JP2005500029A - IFNα−7遺伝子の新規ポリヌクレオチド及びポリペプチド - Google Patents
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Abstract
本発明は、新規SNPを含んで成る、IFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列に由来する新規ポリヌクレオチド、及びこれらのSNPによって生じた突然変異を含んで成る、天然の野生型IFNα−7タンパク質に由来する新規ポリペプチド、並びにそれらの治療上の使用に関する。
Description
【技術分野】
【0001】
本発明は、2001年6月11日に出願された、表題「Nouveaux polynucleotides et polipeptides de I'IFN alpha 7」のフランス国特許出願番号第0107588号に対し優先権を主張するものである。
【0002】
本発明は、新規SNPを含んで成る、IFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列に由来する新規ポリヌクレオチド、及びこれらのSNPによって生じた突然変異を含んで成る、天然の野生型IFNα−7タンパク質に由来する新規ポリペプチド、並びにそれらの治療上の使用に関する。
【背景技術】
【0003】
以降IFNα−7と称する、インターフェロンアルファ7遺伝子は、以下の刊行物に記載されている:
- Olopade, O. I. ;Bohlander, S. K.; Pomykala, H.; Maltepe, E.; Van Melle, E.; Le Beau, M. M.; Diaz, M.O. :"Mapping of the shortest region of overlap of deletions of the short arm of chromosome 9 associated with human neoplasia." ; Genomics 14:437- 443,1992.
- Henco K, Brosius J, Fujisawa A, Fujisawa JI, Haynes JR, Hochstadt J,Kovacic T, Pasek M,Schambock A, Schmid J, et al. :"Structural relationship of human interferon alpha genesand pseudogenes." ; J Mol Biol 1985 Sep 20; 185 (2): 227-60.
- Ullrich A, Gray A, Goeddel DV, Dull TJ:"Nucleotide sequence of a portion of human chromosome 9 containing a leukocyte interferon gene cluster." ; J Mol. Biol. 1982 Apr 15; 156 (3): 467-86.
【0004】
この遺伝子のヌクレオチド配列は、GenBankのデータベースにおいてアクセッション番号X02960のもとアクセス可能である。
【0005】
IFNαは、それらの細胞性抗増殖作用、並びに抗ウイルス性及び抗寄生虫性応答におけるそれらの関与について知られている。
【0006】
IFNαはまた、造血幹細胞のレベルで複数の他のサイトカインの発現を阻害し、そしてある腫瘍の細胞増殖を阻害することも知られている。
【0007】
IFNαはまた、腎ガンにおけるEGF受容体の発現を低下させ、あるミトコンドリア遺伝子の発現を阻害し、そして線維芽細胞、単球及びBリンパ球の増殖を、特にin vitroで阻害し、そしてBリンパ球による抗体の合成を阻止することも知られている。
【0008】
IFNαはまた、腫瘍細胞の表面上での腫瘍特異的抗原の発現を誘導すること、そして更にはISRE型(インターフェロン刺激応答因子)のプロモーター領域の支配下にある遺伝子を、これらのISREの特異的な転写因子に対して作用させることによって誘導することも知られている。
【0009】
IFNαが異なる障害及び/又はヒトの疾患、例えば、異なるガン、例えばガン腫、黒色腫、リンパ腫、白血病並びに肝臓、首、頭及び腎臓のガン、心臓血管疾患、代謝病、例えば免疫系等と関連していないもの、例えば肥満、感染症、例えばB型及びC型肝炎並びにAIDS、感染性肺炎、潰瘍性大腸炎、中枢神経系等の疾患、例えばアルツハイマー病、精神分裂病及びうつ病、組織又は器官移植の拒絶、創傷治癒、透析されている患者の貧血、アレルギー、喘息、多発性硬化症、骨粗鬆症、乾癬、リウマチ様関節炎、クローン病、自己免疫疾患及び障害、胃腸疾患、又は化学療法処置と関連している障害、に関与することが知られている。
【0010】
IFNαは、ある白血病、転移型腎ガン及び免疫欠損後に現れる腫瘍、例えばAIDSの場合にはカポジ肉腫に特に使用される。IFNαは、他のタイプの腫瘍及びあるウイルス感染に対しても有効である。IFNαはまた、生殖器のイボ又は性病の処置についてFDA(食品医薬品局)によって承認されている。
【0011】
しかしながら、IFNα、特にIFNα−7は、それらを医薬組成物において使用する場合に多くの副作用があり、例えば急性過敏症(じんま疹、気管支収縮、アナフィラキシーショック等)、心不整脈、低血圧、てんかん性発作、甲状腺機能についての問題、流感様症候群(発熱、発汗、筋肉痛)等である。
【0012】
更に、IFNαで処置された患者は、これらの分子を中和する抗体を産生することができ、その結果それらの有効性が低下する。
【0013】
本発明者は、天然の野生型IFN−7タンパク質と異なる機能性を有しうる、IFNα−7遺伝子に対する新規ポリペプチド及び新規ポリヌクレオチド類似体、を発見した。
【0014】
これらの新規ポリペプチド及びポリヌクレオチドは、前文で言及した障害又は疾患を処置又は予防し、そしてそれらに縛られている欠点の全部又は一部を回避するために特に使用されうる。
【0015】
本発明の簡単な要約
本発明は、第一の目的として、参照野生型IFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列と異なる、すなわち1又は複数のSNP(一塩基多型)を含んで成る新規ポリヌクレオチドを有する。
【0016】
ヒト参照野生型IFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列である配列番号1は、1983ヌクレオチドから成り、そしてヌクレオチド751(開始コドン)からヌクレオチド1320(終止コドン)の、570ヌクレオチドのコード配列を含んで成る。
【0017】
本出願人は、参照野生型IFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列において14個のSNPを同定してきた。これらの14個のSNPは以下の通りである:a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,a1212g,及びa1294c。
【0018】
当然のことながら、本発明の意味においては、前文で限定したSNPの位置に相当する番号付けは、ヌクレオチド配列である配列番号1の番号付けと関連している。
【0019】
文字a,t,c及びgは、それぞれ窒素性塩基のアデニン、チミン、シトシン及びグアニンに相当する。
【0020】
最初の文字は野生型のヌクレオチドに相当し、一方、最後の文字は変異型ヌクレオチドに相当する。
【0021】
したがって、例えばSNP g1033aは、参照野生型IFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列である配列番号1の、1033位のヌクレオチドであるグアニン(g)が、ヌクレオチドであるアデニン(a)に変異したことに相当する。
【0022】
これらのSNPは、表題「Process for the determination of one or several functional polymorphism(s) in the nucleotide sequence of a preselected functional candiate gene and its applications」の、2000年12月6日に出願された出願人の特許出願FR0022894に記載の決定方法を用いて本出願人によって同定された。
【0023】
この特許出願に記載の方法は、無作為な個体群由来の少なくとも1つの個体において、1(又は複数)の既存のSNPの同定を可能にする。
【0024】
本発明の範囲において、例えば、コード配列を含んで成る、IFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列のフラグメントが、無作為に選択した個体群の異なる個体から単離された。
【0025】
続いて、これらのフラグメントの配列決定が、DHPLC(「変性−高性能液体クロマトグラフィー」)による解析の後、ヘテロ二重鎖プロファイル(すなわち、参照野生型IFNα−7遺伝子配列と異なるプロファイル)を有するこれらの試料のうちのいくつかについて行われた。
【0026】
この方法で配列決定されたフラグメントは、続いて参照野生型IFNα−7遺伝子のフラグメントのヌクレオチド配列と比較され、そして本発明に基づくSNPが同定された。
【0027】
この様にSNPは天然のものであり、そしてこれらの各々が世界の人口のある個体に存在している。
【0028】
参照野生型IFNα−7遺伝子は、最初の23アミノ酸を含むシグナルペプチドの開裂によって166アミノ酸の成熟タンパク質に変換される、アミノ酸配列である配列番号2に相当する、189アミノ酸の未成熟タンパク質をコードする。
【0029】
本発明のコードSNPのそれぞれ、すなわち、t779c,g1033a,c1084a,g1135t,t1166c,g1181a,a1294cは、アミノ酸配列のレベルで、IFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の修飾をもたらす。
【0030】
アミノ酸配列におけるこれらの修飾は以下の通りである:
【0031】
SNP t779cは、アミノ酸配列である配列番号2に相当する、IFNα−7遺伝子によってコードされる未成熟タンパク質の10位にあるアミノ酸であるバリン(V)をアラニン(A)に変異させる。このSNPは、タンパク質成熟の過程の間に開裂するシグナル配列に位置するアミノ酸に影響を与え、そして、それ故にこのSNPは、当該成熟タンパク質上に見られない。本発明の記載において、このSNPによってコードされる突然変異は、V10Aと称されることもある。
【0032】
SNP g1033aは、アミノ酸配列である配列番号2に相当する、IFNα−7遺伝子の未成熟タンパク質の95位にあるアミノ酸、アスパラギン酸(D)の、アスパラギン(N)への突然変異、そして成熟タンパク質の72位にあるものの突然変異をもたらす。本発明の記載において、D72N及びD95Nは、それぞれ成熟タンパク質と、又は未成熟タンパク質と言及されるかどうかにより区別することなくこのSNPによってコードされる突然変異と称される。
【0033】
SNP c1084aは、アミノ酸配列である配列番号2に相当する、IFNα−7遺伝子の未成熟タンパク質の112位にあるアミノ酸、ロイシン(L)の、イソロイシン(I)への突然変異、そして成熟タンパク質の89位にあるものの突然変異をもたらす。本発明の記載において、L89I及びL112Iは、それぞれ成熟タンパク質と、又は未成熟タンパク質と言及されるかどうかにより区別されることなくこのSNPによってコードされる突然変異と称される。
【0034】
SNP g1135tは、アミノ酸配列である配列番号2に相当する、IFNα−7遺伝子の未成熟タンパク質の129位にあるアミノ酸、バリン(V)の、ロイシン(L)への突然変異、そして成熟タンパク質の106位にあるものの突然変異をもたらす。本発明の記載において、V106L及びV129Lは、それぞれ成熟タンパク質と、又は未成熟タンパク質と言及されるかどうかにより区別されることなくこのSNPによってコードされる突然変異と称される。
【0035】
SNP t1166cは、アミノ酸配列である配列番号2に相当する、IFNα−7遺伝子の未成熟タンパク質の139位にあるアミノ酸、フェニルアラニン(F)の、セリン(S)への突然変異、そして成熟タンパク質の116位にあるものの突然変異をもたらす。本発明の記載においては、F116S及びF139Sは、それぞれ成熟タンパク質と、又は未成熟タンパク質と言及されるかどうかにより区別されることなくこのSNPによってコードされる突然変異と称される。
【0036】
SNP g1181aは、アミノ酸配列である配列番号2に相当する、IFNα−7遺伝子の未成熟タンパク質の144位にあるアミノ酸、アルギニン(R)の、リジン(K)への突然変異、そして成熟タンパク質の121位にあるものの突然変異をもたらす。本発明の記載においては、R121K及びR144Kは、それぞれ成熟タンパク質と、又は未成熟タンパク質と言及されるかどうかにより区別されることなくこのSNPによってコードされる突然変異と称される。
【0037】
SNP a1294cは、アミノ酸配列である配列番号2に相当する、IFNα−7遺伝子の未成熟タンパク質の182位にあるアミノ酸、リジン(K)の、グルタミン(Q)への突然変異、そして成熟タンパク質の159位にあるものの 突然変異をもたらす。本発明の記載においては、K159Q及びK182Qは、それぞれ成熟タンパク質と、又は未成熟タンパク質と言及されるかどうかにより区別されることなくこのSNPによってコードされる突然変異と称される。
【0038】
SNP g1033a(D95N),t1166c(F139S),g1181a(R144K),a1294c(K182Q)は、野生型参照IFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドと比較して、本発明に従うポリペプチドの空間的な高次構造の修飾をもたらす。
【0039】
これらの修飾は、当業者に周知の方法に従い、例えば新規のモデリングツール(例えば、SEQFOLD/MSI)、ホモロジー(例えば、MODELER/MSI)、力場の最小化(例えば、DISCOVER,DELPHI/MSI)及び/又は分子動力学(CFF/MSI)を利用して、コンピューター分子モデリングによって観察され得る。
【0040】
その様なモデリングの一例は、本明細書において実験の項目に示される。
【0041】
コンピューター分子モデリングは、成熟変異型タンパク質上の突然変異D72Nが、72位のアスパラギン酸を担持するショートヘリックス(T70−A75)の構造的修飾をもたらすことを示す。136位のチロシン残基を有し、72位のアスパラギン酸に面しているヘリックスDとEとの間のループも修飾される。
【0042】
したがって、当該変異タンパク質は、天然の野生型IFNα−7タンパク質と異なる三次元の高次構造を有する。
【0043】
更に、突然変異D72Nはまた、アスパラギン酸の持っていた負電荷の損失をもたらす。最終的に、72位のアスパラギン酸残基の、アスパラギン残基への突然変異は、受容体に結合するIFNα−7部分の近傍において、タンパク質機能を変えるにちがいない。
【0044】
それ故に、コンピューターによる分子モデリングは、72位のアスパラギンの存在が、天然の野生型IFNα−7タンパク質の構造及び機能の重大な修飾に関与していることを推測する。特に、この突然変異は、IFNα−7の、その受容体に対する親和性を変化させるようである。
【0045】
コンピューターによる分子モデリングは、成熟突然変異タンパク質上の突然変異F116Sが、ヘリックスDの若干の摂動をもたらすが、ショートヘリックス(E40−D44)のレベルでのABループの構造的修飾ももたらすことを示す。このショートヘリックス内に位置する42位のグルタミン酸の配向は、当該突然変異に起因して修飾される。
【0046】
F116Sの最も重要な効果は、IFNα−7構造の内側にあるフェニルアラニンのネットワークによって生じるπスタック効果が弱いことであり、これは恐らく、タンパク質構造のより高い柔軟性をもたらす。
【0047】
116位のフェニルアラニンのペプチド骨格の窒素原子と、114位のグルタミン酸のカルボニル基の酸素原子との間の水素結合は保存される。
【0048】
その結果、当該突然変異タンパク質は、天然の野生型IFNα−7タンパク質と異なる三次元の高次構造を有する。
【0049】
したがって、コンピューターによる分子モデリングは、116位のセリンの存在が、天然の野生型IFNα−7の構造及び機能の重大な修飾に関与すると推測する。
【0050】
コンピューターによる分子モデリングは、成熟突然変異タンパク質上のR121Kの突然変異が、ヘリックスDの高次構造の若干の摂動をもたらすことを示す。
【0051】
アミノ酸L118,K122,Q125及びF124の側鎖の配向は、当該突然変異によって修飾される。
【0052】
更に、IFNα−2のR121残基(IFNα−7のR120に等しい)は、インターフェロンの抗ウイルス活性にとって重要であろうことが証明されてきた(Weber H, Valenzuela D, Lujber G, Gubler M, Weissmann C.; "Single amino acid changes that render human IFN alpha 2 biologically active on mouse cells". (1987) EMBO J. 6:591-598)。
【0053】
このように、当該突然変異タンパク質は、天然の野生型IFNα−7と異なる三次元の高次構造を有する。
【0054】
したがって、コンピューターによる分子モデリングは、121位にあるリジンの存在が、天然の野生型IFNα−7タンパク質の構造及び機能の重大な修飾に関与すると推測する。
【0055】
コンピューターによる分子モデリングは、成熟突然変異タンパク質上のK159Qの突然変異が、ヘリックスEの後ろにあるループの障害をもたらし、この効果は、当該タンパク質のC末端まで続くことを示す。ヘリックスBの直前に位置するループも、Q149残基のレベルで修飾される。
【0056】
リジン159の窒素原子とスレオニン156のカルボニル基の酸素原子との間の水素架橋(C末端のループを有するヘリックスEの末端)も抑制される。
【0057】
159位にあるリジン(K)が、インターフェロンのC末端部分の抗ウイルス活性に影響を及ぼしうると考えられている(Chang NT, Kung HF, Pestka S.;"Synthesis of a human leukocyte interferon with a modified carboxy terminus in Escherichia coli." Arch. Biochem. Biophys. (1983) 221:585-589)。
【0058】
このように、当該突然変異タンパク質は、天然の野生型IFNα−7タンパク質と異なる三次元の高次構造を有する。
【0059】
したがって、コンピューターによる分子モデリングは、159位にあるグルタミンの存在が、天然の野生型IFNα−7タンパク質の構造及び機能の重大な修飾に関与すると推測する。
【0060】
本発明に従う他のSNP、すなわち、a559c,g580a,c667t,c682t,g1125a,g1161a,及びa1212gは、アミノ酸配列である配列番号2のレベルで、IFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の修飾に関与しない。
【0061】
SNP g1125a,g1161a,a1212gはサイレントであり、そしてSNP a559c,g580a,c667t,c682tは非コード領域である。
【0062】
事実、サイレントSNP g1125aは、アミノ酸配列である配列番号2上の125位にあるアミノ酸、グルタミン(Q)を修飾しない。サイレントSNP g1161aは、アミノ酸配列である配列番号2上の137位にあるアミノ酸、グルタミン酸(E)を修飾しない。同様に、サイレントSNP a1212gは、アミノ酸配列である配列番号2上の154位にあるアミノ酸、ロイシン(L)を修飾しない。
【0063】
本発明に従うポリヌクレオチドの遺伝子型判定は、個体群におけるこれらのポリヌクレオチドの対立遺伝子頻度を決定するように実施されうる。遺伝子型判定の例は、以後の実験的な項目において示す。
【0064】
本発明のポリペプチドの機能性の決定は、それらの生物学的活性の試験によって等しく実施されうる。
【0065】
これに関して、例えば、シグナル伝達、樹状細胞の成熟、CD4+又はCD8+Tリンパ球によるサイトカイン放出、単球によるサイトカイン放出、in vitro又はin vivoでの抗ウイルス活性、悪性フレンド赤白血病細胞をあらかじめ接種されたマウスにおける抗腫瘍活性、Daudi Burkitt's細胞系に対する細胞性の抗増殖活性、本発明に従うポリペプチドのTF−1細胞系に対する細胞性の抗増殖活性を測定し、そして野生型IFNα−7、又は市販品の代表として選択された野生型IFNα−2と比較することが可能である。
【0066】
本発明はまた、特に、あるヒトの障害及び/又は疾患の予防及び治療のための、本発明に従うポリヌクレオチド及びポリペプチド並びにこれらのポリヌクレオチド及びポリペプチドから出発して得られ、そして/あるいは同定された治療用分子の使用、という目的を有する。
【0067】
定義
「参照野生型遺伝子のヌクレオチド配列」とは、ヒトIFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列、配列番号1であると理解される。
【0068】
この配列は、GenBankにおいて、アクセッション番号X02960のもとアクセス可能であり、そして
- Olopade, O. I. ; Bohlander, S. K.;Pomykala, H.; Maltepe, E.; Van Melle, E.; Le Beau, M. M.; Diaz, M.O. :"Mapping of the shortest region of overlap of deletions of the short arm of chromosome 9 associated with humanneoplasia." ; Genomics 14: 437443,1992.
- Henco K, Brosius J, Fujisawa A, Fujisawa JI, Haynes JR, Hochstadt J,Kovacic T, Pasek M,Schambock A, Schmid J, et al. :"Structural relationship of human interferon alpha genes andpseudogenes." ; J Mol Biol 1985 Sep 20; 185 (2): 227-60.
- Ullrich A, Gray A, Goeddel DV, Dull TJ:"Nucleotide sequence of a portion of human chromosome 9 containing a leukocyte interferon gene cluster." ; J Mol. Biol. 1982 Apr 15 ; 156 (3): 467-86.
に記載されている。
【0069】
「天然野生型IFNα−7タンパク質」又は「野生型IFNα−7タンパク質」とは、参照野生型IFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされる成熟タンパク質であると理解される。天然野生型未成熟タンパク質IFNα−7は、配列番号2で示されるペプチド配列に相当する。
【0070】
「ポリヌクレオチド」とは、修飾型又は非修飾型DNA又はRNAであり得るポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドであると理解される。
【0071】
用語ポリヌクレオチドは、例えば一本鎖又は二本鎖DNA、1又は複数の一本鎖領域及び1又は複数の二本鎖領域の混合物から成るDNA、一本鎖又は二本鎖RNA並びに1又は複数の一本鎖領域及び1又は複数の二本鎖領域の混合物から成るRNAを含む。用語ポリヌクレオチドは、更に1又は複数の三本鎖領域を含むRNA及び/又はDNAを含むこともある。ポリヌクレオチドとは、安定性の理由又は他の理由のために修飾された骨格を有する様な方法で修飾された1又は複数の塩基を含むDNA及びRNAであると等しく理解される。修飾された塩基とは、例えば異常な塩基、例えばイノシンであると理解される。
【0072】
「ポリペプチド」とは、例えば同じペプチドの場合には通常の又は修飾されたペプチド結合によって、互いに連結した、少なくとも2つのアミノ酸を含んで成るペプチド、オリゴペプチド、オリゴマー又はタンパク質であると理解される。
【0073】
ポリペプチドは、遺伝コードによって定義される、20アミノ酸以外のアミノ酸から成ることがある。ポリペプチドはまた、当業者に周知の、天然の過程、例えば翻訳後成熟過程又は化学的過程によって修飾されたアミノ酸から成ることもある。その様な修飾は文献において完全に詳述されている。これらの修飾は、ポリペプチド、ペプチド骨格、アミノ酸鎖において、又は例えカルボキシ末端若しくはアミノ末端であっても、いずれかに出現し得る。
【0074】
ポリペプチドはユビキチン結合後に枝分かれするか、あるいは枝分かれしながら又は枝分かれせずに環状化することがある。このタイプの修飾は、当業者に周知の天然又は合成翻訳後過程の結果であり得る。
【0075】
例えば、ポリペプチドの修飾は、アセチル化、アシル化、ADPリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘムの共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、共有又は非共有架橋、還化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、システイン形成、ピログルタミン酸塩形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解過程、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セネロイル化(seneloylation)、硫酸化、アミノ酸付加、例えばアルギニル化又はユビキチン結合を含むことがある。その様な修飾は文献:PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T.E. Creighton, New York, 1993, POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C.Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983, Seifter et al.“Analysisfor protein modifications and nonprotein cofactors”, Meth. Enzymol. (1990) 182 : 626-646, and Rattan et al.“Protein Synthesis : Post-translational Modifications and Aging”, Ann NY Acad Sci (1992) 663 : 48-62、において十分に詳述されている。
【0076】
「単離されたポリヌクレオチド」又は「単離されたポリペプチド」とは、例えば上文で限定した様な、ヒトの身体から単離され、又はさもなければ技術的手法によって産生されるポリヌクレオチド又はポリペプチドであると理解される。
【0077】
「同一性」とは、ヌクレオチド又はポリペプチド配列の同一性の測定値であると理解される。
【0078】
同一性は当業者にとって周知の用語であり、そして文献に詳細に記載されている。COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M., Ed., Oxford UniversityPress, New York, 1998 ; BIOCOMPUTING INFORMATICS AND GENOME PROJECT, Smith, D.W., Ed., Academic Press, New York, 1993 ; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A.M. and Griffin H.G., Ed, Humana Press, New Jersey, 1994 ; and SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje,G., Academic Press, 1987を参照のこと。
【0079】
2つの配列間の同一性及び類似性を決定するために一般的に利用される方法も、文献において詳細に記載されている。GUIDE TO HUGE COMPUTER, Martin J. Bishop, Ed, Academic Press, San Diego, 1994, and Carillo H. and Lipton D.,Siam J Applied Math (1988) 48 : 1073を参照のこと。
【0080】
例えば、ヌクレオチド配列である配列番号1と少なくとも95%の同一性を有するポリペプチドは、前記配列と比較して、100ヌクレオチドの範囲に多くても5個所の突然変異を含むポリヌクレオチドである。
【0081】
これらの突然変異の個所は、1(又は複数)のヌクレオチドの1(又は複数)の置換、付加及び/又は欠失であってもよい。
【0082】
同様に、例えば、アミノ酸配列である配列番号2と少なくとも95%の同一性を有するポリペプチドは、前記配列と比較して、100ヌクレオチドの範囲に多くても5個所の突然変異を含むポリペプチドである。
【0083】
これらの突然変異の個所は、1(又は複数)のアミノ酸の1(又は複数)の置換、付加及び/又は欠失であってもよい。
【0084】
本発明のSNPのうち少なくとも1つを含む、ヌクレオチド配列である配列番号1又はアミノ酸配列である配列番号2とそれぞれ完全には同一ではない、本発明に従うポリヌクレオチド及びポリペプチドは、これらの配列の変異体とみなされる。
【0085】
通常、本発明に従うポリペプチドは、本発明のSNPのうち少なくとも1つを含んで成るヌクレオチド配列、配列番号1と、同一又は事実上同一の生物活性を有する。
【0086】
同様に、本発明に従うポリペプチドは通常、本発明のコードSNPのうち少なくとも1つを含んで成るアミノ酸配列、配列番号2と同一又は事実上同一の生物活性を有する。
【0087】
本発明に従う変異体は、例えば部位指定突然変異導入法又は直接合成によって得ることができる。
【0088】
「SNP」とは、ヌクレオチド配列における塩基の何らかの天然の変異であると理解される。ヌクレオチド配列のSNPは、コード、サイレント又は非コードであってもよい。
【0089】
コードSNPは、このヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列における1又は複数のアミノ酸の修飾に関与するコード配列における多型である。この場合、用語SNPは、拡大解釈すれば、アミノ酸配列中の突然変異にも適用される。
【0090】
サイレントSNPは、このヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列におけるアミノ酸の修飾に全く関与しないヌクレオチド配列のコード配列における多型である。
【0091】
非コードSNPは、ヌクレオチド配列の非コード配列における多型である。この多型は、特にイントロン、スプライシング領域、転写プロモーター又はエンハンサー部位の配列において見られる。
【0092】
「機能的SNP」とは、上文で限定した様な、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列に含まれ、そしていくつかの機能を有するSNPであると理解される。
【0093】
「機能性」とは、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの生物活性であると理解される。
【0094】
本発明に従うポリペプチド又はポリヌクレオチドの機能性は、野生型参照遺伝子のヌクレオチド配列又はこの後述するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの生物活性の保存、増大、減少又は抑制に存することもある。
【0095】
本発明に従うポリペプチド又はポリヌクレオチドの機能性は、同様に参照野生型遺伝子のヌクレオチド配列又はこの後述するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの生物活性の性質における変化から成るともいえる。
【0096】
生物活性は、特に本発明に従うポリペプチドと受容体との親和性又は親和性の不在と関連していることがある。
【0097】
ポリヌクレオチド
本発明は、
a)配列番号1の配列又はそのコード配列(ヌクレオチド751〜ヌクレオチド1320)との少なくとも80%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性、更に好ましくは少なくとも95%の同一性、そしてより更に好ましくは少なくとも99%の同一性を有するヌクレオチド配列であって、以下のコードSNP:t779c,g1033a,c1084a,g1135t,t1166c,g1181a,a1294cのうちの少なくとも1つを含んで成ると解されるヌクレオチド配列、あるいは
b)a)のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド配列を第一の目的とする。
【0098】
当然のことながら、本発明の意味において、番号付けは、ヌクレオチド配列である配列番号1のSNPの位置に相当している。
【0099】
本発明は同様に、
a)配列番号1の配列又はそのコード配列であって、それぞれが以下のコードSNP:t779c,g1033a,c1084a,g1135t,t1166c,g1181a,a1294cのうちの少なくとも1つを含んで成ると解されるもの、あるいは
b)a)のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
を含んで成る、単離されたポリヌクレオチドに関する。
【0100】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号1の配列又はそのコード配列であって、これらの配列のそれぞれが、以下のコードSNP:t779c,g1033a,c1084a,g1135t,t1166c,g1181a,a1294cのうちの少なくとも1つを含んで成ると理解されるものから成る。
【0101】
本発明によると、前文で限定したポリヌクレオチドは、t779c,g1033a,c1084a,g1135t,t1166c,g1181a,及びa1294cから成る群から選択される単一のコードSNPを含んで成る。
【0102】
更に好ましくは、前文で限定したポリヌクレオチドは、コードSNPg1033aを含んで成る。
【0103】
前文で限定したようなポリヌクレオチドは、同様に、以下の非コード及びサイレントSNP:a559c,g580a,c667t,c682t,g1125a,g1161a,及びa1212g、のうちの少なくとも1つを含むことがある。
【0104】
本発明はまた、a)ヌクレオチド配列である配列番号1又は、必要によりそのコード配列、であって、それぞれ以下の非コード又はサイレントSNP:a559c,g580a,c667t,c682t,g1125a,g1161a,及びa1212g、のうちの少なくとも1つを含んで成ると解されるもの;あるいは
b)a)のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、
を含んで成る、又はそれらから成る、単離されたポリヌクレオチドを第一の目的とする。
【0105】
当然ながら、以下のサイレントSNP g1125a,g1161a,a1212gのみがヌクレオチド配列である配列番号1のコード配列中に位置する。
【0106】
本発明はまた、a)ヌクレオチド配列である配列番号1又はそのコード配列であって、それぞれ以下のSNP:a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,a1212g,及びa1294c、のうちの少なくとも1つを含んで成ると解されるもの、あるいは
b)a)のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、
の一部から成る単離されたポリヌクレオチドであって、少なくとも10個のヌクレオチドから構成される単離されたポリヌクレオチド、に関する。
【0107】
好ましくは、上文で定義した様な単離されたポリヌクレオチドは10〜40個のヌクレオチドから構成される。
【0108】
本発明はまた、
a)ヌクレオチド配列である配列番号1の全部又は一部であって、但し、そのようなヌクレオチド配列、又は配列の一部が、a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,及びa1212gから成る群から選択される少なくとも1つのSNPを含んで成るもの、あるいは
b)a)のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、
を含んで成る、単離されたポリヌクレオチドに関する。
【0109】
上文で限定したような、単離されたヌクレオチド配列は、少なくとも10個のヌクレオチド、そして好ましくは10〜40個のヌクレオチドから構成される。
【0110】
本発明によると、前文で限定したポリヌクレオチドは、t779c,g1033a,c1084a,g1135t,t1166c,g1181a,及びa1294cから成る群から選択される単一のコードSNPを含んで成る。
【0111】
更に好ましくは、前文で限定したポリヌクレオチドは、コードSNPg1033aを含んで成る。
【0112】
本発明はまた、
a)アミノ酸配列である配列番号2;又は
b)アミノ酸配列である配列番号2の24〜189位の間に含まれるアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列、
の全部又は一部を含んで成るポリペプチドであって、
以下のコードSNP:V10A,D95N,L112I,V129L,F139S,R144K,及びK182Qのうちの少なくとも1つを含んで成るアミノ酸配列を有すると解されるもの、をコードする、単離されたポリヌクレオチドをその目的とする。
【0113】
当然ながら、本発明の意味においては、V10A,D95N,L112I,V129L,F139S,R144K,及びK182Qの位置に相当する番号付けは、アミノ酸配列である配列番号2の番号付けに相当する。
【0114】
本発明の好ましい目的よると、前文で限定したポリペプチドは、上文で限定したような単一のコードSNPを含んで成る。
【0115】
更に好ましくは、本発明に従う単離されたポリヌクレオチドは、アミノ酸配列である配列番号2の全部又は一部を含んで成り、そしてコードSNP D95Nを有するポリペプチドをコードする。
【0116】
好ましくは、本発明に従うポリヌクレオチドは、DNA又はRNA分子から構成される。
【0117】
本発明に従うポリヌクレオチドは、標準的なDNA又はRNA合成法によって得ることができる。
【0118】
本発明に従うポリヌクレオチドはまた、ヌクレオチド配列である配列番号1上の各SNPにつき変異したヌクレオチドによって野生型ヌクレオチドを修飾することによって、IFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列から出発する、部位指定突然変異導入法によって得ることができる。
【0119】
例えば、SNP g1033aを含んで成る、本発明に従うポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列である配列番号1の1033位にあるヌクレオチド、グアニンをアデニンによって修飾することによって、IFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列から出発する、部位指定突然変異導入法によって得ることができる。
【0120】
この様に実施され得る部位指定突然変異導入法の過程は当業者にとって周知であり、刊行物であるTA Kunkelの、1985年の「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」82: 488を参照のこと。
【0121】
単離されたポリヌクレオチドはまた、例えば、プレ、プロ又はプレ−プロタンパク質のアミノ酸配列又はマーカーアミノ酸配列、例えばヘキサヒスチジンペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことがある。
【0122】
本発明のポリヌクレオチドはまた、融合タンパク質又は他の精製産物を得るために、他のタンパク質又はタンパク質フラグメントをコードするヌクレオチド配列を伴うこともある。
【0123】
本発明に従うポリヌクレオチドはまた、ヌクレオチド配列、例えば5′及び/又は3′非コード配列、例えば転写又は非転写配列、翻訳又は非翻訳配列、スプライシングシグナル配列、ポリアデニル化配列、リボソーム結合配列あるいはmRNAを安定化する配列でさえも含むことがある。
【0124】
前記ヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、このヌクレオチド配列とハイブリダイズし得るものと定義される。
【0125】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、ヌクレオチド配列が少なくとも80%、好ましくは90%以上、より更に好ましくは95%以上、そして最も好ましくは97%以上の同一性を有する場合にのみハイブリダイゼーションを可能にする化学条件であると広く理解されるが必ずしもそうではない。
【0126】
ストリンジェントな条件は、当業者にとって周知な方法に従い、例えば50%ホルムアミド、5×SSC(150mMのNaCl,15mMのクエン酸三ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH=7.6)、5×デンハルト溶液、10%硫酸デキストラン及び20μgの変性サケ精子DNAを含んで成る溶液中での、42℃での前記ポリヌクレオチドのインキュベーション、続く0.1×SSC、65℃でのフィルターの洗浄によって得ることができる。
【0127】
本発明の範囲において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のみが、100%に等しい同一性を有するヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを可能にする場合、ヌクレオチド配列は、a)において記載した様なヌクレオチド配列と厳密に相補的であると考えられる。
【0128】
当然のことながら、本発明の意味において、ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチドは、本発明に従う少なくとも1つのアンチセンスSNPを含んで成る。
【0129】
従って、例えば、前記ヌクレオチド配列がSNP g1033aを含んで成る場合、その相補ヌクレオチド配列は、1033位と同等の位置にチミン(t)を含んで成る。
【0130】
SNPを含んで成るポリヌクレオチドの同定、ハイブリダイゼーション及び/又は増幅
本発明はまた、a)ヌクレオチド配列である配列番号1と80〜100%の同一性(好ましくは少なくとも90%の同一性、更に好ましくは95%の同一性、そして特に100%の同一性)を有するポリヌクレオチド、及び/又はb)少なくとも1つのSNPを含んで成る、本発明に従うポリヌクレオチド、の全部又は一部の使用であって、ヌクレオチド配列である配列番号1又は、必要によりそのコード配列(ヌクレオチド751〜ヌクレオチド1320)と80〜100%の同一性(好ましくは少なくとも90%の同一性、更に好ましくは95%の同一性、そして特に100%の同一性)を有するポリヌクレオチドの全部又は一部を同定し、ハイブリダイズし、そして/あるいは増幅するための使用であって、これらの配列のそれぞれが以下のSNP:a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,a1212g,及びa1294c、のうちの少なくとも1つを含むと解される、使用、をその目的とする。
【0131】
本発明はまた、ヌクレオチド配列である配列番号1と80〜100%の同一性を有するポリヌクレオチドの全部又は一部を同定し、あるいは増幅する方法であって、適当なハイブリダイゼーション条件下で、前記ポリヌクレオチドを本発明に従うポリヌクレオチドとハイブリダイズさせることを含んで成る方法、に関する。
【0132】
遺伝子型判定及びSNPの頻度の決定
本発明はまた:
a)ヌクレオチド配列である配列番号1と80〜100%の同一性(好ましくは少なくとも90%の同一性、更に好ましくは95%の同一性、そして特に100%の同一性)を有するポリヌクレオチド、及び/又は
b)少なくとも1つのSNPを含んで成る、本発明に従うポリヌクレオチド、
の全部又は一部の使用であって、
配列番号1又は必要によりそのコード配列(ヌクレオチド751〜ヌクレオチド1320)と80〜100%の同一性(好ましくは少なくとも90%の同一性、更に好ましくは95%の同一性、そして特に100%の同一性)を有するポリヌクレオチドの全部又は一部の遺伝子型判定のための使用であって、これらの配列のそれぞれが、以下のSNP:a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,a1212g,及びa1294c、のうちの少なくとも1つを含んで成ると解される、使用をその目的とする。
【0133】
本発明はまた、ヌクレオチド配列である配列番号1と80〜100%の同一性を有するポリヌクレオチドの全部又は一部を遺伝子型判定するための方法であって、対象者又は対象者群のゲノムDNAの注目の領域を増幅し、そして559,580,667,682,779,1033,1084,1125,1135,1161,1166,1181,及び1212から成る群から選択される、ヌクレオチド配列である配列番号1中の少なくとも1つの位置の対立遺伝子を決定する段階、を含んで成る方法に関する。
【0134】
本発明によれば、遺伝子型判定は、個体又は個体群で行われうる。
【0135】
本発明の意義の範囲内で、遺伝子型判定は個体又は個体群の遺伝子型の決定のための方法として定義される。遺伝子型は、1又は複数の特異的な遺伝子座に存在する対立遺伝子から成る。
【0136】
「個体群」とは、ランダムな方法又はランダムでない方法で選択された、個体の一群であると解される。これらの個体はヒト、動物、微生物又は植物であってもよい。
【0137】
通常、個体群は少なくとも10の個体、好ましくは100〜300の個体含んで成る。
【0138】
個体は、それらの民族性に従い、又はそれらの表現型に従い、特に以下の障害及び/又は疾患によって影響を受けるものが選択され得る:ガン腫、黒色腫、リンパ腫、白血病並びに、肝臓、首、頭及び腎臓のガン、心臓血管疾患、代謝病、例えば非免疫関連疾患、例えば肥満、感染症、特にウイルス感染、例えばB型及びC型肝炎並びにエイズ、感染性肺炎、潰瘍性大腸炎、中枢神経系の疾患、例えばアルツハイマー病、統合失調症及びうつ病、組織又は器官移植の拒絶、創傷治癒、透析されている患者の貧血、喘息、多発性硬化症、骨粗しょう症、乾癬、リウマチ様関節炎、クローン病、自己免疫疾患及び障害、胃腸疾患又は化学療法と関連した疾患。
【0139】
本発明に従う機能的SNPは、好ましくは個体群において遺伝子型判定される。
【0140】
SNPを遺伝子型判定するために実施され得る多くの方法が存在している(例えば、Kwok Pharmacogenomics, 2000, vol 1, 95-100.“High-throughput genotyping assay approaches”)。これらの技術は4つの以下の原理のうちの1つに基づいている:対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、任意にデオキシヌクレオチドの存在下でのジデオキシヌクレオチドによるオリゴヌクレオチドの伸長、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのライゲーション又は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの開裂。これらの技術のいずれか一つが、検出系、例えば直接的な又は偏光した蛍光の測定、あるいは質量分析と組み合わせられ得る。
【0141】
遺伝子型判定は、特に偏光型蛍光スキャナーと一緒に、放射性ddNTP(異なるフルオロフォアによって標識された2つの異なるddNTP)及び非放射性ddNTP(2つの異なる非標識型ddNTP)を用いたミニシークエンスによって実施され得る。偏光型蛍光の読み込みによるミニシークエンスのプロトコール(FP−TDI技術又は蛍光偏光鋳型直接ダイターミネーター取り込み(FluorescencePolarization Template-direct Dye-Terminator Incorporation))は当業者にとって周知である。
【0142】
それは、各個体のDNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅後に得られる産物で実施され得る。このPCR産物は、研究されたSNPを含むポリヌクレオチドの遺伝子領域を網羅するために選択される。PCRサーモサイクラーにおける最後の段階の後、続いて、フルオロフォア特異的励起及び放射フィルターを用いることによる標識された塩基の読み込みのために、偏光型蛍光スキャナー上にプレートが据えられる。標識された塩基の強度の値はグラフ上に記される。
【0143】
PCR増幅に関して、本発明のSNPの場合、センス及びアンチセンスプライマーはそれぞれ、1又は複数のSNPを含む注目の領域を増幅するために、本発明のSNPの位置に従い、当業者によって容易に選択され得る。
【0144】
例えば、IFNα−7のコード配列を含んで成るヌクレオチド配列のPCR増幅に使用されるプライマーに相当するセンス及びアンチセンスのヌクレオチド配列は、それぞれ:
配列番号3:センスプライマー:TACCCACCTCAGGTAGCC
配列番号4:アンチセンスプライマー:CATGAAAGTGTGAGATGATGC
であってもよい。
【0145】
これらのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列である配列番号1におけるヌクレオチド711からヌクレオチド1379の、669ヌクレオチドの長さを有するフラグメントの増幅を可能にする。
【0146】
個体群におけるSNPを含んで成る遺伝子によってコードされる各対立遺伝子の頻度(対立遺伝子頻度)の統計解析が続いて行われ、これは、異なる亜集団、そして特に、必要によりこの個体群を構成する多様な民族集団、におけるそれらの影響及びそれらの分布の重要性の決定を可能にする。
【0147】
遺伝子型判定のデータは、研究された群において観察された、異なる対立遺伝子の分布頻度を推定するために解析される。対立遺伝子頻度の計算は、ソフトウェア、例えばSAS−suite(商標)(SAS)又はSPLUS(商標)(MathSoft)を用いて実施され得る。個体群における異なる民族性の集団に及ぶ本発明のSNPの対立遺伝子分布の比較は、ソフトウェア、例えばARLEQUIN(商標)及びSAS−suite(商標)によって実施され得る。
【0148】
遺伝子マーカーとしての本発明のSNP
遺伝子の機能配列(例えばプロモーター、スプライシング部位、コード領域)を修飾するSNPは疾患の感受性又は抵抗性と直接関連すると思われるが、全てのSNP(機能的又は非機能的)がこれらの疾患の状態に関与する1又は複数の遺伝子の同定にとって価値のあるマーカーを提供することが可能であり、そしてこの結果、これらの疾患の状態と間接的に関連するであろう(Cargill et al. (1999). Nature Genetics 22 : 231-238 ; Riley et al. (2000). Phermacogenomics 1 : 39-47 ; Roberts L. (2000). Science 287 : 1898-1899を参照のこと)。
【0149】
この様に、本発明はまた、IFNα−7遺伝子のポリヌクレオチドにおける以下のSNP:a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,a1212g,及びa1294c、のうちの少なくとも1つを含んで成るデータバンクに関する。
【0150】
更に当然のことながら、前記SNPはヌクレオチド配列である配列番号1に従い番号が付けられている。
【0151】
このデータバンクは、
(i)IFNα−7遺伝子のポリヌクレオチド内の、以下のSNP:a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,a1212g,及びa1294cのうちの少なくとも1つと、
(ii)疾患又は疾患に対する抵抗性、
との間の統計学的に関連している関係を決定するために解析されうる。
【0152】
本発明はまた、疾患又は疾患に対する抵抗性のための診断/予後のキットを開発するための、IFNα−7遺伝子のポリヌクレオチドにおける以下のSNP:a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,a1212g,及びa1294cのうちの少なくとも1つの使用に関する。
【0153】
本発明のSNP、例えば上述したものは、疾患又は疾患に対する抵抗性と直接又は間接的に関連することがある。
【0154】
好ましくは、これらの疾患は上文で言及した様に定義されるものであってもよい。
【0155】
本発明はまた、IFN□−7遺伝子内の、a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,a1212g,及びa1294cから成る群から選択される少なくとも1つのSNPと、疾患又は疾患に対する抵抗性、との間の統計的に関連している関係を決定するための方法であって、
a)個体群を遺伝子型判定し、
b)前記個体群内の前記疾患又は疾患に対する抵抗性の分布を決定し、
c)遺伝子型のデータと、前記疾患又は疾患に対する抵抗性とを比較し、そして
d)前記比較を統計的に関連している関係について解析すること、
を含んで成る方法に関する。
【0156】
本発明はまた、疾患の予後又は疾患に対する抵抗性を診断し、又は決定するための方法であって、IFN□−7遺伝子内の、a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,a1212g,及びa1294cから成る群から選択される少なくとも1つのSNPを検出することを含んで成る方法に関する。
【0157】
本発明のSNPの検出は、下文に記載するような当業者に周知の方法によって実施されうる。
【0158】
本発明の少なくとも1つのSNPの検出は、研究される対象者由来の生体試料、例えば細胞、血液、尿、唾液から出発して、あるいは研究される対象者の生検又は部検から出発して実施されうる。ゲノムDNAは、例えば、直接的に又はPCR増幅後に検出に使用されうる。RNA又はcDNAも同様に使用されうる。
【0159】
その結果、対象者から単離されたポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を、本発明の少なくとも1つのSNPを含んで成るポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と比較することができる。
【0160】
上記ヌクレオチド配列の比較は、配列決定によって、DNAハイブリダイゼーション法によって、変性剤を用いる又は用いない、電気泳動ゲル上でのDNAフラグメントの移動度の差異によって、あるいは融解温度の差異によって実施されうる。Myers et al., Science (1985) 230:1242を参照のこと。正確な点での当該ヌクレオチド配列構造のそのような修飾も、ヌクレアーゼ保護試験、例えばリボヌクレアーゼ及びS1ヌクレアーゼによって、又は化学開裂剤によっても明らかとなりうる。Cotton et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1985) 85:4397-4401を参照のこと。DNAハイブリダイゼーション法と酵素消化の組み合わせも、インベーダーアッセイの場合のように使用されうる。本発明のポリヌクレオチドフラグメントを含んで成るオリゴヌクレオチドプローブも、当該スクリーニングを実施するために使用されうる。
【0161】
発現ベクター及び宿主細胞
本発明はまた、本発明に従う少なくとも1つのポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクターをその目的とする。
【0162】
多くの発現系、例えば、限定しないが染色体、エピソーム、誘導型ウイルスが使用され得る。更に具体的には、使用される組換えベクターは細菌性プラスミド、トランスポゾン、酵母のエピソーム、挿入因子、酵母染色体因子、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パピローマウイルス、例えばSV40、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、キツネポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルスから誘導されることもある。
【0163】
これらの組換えベクターはまた、コスミド又はファージミド誘導体であってもよい。ヌクレオチド配列は、当業者にとって周知な方法、例えばMOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Sambrook et al., 4th Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001に記載のものによって、組換え発現ベクター内に挿入され得る。
【0164】
組換えベクターは、ポリヌクレオチド発現の制御を調節するヌクレオチド配列並びに本発明のポリヌクレオチドの発現及び転写並びに本発明のポリペプチドの翻訳を可能にするヌクレオチド配列を含むことがあり、これらの配列は使用される宿主細胞に従い選択される。
【0165】
従って、例えば適切な分泌シグナルが前記組換えベクターに組み込まれることがあり、その結果、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、小胞体の内腔に向かって、細胞膜周辺腔に向かって、膜上に、又は細胞外環境に向かって、方向づけられるであろう。
【0166】
本発明はまた、本発明に従う組換えベクターを含んで成る宿主細胞をその目的とする。
【0167】
宿主細胞内への組換えベクターの導入は、当業者にとって周知な方法、例えばBASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davis et al., 1986及びMOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL(上記)に記載のもの、例えばリン酸カルシウムによるトランスフェクション、DEAEデキストランによるトランスフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン性脂質によるトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入又は感染、に従い実施され得る。
【0168】
宿主細胞は、細菌細胞、例えばストレプトコッカス(Streptococci)、スタフィロコッカス(Staphylococci)、E.コリ(Coli)又はバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)の細胞、真菌の細胞、例えば酵母細胞及びアスペルギルス(Aspergillus)、ストレプトマイセス(Streptomyces)の細胞、昆虫細胞、例えばショウジョウバエ S2及びスポドプテラ(Spodoptera)Sf9の細胞、動物細胞、例えばCHO,COS,HeLa,C127,BHK,HEK 293細胞及び処置すべき対象のヒト細胞であっても、又は植物細胞でもよい。
【0169】
宿主細胞は、例えば後文で明らかとなる様に、本発明のポリペプチドを発現させるために、又は医薬組成物中の活性産物として使用され得る。
【0170】
ポリペプチド
本発明はまた:
a)配列番号2のアミノ酸配列、又は
b)配列番号2のアミノ酸配列の24〜189位の間に含まれるアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列、
の全部又は一部と少なくとも80%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性、更に好ましくは少なくとも95%の同一性、そしてより更に好ましくは少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチドであって、以下のコードSNP:V10A,D95N,L112I,V129L,F139S,R144K,及びK182Qのうちの少なくとも1つを含むと解されるポリペプチド、をその目的とする。
【0171】
本発明のポリペプチドはまた:
a)配列番号2のアミノ酸配列、又は
b)配列番号2のアミノ酸配列の24〜189位の間に含まれるアミノ酸を含むアミノ酸配列、
の全部又は一部を含んで成り、前記ポリペプチドは、以下のコードSNP:V10A,D95N,L112I,V129L,F139S,R144K,K182Qのうちの少なくとも1つを含むと解される。
【0172】
本発明のポリペプチドは、更に具体的には:
a)配列番号2のアミノ酸配列、又は
b)配列番号2のアミノ酸配列の24〜189位の間に含まれるアミノ酸を含むアミノ酸配列、
の全部又は一部から成り、前記ポリペプチドは、以下のコードSNP:V10A,D95N,L112I,V129L,F139S,R144K,K182Qのうちの少なくとも1つを含むと解される。
【0173】
好ましくは、本発明に従うポリペプチドは、V10A,D95N,L112I,V129L,F139S,R144K,K182Qから成る群から選択される単一のコードSNPを含む。
【0174】
更に好ましくは、本発明に従うポリペプチドは、アミノ酸配列である配列番号2の24〜189のアミノ酸を含んで成り、且つコードSNP,D95Nを有する。
【0175】
本発明はまた、その目的のために上述のポリペプチドの調製方法を有し、ここで、上文で限定した宿主細胞が培養液中で培養され、そして前記ポリペプチドが当該培養液から単離される。
【0176】
ポリペプチドは、当業者にとって周知な方法、例えばカオトロピック剤、例えば塩、特に硫酸アンモニウム、エタノール、アセトン又はトリクロロ酢酸による沈澱、酸抽出;イオン交換クロマトグラフィー;ホスホセルロースクロマトグラフィー;疎水性相互作用クロマトグラフィー;親和性クロマトグラフィー;ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー又は排除クロマトグラフィーに従い、宿主細胞の培養液から出発して精製され得る。
【0177】
「培養液」とは、本発明のポリペプチドが単離され、又は精製される培地であると理解される。この培地は細胞外培地及び/又は細胞溶解物から構成され得る。当業者にとって周知な技術も、前記ポリペプチドの高次構造が単離又は精製の間に変化する場合に、後者のものが前記ポリペプチドの活性高次構造を生むことを可能にする。
【0178】
抗体
本発明はまた、免疫特異的抗体を得るための方法に関する。
【0179】
「抗体」とは、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、一本鎖及び/又はヒト化抗体並びにFabフラグメント、例えばFab又は免疫グロブリン発現ライブラリー産物であると理解される。
【0180】
免疫特異的抗体は、本発明に従うポリペプチドによる動物の免疫化によって得ることができる。
【0181】
本発明はまた、本発明に従うポリペプチド、例えば上文で限定したもののための免疫特異的抗体に関する。
【0182】
本発明に従うポリペプチド、そのフラグメントの1つ、類似体、その変異体の1つ又はこのポリペプチドを発現している細胞も、免疫特異的抗体を産生するために使用され得る。
【0183】
用語「免疫特異的」とは、抗体が、当業界で知られている他のポリペプチドよりも本発明のポリペプチドに対してより良い親和性を有することを意味する。
【0184】
免疫特異的抗体は、本発明のポリペプチド、そのフラグメントの1つ、類似体又はエピトープフラグメント又はこのポリペプチドを発現している細胞を、哺乳類、好ましくはヒト以外に、当業者にとって周知な方法に従い投与することによって得ることができる。
【0185】
モノクローナル抗体の調製に関して、抗体産生のための典型的な方法、例えばハイブリドーマ技術(Kohler et al., Nature (1975) 256 : 495-497)、トリオーマ技術、ヒトのB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4 : 72)及びEBVハイブリドーマ技術(Cole et al., "The EBV-hybridoma technique and its application to human lung cancer", Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (Vol. 27, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, New Series) (eds. R.A. Reisfeld and S.Sell), pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc. N.Y., 1985, pp. 77-96)が、細胞系から出発して使用され得る。
【0186】
一本鎖抗体の産生の技術、例えば米国特許第4,946,778号に記載のものも使用され得る。
【0187】
トランスジェニックな動物、例えばマウスも、ヒト化抗体を産生するのに使用され得る。
【0188】
本発明のポリペプチドと相互作用する物質
本発明はまた、試験される1又は複数の化合物の中から、本発明に従うポリペプチドの活性を活性化し、又は阻害する物質を同定するための方法であって、
a)少なくとも1つのコードSNPを含む、本発明に従うポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクターを含んで成る宿主細胞を提供し、
b)前記宿主細胞を試験される前記化合物と接触させ、
c)前記ポリペプチドの活性に対する活性又は阻害作用を決定し、それにより前記活性又は阻害物質を同定すること、
を含んで成る方法をその目的とする。
【0189】
本発明に従うポリペプチドはまた、それと相互作用する化合物をスクリーニングするために適用され得る。
【0190】
これらの化合物は、本発明に従うポリペプチドの固有の活性を活性化する物質(アゴニスト)又は阻害する物質(アンタゴニスト)であってもよい。これらの化合物はまた、本発明のポリペプチドのリガンド又は基質であってもよい。Coliganet al., Current Protocols in Immunology 1 (2), Chapter 5 (1991) を参照のこと。
【0191】
通常、その様な方法を実行するために、最初に本発明に従うポリペプチドを発現する適切な宿主細胞を生成することが望ましい。その様な細胞は、例えば哺乳類、酵母、昆虫、例えばショウジョウバエ又は細菌、例えばE.コリの細胞であってもよい。
【0192】
これらの細胞又はこれらの細胞の膜抽出物が、続いて試験され得る化合物の存在下に据えられる。
【0193】
本発明のポリペプチドとの、試験される化合物の結合能、並びに機能的応答の阻害又は活性化が続いて観察され得る。
【0194】
上述の方法の段階c)は、直接又は間接的に標識された、試験される物質を用いることによって実行され得る。それはまた、標識又は非標識物質及び標識競合物質を用いることによる競合試験を含むことがある。
【0195】
試験される物質が、検出されるシグナルに従い適切に選択された検出手段を用いることによって、本発明のポリペプチドを発現する細胞上で活性又は阻害シグナルを生じるか否かも決定され得る。
【0196】
その様な活性又は阻害物質はポリヌクレオチドであってもよく、そしてある場合にはオリゴヌクレオチド又はポリペプチド、例えばタンパク質又は抗体であってもよい。
【0197】
本発明はまた、試験される1又は複数の化合物の中から、本発明に従うポリペプチドによって増強され又は阻害される物質を同定するための方法であって:
a)少なくとも1つのコードSNPを含む、本発明に従うポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクターを含んで成る宿主細胞を提供し、
b)前記宿主細胞を試験される前記化合物と接触させ、
c)前記物質の活性に対する増強又は阻害作用を決定し、それによって前記増強又は阻害作用物質を同定すること、を含んで成る方法をその目的とする。
【0198】
本発明のポリペプチドによって増強され、又は阻害される物質は、それぞれ、このポリペプチドの存在下での活性化又は阻害によって応答する物質である。
【0199】
本発明のポリペプチドによって直接又は間接的に活性化され又は阻害される物質は、例えば膜結合型又は核受容体、キナーゼ及び更に好ましくはチロシンキナーゼ、転写因子又はポリヌクレオチドから成ることもある。
【0200】
疾患の検出
本発明はまた、対象者における、本発明に従うポリヌクレオチド及び/又は本発明に従うポリペプチドの生物学的特性を解析するための方法であって、以下の:
a)対象者のゲノムにおいて、本発明に従うポリヌクレオチドの有無を決定し、
b)対象者における、本発明に従うポリヌクレオチドの発現レベルを決定し、
c)対象者における、本発明に従うポリペプチドの有無を決定し、
d)対象者における、本発明に従うポリペプチドの濃度を決定し、そして/あるいは
e)対象者における、本発明に従うポリペプチドの機能性を決定すること、のうちの少なくとも1つを含んで成る方法をその目的とする。
【0201】
これらの生物学的特性は、対象者において、又は対象者由来の試料において解析され得る。
【0202】
これらの生物学的特性は、遺伝子診断を実施し、そして対象者が本発明に従うポリヌクレオチド及び/又は本発明に従うポリペプチドの存在と関連している疾患、軽い疾病又は障害の発生に対して影響を受けているか、又は影響を受ける危険性があるか、又は反対に、それに対する部分的な耐性があるか否かを決定することを可能にし得る。
【0203】
これらの疾患は、障害及び/又はヒトの疾患、例えばガン及び腫瘍、感染病、性病、免疫関連疾患及び/又は自己免疫疾患及び障害、心臓血管疾患、代謝病、中枢神経系の疾患、並びに化学療法に関連する障害、であってもよい。
【0204】
前記ガン及び腫瘍は、転移型腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、首、頭及び腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド性腫瘍及び免疫欠損後に出現する腫瘍であってエイズの場合にはカポジ肉腫を含んで成るもの、を含む。
【0205】
前記感染病は、慢性B型及びC型肝炎並びにHIV/エイズを含んで成るウイルス感染、感染性肺炎、及び性病、例えば生殖器疣、を含む。
【0206】
前記免疫関連疾患及び自己免疫疾患は、組織又は器官の移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含むことがある。
【0207】
前記代謝病は、肥満のような非免疫関連疾患を含むことがある。
【0208】
前記の中枢神経系の疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含むことがある。
【0209】
前記疾患及び障害はまた、創傷治癒、透析患者の貧血、及び骨粗鬆症を含むことがある。
【0210】
この方法はまた、対象者において、本発明に従うSNPによってコードされる変異対立遺伝子の存在と関連している疾患又は疾患に対する抵抗性の遺伝子診断を可能にする。
【0211】
好ましくは、段階a)において、既に限定した様な、少なくとも1つのコードSNPを含むポリヌクレオチドの有無が検出され得る。
【0212】
ポリヌクレオチドの検出は、研究され得る対象者由来の生物学的試料、例えば細胞、血液、尿、唾液から出発して、あるいは研究され得る対象者の生検又は部検から出発して実施され得る。ゲノムDNAは、例えば直接的に又はPCR増幅後に使用され得る。RNA又はcDNAも同様に使用され得る。
【0213】
この結果、本発明に従うポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を、対象者のゲノムにおいて検出されるヌクレオチド配列と比較することが可能となる。
【0214】
ヌクレオチド配列の比較は、配列決定によって、DNAハイブリダイゼーション法によって、変性剤を用いる、又は用いない、電気泳動ゲノム上でのDNAフラグメントの移動度の差異によって、あるいは融解温度の差異によって実施され得る。Myers et al., Science (1985) 230 : 1242 を参照のこと。ヌクレオチド配列の構造における正確な位置でのその様な修飾も、ヌクレアーゼ保護試験によって、例えばリボヌクレアーゼ及びS1ヌクレアーゼによって、又は更に化学開裂剤によって解明されることがある。Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 85 : 4397-4401 を参照のこと。本発明のポリヌクレオチドフラグメントを含んで成るオリゴヌクレオチドプローブはまた、スクリーニングを行うのにも使用され得る。
【0215】
当業者にとって周知の多くの方法が、本発明のポリヌクレオチドの発現を決定し、そしてこのポリヌクレオチドの遺伝的変異性を同定するために使用され得る(Chee et al., Science (1996), vol.274, pp610-613 を参照のこと。)
【0216】
段階b)において、ポリヌクレオチドの発現レベルは、当業者にとって周知な方法に従い、このポリヌクレオチドによってコードされる(そしてポリペプチドをコードする)RNAのレベルを定量することによって、例えばPCR、RT−PCR、リボヌクレアーゼ保護、ノーザンブロット、及び他のハイブリダイゼーション法によって、測定され得る。
【0217】
段階c)及びd)において、対象者又は対象者由来の試料における、本発明に従うポリペプチドの有無及び濃度が、周知の方法、例えば免疫放射アッセイ、競合的結合試験、ウェスタンブロット及びELISA試験によって実施され得る。
【0218】
段階d)に続いて、本発明に従うポリペプチドの決定された濃度は、対象者において通常見出される天然野生型タンパク質の濃度と比較され得る。
【0219】
当業者は、上文の様に起こる疾患、軽い疾病又は障害に対する感受性又は、反対に抵抗性が現れる、しきい値の上限又は下限を、従来技術の刊行物又は常用の試験若しくはアッセイ、例えば既に言及されているものの助けを借りて同定することができる。
【0220】
段階e)において、本発明に従うポリペプチドの機能の決定は、当業者にとって周知な方法によって、例えばin vitroでの試験、例えば上文で言及したものによって、又は前記ポリペプチドを発現する宿主細胞の使用によって実施され得る。
【0221】
本発明はまた、1又は複数の:本発明に従う、単離されたポリヌクレオチド;上文で限定した組換えベクター;上文で限定した宿主細胞;本発明に従うポリペプチド;上文で限定した抗体、を含んで成る診断キットをその目的とする。
【0222】
薬物及び疾患の処置
本発明は、活性物質の目的で、本発明に従うポリペプチドを含む治療化合物をその目的とする。
【0223】
本発明はまた、異なるヒトの障害及び/又は疾患の予防又は処置のための治療用化合物の製造のための、本発明に従うポリペプチドの使用にも関する。これらの疾患は、障害及び/又はヒトの疾患、例えばガン及び腫瘍、感染病、性病、免疫関連疾患及び/又は自己免疫疾患及び障害、心臓血管疾患、代謝病、中枢神経系の疾患、並びに化学療法に関連する障害、であってもよい。
【0224】
前記ガン及び腫瘍は、転移型腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、首、頭及び腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド性腫瘍及び免疫欠損後に出現する腫瘍であってエイズの場合にはカポジ肉腫を含んで成るもの、を含む。
【0225】
前記感染病は、慢性B型及びC型肝炎並びにHIV/エイズを含んで成るウイルス感染、感染性肺炎、及び性病、例えば生殖器疣、を含む。
【0226】
前記免疫関連疾患及び自己免疫疾患は、組織又は器官の移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含むことがある。
【0227】
前記代謝病は、肥満のような非免疫関連疾患を含むことがある。
【0228】
前記の中枢神経系の疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含むことがある。
【0229】
前記疾患及び障害はまた、創傷治癒、透析患者の貧血、及び骨粗鬆症を含むことがある。
【0230】
好ましくは、本発明に従うポリペプチドはまた、異なるヒトの障害及び/又は疾患、例えば、あるウイルス感染、例えば慢性B型及びC型肝炎、白血病、例えばヘアリー細胞白血病及び慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、カルチノイド性腫瘍、悪性黒色腫、転移型腎ガン、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫欠損後に出現する腫瘍、例えばエイズの場合にはカポジ肉腫、並びに生殖器疣又は性病、の予防又は処置を目的とする治療化合物の製造に使用されうる。
【0231】
本発明に従うポリペプチドを得ることを可能にする化合物及びこのポリペプチドによって得られ、又はこれから同定される化合物のいくつかは、同様にヒトの身体の治療的処置のために、すなわち治療化合物として使用され得る。
【0232】
このことが、本発明が更に活性物質の目的で少なくとも1つの上文で限定したコードSNP、上文で限定した組換えベクター、上文で限定した宿主細胞、及び/又は上文で限定した抗体を含む、本発明に従うポリヌクレオチドを含む薬物を目的とする理由である。
【0233】
本発明はまた、異なるヒトの障害及び/又は疾患の予防又は処置を目的とする薬物の製造のための、少なくとも1つの上文で限定したコードSNP、上文で限定した組換えベクター、上文で限定した宿主細胞、及び/又は上文で限定した抗体を含む、本発明に従うポリヌクレオチドの使用にも関する。これらの疾患は、障害及び/又はヒトの疾患、例えばガン及び腫瘍、感染病、性病、免疫関連疾患及び/又は自己免疫疾患及び障害、心臓血管疾患、代謝病、中枢神経系の疾患、並びに化学療法に関連する障害、であってもよい。
【0234】
前記ガン及び腫瘍は、転移型腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、首、頭及び腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド性腫瘍及び免疫欠損後に出現する腫瘍であってエイズの場合にはカポジ肉腫を含んで成るもの、を含む。
【0235】
前記感染病は、慢性B型及びC型肝炎並びにHIV/エイズを含んで成るウイルス感染、感染性肺炎、及び性病、例えば生殖器疣、を含む。
【0236】
前記免疫関連疾患及び自己免疫疾患は、組織又は器官の移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含むことがある。
【0237】
前記代謝病は、肥満のような非免疫関連疾患を含むことがある。
【0238】
前記の中枢神経系の疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含むことがある。
【0239】
前記疾患及び障害はまた、創傷治癒、透析患者の貧血、及び骨粗鬆症を含むことがある。
【0240】
好ましくは、本発明は、異なるヒトの障害及び/又は疾患の予防又は処置を目的とする薬物の製造のための、少なくとも1つの上文で限定したコードSNP、上文で限定した組換えベクター、上文で限定した宿主細胞、及び/又は上文で限定した抗体を含む、本発明に従うポリヌクレオチドの使用であって、異なるヒトの障害及び/又は疾患、例えば、あるウイルス感染、例えば慢性B型及びC型肝炎、白血病、例えばヘアリー細胞白血病及び慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、カルチノイド性腫瘍、悪性黒色腫、転移型腎ガン、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫欠損後に出現する腫瘍、例えばエイズの場合にはカポジ肉腫、並びに生殖器疣又は性病、の予防又は処置を目的とする薬物の製造のための使用に関する。
【0241】
活性物質として有用な、本発明のポリペプチド及び他の化合物の用量は、化合物の選択、治療の兆候、投与形態、製剤の性質、対象者の性質及び医師の判断に依存する。
【0242】
それを活性物質として使用する場合、本発明に従うポリペプチドは、通常1〜100μg/対象者のkgに及ぶ用量で投与される。
【0243】
本発明はまた、活性物質として、少なくとも1つの上記化合物、例えば本発明に従うポリペプチド、少なくとも1つの上文で限定したSNPを含む本発明に従うポリヌクレオチド、上文で限定した組換えベクター、上文で限定した宿主細胞、及び/又は上文で限定した抗体、並びに医薬として許容される賦形剤を含む医薬組成物を目的とする。
【0244】
これらの医薬組成物において、前記活性物質は生理学的に有効な量で有利に存在する。
【0245】
これらの医薬組成物は、例えば固体又は液体であってもよく、そしてヒトの薬物において現在使用されている医薬形態で、例えば単純な又はコートされた錠剤、ゲルキャップ、顆粒、キャラメル、座剤並びに好ましくは注射用調製物及び注射用調製物のための粉末で存在していてもよい。これらの医薬の形態は有用な方法に従い調製され得る。
【0246】
前記活性物質は、医薬組成物において通常適用される賦形剤、例えばタルク、アラビアゴム、ラクトース、デンプン、デキストロース、グリセロール、エタノール、ステアリン酸マグネシウム、カカオバター、水性又は非水性担体、動物又は植物起源の脂肪物質、パラフィン誘導体、グリコール、種々の湿潤剤、分散剤又は乳化剤、防腐剤に組み込まれることもある。
【0247】
本発明に従う活性物質は、単独で、又は他の化合物、例えば治療化合物、例えば他のインターフェロン−α若しくは他のサイトカイン、例えばインターロイキンと組み合わせて適用され得る。
【0248】
前記医薬組成物の異なる製剤は、投与の形態に従い適合される。
【0249】
前記医薬組成物は、当業者にとって既知の異なる投与経路によって投与され得る。
【0250】
本発明はまた、個体における、ガン及び腫瘍、感染病、免疫関連疾患及び/又は自己免疫疾患及び障害、心臓血管疾患、代謝病、中枢神経系の疾患、並びに化学療法の処置に関連する障害、から成る群から選択される疾患を予防し、又は処置する方法であって、前記個体に対し、治療として有効な量の上文で限定した物質、及び医薬として許容される賦形剤を投与することを含んで成る方法、に関する。
【0251】
本発明はまた、活性物質として、少なくとも1つの上記化合物、例えば本発明に従うポリペプチド、本発明に従うポリヌクレオチドの全部又は一部、上文で限定した組換えベクター、上文で限定した宿主細胞、及び/又は上文で限定した抗体、並びに適当な医薬として許容される賦形剤を含む診断組成物を目的とする。
【0252】
この診断組成物は、例えば適当な賦形剤、例えば診断組成物において一般に使用されているもの、例えば緩衝液及び防腐剤を含むことがある。
【0253】
本発明はまた:
a)治療として有効な量の本発明に従うポリペプチド、及び/又は
b)本発明に従うポリヌクレオチド、及び/又は
c)上文で限定した、処置される対象者由来の宿主細胞、
の使用であって、対象者における、本発明に従うポリペプチドの発現又は活性を増大せしめることを目的とする治療用化合物を調製するための使用を目的とする。
【0254】
この様に、本発明のポリペプチドの発現又は活性の増大を必要とする対象者を処置するために、複数の方法が可能である。
【0255】
前記対象者に、治療として有効な量の本発明に従うポリペプチドを、医薬として許容される賦形剤と一緒に投与することは可能である。
【0256】
同様に、前記対象者に対する、本発明に従うポリヌクレオチドの投与によって、本発明のポリペプチドの内因性の産生を増大せしめることが可能である。例えば、そのポリヌクレオチドはレトロウイルス発現ベクター内に挿入され得る。その様なベクターは、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含むレトロウイルスプラスミドベクターに感染した細胞から出発して、形質導入された細胞が注目の遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する様な方法で単離され得る。Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, Chapter 20, in Human Molecular Genetics, Strachan and Read, BIOS Scientifics Publishers Ltd (1996)を参照のこと。
【0257】
本発明に従い、少なくとも1つのコードSNP、例えば上文で限定したものを含むポリヌクレオチドが好ましくは使用される。
【0258】
更に、対象者に対して、その者に属する宿主細胞であって、あらかじめ採取され、そして既に記載した様に本発明のポリペプチドを発現する様に修飾された宿主細胞を投与することが可能である。
【0259】
本発明はまた:
a)治療として有効な量の、上文で限定した免疫特異的抗体、及び/又は
b)本発明に従うポリヌクレオチドの発現の阻害を可能にするポリヌクレオチド、
の使用であって、対象者における、本発明に従うポリペプチドの発現又は活性を低下せしめることを目的とする薬物の調製のための使用に関する。
【0260】
この様に、前記対象者に対して、治療として有効な量の阻害剤及び/又は抗体、例えば上文で限定したものを、好ましくは医薬として許容される賦形剤と組み合わせて投与することが可能である。
【0261】
また、前記対象者に対して、本発明のポリヌクレオチドの発現の阻害を可能にする、本発明に従う相補的なポリヌクレオチドの投与によって、本発明のポリペプチドの内因性の産生を減少させることも可能である。
【0262】
好ましくは、少なくとも1つのコードSNP、例えば上文で限定したものを含む相補的なポリヌクレオチドが使用され得る。
【0263】
本発明はまた、対象者において、本発明に従うポリペプチドの活性を増大又は低下させるための方法であって、治療的に有効な量の:a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,a1212g,及びa1294cから成る群から選択される少なくとも1つのSNPを含んで成るヌクレオチド配列である配列番号1、又は前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、の全部又は一部を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド;前記ポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクター;前記組換えベクターを含んで成る宿主細胞であって、処置される前記対象者から得られうる宿主細胞;アミノ酸配列である配列番号2の全部又は一部を含んで成り、且つV10A,D95N,L112I,V129L,F139S,R144K,及びK182Qから成る群から選択される少なくとも1つのコードSNPを有する、単離されたポリペプチド;前記ポリペプチドに特異的な抗体;及び医薬として許容される賦形剤、を投与することを含んで成る方法に関する。
【0264】
本発明はまた、ヌクレオチド配列である配列番号1であって、但し、以下のSNP:a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,a1212g,及びa1294cのうちの1つを含んで成るヌクレオチド配列と、少なくとも95%の同一性(好ましくは97%の同一性、更に好ましくは99%の同一性及び特に100%の同一性)を有するヌクレオチド配列の、個体のゲノムにおける存在と関連しているIFNα−7変異体によって生じる障害又は疾患を有する前記患者の予防又は処置のための薬物の調製のためのIFNα−7タンパク質の使用に関する。
【0265】
好ましくは、前記薬物は、ガン及び腫瘍、感染病、性病、免疫関連疾患及び/又は自己免疫疾患及び障害、心臓血管疾患、代謝病、中枢神経系の疾患、並びに化学療法に関連する障害、から成る群から選択される疾患の予防又は処置のために使用される。
【0266】
前記ガン及び腫瘍は、転移型腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、首、頭及び腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド性腫瘍及び免疫欠損後に出現する腫瘍であってエイズの場合にはカポジ肉腫を含んで成るもの、を含む。
【0267】
前記感染病は、慢性B型及びC型肝炎並びにHIV/エイズを含んで成るウイルス感染、感染性肺炎、及び性病、例えば生殖器疣、を含む。
【0268】
前記免疫関連疾患及び自己免疫疾患は、組織又は器官の移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含むことがある。
【0269】
前記代謝病は、肥満のような非免疫関連疾患を含むことがある。
【0270】
前記の中枢神経系の疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含むことがある。
【0271】
前記疾患及び障害はまた、創傷治癒、透析患者の貧血、及び骨粗鬆症を含むことがある。
【0272】
本発明はまた、個体において、本発明に従うポリヌクレオチドの前記個体のゲノムの存在に関連する障害又は疾患を予防又は処置するための方法であって、治療的に有効な量の1又は複数の:ヌクレオチド配列である配列番号1の全部又は一部を含んで成り、且つa559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,a1212g,及びa1294cから成る群から選択される少なくとも1つのSNPを有する、単離されたポリヌクレオチド、あるいは前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列の全部又は一部を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド;前記ポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクター;前記組換えベクターを含んで成る宿主細胞;アミノ酸配列である配列番号2の全部又は一部を含んで成り、且つV10A,D95N,L112I,V129L,F139S,R144K,及びK182Qから成る群から選択される少なくとも1つのコードSNPを有する、単離されたポリペプチド;前記ポリペプチドに特異的な抗体;及び医薬として許容される賦形剤、を投与することを含んで成る方法に関する。
【0273】
本発明のSNP D95Nを含んで成るIFNα−7ポリペプチドのミメティック化合物
本発明はまた、
a)アミノ酸配列である配列番号2、又は
b)アミノ酸配列である配列番号2の24〜189位の間に含まれるアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列、
のポリペプチドであって、但し、a)及びb)の前記アミノ酸配列がSNP D95Nを含んで成るポリペプチド、と実質的に同程度の生物活性を有する新規化合物に関する。
【0274】
前記生物活性は、例えば、下文の実験の項目に記載のように、シグナル伝達、樹状細胞の成熟、CD4+又はCD8+Tリンパ球によるサイトカイン放出、単球によるサイトカイン放出、in vitro又はin vivoでの抗ウイルス活性、悪性フレンド赤白血病細胞をあらかじめ接種されたマウスにおける抗腫瘍活性、Daudi Burkitt's細胞系に対する細胞性の抗増殖活性、TF−1細胞系に対する細胞性の抗増殖活性を測定することによって評価されうる。
【0275】
実験の項目で言及するように、D95N突然変異IFNα−7は、
−樹状細胞の成熟を刺激するのが弱い能力
−SEB抗原によってあらかじめ活性化された、CD4+Tリンパ球及びCD8+Tリンパ球によってサイトカインの放出(IFNガンマ及びIL−10)を刺激するのが高い能力
−Daudi細胞の増殖を阻害する能力
−TF−1細胞に対する弱い抗増殖活性
−VSVに感染した細胞培養液中でのin vivoでの高い抗ウイルス活性
−EMCVに感染したマウスにおけるin vivoでの抗ウイルス活性
−FCL接種マウスにおける抗腫瘍活性、
を示す。
【0276】
また、実験の項目において言及するように、野生型のIFNα−2と比較して、D95N突然変異IFNα−7タンパク質は:
−シグナル伝達を同程度活性化する能力
−樹状細胞の成熟を刺激することがより低い能力
−SEB抗原によってあらかじめ活性化された、CD4+Tリンパ球及びCD8+Tリンパ球によってIFNガンマの放出を刺激することがより高い能力
−単球によってIL−10及びTNF−αを刺激することがより高い能力
−TF−1細胞に対する同程度の抗増殖活性
−VSVに感染した細胞培養液中でのin vitroでのより低い抗ウイルス活性
−EMCVに感染したマウスにおけるin vivoでのより高い抗ウイルス活性
−FCL接種マウスにおける若干低い抗腫瘍活性、
を有する。
【0277】
また、実験の項目において言及するように、野生型のIFNα−7と比較して、D95N突然変異IFNα−7タンパク質は:
−シグナル伝達を活性化する同程度の能力
−Daudi細胞の成熟を刺激することが若干高い能力
を有する。
【0278】
上文で限定したような本発明の新規化合物は、D95N突然変異IFNα−7のものと実質的に同程度の生物活性を有することがある。
【0279】
前記化合物はまた、Tリンパ球によるIFN−ガンマの放出、単球によるIL−10及びTNF−αの放出、EMCVに感染したマウスにおけるin vivoでの抗ウイルス活性、及び/又はFLC接種マウスにおける抗腫瘍活性のような生物活性を有することがあり、これらはD95N突然変異IFNα−7のものよりもはるかに高い。
【0280】
前記化合物はまた、樹状細胞の成熟のような生物活性を有することがあり、これはD95N突然変異IFNα−7のものよりもはるかに低い。
【0281】
前記化合物は、例えばポリペプチド又はペプチドのような生化学的化合物、又は、例えば合成ペプチドミメティックのような有機化学的化合物、であってもよい。
【0282】
本発明はまた、上文で定義した様な化合物の同定のための、D95N SNPを含む本発明のポリペプチドの使用に関する。
【0283】
本発明は、本発明の化合物の同定のための方法であって、以下の段階:
a)試験される化合物の生物活性、例えば、下文の実験の項目に記載のように、シグナル伝達、樹状細胞の成熟、CD4+又はCD8+Tリンパ球によるサイトカイン放出、単球によるサイトカイン放出、in vitro又はin vivoでの抗ウイルス活性、悪性フレンド赤白血病細胞をあらかじめ接種されたマウスにおける抗腫瘍活性、Daudi Burkitt's細胞系に対する細胞性の抗増殖活性、本発明に従うポリペプチドのTF−1細胞系に対する細胞性の抗増殖活性を決定し;
b)i)試験される化合物の、段階a)で決定した活性と、
ii)アミノ酸配列である配列番号2のポリペプチド、又はアミノ酸配列である配列番号2の24から189位の間に含まれるアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列のポリペプチド、であって、但し、アミノ酸配列がD95N SNPを含んで成るものの活性、
とを比較し;そして
c)段階b)で実施した比較に基づき、試験される化合物が、アミノ酸配列である配列番号2のポリペプチド、又はアミノ酸配列である配列番号2の24から189位の間に含まれるアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列のポリペプチド、であって、但し、前記アミノ酸配列がD95N SNPを含んで成るポリペプチドと比較して実質的に類似又はそれより低い活性を有するか否かを決定すること、を含んで成る方法に関する。
【0284】
好ましくは、試験される化合物は、合成ペプチドコンビナトリアルライブラリー、高処理量スクリーニングから既に同定されていることがあり、又はコンピューターを使ったドラッグデザインによって設計された結果、アミノ酸配列である配列番号2のポリペプチド、又はアミノ酸配列である配列番号2の24から189位の間に含まれるアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列のポリペプチド、であって、但し、アミノ酸配列がD95N SNPを含んで成るポリペプチドと同一の三次元構造及び/又は化学作用を有することがある。
【0285】
化合物を同定し、そして設計するための方法は、当業者に周知である。
【0286】
これらの方法を引用している刊行物は、例えば:
- Silverman R.B. (1992).“Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action”. Academic Press, 1st edition (January 15, 1992).
- Anderson S and Chiplin J. (2002).“Structural genomics ; shaping the future of drug design? Drug Discov. Today. 7 (2) : 105-107.
- Selick HE, Beresford AP, Tarbit MH. (2002).“The emerging importance of predictive ADME simulation in drug discovery”. Drug Discov. Today.7 (2) : 109-116.
- Burbidge R, Trotter M, Buxton B, Holden S. (2001).“Drug design bymachine learning : support vector machines for pharmaceutical data analysis”. Comput. Chem. 26 (1) : 5-14.
- Kauvar L.M. (1996).“Peptide mimetic drugs : a comment on progressand prospects”14 (6) : 709、であってもよい。
【0287】
本発明の化合物は、ガン及び腫瘍、感染病、性病、免疫関連疾患及び/又は自己免疫疾患及び障害、心臓血管疾患、代謝病、中枢神経系の疾患、並びに化学療法に関連する障害、から成る群から選択される疾患のうちの1つの予防又は処置を目的とする薬物の調製に使用されうる。
【0288】
前記ガン及び腫瘍は、転移型腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、首、頭及び腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド性腫瘍及び免疫欠損後に出現する腫瘍であってエイズの場合にはカポジ肉腫を含んで成るもの、を含む。
【0289】
前記感染病は、慢性B型及びC型肝炎並びにHIV/エイズを含んで成るウイルス感染、感染性肺炎、及び性病、例えば生殖器疣、を含む。
【0290】
前記免疫関連疾患及び自己免疫疾患は、組織又は器官の移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含むことがある。
【0291】
前記代謝病は、肥満のような非免疫関連疾患を含むことがある。
【0292】
前記の中枢神経系の疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含むことがある。
【0293】
前記疾患及び障害はまた、創傷治癒、透析患者の貧血、及び骨粗鬆症を含むことがある。
【0294】
好ましくは、本発明は、異なるヒトの障害及び/又は疾患、例えば、あるウイルス感染、例えば慢性B型及びC型肝炎、白血病、例えばヘアリー細胞白血病及び慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、カルチノイド性腫瘍、悪性黒色腫、転移型腎ガン、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫欠損後に出現する腫瘍、例えばエイズの場合にはカポジ肉腫、並びに生殖器疣又は性病、から成る群から選択される疾患のうちの1つの予防又は処置を目的とする薬物の調製に使用されうる。
【実施例】
【0295】
実験の項目
実施例1:g1023a,t1166c,g1181 a ,又はa1294cのSNPを含 むヌクレオチド配列のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質及び野生型参照遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質のモデリング
最初の段階において、IFNα−7の三次元構造は、ソフトウェアModeler(MSI, San Diego, CA)を用いてPDBデータベース(コード1ITF)において利用可能な構造を有するヒトIFNα−2のものから出発して構築した。
【0296】
続いて、成熟ポリペプチドフラグメントが、突然変異D72N,F116S,R121K,K159Qを再現する様な方法で修飾される。
【0297】
1000回の分子最小化段階が、プログラムAMBER及びDISCOVER(MSI:Molecular Simulations Inc. )を用いることによってこの変異型フラグメントに対して行われた。
【0298】
次に、2回の分子力学計算の実行が同じプログラム及び同じ力場で行われた。
【0299】
それぞれの場合において、50,000回の段階が300°Kで計算され、300回の平衡段階によって終了した。
【0300】
このモデリングの結果を図1、2、3及び4に表す。
【0301】
例2:個体群における t 779 c , g 1033 a , c 1084 a , g 1135 t , t 1166 c , g 1181 a ,又は a 1294 c のSNPの遺伝子判定
SNPの遺伝子型判定は、生成物が偏光した蛍光を読み込むことによって検出される、ミニシークエンスの原理に基づいている。当該技術は蛍光ミニシークエンス(FP−TDI技術又はFluorescence Polarization Template-direct Dye-Terminator Incorporation)から成る。
【0302】
ミニシークエンスは、前記群の各個体のゲノムDNAからPCRによって増幅された生成物で行われる。PCR生成物は、それが遺伝子型判定され得るSNPを含む遺伝子領域を覆う様な方法で選択される。使用されなかったPCRプライマー及び組み込まれなかったdNTPの排除後、ミニシークエンスは行われる。
【0303】
ミニシークエンスは、ポリメラーゼ酵素及び蛍光標識したジデオキシヌクレオチドを用いることによって、SNPの部位のすぐ上流に配置されたポリヌクレオチドプライマーを伸長することから成る。この伸長過程から生じた生成物は、偏光した蛍光を読み込むことによって直接解析される。
【0304】
全てのこれらの段階、及び読み込みが同一のPCRプレートにおいて行われる。
【0305】
この様に、遺伝子型判定は5つの段階:
1)PCRによる増幅
2)酵素消化によるPCR生成物の精製
3)オリゴヌクレオチドプライマーの伸長
4)偏光した蛍光の読み込み
5)読み込みの解釈
を必要とする。
【0306】
遺伝子型判定の段階1及び2は、t779c,g1033a,c1084a,g1135t,t1166c,g1181a,又はa1294cのSNPのそれぞれについては同一の条件で実施される。段階3、4及び5は、これらの多型のそれぞれに特異的である。
【0307】
1)IFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列のPCR増幅は、民族的に異なる起源の268人の個体に由来するゲノムDNAから出発して行われる。
【0308】
これらのゲノムDNAは、米国のCoriell Insfitueによって提供された。
【0309】
268人の個体は以下の様に分布される:
【表1】
【0310】
これらの個体のそれぞれ1つに由来するゲノムDNAが試料を構成する。
【0311】
全てのSNPについて、PCR増幅が以下のプライマー:
配列番号3:センスプライマー:TACCCACCTCAGGTAGCC
配列番号4:アンチセンスプライマー:CATGAAAGTGTGAGATGATGC
から出発して実施される。
【0312】
これらのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列である配列番号1の、ヌクレオチド711からヌクレオチド1379の、669個のヌクレオチドを有するフラグメントの増幅を可能にする。
【0313】
それぞれのSNPについて、PCR生成物はミニシークエンスのための鋳型を果たすであろう。
【0314】
当該PCR反応の合計の反応液量は各試料当たり5μlである。
【0315】
この反応液量は、以下の表に示す試薬から構成される:
【表2】
【0316】
これらの試薬は、ABGeneによって供給される、384個のウェルを有するブラックPCRプレート(参照:TF−0384−K)に配分される。当該プレートはシーリングされ、遠心され、続いて384ウェルプレート用のサーモサイクラー(MJ ResearchのTetrad)内に据えられ、そして以下のインキュベーションを受ける:PCRサイクル:94℃で1分、これに3段階(94℃で15秒、56℃で30秒、68℃で1分)から成る36サイクルが続く。
【0317】
2)PCR増幅生成物は、続いて2つの酵素:シュリンプアルカリホスファターゼ(SAP)及びエキソヌクレアーゼI(ExoI)を用いて精製される。これらの最初の酵素は、PCR増幅の間に組み込まれなかったdNTPの脱リン酸化を可能にし、一方、2番目のものは一本鎖DNA残基、特にPCRの間に使用されなかったプライマーを除去する。
【0318】
この消化は、PCRプレートの各ウェルにおける、試料当たり5μlの反応混合物の添加によって行われる。この反応混合物は以下の試薬から構成される:
【表3】
【0319】
充填したら、プレートをシーリングし、遠心し、続いて384ウェルプレート用のサーモサイクラー(MJ ResearchのTetrad)内に据え、そして以下のインキュベーションを受ける:SAP−EXO消化:37℃で45分、80℃で15分。
【0320】
続いて、伸長又はミニシークエンス段階が、調製した試料当たり5μlの反応混合物の添加によって消化されたPCR生成物で行われる。
【0321】
ミニシークエンス3)及び読み込み段階4)及び読み込みの解釈5)は、t779c,g1033a,c1084a,g1135t,t1166c,g1181a,及びa1294cに特異的である。
【0322】
全てのこれらの段階は、これらの多型のうちのそれぞれ1つに使用される具体的な条件をまとめて後文に記載する。
【0323】
3)ミニシークエンス
遺伝子型判定に必要な2つのミニシークエンスプライマーの配列は、本発明に従うSNPの部位の上流に位置するヌクレオチドの配列に相当する方法で判定した。SNPを含むPCR生成物が二本鎖DNA生成物であるので、遺伝子型判定はセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかで行われ得る。選択したプライマーはLifeTechnologies Inc.によって製造される。
【0324】
次の表は、各SNPについての、試験したミニシークエンスプライマーの配列及び遺伝子型判定のために保持される最適条件を示す。
【表4】
【0325】
SNPのミニシークエンスは、最初に16個の試料全てで確認され、続いて268人の個体及び10人のコントロールから構成される個体群の集合全てを遺伝子型判定した。
【0326】
次に、伸長又はミニシークエンス段階が次の表に示す様に行われる。
【表5】
1 5×伸長緩衝液は、250mM Tris−HCl pH9,250mM KCl,25mM NaCl,10mM MgCl2 及び40%グリセロールから構成される。
2 ddNTPに関して、4塩基の混合物が研究される多型に従い実施される。SNPを構成する注目の2塩基(野生型ヌクレオチド/変異型ヌクレオチド)のみが、例えばTamra又はR110のいずれかで標識される。例えば、SNP g1033aの場合、ddNTPの混合物は
−2.5μMの非標識ddATP、
−2.5μMの非標識ddGTP、
−2.5μMのddTTP(1.875μMの非標識ddTTP及び0.625μMのTamra標識型ddTTP)、
−2.5μMのddCTP(1.875μMの非標識ddCTP及び0.625μMのR110標識ddCTP)、
から構成される。
【0327】
充填したら、プレートはシーリングされ、遠心され、続いて384ウェルプレート用のサーモサイクラー(MJ ResearchのTetrad)に据えられ、そして次のインキュベーションを受ける:伸長サイクル:93℃で1分、これに2段階(93℃で10秒、55℃で30秒)から構成される35サイクルを続ける。
【0328】
サーモサイクラーにおける最後の段階の後、LJL Biosystems Inc. のAralyst(商標)型の、偏光型蛍光リーダー上にプレートを直接据える。プレートは、2つの方法を用いるCriterion Host(商標)のソフトウェアを使用して読み込む。最初のものは、このフルオロフォアに特異的な発光及び励起フィルターを用いることによって、Tamra標識型塩基の読み込みを可能にし(発光550〜10nm、励起580〜10nm)、そして2番目のものは、このフルオロフォアに特異的な発光及び励起フィルターを用いることによって、R110標識型塩基の読み込みを可能にする(発光490〜10nm、励起520〜10nm)。両者の場合において、二色性二重ミラー(dichroic double mirror)(R110/Tamra)が使用され、そして他の読み込みパラメーターは:
Zの高さ:1.5mm
アテニュエーター:アウト
インテグレーションタイム:100,000マイクロ秒
生データユニット:カウント/秒
スイッチ偏光:ウェルごと
プレート設定時間:0ミリ秒
PMT設定:Smart Read(+)、感度2
動的偏光子:発光静的偏光子:S
である。
【0329】
ファイルの結果は、この様にTamraフィルターの場合のmP(ミリ偏光)の計算値及びR110フィルターの場合のものを含めて得られる。これらのmP値は、以下の式に従い、平行な面(//)及び垂直な面(⊥)に対して得られる強度から出発して計算される:MP=1000(//−g⊥)/(//+g⊥)
【0330】
この計算において、値⊥は係数gによって加重される。それは実験的にあらかじめ決定されなければならない機械の係数である。
【0331】
4)及び5)読み込みの解釈及び遺伝子型の決定
mP値は、Microsoft Inc.のExcel、及び/又はLJL Biosystems Inc.によって開発されたAllele Caller(商標)を用いてグラフ上に記された。
【0332】
横軸上にはTamra標識型塩基のmP値を示し、縦軸上にはR110標識型塩基のmP値を示す。強力なmP値は、このフルオロフォアで標識した塩基が組み込まれたことを示し、そして反対に弱いmP値は、この塩基の不在を明らかにしている。
【0333】
異なる遺伝子型を有するヌクレオチド配列の、最大3つの同種の群が得られる。
【0334】
Allele Caller(商標)のソフトウェアの使用は、一度異なる群の同定が行われると、表の書式において各個体について定義されている遺伝子型の直接的な抽出を可能にする。
【0335】
SNP g1033aの場合、例えば、アンチセンスで読まれる対立遺伝子cは、センスで読まれる対立遺伝子gに相当し、そして未成熟IFNα−7タンパク質配列の95位にあるアスパラギン酸(D)の存在に関連していること、そしてそれ故に、アンチセンスで読まれる対立遺伝子tが、センスで読まれる対立遺伝子aに相当し、相当するタンパク質の配列のこの位置につきアスパラギン(N)に相当することを述べる必要がある。
【0336】
SNP t 779 c , g 1033 a , c 1084 a , g 1135 t , t 1166 c , g 1181 a ,及び a 1294 c のミニシークエンスの結果
遺伝子型判定の過程の完了後、本明細書で研究したSNPについての、個体群のうちの個体の遺伝子型の決定は、上述したグラフを用いて行われる。
【0337】
SNP t779cの場合、遺伝子型は、理論的には試験した個体において、ホモ接合体TT、又はヘテロ接合体TC、又はホモ接合体CCのいずれかである。実際には、以下に示す様に、ホモ接合体の遺伝子型CCは個体群において検出されていない。
【0338】
SNP g1033aの場合、遺伝子型は、理論的には試験した個体においてホモ接合体GG、又はヘテロ接合体GA、又はホモ接合体AAのいずれかである。実際には、以下に示す様に、ホモ接合体の遺伝子型AAは個体群において検出されていない。
【0339】
SNP g1135tの場合、遺伝子型は、理論的には試験した個体において、ホモ接合体GG、又はヘテロ接合体GT、又はホモ接合体TTのいずれかである。実際には、以下に示す様に、ホモ接合体の遺伝子型TTは個体群において検出されていない。
【0340】
SNP c1084aの場合、遺伝子型は、理論的には試験した個体において、ホモ接合体CC、又はヘテロ接合体CA、又はホモ接合体AAのいずれかである。実際には、以下に示す様に、ホモ接合体の遺伝子型AAは個体群において検出されていない。
【0341】
SNP t1166cの場合、遺伝子型は、理論的には試験した個体においてホモ接合体TT、又はヘテロ接合体TC、又はホモ接合体CCのいずれかである。実際には、以下に示す様に、ホモ接合体の遺伝子型CCは個体群において検出されていない。
【0342】
SNP g1181aの場合、遺伝子型は、理論的には試験した個体において、ホモ接合体GG、又はヘテロ接合体GA、又はホモ接合体AAのいずれかである。実際には、以下に示す様に、ホモ接合体の遺伝子型AAは個体群において検出されていない。
【0343】
SNP a1294cの場合、遺伝子型は、理論的には試験した個体においてホモ接合体AA、又はヘテロ接合体AC、又はホモ接合体CCのいずれかである。実際には、以下に示す様に、ホモ接合体の遺伝子型CCは個体群において検出されていない。
【0344】
個体群において決定された遺伝子型の分布及び研究した7個のSNPに関する異なる対立遺伝子頻度の計算の結果を次の表に提示する:
【表6】
【表7】
【表8】
【0345】
上記の表において、
−Nは個体数を表し、
−%は特異的な亜集団における個体のパーセンテージを表し、
−対立遺伝子頻度は、特異的な亜集団における変異した対立遺伝子のパーセンテージを表し、
−95%ICは、95%における信頼性の最小値と最大値の間隔を表す。
【0346】
系統群、及びSNPによるこれらの結果を調べることによって、次のことが観察される:
−SNP t779cの場合、2人のヘテロ接合体の個体TCが、非ヨーロッパ系コーカソイドの亜集団出身である。
− SNP g1033aの場合、4人のヘテロ接合体の個体GAが、アフリカ系アメリカ人の亜集団出身である。
− SNP c1084aの場合、2人ヘテロ接合体の個体CAが、アフリカ系アメリカ人の亜集団出身である。
− SNP g1135tの場合、5人のヘテロ接合体の個体GTが、アフリカ系アメリカ人、カリブ人、及びメキシコ人の亜集団出身である。
− SNP t1166cの場合、5人のヘテロ接合体の個体TCが、カリブ人、ヨーロッパ系のコーカソイド、及び東南アジア人の亜集団出身である。
− SNP g1181aの場合、唯一のヘテロ接合体の個体GAが、東南アジア人の亜集団出身である。
− SNP a1294cの場合、2人のヘテロ接合体の個体ACが、アフリカ系アメリカ人の亜集団出身である。
【0347】
例3:酵母における天然野生型IFNα−7及び変異型IFNα−7のタンパク質の発現a)真核生物発現ベクターpPicZα-topoにおける天然野生型IFNα−7及び変異型IFNα−7のクローニング
天然野生型IFNα−7、D27N突然変異型IFNα−7、V106L突然変異型IFNα−7、K159Q突然変異型IFNα−7の成熟部分をコードするヌクレオチド配列は、前記SNPのうちの1つについてヘテロ接合体である個体由来のゲノムDNAを鋳型として用いるPCRによって増幅される。
【0348】
その様な増幅を可能にするPCRプライマーは:
配列番号19:センスプライマー:TGTGATCTGCCTCAGACCCAC
配列番号20:アンチセンスプライマー:TCAATCCTTCCTCCTTAATCCTTTTT
である。
【0349】
PCR生成物は、メタノールによって誘導可能なハイブリッドプロモーターAOX1の支配下にある真核生物発現ベクターpPicZα-topo(TOPO(商標)−クローニング;Invitrogen Corp.)内に挿入される。
【0350】
このベクターは、酵母ピキア・パストリス(Pichia pastoris)における真核生物タンパク質の異種発現を可能にする。
【0351】
組換えタンパク質をコードするベクターの領域のヌクレオチド配列を調べた後、ベクターはPme1の制限酵素によって直線化され、そしてP.パストリスの酵母株(Invitrogen)がこれらの組換え発現ベクターを用いて形質転換される。
b)天然野生型IFNα−7及び突然変異型IFNα−7のP.パストリスにおける異種発現及び精製
天然野生型IFNα−7をコードするクローン、又はD27N突然変異型IFNα−7、V106L突然変異型IFNα−7、又はK159Q突然変異型IFNα−7をコードするクローンを含む50mLのBMGY培地(2%ペプトン、1%酵母抽出物、1.34%YNB,1%グリセロール、100mMリン酸カリウム、0.4mg/Lビオチン、pH6.0)の2つの飽和前培養が、200回転/分(rpm )の振盪で、30℃で24〜48時間行われた。
【0352】
培養が細胞密度に達した場合(600nmの波長で測定すると、12の光学密度に相当する)、それは、50OD/mLで、250mLのBMMY培地(2%ペプトン、1%酵母抽出物、1.34%YNB,0.5%メタノール、100mMリン酸カリウム、0.4mg/Lビオチン、pH6.0)を接種するために使用される。
【0353】
タンパク質の発現は、続いて、180rpmでの培養フラスコの振とうで、30℃で24時間、1%の終濃度のメタノールによって誘導される。
【0354】
コード配列の上流にある、「アルファ因子」のシグナルペプチド配列の存在により、とは培養液中で酵母によって分泌される。アルファ因子はプロセシングの間に自然に開裂する。
【0355】
懸濁液を遠心し、そしてタンパク質は、HPLCによって、得られた上清から出発して精製される。
【0356】
予備的な開始段階において、限外ろ過(Labscale,カットオフ値5000Da,Millipore)、続いて透析は、50mMTris−ClpH9.0,25mMNaClの緩衝液中の酵母の上清の10倍の濃縮を可能にする。
【0357】
最初のクロマトグラフィー段階は、ブルーセファロースカラム(Amersham Pharmacia)上での、親和性によるタンパク質の回収を可能にする。回収された画分中のタンパク質の存在は、一方ではSDS PAGE電気泳動によって、他方ではIFNα−7タンパク質に対して特異的な抗体による免疫検出によって証明される。この段階で、注目のタンパク質の純度は75%超である。
【0358】
第二の精製段階において、ゲル濾過は、50mMTris−ClpH9.0,25mMNaClに対するIFNα−7に相当する回収画分の緩衝液の交換を可能にする。
【0359】
精製の最終段階は、イオン交換クロマトグラフィーカラム上でのタンパク質の分離から成る。組換えタンパク質を含む画分は、、50mMTris−ClpH9.0,25mMNaClの緩衝液中であらかじめ平衡化した陰イオン交換カラム(ResourceQ 6.0mL,Pharmacia)に注入される。タンパク質の溶出は、50mM Tris pH9の緩衝液中の、0.025〜1Mの間のグラジエントの通過によって行われる。あるいは、当該精製はブルーシバクロンを用いて実施されうる。
【0360】
注目のタンパク質の純度はSDS/PAGE上で推定され、そしてタンパク質濃度はデンシトメトリー(Quantity One,Biorad)及びBCAアッセイ(ビシンコニン酸及び硫酸銅、Sigma)によって測定された。
【0361】
このプロトコールに従い得られた、精製された天然野生型IFNα−7、D27N突然変異型IFNα−7、V106L突然変異型IFNα−7、K159Q突然変異型IFNα−7のタンパク質は、最終的にはより大量のタンパク質を得るためにスケールアップされ、後述する機能的試験に使用される。
【0362】
実施例4:シグナル伝達を活性化する野生型及びD72N突然変異型IFNα−7の能力の評価
インターフェロンは、JAK(Janusキナーゼ)及びSTAT(シグナルトランスデューサー及び転写のアクチベーター)タンパク質が関与するシグナル伝達経路を介して作用することが知られている。インターフェロンの、その受容体への結合は、リン酸化によってSTATタンパク質を次々に活性化するJAKタンパク質のリン酸化を誘導する。活性化されたSTATタンパク質は、それらが、各遺伝子の転写を刺激する、遺伝子プロモーター上のインターフェロン応答因子と結合する核に転移する。インターフェロンによって開始されるシグナル伝達経路を研究するために、レポーター遺伝子技術を使用した。方法は後述する。
【0363】
インターフェロン応答性のキメラプロモーターの支配下にあるルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定的にトランスフェクションされたヒト細胞系の使用は、このin vitroでのアッセイのための基礎を提供する。したがって、検出されたルシフェラーゼ活性は、核のレベルでシグナルを誘導するIFNの能力を反映する。
【0364】
このレポーター遺伝子アッセイを用いて、D27N突然変異型IFNα−7、野生型IFNα−7、及び野生型IFNα−2によって示された用量応答曲線が解析され、そして、IFNαタンパク質1mgあたりのIntronA(インターフェロンアルファ2bに相当する市販品)を参照して、国際単位で結果が表される。
【0365】
このアッセイは以下の結果をもたらす:
−D72N突然変異型IFNα−7の場合581IU/mg
−野生型IFNα−7の場合489IU/mg
−野生型IFNα−2の場合698IU/mg。
【0366】
これらの結果は、シグナル伝達を活性化するD72N突然変異型INFα−7の能力が、野生型IFNα−7のもの及び野生型IFNα−2のものとかなり類似していることを示す。
【0367】
実施例5:D72N突然変異型IFNα−7の免疫調節活性の評価
IFNのI型(IFNアルファ及びIFNベータ)は、免疫系のある機能を調節することができる。それらは、樹状細胞(DC)の成熟を増大させること:MHCクラスI(HLA−ABC)及びII(HLA−DR)分子の発現の増大、Tリンパ球、CD80、CD86及びCD83の同時刺激に関与する分子の発現の増大、及びTリンパ球の機能の刺激の増大、が証明されている。
【0368】
a)樹状細胞の成熟に対するD72N突然変異型IFNα−7の作用
D72N突然変異型IFNα−7の免疫調節活性は、樹状細胞の成熟に対して最初に研究され、そして市販のIntronA製品の代表として選択された野生型IFNα−2のものと比較された。
【0369】
それらを実施するために、樹状細胞は、GM−CSF及びIL−4サイトカインの存在下で培養された成人の末梢血単球から最初に生成された。CD14+細胞精製キットを用いての精製の後、これらの樹状細胞は、100ng/mlのD72N突然変異型IFNα−7、又は野生型IFNα−2の存在下に据えられ、そしてそれらの表現型が、MHCクラスI及びII分子並びにCD40、CD80、CD86、CD83及びCD1aマーカーの発現を探す目的で、FACS解析によって決定された。これらの樹状細胞の突然変異状態も、コントロールを提供するためにIFNα処理無しで刺激されていない樹状細胞を用いて得られたもの、及び樹状細胞の成熟を誘導することが知られている1μg/mlのLPS又は2.5ng/mlのTNFαを用いて得られたものと比較された。
【0370】
任意の単位で表した、各マーカー及び5つの実験条件についての蛍光強度の測定値の中央値を以下の表に表す:
【表9】
この試験結果は、D72N突然変異型IFNα−7が、樹状細胞を刺激することが弱い能力を有することを示す。特に、野生型IFNα−2と比較して、D72N突然変異型IFNα−7タンパク質は、免疫抑制活性を示す。
【0371】
b)Tリンパ球によるサイトカイン放出に対するD72N突然変異型IFNα−7の作用
D72N突然変異型IFNα−7の免疫調節活性も、突然変異型IFNα−7の存在下に据えられ、且つ凝集に対する免疫応答を模倣するために強力な抗原(SEB)を用いた、又は用いずに、Tリンパ球によるサイトカイン放出を測定することによって研究された。この試験はまた、コントロールとして使用され、且つIntronAの市販品の代表として選択された野生型IFNα−2の存在下で実施された。
【0372】
それらを実施するために、末梢血単球(PBMC)が健康なドナーから単離され、そして、抗CD3及び抗CD28抗体又はSEBを含む適切な培地中で16時間刺激された。各培地に4μg/mLのD72N突然変異型IFNα−7又は野生型IFNα−2が添加された。刺激後、Tリンパ球は、抗CD3、抗CD4及び抗CD69抗体を用いて細胞外から、そしてTh1型サイトカイン(IFN−ガンマ)又はTh2型サイトカイン(IL10)に対する特異的な抗体で細胞内から標識された。蛍光細胞は、FACScalibur及びCellQuestソフトウェアを用いて解析された。
【0373】
得られた結果は、D72N突然変異型IFNα−7及び野生型IFNα−2が、IL−10及びIFN−ガンマの放出を刺激せず、そして、それ故にSEBの不在下でTリンパ球を活性化しないことを示す。対照的に、D72N突然変異型IFNα−7及び野生型IFNα−2タンパク質は、以下の表に示すように、SEB活性型Tリンパ球によるサイトカイン(IL−10及びIFN−ガンマ)の放出を刺激する。この表は、それぞれCD4+Tリンパ球及びCD8+Tリンパ球についてのCD4+CD69+細胞又はCD8+CD69+細胞のパーセンテージとして表した、SEBの存在下でのTリンパ球によるサイトカイン放出、及び全細胞に対するCD69+細胞のパーセンテージを表す。
【表10】
【0374】
これらの結果は、D72N突然変異型IFNα−7が、SEB抗原によってあらかじめ活性化されたCD4+Tリンパ球及びCD8+Tリンパ球によるサイトカイン放出(IFNガンマ及びIL−10)を刺激する高い能力を有することを示す。特に、CD4+又はCD8+Tリンパ球によるインターフェロンガンマの賛成は、野生型IFNα−2の存在下よりもD72N突然変異型IFNα−7の存在下の方が高い。
【0375】
c)単球によるサイトカイン放出に対するD72N突然変異型IFNα−7の作用
最後に、D72N突然変異型IFNα−7の免疫調節活性が、細菌の毒性物質(LPS)の不在下又は存在下で、単球によるサイトカイン放出を測定することによって研究された。この試験はまた、コントロールとして使用され、且つIntronAの市販品の代表として選択された野生型IFNα−2の存在下で実施された。
【0376】
それらを実施するために、末梢血単球(PBMC)が健康なドナーから単離され、そしてそれらの表現型が、CD64+CD4dim細胞(CD64+CD4dimは血液の単球のマーカーである)の相対量を決定するために解析された。一晩の培養の後、これらのPBMCは培養液のみ(刺激されていない細胞)の中で、又はLPS(刺激された細胞)の存在下でインキュベートされた。各培養において、4μg/mLのD72N突然変異型IFNα−7又は野生型IFNα−2が添加された。培養後、細胞は抗CD64及び抗CD4dimを用いて細胞外から、そしてTh1型サイトカイン(TNFアルファ)、IL−12及びIL−10に対して特異的な抗体を用いて細胞内から標識された。
【0377】
蛍光細胞は、FACScalibur及びCellQuestソフトウェアを用いて解析された。
【0378】
得られた結果は、D72N突然変異型IFNα−7及び野生型IFNα−2が、LPSの存在下でサイトカイン(IL−10、IL−12及びTNF−アルファ)の放出を刺激しないことを示す。
【0379】
対照的に、LPSの存在下で、単球はサイトカイン(IL−10、IL−12及びTNF−α)を放出し、この放出は、以下の表に示すように、D72N突然変異型IFNα−7タンパク質又は野生型IFNα−2の存在下で更に増大する。この表は、CD64+CD4dim細胞のパーセンテージとして表した、LPSの存在下での単球によるサイトカインの放出、及び全細胞に対するCD64+CD4dim細胞のパーセンテージを表す。
【表11】
【0380】
これらの結果は、LPSの存在下、D72N突然変異型IFNα−7タンパク質が、単球によるサイトカイン放出を刺激することができることを示す。特に、単球によるIL−10及びTNFαの放出の刺激は、野生型IFNα−2の存在下よりもD72N突然変異型IFNα−7の存在下のほうが高い。
【0381】
実施例6:D72N突然変異型IFNα−7の in vitro での抗増殖活性の評価
a)Daudi Burkitt細胞系のヒトリンパ芽球に対するもの
これらの試験は、4つの異なるIFN α−7の型、すなわち野生型IFNα−7、V106L突然変異型IFNα−7、及びK159Q突然変異型IFNα−7で実施される。前もってRPMI1640培地(10%ウシ胎児血清及び2mMのL−グルタミンを添加したもの)中で培養された細胞(ヒトDaudi Burkittリンパ腫細胞系、以後「Daudi細胞」と称する)は、4×104 細胞/穴の細胞密度で96穴プレート中に接腫される。
【0382】
各穴において、Daudi細胞は、天然野生型又は変異型IFN α−2のいずれかの濃度の増大させつつ据えられる。野生型及び変異型IFN α−2のいずれかの場合に、0.003pM〜600nMの終濃度が試験される。
【0383】
Daudi細胞は、続いて、Uptiblue試薬(Uptima)を培養液に添加した後に、5%CO2 のもと、37℃で66時間培養される。細胞増殖の速度は、4時間の追加のインキュベーション期間の後に590nm(励起560nm)で放射された蛍光を測定することによって定量される。
【0384】
突然変異型IFNα−7タンパク質又は野生型IFNα−7の抗増殖活性は、細胞増殖を50%阻害するIFNα−7の濃度に相当するIC50の測定に基づいている。
【0385】
少なくとも3つの実験が、3回繰り返して両タンパク質及び各濃度について実施された。
【0386】
試験したIFNα−7のそれぞれについて測定される平均IC50値、同様に野生型タンパク質で測定したIC50値以上の、突然変異タンパク質を用いて測定されたIC50値に相当する平均の比率を以下の表に表す。
【0387】
イオン交換クロマトグラフィーによって精製したタンパク質で得られた結果:
【表12】
【0388】
ブルーシバクロンを用いて精製したタンパク質で得られた結果:
【表13】
【0389】
この試験は、3つの突然変異したIFNα−7タンパク質が、Daudi細胞の増殖を阻害することを示す。更に、細胞の抗増殖活性は、D72N変異型IFNα−7及びK159Q突然変異型タンパク質の場合、野生型IFN α−2と比較して若干増大する。
【0390】
b)TF−1赤白血病細胞系に対するもの
D72N突然変異型IFNα−7の作用はまた、TF−1赤白血病細胞系に対しても評価された。この試験はまた、コントロールとして使用され、且つIntronAの市販品の代表として選択された野生型IFNα−2の存在下で実施された。
【0391】
それらを実施するために、TF−1細胞は、D72N突然変異型IFNα−7又は野生型IFNα−2の濃度を増大させつつ静置し(0.001〜1000ng/mL)、そして当該細胞の増殖を測定した。
【0392】
この実験は3回繰り返し、そして1つの代表的な実験結果を図5に表す。
【0393】
これらのデータは、D72N突然変異型IFNα−7がTF−1細胞に対する弱い抗増殖作用を有することを示す。特に、TF−1赤白血球細胞に対するD72N突然変異型IFNα−7の抗増殖作用は、野生型IFNα−2のものに類似している。
【0394】
実施例7:D72N突然変異型IFNα−7の抗ウイルス活性の評価
IFNは、抗ウイルス性の防御において重要な役割を果たしている。IFNの抗ウイルス活性は、IFNが誘導する酵素系に部分的に起因しており、例えば:
−アデノシンオリゴマー合成を触媒する、2’5’オリゴアデニル酸合成酵素。これらのオリゴマーは、一旦活性化したウイルスRNAを破壊するエンドリボヌクレアーゼである、リボヌクレアーゼLを活性化する。
−ウイルスの転写物の合成及び/又は成熟を阻害するMxタンパク質(GTPアーゼ)。この活性は主にインフルエンザウイルスに働く。
−二本鎖RNAによって活性化されるPKRタンパク質。活性化されたPKRはタンパク質合成を阻害する。
【0395】
IFNの抗ウイルス活性はまた、他の機構、例えばレトロウイルスの場合、ウイルス粒子の細胞内への侵入、複製、結合、粒子の出口及びウイルス粒子の感染力、の阻害によっても誘導される。
【0396】
最終的に、IFNは、免疫系のある機能を調節することによって、特に細胞の媒介に対する応答(特に、MHCクラスI及びII分子の増大、IL−12及びIFN−ガンマの産生の増大、CTL活性の増大、を含む)を支持することによって、間接的な抗ウイルス活性を発揮する。
【0397】
D72N突然変異型IFNα−7の抗ウイルス活性は、in vitroでは細胞培養液中において、そしてin vivoではマウスモデルにおいて、その両方で評価されている。両試験は、コントロールとして使用され、且つIntronAの市販品の代表として選択された野生型IFNα−2と平行して実施された。
【0398】
a)in vitroでの細胞培養液における抗ウイルス活性
このアッセイは、水泡性口内炎ウイルス(VSV)を用いての細胞培養液中でのD72N突然変異型IFNα−7の抗ウイルス活性の評価を可能にする。
【0399】
それを実施するために、WISHヒト表皮細胞が、濃度が低下するD72N突然変異型IFNα−7、又は野生型IFNα−2の存在下で24時間培養された。続いて、当該細胞は水泡性口内炎ウイルス(VSV)にさらに24〜48時間感染させられ、そして細胞溶解が測定された。
【0400】
試験した異なるIFNαの抗ウイルス活性は、VSVによって誘導される細胞溶解の50%を阻害するIFNα−7の量に相当する比活性(IU/μg)と比較することによって決定される。IU/μgの単位は、IFNαタンパク質1μgあたりIntronA活性を言及する国際単位を表す。
【0401】
同様の実験が3回実施され、そして1つの代表的な実験で測定された比活性の値は以下の通りである:
−D72N突然変異型IFNα−7の場合:53IU/μg
−野生型IFNα−2の場合:330IU/μg
【0402】
この実験結果は、D72N突然変異型IFNα−7タンパク質が、in vitroでの細胞培養液中で弱い抗ウイルス活性を有することを示す。特に、VSVに感染した細胞培養液中で、D72N突然変異型IFNα−7は、野生型IFNα−2よりも低い抗ウイルス活性を有する。
【0403】
b)in vivoでのマウスモデルにおける抗ウイルス活性
このin vivoでの試験は、EMCV(脳心筋炎ウイルス)マウスモデルにおいて実施される。
【0404】
ヒトIFNは、同量のマウスIFNによって示されるものよりも通常100〜1,000倍低い、マウスにおける用量依存性の抗ウイルス活性を示す(Meister et al. (1986). J. Gen. Virol. 67, 1633-1644)。
【0405】
脳心筋炎ウイルス(EMCV)を用いるマウスの腹腔内注射は、中枢神経系の関与及び脳炎を特徴とする、急速に進行する致死的疾患をもたらす(Finter NB (1973). Front Biol. 2:295-360)。マウス及びヒトインターフェロン−アルファは共に、致死的なEMCVの感染からマウスを守ることにおいて有効であることが示されている(Tovey and Maury (1999). J. IFN Cytokine Res. 19:145-155)。
【0406】
20匹の6週齢のスイスマウスの群が100xLD50EMCVに腹腔内から感染させられ、そして1時間後に、そしてそれから3日間1日1回、2μgのD72N突然変異型IFNα−7又は野生型IFNα−2の調製物で処理された。コントロール群は、賦形剤のみで処理された動物で実施された。当該動物は、21日間、生存について毎日観察された。
【0407】
結果が図6に提示され、そして、D72N突然変異型IFNα−7で処理されているマウスの相対的生存率が、未処理マウスの生存率よりもはるかに高いことを示し、このことは、in vivoのマウスモデルにおけるD72N突然変異型IFNα−7の抗ウイルス活性を証明している。更に、14日後、D72N突然変異型IFNα−7で処理したマウスの45%が生存し、一方、野生型IFNα−2で処理したマウスの30%が生存している。したがって、in vivoのマウスモデルにおけるD72N突然変異型IFNα−7の抗ウイルス活性は、野生型IFNα−2で処理されているマウスについて観察されたものよりも高い。
【0408】
実施例8:悪性フレンド赤白血病細胞をあらかじめ接種したマウスにおけるD72N突然変異型IFNα−7の抗腫瘍活性の評価
IFNαは、IFN感受性の親のフレンド赤白血病細胞と比べて、IFNαの直接的な抗増殖活性に対し耐性があるフレンド赤白血病細胞のクローンの増殖からのマウスの保護に有効であることが示されており(Belardelli et al., Int. J. Cancer, 30, 813-820, 1982; Belardelli et al., Int J. Cancer, 30, 821-825, 1982)、これは、IFNαの抗腫瘍活性における間接的な免疫媒介機構の重要性を反映している。
【0409】
以下の実験は、フレンド赤白血病細胞をあらかじめ接種されたマウスにおけるD72N突然変異型IFNα−7の抗腫瘍活性の評価、及び市販のIntronA製品の代表として選択された野生型IFNα−2のものとの比較を可能にする。
【0410】
それらを実施するために、12匹の6週齢のDBA/2マウスの群が100,000個のIFN耐性フレンド赤白血病細胞(3C18)(20,000LD50)を腹腔内から接種され、そして、1時間後、そしてそれから21日間1日1回、2.0μgの野生型IFNα−2又は2.0μgのD72N突然変異型IFNα−7又は等量の賦形剤単独で処理された。当該動物は、続いて、生存について毎日観察され、そして初頭効果解析はその賦形剤単独の群との比較における各処置群の相対的生存とされた。
【0411】
図7に提示した、この実験結果は、IFNαで処理されているマウスと比較して、D72N突然変異型IFNα−7によるマウスの処理が、非常に悪性のフレンド赤白血病細胞(FLC)の接種後に生存しているマウスの数の増大をもたらす。45日後、D72N突然変異型IFNα−7で処理したマウスの34%が生存し、一方、野生型IFNα−2で処理したマウスの50%が生存している。したがって、FLC接種マウスの生存率は、野生型IFNα−2による処理後よりも、D72N突然変異型IFNα−7による処理後の方が若干低い。
【0412】
これらの結果は全て、D72N突然変異型IFNα−7が独特な生物学的特性を有することを示す。
【図面の簡単な説明】
【0413】
【図1】図1Aは、SNP D72Nを含んで成る、本発明に従うコードタンパク質及び天然野生型IFNα−7タンパク質のモデルを表す。図1Bは、図1Aで表したタンパク質の各自の下部のモデルのクローズアップを表す。図1A及び図1Bにおいて、黒いリボンは天然野生型IFNα−7の構造を表し、そして白いリボンはD72N突然変異型IFNα−7タンパク質の構造を表す。
【図2】図2Aは、SNP F116Sを含んで成る、本発明に従うコードタンパク質及び天然野生型IFNα−7タンパク質のモデルを表す。図2Bは、図2Aで表したタンパク質の各自の上部のモデルのクローズアップを表す。図2A及び図2Bにおいて、黒いリボンは天然野生型IFNα−7の構造を表し、そして白いリボンはF116S突然変異型IFNα−7タンパク質の構造を表す。
【図3】図3Aは、SNP R121Kを含んで成る、本発明に従うコードタンパク質及び天然野生型IFNα−7タンパク質のモデルを表す。図3Bは、図3Aで表したタンパク質の各自の中央部のモデルのクローズアップを表す。図3A及び図3Bにおいて、黒いリボンは天然野生型IFNα−7の構造を表し、そして白いリボンはR121K突然変異型IFNα−7タンパク質の構造を表す。
【図4】図4Aは、SNP K159Qを含んで成る、本発明に従うコードタンパク質及び天然野生型IFNα−7タンパク質のモデルを表す。図4Bは、図4Aで表したタンパク質の各自の上部のモデルのクローズアップを表す。図4A及び図4Bにおいて、黒いリボンは天然野生型IFNα−7の構造を表し、そして白いリボンはK159Q突然変異型IFNα−7タンパク質の構造を表す。
【図5】図5は、TF−1細胞系へのD72N突然変異型IFNα−7の抗増殖作用の測定についての試験結果を表す。この図において、横座標はIFNαの濃度(ng/ml)に相当し、そして縦座標は細胞増殖の阻害(%)に相当する。D72N突然変異型IFNα−7(黒いひし形)の抗増殖作用は、野生型IFNα−2(白い四角)のものと比較される。
【図6】図6は、VSVウイルスによってあらかじめ感染させられ、そしてD72N突然変異型IFNα−7タンパク質で処理したマウスの生存率を、野生型IFNα−2で処理したもの、又は処置されてないものと比較して表す。この図において、横座標は生存時間(日数)に相当し、そして縦座標はVSV感染マウスの相対的生存率に相当する。黒いひし形は、D72N突然変異型IFNα−7で処理した、VSV感染マウスについてのデータを表し、そして白い三角は、処理されていない、VSV感染マウスについてのデータを表す。
【図7】図7は、悪性フレンド赤白血病細胞(FLC)をあらかじめ接種し、そしてD72N突然変異型IFNα−7タンパク質で処理したマウスの生存率を、野生型IFNα−2で処理したもの、又は処理してないものと比較して表す。この図において、横座標は生存時間(日数)に相当し、そして縦座標は、FLCを接種したマウスの相対的生存率に相当する。黒い四角は、D72N突然変異型IFNα−7で処理した、FLC接種マウスについてのデータを表し、そして白い三角は、処理していないFLC接種マウスについてのデータを表す。
【0001】
本発明は、2001年6月11日に出願された、表題「Nouveaux polynucleotides et polipeptides de I'IFN alpha 7」のフランス国特許出願番号第0107588号に対し優先権を主張するものである。
【0002】
本発明は、新規SNPを含んで成る、IFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列に由来する新規ポリヌクレオチド、及びこれらのSNPによって生じた突然変異を含んで成る、天然の野生型IFNα−7タンパク質に由来する新規ポリペプチド、並びにそれらの治療上の使用に関する。
【背景技術】
【0003】
以降IFNα−7と称する、インターフェロンアルファ7遺伝子は、以下の刊行物に記載されている:
- Olopade, O. I. ;Bohlander, S. K.; Pomykala, H.; Maltepe, E.; Van Melle, E.; Le Beau, M. M.; Diaz, M.O. :"Mapping of the shortest region of overlap of deletions of the short arm of chromosome 9 associated with human neoplasia." ; Genomics 14:437- 443,1992.
- Henco K, Brosius J, Fujisawa A, Fujisawa JI, Haynes JR, Hochstadt J,Kovacic T, Pasek M,Schambock A, Schmid J, et al. :"Structural relationship of human interferon alpha genesand pseudogenes." ; J Mol Biol 1985 Sep 20; 185 (2): 227-60.
- Ullrich A, Gray A, Goeddel DV, Dull TJ:"Nucleotide sequence of a portion of human chromosome 9 containing a leukocyte interferon gene cluster." ; J Mol. Biol. 1982 Apr 15; 156 (3): 467-86.
【0004】
この遺伝子のヌクレオチド配列は、GenBankのデータベースにおいてアクセッション番号X02960のもとアクセス可能である。
【0005】
IFNαは、それらの細胞性抗増殖作用、並びに抗ウイルス性及び抗寄生虫性応答におけるそれらの関与について知られている。
【0006】
IFNαはまた、造血幹細胞のレベルで複数の他のサイトカインの発現を阻害し、そしてある腫瘍の細胞増殖を阻害することも知られている。
【0007】
IFNαはまた、腎ガンにおけるEGF受容体の発現を低下させ、あるミトコンドリア遺伝子の発現を阻害し、そして線維芽細胞、単球及びBリンパ球の増殖を、特にin vitroで阻害し、そしてBリンパ球による抗体の合成を阻止することも知られている。
【0008】
IFNαはまた、腫瘍細胞の表面上での腫瘍特異的抗原の発現を誘導すること、そして更にはISRE型(インターフェロン刺激応答因子)のプロモーター領域の支配下にある遺伝子を、これらのISREの特異的な転写因子に対して作用させることによって誘導することも知られている。
【0009】
IFNαが異なる障害及び/又はヒトの疾患、例えば、異なるガン、例えばガン腫、黒色腫、リンパ腫、白血病並びに肝臓、首、頭及び腎臓のガン、心臓血管疾患、代謝病、例えば免疫系等と関連していないもの、例えば肥満、感染症、例えばB型及びC型肝炎並びにAIDS、感染性肺炎、潰瘍性大腸炎、中枢神経系等の疾患、例えばアルツハイマー病、精神分裂病及びうつ病、組織又は器官移植の拒絶、創傷治癒、透析されている患者の貧血、アレルギー、喘息、多発性硬化症、骨粗鬆症、乾癬、リウマチ様関節炎、クローン病、自己免疫疾患及び障害、胃腸疾患、又は化学療法処置と関連している障害、に関与することが知られている。
【0010】
IFNαは、ある白血病、転移型腎ガン及び免疫欠損後に現れる腫瘍、例えばAIDSの場合にはカポジ肉腫に特に使用される。IFNαは、他のタイプの腫瘍及びあるウイルス感染に対しても有効である。IFNαはまた、生殖器のイボ又は性病の処置についてFDA(食品医薬品局)によって承認されている。
【0011】
しかしながら、IFNα、特にIFNα−7は、それらを医薬組成物において使用する場合に多くの副作用があり、例えば急性過敏症(じんま疹、気管支収縮、アナフィラキシーショック等)、心不整脈、低血圧、てんかん性発作、甲状腺機能についての問題、流感様症候群(発熱、発汗、筋肉痛)等である。
【0012】
更に、IFNαで処置された患者は、これらの分子を中和する抗体を産生することができ、その結果それらの有効性が低下する。
【0013】
本発明者は、天然の野生型IFN−7タンパク質と異なる機能性を有しうる、IFNα−7遺伝子に対する新規ポリペプチド及び新規ポリヌクレオチド類似体、を発見した。
【0014】
これらの新規ポリペプチド及びポリヌクレオチドは、前文で言及した障害又は疾患を処置又は予防し、そしてそれらに縛られている欠点の全部又は一部を回避するために特に使用されうる。
【0015】
本発明の簡単な要約
本発明は、第一の目的として、参照野生型IFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列と異なる、すなわち1又は複数のSNP(一塩基多型)を含んで成る新規ポリヌクレオチドを有する。
【0016】
ヒト参照野生型IFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列である配列番号1は、1983ヌクレオチドから成り、そしてヌクレオチド751(開始コドン)からヌクレオチド1320(終止コドン)の、570ヌクレオチドのコード配列を含んで成る。
【0017】
本出願人は、参照野生型IFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列において14個のSNPを同定してきた。これらの14個のSNPは以下の通りである:a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,a1212g,及びa1294c。
【0018】
当然のことながら、本発明の意味においては、前文で限定したSNPの位置に相当する番号付けは、ヌクレオチド配列である配列番号1の番号付けと関連している。
【0019】
文字a,t,c及びgは、それぞれ窒素性塩基のアデニン、チミン、シトシン及びグアニンに相当する。
【0020】
最初の文字は野生型のヌクレオチドに相当し、一方、最後の文字は変異型ヌクレオチドに相当する。
【0021】
したがって、例えばSNP g1033aは、参照野生型IFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列である配列番号1の、1033位のヌクレオチドであるグアニン(g)が、ヌクレオチドであるアデニン(a)に変異したことに相当する。
【0022】
これらのSNPは、表題「Process for the determination of one or several functional polymorphism(s) in the nucleotide sequence of a preselected functional candiate gene and its applications」の、2000年12月6日に出願された出願人の特許出願FR0022894に記載の決定方法を用いて本出願人によって同定された。
【0023】
この特許出願に記載の方法は、無作為な個体群由来の少なくとも1つの個体において、1(又は複数)の既存のSNPの同定を可能にする。
【0024】
本発明の範囲において、例えば、コード配列を含んで成る、IFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列のフラグメントが、無作為に選択した個体群の異なる個体から単離された。
【0025】
続いて、これらのフラグメントの配列決定が、DHPLC(「変性−高性能液体クロマトグラフィー」)による解析の後、ヘテロ二重鎖プロファイル(すなわち、参照野生型IFNα−7遺伝子配列と異なるプロファイル)を有するこれらの試料のうちのいくつかについて行われた。
【0026】
この方法で配列決定されたフラグメントは、続いて参照野生型IFNα−7遺伝子のフラグメントのヌクレオチド配列と比較され、そして本発明に基づくSNPが同定された。
【0027】
この様にSNPは天然のものであり、そしてこれらの各々が世界の人口のある個体に存在している。
【0028】
参照野生型IFNα−7遺伝子は、最初の23アミノ酸を含むシグナルペプチドの開裂によって166アミノ酸の成熟タンパク質に変換される、アミノ酸配列である配列番号2に相当する、189アミノ酸の未成熟タンパク質をコードする。
【0029】
本発明のコードSNPのそれぞれ、すなわち、t779c,g1033a,c1084a,g1135t,t1166c,g1181a,a1294cは、アミノ酸配列のレベルで、IFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の修飾をもたらす。
【0030】
アミノ酸配列におけるこれらの修飾は以下の通りである:
【0031】
SNP t779cは、アミノ酸配列である配列番号2に相当する、IFNα−7遺伝子によってコードされる未成熟タンパク質の10位にあるアミノ酸であるバリン(V)をアラニン(A)に変異させる。このSNPは、タンパク質成熟の過程の間に開裂するシグナル配列に位置するアミノ酸に影響を与え、そして、それ故にこのSNPは、当該成熟タンパク質上に見られない。本発明の記載において、このSNPによってコードされる突然変異は、V10Aと称されることもある。
【0032】
SNP g1033aは、アミノ酸配列である配列番号2に相当する、IFNα−7遺伝子の未成熟タンパク質の95位にあるアミノ酸、アスパラギン酸(D)の、アスパラギン(N)への突然変異、そして成熟タンパク質の72位にあるものの突然変異をもたらす。本発明の記載において、D72N及びD95Nは、それぞれ成熟タンパク質と、又は未成熟タンパク質と言及されるかどうかにより区別することなくこのSNPによってコードされる突然変異と称される。
【0033】
SNP c1084aは、アミノ酸配列である配列番号2に相当する、IFNα−7遺伝子の未成熟タンパク質の112位にあるアミノ酸、ロイシン(L)の、イソロイシン(I)への突然変異、そして成熟タンパク質の89位にあるものの突然変異をもたらす。本発明の記載において、L89I及びL112Iは、それぞれ成熟タンパク質と、又は未成熟タンパク質と言及されるかどうかにより区別されることなくこのSNPによってコードされる突然変異と称される。
【0034】
SNP g1135tは、アミノ酸配列である配列番号2に相当する、IFNα−7遺伝子の未成熟タンパク質の129位にあるアミノ酸、バリン(V)の、ロイシン(L)への突然変異、そして成熟タンパク質の106位にあるものの突然変異をもたらす。本発明の記載において、V106L及びV129Lは、それぞれ成熟タンパク質と、又は未成熟タンパク質と言及されるかどうかにより区別されることなくこのSNPによってコードされる突然変異と称される。
【0035】
SNP t1166cは、アミノ酸配列である配列番号2に相当する、IFNα−7遺伝子の未成熟タンパク質の139位にあるアミノ酸、フェニルアラニン(F)の、セリン(S)への突然変異、そして成熟タンパク質の116位にあるものの突然変異をもたらす。本発明の記載においては、F116S及びF139Sは、それぞれ成熟タンパク質と、又は未成熟タンパク質と言及されるかどうかにより区別されることなくこのSNPによってコードされる突然変異と称される。
【0036】
SNP g1181aは、アミノ酸配列である配列番号2に相当する、IFNα−7遺伝子の未成熟タンパク質の144位にあるアミノ酸、アルギニン(R)の、リジン(K)への突然変異、そして成熟タンパク質の121位にあるものの突然変異をもたらす。本発明の記載においては、R121K及びR144Kは、それぞれ成熟タンパク質と、又は未成熟タンパク質と言及されるかどうかにより区別されることなくこのSNPによってコードされる突然変異と称される。
【0037】
SNP a1294cは、アミノ酸配列である配列番号2に相当する、IFNα−7遺伝子の未成熟タンパク質の182位にあるアミノ酸、リジン(K)の、グルタミン(Q)への突然変異、そして成熟タンパク質の159位にあるものの 突然変異をもたらす。本発明の記載においては、K159Q及びK182Qは、それぞれ成熟タンパク質と、又は未成熟タンパク質と言及されるかどうかにより区別されることなくこのSNPによってコードされる突然変異と称される。
【0038】
SNP g1033a(D95N),t1166c(F139S),g1181a(R144K),a1294c(K182Q)は、野生型参照IFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドと比較して、本発明に従うポリペプチドの空間的な高次構造の修飾をもたらす。
【0039】
これらの修飾は、当業者に周知の方法に従い、例えば新規のモデリングツール(例えば、SEQFOLD/MSI)、ホモロジー(例えば、MODELER/MSI)、力場の最小化(例えば、DISCOVER,DELPHI/MSI)及び/又は分子動力学(CFF/MSI)を利用して、コンピューター分子モデリングによって観察され得る。
【0040】
その様なモデリングの一例は、本明細書において実験の項目に示される。
【0041】
コンピューター分子モデリングは、成熟変異型タンパク質上の突然変異D72Nが、72位のアスパラギン酸を担持するショートヘリックス(T70−A75)の構造的修飾をもたらすことを示す。136位のチロシン残基を有し、72位のアスパラギン酸に面しているヘリックスDとEとの間のループも修飾される。
【0042】
したがって、当該変異タンパク質は、天然の野生型IFNα−7タンパク質と異なる三次元の高次構造を有する。
【0043】
更に、突然変異D72Nはまた、アスパラギン酸の持っていた負電荷の損失をもたらす。最終的に、72位のアスパラギン酸残基の、アスパラギン残基への突然変異は、受容体に結合するIFNα−7部分の近傍において、タンパク質機能を変えるにちがいない。
【0044】
それ故に、コンピューターによる分子モデリングは、72位のアスパラギンの存在が、天然の野生型IFNα−7タンパク質の構造及び機能の重大な修飾に関与していることを推測する。特に、この突然変異は、IFNα−7の、その受容体に対する親和性を変化させるようである。
【0045】
コンピューターによる分子モデリングは、成熟突然変異タンパク質上の突然変異F116Sが、ヘリックスDの若干の摂動をもたらすが、ショートヘリックス(E40−D44)のレベルでのABループの構造的修飾ももたらすことを示す。このショートヘリックス内に位置する42位のグルタミン酸の配向は、当該突然変異に起因して修飾される。
【0046】
F116Sの最も重要な効果は、IFNα−7構造の内側にあるフェニルアラニンのネットワークによって生じるπスタック効果が弱いことであり、これは恐らく、タンパク質構造のより高い柔軟性をもたらす。
【0047】
116位のフェニルアラニンのペプチド骨格の窒素原子と、114位のグルタミン酸のカルボニル基の酸素原子との間の水素結合は保存される。
【0048】
その結果、当該突然変異タンパク質は、天然の野生型IFNα−7タンパク質と異なる三次元の高次構造を有する。
【0049】
したがって、コンピューターによる分子モデリングは、116位のセリンの存在が、天然の野生型IFNα−7の構造及び機能の重大な修飾に関与すると推測する。
【0050】
コンピューターによる分子モデリングは、成熟突然変異タンパク質上のR121Kの突然変異が、ヘリックスDの高次構造の若干の摂動をもたらすことを示す。
【0051】
アミノ酸L118,K122,Q125及びF124の側鎖の配向は、当該突然変異によって修飾される。
【0052】
更に、IFNα−2のR121残基(IFNα−7のR120に等しい)は、インターフェロンの抗ウイルス活性にとって重要であろうことが証明されてきた(Weber H, Valenzuela D, Lujber G, Gubler M, Weissmann C.; "Single amino acid changes that render human IFN alpha 2 biologically active on mouse cells". (1987) EMBO J. 6:591-598)。
【0053】
このように、当該突然変異タンパク質は、天然の野生型IFNα−7と異なる三次元の高次構造を有する。
【0054】
したがって、コンピューターによる分子モデリングは、121位にあるリジンの存在が、天然の野生型IFNα−7タンパク質の構造及び機能の重大な修飾に関与すると推測する。
【0055】
コンピューターによる分子モデリングは、成熟突然変異タンパク質上のK159Qの突然変異が、ヘリックスEの後ろにあるループの障害をもたらし、この効果は、当該タンパク質のC末端まで続くことを示す。ヘリックスBの直前に位置するループも、Q149残基のレベルで修飾される。
【0056】
リジン159の窒素原子とスレオニン156のカルボニル基の酸素原子との間の水素架橋(C末端のループを有するヘリックスEの末端)も抑制される。
【0057】
159位にあるリジン(K)が、インターフェロンのC末端部分の抗ウイルス活性に影響を及ぼしうると考えられている(Chang NT, Kung HF, Pestka S.;"Synthesis of a human leukocyte interferon with a modified carboxy terminus in Escherichia coli." Arch. Biochem. Biophys. (1983) 221:585-589)。
【0058】
このように、当該突然変異タンパク質は、天然の野生型IFNα−7タンパク質と異なる三次元の高次構造を有する。
【0059】
したがって、コンピューターによる分子モデリングは、159位にあるグルタミンの存在が、天然の野生型IFNα−7タンパク質の構造及び機能の重大な修飾に関与すると推測する。
【0060】
本発明に従う他のSNP、すなわち、a559c,g580a,c667t,c682t,g1125a,g1161a,及びa1212gは、アミノ酸配列である配列番号2のレベルで、IFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の修飾に関与しない。
【0061】
SNP g1125a,g1161a,a1212gはサイレントであり、そしてSNP a559c,g580a,c667t,c682tは非コード領域である。
【0062】
事実、サイレントSNP g1125aは、アミノ酸配列である配列番号2上の125位にあるアミノ酸、グルタミン(Q)を修飾しない。サイレントSNP g1161aは、アミノ酸配列である配列番号2上の137位にあるアミノ酸、グルタミン酸(E)を修飾しない。同様に、サイレントSNP a1212gは、アミノ酸配列である配列番号2上の154位にあるアミノ酸、ロイシン(L)を修飾しない。
【0063】
本発明に従うポリヌクレオチドの遺伝子型判定は、個体群におけるこれらのポリヌクレオチドの対立遺伝子頻度を決定するように実施されうる。遺伝子型判定の例は、以後の実験的な項目において示す。
【0064】
本発明のポリペプチドの機能性の決定は、それらの生物学的活性の試験によって等しく実施されうる。
【0065】
これに関して、例えば、シグナル伝達、樹状細胞の成熟、CD4+又はCD8+Tリンパ球によるサイトカイン放出、単球によるサイトカイン放出、in vitro又はin vivoでの抗ウイルス活性、悪性フレンド赤白血病細胞をあらかじめ接種されたマウスにおける抗腫瘍活性、Daudi Burkitt's細胞系に対する細胞性の抗増殖活性、本発明に従うポリペプチドのTF−1細胞系に対する細胞性の抗増殖活性を測定し、そして野生型IFNα−7、又は市販品の代表として選択された野生型IFNα−2と比較することが可能である。
【0066】
本発明はまた、特に、あるヒトの障害及び/又は疾患の予防及び治療のための、本発明に従うポリヌクレオチド及びポリペプチド並びにこれらのポリヌクレオチド及びポリペプチドから出発して得られ、そして/あるいは同定された治療用分子の使用、という目的を有する。
【0067】
定義
「参照野生型遺伝子のヌクレオチド配列」とは、ヒトIFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列、配列番号1であると理解される。
【0068】
この配列は、GenBankにおいて、アクセッション番号X02960のもとアクセス可能であり、そして
- Olopade, O. I. ; Bohlander, S. K.;Pomykala, H.; Maltepe, E.; Van Melle, E.; Le Beau, M. M.; Diaz, M.O. :"Mapping of the shortest region of overlap of deletions of the short arm of chromosome 9 associated with humanneoplasia." ; Genomics 14: 437443,1992.
- Henco K, Brosius J, Fujisawa A, Fujisawa JI, Haynes JR, Hochstadt J,Kovacic T, Pasek M,Schambock A, Schmid J, et al. :"Structural relationship of human interferon alpha genes andpseudogenes." ; J Mol Biol 1985 Sep 20; 185 (2): 227-60.
- Ullrich A, Gray A, Goeddel DV, Dull TJ:"Nucleotide sequence of a portion of human chromosome 9 containing a leukocyte interferon gene cluster." ; J Mol. Biol. 1982 Apr 15 ; 156 (3): 467-86.
に記載されている。
【0069】
「天然野生型IFNα−7タンパク質」又は「野生型IFNα−7タンパク質」とは、参照野生型IFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされる成熟タンパク質であると理解される。天然野生型未成熟タンパク質IFNα−7は、配列番号2で示されるペプチド配列に相当する。
【0070】
「ポリヌクレオチド」とは、修飾型又は非修飾型DNA又はRNAであり得るポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドであると理解される。
【0071】
用語ポリヌクレオチドは、例えば一本鎖又は二本鎖DNA、1又は複数の一本鎖領域及び1又は複数の二本鎖領域の混合物から成るDNA、一本鎖又は二本鎖RNA並びに1又は複数の一本鎖領域及び1又は複数の二本鎖領域の混合物から成るRNAを含む。用語ポリヌクレオチドは、更に1又は複数の三本鎖領域を含むRNA及び/又はDNAを含むこともある。ポリヌクレオチドとは、安定性の理由又は他の理由のために修飾された骨格を有する様な方法で修飾された1又は複数の塩基を含むDNA及びRNAであると等しく理解される。修飾された塩基とは、例えば異常な塩基、例えばイノシンであると理解される。
【0072】
「ポリペプチド」とは、例えば同じペプチドの場合には通常の又は修飾されたペプチド結合によって、互いに連結した、少なくとも2つのアミノ酸を含んで成るペプチド、オリゴペプチド、オリゴマー又はタンパク質であると理解される。
【0073】
ポリペプチドは、遺伝コードによって定義される、20アミノ酸以外のアミノ酸から成ることがある。ポリペプチドはまた、当業者に周知の、天然の過程、例えば翻訳後成熟過程又は化学的過程によって修飾されたアミノ酸から成ることもある。その様な修飾は文献において完全に詳述されている。これらの修飾は、ポリペプチド、ペプチド骨格、アミノ酸鎖において、又は例えカルボキシ末端若しくはアミノ末端であっても、いずれかに出現し得る。
【0074】
ポリペプチドはユビキチン結合後に枝分かれするか、あるいは枝分かれしながら又は枝分かれせずに環状化することがある。このタイプの修飾は、当業者に周知の天然又は合成翻訳後過程の結果であり得る。
【0075】
例えば、ポリペプチドの修飾は、アセチル化、アシル化、ADPリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘムの共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、共有又は非共有架橋、還化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、システイン形成、ピログルタミン酸塩形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解過程、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セネロイル化(seneloylation)、硫酸化、アミノ酸付加、例えばアルギニル化又はユビキチン結合を含むことがある。その様な修飾は文献:PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T.E. Creighton, New York, 1993, POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C.Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983, Seifter et al.“Analysisfor protein modifications and nonprotein cofactors”, Meth. Enzymol. (1990) 182 : 626-646, and Rattan et al.“Protein Synthesis : Post-translational Modifications and Aging”, Ann NY Acad Sci (1992) 663 : 48-62、において十分に詳述されている。
【0076】
「単離されたポリヌクレオチド」又は「単離されたポリペプチド」とは、例えば上文で限定した様な、ヒトの身体から単離され、又はさもなければ技術的手法によって産生されるポリヌクレオチド又はポリペプチドであると理解される。
【0077】
「同一性」とは、ヌクレオチド又はポリペプチド配列の同一性の測定値であると理解される。
【0078】
同一性は当業者にとって周知の用語であり、そして文献に詳細に記載されている。COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M., Ed., Oxford UniversityPress, New York, 1998 ; BIOCOMPUTING INFORMATICS AND GENOME PROJECT, Smith, D.W., Ed., Academic Press, New York, 1993 ; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A.M. and Griffin H.G., Ed, Humana Press, New Jersey, 1994 ; and SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje,G., Academic Press, 1987を参照のこと。
【0079】
2つの配列間の同一性及び類似性を決定するために一般的に利用される方法も、文献において詳細に記載されている。GUIDE TO HUGE COMPUTER, Martin J. Bishop, Ed, Academic Press, San Diego, 1994, and Carillo H. and Lipton D.,Siam J Applied Math (1988) 48 : 1073を参照のこと。
【0080】
例えば、ヌクレオチド配列である配列番号1と少なくとも95%の同一性を有するポリペプチドは、前記配列と比較して、100ヌクレオチドの範囲に多くても5個所の突然変異を含むポリヌクレオチドである。
【0081】
これらの突然変異の個所は、1(又は複数)のヌクレオチドの1(又は複数)の置換、付加及び/又は欠失であってもよい。
【0082】
同様に、例えば、アミノ酸配列である配列番号2と少なくとも95%の同一性を有するポリペプチドは、前記配列と比較して、100ヌクレオチドの範囲に多くても5個所の突然変異を含むポリペプチドである。
【0083】
これらの突然変異の個所は、1(又は複数)のアミノ酸の1(又は複数)の置換、付加及び/又は欠失であってもよい。
【0084】
本発明のSNPのうち少なくとも1つを含む、ヌクレオチド配列である配列番号1又はアミノ酸配列である配列番号2とそれぞれ完全には同一ではない、本発明に従うポリヌクレオチド及びポリペプチドは、これらの配列の変異体とみなされる。
【0085】
通常、本発明に従うポリペプチドは、本発明のSNPのうち少なくとも1つを含んで成るヌクレオチド配列、配列番号1と、同一又は事実上同一の生物活性を有する。
【0086】
同様に、本発明に従うポリペプチドは通常、本発明のコードSNPのうち少なくとも1つを含んで成るアミノ酸配列、配列番号2と同一又は事実上同一の生物活性を有する。
【0087】
本発明に従う変異体は、例えば部位指定突然変異導入法又は直接合成によって得ることができる。
【0088】
「SNP」とは、ヌクレオチド配列における塩基の何らかの天然の変異であると理解される。ヌクレオチド配列のSNPは、コード、サイレント又は非コードであってもよい。
【0089】
コードSNPは、このヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列における1又は複数のアミノ酸の修飾に関与するコード配列における多型である。この場合、用語SNPは、拡大解釈すれば、アミノ酸配列中の突然変異にも適用される。
【0090】
サイレントSNPは、このヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列におけるアミノ酸の修飾に全く関与しないヌクレオチド配列のコード配列における多型である。
【0091】
非コードSNPは、ヌクレオチド配列の非コード配列における多型である。この多型は、特にイントロン、スプライシング領域、転写プロモーター又はエンハンサー部位の配列において見られる。
【0092】
「機能的SNP」とは、上文で限定した様な、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列に含まれ、そしていくつかの機能を有するSNPであると理解される。
【0093】
「機能性」とは、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの生物活性であると理解される。
【0094】
本発明に従うポリペプチド又はポリヌクレオチドの機能性は、野生型参照遺伝子のヌクレオチド配列又はこの後述するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの生物活性の保存、増大、減少又は抑制に存することもある。
【0095】
本発明に従うポリペプチド又はポリヌクレオチドの機能性は、同様に参照野生型遺伝子のヌクレオチド配列又はこの後述するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの生物活性の性質における変化から成るともいえる。
【0096】
生物活性は、特に本発明に従うポリペプチドと受容体との親和性又は親和性の不在と関連していることがある。
【0097】
ポリヌクレオチド
本発明は、
a)配列番号1の配列又はそのコード配列(ヌクレオチド751〜ヌクレオチド1320)との少なくとも80%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性、更に好ましくは少なくとも95%の同一性、そしてより更に好ましくは少なくとも99%の同一性を有するヌクレオチド配列であって、以下のコードSNP:t779c,g1033a,c1084a,g1135t,t1166c,g1181a,a1294cのうちの少なくとも1つを含んで成ると解されるヌクレオチド配列、あるいは
b)a)のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド配列を第一の目的とする。
【0098】
当然のことながら、本発明の意味において、番号付けは、ヌクレオチド配列である配列番号1のSNPの位置に相当している。
【0099】
本発明は同様に、
a)配列番号1の配列又はそのコード配列であって、それぞれが以下のコードSNP:t779c,g1033a,c1084a,g1135t,t1166c,g1181a,a1294cのうちの少なくとも1つを含んで成ると解されるもの、あるいは
b)a)のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
を含んで成る、単離されたポリヌクレオチドに関する。
【0100】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号1の配列又はそのコード配列であって、これらの配列のそれぞれが、以下のコードSNP:t779c,g1033a,c1084a,g1135t,t1166c,g1181a,a1294cのうちの少なくとも1つを含んで成ると理解されるものから成る。
【0101】
本発明によると、前文で限定したポリヌクレオチドは、t779c,g1033a,c1084a,g1135t,t1166c,g1181a,及びa1294cから成る群から選択される単一のコードSNPを含んで成る。
【0102】
更に好ましくは、前文で限定したポリヌクレオチドは、コードSNPg1033aを含んで成る。
【0103】
前文で限定したようなポリヌクレオチドは、同様に、以下の非コード及びサイレントSNP:a559c,g580a,c667t,c682t,g1125a,g1161a,及びa1212g、のうちの少なくとも1つを含むことがある。
【0104】
本発明はまた、a)ヌクレオチド配列である配列番号1又は、必要によりそのコード配列、であって、それぞれ以下の非コード又はサイレントSNP:a559c,g580a,c667t,c682t,g1125a,g1161a,及びa1212g、のうちの少なくとも1つを含んで成ると解されるもの;あるいは
b)a)のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、
を含んで成る、又はそれらから成る、単離されたポリヌクレオチドを第一の目的とする。
【0105】
当然ながら、以下のサイレントSNP g1125a,g1161a,a1212gのみがヌクレオチド配列である配列番号1のコード配列中に位置する。
【0106】
本発明はまた、a)ヌクレオチド配列である配列番号1又はそのコード配列であって、それぞれ以下のSNP:a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,a1212g,及びa1294c、のうちの少なくとも1つを含んで成ると解されるもの、あるいは
b)a)のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、
の一部から成る単離されたポリヌクレオチドであって、少なくとも10個のヌクレオチドから構成される単離されたポリヌクレオチド、に関する。
【0107】
好ましくは、上文で定義した様な単離されたポリヌクレオチドは10〜40個のヌクレオチドから構成される。
【0108】
本発明はまた、
a)ヌクレオチド配列である配列番号1の全部又は一部であって、但し、そのようなヌクレオチド配列、又は配列の一部が、a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,及びa1212gから成る群から選択される少なくとも1つのSNPを含んで成るもの、あるいは
b)a)のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、
を含んで成る、単離されたポリヌクレオチドに関する。
【0109】
上文で限定したような、単離されたヌクレオチド配列は、少なくとも10個のヌクレオチド、そして好ましくは10〜40個のヌクレオチドから構成される。
【0110】
本発明によると、前文で限定したポリヌクレオチドは、t779c,g1033a,c1084a,g1135t,t1166c,g1181a,及びa1294cから成る群から選択される単一のコードSNPを含んで成る。
【0111】
更に好ましくは、前文で限定したポリヌクレオチドは、コードSNPg1033aを含んで成る。
【0112】
本発明はまた、
a)アミノ酸配列である配列番号2;又は
b)アミノ酸配列である配列番号2の24〜189位の間に含まれるアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列、
の全部又は一部を含んで成るポリペプチドであって、
以下のコードSNP:V10A,D95N,L112I,V129L,F139S,R144K,及びK182Qのうちの少なくとも1つを含んで成るアミノ酸配列を有すると解されるもの、をコードする、単離されたポリヌクレオチドをその目的とする。
【0113】
当然ながら、本発明の意味においては、V10A,D95N,L112I,V129L,F139S,R144K,及びK182Qの位置に相当する番号付けは、アミノ酸配列である配列番号2の番号付けに相当する。
【0114】
本発明の好ましい目的よると、前文で限定したポリペプチドは、上文で限定したような単一のコードSNPを含んで成る。
【0115】
更に好ましくは、本発明に従う単離されたポリヌクレオチドは、アミノ酸配列である配列番号2の全部又は一部を含んで成り、そしてコードSNP D95Nを有するポリペプチドをコードする。
【0116】
好ましくは、本発明に従うポリヌクレオチドは、DNA又はRNA分子から構成される。
【0117】
本発明に従うポリヌクレオチドは、標準的なDNA又はRNA合成法によって得ることができる。
【0118】
本発明に従うポリヌクレオチドはまた、ヌクレオチド配列である配列番号1上の各SNPにつき変異したヌクレオチドによって野生型ヌクレオチドを修飾することによって、IFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列から出発する、部位指定突然変異導入法によって得ることができる。
【0119】
例えば、SNP g1033aを含んで成る、本発明に従うポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列である配列番号1の1033位にあるヌクレオチド、グアニンをアデニンによって修飾することによって、IFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列から出発する、部位指定突然変異導入法によって得ることができる。
【0120】
この様に実施され得る部位指定突然変異導入法の過程は当業者にとって周知であり、刊行物であるTA Kunkelの、1985年の「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」82: 488を参照のこと。
【0121】
単離されたポリヌクレオチドはまた、例えば、プレ、プロ又はプレ−プロタンパク質のアミノ酸配列又はマーカーアミノ酸配列、例えばヘキサヒスチジンペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことがある。
【0122】
本発明のポリヌクレオチドはまた、融合タンパク質又は他の精製産物を得るために、他のタンパク質又はタンパク質フラグメントをコードするヌクレオチド配列を伴うこともある。
【0123】
本発明に従うポリヌクレオチドはまた、ヌクレオチド配列、例えば5′及び/又は3′非コード配列、例えば転写又は非転写配列、翻訳又は非翻訳配列、スプライシングシグナル配列、ポリアデニル化配列、リボソーム結合配列あるいはmRNAを安定化する配列でさえも含むことがある。
【0124】
前記ヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、このヌクレオチド配列とハイブリダイズし得るものと定義される。
【0125】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、ヌクレオチド配列が少なくとも80%、好ましくは90%以上、より更に好ましくは95%以上、そして最も好ましくは97%以上の同一性を有する場合にのみハイブリダイゼーションを可能にする化学条件であると広く理解されるが必ずしもそうではない。
【0126】
ストリンジェントな条件は、当業者にとって周知な方法に従い、例えば50%ホルムアミド、5×SSC(150mMのNaCl,15mMのクエン酸三ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH=7.6)、5×デンハルト溶液、10%硫酸デキストラン及び20μgの変性サケ精子DNAを含んで成る溶液中での、42℃での前記ポリヌクレオチドのインキュベーション、続く0.1×SSC、65℃でのフィルターの洗浄によって得ることができる。
【0127】
本発明の範囲において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のみが、100%に等しい同一性を有するヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを可能にする場合、ヌクレオチド配列は、a)において記載した様なヌクレオチド配列と厳密に相補的であると考えられる。
【0128】
当然のことながら、本発明の意味において、ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチドは、本発明に従う少なくとも1つのアンチセンスSNPを含んで成る。
【0129】
従って、例えば、前記ヌクレオチド配列がSNP g1033aを含んで成る場合、その相補ヌクレオチド配列は、1033位と同等の位置にチミン(t)を含んで成る。
【0130】
SNPを含んで成るポリヌクレオチドの同定、ハイブリダイゼーション及び/又は増幅
本発明はまた、a)ヌクレオチド配列である配列番号1と80〜100%の同一性(好ましくは少なくとも90%の同一性、更に好ましくは95%の同一性、そして特に100%の同一性)を有するポリヌクレオチド、及び/又はb)少なくとも1つのSNPを含んで成る、本発明に従うポリヌクレオチド、の全部又は一部の使用であって、ヌクレオチド配列である配列番号1又は、必要によりそのコード配列(ヌクレオチド751〜ヌクレオチド1320)と80〜100%の同一性(好ましくは少なくとも90%の同一性、更に好ましくは95%の同一性、そして特に100%の同一性)を有するポリヌクレオチドの全部又は一部を同定し、ハイブリダイズし、そして/あるいは増幅するための使用であって、これらの配列のそれぞれが以下のSNP:a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,a1212g,及びa1294c、のうちの少なくとも1つを含むと解される、使用、をその目的とする。
【0131】
本発明はまた、ヌクレオチド配列である配列番号1と80〜100%の同一性を有するポリヌクレオチドの全部又は一部を同定し、あるいは増幅する方法であって、適当なハイブリダイゼーション条件下で、前記ポリヌクレオチドを本発明に従うポリヌクレオチドとハイブリダイズさせることを含んで成る方法、に関する。
【0132】
遺伝子型判定及びSNPの頻度の決定
本発明はまた:
a)ヌクレオチド配列である配列番号1と80〜100%の同一性(好ましくは少なくとも90%の同一性、更に好ましくは95%の同一性、そして特に100%の同一性)を有するポリヌクレオチド、及び/又は
b)少なくとも1つのSNPを含んで成る、本発明に従うポリヌクレオチド、
の全部又は一部の使用であって、
配列番号1又は必要によりそのコード配列(ヌクレオチド751〜ヌクレオチド1320)と80〜100%の同一性(好ましくは少なくとも90%の同一性、更に好ましくは95%の同一性、そして特に100%の同一性)を有するポリヌクレオチドの全部又は一部の遺伝子型判定のための使用であって、これらの配列のそれぞれが、以下のSNP:a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,a1212g,及びa1294c、のうちの少なくとも1つを含んで成ると解される、使用をその目的とする。
【0133】
本発明はまた、ヌクレオチド配列である配列番号1と80〜100%の同一性を有するポリヌクレオチドの全部又は一部を遺伝子型判定するための方法であって、対象者又は対象者群のゲノムDNAの注目の領域を増幅し、そして559,580,667,682,779,1033,1084,1125,1135,1161,1166,1181,及び1212から成る群から選択される、ヌクレオチド配列である配列番号1中の少なくとも1つの位置の対立遺伝子を決定する段階、を含んで成る方法に関する。
【0134】
本発明によれば、遺伝子型判定は、個体又は個体群で行われうる。
【0135】
本発明の意義の範囲内で、遺伝子型判定は個体又は個体群の遺伝子型の決定のための方法として定義される。遺伝子型は、1又は複数の特異的な遺伝子座に存在する対立遺伝子から成る。
【0136】
「個体群」とは、ランダムな方法又はランダムでない方法で選択された、個体の一群であると解される。これらの個体はヒト、動物、微生物又は植物であってもよい。
【0137】
通常、個体群は少なくとも10の個体、好ましくは100〜300の個体含んで成る。
【0138】
個体は、それらの民族性に従い、又はそれらの表現型に従い、特に以下の障害及び/又は疾患によって影響を受けるものが選択され得る:ガン腫、黒色腫、リンパ腫、白血病並びに、肝臓、首、頭及び腎臓のガン、心臓血管疾患、代謝病、例えば非免疫関連疾患、例えば肥満、感染症、特にウイルス感染、例えばB型及びC型肝炎並びにエイズ、感染性肺炎、潰瘍性大腸炎、中枢神経系の疾患、例えばアルツハイマー病、統合失調症及びうつ病、組織又は器官移植の拒絶、創傷治癒、透析されている患者の貧血、喘息、多発性硬化症、骨粗しょう症、乾癬、リウマチ様関節炎、クローン病、自己免疫疾患及び障害、胃腸疾患又は化学療法と関連した疾患。
【0139】
本発明に従う機能的SNPは、好ましくは個体群において遺伝子型判定される。
【0140】
SNPを遺伝子型判定するために実施され得る多くの方法が存在している(例えば、Kwok Pharmacogenomics, 2000, vol 1, 95-100.“High-throughput genotyping assay approaches”)。これらの技術は4つの以下の原理のうちの1つに基づいている:対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、任意にデオキシヌクレオチドの存在下でのジデオキシヌクレオチドによるオリゴヌクレオチドの伸長、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのライゲーション又は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの開裂。これらの技術のいずれか一つが、検出系、例えば直接的な又は偏光した蛍光の測定、あるいは質量分析と組み合わせられ得る。
【0141】
遺伝子型判定は、特に偏光型蛍光スキャナーと一緒に、放射性ddNTP(異なるフルオロフォアによって標識された2つの異なるddNTP)及び非放射性ddNTP(2つの異なる非標識型ddNTP)を用いたミニシークエンスによって実施され得る。偏光型蛍光の読み込みによるミニシークエンスのプロトコール(FP−TDI技術又は蛍光偏光鋳型直接ダイターミネーター取り込み(FluorescencePolarization Template-direct Dye-Terminator Incorporation))は当業者にとって周知である。
【0142】
それは、各個体のDNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅後に得られる産物で実施され得る。このPCR産物は、研究されたSNPを含むポリヌクレオチドの遺伝子領域を網羅するために選択される。PCRサーモサイクラーにおける最後の段階の後、続いて、フルオロフォア特異的励起及び放射フィルターを用いることによる標識された塩基の読み込みのために、偏光型蛍光スキャナー上にプレートが据えられる。標識された塩基の強度の値はグラフ上に記される。
【0143】
PCR増幅に関して、本発明のSNPの場合、センス及びアンチセンスプライマーはそれぞれ、1又は複数のSNPを含む注目の領域を増幅するために、本発明のSNPの位置に従い、当業者によって容易に選択され得る。
【0144】
例えば、IFNα−7のコード配列を含んで成るヌクレオチド配列のPCR増幅に使用されるプライマーに相当するセンス及びアンチセンスのヌクレオチド配列は、それぞれ:
配列番号3:センスプライマー:TACCCACCTCAGGTAGCC
配列番号4:アンチセンスプライマー:CATGAAAGTGTGAGATGATGC
であってもよい。
【0145】
これらのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列である配列番号1におけるヌクレオチド711からヌクレオチド1379の、669ヌクレオチドの長さを有するフラグメントの増幅を可能にする。
【0146】
個体群におけるSNPを含んで成る遺伝子によってコードされる各対立遺伝子の頻度(対立遺伝子頻度)の統計解析が続いて行われ、これは、異なる亜集団、そして特に、必要によりこの個体群を構成する多様な民族集団、におけるそれらの影響及びそれらの分布の重要性の決定を可能にする。
【0147】
遺伝子型判定のデータは、研究された群において観察された、異なる対立遺伝子の分布頻度を推定するために解析される。対立遺伝子頻度の計算は、ソフトウェア、例えばSAS−suite(商標)(SAS)又はSPLUS(商標)(MathSoft)を用いて実施され得る。個体群における異なる民族性の集団に及ぶ本発明のSNPの対立遺伝子分布の比較は、ソフトウェア、例えばARLEQUIN(商標)及びSAS−suite(商標)によって実施され得る。
【0148】
遺伝子マーカーとしての本発明のSNP
遺伝子の機能配列(例えばプロモーター、スプライシング部位、コード領域)を修飾するSNPは疾患の感受性又は抵抗性と直接関連すると思われるが、全てのSNP(機能的又は非機能的)がこれらの疾患の状態に関与する1又は複数の遺伝子の同定にとって価値のあるマーカーを提供することが可能であり、そしてこの結果、これらの疾患の状態と間接的に関連するであろう(Cargill et al. (1999). Nature Genetics 22 : 231-238 ; Riley et al. (2000). Phermacogenomics 1 : 39-47 ; Roberts L. (2000). Science 287 : 1898-1899を参照のこと)。
【0149】
この様に、本発明はまた、IFNα−7遺伝子のポリヌクレオチドにおける以下のSNP:a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,a1212g,及びa1294c、のうちの少なくとも1つを含んで成るデータバンクに関する。
【0150】
更に当然のことながら、前記SNPはヌクレオチド配列である配列番号1に従い番号が付けられている。
【0151】
このデータバンクは、
(i)IFNα−7遺伝子のポリヌクレオチド内の、以下のSNP:a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,a1212g,及びa1294cのうちの少なくとも1つと、
(ii)疾患又は疾患に対する抵抗性、
との間の統計学的に関連している関係を決定するために解析されうる。
【0152】
本発明はまた、疾患又は疾患に対する抵抗性のための診断/予後のキットを開発するための、IFNα−7遺伝子のポリヌクレオチドにおける以下のSNP:a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,a1212g,及びa1294cのうちの少なくとも1つの使用に関する。
【0153】
本発明のSNP、例えば上述したものは、疾患又は疾患に対する抵抗性と直接又は間接的に関連することがある。
【0154】
好ましくは、これらの疾患は上文で言及した様に定義されるものであってもよい。
【0155】
本発明はまた、IFN□−7遺伝子内の、a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,a1212g,及びa1294cから成る群から選択される少なくとも1つのSNPと、疾患又は疾患に対する抵抗性、との間の統計的に関連している関係を決定するための方法であって、
a)個体群を遺伝子型判定し、
b)前記個体群内の前記疾患又は疾患に対する抵抗性の分布を決定し、
c)遺伝子型のデータと、前記疾患又は疾患に対する抵抗性とを比較し、そして
d)前記比較を統計的に関連している関係について解析すること、
を含んで成る方法に関する。
【0156】
本発明はまた、疾患の予後又は疾患に対する抵抗性を診断し、又は決定するための方法であって、IFN□−7遺伝子内の、a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,a1212g,及びa1294cから成る群から選択される少なくとも1つのSNPを検出することを含んで成る方法に関する。
【0157】
本発明のSNPの検出は、下文に記載するような当業者に周知の方法によって実施されうる。
【0158】
本発明の少なくとも1つのSNPの検出は、研究される対象者由来の生体試料、例えば細胞、血液、尿、唾液から出発して、あるいは研究される対象者の生検又は部検から出発して実施されうる。ゲノムDNAは、例えば、直接的に又はPCR増幅後に検出に使用されうる。RNA又はcDNAも同様に使用されうる。
【0159】
その結果、対象者から単離されたポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を、本発明の少なくとも1つのSNPを含んで成るポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と比較することができる。
【0160】
上記ヌクレオチド配列の比較は、配列決定によって、DNAハイブリダイゼーション法によって、変性剤を用いる又は用いない、電気泳動ゲル上でのDNAフラグメントの移動度の差異によって、あるいは融解温度の差異によって実施されうる。Myers et al., Science (1985) 230:1242を参照のこと。正確な点での当該ヌクレオチド配列構造のそのような修飾も、ヌクレアーゼ保護試験、例えばリボヌクレアーゼ及びS1ヌクレアーゼによって、又は化学開裂剤によっても明らかとなりうる。Cotton et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1985) 85:4397-4401を参照のこと。DNAハイブリダイゼーション法と酵素消化の組み合わせも、インベーダーアッセイの場合のように使用されうる。本発明のポリヌクレオチドフラグメントを含んで成るオリゴヌクレオチドプローブも、当該スクリーニングを実施するために使用されうる。
【0161】
発現ベクター及び宿主細胞
本発明はまた、本発明に従う少なくとも1つのポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクターをその目的とする。
【0162】
多くの発現系、例えば、限定しないが染色体、エピソーム、誘導型ウイルスが使用され得る。更に具体的には、使用される組換えベクターは細菌性プラスミド、トランスポゾン、酵母のエピソーム、挿入因子、酵母染色体因子、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パピローマウイルス、例えばSV40、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、キツネポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルスから誘導されることもある。
【0163】
これらの組換えベクターはまた、コスミド又はファージミド誘導体であってもよい。ヌクレオチド配列は、当業者にとって周知な方法、例えばMOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Sambrook et al., 4th Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001に記載のものによって、組換え発現ベクター内に挿入され得る。
【0164】
組換えベクターは、ポリヌクレオチド発現の制御を調節するヌクレオチド配列並びに本発明のポリヌクレオチドの発現及び転写並びに本発明のポリペプチドの翻訳を可能にするヌクレオチド配列を含むことがあり、これらの配列は使用される宿主細胞に従い選択される。
【0165】
従って、例えば適切な分泌シグナルが前記組換えベクターに組み込まれることがあり、その結果、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、小胞体の内腔に向かって、細胞膜周辺腔に向かって、膜上に、又は細胞外環境に向かって、方向づけられるであろう。
【0166】
本発明はまた、本発明に従う組換えベクターを含んで成る宿主細胞をその目的とする。
【0167】
宿主細胞内への組換えベクターの導入は、当業者にとって周知な方法、例えばBASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davis et al., 1986及びMOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL(上記)に記載のもの、例えばリン酸カルシウムによるトランスフェクション、DEAEデキストランによるトランスフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン性脂質によるトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入又は感染、に従い実施され得る。
【0168】
宿主細胞は、細菌細胞、例えばストレプトコッカス(Streptococci)、スタフィロコッカス(Staphylococci)、E.コリ(Coli)又はバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)の細胞、真菌の細胞、例えば酵母細胞及びアスペルギルス(Aspergillus)、ストレプトマイセス(Streptomyces)の細胞、昆虫細胞、例えばショウジョウバエ S2及びスポドプテラ(Spodoptera)Sf9の細胞、動物細胞、例えばCHO,COS,HeLa,C127,BHK,HEK 293細胞及び処置すべき対象のヒト細胞であっても、又は植物細胞でもよい。
【0169】
宿主細胞は、例えば後文で明らかとなる様に、本発明のポリペプチドを発現させるために、又は医薬組成物中の活性産物として使用され得る。
【0170】
ポリペプチド
本発明はまた:
a)配列番号2のアミノ酸配列、又は
b)配列番号2のアミノ酸配列の24〜189位の間に含まれるアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列、
の全部又は一部と少なくとも80%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性、更に好ましくは少なくとも95%の同一性、そしてより更に好ましくは少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチドであって、以下のコードSNP:V10A,D95N,L112I,V129L,F139S,R144K,及びK182Qのうちの少なくとも1つを含むと解されるポリペプチド、をその目的とする。
【0171】
本発明のポリペプチドはまた:
a)配列番号2のアミノ酸配列、又は
b)配列番号2のアミノ酸配列の24〜189位の間に含まれるアミノ酸を含むアミノ酸配列、
の全部又は一部を含んで成り、前記ポリペプチドは、以下のコードSNP:V10A,D95N,L112I,V129L,F139S,R144K,K182Qのうちの少なくとも1つを含むと解される。
【0172】
本発明のポリペプチドは、更に具体的には:
a)配列番号2のアミノ酸配列、又は
b)配列番号2のアミノ酸配列の24〜189位の間に含まれるアミノ酸を含むアミノ酸配列、
の全部又は一部から成り、前記ポリペプチドは、以下のコードSNP:V10A,D95N,L112I,V129L,F139S,R144K,K182Qのうちの少なくとも1つを含むと解される。
【0173】
好ましくは、本発明に従うポリペプチドは、V10A,D95N,L112I,V129L,F139S,R144K,K182Qから成る群から選択される単一のコードSNPを含む。
【0174】
更に好ましくは、本発明に従うポリペプチドは、アミノ酸配列である配列番号2の24〜189のアミノ酸を含んで成り、且つコードSNP,D95Nを有する。
【0175】
本発明はまた、その目的のために上述のポリペプチドの調製方法を有し、ここで、上文で限定した宿主細胞が培養液中で培養され、そして前記ポリペプチドが当該培養液から単離される。
【0176】
ポリペプチドは、当業者にとって周知な方法、例えばカオトロピック剤、例えば塩、特に硫酸アンモニウム、エタノール、アセトン又はトリクロロ酢酸による沈澱、酸抽出;イオン交換クロマトグラフィー;ホスホセルロースクロマトグラフィー;疎水性相互作用クロマトグラフィー;親和性クロマトグラフィー;ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー又は排除クロマトグラフィーに従い、宿主細胞の培養液から出発して精製され得る。
【0177】
「培養液」とは、本発明のポリペプチドが単離され、又は精製される培地であると理解される。この培地は細胞外培地及び/又は細胞溶解物から構成され得る。当業者にとって周知な技術も、前記ポリペプチドの高次構造が単離又は精製の間に変化する場合に、後者のものが前記ポリペプチドの活性高次構造を生むことを可能にする。
【0178】
抗体
本発明はまた、免疫特異的抗体を得るための方法に関する。
【0179】
「抗体」とは、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、一本鎖及び/又はヒト化抗体並びにFabフラグメント、例えばFab又は免疫グロブリン発現ライブラリー産物であると理解される。
【0180】
免疫特異的抗体は、本発明に従うポリペプチドによる動物の免疫化によって得ることができる。
【0181】
本発明はまた、本発明に従うポリペプチド、例えば上文で限定したもののための免疫特異的抗体に関する。
【0182】
本発明に従うポリペプチド、そのフラグメントの1つ、類似体、その変異体の1つ又はこのポリペプチドを発現している細胞も、免疫特異的抗体を産生するために使用され得る。
【0183】
用語「免疫特異的」とは、抗体が、当業界で知られている他のポリペプチドよりも本発明のポリペプチドに対してより良い親和性を有することを意味する。
【0184】
免疫特異的抗体は、本発明のポリペプチド、そのフラグメントの1つ、類似体又はエピトープフラグメント又はこのポリペプチドを発現している細胞を、哺乳類、好ましくはヒト以外に、当業者にとって周知な方法に従い投与することによって得ることができる。
【0185】
モノクローナル抗体の調製に関して、抗体産生のための典型的な方法、例えばハイブリドーマ技術(Kohler et al., Nature (1975) 256 : 495-497)、トリオーマ技術、ヒトのB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4 : 72)及びEBVハイブリドーマ技術(Cole et al., "The EBV-hybridoma technique and its application to human lung cancer", Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (Vol. 27, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, New Series) (eds. R.A. Reisfeld and S.Sell), pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc. N.Y., 1985, pp. 77-96)が、細胞系から出発して使用され得る。
【0186】
一本鎖抗体の産生の技術、例えば米国特許第4,946,778号に記載のものも使用され得る。
【0187】
トランスジェニックな動物、例えばマウスも、ヒト化抗体を産生するのに使用され得る。
【0188】
本発明のポリペプチドと相互作用する物質
本発明はまた、試験される1又は複数の化合物の中から、本発明に従うポリペプチドの活性を活性化し、又は阻害する物質を同定するための方法であって、
a)少なくとも1つのコードSNPを含む、本発明に従うポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクターを含んで成る宿主細胞を提供し、
b)前記宿主細胞を試験される前記化合物と接触させ、
c)前記ポリペプチドの活性に対する活性又は阻害作用を決定し、それにより前記活性又は阻害物質を同定すること、
を含んで成る方法をその目的とする。
【0189】
本発明に従うポリペプチドはまた、それと相互作用する化合物をスクリーニングするために適用され得る。
【0190】
これらの化合物は、本発明に従うポリペプチドの固有の活性を活性化する物質(アゴニスト)又は阻害する物質(アンタゴニスト)であってもよい。これらの化合物はまた、本発明のポリペプチドのリガンド又は基質であってもよい。Coliganet al., Current Protocols in Immunology 1 (2), Chapter 5 (1991) を参照のこと。
【0191】
通常、その様な方法を実行するために、最初に本発明に従うポリペプチドを発現する適切な宿主細胞を生成することが望ましい。その様な細胞は、例えば哺乳類、酵母、昆虫、例えばショウジョウバエ又は細菌、例えばE.コリの細胞であってもよい。
【0192】
これらの細胞又はこれらの細胞の膜抽出物が、続いて試験され得る化合物の存在下に据えられる。
【0193】
本発明のポリペプチドとの、試験される化合物の結合能、並びに機能的応答の阻害又は活性化が続いて観察され得る。
【0194】
上述の方法の段階c)は、直接又は間接的に標識された、試験される物質を用いることによって実行され得る。それはまた、標識又は非標識物質及び標識競合物質を用いることによる競合試験を含むことがある。
【0195】
試験される物質が、検出されるシグナルに従い適切に選択された検出手段を用いることによって、本発明のポリペプチドを発現する細胞上で活性又は阻害シグナルを生じるか否かも決定され得る。
【0196】
その様な活性又は阻害物質はポリヌクレオチドであってもよく、そしてある場合にはオリゴヌクレオチド又はポリペプチド、例えばタンパク質又は抗体であってもよい。
【0197】
本発明はまた、試験される1又は複数の化合物の中から、本発明に従うポリペプチドによって増強され又は阻害される物質を同定するための方法であって:
a)少なくとも1つのコードSNPを含む、本発明に従うポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクターを含んで成る宿主細胞を提供し、
b)前記宿主細胞を試験される前記化合物と接触させ、
c)前記物質の活性に対する増強又は阻害作用を決定し、それによって前記増強又は阻害作用物質を同定すること、を含んで成る方法をその目的とする。
【0198】
本発明のポリペプチドによって増強され、又は阻害される物質は、それぞれ、このポリペプチドの存在下での活性化又は阻害によって応答する物質である。
【0199】
本発明のポリペプチドによって直接又は間接的に活性化され又は阻害される物質は、例えば膜結合型又は核受容体、キナーゼ及び更に好ましくはチロシンキナーゼ、転写因子又はポリヌクレオチドから成ることもある。
【0200】
疾患の検出
本発明はまた、対象者における、本発明に従うポリヌクレオチド及び/又は本発明に従うポリペプチドの生物学的特性を解析するための方法であって、以下の:
a)対象者のゲノムにおいて、本発明に従うポリヌクレオチドの有無を決定し、
b)対象者における、本発明に従うポリヌクレオチドの発現レベルを決定し、
c)対象者における、本発明に従うポリペプチドの有無を決定し、
d)対象者における、本発明に従うポリペプチドの濃度を決定し、そして/あるいは
e)対象者における、本発明に従うポリペプチドの機能性を決定すること、のうちの少なくとも1つを含んで成る方法をその目的とする。
【0201】
これらの生物学的特性は、対象者において、又は対象者由来の試料において解析され得る。
【0202】
これらの生物学的特性は、遺伝子診断を実施し、そして対象者が本発明に従うポリヌクレオチド及び/又は本発明に従うポリペプチドの存在と関連している疾患、軽い疾病又は障害の発生に対して影響を受けているか、又は影響を受ける危険性があるか、又は反対に、それに対する部分的な耐性があるか否かを決定することを可能にし得る。
【0203】
これらの疾患は、障害及び/又はヒトの疾患、例えばガン及び腫瘍、感染病、性病、免疫関連疾患及び/又は自己免疫疾患及び障害、心臓血管疾患、代謝病、中枢神経系の疾患、並びに化学療法に関連する障害、であってもよい。
【0204】
前記ガン及び腫瘍は、転移型腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、首、頭及び腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド性腫瘍及び免疫欠損後に出現する腫瘍であってエイズの場合にはカポジ肉腫を含んで成るもの、を含む。
【0205】
前記感染病は、慢性B型及びC型肝炎並びにHIV/エイズを含んで成るウイルス感染、感染性肺炎、及び性病、例えば生殖器疣、を含む。
【0206】
前記免疫関連疾患及び自己免疫疾患は、組織又は器官の移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含むことがある。
【0207】
前記代謝病は、肥満のような非免疫関連疾患を含むことがある。
【0208】
前記の中枢神経系の疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含むことがある。
【0209】
前記疾患及び障害はまた、創傷治癒、透析患者の貧血、及び骨粗鬆症を含むことがある。
【0210】
この方法はまた、対象者において、本発明に従うSNPによってコードされる変異対立遺伝子の存在と関連している疾患又は疾患に対する抵抗性の遺伝子診断を可能にする。
【0211】
好ましくは、段階a)において、既に限定した様な、少なくとも1つのコードSNPを含むポリヌクレオチドの有無が検出され得る。
【0212】
ポリヌクレオチドの検出は、研究され得る対象者由来の生物学的試料、例えば細胞、血液、尿、唾液から出発して、あるいは研究され得る対象者の生検又は部検から出発して実施され得る。ゲノムDNAは、例えば直接的に又はPCR増幅後に使用され得る。RNA又はcDNAも同様に使用され得る。
【0213】
この結果、本発明に従うポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を、対象者のゲノムにおいて検出されるヌクレオチド配列と比較することが可能となる。
【0214】
ヌクレオチド配列の比較は、配列決定によって、DNAハイブリダイゼーション法によって、変性剤を用いる、又は用いない、電気泳動ゲノム上でのDNAフラグメントの移動度の差異によって、あるいは融解温度の差異によって実施され得る。Myers et al., Science (1985) 230 : 1242 を参照のこと。ヌクレオチド配列の構造における正確な位置でのその様な修飾も、ヌクレアーゼ保護試験によって、例えばリボヌクレアーゼ及びS1ヌクレアーゼによって、又は更に化学開裂剤によって解明されることがある。Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 85 : 4397-4401 を参照のこと。本発明のポリヌクレオチドフラグメントを含んで成るオリゴヌクレオチドプローブはまた、スクリーニングを行うのにも使用され得る。
【0215】
当業者にとって周知の多くの方法が、本発明のポリヌクレオチドの発現を決定し、そしてこのポリヌクレオチドの遺伝的変異性を同定するために使用され得る(Chee et al., Science (1996), vol.274, pp610-613 を参照のこと。)
【0216】
段階b)において、ポリヌクレオチドの発現レベルは、当業者にとって周知な方法に従い、このポリヌクレオチドによってコードされる(そしてポリペプチドをコードする)RNAのレベルを定量することによって、例えばPCR、RT−PCR、リボヌクレアーゼ保護、ノーザンブロット、及び他のハイブリダイゼーション法によって、測定され得る。
【0217】
段階c)及びd)において、対象者又は対象者由来の試料における、本発明に従うポリペプチドの有無及び濃度が、周知の方法、例えば免疫放射アッセイ、競合的結合試験、ウェスタンブロット及びELISA試験によって実施され得る。
【0218】
段階d)に続いて、本発明に従うポリペプチドの決定された濃度は、対象者において通常見出される天然野生型タンパク質の濃度と比較され得る。
【0219】
当業者は、上文の様に起こる疾患、軽い疾病又は障害に対する感受性又は、反対に抵抗性が現れる、しきい値の上限又は下限を、従来技術の刊行物又は常用の試験若しくはアッセイ、例えば既に言及されているものの助けを借りて同定することができる。
【0220】
段階e)において、本発明に従うポリペプチドの機能の決定は、当業者にとって周知な方法によって、例えばin vitroでの試験、例えば上文で言及したものによって、又は前記ポリペプチドを発現する宿主細胞の使用によって実施され得る。
【0221】
本発明はまた、1又は複数の:本発明に従う、単離されたポリヌクレオチド;上文で限定した組換えベクター;上文で限定した宿主細胞;本発明に従うポリペプチド;上文で限定した抗体、を含んで成る診断キットをその目的とする。
【0222】
薬物及び疾患の処置
本発明は、活性物質の目的で、本発明に従うポリペプチドを含む治療化合物をその目的とする。
【0223】
本発明はまた、異なるヒトの障害及び/又は疾患の予防又は処置のための治療用化合物の製造のための、本発明に従うポリペプチドの使用にも関する。これらの疾患は、障害及び/又はヒトの疾患、例えばガン及び腫瘍、感染病、性病、免疫関連疾患及び/又は自己免疫疾患及び障害、心臓血管疾患、代謝病、中枢神経系の疾患、並びに化学療法に関連する障害、であってもよい。
【0224】
前記ガン及び腫瘍は、転移型腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、首、頭及び腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド性腫瘍及び免疫欠損後に出現する腫瘍であってエイズの場合にはカポジ肉腫を含んで成るもの、を含む。
【0225】
前記感染病は、慢性B型及びC型肝炎並びにHIV/エイズを含んで成るウイルス感染、感染性肺炎、及び性病、例えば生殖器疣、を含む。
【0226】
前記免疫関連疾患及び自己免疫疾患は、組織又は器官の移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含むことがある。
【0227】
前記代謝病は、肥満のような非免疫関連疾患を含むことがある。
【0228】
前記の中枢神経系の疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含むことがある。
【0229】
前記疾患及び障害はまた、創傷治癒、透析患者の貧血、及び骨粗鬆症を含むことがある。
【0230】
好ましくは、本発明に従うポリペプチドはまた、異なるヒトの障害及び/又は疾患、例えば、あるウイルス感染、例えば慢性B型及びC型肝炎、白血病、例えばヘアリー細胞白血病及び慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、カルチノイド性腫瘍、悪性黒色腫、転移型腎ガン、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫欠損後に出現する腫瘍、例えばエイズの場合にはカポジ肉腫、並びに生殖器疣又は性病、の予防又は処置を目的とする治療化合物の製造に使用されうる。
【0231】
本発明に従うポリペプチドを得ることを可能にする化合物及びこのポリペプチドによって得られ、又はこれから同定される化合物のいくつかは、同様にヒトの身体の治療的処置のために、すなわち治療化合物として使用され得る。
【0232】
このことが、本発明が更に活性物質の目的で少なくとも1つの上文で限定したコードSNP、上文で限定した組換えベクター、上文で限定した宿主細胞、及び/又は上文で限定した抗体を含む、本発明に従うポリヌクレオチドを含む薬物を目的とする理由である。
【0233】
本発明はまた、異なるヒトの障害及び/又は疾患の予防又は処置を目的とする薬物の製造のための、少なくとも1つの上文で限定したコードSNP、上文で限定した組換えベクター、上文で限定した宿主細胞、及び/又は上文で限定した抗体を含む、本発明に従うポリヌクレオチドの使用にも関する。これらの疾患は、障害及び/又はヒトの疾患、例えばガン及び腫瘍、感染病、性病、免疫関連疾患及び/又は自己免疫疾患及び障害、心臓血管疾患、代謝病、中枢神経系の疾患、並びに化学療法に関連する障害、であってもよい。
【0234】
前記ガン及び腫瘍は、転移型腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、首、頭及び腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド性腫瘍及び免疫欠損後に出現する腫瘍であってエイズの場合にはカポジ肉腫を含んで成るもの、を含む。
【0235】
前記感染病は、慢性B型及びC型肝炎並びにHIV/エイズを含んで成るウイルス感染、感染性肺炎、及び性病、例えば生殖器疣、を含む。
【0236】
前記免疫関連疾患及び自己免疫疾患は、組織又は器官の移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含むことがある。
【0237】
前記代謝病は、肥満のような非免疫関連疾患を含むことがある。
【0238】
前記の中枢神経系の疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含むことがある。
【0239】
前記疾患及び障害はまた、創傷治癒、透析患者の貧血、及び骨粗鬆症を含むことがある。
【0240】
好ましくは、本発明は、異なるヒトの障害及び/又は疾患の予防又は処置を目的とする薬物の製造のための、少なくとも1つの上文で限定したコードSNP、上文で限定した組換えベクター、上文で限定した宿主細胞、及び/又は上文で限定した抗体を含む、本発明に従うポリヌクレオチドの使用であって、異なるヒトの障害及び/又は疾患、例えば、あるウイルス感染、例えば慢性B型及びC型肝炎、白血病、例えばヘアリー細胞白血病及び慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、カルチノイド性腫瘍、悪性黒色腫、転移型腎ガン、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫欠損後に出現する腫瘍、例えばエイズの場合にはカポジ肉腫、並びに生殖器疣又は性病、の予防又は処置を目的とする薬物の製造のための使用に関する。
【0241】
活性物質として有用な、本発明のポリペプチド及び他の化合物の用量は、化合物の選択、治療の兆候、投与形態、製剤の性質、対象者の性質及び医師の判断に依存する。
【0242】
それを活性物質として使用する場合、本発明に従うポリペプチドは、通常1〜100μg/対象者のkgに及ぶ用量で投与される。
【0243】
本発明はまた、活性物質として、少なくとも1つの上記化合物、例えば本発明に従うポリペプチド、少なくとも1つの上文で限定したSNPを含む本発明に従うポリヌクレオチド、上文で限定した組換えベクター、上文で限定した宿主細胞、及び/又は上文で限定した抗体、並びに医薬として許容される賦形剤を含む医薬組成物を目的とする。
【0244】
これらの医薬組成物において、前記活性物質は生理学的に有効な量で有利に存在する。
【0245】
これらの医薬組成物は、例えば固体又は液体であってもよく、そしてヒトの薬物において現在使用されている医薬形態で、例えば単純な又はコートされた錠剤、ゲルキャップ、顆粒、キャラメル、座剤並びに好ましくは注射用調製物及び注射用調製物のための粉末で存在していてもよい。これらの医薬の形態は有用な方法に従い調製され得る。
【0246】
前記活性物質は、医薬組成物において通常適用される賦形剤、例えばタルク、アラビアゴム、ラクトース、デンプン、デキストロース、グリセロール、エタノール、ステアリン酸マグネシウム、カカオバター、水性又は非水性担体、動物又は植物起源の脂肪物質、パラフィン誘導体、グリコール、種々の湿潤剤、分散剤又は乳化剤、防腐剤に組み込まれることもある。
【0247】
本発明に従う活性物質は、単独で、又は他の化合物、例えば治療化合物、例えば他のインターフェロン−α若しくは他のサイトカイン、例えばインターロイキンと組み合わせて適用され得る。
【0248】
前記医薬組成物の異なる製剤は、投与の形態に従い適合される。
【0249】
前記医薬組成物は、当業者にとって既知の異なる投与経路によって投与され得る。
【0250】
本発明はまた、個体における、ガン及び腫瘍、感染病、免疫関連疾患及び/又は自己免疫疾患及び障害、心臓血管疾患、代謝病、中枢神経系の疾患、並びに化学療法の処置に関連する障害、から成る群から選択される疾患を予防し、又は処置する方法であって、前記個体に対し、治療として有効な量の上文で限定した物質、及び医薬として許容される賦形剤を投与することを含んで成る方法、に関する。
【0251】
本発明はまた、活性物質として、少なくとも1つの上記化合物、例えば本発明に従うポリペプチド、本発明に従うポリヌクレオチドの全部又は一部、上文で限定した組換えベクター、上文で限定した宿主細胞、及び/又は上文で限定した抗体、並びに適当な医薬として許容される賦形剤を含む診断組成物を目的とする。
【0252】
この診断組成物は、例えば適当な賦形剤、例えば診断組成物において一般に使用されているもの、例えば緩衝液及び防腐剤を含むことがある。
【0253】
本発明はまた:
a)治療として有効な量の本発明に従うポリペプチド、及び/又は
b)本発明に従うポリヌクレオチド、及び/又は
c)上文で限定した、処置される対象者由来の宿主細胞、
の使用であって、対象者における、本発明に従うポリペプチドの発現又は活性を増大せしめることを目的とする治療用化合物を調製するための使用を目的とする。
【0254】
この様に、本発明のポリペプチドの発現又は活性の増大を必要とする対象者を処置するために、複数の方法が可能である。
【0255】
前記対象者に、治療として有効な量の本発明に従うポリペプチドを、医薬として許容される賦形剤と一緒に投与することは可能である。
【0256】
同様に、前記対象者に対する、本発明に従うポリヌクレオチドの投与によって、本発明のポリペプチドの内因性の産生を増大せしめることが可能である。例えば、そのポリヌクレオチドはレトロウイルス発現ベクター内に挿入され得る。その様なベクターは、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含むレトロウイルスプラスミドベクターに感染した細胞から出発して、形質導入された細胞が注目の遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する様な方法で単離され得る。Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, Chapter 20, in Human Molecular Genetics, Strachan and Read, BIOS Scientifics Publishers Ltd (1996)を参照のこと。
【0257】
本発明に従い、少なくとも1つのコードSNP、例えば上文で限定したものを含むポリヌクレオチドが好ましくは使用される。
【0258】
更に、対象者に対して、その者に属する宿主細胞であって、あらかじめ採取され、そして既に記載した様に本発明のポリペプチドを発現する様に修飾された宿主細胞を投与することが可能である。
【0259】
本発明はまた:
a)治療として有効な量の、上文で限定した免疫特異的抗体、及び/又は
b)本発明に従うポリヌクレオチドの発現の阻害を可能にするポリヌクレオチド、
の使用であって、対象者における、本発明に従うポリペプチドの発現又は活性を低下せしめることを目的とする薬物の調製のための使用に関する。
【0260】
この様に、前記対象者に対して、治療として有効な量の阻害剤及び/又は抗体、例えば上文で限定したものを、好ましくは医薬として許容される賦形剤と組み合わせて投与することが可能である。
【0261】
また、前記対象者に対して、本発明のポリヌクレオチドの発現の阻害を可能にする、本発明に従う相補的なポリヌクレオチドの投与によって、本発明のポリペプチドの内因性の産生を減少させることも可能である。
【0262】
好ましくは、少なくとも1つのコードSNP、例えば上文で限定したものを含む相補的なポリヌクレオチドが使用され得る。
【0263】
本発明はまた、対象者において、本発明に従うポリペプチドの活性を増大又は低下させるための方法であって、治療的に有効な量の:a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,a1212g,及びa1294cから成る群から選択される少なくとも1つのSNPを含んで成るヌクレオチド配列である配列番号1、又は前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、の全部又は一部を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド;前記ポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクター;前記組換えベクターを含んで成る宿主細胞であって、処置される前記対象者から得られうる宿主細胞;アミノ酸配列である配列番号2の全部又は一部を含んで成り、且つV10A,D95N,L112I,V129L,F139S,R144K,及びK182Qから成る群から選択される少なくとも1つのコードSNPを有する、単離されたポリペプチド;前記ポリペプチドに特異的な抗体;及び医薬として許容される賦形剤、を投与することを含んで成る方法に関する。
【0264】
本発明はまた、ヌクレオチド配列である配列番号1であって、但し、以下のSNP:a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,a1212g,及びa1294cのうちの1つを含んで成るヌクレオチド配列と、少なくとも95%の同一性(好ましくは97%の同一性、更に好ましくは99%の同一性及び特に100%の同一性)を有するヌクレオチド配列の、個体のゲノムにおける存在と関連しているIFNα−7変異体によって生じる障害又は疾患を有する前記患者の予防又は処置のための薬物の調製のためのIFNα−7タンパク質の使用に関する。
【0265】
好ましくは、前記薬物は、ガン及び腫瘍、感染病、性病、免疫関連疾患及び/又は自己免疫疾患及び障害、心臓血管疾患、代謝病、中枢神経系の疾患、並びに化学療法に関連する障害、から成る群から選択される疾患の予防又は処置のために使用される。
【0266】
前記ガン及び腫瘍は、転移型腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、首、頭及び腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド性腫瘍及び免疫欠損後に出現する腫瘍であってエイズの場合にはカポジ肉腫を含んで成るもの、を含む。
【0267】
前記感染病は、慢性B型及びC型肝炎並びにHIV/エイズを含んで成るウイルス感染、感染性肺炎、及び性病、例えば生殖器疣、を含む。
【0268】
前記免疫関連疾患及び自己免疫疾患は、組織又は器官の移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含むことがある。
【0269】
前記代謝病は、肥満のような非免疫関連疾患を含むことがある。
【0270】
前記の中枢神経系の疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含むことがある。
【0271】
前記疾患及び障害はまた、創傷治癒、透析患者の貧血、及び骨粗鬆症を含むことがある。
【0272】
本発明はまた、個体において、本発明に従うポリヌクレオチドの前記個体のゲノムの存在に関連する障害又は疾患を予防又は処置するための方法であって、治療的に有効な量の1又は複数の:ヌクレオチド配列である配列番号1の全部又は一部を含んで成り、且つa559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,a1212g,及びa1294cから成る群から選択される少なくとも1つのSNPを有する、単離されたポリヌクレオチド、あるいは前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列の全部又は一部を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド;前記ポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクター;前記組換えベクターを含んで成る宿主細胞;アミノ酸配列である配列番号2の全部又は一部を含んで成り、且つV10A,D95N,L112I,V129L,F139S,R144K,及びK182Qから成る群から選択される少なくとも1つのコードSNPを有する、単離されたポリペプチド;前記ポリペプチドに特異的な抗体;及び医薬として許容される賦形剤、を投与することを含んで成る方法に関する。
【0273】
本発明のSNP D95Nを含んで成るIFNα−7ポリペプチドのミメティック化合物
本発明はまた、
a)アミノ酸配列である配列番号2、又は
b)アミノ酸配列である配列番号2の24〜189位の間に含まれるアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列、
のポリペプチドであって、但し、a)及びb)の前記アミノ酸配列がSNP D95Nを含んで成るポリペプチド、と実質的に同程度の生物活性を有する新規化合物に関する。
【0274】
前記生物活性は、例えば、下文の実験の項目に記載のように、シグナル伝達、樹状細胞の成熟、CD4+又はCD8+Tリンパ球によるサイトカイン放出、単球によるサイトカイン放出、in vitro又はin vivoでの抗ウイルス活性、悪性フレンド赤白血病細胞をあらかじめ接種されたマウスにおける抗腫瘍活性、Daudi Burkitt's細胞系に対する細胞性の抗増殖活性、TF−1細胞系に対する細胞性の抗増殖活性を測定することによって評価されうる。
【0275】
実験の項目で言及するように、D95N突然変異IFNα−7は、
−樹状細胞の成熟を刺激するのが弱い能力
−SEB抗原によってあらかじめ活性化された、CD4+Tリンパ球及びCD8+Tリンパ球によってサイトカインの放出(IFNガンマ及びIL−10)を刺激するのが高い能力
−Daudi細胞の増殖を阻害する能力
−TF−1細胞に対する弱い抗増殖活性
−VSVに感染した細胞培養液中でのin vivoでの高い抗ウイルス活性
−EMCVに感染したマウスにおけるin vivoでの抗ウイルス活性
−FCL接種マウスにおける抗腫瘍活性、
を示す。
【0276】
また、実験の項目において言及するように、野生型のIFNα−2と比較して、D95N突然変異IFNα−7タンパク質は:
−シグナル伝達を同程度活性化する能力
−樹状細胞の成熟を刺激することがより低い能力
−SEB抗原によってあらかじめ活性化された、CD4+Tリンパ球及びCD8+Tリンパ球によってIFNガンマの放出を刺激することがより高い能力
−単球によってIL−10及びTNF−αを刺激することがより高い能力
−TF−1細胞に対する同程度の抗増殖活性
−VSVに感染した細胞培養液中でのin vitroでのより低い抗ウイルス活性
−EMCVに感染したマウスにおけるin vivoでのより高い抗ウイルス活性
−FCL接種マウスにおける若干低い抗腫瘍活性、
を有する。
【0277】
また、実験の項目において言及するように、野生型のIFNα−7と比較して、D95N突然変異IFNα−7タンパク質は:
−シグナル伝達を活性化する同程度の能力
−Daudi細胞の成熟を刺激することが若干高い能力
を有する。
【0278】
上文で限定したような本発明の新規化合物は、D95N突然変異IFNα−7のものと実質的に同程度の生物活性を有することがある。
【0279】
前記化合物はまた、Tリンパ球によるIFN−ガンマの放出、単球によるIL−10及びTNF−αの放出、EMCVに感染したマウスにおけるin vivoでの抗ウイルス活性、及び/又はFLC接種マウスにおける抗腫瘍活性のような生物活性を有することがあり、これらはD95N突然変異IFNα−7のものよりもはるかに高い。
【0280】
前記化合物はまた、樹状細胞の成熟のような生物活性を有することがあり、これはD95N突然変異IFNα−7のものよりもはるかに低い。
【0281】
前記化合物は、例えばポリペプチド又はペプチドのような生化学的化合物、又は、例えば合成ペプチドミメティックのような有機化学的化合物、であってもよい。
【0282】
本発明はまた、上文で定義した様な化合物の同定のための、D95N SNPを含む本発明のポリペプチドの使用に関する。
【0283】
本発明は、本発明の化合物の同定のための方法であって、以下の段階:
a)試験される化合物の生物活性、例えば、下文の実験の項目に記載のように、シグナル伝達、樹状細胞の成熟、CD4+又はCD8+Tリンパ球によるサイトカイン放出、単球によるサイトカイン放出、in vitro又はin vivoでの抗ウイルス活性、悪性フレンド赤白血病細胞をあらかじめ接種されたマウスにおける抗腫瘍活性、Daudi Burkitt's細胞系に対する細胞性の抗増殖活性、本発明に従うポリペプチドのTF−1細胞系に対する細胞性の抗増殖活性を決定し;
b)i)試験される化合物の、段階a)で決定した活性と、
ii)アミノ酸配列である配列番号2のポリペプチド、又はアミノ酸配列である配列番号2の24から189位の間に含まれるアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列のポリペプチド、であって、但し、アミノ酸配列がD95N SNPを含んで成るものの活性、
とを比較し;そして
c)段階b)で実施した比較に基づき、試験される化合物が、アミノ酸配列である配列番号2のポリペプチド、又はアミノ酸配列である配列番号2の24から189位の間に含まれるアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列のポリペプチド、であって、但し、前記アミノ酸配列がD95N SNPを含んで成るポリペプチドと比較して実質的に類似又はそれより低い活性を有するか否かを決定すること、を含んで成る方法に関する。
【0284】
好ましくは、試験される化合物は、合成ペプチドコンビナトリアルライブラリー、高処理量スクリーニングから既に同定されていることがあり、又はコンピューターを使ったドラッグデザインによって設計された結果、アミノ酸配列である配列番号2のポリペプチド、又はアミノ酸配列である配列番号2の24から189位の間に含まれるアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列のポリペプチド、であって、但し、アミノ酸配列がD95N SNPを含んで成るポリペプチドと同一の三次元構造及び/又は化学作用を有することがある。
【0285】
化合物を同定し、そして設計するための方法は、当業者に周知である。
【0286】
これらの方法を引用している刊行物は、例えば:
- Silverman R.B. (1992).“Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action”. Academic Press, 1st edition (January 15, 1992).
- Anderson S and Chiplin J. (2002).“Structural genomics ; shaping the future of drug design? Drug Discov. Today. 7 (2) : 105-107.
- Selick HE, Beresford AP, Tarbit MH. (2002).“The emerging importance of predictive ADME simulation in drug discovery”. Drug Discov. Today.7 (2) : 109-116.
- Burbidge R, Trotter M, Buxton B, Holden S. (2001).“Drug design bymachine learning : support vector machines for pharmaceutical data analysis”. Comput. Chem. 26 (1) : 5-14.
- Kauvar L.M. (1996).“Peptide mimetic drugs : a comment on progressand prospects”14 (6) : 709、であってもよい。
【0287】
本発明の化合物は、ガン及び腫瘍、感染病、性病、免疫関連疾患及び/又は自己免疫疾患及び障害、心臓血管疾患、代謝病、中枢神経系の疾患、並びに化学療法に関連する障害、から成る群から選択される疾患のうちの1つの予防又は処置を目的とする薬物の調製に使用されうる。
【0288】
前記ガン及び腫瘍は、転移型腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、首、頭及び腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド性腫瘍及び免疫欠損後に出現する腫瘍であってエイズの場合にはカポジ肉腫を含んで成るもの、を含む。
【0289】
前記感染病は、慢性B型及びC型肝炎並びにHIV/エイズを含んで成るウイルス感染、感染性肺炎、及び性病、例えば生殖器疣、を含む。
【0290】
前記免疫関連疾患及び自己免疫疾患は、組織又は器官の移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含むことがある。
【0291】
前記代謝病は、肥満のような非免疫関連疾患を含むことがある。
【0292】
前記の中枢神経系の疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含むことがある。
【0293】
前記疾患及び障害はまた、創傷治癒、透析患者の貧血、及び骨粗鬆症を含むことがある。
【0294】
好ましくは、本発明は、異なるヒトの障害及び/又は疾患、例えば、あるウイルス感染、例えば慢性B型及びC型肝炎、白血病、例えばヘアリー細胞白血病及び慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、カルチノイド性腫瘍、悪性黒色腫、転移型腎ガン、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫欠損後に出現する腫瘍、例えばエイズの場合にはカポジ肉腫、並びに生殖器疣又は性病、から成る群から選択される疾患のうちの1つの予防又は処置を目的とする薬物の調製に使用されうる。
【実施例】
【0295】
実験の項目
実施例1:g1023a,t1166c,g1181 a ,又はa1294cのSNPを含 むヌクレオチド配列のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質及び野生型参照遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質のモデリング
最初の段階において、IFNα−7の三次元構造は、ソフトウェアModeler(MSI, San Diego, CA)を用いてPDBデータベース(コード1ITF)において利用可能な構造を有するヒトIFNα−2のものから出発して構築した。
【0296】
続いて、成熟ポリペプチドフラグメントが、突然変異D72N,F116S,R121K,K159Qを再現する様な方法で修飾される。
【0297】
1000回の分子最小化段階が、プログラムAMBER及びDISCOVER(MSI:Molecular Simulations Inc. )を用いることによってこの変異型フラグメントに対して行われた。
【0298】
次に、2回の分子力学計算の実行が同じプログラム及び同じ力場で行われた。
【0299】
それぞれの場合において、50,000回の段階が300°Kで計算され、300回の平衡段階によって終了した。
【0300】
このモデリングの結果を図1、2、3及び4に表す。
【0301】
例2:個体群における t 779 c , g 1033 a , c 1084 a , g 1135 t , t 1166 c , g 1181 a ,又は a 1294 c のSNPの遺伝子判定
SNPの遺伝子型判定は、生成物が偏光した蛍光を読み込むことによって検出される、ミニシークエンスの原理に基づいている。当該技術は蛍光ミニシークエンス(FP−TDI技術又はFluorescence Polarization Template-direct Dye-Terminator Incorporation)から成る。
【0302】
ミニシークエンスは、前記群の各個体のゲノムDNAからPCRによって増幅された生成物で行われる。PCR生成物は、それが遺伝子型判定され得るSNPを含む遺伝子領域を覆う様な方法で選択される。使用されなかったPCRプライマー及び組み込まれなかったdNTPの排除後、ミニシークエンスは行われる。
【0303】
ミニシークエンスは、ポリメラーゼ酵素及び蛍光標識したジデオキシヌクレオチドを用いることによって、SNPの部位のすぐ上流に配置されたポリヌクレオチドプライマーを伸長することから成る。この伸長過程から生じた生成物は、偏光した蛍光を読み込むことによって直接解析される。
【0304】
全てのこれらの段階、及び読み込みが同一のPCRプレートにおいて行われる。
【0305】
この様に、遺伝子型判定は5つの段階:
1)PCRによる増幅
2)酵素消化によるPCR生成物の精製
3)オリゴヌクレオチドプライマーの伸長
4)偏光した蛍光の読み込み
5)読み込みの解釈
を必要とする。
【0306】
遺伝子型判定の段階1及び2は、t779c,g1033a,c1084a,g1135t,t1166c,g1181a,又はa1294cのSNPのそれぞれについては同一の条件で実施される。段階3、4及び5は、これらの多型のそれぞれに特異的である。
【0307】
1)IFNα−7遺伝子のヌクレオチド配列のPCR増幅は、民族的に異なる起源の268人の個体に由来するゲノムDNAから出発して行われる。
【0308】
これらのゲノムDNAは、米国のCoriell Insfitueによって提供された。
【0309】
268人の個体は以下の様に分布される:
【表1】
【0310】
これらの個体のそれぞれ1つに由来するゲノムDNAが試料を構成する。
【0311】
全てのSNPについて、PCR増幅が以下のプライマー:
配列番号3:センスプライマー:TACCCACCTCAGGTAGCC
配列番号4:アンチセンスプライマー:CATGAAAGTGTGAGATGATGC
から出発して実施される。
【0312】
これらのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列である配列番号1の、ヌクレオチド711からヌクレオチド1379の、669個のヌクレオチドを有するフラグメントの増幅を可能にする。
【0313】
それぞれのSNPについて、PCR生成物はミニシークエンスのための鋳型を果たすであろう。
【0314】
当該PCR反応の合計の反応液量は各試料当たり5μlである。
【0315】
この反応液量は、以下の表に示す試薬から構成される:
【表2】
【0316】
これらの試薬は、ABGeneによって供給される、384個のウェルを有するブラックPCRプレート(参照:TF−0384−K)に配分される。当該プレートはシーリングされ、遠心され、続いて384ウェルプレート用のサーモサイクラー(MJ ResearchのTetrad)内に据えられ、そして以下のインキュベーションを受ける:PCRサイクル:94℃で1分、これに3段階(94℃で15秒、56℃で30秒、68℃で1分)から成る36サイクルが続く。
【0317】
2)PCR増幅生成物は、続いて2つの酵素:シュリンプアルカリホスファターゼ(SAP)及びエキソヌクレアーゼI(ExoI)を用いて精製される。これらの最初の酵素は、PCR増幅の間に組み込まれなかったdNTPの脱リン酸化を可能にし、一方、2番目のものは一本鎖DNA残基、特にPCRの間に使用されなかったプライマーを除去する。
【0318】
この消化は、PCRプレートの各ウェルにおける、試料当たり5μlの反応混合物の添加によって行われる。この反応混合物は以下の試薬から構成される:
【表3】
【0319】
充填したら、プレートをシーリングし、遠心し、続いて384ウェルプレート用のサーモサイクラー(MJ ResearchのTetrad)内に据え、そして以下のインキュベーションを受ける:SAP−EXO消化:37℃で45分、80℃で15分。
【0320】
続いて、伸長又はミニシークエンス段階が、調製した試料当たり5μlの反応混合物の添加によって消化されたPCR生成物で行われる。
【0321】
ミニシークエンス3)及び読み込み段階4)及び読み込みの解釈5)は、t779c,g1033a,c1084a,g1135t,t1166c,g1181a,及びa1294cに特異的である。
【0322】
全てのこれらの段階は、これらの多型のうちのそれぞれ1つに使用される具体的な条件をまとめて後文に記載する。
【0323】
3)ミニシークエンス
遺伝子型判定に必要な2つのミニシークエンスプライマーの配列は、本発明に従うSNPの部位の上流に位置するヌクレオチドの配列に相当する方法で判定した。SNPを含むPCR生成物が二本鎖DNA生成物であるので、遺伝子型判定はセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかで行われ得る。選択したプライマーはLifeTechnologies Inc.によって製造される。
【0324】
次の表は、各SNPについての、試験したミニシークエンスプライマーの配列及び遺伝子型判定のために保持される最適条件を示す。
【表4】
【0325】
SNPのミニシークエンスは、最初に16個の試料全てで確認され、続いて268人の個体及び10人のコントロールから構成される個体群の集合全てを遺伝子型判定した。
【0326】
次に、伸長又はミニシークエンス段階が次の表に示す様に行われる。
【表5】
1 5×伸長緩衝液は、250mM Tris−HCl pH9,250mM KCl,25mM NaCl,10mM MgCl2 及び40%グリセロールから構成される。
2 ddNTPに関して、4塩基の混合物が研究される多型に従い実施される。SNPを構成する注目の2塩基(野生型ヌクレオチド/変異型ヌクレオチド)のみが、例えばTamra又はR110のいずれかで標識される。例えば、SNP g1033aの場合、ddNTPの混合物は
−2.5μMの非標識ddATP、
−2.5μMの非標識ddGTP、
−2.5μMのddTTP(1.875μMの非標識ddTTP及び0.625μMのTamra標識型ddTTP)、
−2.5μMのddCTP(1.875μMの非標識ddCTP及び0.625μMのR110標識ddCTP)、
から構成される。
【0327】
充填したら、プレートはシーリングされ、遠心され、続いて384ウェルプレート用のサーモサイクラー(MJ ResearchのTetrad)に据えられ、そして次のインキュベーションを受ける:伸長サイクル:93℃で1分、これに2段階(93℃で10秒、55℃で30秒)から構成される35サイクルを続ける。
【0328】
サーモサイクラーにおける最後の段階の後、LJL Biosystems Inc. のAralyst(商標)型の、偏光型蛍光リーダー上にプレートを直接据える。プレートは、2つの方法を用いるCriterion Host(商標)のソフトウェアを使用して読み込む。最初のものは、このフルオロフォアに特異的な発光及び励起フィルターを用いることによって、Tamra標識型塩基の読み込みを可能にし(発光550〜10nm、励起580〜10nm)、そして2番目のものは、このフルオロフォアに特異的な発光及び励起フィルターを用いることによって、R110標識型塩基の読み込みを可能にする(発光490〜10nm、励起520〜10nm)。両者の場合において、二色性二重ミラー(dichroic double mirror)(R110/Tamra)が使用され、そして他の読み込みパラメーターは:
Zの高さ:1.5mm
アテニュエーター:アウト
インテグレーションタイム:100,000マイクロ秒
生データユニット:カウント/秒
スイッチ偏光:ウェルごと
プレート設定時間:0ミリ秒
PMT設定:Smart Read(+)、感度2
動的偏光子:発光静的偏光子:S
である。
【0329】
ファイルの結果は、この様にTamraフィルターの場合のmP(ミリ偏光)の計算値及びR110フィルターの場合のものを含めて得られる。これらのmP値は、以下の式に従い、平行な面(//)及び垂直な面(⊥)に対して得られる強度から出発して計算される:MP=1000(//−g⊥)/(//+g⊥)
【0330】
この計算において、値⊥は係数gによって加重される。それは実験的にあらかじめ決定されなければならない機械の係数である。
【0331】
4)及び5)読み込みの解釈及び遺伝子型の決定
mP値は、Microsoft Inc.のExcel、及び/又はLJL Biosystems Inc.によって開発されたAllele Caller(商標)を用いてグラフ上に記された。
【0332】
横軸上にはTamra標識型塩基のmP値を示し、縦軸上にはR110標識型塩基のmP値を示す。強力なmP値は、このフルオロフォアで標識した塩基が組み込まれたことを示し、そして反対に弱いmP値は、この塩基の不在を明らかにしている。
【0333】
異なる遺伝子型を有するヌクレオチド配列の、最大3つの同種の群が得られる。
【0334】
Allele Caller(商標)のソフトウェアの使用は、一度異なる群の同定が行われると、表の書式において各個体について定義されている遺伝子型の直接的な抽出を可能にする。
【0335】
SNP g1033aの場合、例えば、アンチセンスで読まれる対立遺伝子cは、センスで読まれる対立遺伝子gに相当し、そして未成熟IFNα−7タンパク質配列の95位にあるアスパラギン酸(D)の存在に関連していること、そしてそれ故に、アンチセンスで読まれる対立遺伝子tが、センスで読まれる対立遺伝子aに相当し、相当するタンパク質の配列のこの位置につきアスパラギン(N)に相当することを述べる必要がある。
【0336】
SNP t 779 c , g 1033 a , c 1084 a , g 1135 t , t 1166 c , g 1181 a ,及び a 1294 c のミニシークエンスの結果
遺伝子型判定の過程の完了後、本明細書で研究したSNPについての、個体群のうちの個体の遺伝子型の決定は、上述したグラフを用いて行われる。
【0337】
SNP t779cの場合、遺伝子型は、理論的には試験した個体において、ホモ接合体TT、又はヘテロ接合体TC、又はホモ接合体CCのいずれかである。実際には、以下に示す様に、ホモ接合体の遺伝子型CCは個体群において検出されていない。
【0338】
SNP g1033aの場合、遺伝子型は、理論的には試験した個体においてホモ接合体GG、又はヘテロ接合体GA、又はホモ接合体AAのいずれかである。実際には、以下に示す様に、ホモ接合体の遺伝子型AAは個体群において検出されていない。
【0339】
SNP g1135tの場合、遺伝子型は、理論的には試験した個体において、ホモ接合体GG、又はヘテロ接合体GT、又はホモ接合体TTのいずれかである。実際には、以下に示す様に、ホモ接合体の遺伝子型TTは個体群において検出されていない。
【0340】
SNP c1084aの場合、遺伝子型は、理論的には試験した個体において、ホモ接合体CC、又はヘテロ接合体CA、又はホモ接合体AAのいずれかである。実際には、以下に示す様に、ホモ接合体の遺伝子型AAは個体群において検出されていない。
【0341】
SNP t1166cの場合、遺伝子型は、理論的には試験した個体においてホモ接合体TT、又はヘテロ接合体TC、又はホモ接合体CCのいずれかである。実際には、以下に示す様に、ホモ接合体の遺伝子型CCは個体群において検出されていない。
【0342】
SNP g1181aの場合、遺伝子型は、理論的には試験した個体において、ホモ接合体GG、又はヘテロ接合体GA、又はホモ接合体AAのいずれかである。実際には、以下に示す様に、ホモ接合体の遺伝子型AAは個体群において検出されていない。
【0343】
SNP a1294cの場合、遺伝子型は、理論的には試験した個体においてホモ接合体AA、又はヘテロ接合体AC、又はホモ接合体CCのいずれかである。実際には、以下に示す様に、ホモ接合体の遺伝子型CCは個体群において検出されていない。
【0344】
個体群において決定された遺伝子型の分布及び研究した7個のSNPに関する異なる対立遺伝子頻度の計算の結果を次の表に提示する:
【表6】
【表7】
【表8】
【0345】
上記の表において、
−Nは個体数を表し、
−%は特異的な亜集団における個体のパーセンテージを表し、
−対立遺伝子頻度は、特異的な亜集団における変異した対立遺伝子のパーセンテージを表し、
−95%ICは、95%における信頼性の最小値と最大値の間隔を表す。
【0346】
系統群、及びSNPによるこれらの結果を調べることによって、次のことが観察される:
−SNP t779cの場合、2人のヘテロ接合体の個体TCが、非ヨーロッパ系コーカソイドの亜集団出身である。
− SNP g1033aの場合、4人のヘテロ接合体の個体GAが、アフリカ系アメリカ人の亜集団出身である。
− SNP c1084aの場合、2人ヘテロ接合体の個体CAが、アフリカ系アメリカ人の亜集団出身である。
− SNP g1135tの場合、5人のヘテロ接合体の個体GTが、アフリカ系アメリカ人、カリブ人、及びメキシコ人の亜集団出身である。
− SNP t1166cの場合、5人のヘテロ接合体の個体TCが、カリブ人、ヨーロッパ系のコーカソイド、及び東南アジア人の亜集団出身である。
− SNP g1181aの場合、唯一のヘテロ接合体の個体GAが、東南アジア人の亜集団出身である。
− SNP a1294cの場合、2人のヘテロ接合体の個体ACが、アフリカ系アメリカ人の亜集団出身である。
【0347】
例3:酵母における天然野生型IFNα−7及び変異型IFNα−7のタンパク質の発現a)真核生物発現ベクターpPicZα-topoにおける天然野生型IFNα−7及び変異型IFNα−7のクローニング
天然野生型IFNα−7、D27N突然変異型IFNα−7、V106L突然変異型IFNα−7、K159Q突然変異型IFNα−7の成熟部分をコードするヌクレオチド配列は、前記SNPのうちの1つについてヘテロ接合体である個体由来のゲノムDNAを鋳型として用いるPCRによって増幅される。
【0348】
その様な増幅を可能にするPCRプライマーは:
配列番号19:センスプライマー:TGTGATCTGCCTCAGACCCAC
配列番号20:アンチセンスプライマー:TCAATCCTTCCTCCTTAATCCTTTTT
である。
【0349】
PCR生成物は、メタノールによって誘導可能なハイブリッドプロモーターAOX1の支配下にある真核生物発現ベクターpPicZα-topo(TOPO(商標)−クローニング;Invitrogen Corp.)内に挿入される。
【0350】
このベクターは、酵母ピキア・パストリス(Pichia pastoris)における真核生物タンパク質の異種発現を可能にする。
【0351】
組換えタンパク質をコードするベクターの領域のヌクレオチド配列を調べた後、ベクターはPme1の制限酵素によって直線化され、そしてP.パストリスの酵母株(Invitrogen)がこれらの組換え発現ベクターを用いて形質転換される。
b)天然野生型IFNα−7及び突然変異型IFNα−7のP.パストリスにおける異種発現及び精製
天然野生型IFNα−7をコードするクローン、又はD27N突然変異型IFNα−7、V106L突然変異型IFNα−7、又はK159Q突然変異型IFNα−7をコードするクローンを含む50mLのBMGY培地(2%ペプトン、1%酵母抽出物、1.34%YNB,1%グリセロール、100mMリン酸カリウム、0.4mg/Lビオチン、pH6.0)の2つの飽和前培養が、200回転/分(rpm )の振盪で、30℃で24〜48時間行われた。
【0352】
培養が細胞密度に達した場合(600nmの波長で測定すると、12の光学密度に相当する)、それは、50OD/mLで、250mLのBMMY培地(2%ペプトン、1%酵母抽出物、1.34%YNB,0.5%メタノール、100mMリン酸カリウム、0.4mg/Lビオチン、pH6.0)を接種するために使用される。
【0353】
タンパク質の発現は、続いて、180rpmでの培養フラスコの振とうで、30℃で24時間、1%の終濃度のメタノールによって誘導される。
【0354】
コード配列の上流にある、「アルファ因子」のシグナルペプチド配列の存在により、とは培養液中で酵母によって分泌される。アルファ因子はプロセシングの間に自然に開裂する。
【0355】
懸濁液を遠心し、そしてタンパク質は、HPLCによって、得られた上清から出発して精製される。
【0356】
予備的な開始段階において、限外ろ過(Labscale,カットオフ値5000Da,Millipore)、続いて透析は、50mMTris−ClpH9.0,25mMNaClの緩衝液中の酵母の上清の10倍の濃縮を可能にする。
【0357】
最初のクロマトグラフィー段階は、ブルーセファロースカラム(Amersham Pharmacia)上での、親和性によるタンパク質の回収を可能にする。回収された画分中のタンパク質の存在は、一方ではSDS PAGE電気泳動によって、他方ではIFNα−7タンパク質に対して特異的な抗体による免疫検出によって証明される。この段階で、注目のタンパク質の純度は75%超である。
【0358】
第二の精製段階において、ゲル濾過は、50mMTris−ClpH9.0,25mMNaClに対するIFNα−7に相当する回収画分の緩衝液の交換を可能にする。
【0359】
精製の最終段階は、イオン交換クロマトグラフィーカラム上でのタンパク質の分離から成る。組換えタンパク質を含む画分は、、50mMTris−ClpH9.0,25mMNaClの緩衝液中であらかじめ平衡化した陰イオン交換カラム(ResourceQ 6.0mL,Pharmacia)に注入される。タンパク質の溶出は、50mM Tris pH9の緩衝液中の、0.025〜1Mの間のグラジエントの通過によって行われる。あるいは、当該精製はブルーシバクロンを用いて実施されうる。
【0360】
注目のタンパク質の純度はSDS/PAGE上で推定され、そしてタンパク質濃度はデンシトメトリー(Quantity One,Biorad)及びBCAアッセイ(ビシンコニン酸及び硫酸銅、Sigma)によって測定された。
【0361】
このプロトコールに従い得られた、精製された天然野生型IFNα−7、D27N突然変異型IFNα−7、V106L突然変異型IFNα−7、K159Q突然変異型IFNα−7のタンパク質は、最終的にはより大量のタンパク質を得るためにスケールアップされ、後述する機能的試験に使用される。
【0362】
実施例4:シグナル伝達を活性化する野生型及びD72N突然変異型IFNα−7の能力の評価
インターフェロンは、JAK(Janusキナーゼ)及びSTAT(シグナルトランスデューサー及び転写のアクチベーター)タンパク質が関与するシグナル伝達経路を介して作用することが知られている。インターフェロンの、その受容体への結合は、リン酸化によってSTATタンパク質を次々に活性化するJAKタンパク質のリン酸化を誘導する。活性化されたSTATタンパク質は、それらが、各遺伝子の転写を刺激する、遺伝子プロモーター上のインターフェロン応答因子と結合する核に転移する。インターフェロンによって開始されるシグナル伝達経路を研究するために、レポーター遺伝子技術を使用した。方法は後述する。
【0363】
インターフェロン応答性のキメラプロモーターの支配下にあるルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定的にトランスフェクションされたヒト細胞系の使用は、このin vitroでのアッセイのための基礎を提供する。したがって、検出されたルシフェラーゼ活性は、核のレベルでシグナルを誘導するIFNの能力を反映する。
【0364】
このレポーター遺伝子アッセイを用いて、D27N突然変異型IFNα−7、野生型IFNα−7、及び野生型IFNα−2によって示された用量応答曲線が解析され、そして、IFNαタンパク質1mgあたりのIntronA(インターフェロンアルファ2bに相当する市販品)を参照して、国際単位で結果が表される。
【0365】
このアッセイは以下の結果をもたらす:
−D72N突然変異型IFNα−7の場合581IU/mg
−野生型IFNα−7の場合489IU/mg
−野生型IFNα−2の場合698IU/mg。
【0366】
これらの結果は、シグナル伝達を活性化するD72N突然変異型INFα−7の能力が、野生型IFNα−7のもの及び野生型IFNα−2のものとかなり類似していることを示す。
【0367】
実施例5:D72N突然変異型IFNα−7の免疫調節活性の評価
IFNのI型(IFNアルファ及びIFNベータ)は、免疫系のある機能を調節することができる。それらは、樹状細胞(DC)の成熟を増大させること:MHCクラスI(HLA−ABC)及びII(HLA−DR)分子の発現の増大、Tリンパ球、CD80、CD86及びCD83の同時刺激に関与する分子の発現の増大、及びTリンパ球の機能の刺激の増大、が証明されている。
【0368】
a)樹状細胞の成熟に対するD72N突然変異型IFNα−7の作用
D72N突然変異型IFNα−7の免疫調節活性は、樹状細胞の成熟に対して最初に研究され、そして市販のIntronA製品の代表として選択された野生型IFNα−2のものと比較された。
【0369】
それらを実施するために、樹状細胞は、GM−CSF及びIL−4サイトカインの存在下で培養された成人の末梢血単球から最初に生成された。CD14+細胞精製キットを用いての精製の後、これらの樹状細胞は、100ng/mlのD72N突然変異型IFNα−7、又は野生型IFNα−2の存在下に据えられ、そしてそれらの表現型が、MHCクラスI及びII分子並びにCD40、CD80、CD86、CD83及びCD1aマーカーの発現を探す目的で、FACS解析によって決定された。これらの樹状細胞の突然変異状態も、コントロールを提供するためにIFNα処理無しで刺激されていない樹状細胞を用いて得られたもの、及び樹状細胞の成熟を誘導することが知られている1μg/mlのLPS又は2.5ng/mlのTNFαを用いて得られたものと比較された。
【0370】
任意の単位で表した、各マーカー及び5つの実験条件についての蛍光強度の測定値の中央値を以下の表に表す:
【表9】
この試験結果は、D72N突然変異型IFNα−7が、樹状細胞を刺激することが弱い能力を有することを示す。特に、野生型IFNα−2と比較して、D72N突然変異型IFNα−7タンパク質は、免疫抑制活性を示す。
【0371】
b)Tリンパ球によるサイトカイン放出に対するD72N突然変異型IFNα−7の作用
D72N突然変異型IFNα−7の免疫調節活性も、突然変異型IFNα−7の存在下に据えられ、且つ凝集に対する免疫応答を模倣するために強力な抗原(SEB)を用いた、又は用いずに、Tリンパ球によるサイトカイン放出を測定することによって研究された。この試験はまた、コントロールとして使用され、且つIntronAの市販品の代表として選択された野生型IFNα−2の存在下で実施された。
【0372】
それらを実施するために、末梢血単球(PBMC)が健康なドナーから単離され、そして、抗CD3及び抗CD28抗体又はSEBを含む適切な培地中で16時間刺激された。各培地に4μg/mLのD72N突然変異型IFNα−7又は野生型IFNα−2が添加された。刺激後、Tリンパ球は、抗CD3、抗CD4及び抗CD69抗体を用いて細胞外から、そしてTh1型サイトカイン(IFN−ガンマ)又はTh2型サイトカイン(IL10)に対する特異的な抗体で細胞内から標識された。蛍光細胞は、FACScalibur及びCellQuestソフトウェアを用いて解析された。
【0373】
得られた結果は、D72N突然変異型IFNα−7及び野生型IFNα−2が、IL−10及びIFN−ガンマの放出を刺激せず、そして、それ故にSEBの不在下でTリンパ球を活性化しないことを示す。対照的に、D72N突然変異型IFNα−7及び野生型IFNα−2タンパク質は、以下の表に示すように、SEB活性型Tリンパ球によるサイトカイン(IL−10及びIFN−ガンマ)の放出を刺激する。この表は、それぞれCD4+Tリンパ球及びCD8+Tリンパ球についてのCD4+CD69+細胞又はCD8+CD69+細胞のパーセンテージとして表した、SEBの存在下でのTリンパ球によるサイトカイン放出、及び全細胞に対するCD69+細胞のパーセンテージを表す。
【表10】
【0374】
これらの結果は、D72N突然変異型IFNα−7が、SEB抗原によってあらかじめ活性化されたCD4+Tリンパ球及びCD8+Tリンパ球によるサイトカイン放出(IFNガンマ及びIL−10)を刺激する高い能力を有することを示す。特に、CD4+又はCD8+Tリンパ球によるインターフェロンガンマの賛成は、野生型IFNα−2の存在下よりもD72N突然変異型IFNα−7の存在下の方が高い。
【0375】
c)単球によるサイトカイン放出に対するD72N突然変異型IFNα−7の作用
最後に、D72N突然変異型IFNα−7の免疫調節活性が、細菌の毒性物質(LPS)の不在下又は存在下で、単球によるサイトカイン放出を測定することによって研究された。この試験はまた、コントロールとして使用され、且つIntronAの市販品の代表として選択された野生型IFNα−2の存在下で実施された。
【0376】
それらを実施するために、末梢血単球(PBMC)が健康なドナーから単離され、そしてそれらの表現型が、CD64+CD4dim細胞(CD64+CD4dimは血液の単球のマーカーである)の相対量を決定するために解析された。一晩の培養の後、これらのPBMCは培養液のみ(刺激されていない細胞)の中で、又はLPS(刺激された細胞)の存在下でインキュベートされた。各培養において、4μg/mLのD72N突然変異型IFNα−7又は野生型IFNα−2が添加された。培養後、細胞は抗CD64及び抗CD4dimを用いて細胞外から、そしてTh1型サイトカイン(TNFアルファ)、IL−12及びIL−10に対して特異的な抗体を用いて細胞内から標識された。
【0377】
蛍光細胞は、FACScalibur及びCellQuestソフトウェアを用いて解析された。
【0378】
得られた結果は、D72N突然変異型IFNα−7及び野生型IFNα−2が、LPSの存在下でサイトカイン(IL−10、IL−12及びTNF−アルファ)の放出を刺激しないことを示す。
【0379】
対照的に、LPSの存在下で、単球はサイトカイン(IL−10、IL−12及びTNF−α)を放出し、この放出は、以下の表に示すように、D72N突然変異型IFNα−7タンパク質又は野生型IFNα−2の存在下で更に増大する。この表は、CD64+CD4dim細胞のパーセンテージとして表した、LPSの存在下での単球によるサイトカインの放出、及び全細胞に対するCD64+CD4dim細胞のパーセンテージを表す。
【表11】
【0380】
これらの結果は、LPSの存在下、D72N突然変異型IFNα−7タンパク質が、単球によるサイトカイン放出を刺激することができることを示す。特に、単球によるIL−10及びTNFαの放出の刺激は、野生型IFNα−2の存在下よりもD72N突然変異型IFNα−7の存在下のほうが高い。
【0381】
実施例6:D72N突然変異型IFNα−7の in vitro での抗増殖活性の評価
a)Daudi Burkitt細胞系のヒトリンパ芽球に対するもの
これらの試験は、4つの異なるIFN α−7の型、すなわち野生型IFNα−7、V106L突然変異型IFNα−7、及びK159Q突然変異型IFNα−7で実施される。前もってRPMI1640培地(10%ウシ胎児血清及び2mMのL−グルタミンを添加したもの)中で培養された細胞(ヒトDaudi Burkittリンパ腫細胞系、以後「Daudi細胞」と称する)は、4×104 細胞/穴の細胞密度で96穴プレート中に接腫される。
【0382】
各穴において、Daudi細胞は、天然野生型又は変異型IFN α−2のいずれかの濃度の増大させつつ据えられる。野生型及び変異型IFN α−2のいずれかの場合に、0.003pM〜600nMの終濃度が試験される。
【0383】
Daudi細胞は、続いて、Uptiblue試薬(Uptima)を培養液に添加した後に、5%CO2 のもと、37℃で66時間培養される。細胞増殖の速度は、4時間の追加のインキュベーション期間の後に590nm(励起560nm)で放射された蛍光を測定することによって定量される。
【0384】
突然変異型IFNα−7タンパク質又は野生型IFNα−7の抗増殖活性は、細胞増殖を50%阻害するIFNα−7の濃度に相当するIC50の測定に基づいている。
【0385】
少なくとも3つの実験が、3回繰り返して両タンパク質及び各濃度について実施された。
【0386】
試験したIFNα−7のそれぞれについて測定される平均IC50値、同様に野生型タンパク質で測定したIC50値以上の、突然変異タンパク質を用いて測定されたIC50値に相当する平均の比率を以下の表に表す。
【0387】
イオン交換クロマトグラフィーによって精製したタンパク質で得られた結果:
【表12】
【0388】
ブルーシバクロンを用いて精製したタンパク質で得られた結果:
【表13】
【0389】
この試験は、3つの突然変異したIFNα−7タンパク質が、Daudi細胞の増殖を阻害することを示す。更に、細胞の抗増殖活性は、D72N変異型IFNα−7及びK159Q突然変異型タンパク質の場合、野生型IFN α−2と比較して若干増大する。
【0390】
b)TF−1赤白血病細胞系に対するもの
D72N突然変異型IFNα−7の作用はまた、TF−1赤白血病細胞系に対しても評価された。この試験はまた、コントロールとして使用され、且つIntronAの市販品の代表として選択された野生型IFNα−2の存在下で実施された。
【0391】
それらを実施するために、TF−1細胞は、D72N突然変異型IFNα−7又は野生型IFNα−2の濃度を増大させつつ静置し(0.001〜1000ng/mL)、そして当該細胞の増殖を測定した。
【0392】
この実験は3回繰り返し、そして1つの代表的な実験結果を図5に表す。
【0393】
これらのデータは、D72N突然変異型IFNα−7がTF−1細胞に対する弱い抗増殖作用を有することを示す。特に、TF−1赤白血球細胞に対するD72N突然変異型IFNα−7の抗増殖作用は、野生型IFNα−2のものに類似している。
【0394】
実施例7:D72N突然変異型IFNα−7の抗ウイルス活性の評価
IFNは、抗ウイルス性の防御において重要な役割を果たしている。IFNの抗ウイルス活性は、IFNが誘導する酵素系に部分的に起因しており、例えば:
−アデノシンオリゴマー合成を触媒する、2’5’オリゴアデニル酸合成酵素。これらのオリゴマーは、一旦活性化したウイルスRNAを破壊するエンドリボヌクレアーゼである、リボヌクレアーゼLを活性化する。
−ウイルスの転写物の合成及び/又は成熟を阻害するMxタンパク質(GTPアーゼ)。この活性は主にインフルエンザウイルスに働く。
−二本鎖RNAによって活性化されるPKRタンパク質。活性化されたPKRはタンパク質合成を阻害する。
【0395】
IFNの抗ウイルス活性はまた、他の機構、例えばレトロウイルスの場合、ウイルス粒子の細胞内への侵入、複製、結合、粒子の出口及びウイルス粒子の感染力、の阻害によっても誘導される。
【0396】
最終的に、IFNは、免疫系のある機能を調節することによって、特に細胞の媒介に対する応答(特に、MHCクラスI及びII分子の増大、IL−12及びIFN−ガンマの産生の増大、CTL活性の増大、を含む)を支持することによって、間接的な抗ウイルス活性を発揮する。
【0397】
D72N突然変異型IFNα−7の抗ウイルス活性は、in vitroでは細胞培養液中において、そしてin vivoではマウスモデルにおいて、その両方で評価されている。両試験は、コントロールとして使用され、且つIntronAの市販品の代表として選択された野生型IFNα−2と平行して実施された。
【0398】
a)in vitroでの細胞培養液における抗ウイルス活性
このアッセイは、水泡性口内炎ウイルス(VSV)を用いての細胞培養液中でのD72N突然変異型IFNα−7の抗ウイルス活性の評価を可能にする。
【0399】
それを実施するために、WISHヒト表皮細胞が、濃度が低下するD72N突然変異型IFNα−7、又は野生型IFNα−2の存在下で24時間培養された。続いて、当該細胞は水泡性口内炎ウイルス(VSV)にさらに24〜48時間感染させられ、そして細胞溶解が測定された。
【0400】
試験した異なるIFNαの抗ウイルス活性は、VSVによって誘導される細胞溶解の50%を阻害するIFNα−7の量に相当する比活性(IU/μg)と比較することによって決定される。IU/μgの単位は、IFNαタンパク質1μgあたりIntronA活性を言及する国際単位を表す。
【0401】
同様の実験が3回実施され、そして1つの代表的な実験で測定された比活性の値は以下の通りである:
−D72N突然変異型IFNα−7の場合:53IU/μg
−野生型IFNα−2の場合:330IU/μg
【0402】
この実験結果は、D72N突然変異型IFNα−7タンパク質が、in vitroでの細胞培養液中で弱い抗ウイルス活性を有することを示す。特に、VSVに感染した細胞培養液中で、D72N突然変異型IFNα−7は、野生型IFNα−2よりも低い抗ウイルス活性を有する。
【0403】
b)in vivoでのマウスモデルにおける抗ウイルス活性
このin vivoでの試験は、EMCV(脳心筋炎ウイルス)マウスモデルにおいて実施される。
【0404】
ヒトIFNは、同量のマウスIFNによって示されるものよりも通常100〜1,000倍低い、マウスにおける用量依存性の抗ウイルス活性を示す(Meister et al. (1986). J. Gen. Virol. 67, 1633-1644)。
【0405】
脳心筋炎ウイルス(EMCV)を用いるマウスの腹腔内注射は、中枢神経系の関与及び脳炎を特徴とする、急速に進行する致死的疾患をもたらす(Finter NB (1973). Front Biol. 2:295-360)。マウス及びヒトインターフェロン−アルファは共に、致死的なEMCVの感染からマウスを守ることにおいて有効であることが示されている(Tovey and Maury (1999). J. IFN Cytokine Res. 19:145-155)。
【0406】
20匹の6週齢のスイスマウスの群が100xLD50EMCVに腹腔内から感染させられ、そして1時間後に、そしてそれから3日間1日1回、2μgのD72N突然変異型IFNα−7又は野生型IFNα−2の調製物で処理された。コントロール群は、賦形剤のみで処理された動物で実施された。当該動物は、21日間、生存について毎日観察された。
【0407】
結果が図6に提示され、そして、D72N突然変異型IFNα−7で処理されているマウスの相対的生存率が、未処理マウスの生存率よりもはるかに高いことを示し、このことは、in vivoのマウスモデルにおけるD72N突然変異型IFNα−7の抗ウイルス活性を証明している。更に、14日後、D72N突然変異型IFNα−7で処理したマウスの45%が生存し、一方、野生型IFNα−2で処理したマウスの30%が生存している。したがって、in vivoのマウスモデルにおけるD72N突然変異型IFNα−7の抗ウイルス活性は、野生型IFNα−2で処理されているマウスについて観察されたものよりも高い。
【0408】
実施例8:悪性フレンド赤白血病細胞をあらかじめ接種したマウスにおけるD72N突然変異型IFNα−7の抗腫瘍活性の評価
IFNαは、IFN感受性の親のフレンド赤白血病細胞と比べて、IFNαの直接的な抗増殖活性に対し耐性があるフレンド赤白血病細胞のクローンの増殖からのマウスの保護に有効であることが示されており(Belardelli et al., Int. J. Cancer, 30, 813-820, 1982; Belardelli et al., Int J. Cancer, 30, 821-825, 1982)、これは、IFNαの抗腫瘍活性における間接的な免疫媒介機構の重要性を反映している。
【0409】
以下の実験は、フレンド赤白血病細胞をあらかじめ接種されたマウスにおけるD72N突然変異型IFNα−7の抗腫瘍活性の評価、及び市販のIntronA製品の代表として選択された野生型IFNα−2のものとの比較を可能にする。
【0410】
それらを実施するために、12匹の6週齢のDBA/2マウスの群が100,000個のIFN耐性フレンド赤白血病細胞(3C18)(20,000LD50)を腹腔内から接種され、そして、1時間後、そしてそれから21日間1日1回、2.0μgの野生型IFNα−2又は2.0μgのD72N突然変異型IFNα−7又は等量の賦形剤単独で処理された。当該動物は、続いて、生存について毎日観察され、そして初頭効果解析はその賦形剤単独の群との比較における各処置群の相対的生存とされた。
【0411】
図7に提示した、この実験結果は、IFNαで処理されているマウスと比較して、D72N突然変異型IFNα−7によるマウスの処理が、非常に悪性のフレンド赤白血病細胞(FLC)の接種後に生存しているマウスの数の増大をもたらす。45日後、D72N突然変異型IFNα−7で処理したマウスの34%が生存し、一方、野生型IFNα−2で処理したマウスの50%が生存している。したがって、FLC接種マウスの生存率は、野生型IFNα−2による処理後よりも、D72N突然変異型IFNα−7による処理後の方が若干低い。
【0412】
これらの結果は全て、D72N突然変異型IFNα−7が独特な生物学的特性を有することを示す。
【図面の簡単な説明】
【0413】
【図1】図1Aは、SNP D72Nを含んで成る、本発明に従うコードタンパク質及び天然野生型IFNα−7タンパク質のモデルを表す。図1Bは、図1Aで表したタンパク質の各自の下部のモデルのクローズアップを表す。図1A及び図1Bにおいて、黒いリボンは天然野生型IFNα−7の構造を表し、そして白いリボンはD72N突然変異型IFNα−7タンパク質の構造を表す。
【図2】図2Aは、SNP F116Sを含んで成る、本発明に従うコードタンパク質及び天然野生型IFNα−7タンパク質のモデルを表す。図2Bは、図2Aで表したタンパク質の各自の上部のモデルのクローズアップを表す。図2A及び図2Bにおいて、黒いリボンは天然野生型IFNα−7の構造を表し、そして白いリボンはF116S突然変異型IFNα−7タンパク質の構造を表す。
【図3】図3Aは、SNP R121Kを含んで成る、本発明に従うコードタンパク質及び天然野生型IFNα−7タンパク質のモデルを表す。図3Bは、図3Aで表したタンパク質の各自の中央部のモデルのクローズアップを表す。図3A及び図3Bにおいて、黒いリボンは天然野生型IFNα−7の構造を表し、そして白いリボンはR121K突然変異型IFNα−7タンパク質の構造を表す。
【図4】図4Aは、SNP K159Qを含んで成る、本発明に従うコードタンパク質及び天然野生型IFNα−7タンパク質のモデルを表す。図4Bは、図4Aで表したタンパク質の各自の上部のモデルのクローズアップを表す。図4A及び図4Bにおいて、黒いリボンは天然野生型IFNα−7の構造を表し、そして白いリボンはK159Q突然変異型IFNα−7タンパク質の構造を表す。
【図5】図5は、TF−1細胞系へのD72N突然変異型IFNα−7の抗増殖作用の測定についての試験結果を表す。この図において、横座標はIFNαの濃度(ng/ml)に相当し、そして縦座標は細胞増殖の阻害(%)に相当する。D72N突然変異型IFNα−7(黒いひし形)の抗増殖作用は、野生型IFNα−2(白い四角)のものと比較される。
【図6】図6は、VSVウイルスによってあらかじめ感染させられ、そしてD72N突然変異型IFNα−7タンパク質で処理したマウスの生存率を、野生型IFNα−2で処理したもの、又は処置されてないものと比較して表す。この図において、横座標は生存時間(日数)に相当し、そして縦座標はVSV感染マウスの相対的生存率に相当する。黒いひし形は、D72N突然変異型IFNα−7で処理した、VSV感染マウスについてのデータを表し、そして白い三角は、処理されていない、VSV感染マウスについてのデータを表す。
【図7】図7は、悪性フレンド赤白血病細胞(FLC)をあらかじめ接種し、そしてD72N突然変異型IFNα−7タンパク質で処理したマウスの生存率を、野生型IFNα−2で処理したもの、又は処理してないものと比較して表す。この図において、横座標は生存時間(日数)に相当し、そして縦座標は、FLCを接種したマウスの相対的生存率に相当する。黒い四角は、D72N突然変異型IFNα−7で処理した、FLC接種マウスについてのデータを表し、そして白い三角は、処理していないFLC接種マウスについてのデータを表す。
Claims (43)
- a)ヌクレオチド配列である配列番号1の全部又は一部であって、但し、そのようなヌクレオチド配列、又は配列の一部が、a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,及びa1212gから成る群から選択される少なくとも1つのSNPを含んで成るもの、あるいは
b)a)のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、
を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド。 - 配列番号1のヌクレオチド751〜1320を含んで成る、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、但し、当該配列が、t779c,g1033a,c1084a,g1135t,t1166c,及びg1181aから成る群から選択される、少なくとも1つのコードSNPを含んで成る、単離されたポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、少なくとも10個のヌクレオチドから構成される、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- アミノ酸配列である配列番号2の全部又は一部を含んで成り、且つV10A,D95N,L112I,V129L,F139S,及びR144Kから成る群から選択される少なくとも1つのコードSNPを有するポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- アミノ酸配列である配列番号2の全部又は一部を含んで成り、且つコードSNP D95Nを有するポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- ヌクレオチド配列である配列番号1と80〜100%の同一性を有するポリヌクレオチドの全部又は一部を同定し、あるいは増幅する方法であって、適当なハイブリダイゼーション条件下で、前記ポリヌクレオチドを請求項1に記載のポリヌクレオチドとハイブリダイズさせることを含んで成る方法。
- ヌクレオチド配列である配列番号1と80〜100%の同一性を有するポリヌクレオチドの全部又は一部を遺伝子型判定するための方法であって、対象者又は対象者群のゲノムDNAの注目の領域を増幅し、そして559,580,667,682,779,1033,1084,1125,1135,1161,1166,1181,及び1212から成る群から選択される、ヌクレオチド配列である配列番号1中の少なくとも1つの位置の対立遺伝子を決定する段階、を含んで成る方法。
- 遺伝子型判定がミニシークエンスによって実施される、請求項7に記載の方法。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドを含んでなる組換えベクター。
- 請求項9に記載の組換えベクターを含んで成る宿主細胞。
- ポリペプチドを分離するための方法であって、請求項10に記載の宿主細胞を培養液中で培養し、そして前記ポリペプチドを培養液から分離することを含んで成る方法。
- 請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
- アミノ酸配列である配列番号2の全部又は一部を含んで成り、且つV10A,D95N,L112I,V129L,F139S,及びR144Kから成る群から選択される少なくとも1つのコードSNPを有する、単離されたポリペプチド。
- アミノ酸配列である配列番号2のアミノ酸24〜189を含んで成り、且つV10A,D95N,L112I,V129L,F139S,及びR144Kから成る群から選択される少なくとも1つのコードSNPを有する、請求項12に記載のポリペプチド。
- アミノ酸配列である配列番号2の24〜189のアミノ酸を含んで成り、且つコードSNP D95Nを有する、請求項12に記載のポリペプチド。
- 免疫特異的抗体を得るための方法であって、動物を請求項12に記載のポリペプチドで免疫化し、そして前記抗体を前記動物から回収すること、を含んで成る方法。
- 請求項16に記載の方法から生じる免疫特異的抗体。
- 試験される1又は複数の化合物の中から、アミノ酸配列である配列番号2の全部又は一部を含んで成り、且つV10A,D95N,L112I,V129L,F139S,及びR144Kから成る群から選択される少なくとも1つのコードSNPを有する単離されたポリペプチドの活性を活性化し、又は阻害する物質を同定するための方法であって、
a)請求項9に記載の組換えベクターを含んで成る宿主細胞を提供し、
b)前記宿主細胞を試験される前記化合物と接触させ、
c)前記ポリペプチドの活性に対する活性又は阻害作用を決定し、それにより前記活性又は阻害物質を同定すること、
を含んで成る方法。 - 試験される1又は複数の化合物の中から、アミノ酸配列である配列番号2の全部又は一部を含んで成り、且つV10A,D95N,L112I,V129L,F139S,及びR144Kから成る群から選択される少なくとも1つのコードSNPを有する単離されたポリペプチドによって活性が増強され又は阻害される物質を同定するための方法であって、
a)請求項9に記載の組換えベクターを含んで成る宿主細胞を提供し、
b)前記宿主細胞を試験される前記化合物と接触させ、
c)前記物質の活性に対する増強又は阻害作用を決定し、それにより前記の増強され又は阻害された物質を同定すること、
を含んで成る方法。 - 対象者の生物学的特性を解析するための方法であって、以下の段階:
a)対象者のゲノムにおける、請求項1に記載のポリヌクレオチドの有無を決定し、
b)対象者における、請求項1に記載のポリヌクレオチドの発現レベルを決定し、
c)対象者における、請求項12に記載のポリペプチドの有無を決定し、
d)対象者における、請求項12に記載のポリペプチドの濃度を決定し;あるいは
e)対象者における、請求項12に記載のポリペプチドの機能性を決定すること、のうちの少なくとも1つを実施すること、を含んで成る方法。 - ヌクレオチド配列、又はヌクレオチド配列の一部が、a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,及びa1212g,から成る群から選択される少なくとも1つのSNPを含んで成る、ヌクレオチド配列である配列番号1、あるいは前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、の全部又は一部を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド;前記ポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクター;前記組換えベクターを含んで成る宿主細胞;アミノ酸配列である配列番号2の全部又は一部を含んで成り、且つV10A,D95N,L112I,V129L,F139S,及びR144Kから成る群から選択される少なくとも1つのコードSNPを有する、単離されたポリペプチド;前記ポリペプチドに特異的な抗体、から成る群から選択される、1又は複数の化合物を含んで成る治療物質。
- 個体における、ガン及び腫瘍、感染病、性病、免疫関連疾患及び/又は自己免疫疾患及び障害、心臓血管疾患、代謝病、中枢神経系の疾患、並びに化学療法に関連する障害から成る群から選択される疾患を予防又は処置する方法であって、前記個体に対し、有効量の請求項21に記載の物質、及び医薬として許容される賦形剤を投与することを含んで成る方法。
- 前記ガン及び腫瘍が、転移型腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、首、頭及び腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド性腫瘍及び免疫欠損後に出現する腫瘍であってエイズの場合にはカポジ肉腫を含んで成るもの、を含んで成る、請求項22に記載の方法。
- 前記代謝病が肥満のような非免疫関連疾患を含んで成る、請求項22に記載の方法。
- 前記感染病が、慢性B型及びC型肝炎並びにHIV/エイズを含んで成るウイルス感染、感染性肺炎、及び性病、例えば生殖器疣、を含んで成る、請求項22に記載の方法。
- 前記の中枢神経系の疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含んで成る、請求項22に記載の方法。
- 前記免疫関連疾患及び自己免疫疾患が、組織又は器官の移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含んで成る、請求項22に記載の方法。
- 個体における、創傷治癒、透析患者の貧血、及び骨粗鬆症から成る群から選択される疾患を予防又は処置するための方法であって、前記個体に対し、有効量の請求項21に記載の物質、及び医薬として許容される賦形剤を投与することを含んで成る方法。
- 対象者における、請求項12に記載のポリペプチドの活性を増大又は低下させるための方法であって、治療的に有効な量の1又は複数の:ヌクレオチド配列、又はヌクレオチド配列の一部が、a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,及びa1212g,から成る群から選択される少なくとも1つのSNPを含んで成るヌクレオチド配列である配列番号1、あるいは前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、の全部又は一部を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド;前記ポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクター;前記組換えベクターを含んで成る宿主細胞であって、処置される前記対象者から得られうる宿主細胞;アミノ酸配列である配列番号2の全部又は一部を含んで成り、且つV10A,D95N,L112I,V129L,F139S,及びR144Kから成る群から選択される少なくとも1つのコードSNPを有する、単離されたポリペプチド;前記ポリペプチドに特異的な抗体;及び医薬として許容される賦形剤、を投与することを含んで成る方法。
- 個体における、請求項1に記載のポリヌクレオチドの前記個体のゲノムの存在に関連する障害又は疾患を予防又は処置するための方法であって、治療的に有効な量の1又は複数の:ヌクレオチド配列である配列番号1の全部又は一部を含んで成り、且つa559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,及びa1212gから成る群から選択される少なくとも1つのSNPを有する、単離されたポリヌクレオチド、あるいは前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列の全部又は一部を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド;前記ポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクター;前記組換えベクターを含んで成る宿主細胞であって、処置される前記対象者から得られうる宿主細胞;アミノ酸配列である配列番号2の全部又は一部を含んで成り、且つV10A,D95N,L112I,V129L,F139S,及びR144Kから成る群から選択される少なくとも1つのコードSNPを有する、単離されたポリペプチド;前記ポリペプチドに特異的な抗体;及び医薬として許容される賦形剤、を投与することを含んで成る方法。
- IFN□−7遺伝子内の、a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,及びa1212gから成る群から選択される少なくとも1つのSNPと、疾患又は疾患に対する抵抗性、との間の統計的に関連している関係を決定するための方法であって、
a)個体群を遺伝子型判定し、
b)前記個体群内の前記疾患又は疾患に対する抵抗性の分布を決定し、
c)遺伝子型のデータと、前記疾患又は疾患に対する抵抗性とを比較し、そして
d)統計的に関連している関係についての前記比較を解析すること、
を含んで成る方法。 - 疾患の予後又は疾患に対する抵抗性を診断し、又は決定するための方法であって、IFN□−7遺伝子内の、a559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,及びa1212gから成る群から選択される少なくとも1つのSNPを検出することを含んで成る方法。
- 試験される1又は複数の化合物の中から、D95N突然変異型IFN□−7の遺伝子産物と実質的に同程度の生物学的活性を有する化合物を同定するための方法であって、
a)試験される化合物の生物活性、例えば、シグナル伝達、樹状細胞の成熟、CD4+又はCD8+Tリンパ球によるサイトカイン放出、単球によるサイトカイン放出、in vitro又はin vivoでの抗ウイルス活性、悪性フレンド赤白血病細胞をあらかじめ接種されたマウスにおける抗腫瘍活性、Daudi Burkitt's細胞系に対する細胞性の抗増殖活性、TF−1細胞系に対する細胞性の抗増殖活性を決定し;
b)前記化合物の段階a)で決定した活性を、D95N突然変異型IFN□−7の遺伝子産物の活性と比較し、
c)段階b)で実施した比較に基づき、前記化合物が、D95N突然変異型IFN□−7の遺伝子産物と比較して、実質的に同程度又はそれより低い、又はそれより高い活性を有するか否かを決定すること、を含んで成る方法。 - 試験される化合物が、合成ペプチドコンビナトリアルライブラリー、高処理量スクリーニングから既に同定され、又はコンピューターを使ったドラッグデザインによって設計された結果、アミノ酸配列である配列番号2のポリペプチド、又はアミノ酸配列である配列番号2の24から189位の間に含まれるアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列のポリペプチド、であって、但し、アミノ酸配列がD95N SNPを含んで成るもの、と同一の三次元構造及び/又は化学作用を有する、請求項33に記載の方法。
- 請求項33に記載の方法によって同定される化合物。
- 個体における、ガン及び腫瘍、感染病、性病、免疫関連疾患及び/又は自己免疫疾患及び障害、心臓血管疾患、代謝病、中枢神経系の疾患、並びに化学療法に関連する障害から成る群から選択される疾患を予防又は処置する方法であって、前記個体に対し、有効量の請求項35に記載の化合物、及び医薬として許容される賦形剤を投与することを含んで成る方法。
- 前記ガン及び腫瘍が、転移型腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、首、頭及び腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド性腫瘍及び免疫欠損後に出現する腫瘍であってエイズの場合にはカポジ肉腫を含んで成るもの、を含んで成る、請求項36に記載の方法。
- 前記感染病が、慢性B型及びC型肝炎並びにHIV/エイズを含んで成るウイルス感染、感染性肺炎、及び性病、例えば生殖器疣、を含んで成る、請求項36に記載の方法。
- 前記免疫関連疾患及び自己免疫疾患が、組織又は器官の移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含んで成る、請求項36に記載の方法。
- 前記の中枢神経系の疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含んで成る、請求項36に記載の方法。
- 前記代謝病が肥満のような非免疫関連疾患を含んで成る、請求項36に記載の方法。
- 個体における、創傷治癒、透析患者の貧血、及び骨粗鬆症から成る群から選択される疾患を予防又は処置するための方法であって、前記個体に対し、有効量の請求項35に記載の化合物、及び医薬として許容される賦形剤を投与することを含んで成る方法。
- 1又は複数の:ヌクレオチド配列である配列番号1の全部又は一部を含んで成り、且つa559c,g580a,c667t,c682t,t779c,g1033a,c1084a,g1125a,g1135t,g1161a,t1166c,g1181a,及びa1212gから成る群から選択される少なくとも1つのSNPを有する、単離されたポリヌクレオチド、あるいは前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列の全部又は一部、を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド;前記ポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクター;前記組換えベクターを含んで成る宿主細胞;アミノ酸配列である配列番号2の全部又は一部を含んで成り、且つV10A,D95N,L112I,V129L,F139S,及びR144Kから成る群から選択される少なくとも1つのコードSNPを有する、単離されたポリペプチド;前記ポリペプチドに特異的な抗体、を含んで成る診断キット。
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