはＧＣプライマーのそれぞ
れと組合せて使用した。次に試料を、７％変性ポリアクリルアミドゲルで流し、
オートラジオグラフィーに暴露した。推定の差別的に発現されたバンドを切り取
り、供給業者の説明書に従って再増幅し、ＩＦＮ処理、ＩＬ−１５処理、および
賦形剤処理動物の口咽頭腔から抽出したＲＮＡのノーザンブロットとハイブリダ
イズするプローブとしてさらに使用した。

【０１２７】 クローニングと配列決定 差別ディスプレイスクリーニングからの再増幅バンドを、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉ
ｐｔＳＫ（＋）プラスミド（ストラタジーン（Stratagene））のＳｆｒ１部位に
クローン化し、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅から増幅されたｃＤＮＡを、ｐＣＲ３プ
ラスミド（インビトロゲン（Invitrogen））中のＴＡクローニングにより単離し
た。自動ジデオキシシーケンサー（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）ＡＢＩ
ＰＲＩＳＭ３７７）を使用して、ＤＮＡを配列決定した。

【０１２８】 ヒトｃＤＮＡの同定 差別ディスプレイスクリーニングから同定した差別的に発現されたマウス３'
配列を、米国ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメ
ーション（ＮＣＢＩ、National Center for Biotechnology Information）のジ
ーンバンク（GenBank）（登録商標）のｄｂＥＳＴデータベース中に存在するラ
ンダムなヒトの発現配列標識物（ＥＳＴ）と比較した。差別ディスプレイスクリ
ーニングから単離されたマウスＥＳＴと関連するかも知れない配列をコンチグ（
contig）で組合せて、推定ｃＤＮＡに対応するヒトコンセンサス配列を構築する
のに使用した。

【０１２９】 そのようなｃＤＮＡの１つは、ジーンバンク（GenBank）ｃＤＮＡ配列ｇ４５
０５６５６に対応することがわかった。対応するポリペプチド配列は、ジーンバ
ンク（GenBank）配列ｇ４５０５６５７であり、これは、ＰＤＥ２Ａに対応する
としてジーンバンク（GenBank）で認められている。

【０１３０】 上記したようにＩＦＮ−αの口腔粘着投与に応答してリンパ組織中でアップレ
ギュレートされた他のマウス遺伝子もまた、ＩＦＮ−αの静脈内投与に応答して
マウスの脾臓中でアップレギュレートされることがわかっている。ＩＦＮ−αの
静脈内投与を以下の例１７に記載のように行うと、ジーンバンク（GenBank）ｃ
ＤＮＡ受け入れ番号ｇ４５０５６５６により同定されるヒト遺伝子に対応するマ
ウス遺伝子について、同様の結果が予測される。

【０１３１】 さらに、ＩＦＮ−αの口腔粘着および静脈内投与に応答してアップレギュレー
トされることがわかったマウス遺伝子のヒト遺伝子類似体に対応するｍＲＮＡは
、ＩＦＮ−αのインビトロの処理後にヒトの末梢血単核細胞中で増加することが
わかっている。ヒト末梢血単核細胞を以下の例１８に記載のようにＩＦＮ−αで
処理すると、配列番号１７に示すｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡについて、同じ結
果が予測される。

【０１３２】 例１０ 正常な成体マウスの各鼻孔に、Ｐ２０エッペンドルフマイクロピペットを使用
して、５μlのクリスタルバイオレットを適用すると、ほとんど直後に口咽頭腔
の全表面にわたって色素が分布することが、以前の実験で証明されている。口咽
頭腔の染色は、色素の適用後約３０分後もまだ明らかであった。これらの結果は
、同じ方法で適用された¹²⁵Ｉ−標識組換えヒトＩＦＮ−α１−８を使用して確
認された。同じ投与法を使用して、以下に示す試験で口腔粘膜投与を行った。

【０１３３】 ６週齢の雄のＤＢＡ／２マウスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のラ
イフテクノロジーズ社（Life Technologies Inc.）から購入した１００，０００
IUの組換えマウスインターフェロンα（ＩＦＮα）、プロテインインスチチュー
ト社（Protein Institute Inc.）から購入した１０μgの組換えヒトインターロ
イキン１５（ＩＬ−１５）、１００μg/mlのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
有するＰＢＳで処理したか、または未処理のままとした。８時間後、マウスを頚
部脱臼により屠殺し、口咽頭腔から外科的にリンパ組織を取り出し、液体窒素中
で急速凍結し、−８０℃で保存した。チョムクジンスキー（Chomczynski）とサ
ッチ（Sacchi）の方法（Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159）によりリンパ組
織からＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ差別ディスプレイ分析を行った（ラング・ピー
（Lang. P.）とパルディー・エー・ビー（Pardee, A.B.）, Science 257, 967-9
71）。

【０１３４】 差別ディスプレイ分析 差別ディスプレイ分析は、ゲンフンター・コーポレーション（GenHunter Corp
oration）の「メッセージクリーン（Message Clean）」と「ＲＮＡイメージ（RN
A image）」キットを、基本的に製造業者が記載するように使用して行った。簡
単に説明すると、ＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅで処理し、１μg
を、３つの１塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡ、Ｃ、またはＧのい
ずれかを使用して、１００μlの反応緩衝液中で逆転写した。ＲＮＡはまた、９
個の２塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、Ｃ
Ａ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＣのいずれかを使用して逆転写した。比較すべきすべ
て試料を、同じ実験で逆転写し、アリコートに分けて凍結した。ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼとα−³³Ｐ ｄＡＴＰ（３，０００Ci/mmol）を含有する１０μlの増
幅混合物中のわずかに１μlのみの逆転写試料を用いて、増幅を行った。８０の
５'末端（ＨＡＰ）ランダム配列プライマーを、（ＨＴ１１）Ａ、Ｃ、Ｇ、ＡＡ
、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、ＣＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、またはＧＣプライマーのそれぞ
れと組合せて使用した。次に試料を、７％変性ポリアクリルアミドゲルで流し、
オートラジオグラフィーに暴露した。推定の差別的に発現されたバンドを切り取
り、供給業者の説明書に従って再増幅し、ＩＦＮ処理、ＩＬ−１５処理、および
賦形剤処理動物の口咽頭腔から抽出したＲＮＡのノーザンブロットとハイブリダ
イズするプローブとしてさらに使用した。

【０１３５】 クローニングと配列決定 差別ディスプレイスクリーニングからの再増幅バンドを、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉ
ｐｔＳＫ（＋）プラスミド（ストラタジーン（Stratagene））のＳｆｒ１部位に
クローン化し、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅から増幅されたｃＤＮＡを、ｐＣＲ３プ
ラスミド（インビトロゲン（Invitrogen））中のＴＡクローニングにより単離し
た。自動ジデオキシシーケンサー（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）ＡＢＩ
ＰＲＩＳＭ３７７）を使用して、ＤＮＡを配列決定した。

【０１３６】 ヒトｃＤＮＡの同定 差別ディスプレイスクリーニングから同定した差別的に発現されたマウス３'
配列を、米国ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメ
ーション（ＮＣＢＩ、National Center for Biotechnology Information）のジ
ーンバンク（GenBank）（登録商標）のｄｂＥＳＴデータベース中に存在するラ
ンダムなヒトの発現配列標識物（ＥＳＴ）と比較した。差別ディスプレイスクリ
ーニングから単離されたマウスＥＳＴと関連するかも知れない配列をコンチグ（
contig）で組合せて、推定ｃＤＮＡに対応するヒトコンセンサス配列を構築する
のに使用した。

【０１３７】 そのようなｃＤＮＡの１つは、ジーンバンク（GenBank）ｃＤＮＡ配列ｇ１５
０４００７に対応することがわかった。対応するポリペプチド配列は、ジーンバ
ンク（GenBank）配列ｇ１５０４００８であり、これは、ＫＩＡＡ０２１２に対
応するとしてジーンバンク（GenBank）で認められている。

【０１３８】 上記したようにＩＦＮ−αの口腔粘着投与に応答してリンパ組織中でアップレ
ギュレートされた他のマウス遺伝子もまた、ＩＦＮ−αの静脈内投与に応答して
マウスの脾臓中でアップレギュレートされることがわかっている。ＩＦＮ−αの
静脈内投与を以下の例１７に記載のように行うと、ジーンバンク（GenBank）ｃ
ＤＮＡ受け入れ番号ｇ１５０４００７により同定されるヒト遺伝子に対応するマ
ウス遺伝子について、同様の結果が予測される。

【０１３９】 さらに、ＩＦＮ−αの口腔粘着および静脈内投与に応答してアップレギュレー
トされることがわかったマウス遺伝子のヒト遺伝子類似体に対応するｍＲＮＡは
、ＩＦＮ−αのインビトロの処理後にヒトの末梢血単核細胞中で増加することが
わかっている。ヒト末梢血単核細胞を以下の例１８に記載のようにＩＦＮ−αで
処理すると、配列番号１１９に示すｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡについて、同じ
結果が予測される。

【０１４０】 例１１ 正常な成体マウスの各鼻孔に、Ｐ２０エッペンドルフマイクロピペットを使用
して、５μlのクリスタルバイオレットを適用すると、ほとんど直後に口咽頭腔
の全表面にわたって色素が分布することが、以前の実験で証明されている。口咽
頭腔の染色は、色素の適用後約３０分後もまだ明らかであった。これらの結果は
、同じ方法で適用された¹²⁵Ｉ−標識組換えヒトＩＦＮ−α１−８を使用して確
認された。同じ投与法を使用して、以下に示す試験で口腔粘膜投与を行った。

【０１４１】 ６週齢の雄のＤＢＡ／２マウスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のラ
イフテクノロジーズ社（Life Technologies Inc.）から購入した１００，０００
IUの組換えマウスインターフェロンα（ＩＦＮα）、プロテインインスチチュー
ト社（Protein Institute Inc.）から購入した１０μgの組換えヒトインターロ
イキン１５（ＩＬ−１５）、１００μg/mlのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
有するＰＢＳで処理したか、または未処理のままとした。８時間後、マウスを頚
部脱臼により屠殺し、口咽頭腔から外科的にリンパ組織を取り出し、液体窒素中
で急速凍結し、−８０℃で保存した。チョムクジンスキー（Chomczynski）とサ
ッチ（Sacchi）の方法（Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159）によりリンパ組
織からＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ差別ディスプレイ分析を行った（ラング・ピー
（Lang. P.）とパルディー・エー・ビー（Pardee, A.B.）, Science 257, 967-9
71）。

【０１４２】 差別ディスプレイ分析 差別ディスプレイ分析は、ゲンフンター・コーポレーション（GenHunter Corp
oration）の「メッセージクリーン（Message Clean）」と「ＲＮＡイメージ（RN
A image）」キットを、基本的に製造業者が記載するように使用して行った。簡
単に説明すると、ＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅで処理し、１μg
を、３つの１塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡ、Ｃ、またはＧのい
ずれかを使用して、１００μlの反応緩衝液中で逆転写した。ＲＮＡはまた、９
個の２塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、Ｃ
Ａ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＣのいずれかを使用して逆転写した。比較すべきすべ
て試料を、同じ実験で逆転写し、アリコートに分けて凍結した。ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼとα−³³Ｐ ｄＡＴＰ（３，０００Ci/mmol）を含有する１０μlの増
幅混合物中のわずかに１μlのみの逆転写試料を用いて、増幅を行った。８０の
５'末端（ＨＡＰ）ランダム配列プライマーを、（ＨＴ１１）Ａ、Ｃ、Ｇ、ＡＡ
、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、ＣＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、またはＧＣプライマーのそれぞ
れと組合せて使用した。次に試料を、７％変性ポリアクリルアミドゲルで流し、
オートラジオグラフィーに暴露した。推定の差別的に発現されたバンドを切り取
り、供給業者の説明書に従って再増幅し、ＩＦＮ処理、ＩＬ−１５処理、および
賦形剤処理動物の口咽頭腔から抽出したＲＮＡのノーザンブロットとハイブリダ
イズするプローブとしてさらに使用した。

【０１４３】 クローニングと配列決定 差別ディスプレイスクリーニングからの再増幅バンドを、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉ
ｐｔＳＫ（＋）プラスミド（ストラタジーン（Stratagene））のＳｆｒ１部位に
クローン化し、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅から増幅されたｃＤＮＡを、ｐＣＲ３プ
ラスミド（インビトロゲン（Invitrogen））中のＴＡクローニングにより単離し
た。自動ジデオキシシーケンサー（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）ＡＢＩ
ＰＲＩＳＭ３７７）を使用して、ＤＮＡを配列決定した。

【０１４４】 ヒトｃＤＮＡの同定 差別ディスプレイスクリーニングから同定した差別的に発現されたマウス３'
配列を、米国ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメ
ーション（ＮＣＢＩ、National Center for Biotechnology Information）のジ
ーンバンク（GenBank）（登録商標）のｄｂＥＳＴデータベース中に存在するラ
ンダムなヒトの発現配列標識物（ＥＳＴ）と比較した。差別ディスプレイスクリ
ーニングから単離されたマウスＥＳＴと関連するかも知れない配列をコンチグ（
contig）で組合せて、推定ｃＤＮＡに対応するヒトコンセンサス配列を構築する
のに使用した。

【０１４５】 そのようなｃＤＮＡの１つは、ジーンバンク（GenBank）ｃＤＮＡ配列ｇ３７
０２４４６に対応することがわかった。対応するポリペプチド配列は、ジーンバ
ンク（GenBank）配列ｇ３７０２４４８であり、これは、ＮＰＩＫ−Ｂに対応す
るとしてジーンバンク（GenBank）で認められている。

【０１４６】 上記したようにＩＦＮ−αの口腔粘着投与に応答してリンパ組織中でアップレ
ギュレートされた他のマウス遺伝子もまた、ＩＦＮ−αの静脈内投与に応答して
マウスの脾臓中でアップレギュレートされることがわかっている。ＩＦＮ−αの
静脈内投与を以下の例１７に記載のように行うと、ジーンバンク（GenBank）ｃ
ＤＮＡ受け入れ番号ｇ３７０２４４６により同定されるヒト遺伝子に対応するマ
ウス遺伝子について、同様の結果が予測される。

【０１４７】 さらに、ＩＦＮ−αの口腔粘着および静脈内投与に応答してアップレギュレー
トされることがわかったマウス遺伝子のヒト遺伝子類似体に対応するｍＲＮＡは
、ＩＦＮ−αのインビトロの処理後にヒトの末梢血単核細胞中で増加することが
わかっている。ヒト末梢血単核細胞を以下の例１８に記載のようにＩＦＮ−αで
処理すると、配列番号２１に示すｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡについて、同じ結
果が予測される。

【０１４８】 例１２ 正常な成体マウスの各鼻孔に、Ｐ２０エッペンドルフマイクロピペットを使用
して、５μlのクリスタルバイオレットを適用すると、ほとんど直後に口咽頭腔
の全表面にわたって色素が分布することが、以前の実験で証明されている。口咽
頭腔の染色は、色素の適用後約３０分後もまだ明らかであった。これらの結果は
、同じ方法で適用された¹²⁵Ｉ−標識組換えヒトＩＦＮ−α１−８を使用して確
認された。同じ投与法を使用して、以下に示す試験で口腔粘膜投与を行った。

【０１４９】 ６週齢の雄のＤＢＡ／２マウスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のラ
イフテクノロジーズ社（Life Technologies Inc.）から購入した１００，０００
IUの組換えマウスインターフェロンα（ＩＦＮα）、プロテインインスチチュー
ト社（Protein Institute Inc.）から購入した１０μgの組換えヒトインターロ
イキン１５（ＩＬ−１５）、１００μg/mlのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
有するＰＢＳで処理したか、または未処理のままとした。８時間後、マウスを頚
部脱臼により屠殺し、口咽頭腔から外科的にリンパ組織を取り出し、液体窒素中
で急速凍結し、−８０℃で保存した。チョムクジンスキー（Chomczynski）とサ
ッチ（Sacchi）の方法（Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159）によりリンパ組
織からＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ差別ディスプレイ分析を行った（ラング・ピー
（Lang. P.）とパルディー・エー・ビー（Pardee, A.B.）, Science 257, 967-9
71）。

【０１５０】 差別ディスプレイ分析 差別ディスプレイ分析は、ゲンフンター・コーポレーション（GenHunter Corp
oration）の「メッセージクリーン（Message Clean）」と「ＲＮＡイメージ（RN
A image）」キットを、基本的に製造業者が記載するように使用して行った。簡
単に説明すると、ＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅで処理し、１μg
を、３つの１塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡ、Ｃ、またはＧのい
ずれかを使用して、１００μlの反応緩衝液中で逆転写した。ＲＮＡはまた、９
個の２塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、Ｃ
Ａ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＣのいずれかを使用して逆転写した。比較すべきすべ
て試料を、同じ実験で逆転写し、アリコートに分けて凍結した。ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼとα−³³Ｐ ｄＡＴＰ（３，０００Ci/mmol）を含有する１０μlの増
幅混合物中のわずかに１μlのみの逆転写試料を用いて、増幅を行った。８０の
５'末端（ＨＡＰ）ランダム配列プライマーを、（ＨＴ１１）Ａ、Ｃ、Ｇ、ＡＡ
、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、ＣＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、またはＧＣプライマーのそれぞ
れと組合せて使用した。次に試料を、７％変性ポリアクリルアミドゲルで流し、
オートラジオグラフィーに暴露した。推定の差別的に発現されたバンドを切り取
り、供給業者の説明書に従って再増幅し、ＩＦＮ処理、ＩＬ−１５処理、および
賦形剤処理動物の口咽頭腔から抽出したＲＮＡのノーザンブロットとハイブリダ
イズするプローブとしてさらに使用した。

【０１５１】 クローニングと配列決定 差別ディスプレイスクリーニングからの再増幅バンドを、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉ
ｐｔＳＫ（＋）プラスミド（ストラタジーン（Stratagene））のＳｆｒ１部位に
クローン化し、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅から増幅されたｃＤＮＡを、ｐＣＲ３プ
ラスミド（インビトロゲン（Invitrogen））中のＴＡクローニングにより単離し
た。自動ジデオキシシーケンサー（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）ＡＢＩ
ＰＲＩＳＭ３７７）を使用して、ＤＮＡを配列決定した。

【０１５２】 ヒトｃＤＮＡの同定 差別ディスプレイスクリーニングから同定した差別的に発現されたマウス３'
配列を、米国ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメ
ーション（ＮＣＢＩ、National Center for Biotechnology Information）のジ
ーンバンク（GenBank）（登録商標）のｄｂＥＳＴデータベース中に存在するラ
ンダムなヒトの発現配列標識物（ＥＳＴ）と比較した。差別ディスプレイスクリ
ーニングから単離されたマウスＥＳＴと関連するかも知れない配列をコンチグ（
contig）で組合せて、推定ｃＤＮＡに対応するヒトコンセンサス配列を構築する
のに使用した。

【０１５３】 そのようなｃＤＮＡの１つは、ジーンバンク（GenBank）ｃＤＮＡ配列ｇ４０
０１８０２に対応することがわかった。対応するポリペプチド配列は、ジーンバ
ンク（GenBank）配列ｇ４００１８０３であり、これは、ＢＡＦ５３ａに対応す
るとしてジーンバンク（GenBank）で認められている。

【０１５４】 上記したようにＩＦＮ−αの口腔粘着投与に応答してリンパ組織中でアップレ
ギュレートされた他のマウス遺伝子もまた、ＩＦＮ−αの静脈内投与に応答して
マウスの脾臓中でアップレギュレートされることがわかっている。ＩＦＮ−αの
静脈内投与を以下の例１７に記載のように行うと、ジーンバンク（GenBank）ｃ
ＤＮＡ受け入れ番号ｇ４００１８０２により同定されるヒト遺伝子に対応するマ
ウス遺伝子について、同様の結果が予測される。

【０１５５】 さらに、ＩＦＮ−αの口腔粘着および静脈内投与に応答してアップレギュレー
トされることがわかったマウス遺伝子のヒト遺伝子類似体に対応するｍＲＮＡは
、ＩＦＮ−αのインビトロの処理後にヒトの末梢血単核細胞中で増加することが
わかっている。ヒト末梢血単核細胞を以下の例１８に記載のようにＩＦＮ−αで
処理すると、配列番号２３に示すｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡについて、同じ結
果が予測される。

【０１５６】 例１３ 正常な成体マウスの各鼻孔に、Ｐ２０エッペンドルフマイクロピペットを使用
して、５μlのクリスタルバイオレットを適用すると、ほとんど直後に口咽頭腔
の全表面にわたって色素が分布することが、以前の実験で証明されている。口咽
頭腔の染色は、色素の適用後約３０分後もまだ明らかであった。これらの結果は
、同じ方法で適用された¹²⁵Ｉ−標識組換えヒトＩＦＮ−α１−８を使用して確
認された。同じ投与法を使用して、以下に示す試験で口腔粘膜投与を行った。

【０１５７】 ６週齢の雄のＤＢＡ／２マウスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のラ
イフテクノロジーズ社（Life Technologies Inc.）から購入した１００，０００
IUの組換えマウスインターフェロンα（ＩＦＮα）、プロテインインスチチュー
ト社（Protein Institute Inc.）から購入した１０μgの組換えヒトインターロ
イキン１５（ＩＬ−１５）、１００μg/mlのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
有するＰＢＳで処理したか、または未処理のままとした。８時間後、マウスを頚
部脱臼により屠殺し、口咽頭腔から外科的にリンパ組織を取り出し、液体窒素中
で急速凍結し、−８０℃で保存した。チョムクジンスキー（Chomczynski）とサ
ッチ（Sacchi）の方法（Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159）によりリンパ組
織からＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ差別ディスプレイ分析を行った（ラング・ピー
（Lang. P.）とパルディー・エー・ビー（Pardee, A.B.）, Science 257, 967-9
71）。

【０１５８】 差別ディスプレイ分析 差別ディスプレイ分析は、ゲンフンター・コーポレーション（GenHunter Corp
oration）の「メッセージクリーン（Message Clean）」と「ＲＮＡイメージ（RN
A image）」キットを、基本的に製造業者が記載するように使用して行った。簡
単に説明すると、ＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅで処理し、１μg
を、３つの１塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡ、Ｃ、またはＧのい
ずれかを使用して、１００μlの反応緩衝液中で逆転写した。ＲＮＡはまた、９
個の２塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、Ｃ
Ａ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＣのいずれかを使用して逆転写した。比較すべきすべ
て試料を、同じ実験で逆転写し、アリコートに分けて凍結した。ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼとα−³³Ｐ ｄＡＴＰ（３，０００Ci/mmol）を含有する１０μlの増
幅混合物中のわずかに１μlのみの逆転写試料を用いて、増幅を行った。８０の
５'末端（ＨＡＰ）ランダム配列プライマーを、（ＨＴ１１）Ａ、Ｃ、Ｇ、ＡＡ
、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、ＣＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、またはＧＣプライマーのそれぞ
れと組合せて使用した。次に試料を、７％変性ポリアクリルアミドゲルで流し、
オートラジオグラフィーに暴露した。推定の差別的に発現されたバンドを切り取
り、供給業者の説明書に従って再増幅し、ＩＦＮ処理、ＩＬ−１５処理、および
賦形剤処理動物の口咽頭腔から抽出したＲＮＡのノーザンブロットとハイブリダ
イズするプローブとしてさらに使用した。

【０１５９】 クローニングと配列決定 差別ディスプレイスクリーニングからの再増幅バンドを、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉ
ｐｔＳＫ（＋）プラスミド（ストラタジーン（Stratagene））のＳｆｒ１部位に
クローン化し、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅から増幅されたｃＤＮＡを、ｐＣＲ３プ
ラスミド（インビトロゲン（Invitrogen））中のＴＡクローニングにより単離し
た。自動ジデオキシシーケンサー（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）ＡＢＩ
ＰＲＩＳＭ３７７）を使用して、ＤＮＡを配列決定した。

【０１６０】 ヒトｃＤＮＡの同定 差別ディスプレイスクリーニングから同定した差別的に発現されたマウス３'
配列を、米国ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメ
ーション（ＮＣＢＩ、National Center for Biotechnology Information）のジ
ーンバンク（GenBank）（登録商標）のｄｂＥＳＴデータベース中に存在するラ
ンダムなヒトの発現配列標識物（ＥＳＴ）と比較した。差別ディスプレイスクリ
ーニングから単離されたマウスＥＳＴと関連するかも知れない配列をコンチグ（
contig）で組合せて、推定ｃＤＮＡに対応するヒトコンセンサス配列を構築する
のに使用した。

【０１６１】 そのようなｃＤＮＡの１つは、ジーンバンク（GenBank）ｃＤＮＡ配列ｇ２９
２２８９に対応することがわかった。対応するポリペプチド配列は、ジーンバン
ク（GenBank）配列ｇ２９２２９０であり、これは、ＭＥＦ２Ｃに対応するとし
てジーンバンク（GenBank）で認められている。

【０１６２】 上記したようにＩＦＮ−αの口腔粘着投与に応答してリンパ組織中でアップレ
ギュレートされた他のマウス遺伝子もまた、ＩＦＮ−αの静脈内投与に応答して
マウスの脾臓中でアップレギュレートされることがわかっている。ＩＦＮ−αの
静脈内投与を以下の例１７に記載のように行うと、ジーンバンク（GenBank）ｃ
ＤＮＡ受け入れ番号ｇ２９２２８９により同定されるヒト遺伝子に対応するマウ
ス遺伝子について、同様の結果が予測される。

【０１６３】 さらに、ＩＦＮ−αの口腔粘着および静脈内投与に応答してアップレギュレー
トされることがわかったマウス遺伝子のヒト遺伝子類似体に対応するｍＲＮＡは
、ＩＦＮ−αのインビトロの処理後にヒトの末梢血単核細胞中で増加することが
わかっている。ヒト末梢血単核細胞を以下の例１８に記載のようにＩＦＮ−αで
処理すると、配列番号２５に示すｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡについて、同じ結
果が予測される。

【０１６４】 例１４ 正常な成体マウスの各鼻孔に、Ｐ２０エッペンドルフマイクロピペットを使用
して、５μlのクリスタルバイオレットを適用すると、ほとんど直後に口咽頭腔
の全表面にわたって色素が分布することが、以前の実験で証明されている。口咽
頭腔の染色は、色素の適用後約３０分後もまだ明らかであった。これらの結果は
、同じ方法で適用された¹²⁵Ｉ−標識組換えヒトＩＦＮ−α１−８を使用して確
認された。同じ投与法を使用して、以下に示す試験で口腔粘膜投与を行った。

【０１６５】 ６週齢の雄のＤＢＡ／２マウスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のラ
イフテクノロジーズ社（Life Technologies Inc.）から購入した１００，０００
IUの組換えマウスインターフェロンα（ＩＦＮα）、プロテインインスチチュー
ト社（Protein Institute Inc.）から購入した１０μgの組換えヒトインターロ
イキン１５（ＩＬ−１５）、１００μg/mlのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
有するＰＢＳで処理したか、または未処理のままとした。８時間後、マウスを頚
部脱臼により屠殺し、口咽頭腔から外科的にリンパ組織を取り出し、液体窒素中
で急速凍結し、−８０℃で保存した。チョムクジンスキー（Chomczynski）とサ
ッチ（Sacchi）の方法（Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159）によりリンパ組
織からＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ差別ディスプレイ分析を行った（ラング・ピー
（Lang. P.）とパルディー・エー・ビー（Pardee, A.B.）, Science 257, 967-9
71）。

【０１６６】 差別ディスプレイ分析 差別ディスプレイ分析は、ゲンフンター・コーポレーション（GenHunter Corp
oration）の「メッセージクリーン（Message Clean）」と「ＲＮＡイメージ（RN
A image）」キットを、基本的に製造業者が記載するように使用して行った。簡
単に説明すると、ＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅで処理し、１μg
を、３つの１塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡ、Ｃ、またはＧのい
ずれかを使用して、１００μlの反応緩衝液中で逆転写した。ＲＮＡはまた、９
個の２塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、Ｃ
Ａ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＣのいずれかを使用して逆転写した。比較すべきすべ
て試料を、同じ実験で逆転写し、アリコートに分けて凍結した。ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼとα−³³Ｐ ｄＡＴＰ（３，０００Ci/mmol）を含有する１０μlの増
幅混合物中のわずかに１μlのみの逆転写試料を用いて、増幅を行った。８０の
５'末端（ＨＡＰ）ランダム配列プライマーを、（ＨＴ１１）Ａ、Ｃ、Ｇ、ＡＡ
、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、ＣＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、またはＧＣプライマーのそれぞ
れと組合せて使用した。次に試料を、７％変性ポリアクリルアミドゲルで流し、
オートラジオグラフィーに暴露した。推定の差別的に発現されたバンドを切り取
り、供給業者の説明書に従って再増幅し、ＩＦＮ処理、ＩＬ−１５処理、および
賦形剤処理動物の口咽頭腔から抽出したＲＮＡのノーザンブロットとハイブリダ
イズするプローブとしてさらに使用した。

【０１６７】 クローニングと配列決定 差別ディスプレイスクリーニングからの再増幅バンドを、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉ
ｐｔＳＫ（＋）プラスミド（ストラタジーン（Stratagene））のＳｆｒ１部位に
クローン化し、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅から増幅されたｃＤＮＡを、ｐＣＲ３プ
ラスミド（インビトロゲン（Invitrogen））中のＴＡクローニングにより単離し
た。自動ジデオキシシーケンサー（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）ＡＢＩ
ＰＲＩＳＭ３７７）を使用して、ＤＮＡを配列決定した。

【０１６８】 ヒトｃＤＮＡの同定 差別ディスプレイスクリーニングから同定した差別的に発現されたマウス３'
配列を、米国ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメ
ーション（ＮＣＢＩ、National Center for Biotechnology Information）のジ
ーンバンク（GenBank）（登録商標）のｄｂＥＳＴデータベース中に存在するラ
ンダムなヒトの発現配列標識物（ＥＳＴ）と比較した。差別ディスプレイスクリ
ーニングから単離されたマウスＥＳＴと関連するかも知れない配列をコンチグ（
contig）で組合せて、推定ｃＤＮＡに対応するヒトコンセンサス配列を構築する
のに使用した。

【０１６９】 そのようなｃＤＮＡの１つは、ジーンバンク（GenBank）ｃＤＮＡ配列ｇ４５
５７２２６に対応することがわかった。対応するポリペプチド配列は、ジーンバ
ンク（GenBank）配列ｇ４５５７２２７であり、これは、ＡＡＤＡＣに対応する
としてジーンバンク（GenBank）で認められている。

【０１７０】 上記したようにＩＦＮ−αの口腔粘着投与に応答してリンパ組織中でアップレ
ギュレートされた他のマウス遺伝子もまた、ＩＦＮ−αの静脈内投与に応答して
マウスの脾臓中でアップレギュレートされることがわかっている。ＩＦＮ−αの
静脈内投与を以下の例１７に記載のように行うと、ジーンバンク（GenBank）ｃ
ＤＮＡ受け入れ番号ｇ４５５７２２６により同定されるヒト遺伝子に対応するマ
ウス遺伝子について、同様の結果が予測される。

【０１７１】 さらに、ＩＦＮ−αの口腔粘着および静脈内投与に応答してアップレギュレー
トされることがわかったマウス遺伝子のヒト遺伝子類似体に対応するｍＲＮＡは
、ＩＦＮ−αのインビトロの処理後にヒトの末梢血単核細胞中で増加することが
わかっている。ヒト末梢血単核細胞を以下の例１８に記載のようにＩＦＮ−αで
処理すると、配列番号２７に示すｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡについて、同じ結
果が予測される。

【０１７２】 例１５ 正常な成体マウスの各鼻孔に、Ｐ２０エッペンドルフマイクロピペットを使用
して、５μlのクリスタルバイオレットを適用すると、ほとんど直後に口咽頭腔
の全表面にわたって色素が分布することが、以前の実験で証明されている。口咽
頭腔の染色は、色素の適用後約３０分後もまだ明らかであった。これらの結果は
、同じ方法で適用された¹²⁵Ｉ−標識組換えヒトＩＦＮ−α１−８を使用して確
認された。同じ投与法を使用して、以下に示す試験で口腔粘膜投与を行った。

【０１７３】 ６週齢の雄のＤＢＡ／２マウスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のラ
イフテクノロジーズ社（Life Technologies Inc.）から購入した１００，０００
IUの組換えマウスインターフェロンα（ＩＦＮα）、プロテインインスチチュー
ト社（Protein Institute Inc.）から購入した１０μgの組換えヒトインターロ
イキン１５（ＩＬ−１５）、１００μg/mlのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
有するＰＢＳで処理したか、または未処理のままとした。８時間後、マウスを頚
部脱臼により屠殺し、口咽頭腔から外科的にリンパ組織を取り出し、液体窒素中
で急速凍結し、−８０℃で保存した。チョムクジンスキー（Chomczynski）とサ
ッチ（Sacchi）の方法（Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159）によりリンパ組
織からＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ差別ディスプレイ分析を行った（ラング・ピー
（Lang. P.）とパルディー・エー・ビー（Pardee, A.B.）, Science 257, 967-9
71）。

【０１７４】 差別ディスプレイ分析 差別ディスプレイ分析は、ゲンフンター・コーポレーション（GenHunter Corp
oration）の「メッセージクリーン（Message Clean）」と「ＲＮＡイメージ（RN
A image）」キットを、基本的に製造業者が記載するように使用して行った。簡
単に説明すると、ＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅで処理し、１μg
を、３つの１塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡ、Ｃ、またはＧのい
ずれかを使用して、１００μlの反応緩衝液中で逆転写した。ＲＮＡはまた、９
個の２塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、Ｃ
Ａ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＣのいずれかを使用して逆転写した。比較すべきすべ
て試料を、同じ実験で逆転写し、アリコートに分けて凍結した。ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼとα−³³Ｐ ｄＡＴＰ（３，０００Ci/mmol）を含有する１０μlの増
幅混合物中のわずかに１μlのみの逆転写試料を用いて、増幅を行った。８０の
５'末端（ＨＡＰ）ランダム配列プライマーを、（ＨＴ１１）Ａ、Ｃ、Ｇ、ＡＡ
、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、ＣＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、またはＧＣプライマーのそれぞ
れと組合せて使用した。次に試料を、７％変性ポリアクリルアミドゲルで流し、
オートラジオグラフィーに暴露した。推定の差別的に発現されたバンドを切り取
り、供給業者の説明書に従って再増幅し、ＩＦＮ処理、ＩＬ−１５処理、および
賦形剤処理動物の口咽頭腔から抽出したＲＮＡのノーザンブロットとハイブリダ
イズするプローブとしてさらに使用した。

【０１７５】 クローニングと配列決定 差別ディスプレイスクリーニングからの再増幅バンドを、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉ
ｐｔＳＫ（＋）プラスミド（ストラタジーン（Stratagene））のＳｆｒ１部位に
クローン化し、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅から増幅されたｃＤＮＡを、ｐＣＲ３プ
ラスミド（インビトロゲン（Invitrogen））中のＴＡクローニングにより単離し
た。自動ジデオキシシーケンサー（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）ＡＢＩ
ＰＲＩＳＭ３７７）を使用して、ＤＮＡを配列決定した。

【０１７６】 ヒトｃＤＮＡの同定 差別ディスプレイスクリーニングから同定した差別的に発現されたマウス３'
配列を、米国ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメ
ーション（ＮＣＢＩ、National Center for Biotechnology Information）のジ
ーンバンク（GenBank）（登録商標）のｄｂＥＳＴデータベース中に存在するラ
ンダムなヒトの発現配列標識物（ＥＳＴ）と比較した。差別ディスプレイスクリ
ーニングから単離されたマウスＥＳＴと関連するかも知れない配列をコンチグ（
contig）で組合せて、推定ｃＤＮＡに対応するヒトコンセンサス配列を構築する
のに使用した。

【０１７７】 そのようなｃＤＮＡの１つは、ジーンバンク（GenBank）ｃＤＮＡ配列ｇ４５
０７６４６に対応することがわかった。対応するポリペプチド配列は、ジーンバ
ンク（GenBank）配列ｇ４５０７６４７であり、これは、ＴＰＭ１に対応すると
してジーンバンク（GenBank）で認められている。

【０１７８】 上記したようにＩＦＮ−αの口腔粘着投与に応答してリンパ組織中でアップレ
ギュレートされた他のマウス遺伝子もまた、ＩＦＮ−αの静脈内投与に応答して
マウスの脾臓中でアップレギュレートされることがわかっている。ＩＦＮ−αの
静脈内投与を以下の例１７に記載のように行うと、ジーンバンク（GenBank）ｃ
ＤＮＡ受け入れ番号ｇ４５０７６４６により同定されるヒト遺伝子に対応するマ
ウス遺伝子について、同様の結果が予測される。

【０１７９】 さらに、ＩＦＮ−αの口腔粘着および静脈内投与に応答してアップレギュレー
トされることがわかったマウス遺伝子のヒト遺伝子類似体に対応するｍＲＮＡは
、ＩＦＮ−αのインビトロの処理後にヒトの末梢血単核細胞中で増加することが
わかっている。ヒト末梢血単核細胞を以下の例１８に記載のようにＩＦＮ−αで
処理すると、配列番号２９に示すｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡについて、同じ結
果が予測される。

【０１８０】 例１６ 正常な成体マウスの各鼻孔に、Ｐ２０エッペンドルフマイクロピペットを使用
して、５μlのクリスタルバイオレットを適用すると、ほとんど直後に口咽頭腔
の全表面にわたって色素が分布することが、以前の実験で証明されている。口咽
頭腔の染色は、色素の適用後約３０分後もまだ明らかであった。これらの結果は
、同じ方法で適用された¹²⁵Ｉ−標識組換えヒトＩＦＮ−α１−８を使用して確
認された。同じ投与法を使用して、以下に示す試験で口腔粘膜投与を行った。

【０１８１】 ６週齢の雄のＤＢＡ／２マウスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のラ
イフテクノロジーズ社（Life Technologies Inc.）から購入した１００，０００
IUの組換えマウスインターフェロンα（ＩＦＮα）、プロテインインスチチュー
ト社（Protein Institute Inc.）から購入した１０μgの組換えヒトインターロ
イキン１５（ＩＬ−１５）、１００μg/mlのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
有するＰＢＳで処理したか、または未処理のままとした。８時間後、マウスを頚
部脱臼により屠殺し、口咽頭腔から外科的にリンパ組織を取り出し、液体窒素中
で急速凍結し、−８０℃で保存した。チョムクジンスキー（Chomczynski）とサ
ッチ（Sacchi）の方法（Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159）によりリンパ組
織からＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ差別ディスプレイ分析を行った（ラング・ピー
（Lang. P.）とパルディー・エー・ビー（Pardee, A.B.）, Science 257, 967-9
71）。

【０１８２】 差別ディスプレイ分析 差別ディスプレイ分析は、ゲンフンター・コーポレーション（GenHunter Corp
oration）の「メッセージクリーン（Message Clean）」と「ＲＮＡイメージ（RN
A image）」キットを、基本的に製造業者が記載するように使用して行った。簡
単に説明すると、ＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅで処理し、１μg
を、３つの１塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡ、Ｃ、またはＧのい
ずれかを使用して、１００μlの反応緩衝液中で逆転写した。ＲＮＡはまた、９
個の２塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、Ｃ
Ａ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＣのいずれかを使用して逆転写した。比較すべきすべ
て試料を、同じ実験で逆転写し、アリコートに分けて凍結した。ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼとα−³³Ｐ ｄＡＴＰ（３，０００Ci/mmol）を含有する１０μlの増
幅混合物中のわずかに１μlのみの逆転写試料を用いて、増幅を行った。８０の
５'末端（ＨＡＰ）ランダム配列プライマーを、（ＨＴ１１）Ａ、Ｃ、Ｇ、ＡＡ
、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、ＣＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、またはＧＣプライマーのそれぞ
れと組合せて使用した。次に試料を、７％変性ポリアクリルアミドゲルで流し、
オートラジオグラフィーに暴露した。推定の差別的に発現されたバンドを切り取
り、供給業者の説明書に従って再増幅し、ＩＦＮ処理、ＩＬ−１５処理、および
賦形剤処理動物の口咽頭腔から抽出したＲＮＡのノーザンブロットとハイブリダ
イズするプローブとしてさらに使用した。

【０１８３】 クローニングと配列決定 差別ディスプレイスクリーニングからの再増幅バンドを、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉ
ｐｔＳＫ（＋）プラスミド（ストラタジーン（Stratagene））のＳｆｒ１部位に
クローン化し、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅から増幅されたｃＤＮＡを、ｐＣＲ３プ
ラスミド（インビトロゲン（Invitrogen））中のＴＡクローニングにより単離し
た。自動ジデオキシシーケンサー（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）ＡＢＩ
ＰＲＩＳＭ３７７）を使用して、ＤＮＡを配列決定した。

【０１８４】 ヒトｃＤＮＡの同定 差別ディスプレイスクリーニングから同定した差別的に発現されたマウス３'
配列を、米国ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメ
ーション（ＮＣＢＩ、National Center for Biotechnology Information）のジ
ーンバンク（GenBank）（登録商標）のｄｂＥＳＴデータベース中に存在するラ
ンダムなヒトの発現配列標識物（ＥＳＴ）と比較した。差別ディスプレイスクリ
ーニングから単離されたマウスＥＳＴと関連するかも知れない配列をコンチグ（
contig）で組合せて、推定ｃＤＮＡに対応するヒトコンセンサス配列を構築する
のに使用した。

【０１８５】 そのようなｃＤＮＡの１つは、ジーンバンク（GenBank）ｃＤＮＡ配列ｇ４５
０７１７０に対応することがわかった。対応するポリペプチド配列は、ジーンバ
ンク（GenBank）配列ｇ４５０７１７１であり、これは、ＳＰＡＲＣに対応する
としてジーンバンク（GenBank）で認められている。

【０１８６】 上記したようにＩＦＮ−αの口腔粘着投与に応答してリンパ組織中でアップレ
ギュレートされた他のマウス遺伝子もまた、ＩＦＮ−αの静脈内投与に応答して
マウスの脾臓中でアップレギュレートされることがわかっている。ＩＦＮ−αの
静脈内投与を以下の例１７に記載のように行うと、ジーンバンク（GenBank）ｃ
ＤＮＡ受け入れ番号ｇ４５０７１７０により同定されるヒト遺伝子に対応するマ
ウス遺伝子について、同様の結果が予測される。

【０１８７】 さらに、ＩＦＮ−αの口腔粘着および静脈内投与に応答してアップレギュレー
トされることがわかったマウス遺伝子のヒト遺伝子類似体に対応するｍＲＮＡは
、ＩＦＮ−αのインビトロの処理後にヒトの末梢血単核細胞中で増加することが
わかっている。ヒト末梢血単核細胞を以下の例１８に記載のようにＩＦＮ−αで
処理すると、配列番号３１に示すｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡについて、同じ結
果が予測される。

【０１８８】 例１７ ＩＦＮ−αの静脈内投与 オスのＤＢＡ／２マウスに、２００μlのＰＢＳ中のライフテクノロジーズ社
（Life Technologies Inc.）から購入した１００，０００IUの組換えマウスＩＦ
Ｎ−αを静脈内注射したか、または等量のＰＢＳのみで処理した。８時間後、頚
部脱臼により動物を屠殺し、通常の方法で脾臓を取り出した。チョムクジンスキ
ー（Chomczynski）とサッチ（Sacchi）の方法（Anal. Biochem. (1987) 162, 15
6-159）により総ＲＮＡを抽出し、試料当たり１０．０μgの総ＲＮＡを、グリオ
キサールの存在下でノーザンブロッティングを行い、ダンドイ−ドロン（Dandoy
-Dron）ら（J. Biol. Chem. (1998) 273, 7691-7697）が記載したように、目的
のｍＲＮＡについてｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ブロットをまず
、オートラジオグラフィーに暴露し、次にホスホルマージャー（Phospholmager
）を使用して製造業者の説明書に従って定量した。

【０１８９】 例１８ １型インターフェロン応答性のインビトロの試験 正常ドナーからヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコール−ヒペーク（
Ficoll-Hypaque）密度勾配を使用して単離し、ＰＢＳ中１０，０００IUの組換え
ヒトＩＦＮ−α２（シェリング−プラウ（Shering-Plough）からのイントロンＡ
）または等量のＰＢＳのみでインビトロ処理した。８時間後、細胞を遠心分離（
８００×ｇで１０分）し、細胞ペレットを回収した。上記例１７に記載のように
、チョムクジンスキー（Chomczynski）とサッチ（Sacchi）の方法により細胞ペ
レットから総ＲＮＡを抽出し、試料当たり１０．０μgの総ＲＮＡを、ノーザン
ブロッティングを行った。

【０１９０】 同じ操作を使用して、１型インターフェロンで治療する予定の患者から取った
ＰＢＭＣを使用して、１型インターフェロン応答性を予測することができる。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０００３２０５．２ (32)優先日 平成12年２月11日(2000．2．11) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ０００３２０６．０ (32)優先日 平成12年２月11日(2000．2．11) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ０００３２０７．８ (32)優先日 平成12年２月11日(2000．2．11) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ０００３２０８．６ (32)優先日 平成12年２月11日(2000．2．11) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ０００３２１０．２ (32)優先日 平成12年２月11日(2000．2．11) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ０００３２１２．８ (32)優先日 平成12年２月11日(2000．2．11) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ０００３２１３．６ (32)優先日 平成12年２月11日(2000．2．11) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ０００３２１５．１ (32)優先日 平成12年２月11日(2000．2．11) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ０００３２１６．９ (32)優先日 平成12年２月11日(2000．2．11) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ０００３２１９．３ (32)優先日 平成12年２月11日(2000．2．11) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ０００３２２０．１ (32)優先日 平成12年２月11日(2000．2．11) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ０００３２２１．９ (32)優先日 平成12年２月11日(2000．2．11) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ０００３２２２．７ (32)優先日 平成12年２月11日(2000．2．11) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ０００３７６８．９ (32)優先日 平成12年２月17日(2000．2．17) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 トヴェイ、マイケル、ジェラード フランス国 パリ、リュ ラグランジュ、 ７ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA04 CA09 CA12 HA12 4B063 QA01 QA20 QQ08 QQ53 QQ79 QR32 QR55 QR82

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 １型インターフェロンによる治療に対する患者の応答性を予
   測する方法であって、該患者の細胞試料中の、配列番号２、配列番号４、配列番
   号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６
   、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、
   配列番号２８、配列番号３０、または配列番号３２に記載の配列により定義され
   るタンパク質から選択される１つ以上のタンパク質、またはその天然に存在する
   変種、または１つ以上の対応するｍＲＮＡ、のレベルを測定することを含んでな
   り、該試料は、１型インターフェロンが投与された後に該患者から得られるか、
   または該測定前に１型インターフェロンでインビトロで処理される、上記方法。
2. 【請求項２】 試料を得る前に投与されるかまたはインビトロで該試料を処
   理するのに使用されるインターフェロンは、患者の治療に使用される予定のイン
   ターフェロンである、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 患者の血液試料から単離される末梢血単核細胞を含む試料は
   、インビトロで１型インターフェロンで処理される、請求項１または２に記載の
   方法。
4. 【請求項４】 測定は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８
   、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、
   配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配
   列番号３０、または配列番号３２に記載の配列により定義されるタンパク質から
   選択されるタンパク質、または該タンパク質の天然に存在する変種から選択され
   るタンパク質を、コードする１つ以上のｍＲＮＡのレベルを測定することを含ん
   でなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 【請求項５】 ｍＲＮＡまたはその一部は、検出前に増幅される、請求項４
   に記載の方法。
6. 【請求項６】 ｍＲＮＡまたはその増幅産物は、固体支持体に結合した核酸
   プローブを使用して検出される、請求項４または請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 測定は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８
   、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、
   配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配
   列番号３０、または配列番号３２に記載の配列により定義されるタンパク質から
   選択される１つ以上のタンパク質、またはその天然に存在する変種の、レベルを
   測定することを含んでなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。