CN1310675C

CN1310675C - TNF－α转变酶

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Publication number: CN1310675C
Application number: CNB961944595A
Authority: CN
Inventors: R·A·布莱克; C·劳赫; C·J·马奇; D·P·塞雷提
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1995-07-20
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 2007-04-18
Anticipated expiration: 2016-06-03
Also published as: CN1211918A; HK1017606A1

Abstract

本发明分离和纯化可将TNF-α从26kD形式转变为17kD形式的金属蛋白酶，并获得了cDNA序列。特别是，蛋白酶的分子量为约80kD。分离和纯化的蛋白酶可用于设计其抑制剂，并可用于治疗试剂。检测分子的蛋白酶抑制活性的测定方法也是本发明的一个方面。

Description

TNF-α转变酶

发明领域

本发明涉及纯化和分离TNF-α转变酶，这种酶的核酸序列、产生重组TNF-α转变酶的方法，含有这种酶的药物组合物及它们在各种测定和治疗方面的用途。

发明背景

肿瘤坏死因子-α(TNF-α，也称作恶液质素)是一种可诱导对多种细胞类型产生各种效应的哺乳动物蛋白质。TNF-α最初的特征是可以裂解肿瘤细胞，其可由激活的细胞如单核吞噬细胞、T细胞、B细胞、肥大细胞和NK细胞产生。TNF-α有两种形式，相对分子量为26000(26kD)的II型膜蛋白和可溶的17kD的通过蛋白酶裂解从细胞结合蛋白质上产生的形态。TNF-α是宿主对革兰氏阴性细菌应答的主要介体。从革兰氏阴性细菌细胞壁产生的脂多糖(LPS，也称作内毒素)是TNF-α合成的有效刺激剂。由于由TNF-α的过量生成或增量调节地生成导致的毒性非常严重，因此进行了相当的努力来控制或调节血清中TNF-α的水平。这些有效控制血清TNF-α水平中的重要部分是掌握TNF-α生物合成的机理。

分泌TNF-α的机理以前没有人提出。Krieght等人在“细胞”53：45(1988)中推测TNF-α的“分泌”是由于26kD膜结合分子被一个未知的蛋白裂解酶或蛋白酶转变而产生的。Scuderi等人在“免疫学杂志”143：168(1989)中提出，TNF-α从人的白细胞中释放与一种或多种丝氨酸蛋白酶如白细胞弹性蛋白酶或胰蛋白酶有关。发现一种丝氨酸蛋白酶抑制剂即对-甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯可以浓度依赖的方式抑制人白细胞TNF-α的释放。Scuderi等人提出精氨酸甲酯竞争结合酶活性中心的精氨酸结合位点，因此抑制了水解。抑制剂的赖氨酸和苯丙氨酸类似物据报道没有精氨酸甲酯那样的活性。然而，从来没有显示该化合物是通过抑制裂解26kD TNF的蛋白酶而发挥作用。最近，有报道金属蛋白酶抑制剂抑制TNF从THP-1细胞中的释放。参见Mohler等人，“自然”370：218(1994)；Gearing等人，“自然”370：555(1994)；和McGeehan等人，“自然”370：568(1994)。

大多数(并非所有)蛋白酶识别特定氨基酸序列。一些蛋白酶主要识别位于断裂键的N末端的残基，一些蛋白酶识别位于断裂键的C末端的残基，一些蛋白酶识别位于断裂键的两边的残基。金属蛋白酶用一个结合的金属离子，通常是Zn²⁺，来催化肽键的水解。金属蛋白酶和关节损伤(骨架金属蛋白酶)，血压调节(血管紧张肽转变酶)和肽-激素水平(中性内肽酶-24.11)调节有关。

发明概要

本发明涉及一种分离和纯化的多肽形式的具有生物活性的TNF-α转变酶(“TACE”)。此外，本发明还涉及分离的TACE的核酸序列和包括编码TACE的cDNA的表达载体。本发明还包括被含有编码TACE的cDNA的表达载体转染或转化的宿主细胞，和在诱导TACE表达的条件下培养这些宿主细胞来产生TACE的方法。通过纯化TACE，使针对TACE的抗体，特别是单克隆抗体成为本发明的一方面内容。此外，本发明还包括用TACE来筛选其有效抑制剂的方法和用TACE作为治疗剂来治疗由细胞结合的TNF-α或其它分子介导的疾病。而且，用TACE来设计其抑制剂的方法也是本发明的一个方面内容。

本发明的分离纯化的金属蛋白酶可将26kD膜结合形式的TNF-α转变成17kD形式，其分子量在约66kD至约97kD之间。TACE的cDNA序列列在SEQID NO：1中。分离和纯化的TNF-α转变酶(“TACE”)包括SEQ ID NO：2中的氨基酸18-824。

抑制TACE可抑制TNF-α进入血清和其它胞外空间。因此TACE抑制剂可用于临床治疗以TNF-α过量生成和增量调节生成为特征的状况。适用于某些病理状况的TACE抑制剂可选择性抑制TACE而不影响TNF-β(也称为淋巴毒素)的血清水平。TNF-α过量生成和增量调节生成与某些状况和疾病有关，例如，系统性炎性反应综合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome)、再灌注损伤、心血管疾病、传染性疾病如HIV感染和HIV神经病、妇产科疾病、炎性/自身免疫、过敏/特异反应疾病、恶性肿瘤、移植物包括器官移植物排斥或移植物抗宿主疾病、恶病质、先天性疾病、皮肤疾病、神经疾病、肾病、中毒性和新陈代谢/自发性疾病。

TACE的抑制剂可防止细胞结合的TNF-α的裂解，从而减少了TNF-α在血清和组织中的水平。本发明包括该类实例，并包括一种抑制TNF-α从哺乳动物细胞膜上裂解的方法，其包括对这种哺乳动物施用有效量的化合物，该化合物可抑制有SEQ ID NO：2中18至671直至824个氨基酸序列的酶的TNF-α蛋白酶解活性。此外本发明包括一种治疗由以NF-α过量生成和增量调节生成为特征疾病的哺乳动物的方法，包括对哺乳动物施用有效量的化合物，该化合物可抑制有SEQID NO：2中18-824氨基酸序列的酶的TNF-α蛋白酶解活性。这种抑制剂有显著的临床用途，可有效治疗上面列举的与TNF-α有关的疾病。TACE的分离和纯化为有效开发TACE抑制剂和治疗TNF相关的疾病提供了良好的前提，实际上，其导致了用TACE本身作为治疗剂用于某些生理性疾病。例如，除TNF-α外，其它细胞因子和细胞因子受体和一些粘着蛋白可被TACE或相关的蛋白酶从细胞表面释放下来。施用TACE可调节或除去细胞表面的细胞因子、细胞因子受体和涉及肿瘤细胞生长、发炎或受精的粘着蛋白。

发明细节描述

分离得到编码人TNF-α转变酶(“TACE”)的cDNA，并公开在SEQ ID NO：1中。该编码人TACE的cDNA能够构建包括编码TACE的核酸序列的表达载体；用表达载体转染或转化宿主细胞；以分离和纯化的蛋白质形式的具有生物活性的人TACE；和与TACE免疫反应的抗体。

本发明的分离和纯化的TACE多肽可用于检测分子的TACE抑制活性。在这种涉及常规技术的方法中，将一种未知TACE抑制活性的分子与一个底物混合，并与TACE多肽培育。然后用色谱检测底物裂解的程度。

此外，本发明的TACE多肽用于根据结构设计TACE抑制剂。这种设计包括决定这种TACE多肽三维结构的步骤、分析三维结构可能的底物结合位点的步骤、合成一种掺入可预计反压位点的分子的步骤和测定分子的TACE抑制活性的步骤。

与TACE免疫反应的抗体，特别是针对TACE的单克隆抗体在本发明中是可获得的。这种抗体可用于在体内抑制TACE活性，并可检测样品中TACE的存在。

如这里所用的，术语“TACE”指一种多肽，其可将TNF-α(包括胞内区域，膜区域和胞外区域)的26kD膜结合的形式转变成可溶的含有TNF-α蛋白C-末端156个残基的17kD形式。TACE包括有SEQ ID NO：2中18至824氨基酸序列的蛋白质，和与SEQ ID NO：2中18至824氨基酸序列的蛋白质高度相近(至少80％，较佳的为90％同源)且有生物活性的蛋白质。此外，TACE指SEQ ID NO：1中52-2472核苷酸的有生物活性的基因产物。术语“TACE”还包括膜结合蛋白(其包括胞内区域、膜区域和胞外区域)，和可溶或截短的基本上包含蛋白质胞外部分、保持生物活性并可分泌的蛋白质。这些可溶的蛋白质的特定例子是那些包括SEQ ID NO：2中18-671氨基酸序列的蛋白质。截短形式是那些比蛋白质胞外部分更短的蛋白质，其包含例如SEQ ID NO：2的18-477氨基酸或基本上包含所有催化区域，即SEQ ID NO：2的215至477个氨基酸。

本发明的分离和纯化的TACE用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定分子量为约66kD至约97kD。更具体的是，用SDS-PAGE测定分子量约为80kD。

这里所用的术语“分离的和纯化的”指TACE中基本上不含其它蛋白质或多肽，例如作为重组宿主细胞培养的纯化产品或来自非重组体源的纯化的产品。这里所用的术语“基本上纯化的”指混合物包含TACE，其基本上不含其它蛋白质或多肽，只是存在已知的可用特定抗体除去的蛋白质，且基本上纯化的TACE保持生物活性。术语“纯化的TACE”指的是如本文所描述的“分离的和纯化的”形式的TACE或“基本上纯化的”形式的TACE。

术语“生物活性”是指TACE的生物活性，其指TACE可将26kD形式的TNF-α转变为17kD形式。

“核酸序列”指的是分离片段形式的多核苷酸分子或较大核酸构键物的组分，其中构键物从DNA或RNA分离获得，至少曾经为基本上纯净形式(即无污染内源物)且数量或浓度可以用标准生化方法鉴定，操作及回收组分核苷酸序列(如在Sambrook等人在“分子克隆：实验室手册”中，第2版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)中所述)。这些序列最好应提供可读框架，且不被内部不翻译序列或通常在真核生物基因中存在内含子打断。不翻译DNA序列可在可读框架的3′或5′端，其不干扰编码区域的操作和表达。

这里所指的“TACE变异体”指与天然TACE基本上同源，但由于一个或多个氨基酸缺失、插入或取代而与天然TACE(人、鼠或其它哺乳动物种)氨基酸序列不同的多肽。变异体氨基酸与天然TACE氨基酸序列有至少80％相同，最好有90％相同。用威斯康辛大学遗传学计算机组(University of Wisconsin GeneticsComputer Group(UWGCG))Devereux等人(Nucl.Acids Res.12：387，1984)的6.0版GAP计算机程序比较序列信息可测定相同百分比。 GAP程序用了Needleman和Wunsch(分子生物学杂志，48：443，1970)，并经Smith和Waterman(Adv.Appl.Math2：482，1981)改编的排列方法。GAP程序较佳的缺省参数包括：(1)核苷酸的一元比较矩阵(含有数值1代表相同，数值0代表不相同)和加权比较矩阵(Gribskov和Burgess，Nucl.Acids Res.14：6745，1986)，如Schwartz和Dayhoff编辑的Atlas ofProtein Sequence and Structure，国家生物医学研究基金会，pp.353-358，1979中所描述的；(2)每个缺口补偿3.0，每个缺口的每个特征附加1.0的补偿；和(3)末端缺口不补偿。

变异体可包括保守取代序列，指给定氨基酸残基可被有相似理化特征的残基取代。保守取代是本领域所熟知的，包括脂肪族残基被另一个如Ile、Val、Leu或Ala取代成另一个，或极性残基间取代，如Lys和Arg间； Glu和Arg间；或Gln和Asn间的取代。常规步骤和方法可用于制备和使用这些变异体。其它此类保守取代，例如整个有相似疏水特性的区域的取代是熟知的，通常被采用。天然发生的TACE变异体也包括在本发明中。这些变异体的例子是由可变mRNA剪接产生的或由TACE蛋白的蛋白酶解裂解而仍保持TACE蛋白酶解性质的蛋白质。mRNA的可变剪接可形成截短的但有生物活性的TACE蛋白，如蛋白质的一种天然发生的可溶形式，例如在SEQ ID NO：4中所示。由蛋白酶解引起的变异体包括，例如由于从TACE蛋白上蛋白酶解除去一个或多个末端氨基酸(通常为1-5个末端氨基酸)，不同类型宿主细胞中在表达时其N-或C-末端不同。

如上所述，本发明提供分离和纯化的、或均一的、重组和非重组TACE多肽。保持所需生物活性的天然TACE蛋白的变异体和衍生物可通过编码天然TACE多肽的核苷酸序列的突变来获得。天然氨基酸序列的改变可由多种常规方法中的任一种来实现。在特定基因座引入突变是通过合成含有突变型序列的寡核苷酸，旁侧有可与连接天然序列的片段连接的限制性位点。在连接后，得到的重新构建的序列编码一个有所需氨基酸插入，取代或缺失的类似物。

或者，可用寡核苷酸定向的位点特异定诱变方法提供一种改变的基因，其中预先确定的密码子可由取代、缺失或插入来改变。典型的上述方法由Walder等人(基因42：133，1986)；Bauer等人(基因37：37，1985)；Craik(生物技术1985年1月，12-19)；Smith等人(基因工程：原理和方法，Plenum Press，1981)；Kunkel(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488，1985)；kunkel等人(酶学方法，154：367，1987)；和美国专利No 4,518,584和4,737,462公开，并在这里引证参照。

TACE可通过与其它化学成分如糖基基团，聚乙二醇(PEG)基团，脂质，磷酸盐，乙酰基基团等形成共价或凝集共轭物被修饰形成TACE衍生物。TACE的共价衍生物可通过将化学成分和TACE氨基酸侧链或TACE多肽的N末端或C末端或其胞外区域的官能团连接来形成。本发明范围中的其它TACE衍生物包括TACE或其片段与其它蛋白质或多肽的共价或凝集共轭物，如在重组培养中N末端或C末端融合的合成。例如，共轭物可包括TACE多肽N末端的信号或前导多肽序列(如，酵母属(Saccharomyces)的α因子前导序列)。信号或前导多肽在翻译时或翻译后将共轭物定向从其合成位点输送至细胞膜或细胞壁的内部或外部位点。

TACE多肽共轭物可包括加入的多肽以便于TACE纯化和鉴定。这些多肽包括，例如，聚组氨酸或在美国专利No.5,011,912中和Hopp等人在“生物技术”(Bio/Technology，6：1204，1988)中描述的抗原鉴定多肽。

本发明还包括有或没有相连的天然方式糖基化的TACE多肽。酵母或哺乳动物表达系统(如，COS-7细胞)中表达的TACE在分子量和糖基化方式上与天然TACE多肽相似或有显著的不同，这依赖于所造的表达系统。在细菌表达系统，如大肠杆菌中的TACE多肽表达提供了非糖基化的分子。糖基基团可用常规方法特别可用糖肽酶除去。通常，糖基化TACE可与过量摩尔的糖肽酶(BoehringerMannheim)培育。

本发明还包括等价的DNA构建物，其编码各种加入或取代氨基酸残基或序列，或与生物活性无关的末端或中间缺失的残基或序列。例如，在TACE胞外区域的N糖基化位点可被修饰以预防糖基化，使哺乳动物和酵母表达系统中表达出糖减少的类似物。真核多肽中的N糖基化位点的特征是氨基酸三联体Asn-X-Y，其中X是除Pro的氨基酸，Y是Ser或Thr。编码这些三联体核苷酸序列的适当取代，插入或缺失可防止在Asn侧链与糖类连接。单个核苷酸的改变，例如选择用不同的氨基酸代替Asn，就足以失活N-糖基化位点。已知的失活蛋白质内的N糖基化位点步骤包括那些在美国专利5,071,972和欧洲专利276,846中所述的步骤，并在这里引证参照。

在另一个例子中，编码生物活性非必需的Cys残基序列可通过使Cys残基缺失或被其它氨基酸取代而改变，可防止在复性时不正确的分子内二硫键形成。其它等价物可通过修饰相邻的两个碱性氨基酸残基来形成，以增加在有KEX2蛋白酶活性的酵母系统中的表达。欧洲专利212,914公开了用位点特异性诱变失活蛋白质中KEX2蛋白酶加工位点。KEX2蛋白酶加工位点是通过缺失，插入或取代残基，改变Arg-Arg，Arg-Lys和Lys-Arg对来失活的，从而消除了这些相邻碱性残基的发生。Lys-Lys对KEX2裂解较不敏感，将Arg-Lys或Lys-Arg转变成Lys-Lys表示了一个保守而较佳的失活KEX2位点的方法。

本发明范围中的核酸序列包括与这里公开的天然TACE核酸序列在适中的或高度严紧性条件下杂交的分离的DNA和RNA序列，其编码有生物活性的TACE。中度严紧性的条件，如该领域技术人员所知的，并如Sambrook等人在“分子克隆：实验室手册”(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2 ed.Vol.1，pp.1.101-104，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989))中定义的，包括用预洗溶液5X SSC，0.5％SDS，1.0mM EDTA(pH8.0)和杂交条件为约50℃至60℃，5XSSC，过夜，较佳温度为55℃。高度严紧的条件包括较高的杂交温度和洗涤。技术人员可认识到温度和洗液盐浓度可根据一些因素如探针的长度而作必要的调整。

由于遗传密码的已知简并性，其中多个密码子可编码相同的氨基酸，因此，DNA序列可与SEQ ID NO：1中所示的不同但仍可编码出与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相同的TACE蛋白质。这些变异DNA序列可由沉默诱变(如，在PCR扩增中发生的)，或由天然序列有目的诱变产生。

因此本发明提供等价的有编码生物活性的TACE的分离的DNA序列，其选自：(a)天然哺乳动物TACE基因的编码区域；(b)有SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列的cDNA；(c)可与一种DNA杂交的DNA，前者是(a)在中度严紧条件下，可编码生物活性TACE；和(d)与如(a)、(b)或(c)中确定的DNA的遗传密码具有简并性的DNA，其可编码有生物活性的TACE。由这些DNA等价序列编码的TACE蛋白质包括在本发明中。

与SEQ ID NO：1中的DNA序列等价的DNA可与天然的双链DNA在中度严紧或高度严紧条件下进行杂交，其中天然双链DNA可编码含有SEQ ID NO：2的18-Xaa氨基酸序列的多肽，其中Xaa是671至824的一个氨基酸。由这种DNA编码的TACE蛋白质例子包括(但不局限于)，TACE片段(可溶的或与膜结合的)和有如上所述的失活N糖基化位点、失活KEX2蛋白酶加工位点、或保守氨基酸取代的TACE蛋白质。本发明也包括由从其它哺乳动物种类衍生获得的DNA编码的TACE蛋白质，其中DNA在中度或高度严紧条件下与SEQ ID NO：1中的互补的cDNA杂交。

或者，TACE结合的蛋白质，如本发明的抗TACE抗体可与一个固相如柱色谱基质或类似底物结合，以鉴定，分离或纯化有TACE在其表面上表达的细胞。TACE结合蛋白质与固相接触表面的连接可用任何一种方法实现。例如，可在磁性微球体上包被TACE结合蛋白质并置于一个通过磁场的培育容器中。细胞混合物悬浮液与其上有TACE结合蛋白质的固相接触。表面有TACE的细胞与固定的TACE结合蛋白质结合，而未结合的细胞被洗去。这种亲和结合方法可用于从溶液中纯化，筛选或分离这种表达TACE的细胞。将阳性选择细胞从固相上解离下来的方法是该领域已知的，其包括例如用酶的方法。这些酶最好对细胞无毒、无损伤，最好直接裂解细胞表面结合的配偶体。

或者，可能含有表达TACE的细胞的细胞混合物首先可与生物素化的TACE结合蛋白质培育。培育时间典型的为一个小时，以保证与TACE充分结合。然后将获得的混合物通过一根装有包被亲和素珠的柱，其中亲和素对生物素的高度亲和性使TACE结合细胞与珠结合。用亲和素包被的珠粒的方法是该领域已知的。见Berenson等人“细胞生物化学杂志”(j.Cell.Biochem.，10D：(239)(1986))。洗去未结合物和解离结合的细胞是用常规方法进行。

在上面描述的方法中，合适的TACE结合蛋白质是抗-TACE抗体，和其它可与TACE高度亲和性结合的蛋白质。较佳的TACE结合蛋白质是如在实施例4中获得的抗-TACE单克隆抗体。

TACE多肽可以寡聚体形式存在，如共价连接或非共价连接的二聚体或三聚体。寡聚体可通过不同TACE多肽上的半胱氨酸残基间形成的二硫键连接形成。在本发明的一个实施例中，TACE二聚体是通过TACE与抗体(如IgG1)Fc区域以不干扰TACE生物活性的形式融合形成。Fc多肽最好与可溶TACE的C-末端(只包括胞外区域)融合。包括异源多肽的融合蛋白质常用的制备方法是与从抗体衍生获得的多肽(包括Fc区域)的不同部位融合，方法是如Ashkenazi等人(PNAS USA88：10535，1991)和Byrn等人(自然，344：677，1990)描述的，并在这里引证参照。编码TACE：Fc融合蛋白的融合基因可插入一个合适的表达载体中。TACE：Fc融合蛋白质可合成许多类似抗体分子，其中在Fc多肽间形成链内二硫键，形成了二价TACE。如果融合蛋白用一个抗体的重链和轻链来制备，那么可以形成一个有多达四个TACE胞外区域的TACE寡聚物。或者，可用肽接头连接两个可溶性TACE区域。

含有编码TACE核酸序列的重组表达载体可用已知的方法制备。表达载体包括一个可与合适转录或转译调控核苷酸序列(如从哺乳动物，微生物，病毒或昆虫基因获得的)可操作连接的TACE DNA序列。调控序列的例子包括转录启动子、操纵子、或增强子、mRNA核糖体结合位点，和控制转录和转译启动和终止的适当的序列。当调控序列与TACE DNA序列功能性相关时，这两种核苷酸序列是“可操作连接”的。因此，当启动子核苷酸序列控制TACE DNA序列的转录时，启动子核苷酸序列与TACE DNA序列可操作连接。在表达载体中可附加入能在所需宿主细胞中复制的(复制起点)和一个鉴别转化体选择性基因。

此外，在表达载体中可加入编码与TACE不天然连接的合适的信号肽的序列。例如，在TACE序列中可融合入符合读框的信号肽(分泌性前导序列)的DAN序列，这样，最初转译的TACE是一种有信号肽的融合蛋白质。在有目的的宿主细胞中起作用的信号肽加强了TACE多肽的胞外分泌。信号肽可在TACE从细胞分泌时从TACE上裂解。

表达TACE多肽的合适的宿主细胞包括原核生物，酵母或较高等真核生物细胞。适用于细菌，真菌，酵母和哺乳动物宿主细胞的克隆和表达载体在例如Pouwel等人的“克隆载体”(Cloning Vectors：A Laboratory Manual，Elsevier，NewYork，(1985))中有所描述。无细胞转译系统也可被采用来用从这里公开的DNA构建物获得的RNA制备TACE多肽。

原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性微生物，例如，大肠杆菌属或芽胞杆菌属。适于转化的原核生物宿主细胞包括，例如，大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、鼠伤寒杆菌，和其它假单胞杆菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的各个种类。在原核宿主细胞如大肠杆菌中，TACE可包括N末端甲硫氨酸残基以使原核宿主细胞内的重组多肽更容易表达。N末端甲硫氨酸可与表达的重组TACE多肽裂解。

用于原核宿主细胞的表达载体通常包括一种或多种表型选择标记基因。表型选择标记基因是例如编码具有抗生素抗性或提供自养需求的蛋白质的基因。可用于原核宿主细胞的表达载体的例子包括从商业可获得的质粒如克隆载体pBR322(ATCC 37017)衍生获得的载体。pBR322含有氨苄青霉素和四环素抗性的基因，因此提供了简单的鉴定转化细胞的方法。为用pBR322构建一个表达载体，可在pBR322载体上插入合适的启动子和TACE DNA序列。其它商业可获得的载体包括例如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和pGEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。

通常用于重组原核宿主细胞表达载体的启动子序列包括β-内酰胺酶(青霉素酶)，乳糖启动子系统(Chang等人，自然，275：615，1978；和Goeddel等人，自然，281：544，1979)，色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等人，Nucl.Acids Res.8：4057，1980；和欧洲专利EP-A-36776)和tac启动子(Maniatis，分子克隆：实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory，p.412，1982)。特别有用的原核宿主细胞表达系统是用噬菌体λP_L启动子和cI857ts热不稳定性阻遏序列。从美国典型培养物保藏中心“American Type Culture Collection”获得的加入λP_L启动子的衍生物的质粒载体包括质粒pHUB2(存在于大肠杆菌菌株JMB9(ATCC 37092)中)和pPLc28(存在于大肠杆菌RR1(ATCC 53082)中)。

TACE多肽可在酵母宿主细胞中表达，最好是酵母属(如酿酒酵母(S.cerevisiae))。也可采用另一些酵母属如毕赤氏酵母属(Pichia)，乳克鲁维氏酵母(K.lactis)或克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)。酵母载体通常包括一个来自2μ酵母质粒的复制序列起始点、自主复制序列(ABS)、启动子区域、聚腺苷酸化的序列、转录终止序列和可选择标记基因。适于酵母载体的合适的启动子顺序包括其它启动子、金属硫蛋白、3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等人，生物化学杂志，255：2073，1980)的启动子或其它糖酵解酶(Hess等人，J.Adv.Enzyme Reg.7：149，1968；和Holland等人，生物化学，17：4900，1978)，如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、果糖磷酸激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶、和糖激酶的启动子。其它适用于酵母表达的载体和启动子还在Hitzeman的欧洲专利申请-73,657或Fleer等人在“基因”(Gene，107：285-195(1991))和van den Berg等人在“生物技术”(Bio/Technology，8：135-139(1990)中有所描述。另一个是Russell等人(j.Biol.Chem.258：2674，1982)和Beier等人(自然，300：724，1982)所描述的葡萄糖阻抑型ADH2启动子。在酵母和大肠杆菌中可复制的穿梭载体可通过将用于在大肠杆菌中选择和复制的pBR322上的DNA序列(Amp^r基因和复制起点)插入上述的酵母载体中来构建。

酵母α因子前导序列可用于TACE多肽的定向分泌。α因子前导序列通常位于启动子序列和结构基因序列中间。见，如Kurjan等人，“细胞学”(Cell)30：933，1982；和Bitter等人的Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：5330，1984；美国专利4,546,082；和欧洲专利324,274。另一些适于使酵母宿主的重组多肽更易分泌的前导序列是该领域技术人员所熟知的。前导序列可在其近3′端修饰以获得一个或多个限制性酶切位点。这使前导序列与结构基因的融合更容易。

酵母转化过程是该领域技术人员所知的。一个过程在Hinnen等人的Proc.Natl.Acad.Sci.(USA 75：1929，1978)中有所描述。Hinnen等人的过程是在选择性培养基中选择Trp⁺转化体，其中选择性培养基是由0.67％酵母氮基，0.5％酪蛋白水解物，2％葡萄糖，10μg/ml腺嘌呤和20μg/ml尿嘧啶组成。

由含有ADH2启动子序列的载体转化的酵母宿主细胞可生长以诱导其在“丰富”培养基中表达。丰富培养基的一个例子是由1％酵母抽提物，2％胨和1％的含有80μg/ml腺嘌呤和80μg/ml尿嘧啶的葡萄糖组成。ADH2启动子的去阻抑是当培养基中的葡萄糖耗尽时发生。

也可用哺乳动物或昆虫的宿主细胞培养系统来表达重组TACE多肽Luckow和Summers(生物技术，6：47(1988))回顾了用杆状病毒系统在昆虫细胞中生产不均一蛋白质。也可用已建立的哺乳动物来源的细胞系。合适的哺乳动物细胞系的例子有猴肾细胞的COS-7细胞系(ATCC CRL 1651)(Gluzman等人，Cell23：175，1981)、L细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL 163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞和BHK(ATCC CRL 10)细胞系和从非洲绿猴肾脏细胞系CVI(ATCC CCL 70)衍生获得的CV-1/EBNA-1细胞系(如McMahan等人，EMBO J.10：2821，1991所描述的)。

哺乳动物宿主细胞表达载体的转录和转译控制序列可从病毒基因组中切下。通常所用的启动子序列和增强子序列是从多瘤病毒、腺病毒2、猴病毒40(SV40)和人巨细胞病毒衍生获得。从SV40病毒基因组衍生获得的DNA序列，例如SV40起始点，早期和晚期启动子，增强子，剪接位点和聚腺苷酸化位点可用于提供其它基因组件来在哺乳动物宿主细胞中表达结构基因序列。病毒早期和晚期启动子特别有用，因为两者均易从病毒基因组中以一段含有病毒复制起始点的片段获得(Fiers等人，自然273：113，1978)。也可用较小或较大的SV40片段，只要包括SV40病毒复制起始位点中从Hind III位点至Bgl I位点的约250bp的序列。

典型的用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可如Okayama和Berg(分子细胞生物学杂志，(Mol.Cell.Bio.)3：280，1983)公开的方法构建。在C127鼠乳上皮细胞中稳定高水平表达哺乳动物cDNA的有用的系统基本上用如Cosman等人(Mol.Immunol.23：935，1986)公开的方法构建。Cosman等人(自然，312：768，1984)描述的一种有用的高表达载体PMLSV N1/N4，如保藏号为ATCC 39890。另外有用的哺乳动物表达载体在EP-A-0367566，美国专利申请号No.07/701,415(1991年5月16提交)中有所描述，并在这里作引证参照。载体可从逆转录病毒衍生获得。可加入一段不均一信号序列以代替天然信号序列，如美国专利4,965,195描述的IL-7的信号序列；Cosman等人(自然，312：768(1984))描述的IL-2受体的信号序列；EP367,566描述的IL-4信号肽；美国专利4,968,607描述的I型IL-1受体信号肽；和EP460,846描述的II型IL-1受体信号肽。

本发明的分离和纯化的TACE蛋白质可通过上述的重组表达系统制备或从天然发生的细胞中纯化获得。TACE通过分析SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上的一条蛋白带表明TACE基本上是纯的。制备TACE的一种方法包括培养用表达载体转化的宿主细胞，其中表达载体包括在足以启动TACE表达的条件下编码TACE的DNA序列。然后根据采用的表达系统将TACE从培养基或细胞抽提物中回收。如该领域技术人员所知的，由于所用的宿主细胞类型不同及重组蛋白是否分泌到培养基中等因素，纯化重组蛋白质的方法可以不同。例如，当采用的是分泌重组蛋白质的表达系统时，首先用常规可获得的蛋白质浓缩过滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤设备，对培养基进行浓缩。浓缩步骤后，浓缩物可应用于纯化基质上如凝胶过滤介质上。或者，可用阴离子交换树脂，例如有二乙胺基乙基(DEAE)侧基的基质或底物。基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或其它常用于蛋白质纯化的类型。或者可用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换剂包括各种不可溶的包括磺丙基或羧甲基基团的基质。最好是磺丙基基团。最后用一步或多步反相高效液相色谱(RP-HPLC)步骤，用疏水性RP-HPLC介质(如有甲基或其它芳香族侧基的硅胶)进一步纯化TACE。前述的一些或所有的纯化步骤，及各种组合是熟知的，并可用于提供分离和纯化的重组蛋白。

除重组制备TACE外，TACE可从激活的单核细胞系THP-1中分离和纯化。典型的THP-1生成比HL-60细胞更多的TNF-α，是生成TNF的较佳的来源。其它TACE的来源也可使用，在其它生成TNF-α类型的细胞中也发现有TACE。一旦鉴定了TACE的来源后，最好首先刺激源细胞生成TNF-α来分离和纯化TACE。刺激是非必需的，然而其可通过该领域熟知的技术来完成。然后细胞被收集清洗，并用常规步骤分离质膜。特别佳的分离质膜的方法是Maeda等人(Biochim.et.Biophys.Acta，731：15(1983))描述的第三种方法；只是在该方法中没有二硫苏糖醇，因为经测定二硫苏糖醇抑制了TACE活性。然后通过将膜制品悬浮在无离子去污剂稀释液中来使质膜的蛋白质溶解，然后进行简单的匀浆。然后用常规方法抽提出磷脂。

可以采用包括TACE结合的蛋白质的亲和柱来亲和纯化表达的TACE多肽。可用常规技术如用高盐洗脱缓冲液然后在低盐缓冲液中透析，或改变pH或其它与所用亲和基质有关的组分，将TACE多肽从亲和柱上除下。实施例4描述了用本发明的TACE生成抗TACE的单克隆抗体的步骤。

细菌培养生成的重组蛋白通常通过最初破碎宿主细胞，离心，如果是不溶性多肽则从细胞沉淀物抽提，如果是可溶性多肽则从上清液抽提，然后进行一步或多步浓缩，盐析，离子交换，亲和纯化或粒度排阻色谱来分离获得。最后，可用RP-HPLC进行最终纯化。微生物细胞可用常规方法来破碎，包括冻融交替法，超声处理，机械破碎，或用细胞裂解剂。

为简化纯化，最好用转化的酵母宿主细胞来表达作为分泌多肽的TACE。酵母细胞发酵液中的分泌重组多肽可用与Urdal等人(J.Chromatog.296：171，1984)公开相似的方法纯化。Urdal等人描述两个顺序的反相HPLC步骤以在制备HPLC柱上纯化重组人IL-2。

本发明可生成包括单链核酸序列(RNA或DNA)的反义或有义寡核苷酸，单链核酸序列可与靶TACE mRNA序列(形成双螺旋)结合或与双链DNA螺旋中的TACE序列结合(形成三螺旋)。本发明的反义或有义寡核苷酸，包括TACE cDNA密码区域的片段。该片段通常包括至少约14个核苷酸，最好为约14至30个核苷酸。根据给定的蛋白质的cDNA序列生成反义或有义寡核苷酸的方法，例如Stein和Cohen(Cancer Res.48：2659，1988)和van der Krol等人(生物技术6：958，1988)已有描述。

反义或有义寡核苷酸与靶核酸序列的结合导致形成复合物，其可通过包括加强双螺旋降解，转录或转译提前终止或其它方法中的一种方法来抑制转译(RNA)或转录(DNA)。因此反义寡核苷酸可用于封闭TACE蛋白质的表达。反义或有义寡核苷酸还包括有修饰的糖-磷酸二酯骨架(或其它糖键，如在WO 91/06629中所描述的)的寡核苷酸，其中这些糖键对内源核酸酶有抗性。这种有糖键抗性的寡核苷酸在体内是稳定的(即，可抗酶降解)但保留与靶核苷酸序列结合的序列特异性。有义或反义寡核苷酸的其它例子包括那些与如在WO 90/10448中描述的有机成分或其它可提高寡核苷酸对靶核酸序列亲和性的成分质如聚(L-赖氨酸)共价连接的寡核苷酸。而且，嵌入剂如玫瑰树碱，和烷基化剂或金属复合物可与有义或反义寡核苷酸连接以修饰反义和有义寡核苷酸对靶核苷酸顺序的结合特异性。

反义或有义寡核苷酸可用包括例如CaPO₄介导DNA转染，电穿孔法的任何基因转移方法，或用基因转移载体如Epstein-Barr病毒引入含有靶核酸序列的细胞。反义或有义寡核苷酸引入含有靶核酸序列的细胞最好是通过将反义或有义寡核苷酸插入合适的逆转录病毒载体，然后在体内或体外使含有插入顺序的逆转录病毒载体与细胞接触来实现。合适逆转录病毒载体包括(但不局限于)，鼠逆转录病毒M-MuLV、N2(从M-MuLV衍生获得的逆转录病毒)或以DCT5A、DCT5B和DCT5C(见PCT申请号US 90/02656)命名的双拷贝载体。

有义或反义寡核苷酸也可通过如WO 91/04753所描述的与配体结合分子形成共轭物来引入含有靶核苷酸序列的细胞。合适的配体结合分子包括(但不局限于)细胞表面受体，生长因子，其它细胞因子或与细胞表面受体结合的其它配体。最好配体结合分子共轭物基本上不干扰配体结合分子与其相应的分子或受体结合的能力，或阻止有义或反义寡核苷酸或其共轭物进入细胞。

或者，如WO 90/10448所描述的，有义或反义寡核苷酸可通过形成寡核苷酸-脂质复合物引入含有靶核酸序列的细胞中。有义或反义寡核苷酸-脂质复合物最好在细胞内可被内源性脂肪酶解离。

分离和纯化的TACE或其片段，特别是TACE的胞外区域也可用作调节某些细胞表面蛋白质水平的治疗剂。除TNF-α外，其它细胞因子和细胞因子受体及一些粘着蛋白质可被TACE或相应的蛋白酶从细胞表面上解离下来。TACE或其片段，特别是TACE的胞外区域可进行给药来调控或除去涉及肿瘤细胞生长、发炎、或受精的细胞表面的细胞因子、细胞因子受体和粘着蛋白。当其用于医疗试剂时，TACE可用已知的方法制成药物组合物。TACE作为单独活性物质或与其它已知的活性物质混用，与药物上合适的稀释剂(如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)，防腐剂(如乙基汞硫代水杨酸钠、苄醇、paraben)、乳化剂、增溶剂、佐剂和/或载体混合。合适的载体及其制剂在Remington′s Pharmaceutical Science，16th ed.1980，Mack Publishing Co.中有所描述。此外，这种组合物含有与聚乙二醇(PEG)、金属离子混合的TACE，或TACE掺入聚合的混合物如聚乙酸、聚乙醇酸、水凝胶等中，或掺入脂质体、微乳液、微团单片或多片泡囊、红细胞空胞或原生质球中。这些组合物将影响TACE的物理状态、溶解度、稳定性、体内解离速度和体内清除速度。

TACE可用该领域已知的各种金属蛋白酶测定法来测定。通常，TACE可用有天然的TNF-α的裂解位点的肽底物来测定。例如，为检测底物被TACE裂解，底物可在裂解位点的一侧用荧光基团标记，另一侧用荧光淬灭基团标记。当被TACE裂解时，淬灭效应被除去，因此提供了可检测的信号。或者，底物可用在裂解时有强吸收的比色除去基团标记。或者，在底物的裂解位点可合成一个硫酯基团，这样当被TACE裂解时就有巯基基团，其可用常规方法检测。测定样品中的TACE活性的特别佳的方法在下面的实施例1中有所描述。其它检测TACE活性的方法也可使用而不需多余的实验。

如下面实施例1所述的，也可用TACE的定量测定方法，其包括使约1mM的肽底物和TACE在37℃培育固定的时间；加入酸或金属螯合剂停止反应，用HPLC分析测定裂解程度。

本发明的一个方面是，TACE和以TACE氨基酸序列为基础的肽可用于制备可与TACE特异性结合的抗体。这种抗体制备的特别的实施例在这里实施例4中有所描述。术语“抗体”包括多克隆抗体，单克隆抗体，它们的片段如F(ab′)2，和Fab片段，及任何重组制备的结合配偶体。当抗体与TACE结合的K_a大于或等于约10⁷M^-1时抗体被确定为可特异性结合。配偶体部分或抗体的亲和性用常规方法，例如Scatchard等人(Ann.N.Y.Acad.Sci.，51：660(1994))描述的方法很容易测定。

多克隆抗体用该领域已知的步骤很容易从各种来源例如，马、奶牛、山羊、羊、狗、鸡、野兔、鼠或大鼠中获得。通常，纯化的TACE或以TACE氨基酸序列为基础的适于共轭的肽，通过胃肠外注射对宿主动物给药。TACE免疫原性可用佐剂如Freund完全或不完全佐剂来增强。在激发免疫反应后，收集血清样品并检测其与TACE或TACE肽的反应活性。各种适于这些测定的方法的例子包括：在“抗体：实验手册”(Harlow和Lane(eds.)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1988)中描述的；和步骤如逆流免疫电泳(CIEP)、放射免疫测定法、放射免疫沉淀法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、斑点印迹法和夹心测定法，见美国专利No.4,376,110和4,486,530。

用熟知的方法很容易制备单克隆抗体，例如美国专利No.RE 32,011，4,902,614，4,543,439和4,411,993；单克隆抗体，杂交瘤：生物分析的新领域，(Plenum Press，Kennett，McKearn和Bechtol(eds.)，1980)中所描述的方法。简单的说，对宿主动物如鼠腹膜内注射存在于可选佐剂中分离和纯化的TACE或共轭TACE肽，给药每隔3周至少一次，最好至少两次。然后用斑点印迹法或抗体捕捉(ABC)测定鼠血清以决定哪个鼠的融合最好。约二至三周后，对鼠进行静脉注射TACE或共轭的TACE肽。然后，在建立的步骤后，杀死鼠使脾细胞与商业性获得的骨髓瘤细胞如Ag8.653(ATCC)融合。简单的说，骨髓瘤细胞在培养基中洗涤数次，以约三个脾细胞对一个骨髓瘤细胞的比例使它与鼠脾细胞融合。融合试剂可以是该领域所用任何试剂，例如，聚乙二醇(PEG)。将融合物置于含有可使融合细胞选择性生长的培养基中。然后可使融合细胞生长约8天。收集获得的杂交瘤的上清液并加入首先用山羊的抗鼠Ig包被的平板中。在洗涤后，可将一个标记如¹²⁵I-TACE加入每个孔中进行培育。然后用放射自显影术检测阳性孔。使阳性克隆大量培育生长，然后用蛋白质A柱(Pharmacia)纯化上清液。

本发明的单克隆抗体可用另一个技术如Alting-Mees等人描述的(“单克隆抗体表达库：杂交瘤的另一个快速方法”，Strategies in Molecular Biology 3：1-9(1990))技术来生产，该方法在这里引证参照。同样，结合配偶体可用重组DNA技术来构建以掺入编码特异性结合抗体的基因的不同区域。这些技术Larrick等人在“生物技术”(Biotechnology，7：394(1989))中有描述。

另一些“抗体”类型可用这里提供的信息和该领域技术相接合来生产。例如，本发明也包括可与TACE特异性结合的人源化抗体。

一旦分离和纯化后，用建立的测定方法用抗TACE的抗体可检测样品中TACE的存在。而且，本发明的抗体在医疗上在体内可与TACE结合并抑制其活性。

本发明的纯化TACE使得发现TACE抑制剂以及过量的TNF-α解离的抑制剂变得更容易。用纯化的TACE多肽来筛选其有效的抑制剂是非常重要的，并基本上消除了杂质的干扰反应。该检测分子的TACE抑制活性的筛选测定通常包括使有效的抑制剂分子与合适的底物混合，培育混合物中至少基本上纯的TACE，如上所述检测底物裂解的程度。当各种合适底物可设计成用于测定方法中时，最好用肽基底物，肽基底物包括氨基酸序列Leu-Ala-Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser(SEQID NO：5)。

此外，TACE多肽也可用于以结构为基础的TACE抑制剂设计。这种以结构为基础的设计也称为“合理的药物设计”。TACE多肽可用例如X-射线晶体学，核磁共振或同源模型进行三维分析，所有这些方法都是熟知的。本发明也包括根据TACE结构信息用分子模型软件系统来设计抑制剂和抑制剂-TACE相互反应。这种计算机辅助模型和药物设计可利用信息如化学构象分析，分子静电势，蛋白质折叠等。例如，大多数金属蛋白酶的类别特异性抑制剂设计侧重于螯合或结合催化性锌原子。合成的抑制剂通常设计成含有负电荷成分，其与其它一系列设计成配合特定蛋白酶的特异性口袋的基团连接。本发明的一个特别方法包括分析TACE的可能与底物位点结合的三维结构，合成有可掺入预计的活性位点的新的分子，如上所述测定新分子。

下面的实施例提供了本发明特征的描述，不应被理解为附加权利要求提出的发明范围的限制。在下列实施例中，所有描述的方法是常规的除非另有指出。

实施例1

TNF-α转变酶的纯化

该实施例描述纯化TACE的方法。TACE从刺激TNF-α生产的人单细胞细胞系THP-1(ATCC号为TIB 202)的膜上分离纯化获得。选用THP-1细胞是因为它们比常用的人单细胞细胞系HL-60细胞能生产更多的TNF-α。用前述的Kronheim等人(Arch.Biochem.Biophys.269：698(1992)，在这里引证参照)的方法刺激约1200亿个细胞。刺激后2小时，通过离心收获细胞。获得的细胞用Hanks平衡盐溶液洗至少两次，用Maeda等人(Biochim.et.Biophys.Acta，731：15(1983))描述的第三种方法分离质膜，只是不用二硫苏糖醇，每毫升细胞沉淀用1.25毫升匀浆缓冲液。经测定Maeda等人的标准方法(一种测定TACE活性的方法，其在下面有描述)用二硫苏糖醇不能生产有TACE活性的化合物。然后通过将膜制品重新悬浮在1％辛基糖苷溶液，10ml Tris-HCl(pH8)，1mM MgCl₂和30mM NaCl中并用Brinkman匀浆器简单匀浆(两次，每次5秒)来溶解蛋白质。然后加入四体积的冰(0℃)丙酮来抽提磷脂；在4℃下培育30分钟后，使丙酮抽提物在H1000B转头离心机上以1500rpm离心10分钟。

色谱分析

将沉淀物溶解在450毫升缓冲液A(缓冲液A包括10mM Tris-HCl(pH9.5)和1％(体积重量比)辛基糖苷)中，以4ml/分钟上柱于120ml DEAE-Sepharose fast-flow(Pharmacia)柱上。柱然后用360ml缓冲液A以6ml/分钟速度洗涤，然后蛋白质用NaCl(0-0.3M)梯度增加的缓冲液A以6ml/分钟速度在40分钟内洗脱。TACE在NaCl浓度为约50至约150mM时被洗脱。

当TACE在裂解与氨基末端的8个氨基酸序列的“旗”(T.P.Hopp等人，生物技术，6：1204(1988))融合的重组26kDTNF-α时被检测。编码人TNF-α的基因与编码旗序列的DNA剪接，该构建物插入pPL3载体(C.Maliszewski等人，分子免疫学，25：249(1987))中。蛋白质然后在有必要防止细菌降解前体的蛋白酶缺陷型大肠杆菌(R.T.Libby等人，DNA，6：221(1987))中表达。在除去生长培养基后，细菌再次悬浮在30mM Tris-HCl(pH8)，5mM EDTA中，悬浮液用超声处理约30秒。然后物质在SS34转头离心机上以20000rpm离心30分钟，除去上清液部分，将沉淀物悬浮在含8M尿素的10mM Tris-HCl(pH8)中。物质用25冲程的匀浆机匀浆，然后在SS34转头离心机上以20000rpm离心30分钟。含有TNF-α前体的上清液部分用10mM Tris-HCl(pH8)透析四次。

该物质在37℃与从DEAE-Sepharose上洗脱的TACE培育至少4小时，TACE预先用1mM N-甲氧基琥珀酰基-Ala-Ala-Val-氯-甲基酮，10μg/ml亮抑肽酶和1mg/mlα1-蛋白酶抑制剂处理，所有这些试剂均是商业上可获得的。获得的17kD产物的N-末端发现是真正的TNF-α的末端。在用这种方法最初鉴定TACE后，发现酶也将8个残基的肽切下，该肽为TNF-α区段Leu⁷³-Ala⁷⁴-Gln⁷⁵-Ala⁷⁶-↓-Val⁷⁷-Arg⁷⁸-Ser⁷⁹-Ser⁸⁰(sEQ ID NO：5)。其中(↓)表示裂解位点，根据这一发现，可建立一个定量的测定方法：将1mM肽与酶在37℃下在0.1mM二氯异香豆素，1mM甲氧基琥珀酰基-Ala-Ala-Pro-Val-氯甲基酮，10μg/ml亮抑肽酶，10μM苯丁抑制素和1mg/mlα1-蛋白酶抑制剂(Sigma)存在下培育固定时间，所有这些试剂都是商业可获得的。反应通过加入酸或金属螯合剂而停止。该肽的裂解程度反映了TACE存在的量，其可通过将化合物上柱于Vydac C18柱，并用梯度为0至30％的乙腈在15分钟内洗脱来测定。

从DEAE柱上用0.05-0.25M NaCl洗脱下的物质的比活比开始的物质高约4倍。洗脱的物质用超声处理，然后与麦胚凝集素-琼脂糖(载体库)在4℃振荡2小时。在使用前，麦胚凝集素-琼脂糖用5倍柱体积的缓冲液B冲洗(缓冲液B包括10mM Tris-HCl(pH7.5)，0.15M NaCl，0.1mM MnCl₂，0.1mM CaCl₂，1％辛基糖苷和10％甘油)；经BCA蛋白质测定法(Pierce)测定，1ml树脂用于2mg样品中的蛋白质。在2小时后，树脂7体积的缓冲液B清洗，然后物质用5倍柱体积的缓冲液B和0.3M乙酰氨基葡萄糖(Sigma)洗脱，每加入一个柱体积间隔30分钟。

洗脱级分的TACE活性比活比开始物高十倍。这些级分在Centriprep-30浓缩器(Amicon)中浓缩至约5ml，然后用缓冲液C(缓冲液C包括10mM Tris-HCl(pH8)，1％辛基糖苷和10％甘油)稀释3倍。稀释物进行超声破碎(3个10秒破裂)然后以0.5ml/分钟上柱于MonoQ HR 5/5柱(Pharmacia)柱，并用0至0.25MNaCl梯度缓冲液在30分钟内以0.5ml/分钟洗脱。TACE活性在约0.15M NaCl时洗脱出，TACE活性在该阶段检测然后与前述肽底物在没有蛋白酶抑制剂的情况下培育。

含有活性的MonoQ级分的NaCl浓度通过将其在缓冲液C中稀释来减少至少十倍，然后将物质以0.5ml/分钟上柱于羟基磷灰石柱(American InternationalChemical，Ceramic Hydroxyapatite HS40)。在用3倍柱体积缓冲液C洗后，蛋白质用0至50mM梯度的磷酸钠在30分钟内以1ml/分钟洗脱。TACE在约15mM磷酸钠时洗脱。

从羟基磷灰石柱上洗脱的TACE然后用Centricon-50浓缩器(Amicon)浓缩至约100μl，并上柱于Bio-Rad SEC-400体积柱(30cm)。蛋白质用缓冲液C以0.5ml/分钟的速度洗脱；TACE在约28分钟时洗脱。

从体积柱上洗脱的TACE在缓冲液D(缓冲液D包括20mM MES(pH6)，1％辛基糖苷和10％甘油)中稀释成3倍，并以0.25ml/分钟的速度上柱于1ml的Red120-agrose(Sigma)。柱用10ml缓冲液D洗后，蛋白质用0至1M NaCl梯度的缓冲液D在60分钟内以0.25ml/分钟洗脱。TACE在0.2至0.3NaCl时洗脱。每个洗脱级分取5％在SDS聚丙烯酰胺凝胶(10％)电泳，并银染法显示级分中有活性的蛋白质主要在凝胶上约66至97kD标记(Novex)中间约80kD处。

在含有约80kD的蛋白质的合并级分中加入三氟乙酸(TFA)至0.2％(体积百分含量)，将混合物用Shimadzu LC-10AD以约10μl/分钟泵送至2.1×5cmC4柱上。蛋白质用含0至100％梯度的乙腈的0.1％TFA在100分钟内以100μl/分钟洗脱。收集每分钟的级分并将每个级分的5至10％在Novex SDS聚丙烯酰胺凝胶(10％)上电泳。将在约70％乙腈洗脱的含有约80kD的蛋白质的级分合并并蒸发干燥。

肽生成和测序

然后将合并的级分溶解在200μl的50mM Tris-HCl(pH8)中，加入1mM EDTA和含量约为样品中蛋白质含量的1/50的内-LYS-C(promega)。物质在37℃下培育过夜，然后加入新鲜的相同量的内-LYS-C并再在37℃培育3小时。

获得的肽通过将物质以20μl/分钟速度上柱于毛细管C18柱并用含梯度增加(0.5％/分钟)的乙腈的0.1％TFA在约200分钟内洗脱。肽用ABI476或ABI494自动测序仪测序。

实施例2

分离和纯化的TACE的制备

该实施例描述进一步纯化用上述步骤获得的纯化的TACE的方法。从THP-1细胞获得的纯化的TACE可能含有小量的人溶酶体85kD唾液酸糖蛋白(Biochem.Biophys.Res.Commun.184：604-611(1992))和人溶酶体α-甘露糖苷酶(Biochem.Biophys.Res.Comm.200：239-245(1994))，它们可用标准免疫吸附法如在这里描述的Robert K.Scopes的方法(Protein Purification--Principles and Practice(Spring-Verlag，2nd edit.)，pp.167-172)除去。用在实施例2中描述的标准可获得分离和纯化的TACE。

实施例3

人TACE的克隆

该实施例描述分离编码人TACE的DNA序列的方法。用常规方法从商业可获得的THP-1细胞系(Amersham)可生成随机引物cDNA库。聚合酶链反应(PCR)(Mullis和Faloona，Meth.Enzymol.155：355-350，1987)用下列引物进行：

引物(1)：5′-AARTAYGTNATGTAYCC-3′SEQ ID NO：6

引物(2)：5′-CCRCARTCRCAYTCYTC-3′SEQ ID NO：7

引物(1)是根据肽(2)的前面五个氨基酸再在5′端加上赖氨酸的三联体编码。引物(2)是在同源金属蛋白酶，牛重新蛋白质裂解物1(reprolysin 1)(GenbankAccession#Z21961)中发现的保守氨基酸序列Glu-Glu-Cys-Asp-Cys-Gly(EECDCG)SEQ ID NO：8的反义序列。

在标准PCR条件下用上述的混合寡核苷酸放大单链cDNA。PCR反应产物在凝胶电泳中分级，分离约180bp的DAN条带，并亚克隆如商业可获得的pBLUESCRIPT中。测序揭示含有编码氨基酸Ile-Ala-Val-Ser-Gly-Asp-His-Glu-Asn-Asn-Lys(SEQ ID NO：9)的核酸序列和含有编码氨基酸Glu-Glu-Cys-Asp-Cys-Gly(EECDCG)(SEQ ID NO：8)的核酸序列的克隆。该克隆称为“30CD克隆”。对30CD克隆进行测序，根据该序列生成引物。引物然后可用于检测从人KB细胞制得的噬菌体库中的TACE cDNA。该库用根据30CD序列的探头在常规条件下筛选。分离整形杂交噬菌斑并对这些克隆的DNA片段测序。测序结果提供了人TACE的cDNA的整个长度，其显示在SEQ ID NO：1中。发现人TACE是有824个氨基酸的I型跨膜蛋白质，其包括N末端的17个氨基酸信号肽。信号肽后是654个氨基酸胞外区域，23个氨基酸的跨膜区域和130个氨基酸的细胞质区域。对另一个剪接的变异体克隆测序并发现它含有与TACE相同的氨基酸序列，至少在细胞质区域的5′末端缺失50bp片段，从而将可读框架改变成可编码六个氨基酸的细胞质区域。该变异体的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：4中，其cDNA显示在SEQ ID NO：3中。

实施例4

抗TACE的抗体的制备

该实施例描述生成抗TACE的单克隆抗体的方法。对Balb/c鼠腹膜内注射在RIBI佐剂(RIBI Corp.，Hamilton，Montana)存在时的10μg的分离和纯化的实施例1的TACE或基于TACE的氨基酸序列的肽，隔3周注射两次。然后用常规斑点印迹法或抗体捕捉法(ABC)测定鼠血清来决定哪一个动物的融合最佳。三星期后，对鼠进行静脉注射悬浮在无菌PBS中的3μg人TACE或TACE肽。三天后，杀死鼠，按建立的步骤使脾细胞与Ag8.653骨髓瘤细胞(ATCC)融合。简单的说，Ag8.653细胞在无血清培养基中洗数次，以约三个脾细胞对一个骨髓瘤细胞的比例使它与鼠脾细胞融合。融合试剂是50％PEG：10％DMSO(Sigma)。将融合物取出置于20个96-孔的含有HAT以及DMEM培养基的平底平板(Corning)中使它生长8天。收集获得的杂交瘤的上清液并加入首先用山羊抗鼠Ig涂布的96-孔平板中进行60分钟。在清洗后，将¹²⁵I-TACE加入每个孔中在室温下培育60分钟，然后洗四次。然后用放射自显影术，Kodak X-ormat S胶片在-70℃检测阳性孔。使阳性克隆大量培育生长，然后用蛋白质A柱(Pharmacia)纯化上清液。

序列表

<110>依默耐克斯有限公司(Immunex Corporation)

<120>TNF-a转变酶

<130>2507-WO

<140>96194459.5

<141>1996-06-03

<160>9

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>2475

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2472)

<400>1

atg agg cag tct ctc cta ttc ctg acc agc gtg gtt cct ttc gtg ctg 48

Met Arg Gln Ser Leu Leu Phe Leu Thr Ser Val Val Pro Phe Val Leu

1 5 10 15

gcg ccg cga cct ccg gat gac ccg ggc ttc ggc ccc cac cag aga ctc 96

Ala Pro Arg Pro Pro Asp Asp Pro Gly Phe Gly Pro His Gln Arg Leu

20 25 30

gag aag ctt gat tct ttg ctc tca gac tac gat att ctc tct tta tct 144

Glu Lys Leu Asp Ser Leu Leu Ser Asp Tyr Asp Ile Leu Ser Leu Ser

35 40 45

aat atc cag cag cat tcg gta aga aaa aga gat cta cag act tca aca 192

Asn Ile Gln Gln His Ser Val Arg Lys Arg Asp Leu Gln Thr Ser Thr

50 55 60

cat gta gaa aca cta cta act ttt tca gct ttg aaa agg cat ttt aaa 240

His Val Glu Thr Leu Leu Thr Phe Ser Ala Leu Lys Arg His Phe Lys

65 70 75 80

tta tac ctg aca tca agt act gaa cgt ttt tca caa aat ttc aag gtc 288

Leu Tyr Leu Thr Ser Ser Thr Glu Arg Phe Ser Gln Asn Phe Lys Val

85 90 95

gtg gtg gtg gat ggt aaa aac gaa agc gag tac act gta aaa tgg cag 336

Val Val Val Asp Gly Lys Asn Glu Ser Glu Tyr Thr Val Lys Trp Gln

100 105 110

gac ttc ttc act gga cac gtg gtt ggt gag cct gac tct agg gtt cta 384

Asp Phe Phe Thr Gly His Val Val Gly Glu Pro Asp Ser Arg Val Leu

115 120 125

gcc cac ata aga gat gat gat gtt ata atc aga atc aac aca gat ggg 432

Ala His Ile Arg Asp Asp Asp Val Ile Ile Arg Ile Asn Thr Asp Gly

130 135 140

gcc gaa tat aac ata gag cca ctt tgg aga ttt gtt aat gat acc aaa 480

Ala Glu Tyr Asn Ile Glu Pro Leu Trp Arg Phe Val Asn Asp Thr Lys

145 150 155 160

gac aaa aga atg tta gtt tat aaa tct gaa gat atc aag aat gtt tca 528

Asp Lys Arg Met Leu Val Tyr Lys Ser Glu Asp Ile Lys Asn Val Ser

165 170 175

cgt ttg cag tct cca aaa gtg tgt ggt tat tta aaa gtg gat aat gaa 576

Arg Leu Gln Ser Pro Lys Val Cys Gly Tyr Leu Lys Val Asp Asn Glu

180 185 190

gag ttg ctc cca aaa ggg tta gta gac aga gaa cca cct gaa gag ctt 624

Glu Leu Leu Pro Lys Gly Leu Val Asp Arg Glu Pro Pro Glu Glu Leu

195 200 205

gtt cat cga gtg aaa aga aga gct gac cca gat ccc atg aag aac acg 672

Val His Arg Val Lys Arg Arg Ala Asp Pro Asp Pro Met Lys Asn Thr

210 215 220

tgt aaa tta ttg gtg gta gca gat cat cgc ttc tac aga tac atg ggc 720

Cys Lys Leu Leu Val Val Ala Asp His Arg Phe Tyr Arg Tyr Met Gly

225 230 235 240

aga ggg gaa gag agt aca act aca aat tac tta ata gag cta att gac 768

Arg Gly Glu Glu Ser Thr Thr Thr Asn Tyr Leu Ile Glu Leu Ile Asp

245 250 255

aga gtt gat gac atc tat cgg aac act tca tgg gat aat gca ggt ttt 816

Arg Val Asp Asp Ile Tyr Arg Asn Thr Ser Trp Asp Asn Ala Gly Phe

260 265 270

aaa ggc tat gga ata cag ata gag cag att cgc att ctc aag tct cca 864

Lys Gly Tyr Gly Ile Gln Ile Glu Gln Ile Arg Ile Leu Lys Ser Pro

275 280 285

caa gag gta aaa cct ggt gaa aag cac tac aac atg gca aaa agt tac 912

Gln Glu Val Lys Pro Gly Glu Lys His Tyr Asn Met Ala Lys Ser Tyr

290 295 300

cca aat gaa gaa aag gat gct tgg gat gtg aag atg ttg cta gag caa 960

Pro Asn Glu Glu Lys Asp Ala Trp Asp Val Lys Met Leu Leu Glu Gln

305 310 315 320

ttt agc ttt gat ata gct gag gaa gca tct aaa gtt tgc ttg gca cac 1008

Phe Ser Phe Asp Ile Ala Glu Glu Ala Ser Lys Val Cys Leu Ala His

325 330 335

ctt ttc aca tac caa gat ttt gat atg gga act ctt gga tta gct tat 1056

Leu Phe Thr Tyr Gln Asp Phe Asp Met Gly Thr Leu Gly Leu Ala Tyr

340 345 350

gtt ggc tct ccc aga gca aac agc cat gga ggt gtt tgt cca aag gct 1104

Val Gly Ser Pro Arg Ala Asn Ser His Gly Gly Val Cys Pro Lys Ala

355 360 365

tat tat agc cca gtt ggg aag aaa aat atc tat ttg aat agt ggt ttg 1152

Tyr Tyr Ser Pro Val Gly Lys Lys Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Gly Leu

370 375 380

acg agc aca aag aat tat ggt aaa acc atc ctt aca aag gaa gct gac 1200

Thr Ser Thr Lys Asn Tyr Gly Lys Thr Ile Leu Thr Lys Glu Ala Asp

385 390 395 400

ctg gtt aca act cat gaa ttg gga cat aat ttt gga gca gaa cat gat 1248

Leu Val Thr Thr His Glu Leu Gly His Asn Phe Gly Ala Glu His Asp

405 410 415

ccg gat ggt cta gca gaa tgt gcc ccg aat gag gac cag gga ggg aaa 1296

Pro Asp Gly Leu Ala Glu Cys Ala Pro Asn Glu Asp Gln Gly Gly Lys

420 425 430

tat gtc atg tat ccc ata gct gtg agt ggc gat cac gag aac aat aag 1344

Tyr Val Met Tyr Pro Ile Ala Val Ser Gly Asp His Glu Asn Asn Lys

435 440 445

atg ttt tca aac tgc agt aaa caa tca atc tat aag acc att gaa agt 1392

Met Phe Ser Asn Cys Ser Lys Gln Ser Ile Tyr Lys Thr Ile Glu Ser

450 455 460

aag gcc cag gag tgt ttt caa gaa cgc agc aat aaa gtt tgt ggg aac 1440

Lys Ala Gln Glu Cys Phe Gln Glu Arg Ser Asn Lys Val Cys Gly Asn

465 470 475 480

tcg agg gtg gat gaa gga gaa gag tgt gat cct ggc atc atg tat ctg 1488

Ser Arg Val Asp Glu Gly Glu Glu Cys Asp Pro Gly Ile Met Tyr Leu

485 490 495

aac aac gac acc tgc tgc aac agc gac tgc acg ttg aag gaa ggt gtc 1536

Asn Asn Asp Thr Cys Cys Asn Ser Asp Cys Thr Leu Lys Glu Gly Val

500 505 510

cag tgc agt gac agg aac agt cct tgc tgt aaa aac tgt cag ttt gag 1584

Gln Cys Ser Asp Arg Asn Ser Pro Cys Cys Lys Asn Cys Gln Phe Glu

515 520 525

act gcc cag aag aag tgc cag gag gcg att aat gct act tgc aaa ggc 1632

Thr Ala Gln Lys Lys Cys Gln Glu Ala Ile Asn Ala Thr Cys Lys Gly

530 535 540

gtg tcc tac tgc aca ggt aat agc agt gag tgc ccg cct cca gga aat 1680

Val Ser Tyr Cys Thr Gly Asn Ser Ser Glu Cys Pro Pro Pro Gly Asn

545 550 555 560

gct gaa gat gac act gtt tgc ttg gat ctt ggc aag tgt aag gat ggg 1728

Ala Glu Asp Asp Thr Val Cys Leu Asp Leu Gly Lys Cys Lys Asp Gly

565 570 575

aaa tgc atc cct ttc tgc gag agg gaa cag cag ctg gag tcc tgt gca 1776

Lys Cys Ile Pro Phe Cys Glu Arg Glu Gln Gln Leu Glu Ser Cys Ala

580 585 590

tgt aat gaa act gac aac tcc tgc aag gtg tgc tgc agg gac ctt tcc 1824

Cys Asn Glu Thr Asp Asn Ser Cys Lys Val Cys Cys Arg Asp Leu Ser

595 600 605

ggc cgc tgt gtg ccc tat gtc gat gct gaa caa aag aac tta ttt ttg 1872

Gly Arg Cys Val Pro Tyr Val Asp Ala Glu Gln Lys Asn Leu Phe Leu

610 615 620

agg aaa gga aag ccc tgt aca gta gga ttt tgt gac atg aat ggc aaa 1920

Arg Lys Gly Lys Pro Cys Thr Val Gly Phe Cys Asp Met Asn Gly Lys

625 630 635 640

tgt gag aaa cga gta cag gat gta att gaa cga ttt tgg gat ttc att 1968

Cys Glu Lys Arg Val Gln Asp Val Ile Glu Arg Phe Trp Asp Phe Ile

645 650 655

gac cag ctg agc atc aat act ttt gga aag ttt tta gca gac aac atc 2016

Asp Gln Leu Ser Ile Asn Thr Phe Gly Lys Phe Leu Ala Asp Asn Ile

660 665 670

gtt ggg tct gtc ctg gtt ttc tcc ttg ata ttt tgg att cct ttc agc 2064

Val Gly Ser Val Leu Val Phe Ser Leu Ile Phe Trp Ile Pro Phe Ser

675 680 685

att ctt gtc cat tgt gtg gat aag aaa ttg gat aaa cag tat gaa tct 2112

Ile Leu Val His Cys Val Asp Lys Lys Leu Asp Lys Gln Tyr Glu Ser

690 695 700

ctg tct ctg ttt cac ccc agt aac gtc gaa atg ctg agc agc atg gat 2160

Leu Ser Leu Phe His Pro Ser Asn Val Glu Met Leu Ser Ser Met Asp

705 710 715 720

tct gca tcg gtt cgc att atc aaa ccc ttt cct gcg ccc cag act cca 2208

Ser Ala Ser Val Arg Ile Ile Lys Pro Phe Pro Ala Pro Gln Thr Pro

725 730 735

ggc cgc ctg cag cct gcc cct gtg atc cct tcg gcg cca gca gct cca 2256

Gly Arg Leu Gln Pro Ala Pro Val Ile Pro Ser Ala Pro Ala Ala Pro

740 745 750

aaa ctg gac cac cag aga atg gac acc atc cag gaa gac ccc agc aca 2304

Lys Leu Asp His Gln Arg Met Asp Thr Ile Gln Glu Asp Pro Ser Thr

755 760 765

gac tca cat atg gac gag gat ggg ttt gag aag gac ccc ttc cca aat 2352

Asp Ser His Met Asp Glu Asp Gly Phe Glu Lys Asp Pro Phe Pro Asn

770 775 780

agc agc aca gct gcc aag tca ttt gag gat ctc acg gac cat ccg gtc 2400

Ser Ser Thr Ala Ala Lys Ser Phe Glu Asp Leu Thr Asp His Pro Val

785 790 795 800

acc aga agt gaa aag gct gcc tcc ttt aaa ctg cag cgt cag aat cgt 2448

Thr Arg Ser Glu Lys Ala Ala Ser Phe Lys Leu Gln Arg Gln Asn Arg

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gtt gac agc aaa gaa aca gag tgc taa 2475

Val Asp Ser Lys Glu Thr Glu Cys

820

<210>2

<211>824

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2Met Arg Gln Ser Leu Leu Phe Leu Thr Ser Val Val Pro Phe Val Leu

1 5 10 15

Ala Pro Arg Pro Pro Asp Asp Pro Gly Phe Gly Pro His Gln Arg Leu

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Glu Lys Leu Asp Ser Leu Leu Ser Asp Tyr Asp Ile Leu Ser Leu Ser

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Asn Ile Gln Gln His Ser Val Arg Lys Arg Asp Leu Gln Thr Ser Thr

50 55 60

His Val Glu Thr Leu Leu Thr Phe Ser Ala Leu Lys Arg His Phe Lys

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Thr Ser Ser Thr Glu Arg Phe Ser Gln Asn Phe Lys Val

85 90 95

Val Val Val Asp Gly LysAsn Glu Ser Glu Tyr Thr Val Lys Trp Gln

100 105 110

Asp Phe Phe Thr Gly His Val Val Gly Glu Pro Asp Ser Arg Val Leu

115 120 125

Ala His Ile Arg Asp Asp Asp Val Ile Ile Arg Ile Asn Thr Asp Gly

130 135 140

Ala Glu Tyr Asn Ile Glu Pro Leu Trp Arg Phe Val Asn Asp Thr Lys

145 150 155 160

Asp Lys Arg Met Leu Val Tyr Lys Ser Glu Asp Ile Lys Asn Val Ser

165 170 175

Arg Leu Gln Ser Pro Lys Val Cys Gly Tyr Leu Lys Val Asp Asn Glu

180 185 190

Glu Leu Leu Pro Lys Gly Leu Val Asp Arg Glu Pro Pro Glu Glu Leu

195 200 205

Val His Arg Val Lys Arg Arg Ala Asp Pro Asp Pro Met Lys Asn Thr

210 215 220

Cys Lys Leu Leu Val Val Ala Asp His Arg Phe Tyr Arg Tyr Met Gly

225 230 235 240

Arg Gly Glu Glu Ser Thr Thr Thr Asn Tyr Leu Ile Glu Leu Ile Asp

245 250 255

Arg Val Asp Asp Ile Tyr Arg Asn Thr Ser Trp Asp Asn Ala Gly Phe

260 265 270

Lys Gly Tyr Gly Ile Gln Ile Glu Gln Ile Arg Ile Leu Lys Ser Pro

275 280 285

Gln Glu Val Lys Pro Gly Glu Lys His Tyr Asn Met Ala Lys Ser Tyr

290 295 300

Pro Asn Glu Glu Lys Asp Ala Trp Asp Val Lys Met Leu Leu Glu Gln

305 310 315 320

Phe Ser Phe Asp Ile Ala Glu Glu Ala Ser Lys Val Cys Leu Ala His

325 330 335

Leu Phe Thr Tyr Gln Asp Phe Asp Met Gly Thr Leu Gly Leu Ala Tyr

340 345 350

Val Gly Ser Pro Arg Ala Asn Ser His Gly Gly Val Cys Pro Lys Ala

355 360 365

Tyr Tyr Ser Pro Val Gly Lys Lys Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Gly Leu

370 375 380

Thr Ser Thr Lys Asn Tyr Gly Lys Thr Ile Leu Thr Lys Glu Ala Asp

385 390 395 400

Leu Val Thr Thr His Glu Leu Gly His Asn Phe Gly Ala Glu His Asp

405 410 415

Pro Asp Gly Leu Ala Glu Cys Ala Pro Asn Glu Asp Gln Gly Gly Lys

420 425 430

Tyr Val Met Tyr Pro Ile Ala Val Ser Gly Asp His Glu Asn Asn Lys

435 440 445

Met Phe Ser Asn Cys Ser Lys Gln Ser Ile Tyr Lys Thr Ile Glu Ser

450 455 460

Lys Ala Gln Glu Cys Phe Gln Glu Arg Ser Asn Lys Val Cys Gly Asn

465 470 475 480

Ser Arg Val Asp Glu Gly Glu Glu Cys Asp Pro Gly Ile Met Tyr Leu

485 490 495

Asn Asn Asp Thr Cys Cys Asn Ser Asp Cys Thr Leu Lys Glu Gly Val

500 505 510

Gln Cys Ser Asp Arg Asn Ser Pro Cys Cys Lys Asn Cys Gln Phe Glu

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Thr Ala Gln Lys Lys Cys Gln Glu Ala Ile Asn Ala Thr Cys Lys Gly

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Val Ser Tyr Cys Thr Gly Asn Ser Ser Glu Cys Pro Pro Pro Gly Asn

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Lys Cys Ile Pro Phe Cys Glu Arg Glu Gln Gln Leu Glu Ser Cys Ala

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Cys Asn Glu Thr Asp Asn Ser Cys Lys Val Cys Cys Arg Asp Leu Ser

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645 650 655

Asp Gln Leu Ser Ile Asn Thr Phe Gly Lys Phe Leu Ala Asp Asn Ile

660 665 670

Val Gly Ser Val Leu Val Phe Ser Leu Ile Phe Trp Ile Pro Phe Ser

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Ile Leu Val His Cys Val Asp Lys Lys Leu Asp Lys Gln Tyr Glu Ser

690 695 700

Leu Ser Leu Phe His Pro Ser Asn Val Glu Met Leu Ser Ser Met Asp

705 710 715 720

Ser Ala Ser Val Arg Ile Ile Lys Pro Phe Pro Ala Pro Gln Thr Pro

725 730 735

Gly Arg Leu Gln Pro Ala Pro Val Ile Pro Ser Ala Pro Ala Ala Pro

740 745 750

Lys Leu Asp His Gln Arg Met Asp Thr Ile Gln Glu Asp Pro Ser Thr

755 760 765

Asp Ser His Met Asp Glu Asp Gly Phe Glu Lys Asp Pro Phe Pro Asn

770 775 780

Ser Ser Thr Ala Ala Lys Ser Phe Glu Asp Leu Thr Asp His Pro Val

785 790 795 800

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805 810 815

Val Asp Ser Lys Glu Thr Glu Cys

820

<210>3

<211>2097

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2094)

<400>3

atg agg cag tct ctc cta ttc ctg acc agc gtg gtt cct ttc gtg ctg 48

Met Arg Gln Ser Leu Leu Phe Leu Thr Ser Val Val Pro Phe Val Leu

1 5 10 15

gcg ccg cga cct ccg gat gac ccg ggc ttc ggc ccc cac cag aga ctc 96

Ala Pro Arg Pro Pro Asp Asp Pro Gly Phe Gly Pro His Gln Arg Leu

20 25 30

gag aag ctt gat tct ttg ctc tca gac tac gat att ctc tct tta tct 144

Glu Lys Leu Asp Ser Leu Leu Ser Asp Tyr Asp Ile Leu Ser Leu Ser

35 40 45

aat atc cag cag cat tcg gta aga aaa aga gat cta cag act tca aca 192

Asn Ile Gln Gln His Ser Val Arg Lys Arg Asp Leu Gln Thr Ser Thr

50 55 60

cat gta gaa acacta cta act ttt tca gct ttg aaa agg cat ttt aaa 240

His Val Glu Thr Leu Leu Thr Phe SerAla Leu Lys Arg His Phe Lys

65 70 75 80

tta tac ctg aca tca agt act gaa cgt ttt tca caa aat ttc aag gtc 288

Leu Tyr Leu Thr Ser Ser Thr GluArg Phe Ser Gln Asn Phe Lys Val

85 90 95

gtg gtg gtg gat ggt aaa aac gaa agc gag tac act gta aaa tgg cag 336

Val Val Val Asp Gly Lys Asn Glu Ser Glu Tyr Thr Val Lys Trp Gln

100 105 110

gac ttc ttc act gga cac gtg gtt ggt gag cct gac tct agg gtt cta 384

Asp Phe Phe Thr Gly His Val Val Gly Glu Pro Asp Ser Arg Val Leu

115 120 125

gcc cac ata aga gat gat gat gtt ata atc aga atc aac aca gat ggg 432

Ala His Ile Arg Asp Asp Asp Val Ile Ile Arg Ile Asn Thr Asp Gly

130 135 140

gcc gaa tat aac ata gag cca ctt tgg aga ttt gtt aat gat acc aaa 480

Ala Glu Tyr Asn Ile Glu Pro Leu Trp Arg Phe Val Asn Asp Thr Lys

145 150 155 160

gac aaa aga atg tta gtt tat aaa tct gaa gat atc aag aat gtt tca 528

Asp Lys Arg Met Leu Val Tyr Lys Ser Glu Asp Ile Lys Asn Val Ser

165 170 175

cgt ttg cag tct cca aaa gtg tgt ggt tat tta aaa gtg gat aat gaa 576

Arg Leu Gln Ser Pro Lys Val Cys Gly Tyr Leu Lys Val Asp Asn Glu

180 185 190

gag ttg ctc cca aaa ggg tta gta gac aga gaa cca cct gaa gag ctt 624

Glu Leu Leu Pro Lys Gly Leu Val Asp Arg Glu Pro Pro Glu Glu Leu

195 200 205

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Val His Arg Val Lys Arg Arg Ala Asp Pro Asp Pro Met Lys Asn Thr

210 215 220

tgt aaa tta ttg gtg gta gca gat cat cgc ttc tac aga tac atg ggc 720

Cys Lys Leu Leu Val Val Ala Asp His Arg Phe Tyr Arg Tyr Met Gly

225 230 235 240

aga ggg gaa gag agt aca act aca aat tac tta ata gag cta att gac 768

Arg Gly Glu Glu Ser Thr Thr Thr Asn Tyr Leu Ile Glu Leu Ile Asp

245 250 255

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Arg Val Asp Asp Ile Tyr Arg Asn Thr Ser Trp Asp Asn Ala Gly Phe

260 265 270

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Lys Gly Tyr Gly Ile Gln Ile Glu Gln Ile Arg Ile Leu Lys Ser Pro

275 280 285

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Gln Glu Val Lys Pro Gly Glu Lys His Tyr Asn Met Ala Lys Ser Tyr

290 295 300

cca aat gaa gaa aag gat gct tgg gat gtg aag atg ttg cta gag caa 960

Pro Asn Glu Glu Lys Asp Ala Trp Asp Val Lys Met Leu Leu Glu Gln

305 310 315 320

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Phe Ser Phe Asp Ile Ala Glu Glu Ala Ser Lys Val Cys Leu Ala His

325 330 335

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Leu Phe Thr Tyr Gln Asp Phe Asp Met Gly Thr Leu Gly Leu Ala Tyr

340 345 350

gtt ggc tct ccc aga gca aac agc cat gga ggt gtt tgt cca aag gct 1104

Val Gly Ser Pro Arg Ala Asn Ser His Gly Gly Val Cys Pro Lys Ala

355 360 365

tat tat agc cca gtt ggg aag aaa aat atc tat ttg aat agt ggt ttg 1152

Tyr Tyr Ser Pro Val Gly Lys Lys Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Gly Leu

370 375 380

acg agc aca aag aat tat ggt aaa acc atc ctt aca aag gaa gct gac 1200

Thr Ser Thr Lys Asn Tyr Gly Lys Thr Ile Leu Thr Lys Glu Ala Asp

385 390 395 400

ctg gtt aca act cat gaa ttg gga cat aat ttt gga gca gaa cat gat 1248

Leu Val Thr Thr His Glu Leu Gly His Asn Phe Gly Ala Glu His Asp

405 410 415

ccg gat ggt cta gca gaa tgt gcc ccg aat gag gac cag gga ggg aaa 1296

Pro Asp Gly Leu Ala Glu Cys Ala Pro Asn Glu Asp Gln Gly Gly Lys

420 425 430

tat gtc atg tat ccc ata gct gtg agt ggc gat cac gag aac aat aag 1344

Tyr Val Met Tyr Pro Ile Ala Val Ser Gly Asp His Glu Asn Asn Lys

435 440 445

atg ttt tca aac tgc agt aaa caa tca atc tat aag acc att gaa agt 1392

Met Phe Ser Asn Cys Ser Lys Gln Ser Ile Tyr Lys Thr Ile Glu Ser

450 455 460

aag gcc cag gag tgt ttt caa gaa cgc agc aat aaa gtt tgt ggg aac 1440

Lys Ala Gln Glu Cys Phe Gln Glu Arg Ser Asn Lys Val Cys Gly Asn

465 470 475 480

tcg agg gtg gat gaa gga gaa gag tgt gat cct ggc atc atg tat ctg 1488

Ser Arg Val Asp Glu Gly Glu Glu Cys Asp Pro Gly Ile Met Tyr Leu

485 490 495

aac aac gac acc tgc tgc aac agc gac tgc acg ttg aag gaa ggt gtc 1536

Asn Asn Asp Thr Cys Cys Asn Ser Asp Cys Thr Leu Lys Glu Gly Val

500 505 510

cag tgc agt gac agg aac agt cct tgc tgt aaa aac tgt cag ttt gag 1584

Gln Cys Ser Asp Arg Asn Ser Pro Cys Cys Lys Asn Cys Gln Phe Glu

515 520 525

act gcc cag aag aag tgc cag gag gcg att aat gct act tgc aaa ggc 1632

Thr Ala Gln Lys Lys Cys Gln Glu Ala Ile Asn Ala Thr Cys Lys Gly

530 535 540

gtg tcc tac tgc aca ggt aat agc agt gag tgc ccg cct cca gga aat 1680

Val Ser Tyr Cys Thr Gly Asn Ser Ser Glu Cys Pro Pro Pro Gly Asn

545 550 555 560

gct gaa gat gac act gtt tgc ttg gat ctt ggc aag tgt aag gat ggg 1728

Ala Glu Asp Asp Thr Val Cys Leu Asp Leu Gly Lys Cys Lys Asp Gly

565 570 575

aaa tgc atc cct ttc tgc gag agg gaa cag cag ctg gag tcc tgt gca 1776

Lys Cys Ile Pro Phe Cys Glu Arg Glu Gln Gln Leu Glu Ser Cys Ala

580 585 590

tgt aat gaa act gac aac tcc tgc aag gtg tgc tgc agg gac ctt tcc 1824

Cys Asn Glu Thr Asp Asn Ser Cys Lys Val Cys Cys Arg Asp Leu Ser

595 600 605

ggc cgc tgt gtg ccc tat gtc gat gct gaa caa aag aac tta ttt ttg 1872

Gly Arg Cys Val Pro Tyr Val Asp Ala Glu Gln Lys Asn Leu Phe Leu

610 615 620

agg aaa gga aag ccc tgt aca gta gga ttt tgt gac atg aat ggc aaa 1920

Arg Lys Gly Lys Pro Cys Thr Val Gly Phe Cys Asp Met Asn Gly Lys

625 630 635 640

tgt gag aaa cga gta cag gat gta att gaa cga ttt tgg gat ttc att 1968

Cys Glu Lys Arg Val Gln Asp Val Ile Glu Arg Phe Trp Asp Phe Ile

645 650 655

gac cag ctg agc atc aat act ttt gga aag ttt tta gca gac aac atc 2016

Asp Gln Leu Ser Ile Asn Thr Phe Gly Lys Phe Leu Ala Asp Asn Ile

660 665 670

gtt ggg tct gtc ctg gtt ttc tcc ttg ata ttt tgg att cct ttc agc 2064

Val Gly Ser Val Leu Val Phe Ser Leu Ile Phe Trp Ile Pro Phe Ser

675 680 685

att ctt gtc cat tgt gta acg tcg aaa tgc tga 2097

Ile Leu Val His Cys Val Thr Ser Lys Cys

690 695

<210>4

<211>698

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>4

Met Arg Gln Ser Leu Leu Phe Leu Thr Ser Val Val Pro Phe Val Leu

1 5 10 15

Ala Pro Arg Pro Pro Asp Asp Pro Gly Phe Gly Pro His Gln Arg Leu

20 25 30

Glu Lys Leu Asp Ser Leu Leu Ser Asp Tyr Asp Ile Leu Ser Leu Ser

35 40 45

Asn Ile Gln Gln His Ser Val Arg Lys Arg Asp Leu Gln Thr Ser Thr

50 55 60

His Val Glu Thr Leu Leu Thr Phe Ser Ala Leu Lys Arg His Phe Lys

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Thr Ser Ser Thr Glu Arg Phe Ser Gln Asn Phe Lys Val

85 90 95

Val Val Val Asp Gly Lys Asn Glu Ser Glu Tyr Thr Val Lys Trp Gln

100 105 110

Asp Phe Phe Thr Gly His Val Val Gly Glu Pro Asp Ser Arg Val Leu

115 120 125

Ala His Ile Arg Asp Asp Asp Val Ile Ile Arg Ile Asn Thr Asp Gly

130 135 140

Ala Glu Tyr Asn Ile Glu Pro Leu Trp Arg Phe Val Asn Asp Thr Lys

145 150 155 160

Asp Lys Arg Met Leu Val Tyr Lys Ser Glu Asp Ile Lys Asn Val Ser

165 170 175

Arg Leu Gln Ser Pro Lys Val Cys Gly Tyr Leu Lys Val Asp Asn Glu

180 185 190

Glu Leu Leu Pro Lys Gly Leu Val Asp Arg Glu Pro Pro Glu Glu Leu

195 200 205

Val His Arg Val Lys Arg Arg Ala Asp Pro Asp Pro Met Lys Asn Thr

210 215 220

Cys Lys Leu Leu Val Val Ala Asp His Arg Phe Tyr Arg Tyr Met Gly

225 230 235 240

Arg Gly Glu Glu Ser Thr Thr Thr Asn Tyr Leu Ile Glu Leu Ile Asp

245 250 255

Arg Val Asp Asp Ile Tyr Arg Asn Thr Ser Trp Asp Asn Ala Gly Phe

260 265 270

Lys Gly Tyr Gly Ile Gln Ile Glu Gln Ile Arg Ile Leu Lys Ser Pro

275 280 285

Gln Glu Val Lys Pro Gly Glu Lys His Tyr Asn Met Ala Lys Ser Tyr

290 295 300

Pro Asn Glu Glu Lys Asp Ala Trp Asp Val Lys Met Leu Leu Glu Gln

305 310 315 320

Phe Ser Phe Asp Ile Ala Glu Glu Ala Ser Lys Val Cys Leu Ala His

325 330 335

Leu Phe Thr Tyr Gln Asp Phe Asp Met Gly Thr Leu Gly Leu Ala Tyr

340 345 350

Val Gly Ser Pro Arg Ala Asn Ser His Gly Gly Val Cys Pro Lys Ala

355 360 365

Tyr Tyr Ser Pro Val Gly Lys Lys Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Gly Leu

370 375 380

Thr Ser Thr Lys Asn Tyr Gly Lys Thr Ile Leu Thr Lys Glu Ala Asp

385 390 395 400

Leu Val Thr Thr His Glu Leu Gly His Asn Phe Gly Ala Glu His Asp

405 410 415

Pro Asp Gly Leu Ala Glu Cys Ala Pro Asn Glu Asp Gln Gly Gly Lys

420 425 430

Tyr Val Met Tyr Pro Ile Ala Val Ser Gly Asp His Glu Asn Asn Lys

435 440 445

Met Phe Ser Asn Cys Ser Lys Gln Ser Ile Tyr Lys Thr Ile Glu Ser

450 455 460

Lys Ala Gln Glu Cys Phe Gln Glu Arg Ser Asn Lys Val Cys Gly Asn

465 470 475 480

Ser Arg Val Asp Glu Gly Glu Glu Cys Asp Pro Gly Ile Met Tyr Leu

485 490 495

Asn Asn Asp Thr Cys Cys Asn Ser Asp Cys Thr Leu Lys Glu Gly Val

500 505 510

Gln Cys Ser Asp Arg Asn Ser Pro Cys Cys Lys Asn Cys Gln Phe Glu

515 520 525

Thr Ala Gln Lys Lys Cys Gln Glu Ala Ile Asn Ala Thr Cys Lys Gly

530 535 540

Val Ser Tyr Cys Thr Gly Asn Ser Ser Glu Cys Pro Pro Pro Gly Asn

545 550 555 560

Ala Glu Asp Asp Thr Val Cys Leu Asp Leu Gly Lys Cys Lys Asp Gly

565 570 575

Lys Cys Ile Pro Phe Cys Glu Arg Glu Gln Gln Leu Glu Ser Cys Ala

580 585 590

Cys Asn Glu Thr Asp Asn Ser Cys Lys Val Cys Cys Arg Asp Leu Ser

595 600 605

Gly Arg Cys Val Pro Tyr Val Asp Ala Glu Gln Lys Asn Leu Phe Leu

610 615 620

Arg Lys Gly Lys Pro Cys Thr Val Gly Phe Cys Asp Met Asn Gly Lys

625 630 635 640

Cys Glu Lys Arg Val Gln Asp Val Ile Glu Arg Phe Trp Asp Phe Ile

645 650 655

Asp Gln Leu Ser Ile Asn Thr Phe Gly Lys Phe Leu Ala Asp Asn Ile

660 665 670

Val Gly Ser Val Leu Val Phe Ser Leu Ile Phe Trp Ile Pro Phe Ser

675 680 685

Ile Leu Val His Cys Val Thr Ser Lys Cys

690 695

<210>5

<211>8

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>5

Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser

1 5

<210>6

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：混合的寡核苷酸引物

<220>

<221>不确定

<222>(9)..(9)

<223>不确定

<400>6

aartaygtna tgtaycc 17

<210>7

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：混合的寡核苷酸引物

<400>7

ccrcartcrc aytcytc 17

<210>8

<211>6

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>8

Glu Glu Cys Asp Cys Gly

1 5

<210>9

<211>11

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>9

Ile Ala Val Ser Gly Asp His Glu Asn Asn Lys

1 5 10

Claims

1.一种分离和纯化的多肽，它由SEQ ID NO：2的氨基酸18-671组成。

2.一种分离和纯化的多肽，它由SEQ ID NO：2的氨基酸215-477组成。

3.一种分离和纯化的多肽，它由SEQ ID NO：2的氨基酸18-Xaa组成，其中Xaa是选自氨基酸671至824的一个氨基酸。

4.根据权利要求1-3任一所述的分离和纯化的多肽，它是非糖基化形式。

5.与权利要求1所述的多肽结合的分离和纯化的抗体。

6.根据权利要求5所述的分离和纯化的抗体，其中抗体是单克隆抗体。

7.一种检测分子的TACE抑制活性的方法，包括使所述分子与一种底物混合，使混合物和权利要求1-3任一所述的多肽培育，和用色谱分析检测底物裂解的程度。

8.根据权利要求7所述的检测分子的TACE抑制活性的方法，其中底物由氨基酸序列Leu-Ala-Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser组成。

9.一种用权利要求1-3任一所述的多肽根据结构设计所述多肽的抑制剂的方法，包括下列步骤：确定这种多肽的三维空间结构，分析三维空间结构可能结合底物位点，合成一个具有多肽抑制活性的分子。

10.一种分离的核酸，它由SEQ ID NO：1的核苷酸52-2472组成。

11.一种分离的核酸，它由编码SEQ ID NO：2的氨基酸215-477的核苷酸序列组成。

12.一种分离的核酸，它由编码SEQ ID NO：2的氨基酸18-671的核苷酸序列组成。

13.一种表达载体，它包含权利要求10-12任一所述的核苷酸序列以及与该核苷酸序列可操作连接的表达调控序列。

14.一种宿主细胞，它转染或转化有权利要求13所述的表达载体。

15.一种生产TACE多肽的方法，包括在加速表达的条件下培养权利要求14所述的宿主细胞，和从培养基中回收多肽。

16.抑制由SEQ ID NO：2的氨基酸18-671组成的酶的TNF-α蛋白酶解活性的化合物在制备用于抑制TNF-α从哺乳动物细胞膜上裂解的药物中的应用。

17.由SEQ ID NO：2的氨基酸18-671组成的酶在制备用于抑制TNF-α从细胞膜上裂解的药物中的应用。

18.组合物在制备用于处理有过量生产或未调控生产的TNF-α特征的疾病的哺乳动物的药物中的应用，所述组合物含有一定量可有效抑制由SEQ ID NO：2的氨基酸18-671组成的酶的TNF-α蛋白酶解活性的化合物。