JPH03195495A - 骨形態形成タンパク - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、軟骨および骨の成長を開始させる骨形態形成
タンパク（ＢＭＰ）に関する。ＢＭＰの全長コード配列
、ポリペプチドが提供される。

ＢＭＰは、供給源の骨から単離することにより提供され
、そして９組換えＤＮＡの手法を用いて合成することに
より提供される。

（従来の技術） 一般に、基質誘導骨形成（ｍａｔｒｉｘ　　１ｎｄｕｃ
ｅｄｂｏｎｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）と呼ばれる工程に
より、無機質が脱落した骨基質を柔組織に移植した場合
には、該骨基質が新しい骨形成を誘導することが知られ
ている（Ｕｒｉｓｔ、Ｍ、Ｒ，，５ｃｉｅｎｃｅ、　１
５０巻：　８９３−８９９（ｉ９６５年）参照）。この
工程を誘導する単数または複数の活性物質を抽出し、同
定する多大の努力がなされており、この単数または複数
の活性物質は、これらの文献中では一般に骨形態形成タ
ンパク（ＢＭＰ）と言われている。ＢＭＰは単一の物質
であるのか、あるいは物質の混合物であるのかについて
は確定しておらず、従って、どの物質（もし存在すれば
）が骨形態形成タンパクであるかということに関しては
、研究者の意見が一致していない。

ここで論議されるように、用語ｒＢＭＰＪは、第３図（
ウシＢＭＰ）または第５図（ヒトＢＭＰ）に示される。

シグナルペプチドをもたないアミノ酸配列を有するタン
パクを説明するのに使用される。

ＢＭＰを治療に使用することは、伝統的な骨移植物質を
使用する場合に比べかなりの利点がある。

いかなる理論にも制限されないが、一つの仮説として、
ＢＭＰが組繊細胞を骨芽細胞（骨を形成する細胞）に分
化させると考えられる。正常なヒト胎児の発達で繰り返
される工程のなかで、ＢＭＰに誘導された骨芽細胞は軟
骨を形成し、数週間にわたって硬骨に発達する。このよ
うに、ＢＭＰは。

病気や事故により破壊された骨を更新するため。

側弯症の患者を治療するため、奇形の骨や誤って形成さ
れた骨を治療するため、骨折を直すため。

歯を再形成するため、股肉節を矯正するため、骨の型を
直すため、およびオステオポローシスを制御するためな
どに有用であり得る。

従って１本発明の目的は、全アミノ酸配列が同定された
タンパクであり、ＢＭＰ活性を有する機脆性軟骨および
骨成長因子あるいはその構成要素を生産することである
。

本発明の他の目的は、この生物学的に活性のあるＢＭＰ
タンパクを組換えＤＮＡの手法により生産することであ
る。

（発明の要旨） 本発明は、　「骨形態形成タンパク」あるいはｒＢＭＰ
Ｊと本発明で名付けられる哺乳類の天然成熟タンパクの
クラスを提供する。ＢＭＰは２本発明で記載されている
ヒト天然ＢＭＰおよびウシ天然ＢＭＰに代表される。一
般に、このクラスのタンパクは、骨成長をインビボある
いはインビトロで誘導する。ヒトおよび／またはウシＢ
ＭＰ配列は、このクラスの代表例であり、核酸配列およ
びアミノ酸配列において相同性が少な（とも一部または
全体にわたっである他の哺乳類ＢＭＰタンパクの同定お
よび単離に使用され得る。当業者は。

本発明に記載されるヒトおよびウシタンパクと相同性の
ある配列に基づいた他の哺乳類ＢＭＰ、　　および生物
的活性の同定を容易に行うことができる。

ＢＭＰ中の対立遺伝子の変異は極内でもあり得ることが
認められ、このような対立遺伝子の変異体もまた本発明
により提供されるタンパクのクラスの範囲内にある。

本発明は更に、ＢＭＰの類似体（例えばＢＭＰ変異タン
パク）、　融合タンパク（ＢＭＰあるいはＢＭＰドメイ
ンを有する）、およびＢＭＰ断片であるポリペプチドを
提供する。好ましい類似体は。

ＢＭＰ活性を有している。ＢＭＰ変異タンパクは。

天然ＢＭＰ配列と本質的に相同なタンパクであり（例え
ば、少なくとも約７５％、８５％、９０％または９５％
の相同性を有する）、少なくとも１つのアミノ酸が異な
っている。融合タンパクという語は、完全なりＭＰ配列
またはＢＭＰドメイン、および非相同のＮ末端またはＣ
末端配列（例えば、シグナル配列またはタンパクを分解
から保護する配列）を有するタンパクを包含する。ＢＭ
Ｐ断片またはＢＭＰドメインは、ＢＭＰタンパク由来の
充分な長さのアミノ酸配列であり、従って、そのような
りＭＰタンパク由来であることから同定が可能である。

特定のペプチドの起源は２例えば、公共のデータベース
にある配列と該ペプチドの配列とを比較することにより
決定され得る。

本発明は、他の実施態様において、第３図および第５図
（シグナルペプチドも示す）に示されるアミノ酸配列を
有するＢＭＰを提供する。本発明はまた１組換えＤＮＡ
の手法によるＢＭＰの調製方法を提供する。

もう一つの実施態様において９本発明は、　　ＢＭＰを
コードするＤＮＡ配列またはその類似体を提供し、この
ＤＮＡ配列またはその類似体は、宿主システム中で発現
するベクターを組換えＤＮＡの手法により構築するため
に使用され得る。

更にもう一つの実施態様において９本発明は。

ＢＭＰ、　　および必要に応じて、基質Ｇｌａタンパク
（ＭＧＰ）および骨カルシウム沈着因子（ＢＣＦ）のよ
うな他の骨誘導関連因子を含有する治療用組成物を提供
し、そして、骨形態形成を開始させる効果的な量のＢＭ
Ｐを、所望の部位にインビボで導入することにより、を
椎動物の軟骨および骨を形成する方法を提供する。ＭＧ
Ｐの同定は。

Ｐｒ１ｃｅ、　ＵｒｉｓｔおよびＯｔａｗａｒａ　（Ｂ
ｉｏｃｈｅ＋＊、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏ
ｍ＋＊、　１１７巻：　７６５−７７１．１９８３年）
により初めて報告された。ＢＣＦの同定は、　　１９８
９年６月２日に出願された同一出願人による同時係属中
の特許出願第３６０．８２６号に開示されている。

本発明の組成物は、他の骨誘導関連因子を実質的に含ま
ない、＠乳類骨形態形成タンパク（ＢＭＰ）およびその
類似体からなる群より選択されるポリペプチドを含有す
る。

好適な実施態様においては、上記哺乳類骨形態形成タン
パクは、ヒトまたはウシＢＭＰである。

好適な実施態様においては、上記ポリペプチドは、　第
５図に示されるアミノ酸配列　　　ａａｌ−ａａｔ＄２
またはその断片を含有する。

好適な実施態様においては、上記ポリペプチドは、　　
第３図に示されるアミノ酸配列　　ａａｌ−ａａｌ１８
またはその断片を含有する。

上記ポリペプチドは、１６ＫＤ酵母開裂類似体を含有す
る。

本発明は、＃４乳類ＢＭＰおよびその類似体のアミノ酸
配列を含有するポリペプチドをコードする。

イントロンを含まないＤＮＡ配列またはその補体を包含
する。

好適な実施態様においては、上記ＤＮＡは、ヒトまたは
ウシＢＭＰをコードする。

上記ポリペプチドは、１１１乳類ＢＭＰシグナル配列を
含有し、もしくは含有しない。

好適な実施態様においては、上記ポリペプチドは、宿主
酵母における分泌を提供するＮ末端酵母α因子シグナル
配列を更に含有する。

本発明は、上記ＤＮＡ配列を有するレプリコンを包含す
る。

本発明は、上記ＤＮＡ配列を宵するベクターを包含する
。

本発明は、上記レプリコンを有する細胞を包含する。

本発明は、上記ベクターを有する細胞を包含する。

本発明は、以下の工程を包含する組換え体哺乳類ＢＭＰ
またはその類似体を調製する方法を包含する： （ａ）非相同のＤＮＡ配列を有する細胞集団を提供する
工程、ここで、該ＤＮＡ配列は（ｉ）該細胞内で機能す
る転写および翻訳制御配列、および（ＩＩ）Ｉｌｉ乳類
乳類８詰Ｐびその類似体を包含するポリペプチドをコー
ドし、該転写および翻訳制御配列の制御下にあるコード
配列を有する；および （ｂ）該ポリペプチドを発現するための条件下で該細胞
集団を増殖させること。

好適な実施態様においては、上記ポリペプチドは、更に
、該ポリペプチドのＮ末端にシグナル配列をフードする
配列を有し、そして該ポリペプチドが前記細胞から分泌
される。

本発明の骨増殖誘導方法は、骨組織を、有効量の、哺乳
類ＢＭＰ組成物またはその活性類似体組成物と接触させ
る工程を包含する。

本発明は、哺乳類骨形態形成タンパクに対するモノクロ
ナール抗体を包含する。

（発明の構成） 本発明のｅｕｐは、化学的方法（例えばメリフィールド
合成法）を用いるペプチド分取合成法、または組換えＤ
ＮＡ法によって、骨起源から直接に、他の骨誘導関連因
子を含有せずに得られ得る。

実施例１に一層詳しく説明するように、　ＢＭＰは。

ヒト、ウシまたはその他のを推動物の骨の部分的に精製
した抽出物から、タンパクを分取ゲル電気泳動法と電気
溶離法とを用いて調製することによって得ることができ
る。

ＢＭＰの核酸配列は、　ｍＲＮへの逆転写体をスクリー
ニングするか、または細胞由来のゲノムライブラリーを
スクリーニングするような組換えＤＮＡ法によって得る
ことができる。このＤＮＡは、一般に利用できる技術お
よびＤＮＡ合成装置を用いてＤＮＡを合成することによ
っても得ることができる。合成法は、　ＤＮＡを調製す
る際に、特定の制限部位を導入できるので、天然起源に
は存在しない制限部位を含有する遺伝子をベクターに用
いることが容易になるので有利である。更に、　ＤＮＡ
における所望の部位修飾を合成によって導入することが
でき、　ＤＮＡを変異誘発によってさらに修飾する必要
がない。

一般に、　ＢＭＰをコードするＤＮＡは、を推動物の組
織から単離されたｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを
構築し、相同配列を有するｃＤＮ＾ライブラリー中のク
ローンを検出するために、ヒトまたはウシ由来の鎖のコ
ード部分を、標識を付けたＤＮＡプローブでスクリーニ
ングするか；またはｃＤＮＡ　（ｍＲＮＡ由来）をポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し。

ザブクローン化し、標識を付けたＤＮＡプローブでスク
リーニングして１次いで、クローンを制限酵素分析法で
分析し、核酸の配列を決定して全長のクローンを同定し
、全長クローンがライブラリー中に存在しない場合は、
各種のクローン由来の適切な断片を回収して、それら断
片を該クローンに共通の制限部位で連結して全長分子を
コードするクローンを組立てることによって、ヒト、ウ
シなどの起源から得ることができる。特に好ましいＤＮ
Ａプローブは後述する実施例で説明する。ＢＭＰ　ｃＤ
ＮＡの５゛末端から欠失したいずれの配列も、　ｍＲＮ
Ａを鋳型として使用してＢＭＰ配列に相補的な合成オリ
ゴヌクレオチド３°末端を延長することによって得られ
得る（いわゆるプライマー延長法）。あるいは相同の配
列は、第３図または第５図に示すヒトもしくはウシの配
列由来の公知のｃＤＮＡから供給される。

本発明を実施する場合、特にことわらない限り。

通常の分子生物学、微生物学および従来の技術に含まれ
る組換えＯＮＮ性法利用される。このような技術は文献
類に充分説明されている〔例えば以下の文献を参照のこ
と：　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ　＆Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ、　　　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　　Ｍａｎｕａ
ｌ”　　（ｉ９８２年）；　ＤＮＡ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ
：八　Ｐｅａｃｔｉｃａｌ　　八ｐｐｒｏａｃｈ”第１
および■巻ＣＤ、　Ｎ、　Ｇｌｏｖｅｒ編集、　１９８
５年）；”［ｌＩｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ”　（Ｍ、Ｊ、Ｇａｌｔ編集。

１９８４年）；　“Ｎｕｃｌｅｉｃ　　八ｃｉｄ　　Ｈ
ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”　（Ｂ、Ｄ。

Ｎａｍｅｓ　＆Ｓ、　Ｊ、　Ｈｉｇｇｉｎｓ編集、　　
１９８５年）；　”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　　八
ｎｄ　　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　　″　（Ｂ、Ｄ、Ｈ
ａｍｅｓ＆Ｓ、Ｔ、Ｈｉｇｇｉｎｓ編集、　１９８４）
；“Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌｓ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ”（Ｒ
，ＬＦｒｅｓｈｎｅｙ編集、　　１９８６年）；“Ｉｍ
ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｃｅ１ｌｓ　Ａｎｄ　Ｂｎｚｙｍ
ｅｓ″（ＩＲＮ　Ｐｒｅｓｓ、　　１９８６年）　；Ｂ
、　Ｐｅｒｂａｌ、　　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕ
ｉｄｅ　Ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ″
（ｉ９８４年）〕。

本発明を説明する際に、下記の用語が、以下に説明する
定義にしたがって用いられる。

“骨誘発関連因子”という用語には、＠乳動物の骨など
の哺乳類の組織中に存在する当該技術分野に公知の因子
が含まれ、　ＢＭＰもしくはＢＭＰ活性とともに共精製
（ｃｏ−ｐｕｒｉｆｙ）される傾向がある。このような
因子は、限定はされないが、骨から単離され、　５Ｏ３
−ＰＡＧＢ上の泳動による相対分子量が３４ｋＤ。

２４ｋＤ、　１８．５ｋＤ、　１７．５ｋＤ、　１６．
５に０．１４ｋＤ（米国特許第４゜７６１、４７１号に
引用されている）および６ｋＤ　（Ｐｒ　ｉｃｅ。

Ｐ、　Ａ、ら、　　Ｐｒｏｔ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　、　７３巻、　　１４４７−１４５１夏、　
１９７６年に報告されている）であると報告されている
タンパクを含有している。観察された分子量はすべて１
本願では、　５Ｏ３−ＰＡＧＥゲル上の泳動による相対
的分子量として報告されている。

「レプリコン」は、インビボでＤＮＡを複製する自律性
単位として機能する。すなわちそれ自体の制御のもとに
複製できる。あらゆる遺伝要素（例えば、プラスミド、
染色体、ウィルス）である。

「ベクター」は、プラスミド、ファージもしくはコスミ
ドのようなレプリコンであり、これに他のＤＮＡセグメ
ントが連結して、連結したセグメントの複製が行われる
。

ｒ　ＤＮＡ分子」は、−本領もしくは二本鎖らせん形の
デオキシリボヌクレオチド（アテ′ニン、グアニン、チ
ミンもしくはシトシン）の高分子形態を意味する。この
用語は２分子の一次と二次の構造のみを意味し、特定の
三次構造に限定しない。したがって、この用語には、特
に線形ＤＮＡ分子（例えば制限断片）、ウィルス、プラ
スミドおよび染色体中に見出された二本鎖ＤＮＡが含ま
れる。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を考察する際９本
願では。

配列は、　ＤＮＡの非転写ストランド（すなわち、　ｍ
ＲＮＡに相同の配列を有するストランド）にそって５°
から３゛への方向の配列だけを示す通常の規則にしたが
って記載する。

ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の制御下にお
かれている場合、インビボで、ポリペプチドに転写され
翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。

コード配列の境界は、５′（アミノ）末端における開始
コドンと、３°（カルボキシ）末端における翻訳終止コ
ドンとによって決定される。コード配列には、特に限定
はされないが、原核配列、真核ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ
、真核（例えば哺乳類の）　ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ
配列が含まれ１合成のＤＮＡ配列も含まれ得る。ポリア
デニル化シグナルと転写終止配列は。

通常、コード配列に対して３′側に位置している。

転写制御配列および翻訳制御配列は、プロモーター、エ
ンハンサ−、ポリアデニル化シグナル。

ターミネータ−等のＤＮＡ調節配列であり、宿主細胞中
でコード配列の発現を行う。

「プロモーター配列」は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼ
を結合し、下流の（３°方向）コード配列の転写を開始
することができるＤＮＡ調節領域である。

本発明を定義するために、プロモーター配列は。

その３′末端において転写開始部位を境界とし、上流（
５°方向）はバックランドを越えて検出可能なレベルで
転写を開始するのに必要な最小数の塩基もしくは要素を
含むように広がっている。プロモーター配列内には、転
写開始部位（通常ヌクレアーゼＳ１を用いてマツピング
することによって定義される）と、　ＲＡＳポリメラー
ゼの結合に関与するタンパク結合ドメイン（コンセンサ
ス配列）とが見出される。真核プロモーターは、常時で
はないが、“ＴＡＴ＾”ボックスと“ＣＡＴ”ボックス
を有することが多い。原核プロモーターは、−１０と−
３５のコンセンサス配列に加えてシャイン、ダルガルノ
配列をもっている。

ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し。

次にこのｍＲＮＡが、コード配列によってコードされる
タンパクに翻訳される場合に、コード配列は。

細胞内の転写制御配列および翻訳制御配列の「制御下」
にある。

「シグナル配列」は、コード配列の前に、含有され得る
。この配列は、ポリペプチドのＮ末端側のシグナルペプ
チドをコードし、このシグナルペプチドは、宿主細胞に
コミュニケートしてポリペプチドを細胞表面に誘導する
か、またはポリペプチドを培地中に分泌し、そしてこの
シグナルペプチドは、宿主細胞によって切り離されてか
ら細胞から放出される。シグナル配列は、真核細胞およ
び原核細胞に天然に存在する各種タンパクと結合して見
出され得る。例えば天然の一酵母タンパクである。α因
子は、酵母から分泌され、そのシグナル配列は、培地に
分泌される非相同タンパクに連結され得る。（米国特許
第４．５４６．０８２号、　１９８３年１月１２日公開
のヨーロッパ特許出願公開０１１６２０１号；１９８３
年８月１２日出願の米国特許出願第５２２．９０９号参
照）。さらにα因子とその類似体は、サツカロマイセス
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびクルイベ０フイ
セス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）等の各種酵母から
非相同タンパクを分泌させることが見出されている　（
ｉ９８８年１２月２３日出願のヨーロッパ特許出願８８
３１２３０６．９号；　１９８７年１２月３０日出願の
米国特許出願第１３９．６８２号；および１９８９年２
月１日公開のヨーロッパ特許出願公開第０３０１６６９
号）。

外因性もしくは非相同性のＤＮＡが細胞内に導入された
場合に、その細胞はこれらのＤＮＡによって「形質転換
」されたという。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムを構
成する染色体ＤＮＡに組み込まれる（共有結合的に連結
されている）か、または組み込まれない。例えば、原核
細胞、酵母細胞および哺乳類細胞内には、形質転換ＤＮ
Ａは、プラスミド等のエピソーム要素上に保持され得る
。真核細胞については、安定して形質転換された細胞は
、形質転換ＤＮＡが、染色体に組み込まれるようになり
。

染色体の複製によって娘細胞に遺伝される細胞である。

この安定性は、真核細胞が、形質転換ＤＮＡを有する娘
細胞の集団からなる細胞系もしくはクローンを作る能力
によって示される。「クローン」は、単一細胞もしくは
共通の先祖から有糸分裂で誘導される細胞の集団である
。「細胞系」は、多世代にわたってインビトロで安定に
増殖できる一次細胞のクローンである。

ヌクレオチドの少なくとも約８５％（好ましくは少なく
とも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％）が
、　ＤＮＡ配列の所定の長さにわたって一致する場合、
２つのＤＮＡ配列は「実質的に相同である」。実質的に
相同の配列は１例えばその特定の系に対して定義された
厳密な条件下、サザンハイプリダイゼーション実験法で
同定することができる。適切なハイブルダイゼーション
条件を定義することは、当業者の技術範囲内である（例
えば。

Ｍａｎｉａｔｉｓら、上記文献；ＯＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ、　　Ｉおよび■巻、上記文献；　Ｎｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃ１ｄ　１ｌｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、上記文献参
照）。

ＤＮＡ構築物の「非相同」領域は、より大きな［］ＮＡ
分子内の、　ＯＮへの同定可能なセグメントであるが。

天然には、その大きなＩＩＮＡに連結した状態では見い
出されていないセグセントである。したがって。

非相同領域が哺乳類の遺伝子をコードする場合。

その遺伝子は、起源の生物体のゲノム内の哺乳類ゲノム
ＤＮＡに隣接していないＤＮＡが通常隣接している。非
相同のコード配列の他の例は、コード配列自体が天然に
は見られない構造である（例えば。

ゲノムのコード配列が、イントロンをもっているｃＤＮ
Ａ、または天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配
列）。対立遺伝子の変化、または自然に発生ずる変異現
象は１本願で定義するＤＮＡの非相同領域には起こらな
い。

組成物中の少なくとも約７５重量％のタンパク。

ＤＮＡ、ベクター（後記ＡとＢの属する種の範鴫によっ
て決まる）が「Ａ」の場合、「Ａ」を含有する組成物（
「Ａ」は単一のタンパク、　ＤＮＡ分子。

ベクターなどである）には、ｒＢ」　（ｒＢＪは１種以
上の夾雑タンパク、　ＤＮＡ分子、ベクターなどを含む
）は実質的に存在しない。好ましくは「Ａ」は１組成物
中で、少なくともＡ＋８の種の約９０重量％、最も好ま
しくは、少なくとも約９９重量％含有される。汚染物が
実質的に存在しない組成物が。

問題の種の活性もしくは特性を有する単一の分子量の種
だけを含有する組成物であることも好ましい。

「抗体」は、抗体およびその断片を含む免疫ダブリンで
あり、特異的なエビローブと結合する。

この用語は、特に、ポリクローナル、モノクローナルお
よびキメラの抗体を含む。

さらにキメラ抗体については、米国特許第４．８１６、
３９７号と第４．８１６．５６７号を参照のこと。

本発明によって提供されるイントロンを含まないＤＮＡ
は、天然に発生するヒトおよびウシの遺伝子が、イント
ロンをもっていると考えられるので。

新規である。したがって、「イントロンを含まない」と
いう用語は、ヒトもしくはウシの細胞染色体内に天然に
発生するＤＮＡ配列を除外する。本願に記載されるＤＮ
Ａ配列から誘導可能なイントロンを含有しないｃＤＮ＾
ＤＮＡ配列含する。

以下の実施例で一層詳しく説明しているように。

ヒトとウシのｃＤＮＡライブラリーは、標識を付けたオ
リゴデオキシヌクレオチド配列を用いてＢＭＰ配列をコ
ードする配列について最初にプローブされた。なお上記
の標識を付けたオリゴデオヌクレオチドの配列は９本願
に記載した骨由来の精製タンパク試料の分析結果から決
定された部分アミノ酸配列に基づいたものである。しか
し９本願に記載したヒトとウシのＢＭＰをコードするイ
ントロンを含まないＤＮＡと、そのリーダー配列とが一
旦得られると正確にハイブリッドを形成するプローブを
記載された配列から調製して、所望のヒトもしくはウシ
の遺伝子の残りの部分を容易に得ることができることが
当業者に認識されるであろうことは明らかである。

ベクターは、　　ＢＭＰポリペプチドをコードするＤＮ
Ａの操作、すなわち、多量のＤＮＡを調製して、プロセ
ッシングをさらに行う（クローニングベクター）か、ま
たはＢＭＰポリペプチドの発現（発現ベクター）を行う
ための操作を簡略化するのに用いられる。ベクターには
、プラスミド、ウィルス（ファージを含む）および組み
込み可能なりＮＡ断片、すなわち組み換えによって宿主
ゲノムに組み込むことができる断片が含まれる。クロー
ニングベクターは９発現制御配列をもつ必要はない。し
かし。

発現ベクター中の制御配列には、転写プロモータ、転写
を制御する任意のオペレーター配列、適切なリポソーム
結合部位（原核発現のための部位）をコードする配列、
および転写と翻訳の終止を制御する配列等の転写と翻訳
の制御配列が含まれる。

発現ベクターには、好ましくは、　ＢＭＰの安定した発
現を容易にし、そして／あるいは形質転換体を同定する
選択遺伝子が含まれていなければならない。しかし９発
現を維持する選択遺伝子は、真核宿主細胞を用いて、共
形質転換システムで別個のベクターによって供給するこ
とができる。

適切なベクターは、一般に、レプリコン（非組み込みベ
クターに用いる複製の起点）と、目的とする発現宿主と
相溶性の種由来の制御配列とを有する。本願で用いる「
複製可能な」ベクターという用語は、上記のレプリコン
と、宿主ゲノムへの組み込みによって複製されるベクタ
ーとを含有するベクターを包含するものとする。形質転
換された宿主細胞は、　ＢＭＰをコードするＤＮＡを含
有するベクターで形質転換されたか、またはトランスフ
ェクトされた細胞である。発現されたＢＮＰは９選択さ
れた宿主細胞と１発現されたペプチドの適切なプロセッ
シングシグナル、例えば、相同もしくは非相同のシグナ
ル配列の存在によって、細胞内に析出するか；または細
胞周辺の空間もしくは培養物上清中に分泌される。

適切な宿主細胞は、原核細胞もしくは真核細胞である。

原核細胞には、ゲノム陰性またはゲノム陽性の生物９例
えばイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）もしくは桿菌類が含
まれる。真核細胞には、酵母、または哺乳類起源の株化
細胞系のような高等真核細胞が含まれる。

宿主細胞の発現ベクターは、複製起点、リボゾーム結合
部位とともにＢＭＰをコードする配列の上流に位置する
プロモーター、ポリアデニル化部位および転写終止配列
を通常もっている。当業者ならば、これらの配列のいく
つかは、ある種の宿主内での発現には必要でないことが
分かるであろう。

微生物とともに用いる発現ベクターは、宿主によって３
忍識される複製起点、宿主内で機能するプロモーター、
および選択遺伝子だけを含有する必要がある。

発現ベクターは９本発明によって構築され、　ＢＭＰを
コードする配列は、適切な調節配列を有するベクター内
に位置され、そのコード配列は、制御配列の「制御」下
で転写され翻訳されるように（すなわち、制御配列の位
置でＤＮＡ分子と結合するＲＮＡポリメラーゼがコード
配列を転写するように）制御配列に対して位置し配向し
ている。制御配列は、上記のクローニングベクターのよ
うなベクターに挿入される前に、コード配列に連結され
る。

あるいは、コード配列は、制御配列と適切な制限部位と
をすでにもっている発現ベクターに直接クローン化する
こともできる。原核細胞と酵母中にＢＭＰを発現させる
には、制御配列は、コード配列に対して非相同であるこ
とが必要である。宿主細胞が原核細胞の場合、コード配
列がイントロンを含まないこと（例えばｃＤＮＡ）が必
要である。選択された宿主細胞が哺乳類の細胞の場合、
制御細胞はＢＮＰをコードする配列に対して非相同もし
くは相同であり得、コード配列１ま、イントロンを含有
するゲノムＯＮ＾またはｃＤＮＡであり得る。ゲノム配
列もしくはｃＤＮＡをコードする配列は、酵母中に発現
することができる。

発現ベクターは、宿主生物によって認識されるプロモー
ターを含有していなければならない。組換えＤＮＡを構
築するのに用いられる。公知で利用可能なプロモーター
には、β−ラクタマーゼ（ぺ二シリナーゼ）とラクトー
スプロモーター系、トリプトファン（Ｔｒｐ）プロモー
ター系およびそのｔａｃプロモーターが包含されている
。これらのプロモーターが通常用いられているが、他の
公知の微生物プロモーターも適用できる。

原核細胞に加えて、酵母のような真核細胞がＢＮＰをコ
ードするベクターで形質転換される。サツカロミセス１
セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）すなわち通常のパン酵母は、低級な真核宿
主微生物の中で最も普通に用いられている。しかし、他
の多くの種も、一般に利用することができ１本発明に有
用である。酵母ベクターは、一般に、２ミクロンの酵母
プラスミド由来の複製起点もしくは自己複製配列（ＡＲ
５）　、　プロモーター、　ＢＭＰをコードするＤＮＡ
　、ポリアデニル化と転写終止のための配列、および選
択遺伝チを含有している。

酵母ベクター内の適切なプロモーター列には。

以下のような解糖系酵素のプロモーターが含まれている
。これらの酵素には１例えばエノラーゼ。

３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド
−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピル
ビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、
グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリ
セリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリ
ン酸イソメラーゼ。

ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼが
含まれる。

その他の酵母プロモーターは、転写が増殖条件によって
制御されるという追加の利点をもっているものがある。

これらは、アルコールデヒドロゲナーゼ１もしくは２．
イソシトロクロムＣ１酸性ホスファターゼ、およびマル
トースとガラクトースの利用に関与する酵素に対するプ
ロモーター領域である。

高級真核細胞の培養物は、を推動物の細胞もしくは非を
推動物の細胞にかかわらず、昆虫を含めて、用いること
ができ、その増殖法は公知である（例えば、　Ｔｉ５ｓ
ｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ
、　ＫｒｕｓｅとＰａｔｔｅｒｓｏｎ編集、　１９７３
年参照）。

高級真核細胞にＢＭＰを発現させるのに適切な宿主細胞
には、　ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶＩ系（
ＣＯ３−７，ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５１）　　；仔ハム
スター腎臓細胞（Ｂ）ＩＫ、八ＴＣＣＣＲＬ　１０）；
チャイニーズハムスター卵巣細胞ＤＨＰＲ（Ｕｒｌａｕ
ｂとＣｈａｓｉｎ、　ＰＮＡＳ（ＩＪＳＡ）、　７７巻
。

４２１６頁、　１９８０年に記載されている）；マウス
・セルトリ細胞（ＴＭ４．　Ｍａｔｈｅｒ、　Ｊ、　Ｐ
、　、　Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐｒｏｄ、　２３巻。

２４３−２５１頁、　１９８０年）；サル腎臓細胞（Ｃ
ＶＩ　ＡＴＣＣ［Ｃ１，７０）　；７−ｙ　＋）カミ）
’　ＩＪ　ｆ）Ｌｔ腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６゜＾ＴＣ
［：　ＣＲＬ　１５８７）；　ヒト子宮頚癌細胞（Ｉ（
ＥＬＡ、　ＡＴＣＣ［：Ｃ１０）；イヌ腎臓細胞（ＭＤ
ＣＫ、　ＡＴＣＣＣＣ’Ｌ　３４）　；バッファローラ
ット肝臓細胞（ＢＲＬ　３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ　１４４
２）　；ヒト肺細胞（Ｗ１３８．ＡＴ［’［：　ＣＣＬ
　７５）；　ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ　Ｇ２．ＨＢ　８０
６５）；”ウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ　０６０６５２．ＡＴ
［：（ｉ゜Ｃ［’Ｌ５１）；ラット肝癌細胞（ｔ（ＴＣ
，Ｍｌ、　５４．８ａｕｍａｎｎ、　Ｍ、ら。

Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、８５巻、１〜８頁、　１９
８０年）；およびＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ　Ｊ、Ｐ、
　　ら、　Ａｎｎａｌｓ　Ｎ、Ｙ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　、　３８３巻、４４〜６８頁、　１９８２年
）が含まれる。通常用いられるプロモーターは、ポリオ
ーマ、アデノウィルス２およびシミアンウィルス４０　
（ＳＶ４０）　由来のものである。組換えＢＭＰは、＠
乳類の組織中で発現された場合、グリコジル化によって
分子量が高くなっていることは認識されている。それ故
に１分子量が１９ＫＯより大きい１部分的もしくは完全
にグリコジル化された形態のＢＭＰは、その末グリコジ
ル化形態とともに本発明の範囲に含まれるものである。

多数の原核発現ベクターが当該技術分野で公知になって
いる（例えば、米国特許４．４４０．８５９号。

第４．４３６．８１５号、第４．４３１．７４０号、第
４．４３１．７３９号。

第４．４２８．９４１号、第４．４２５．４３７号、第
４．４１８．１４９号。

第４．４１１．９９４号、第４．３６６、２４６号およ
び第４．３４２．８３２号を参照のこと；英国特許出願
公開第ＧＢ２．１２１．０５４号、第ＧＢ２．００８．
１２３号および第ＧＢ２．００７．６７５号；ならびに
ヨーロッパ特許出願公開第１０３．３９５号も参照のこ
と）。好ましい原核発現系はイー・コリ内である。

（以下余白） その他の好ましい発現ベクターは、真核系に用いるベク
ターである。真核発現系の１例は、ワタシニアウイルス
を用いるもので、これは当該技術分野で公知である。（
例えば、　１ＪＨｃｋｅｔら、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、。

４９巻、８５７頁、　　１９８４年；”ＤＮＡ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ”第■巻。

１９１〜２１１頁、前記文献；　ＰＣＴ特許出願公開第
ＷＯ３６１０７５９３号参照）。酵母の発現ベクターは
当該技術分野で公知である（例えば、米国特許第４．４
４６゜２３５号、第４．４４３．５３９号、第４．４３
０．４２８号；ヨーロッパ特許出願公開第１０３．４０
９号、　１００．５６１号。

９６、４９１号参照）。その他の好ましい発現系は、チ
ャイニーズハムスター卵巣細胞を形質転換するベクター
ｐＨ５ｌである（ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ３７１０２
０６２号参照）。哺乳類の組織を、ジヒドロ葉酸還元酵
素（ＤＨＦＲ）もしくはチミジンキナーゼのような選択
可能なマーカーをコードするＤＮＡと、　ＢＮＰをコー
ドするＤＮＡとで共形質転換することができる。

野生型のＤＨＰＲ遺伝子４用いる場合、　ＤＨＰＲが欠
乏している宿主細胞を選択するのが好ましく、その結果
、ヒボキサンチン、グリシンおよびチミジンを欠いたｈ
ｇｔ−培地中でうまくトランスフェクトしたか否かを確
かめるだめのマーカーとして叶ＰＲをコードする配列を
用いることができるようになる。この場合の適切な宿主
細胞は、　ＤＨＦＲ活性を欠いたチャイニーズハムスタ
ー卵巣（ＣＩＩＯ）細胞系であり、　　Ｕｒｌａｕｂと
Ｃｈａｓｉｎ、　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、＾ｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、　（ＵＳＡ）　。

７７巻、　４２１６頁、　１９８０年に記載されている
ようにして調製・増殖される。昆虫細胞中で用いられる
バキュロウィルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）由来の発
現ベクターは、当該技術分野で公知であり、利用するこ
とができる（ＬｕｃｋｌｏｗとＳｕｍｍｅｒｓ、　Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。

６巻、４７〜５５頁参照）。

選択された発現系と宿主に基づき、　ＢＭＰは、上記発
現ベクターのような外因性もしくは非相同のＤＮＡ構築
物で形質転換された宿主細胞を、　ＢＭＰタンパクが発
現される条件下で増殖させることによって産生される。

次いで、生成したＢＭＰを宿主細胞から単離して精製す
る。発現系がＢＭＰを増殖培地に分泌したならば、タン
パクは、無細胞の培地から直接精製することができる。

ＢＭＰタンパクが分泌されない場合は、細胞溶解物から
単離される。

適切な増殖条件と回収法の選択は、当該技術分野の技術
に含まれる。

組換え技術で作製したＢＭＰは、公知の方法にしたがっ
て、形質転換された細胞から回収される。

形質転換された細胞からＢＭＰを分泌する発現ベクター
を使用するのが好ましく、シたがって、その細胞を遠心
分離で分離することができる。ＢＭＰは一般に９通常の
タンパク精製法によって精製され。

これらの方法には、特に限定されないが、サイズ排除法
、イオン交換クロマトグラフィー、　ＨＰＬＣなどが含
まれる。

ＢＭＰに対するコード配列が、−旦調製もしくは単離さ
れると、適切なベクターにクローン化され得、　ＢＭＰ
をコードする配列を含有しない細胞が実質的に存在しな
い細胞の組成物（例えば、他のライブラリークローンが
存在しない）中に保持され得る。多数のクローニングベ
クターが当業者にとって公知である。クローニング用の
組換えＤＮＡベクターと、これらベクターが形質転換で
きる宿主細胞には、各種の、バクテリオファージスベク
ター　（イー・コリ）、　　ｐＢＲ３２２（イー・コリ
）　、　　ｐＡｃＹｃ１７７（イー　−：Ｉ　！Ｊ　）
、　ｐＫＴ２３０（グラム陰性菌）、　ｐＧＶ１１０６
（グラム陰性菌）　、　ｐＬＡＦＲｌ　（グラム陰性菌
）、　ｐＭＢ２９０（非イー・コリグラム陰性菌）、　
ｐｔｌＶ１４　［イー・コリおよびバチルス・サブチリ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　］　、　
ｐＢＤ９　（バチルス）、　ＰＩＪ６１　（ストレプト
ミセス）、　　ｐＵｃ６　（ストレプトミセス）、アク
チノファージ、φＣ３１（ストレプトミセス）、Ｙ［ｐ
５（サツカロミセス）、　ＹＣｐ１９　（サツロミセス
）、　およびウシ乳頭腫ウィルス（哺乳動物細胞）が含
まれる　（一般に、　ＯＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ｉ
巻および■巻、上記文献；　Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓら
、上記文献；　Ｂ、Ｐｅｒｂａｌ、上記文献参照）。

あるいは、　ＢＭＰは９通常のペプチド合成法１例えば
、メリフィールド合成法の原理およびメリフィールド合
成法を利用するように設計された市販の自動装置を用い
ることによって製造され得る。

通常のペプチド合成法を用いて作製したペプチドは９通
常のアフィニティークロマトグラフィーゲル濾過法およ
び／またはＲＰ−ＨＰＬＣ法を用いて精製され得る。

第３図は、ウシＢＭＰ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列と
。

推定したアミノ酸配列もしくは前駆体ポリペプチドを示
す。推定のシグナルペプチダーゼの開裂部位は（↓）印
で示しである。ｃＤＮＡ配列を９２８ＭＰｃＤＮＡクロ
ーン＃１の８３０ｂｐ　Ｂｇｌ　Ｉｆ挿入断片から得た
。なおこのクローンは、下記のようにして、仔つシ肝１
）ｉｉｃＤＮＡライブラリーから単離した。

第５図は、ヒトＢＭＰ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列と
。

前駆体ポリペプチドの推定アミノ酸配列とを示す。

推定シグナルペプチダーゼの開裂部位は（↓）印で示し
である。ｃＤＮＡ配列は、ヒトＢＭＰ　ｃＤＮＡクロー
ンＡ６の６００ｂｐ　Ｄａｍ）Ｉｆ／Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ
挿入断片から得たが。

このクローンは、下記のようにして、　ＢＭＰ／ＰＣＲ
ヒト腎１］１ｌｃＤＮＡライブラリから単離した。

第３図と第５図のヌクレオチド配列は、さらにＢＭＰ類
似体が９本発明の範囲に含まれるものであることを意図
している。断片のような類似体は。

例えば、　ＢＭＰをペプシンで消化することによって産
生され得る。変異タンパク　（ｍｕｔｅｉｎ）のような
他の類似体は、　ＢＭＰコード配列の標準的な特定部位
の変異誘発によって産生され得る。ｒ　ＢＭＰ活性」を
示す類似体は、インビボおよび／またはインビトロのア
ッセイによって同定され得るが、インビトロの軟骨誘発
アッセイが好ましい（Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆ　Ｂｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ、　　１４６巻、　２９４〜３１２頁、　　
１９８７年）。

ＢＭＰ類似体の１例は、ウシもしくはヒト　ＢＭＰの全
長発現産物からインビボで産生される酵母の開裂生成物
である。ウシ発現産物のプロセッシングによって、後記
の実施例９で説明される２つのほぼ１６ｋＤのポリペプ
チドが生じ、これらの類似体の１つもしくは両方を本願
では、　　ｒ１６ｋＤ酵母開裂類似体」と呼ぶ。

上記のように、　ＢＭＰをコードするＤＮＡ配列は。

クローン化するよりはむしろ合成によって調製され得る
。ＤＮＡ配列は、　ＢＭＰアミノ酸配列配列する適切な
コドンを用いて設計され得る。一般に、配列が発現に使
用される場合、目的とする宿主に対して好ましいコドン
が選択される。完全な配列は。

標準方法で調製されたオリゴヌクレオチドをオーバーラ
ツプさせることにより組立られ１次いで完全なコード配
列に組立られる（例えば、　Ｂｄｇｅ、Ｎａｔｕｒｅ。

２９２巻、７５６頁、　１９８１年ＨＮａｍｂａｉｒら
、　５ｃｉｅｎｃｅ。

２２３巻、　　１２９９頁、　　１９８４年ＨＪａｙ　
ら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、［：ｈｅｍ、。

２５９巻、　６３１１頁、　１９８４年参照）。

合成のＯＮ＾配列によって、　ＢＭＰ類似体または「変
異タンパク」を発現する遺伝子を簡便に構築することが
できる。あるいは、変異タンパクをコードするＤＮＡは
、天然ＢＭＰの遺伝子もしくはｃＤＮＡの特定部位に変
異を誘発させることによって作製され得、変異タンパク
は１通常のポリペプチド合成法を用いることによって直
接作製され得る。

部位特異的変異誘発法は、変異をおこすべき一本鎖ファ
ージＤＮＡに、特定のミスマツチ部分を除いて相補性の
ブライマー合成オリゴヌクレオチドを用いて行われ、所
望の変異が得られる。簡単に述べれば１合成オリゴヌク
レオチドをブライマーとして用いて、ファージに相補性
の一本鎖が直接合成され、得られた二重鎖ＤＮＡはファ
ージを保持する宿主細菌に形質転換される。形質転換さ
れた細菌の培養物を寒天の上面にプレートして、ファー
ジを保持する単一の細胞からプラークを形成させること
ができる。

理論的には、新しいプラークの５０％が、−重鎖として
変異した形態のファージを含有し、５０％が元の配列を
有している。得られたプラークは、正確に一致したもの
のハイブリダイゼーションが可能であるが１元の鎖に対
して一致していない場合は充分にハイブリダイゼーショ
ンが防止される温度で、キナーゼ化された合成ブライマ
ーを用いてハイブリッドされる。プローブとハイブリッ
ドするプラークを次に取り出し、培養して、　ＤＮＡが
回収される。

一般的な非天然アミノ酸のタンパクへの部位特異的組込
み法は、　Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｎ　Ｊ、Ｎｏｒｅｎ、
５ｐｅｎｃｅｒＪ、Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ、Ｍ
ｉｃｈａｅｌ　　Ｃ０Ｇｒｉｆｆｉｔｈ、Ｐｅｔｅｒ　
　Ｇ。

５ｃｈｕｌｔｚ、５ｃｉｅｎｃｅ、　２４４巻、　　１
８２〜１８Ｂ頁、　　１９８９年４月に記載されている
。この方法は、非天然アミノ酸を有する類似体を作成す
るのに用いられ得る。

ＢＭＰおよびその類似体の調製は、　Ｕｒｉｓｔら、　
Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　［ｉｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　
　（Ｄ、Ｂａｒｎｅｓ　　ａｎｄ　　ロ、Ａ、５ｉｒｂ
ａｓｋａ編集）、　　１４６巻、　２９４〜３１２頁、
　　１９８７年、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ニ
ューヨークに記載の方法によって。

インビボでアッセイされ得、また５ａｔｏとＬｌｒｉｓ
ｔ、　Ｃｌ１ｎ、０ｒｔｈｏｐ、、　１８３巻、　１８
０〜１８７頁、　１９８４年の方法であって、　Ｋａｗ
ａｍｕｒａとＵｒｉｓｔ、Ｄｅｗ、Ｂｉｏｌｏ、　１３
０巻。

４３５〜４４２頁、　１９８８年で改変された方法によ
ってインビトロでアッセイされ得る。これらの文献はす
べて本願に援用されている。

実質的に純粋なりＭＰ　、その高分子量でグリコジル化
された形態のもの、またはその活性断片、またはその非
毒性の塩は、医薬的に許容される担体と組合わされて医
薬組成物を形成し、ヒトを含む哺乳類に、静脈、皮下、
経皮、筋肉内または経口投与され得る。

上記のタンパクは、医薬的に許容される非毒性の塩９例
えば酸付加塩、または例えば、亜鉛、鉄などとの金属錯
体（これらは上記の用途では塩とみなされる）の形態で
投与されることが多い。このような酸付加塩の例として
は、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイ
ン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩
、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩などである
。

活性成分を錠剤形態で投与する場合９錠剤は、トラガカ
ントゴム、コーンスターチもしくはゼラチンのような結
合剤；アルギン酸のような崩壊剤；およびステアリン酸
マグネシウムのような滑沢剤を含有している。波形態で
投与したい場合、甘味剤および／または矯味矯臭剤が用
いられ１等張食塩水、リン酸緩衝溶液などに入れて静脈
内投与がなされる。

医薬組成物は、従来から医薬として許容される担体とと
もに、有効量のＢＭＰを通常含有している。

投与量は、タンパクが投与される具体的な目的によって
変動し、約０．１μｇ〜約１００　ｍｇ／ｋｇ体重の範
囲の投与レベルが用いられ得る。

本発明では、さらに、インビトロおよびインビボの両方
で骨形成を開始する治療用組成物としてのＢＭＰと、特
にヒトもしくはウシのＢＣＦとの組合せを目的としてい
る。

組換えＢＭＰを、単独の、または１種以上の骨誘導関連
因子と混合した場合の移植物は、軟骨と骨の増殖を開始
するのに用いられ得る。この移植物は１例えば、宿主被
検体が吸収しつる天然もしくは合成のリポソームや他の
徐放性膜内にカプセル封入される徐放性組成物であって
もよい。ＢＭＰは。

ヒト、ウシもしくはその他の哺乳動物形、またはその混
合物であってもよい。骨の増殖を開始するために、　Ｂ
ＭＰは、１種以上の他のタンパク、特に骨由来の１種以
上の他のタンパクの組合せと混合してもよい。このよう
な混合物は、軟骨の形成を開始し２次いで骨を増殖させ
る。ＢＭＰの移植物は。

四頭筋のコンパートメントで軟骨と骨の増殖を誘発する
のに用いられ得る。

以下に詳細に述べる精製法によって、初めて。

正確にアミノ酸の配列決定ができる。充分な量と充分な
純度で、天然のＢＭＰを精製することができる。精製さ
れたＢＭＰから得られるアミノ酸配列によって、天然Ｂ
ＭＰ核酸配列の単離を促進するプローブの設計、または
ＢＭＰのアミノ酸配列をコードする合成核酸配列の設計
が可能になり、それとともに、　ＢＭＰとその類似体に
対する診断用抗体と治療用抗体の両者が初めて生産可能
になる。ＢＭＰ　ＤＮＡ遺伝子もしくは断片は、欠陥の
あるＢＭＰ遺伝子を有する被検体を同定する診断試験に
も利用され得る。

特異的抗血清もしくはモノクローナル抗体（以下に述べ
る）は第３ｒＸＪもしくは第５図に示すようなアミノ酸
残基の配列もしくは断片を有する合成りＭＰペプチドに
作製することができる。第１図に示すトリプシンの断片
が例であり、これに対する抗体は９選択された組織、細
胞抽出物もしくは体液中に存在するＢＭＰを免疫沈澱さ
せるのに使用することができる。この超厚から得た精製
ＢＭＰは。

次に配列が決定され、上記の特異的プローブを設計する
基礎として使用され得る。公知のＢＭＰと異なる。他の
領域に対する抗体も使用され得る。精製された天然もし
くは組換えＢＭＰは抗原としても有用である。

天然、組換えまたは合成のＢＭＰペプチド（全長もしく
はサブユニット）は、ポリクローナル抗体とモノクロー
ナル抗体との両者を作製するのに使用され得る。ポリク
ローナル抗体が所望の際は。

精製ＢＭＰペプチドを用いて選択された哺乳動物（例え
ば、マウス、ラビット、ヤギ、ウマなど）を免疫化し、
免疫化された動物から血清を集めて。

公知の方法で処理する。ＢＭＰに加えて、各種の抗原に
対するポリクローナル抗体を含有する組成物は、免疫ア
フィニティークロマトグラフィーによって、抗ＢＭＰで
ない抗体が実質的に存在しないように作製し得る。

モノクローナル抗ＢＭＰ抗体も、当業者には本文中の開
示内容から容易に作製できる。ハイブリドーマによって
モノクローナル抗体を作製する一般的な方法は周知であ
る。永久増殖化された抗体産生細胞系は、腫瘍ＤＮＡに
よるＢリンパ球の直接形質転換、またはエプスタイン−
バーウィルスによるトランスフェクションのような融合
以外の手法によっても作製され得る。（例えば、　Ｍ、
５ｃｈｒｅｉｅｒら、　　ｒＨｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ」、　　１９８０年；　Ｈａｍｍｅｒ
ｌｉｎｇら、　　’Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ　Ａｎｄ　Ｔ−ｃｅｌｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍ
ａｓ　　、　　１９８１年；にｅｎｎｅｔｔ　ら、　　
”ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”、　１
９８０年；米国特許第４．３４１．７６１号。

第４．３９９．１２１号、第４．４２７．７８３号、第
４．４４４．８８７号、　４，４５１，５７０号、第４
．４６６、９１７号、第４．４７２．５００号、第４．
４９１．６３２号、第４．４９３．８９０号参照）。

ＢＭＰペプチドに対して作製されたモノクローナル抗体
のパネルは種々の特性、すなわちアイソタイプ、エピト
ープ、親和性などについてスクリーニングされ得る。特
に重要なのは、　ＥＩＭＰの活性を中和するモノクロー
ナル抗体である。このようなモノクローナル抗体は、　
ＢＭＰ活性アッセイにおいて容易に同定され得る。親和
性の高い抗体は、天然もしくは組換えＢＭＰの免疫アフ
ィニティー精製においても有用である。

本文中に記載のＢＭＰ形態に対する抗体（ポリクローナ
ルおよびモノクローナルの両方）は、骨粗しよう症、変
形性関節症などのような骨の疾病の各種の臨床上の病状
を抑制もしくは回復させるのに用いることができる。ひ
とつの治療法は、患者を９通常の静脈内経路を通して有
効投与量の抗ＢＭＰ抗体を投与することにより治療する
ことであろう。

ＢＭＰの変異タンパクのようなりＭＰの拮抗体もしくは
作動体も抗体の代わりに用いることができる。

これらの抗ＢＭＰ組成物はまた。各種の形態の腫瘍を検
出もしくは阻害するのに有用であり得る。その理由はい
くつかの腫瘍が成長因子によって誘発されることが知ら
れているからである。

適切な治療計画（すなわち投与量、投与頻度。

全身投与または局所投与など）の決定は、当該技術分野
の範囲内である。投与するために、抗体を。

医薬的に許容される非経口溶剤と共に単位投与量の注射
形態（溶液、懸濁液、乳濁など）として処方する。この
ような溶剤は１通常無毒性でかつ非治療性である。この
ような溶剤の例は、水、生理食塩水、リンガ−液、ブド
ウ糖溶液およびハンクス液である。固定油やオレイン酸
エチルのような非水溶性溶剤も使用され得る。好ましい
溶剤は。

ヒトアルブミンの５　ｗ／ｗ％生理食塩水溶液である。

溶剤は１等張性と化学的安定性を高める物質１例えば緩
衝剤と保存剤のような添加物を少量含有していてもよい
。抗体は、一般に、このような溶剤中に、約１μｇ／ｍ
ｊ！〜１０ｍｇ／−の濃度で処方される。

抗ＢＭＰ抗体はまた９診断用途にも有用である。

本発明は、ヒト（もしくは他の哺乳類）由来のサンプル
を得、　ＢＭＰの量をアッセイにおいて定量的に測定す
る方法、特に診断方法を考慮している。

例えば、定量的免疫学的検定法において用いたＢＭＰ抗
体は、　ＢＭＰ中の遺伝子的な欠損を検出するのに利用
されつる。ＢＭＰに対して特異的な抗体は、従来のどの
ような免疫学的検定形式（例えば、同種または異種の放
射性免疫測定法もしくはＢＬＩＳＡ）にも処方され得る
。種々の形式が当業者には周知である（例えば、　”Ｉ
ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　八Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉ
ｄｅ”Ｄ、　Ｗ、　ＣｈａｎとＭ、Ｔ、Ｐｅｒｌｓｔｅ
ｉｎ編集、　１９８７年参照）。

この開示内容は参照として本文中に包含される。

一般に９組換え体−ＢＭＰの産生によって、夾雑タンパ
クを実質的に含有しないポリペプチドからなる組成物を
提供できる。高レベルの純度を得る能力は、インビボで
の超厚に比べて相当量のＢＭＰを産生できる組換え体の
発現系の成果である。したがって１組換え体培養物に従
来の手法を適用することにより、骨超厚から得られる組
成物よりも実質的に純度の高いＢＭＰ組成物が得られる
。

精製されたＢＭＰは、軟骨もしくは骨の成長阻害因子の
設計およびスクリーンニングの道具として特に有用であ
ろう。まず第一に、ミリグラム量の物質が９本発明に従
って得られる。ミリグラム量によって、Ｘ線解析とコン
ピュータ分析を用いた三次元的な研究を行うための結晶
化が可能となる。

これは９分子の形態に関する演鐸を可能にし、従って、
　ＢＭＰが通常示す活性の阻害因子として有用な物質に
対する適正な形態が定義できるであろう。

一般に、拮抗物質は、ペプチドであり、そのペプチドの
活性が阻害されるポリペプチドとの相互作用は、そのペ
プチド結合に関与する「残基」を修飾して、安定化する
。この「残基」は、酵素、受容体もしくは補助因子（例
えばＢＭＰの場合の骨誘導関連因子）と特異的に相互作
用するペプチドの性能を強化するようにペプチド結合に
関与する。

したがって、そのペプチド結合は、特異的に選択された
カルボン酸とアミン（必ずしもアミノ酸ではない）とを
結合する。これらのペプチドは、目標の標的の形態を相
補する三次元配列の形態をもっている。類似の鍵と錠孔
の空間配置は１本発明のＢＭＰの表面外形に相補的に設
計された分子からも生じ得る。「表面」が内側に面した
渦巻き（ｃａｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）を有し、特異的に活
性部位を含んでいることは、理解されてい　る。さらに
、「相補的」という用語は、「適合する」空間形態に加
えて。

タンパクと、その表面外形と一致する分子との相互作用
が吸引的でかつ積極的であることを意味すると理解され
ている。これらの相互作用は、水素結合、イオン的親和
性もしくは疎水的親和性であってもよい。

したがって１本発明は１組換えＢＭＰの表面の三次元外
形に相補的な三次元外形によって特徴づけられる。　Ｂ
ＭＰに対するペプチドの拮抗物質および作動物質（２−
１５アミノ酸）を考慮している。これに関連して、ペプ
チドは、拮抗物質もしくは作動物質が、カルボン酸アミ
ド結合を有することを意味する。このカルボン酸とアミ
ンの関与物質はαアミノ酸でなくてもよい。

第二に、三次元構造の決定の助けを得なくても。

本発明の精製ＢＭＰは、評価への特別なアプローチとし
てインビトロでＢＭＰ阻害因子をスクリーニングする試
薬として有用である。現在人手できる未精製のＢＭＰ製
剤は、不純物に起因する。混乱したデータを生じる。例
えば、それら自体が、　ＢＭＰにとって、阻害因子、活
性化物質、または基質となる汚染物は、評価に干渉する
可能性がある。したがって、精製ＢＭＰタンパクを利用
することによりＢＭＰの作動物質と捨孔物質に対する現
在のスクリーング手法に実質的な改良がもたらされるで
あろう。

（以下余白） 本発明は、哺乳類ＢＭＰおよびその類似体のアミノ酸配
列を含有するポリペプチドをコードする。

イントロンを含まないＤＮＡ配列またはその補体を包含
する。

好適な実施態様においては、上記ＤＮＡは、ヒトまたは
ウシＢＭＰをコードする。

上記ポリペプチドは、哺乳類ＢＭＰシグナル配列を含有
し、もしくは含有しない。

好適な実施態様においては、上記ポリペプチドは、宿主
酵母における分泌を提供するＮ末端酵母α因子シグナル
配列を更に含有する。

本発明は、上記ＤＮＡ配列を有するレプリコンを包含す
る。

本発明は、上記ＤＮＡ配列を有するベクターを包含する
。

本発明は、上記レプリコンを有する細胞を包含する。

本発明は、上記ベクターを有する細胞を包含する。

本発明は、以下の工程を包含する組換え体哺乳類ＢＭＰ
またはその類似体を調製する方法を包含する： （ａ）非相同のＤＮＡ配列を有する細胞集団を提供する
工程、ここで、該ＤＮＡ配列はくり該細胞内で機能する
転写および翻訳制御配列、および（Ｉ　Ｉ）哺乳類ＢＭ
Ｐおよびその類似体を包含するポリペプチドをコードし
、該転写および翻訳制御配列の制御下にあるコード配列
を有する；および （ｂ）該ポリペプチドを発現するための条件下で該細胞
集団を増殖させること。

好適な実施態様においては、上記ポリペプチドは、更に
、該ポリペプチドのＮ末端にシグナル配列をコードする
配列を有し、そして該ポリペプチドが前記細胞から分泌
される。

本発明の骨増殖誘導方法は、骨組織を、有効量の、＃４
乳類ＢＭＰ組成物またはその活性類似体組成物と接触さ
せる工程を包含する。

本発明は、＠乳類骨形態形酸タンパクに対するモノクロ
ナール抗体を包含する。

本発明の記述および開示が２本発明の精神および範囲内
にある本発明のすべての変更および改変を包含すること
を意図していることは理解されるであろう。分子のカル
シウム沈着および骨成長誘導活性に実質的な影響を及ぼ
さずに、ＢＭＰのアミノ酸配列内にアミノ酸を挿入、欠
失あるいは置換することは当該技術の知識の範囲内であ
る。従って２本発明は、そのような欠失、付加あるいは
置換を包含する。更に、当業者がこのような修飾タンパ
クを組換えによって生成し得ることは理解されている。

（実施例） 以下に実施例を説明するが９本発明を制限するものでは
ない。

ユリストら（Ｕｒｉｓｔ、　ｅｔ　ａｌ）、　　Ｐｒｏ
ｃ、　　Ｎａｔ。

Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、　　８１巻、　　
３７１−３７５頁、　　１９８４年、が述べているよう
に、ヒト（ｉ７ＫＤ）およびウシ（ｉ９ＫＤ）起源由来
の部分精製した。ここで問題とするＢＭＰタンパクを、
予備的ゲル電気泳動および電気溶出（Ｍ、　Ｗ、　　バ
ンカピラー　Ｅ、ルジャン、Ｆ、オストランダー、およ
びり、　　Ｅ、　　フード（Ｍ、ｌｌ’、　Ｈｕｎｋａ
ｐｉｌｌｅｒ、　Ｅ、　Ｌｕｊａｎ、　Ｆ、　０ｓｔｒ
ａｎｄｅｒａｎｄ　Ｌ、Ｅ、　Ｈｏｏｄ）　、　Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ＋ｍｏｌｏｇｙ、　９１巻：
　２２７−２３６頁、　　１９８３年）によってさらに
精製し。

均質にした。この精製により、最初の部分精製サンプル
が、１９ＫＤのＢＭＰに加えて、３４ＫＤ。

２２ＫＤ、１４ＫＤおよび６ＫＤの他の哺乳類タンパク
を含むことが示された。アセトンで沈降さｆ　（Ｗ、Ｈ
，コニグスバーグおよびり、ヘンダーソン（Ｗ、Ｈ，Ｋ
ｏｎｉｇｓｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｌ、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ
）　ｒ　　Ｍｅｔｈｏｄｓｆｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
、　９１巻：　２５４−２５９頁、　　１９８３年）。

アミノ酸分析によって定量［Ｂ、Ａ、　　ピドリングマ
イヤー、　　Ｓ、　　Ａ、　　コーエンおよびＴ、　　
Ｌ、　　タービン（Ｂ、Ａ、Ｂｉｄｌｉｎｇｍｅｙｅｒ
、　Ｓ、Ａ、Ｃｏｈｅｎ　ａｎｄ　Ｔ、Ｌ、Ｔａｒｗｉ
ｎ）、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ
ａｐｈｙ、　３３６巻：９３−１０４頁、　　１９８４
年コした後、該物質を変性条件下で。

２−メルカプトエタノールで還元し、システィン残基を
４−ビニル−ピリジンで誘導体化した［Ｍ。

フリドーマン、　　Ｌ、　　Ｇ、　　クラルおよびＪ、
　　Ｆ、ケイビンス（Ｍ、Ｐｒｉｅｄｍａｎ、　Ｌ、Ｇ
、Ｋｒｕｌｌ　ａｎｄ　Ｊ、Ｆ、Ｃａｖｉｎｓ）、　Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ、　２４５巻＝３８６８−３８７１頁１９７
０年］。充分に透析することによって変性物を除去した
後、アミノ酸分析を反復してタンパク回収率を評価した
。該タンパクを２Ｍ尿素の存在下にＴＰＣＫ−）リブシ
ンで消化し。

配列分析に適したブロックされていないペプチド断片を
生成させた［Ｇ、　　アレン（Ｇ、Ａ１１ｅｎ）、　　
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎ
ｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、　　５１−６２頁、　　１９８
１年、　　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａ
ｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、オラン
ダ、アムステルダム］。消化産物を。

トリフルオロ酢酸水溶液中アセトニトリルあるいはアセ
トニトリル／イソプロパツール勾配を用いて、逆相高速
液体クロマトグラフィーにより分析した［Ｊ、　　Ｅ、
　　シバリー（Ｊ、Ｅ、５ｈｌｖｅｌｙ）、　Ｍｅｔｈ
ｏｄｓｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍｉｃｒｏｃｈａｒａｃ
ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ、　　４１−８７頁。

１９８６年、　　Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ、　　二ニ
ーシャーシー州りリフトン］。アプライド・バイオシス
テムズ４７０Ａタンパクシーケンサ−を用いてペプチド
画分を自動エドマン分解に付した［Ｍ、　　Ｗ、　　バ
ンカピラＲ，Ｗ、　　へヴイック、　　Ｗ、　　Ｊ、　
　ドレイヤーおよびり、　　Ｅ、　　フード（Ｍ、Ｗ、
Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、Ｒ，Ｍ、Ｈｅｖｉｃｋ、　Ｗ
、Ｊ、Ｄｒｅｙｅｒ　ａｎｄ　Ｌ、Ｅ、Ｈｏｏｄ）　、
　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｌｎ　Ｅｎｚｙ＋＊ｏｌｏｇｙ、
　９１巻：　３９９−４１３頁１９８３年］。フェニル
チオヒダントインアミノ酸誘導体を、アプライド。

バイオシステムズ１２０Ａ　　ＰＴＨ分析器でクロマト
グラフィーにかけて同定した［Ｍ、　　Ｗ、　　バンカ
ピラー（Ｍ、Ｗ、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ）、　Ａｐｐ
ｌｉｅｄ　Ｂｌｏｓｙｓｔｅ＋ｎＳ、ユーザー会報第１
４号、１９８５年、　　　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅ＋ｏｓ、カリフォルニア州フォスター・シティ］
。

９　　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　
Ｃｏ１１ｅｃｔｆｏｎから得られたヒト胎児の肝臓細胞
系２９３　（ＡＴＣＣＮｏ、　ＣＲＬ　１５７３）を、
１０％の子ウシ胎児血清、１００Ｕ　／　ｍ　１のペニ
シリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン
を含むダルベツコ変性イーグル培地中で、３７・Ｃで５
％のＣＯ２の雰囲気下で培養した。

立上ノ」υ１薩　ＲＮＡを、子ウシの肝臓（ＪＲ５ｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃ、　　カリフォルニア州ウッドランドよ
り入手）からチオシアン酸グアニジン／　Ｃｓ　Ｃｌ　
法によって単離した［マニアティん　Ｔ、フリッチ、Ｅ
。

Ｆ、およびサムプルツク、　　Ｊ、　　ＣＭａｎｉａｔ
ｉｓ、　Ｔ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、　ａｎｄ　Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、）　、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ　：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎ
ｕａｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｆｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ
ａｂ、、　ニューヨーク州コールドスプリングハーバ−
１９８２年；フリーマン、　　Ｇ、　　Ｊ、、クレイバ
ーｉｆ　−、ｃ、　　、デクリニイフ、Ｒ０ローゼンプ
ラム、　　Ｄ、　　Ｓ、　　およびカンタ−、Ｈ，（Ｆ
ｒｅｅＩｌａｎ、　　Ｇ、Ｊ、、Ｃｌａｙｂｅｒｇｅｒ
、Ｃ，、ＤｅＫｒｕｙｆｆ、Ｒ，、Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ
。

Ｄ、Ｓ、、ａｎｄ　Ｃａｎｔｏｒ、Ｈ，）　、　　Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

：ＵＳＡ、　８０巻：　４０９４−４０９８頁１９８３
年］。オリゴ（ｄ　Ｔ）−セルロースで１回分画するこ
とにより、ポリ（Ａ）”ＲＮＡを精製した（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ、　Ｔ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ。

Ｅ、Ｆ、　　ａｎｄ　　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　　Ｊ、　
　（ｉ９８２）　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｃ
ｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、、　Ｃ
ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。

オリゴヌクレオチドのＡ　　オリゴヌクレオチドアダプ
ター、ブライマー、およびプローブは、アプライド・バ
イオシステムズ（カリフォルニア州フォスターシティ−
）モデル３８０Ａシンセサイザーを用いたホスホアミダ
イト法によって合成し。

ポリアクリルミドゲル電気泳動にかけて精製して。

ウォーターズ５ＥＰ−ＰＡＫ　（Ｃ１ｓ）カートリッジ
で脱塩した。

（ａ）アダプター：１４−ｍｅｒオリゴヌクレオチド（
５’　ＣＣＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＣＧ３°）および１８
−ｍｅｒオリゴヌクレオチド（５°ＡＡＴＴＣＧＧＡＧ
ＡＴＣＴＡＣＡＧＧ３゜）を合成し、λＺＡＰＩ＋中で
構築されたｃＤＮＡライブラリー用のＥｃｏＲ１アダプ
ターとして使用した。

１４−ｍｅｒをリン酸化しくマニアティん　Ｔ。

フリッチ、　　Ｅ、　　Ｆ、およびサムプルツク、Ｊ。

１９８２年（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、　Ｆｒ１ｔｓｃ
ｈ、　Ｅ、Ｆ、　ａｎｄ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、、
１９８２年）、　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ）、二ニーヨーク州コールドスプ
リングハーバ−）、その後１５分間９５・Ｃに加熱して
ポリヌクレオチドキナーゼを不活性化し２次に１８−ｍ
ｅｒとアニーリングした。これらの非対称リン酸化アダ
プターは、内部に、　　Ｂｇｌｌ＋制限酵素部位も含ん
でいた。

（ｂ）ＰＣＲプライＴ−：　２つの４７−ｍｅｒオリゴ
ヌクレオチドは、肝臓細胞系２９３ｍＲＮＡから得たヒ
トＢＭＰ　　ｃＤＮＡの完全なコード領域のＰＣＲ増幅
のために合成され１次いでλＺＡｐＨにクローン化され
た。　５゛センスブライマー（５°ＴＣＣＧＧＡＣＴＣ
ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡＣＡＡＴＣＡＴＧＡＴＴＴＣ
ＣＡＧＡＡＴＧＧＡＧＡＡＧ３°）および３°アンチセ
ンスプライマー（５°ＧＡＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＧ
ＴＣＧＡＣＡＣＣＴＣＡＡＧＧＣＣＧＴＴＡＣＴＣＡＡ
ＡＧＴＣＡＧＴ３°）は、各々、ヒトの遺伝子エクソン
１および７に基づいている。この２つのプライマーは。

いくつかの制限酵素部位を含む５′延長部分（アダプタ
ー）を有する。

２セツトの追加ＰＣＲＣラブライマーダプターを合成し
、ウシおよびヒトＢＭＰ　　ｃＤＮＡクローン（成熟タ
ンパクのみをコードする）を増幅させ１次いで酵母α−
因子リーダー配列を含むプラスミド、ｐＡＢ１２５にク
ローン化した。ヒトＢＭＰ　　ｃＤＮＡの５°センスブ
ライｖ　−（４２−ｍｅｒ）（５°ＡＣＴＡＣＴＧＧＴ
ＣＴＡＧＡＴＡＡＡＡＧＡＴＴＣＣＣＡＧＴＧＴＡＣＧ
ＡＣＴＡＣＧＡＴ３°）およびウシＢＭＰ　　ｃＤＮＡ
の５′センスブライマー（４１−ｍａｒ）　　（Ｓ°Ｇ
ＧＡＡＣＣＣＴＣＴＣＴＡＧＡＴＡＡＡＡＧＡＴＴＣＣ
ＣＧＧＴＧＴＡＴＧＡＣＴＡＴＧ３’　）は、　　Ｘｂ
ａ１部位を有し、ＰＣＲで増幅されたｃＤＮＡのα因子
リーダー配列への連結を容易にする。ヒトＢＭＰ　　ｃ
ＤＮＡの３°アンチセンスブライ７−（３７−ｍａｒ）
　　（５°ＴＣＴＴＡＣＣＴＧＴＣＧＡＣＴＡＴＴＡＣ
ＴＣＡＡＡＧＴＣＡＧＴＡＴＴＴＡＴ３°）およびウシ
ＢＭＰ　　ｃＤＮＡの３°アンチセンスブライマー（４
１−＋ｅｅｒ）　　（５°ＡＡＴＧＧＣＣＧＴＣＧＡＣ
ＴＡＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＡＣＴＣ
ＴＴＧ３°）は、終止コドンのすぐあとに５ａ１１部位
を有する。

（Ｃ）プローブ：ウシＢＭＰのトリプシンペプチド配列
に基づいたオリゴヌクレオチドプローブを、ウシゲノム
ライブラリー（プローブＡ−Ｄ）のスクリーニングのた
めに合成した。第１図にこれを示す。実際のプローブは
、示される配列に相補的である。４つの追加ＢＭＰ　）
リブシンペプチドの配列を決定しくＥ−Ｈ）、　　第１
図にこれを示す。いくつかのコドンと共に、２つのヌク
レオチドが変性した位置に含まれ、正確な推測の可能性
を高めている。セリン残基において、各々のプローブに
対する２つの異なるオリゴヌクレオチド（セリンコドン
においてのみ異なる）を、セリンコドンが変性されてい
るという唯一の特性のために。

合成しなければならなかった。

ウシＢＭＰエクンン３配列に基づいた。２つの部分的に
オーバーラツプした５０−ｍａｒオリゴヌクレオチドを
、子ウシの肝臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｐｒｏｂｅ　Ｉ
）をスクリーニングするために９合成した。これを第２
図ａ（下線部）に示す。４つのオリゴヌクレオチドプロ
ーブを、ヒトＢＭＰ遺伝子のエクソン１．　５．　６．
　　および７を同定するために合成した（表１参照）。

プローブＢＭＰ　１０３（５°ＣＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡ
ＴＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＡＡＴＡＴＣＡＣＣＡＡＣＡＴ
ＣＴＴＣＡＴＣＧＣＣＡＴＣＴＴＣＴＣＣＡＴ３°）は
、ウシＢＭＰエクソン１コード配列に相補的な５７−ｍ
ｅｒである。プローブＢ　Ｍ　Ｐ　１０４　（５’ＴＣ
ＡＣＴＣＡＡＡＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＡＣＴＣＴＴＧＣ
ＴＣＴＧＧＧＣＣＡＣＧＧＧＴＴＣＧＡＧＴＡＣＣＴＴ
ＣＴＡＴＴ３”）もまた。

ウシＢＭＰエクソン７コード配列に相補的な５７−ｍｅ
ｒである。ＢＭＰＩ　ｌ　６　（５°ＧＡＧＡＣＣＡＡ
ＡＴＡＧＡＴＡＡＴＴＧＴＴＴＣＴＣＣＡＴＴＴＡＴＧ
ＡＧＡＴＣＣ３°）は、ヒトＢＭＰエクソン５コード配
列に相補的な３９−ｍｅｒである。　　ＢＭＰＩ　　１
　７　　（５°ＣＡＡＧＴＧＡＣＣＧＡＴＣＡＴＡＡＡ
ＡＴＴＧＴＴＣＡＣＴＴＡＴＧＧＡＣＴＣＧＴＣＴＧＡ
ＡＡＴＧＡＧＡ３’　）は、　ヒトＢＭＰエクソン６コ
ード配列に相補的な５１−ｍｅｒである。ヒトＢＭＰエ
クソン３コード配列（プローブＪ）に相補的な２６−ｍ
ｅｒオリゴヌクレオチド（５°ＴＡＧＴＣＣＣＴＣＴＧ
ＧＡＡＧＧＣＡＣＡＴＧＴＡＧＣ３°）を、ヒトＢＭＰ
／ＰＣＲｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするた
めに合成した。

！ ｃＤＮＡライブラリーの　　＝　（ａ）子ウシの肝１１
ａｃＤＮＡライブラリー　オカヤマおよびバーブ（Ｏｋ
ａｙａｍａ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｂｅｒｇ、　Ｐ、　Ｍａｒ
ａｃ、　ａｎｄ　Ｃｅｌ　１．　Ｂｉｏｌ、　３巻：　
４０９４−４０９８頁、　　１９８３年）と同様の条件
を用いて子ウシの肝臓ポリ（Ａ）”ＲＮＡから第１Ｊ［
ｃＤＮＡを合成した。５ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７゜５
）２０μｌ中のポリ（Ａ）”ＲＮＡ約５μｇを３分間６
５’Ｃに加熱し、その後氷水上で急冷し、ただちに室温
で、５０ｍＭトリス−塩酸（４２°ＣでｐＨ８，３）：
　８ｍＭ　　ＭｇＣ１２Ｂ　３０ｍＭ　　ＫＣｌ；１０
ｍＭジチオスレイトール；ｄＡＴＰ。

ｄＧＴＰ、（ＩＴＴＰおよび〔α−３２Ｐ）ｄＣＴＰ（
約３００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）各２ｍＭ：６０単位のＲＮ
ａｓｌｎ、　　および２．５ｇｇのオリゴ（ｄＴ）　１
２−１１　（総容量４０ｍ１）を含むように調整した。

クローニングしたモロニーマウス白血病ウィルス逆転写
酵素５０−６０単位を添加して反応を開始させ、４２’
Ｃで６０分間継続させた。二次ＣＤＮＡ鎖を、アルフォ
およびシード（Ａｒｕｆｆｏ、Ａ、ａｎｄ　５ｅｅｄ、
Ｂ、、　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ：Ｕ
ＳＡ　７４巻：８５７３−８５７７頁、　　１９８７年
）により修正されたガブラーおよびホフマン（Ｇｕｂｌ
ｅｒ、　Ｕ、ａｎｄ　Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｂ、Ｊ、、　Ｇ
ｅｎｅ２５巻：２６３−２６９頁、　　１９８３年）の
方法によって合成した。次いで、アルフォおよびシード
前出が述べているように、ｄｓ　　ｃＤＮＡを非対称（
ヘミ）リン酸化ＥｃｏＲＩアダプター（オリゴヌクレオ
チド合成の項参照）に連結し、Ｔａポリヌクレオチドキ
ナーゼでリン酸化して（マニアティスら、前出）。

０．５Ｍ　　ＮａＣ１，２５ｍＭ　　ＥＤＴＡとなるよ
うに調整し、７５・Ｃで１５分間加熱してポリヌクレオ
チドキナーゼを不活性化した。ｄｓ　　ｃＤＮＡを、バ
イオゲルＡ−１５ｍを用いたクロマトグラフィーにかけ
て、連結していないアダプターから分離し、エタノール
沈殿によって回収した。ＣＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼ
（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を用い、
供給者が指示している方法により。

ＥｃｏＲＩ−切断λＺＡＰＩＩ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）に連結した。但し、フェイファーおよびチンマーマ
ン（Ｐｈｅｉｆｆｅｒ。

Ｂ、Ｈ，ａｎｄ　Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ、Ｓ、Ｂ、、Ｎｕ
ｃｌ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、１１巻＝７８５３−７８７
１頁、　　１９８３年）が述べた修正に従い、１５％ポ
リエチｌ／ングリコール（ＰＥＧ）　８０００　（Ｓｉ
ｇｍａ）を含有させた。連結したＤＮＡを遠心分離（ｉ
２，０００ｘｇ）によって回収し、クロロホルムで洗浄
しＣ乾燥し、水４μｌ中に再懸濁して、インビトロパッ
ケージング抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と共に、供
給者の指示に従って、インキ１ベートした。組換えファ
ージをイー・コリ　ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ　（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎａ）中で増殖させた。　　（ｂ）ＢＭＰでプライ
ムされたＰＣＲによって増幅された（ＢＭＰ／ＰＣＲ）
ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ
キットの供給者、パーキン、エルマー、およびシータス
（Ｐｅｒｋｉｎ／Ｅｌｓ＋ｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）によって
説明されるように行った。配列が、ヒトＢＭＰ遺伝子の
エクソン１（センスブライマー）およびエクソン７（ア
ンチセンスプライマー）由来であり、クローンに適する
制限部位アダプターを含む、２つの合成４７−ｍｅｒオ
リゴヌクレオチドプライマーを、各々ｌμＭの最終濃度
で使用した。ＰＣＲブライマーは、ｈＢＭＰ　　ｍＲＮ
Ａの完全なコード領域に隣接する。テンプレートｃＤＮ
Ａを、２．５μｇのヒト腎臓胚細胞系２９３ポリ（Ａ）
”ＲＮＡから合成した。ｃＤＮＡ合成の条件は９反応容
量が２０μｍであったこと以外は上記（パートＡ）と同
一であった。ｃＤＮＡを、　　Ｂ（ｏｇｅｌ　Ａ−１５
ｍで上記のように分画し、エタノール沈殿によって回収
し、１００μｌの滅菌水で再懸濁した。１−１０μｌの
ｃＤＮＡテンプレートを、各ＰＣＲ反応に使用した。４
０サイクルのＰＣＲが、パーキン／エルマー／シーラス
（Ｐｅｒｋｉｎ／Ｅ１ｗ＋ｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）　ＤＮＡ
熱循環器（ＤＮＡ　ｔｈｅｒ＋ｅａｌ　ｃｙｃｌｅｒ）
によって行われた。各サイクルは、９４・Ｃで１分間の
変性工程。

５５°Ｃで２分間のア二一リング工程、および７２・Ｃ
で３分間の鎖延長工程から構成された。４０番目サイク
ルで鎖延長工程は、３分ではなく、１５分であった。サ
ンプルを、フェノール／クロロホルム／　Ｉ　Ａ　Ａ　
（ｉ：ｌ：０．０４）で−度抽出し、クロロホルム／　
Ｉ　ＡＡ　（２４：１）で−度抽出し、エタノール沈殿
により回収し、　　ＥｃｏＲＩで消化し、そして、７％
のアクリルアミド、１ｘＴＢＥゲル上で、電気泳動によ
り分画した。４００−８００　　ｂ、ｐ。

の間に移動するＤＮＡをゲルから切り出し、エル−チッ
プ−ｄカラムを通過さびることによって精製し、　　Ｅ
ｃｏ−Ｒ１断片λＺＡＰ　Ｉ　１に連結し、上記（パー
トＡ）のようにパッケージし、増殖させた。

ライブラ　−のスフ　−ニング：　（ａ）ウシゲノムラ
イブラリー。ウシゲノムライブラリー（Ｃ１ｏｎｔｅｃ
ｈ）由来のイー・コリ　ＬＥ３９２中の約１０６の組換
えファージをプレートしく２０，０００フア一ジ／直径
１３７ｍｍプレート）、３７−Ｃで５−６時間増殖させ
た。ファージを、ニトロセルロースフィルター（Ｍｉｌ
ｌｉｐｏｒｅ、　ＨＡＴＦ１３７）に移して、ベントン
およびデービス（Ｂｅｎｔｏｎ　　ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ
）　　（８）に従って処理し、プローブＡでスクリーニ
ングした（第１図）。このプローブをＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼおよび（δ３２−Ｐ）　ＡＴＰ（ｉ）で末
端標識し。

比活性を１−２ｘｌＯ”ｃｐｍ／μｇとした。フィルタ
ーを、５ｘＳＳＣ（ｉｘＳＳＣ＝Ｏ１１５Ｍ塩化ナトリ
ウム１０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム。

ｐＨ７）、５ｘデンノ翫−ト液（ｌｘデンノ１−ト液＝
０．０２％ポリビニルピロリドン７０．０２％フィコー
ル７０．０２％ウシ血清アルブミン）、１０％硫酸デキ
ストラン、５０ｍＭリン酸ナトリウム。

ｐＨ６，８，１ｍＭピロリン酸ナトリウム、０．１％Ｎ
ａＤｏｄＳＯ４および５０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮ
Ａにて、３７・Ｃで１−２時間ブレノ１イブリダイズさ
せた。標識したプローブを１０’ｃｐｍ／ｍｌの濃度で
添加し、穏やかに揺り動かしなから３７・Ｃで一晩ハイ
ブリダイザーシ謬ンを継続させた。

フィルターを２ｘＳＳＣ，０，１％ＮａＤＯｄＳＯａ中
５５・Ｃで洗浄し、デュポン・ライトニングプラス強力
スクリーン（Ｄｕｐｏｎｔ　　Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ　　
Ｐｌｕｓ　ｉｎｔｅｎｓｉｆｙｉｎｇ　５ｃｒｅｅｎ）
により、−８０・Ｃで一晩コダ・ツクＸＡＲ−２フィル
ムに露光させた。現像した後。

プローブは、　　０．１ｘＳＳＣ，０，１％ＮａＤｏｄ
ＳＯ４中。

６５°Ｃで洗浄することによって、フィルターより取す
除かれた。次いで、１セツトのフィルターを。

プローブＢ（第１図）と７１イブリダイズさせ、洗浄し
、上記のように露光した。プローブＡおよびＢによりシ
グナルを与えるプラーク領域を、拾い上げ、再びプレー
トし、ニトロセルロースに移しく検体数４）、ウー（Ｗ
ｏｏ）　　（２１）に従って増幅し、プローブＡ−Ｄ　
（第１Ｅ）（ｉフィルター当り、１プローブ）でスクリ
ーニングした。上記のように、フィルターを、洗浄し、
フィルムに露光した。４つのプローブのうち、３つ（Ａ
−Ｃ）のプローブでシグナルを与えるプラークを、再び
プレートし、スクリーニングすることによって精製した
。

（ｂ）子ウシゲノムライブラリー。イー・コリＸＬＩ−
ｂｌｕｅ中の約１９２，０００の組換えファージをプレ
ートしく１６，０００フア一ジ／直径１３７ｍｍプレー
ト）、上記のように処理し、イー・コリプローブ！　（
第２図ａ）でスクリーニングした。プローブは、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ　（クレノー断片）および（α３２−Ｐ
）　−ｄ　　ＣＴＰ　（９）で標識し、比活性２ｘｌＯ
”ｃｐｍ／μｇとした。

フィルターを、以下の変更を加えたこと以外、上記（ａ
）と同様にしてスクリーニングした。（ｉ）ハイブリダ
イゼータ５ン溶液は４０％のホルムアミドを含有した。

および（２）フィルターは、２ｘＳＳＣ，０，１％Ｎａ
ＤｏｄＳＯ４中６５°Ｃで洗浄した。

（Ｃ）ヒトゲノムライブラリー。イー・コリＬＥ３９２
中のヒトゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
由来の約１０６組換えファージをプレートしく５０゜０
００フアージ／プレート）　、　　ｂ　ＢＭＰ　　ｃ　
ＤＮＡ＃１　（第３図）の７ｓｏｂｐ　　ＢｇｌＩＩ挿
入物で処理し、スクリーニングした。プローブを標識し
く９）、フィルターを上記のようにハイブリダイズした
（子ウシ肝臓ｃ　ＤＮＡライブラリー参照）。フ４ル９
−ヲ、　　２ｘＳＳＣ，０，１％ＮａＤ。

ｄｓＯ４中、６０°Ｃで洗浄した。陽性のプラークを再
びプレートし、モして再スクリーニングすることによっ
て精製した。

（ｄ）（ＢＭＰ／ＰＣＲ）ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリ
ー　イー・コリＸＬＩ　Ｂｌｕｅ中の約１０００の組換
えファージをプレートシ（直径５００ｍｍプレート）、
処理し、プローブＪ（第４図す、下線）でハイブリダイ
ズし、　（ａ）のように洗浄した。陽性プラークを、再
プレートシ、モして再スクリーニングすることによって
精製した。

サブクローニング　　　　　および プラスミドＤＮＡは、アルカリ分解法、　（マニアティ
ス、前出）によって単離され、λＤＮＡは。

ジョーンズおよびロールズ（Ｊｏｎｅｓ、に、Ｗ、　ａ
ｎｄ　Ｒａｖｌｓ、　Ｊ、Ｍ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１２
０巻ニア３３−７４２頁、　　１９８８年）により説明
されるファージミニ調製法（ａ　ｐｈａｇｅｍｔｎｉｐ
ｒｅｐ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）によって単離された。

ＢＭＰ　　ｃＤＮＡを含有するブルースクリプト５Ｋ（
−）プラスミドを、供給者（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が
述べているＭ１３解放／切除（ｒｅｓｃｕｅ／ｅｘｃｉ
ｓｉｏｎ）プロトコールにより、λＺＡＰから放出させ
た。ＢＭＰ遺伝子断片を、　　５ａｉｌまたは他の適切
な制限酵素による消化（第２図および第１表参照）によ
り。

ＥＭＢＬ３　　λベクターから放出させた。ＢＭＰｃＤ
ＮＡ挿入物を、　　Ｂｇｌ［Ｉ　（ｂＢＭＰ　ｃＤＮＡ
）またはＢａｍＨ１／旧ｎｄｌｌｌ　（ｈＢＭＰ　ｃＤ
ＮＡ）消化により、ブルースクリプトＳＫ　（−）ベク
ターから切り出した。ＤＮＡ断片を、ポリアクリルアミ
ドまたはアガロースゲル電気泳動（マニアティスら、前
出）およびエル−チップ−ｄカラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈ
ｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ）を通過させることによ
って精製して、　　ｐＵＣ１９またはＭＩ３配列決定用
ベクター（ｓｅｑｕｅｎｃｌｎｇ　ｖｅｃｔｏｒ）　　
（ヤミフシューペロン、Ｃ０，ビエラ、Ｊ、およびメツ
シング、　　Ｊ、　　（Ｙａｍｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ
、　Ｃ，、Ｖｉｅｉｒａ。

Ｊ、　　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　　Ｊ、、　Ｇｅｎ
ｅ　３３巻、　　１０３−１１９頁。

１９８５年）にサブクローニングした。ＤＮＡ配列決定
は２Ｍ１３プライマーならびに特異的内部ブライマーを
使用して、ジデオキシ鎖終了法（サンガＦ、、ニックレ
ン、Ｓ、およびカウルソン。

Ａ、　Ｒ，）、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、ＵＳＡ、　７４巻：５４６３−６７頁、　　１９７
７年）により実施した。曖昧な領域は、７−ジアザ−２
−ブオキシグアニジンートリホスフエート（バー、　　
Ｐ、　　Ｊ、　　、セイヤー　ＲｌＭ、、レイブーン、
Ｐ、、ナシヤリアン、　　Ｒ，Ｃ，。

シープ、Ｆ、、およびトラン、　　Ｄ　（Ｂａｒｒ、　
Ｐ、Ｊ、。

Ｔｈａｙｅｒ、　Ｒ，Ｍ、、　Ｌａｙｂｏｕｒｎ、　　
Ｐ、、　Ｎａｊａｒｉａｎ、　Ｒ，Ｃ，。

５ｅｅｌａ、　Ｆ、、　　ａｎｄ　Ｔｏｌａｎ、　Ｄ、
）　、　　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４巻：　４２
８−３２頁、　　１９８６年）およびシーケナーゼ（Ｕ
。

Ｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて分析した。

ノーザンプロット　　　ポリ（Ａ）”ＲＮＡをホルムア
ルデヒドの存在下に１．４％アガロースゲル上で分画し
くレーラッシュ、　　Ｈ，、ダイアモンド。

Ｄ、　　ウィズニー　Ｊ、　　Ｍ、　　およびベトウカ
ーＨ，（Ｌｅｈｒａｃｈ、　　Ｈ，、Ｄｉａｍｏｎｄ、
　　Ｄ、、　　Ｗｏｚｎｅｙ、　　Ｊ、Ｍ。

ａｎｄ　Ｂｏｅｄｔｋｅｒ、　Ｈ，）　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　１６巻：　４７４３−５１頁、　　１９７
７年）、トーマス（Ｔｈｏｍａｓ、　Ｐ、、　Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７
巻：　５２０１−５頁、　　１９８０年）に従って直接
ニトロセルロースに移した。

フィルターをプローブＩまたはｂＢＭＰ　　ｃＤＮＡ４
ｔ　１でハイブリダイズし、上記セクションＢで、ライ
ブラリーをスクリーニングしたときに述べたように、洗
浄した。

サザンブロット　　　ゲノムプロット：　１０μｇのヒ
ト、ウシ、およびマウスゲノムＤＮＡ（Ｃ１ｏｎｔｅｃ
ｈ）を、　　ＥｃｏＲｌで消化し、０．７％アガロース
ゲル上で分画し、ニトロセルロースに移した（マニアテ
ィスら、前出）。ハイブリダイゼーションおよび洗浄は
、　「ノーザンプロット分析」で記述したものと同様で
あった。クローンおよびＰＣＲプロット：ゲノムクロー
ン、ｃＤＮＡクローンまたはＰＣＲ反応により得られた
ＤＮＡを、様々な制限酵素で消化し、１％のアガロース
ゲル上で分画シ、ニトロセルロースに移した（マニアナ
イスら、前出）。

皿 詳細を上記に述べたＰＣＲプライマーを使用して、ｐＡ
Ｂ１２５に直接インフレームクローニングするための、
Ｘｂａ　　１およびＳａｔ　　１制限部位を有するＤＮ
Ａ配列を生じさせた。上記ｐＡＢ１２５は、ＡＤＨ２／
ＧＡＰＤＨプロモーター（ｉ９８５年７月２９日出願で
、同時係属中の米国特許出願束７６０．１９７号に記載
）に融合しているα因子リーダー（ｉ９８４年８月２２
日発行のヨーロッパ特許公開第０１１６２０１号に記載
）配列を有するベクターである。生じたプロモーター／
リーダー／遺伝子カセットを、　　ＢａｍＨｌおよびＳ
ａｌ　１により切り出し、酵母発現ベクターｐＢｓ２４
．１．にクローン化した。プラスミドｐＢｓ２４．１は
、　１９８フ年１２月２４日出願の同時係属中の米国特
許出願束Ｈ８，８９４号に記載の誘導体である。ｐＢＳ
２４のＢａｍＨＩ−Ｓａｌ＋ベクター断片を、６５塩基
対のヒトベーシックＦＧＦＢａ＋ｉ旧−５ａｉｌ断片に
連結し、　　ｐＢｓ２４．１．を創製した。

この６５塩基対の断片は、　　ｐＢｓ２４．１に連結す
るＢａｍＨＩ−Ｓａｉ＋プロモーター／リーダー／ＢＭ
Ｐカセ・ノドに置き換えられ得る。得られたプラスミド
ｐＢＳ　２４ｂＢＭＰおよびｐＢＳ２４ｈＢＭＰを使用
して、酵母菌株ＡＢＩ　１０遺伝子型Ｍａｔａ、　　ｕ
ｒａ３−５２．１ｅｕ２−０４または１ｅｕ２−３およ
び１ｅｕ２−１１２の両方、　ｐｅｐ４−３．　　　ｈ
ｉｓ４−５８０゜ｃｉｒ’を、ロイシンを含まない合成
完全培地のようなロイシン選択培地［Ｆ、ジャーマン、
　　Ｇ、　　Ｒ。

フィフクおよびＪ、Ｂ、　　ヒックス（Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃｏ１ｄ　
Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ、　１９８６．　Ｆ、Ｓｈｅｒｍａｎ、　Ｇ、Ｒ，Ｆ
ｌｎｋ　ａｎｄ　Ｊ、Ｂ、　Ｈｉｃｋｓ］で、形質転換
した。発現の誘導のために、細胞を下記のウラシル欠損
培地で、４８時間増殖させた。

２０ｇ　　　　　　カザミノ酸 ５ｇ　　　　　硫酸アンモニウム １ｇ　　　　　リン酸カルシウム ０．５ｇ ０．１ｇ ０、　１　ｇ ０、　０４ １ ０、　０１ ０、０３ ０、　０３ ７０　　　　　　　ｍ 水を加えて９ 水を加えて１ ｇ ｇ ０ ０ 硫酸マグネシウム 塩化ナトリウム 塩化カルシウム 微量混合成分 ２％　モリブデン酸ナトリウム ビタミン混合物 パントテン酸塩 イノシトール ５０％　グルコース ｍｌとし、ｐＨを６．０とし。

Ｏｍｌとする。

微量混合成分 ｇ ０．４ｇ ｇ ｇ ｇ ｇ ｇ ホウ酸 硫酸第二銅 ヨウ化カリウム 塩化第二鉄 硫酸マンガン モリブデン酸ナトリウム 硫酸亜鉛 水を加えて１０１００Ｏとし、濾過により滅菌する。

ビタミン混合物 ３ｇ　　　　　ミオイノシトール ３ｇ　　　　　チアミン ３ｇ　　　　　ピリドキシン ３ｇ　　　　　パントテン酸カルシウム０．２ｇ　　　
　ビオチン ２ｇ　　　　　　Ｉ）−アミノ安息香酸２ｇ　　　　　
リボフラビン ０．２ｇ　　　葉酸 ３ｇ　　　　　ナイアシン 酵母細胞を、遠心分離により培地から除去し。

上清のタンパクを、１０％トリクロロ酢酸／デオキシク
ロレー）　（０，４ｍｇ／ｍｌ）で沈降させた後９分析
した。ペレットを、アセトンで洗浄し、　１５％の５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲルに、適当な対照とともに、
かけた。タンパクを、クマシーブル−染色によって可視
化した。ｐＢＳ２４．１ｂＢＭＰまたはｐＢＳ２４．１
ｈＢＭＰを含むＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓＩａｅ　ＡＢＩＩ
Ｏ株の１サンプルは、１９８９年６月１日に、　　ＡＴ
ＣＣに、受託番号２０９４９および２０９５０で、寄託
された。

酵母細胞から遠心分離によって培地を除去し。

１０倍に濃縮した。ｐＨを、４．５に調節し、濃縮物を
伝導率５　ｍ　Ｓ　／　ｃ　ｍ未満に希釈した。これを
、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ。

および１ｍＭＰＭＳＦ　（ｐＨ４，５）で予め平衡化し
たファースト７０−Ｓ　（Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　Ｓ）イ
オン交換樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけた。カラム
を１容量の上記緩衝液で洗浄し、上記緩衝液中のＯ−Ｌ
Ｍの塩化ナトリウム勾配を用いて溶出した。１９ＫＤお
よび１６ＫＤタンパクを、伝導率５−．２５ｍ５　／　
ｃ　ｍで溶出し、５ＤＳ−ＰＡＧＥを用いて確認した。

主に、１９ＫＤタンパク含有画分をプールし、ｐＨ７，
５に調節し、尿素の濃度を４．５Ｍとし、濃縮し、４Ｍ
尿素、　　１００ｍＭ　　）リス／ＨＣＩ、　　１ｍＭ
　　ＥＤＴＡ、　　１ｍＭ　　ＰＭＳＦ（ｐＨ７，５）
を用いて、５−ｉｏｏ分級カラムにかけた。１９ＫＤお
よび１６ＫＤタンパクを含有する画分を５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによって同定し。

別々にプールし、水に対して透析した後、凍結乾燥した
。

精製された組換えＢＭＰのサンプルを、ラットの胎児の
中腹二頭筋ブリシイ（＋ｅｉｄｂｅｌｌｙ　ｔｒｉｃｅ
ｐｓｂｒａｃｈｉｉ）筋肉画分を含有するＣＭＲＬ−１
０６６（Ｇ　Ｉ　ＢＣＯ）培養物培地に加えた。結合組
織の外植を、成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｖｌｅｙラッ
トの長骨骨幹由来のＢＭＰを含まないマトリックスの基
底上で培養した。このアッセイは、カワムラおよびユリ
スト（Ｋａｗａｔａｕｒａ　ａｎｄ　Ｕｒｉｓｔ、　Ｄ
ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　１３０
巻、　　４３５−４４２頁、　　１９８２年）によって
更に詳しく説明されている。誘導活性は、ＤＮＡへの［
３Ｈ］チミジンとりこみ、グリコサミノグリカンへの［
３５３］硫酸塩とりこみ、および組織構造学的に軟骨生
成の確認によって測定される。組換えＢＭＰを、２ｍｌ
培養系中、２００ｎｇ／ｍｌから５ｇ／ｍ＋の濃度でテ
ストした。同等の濃度において天然のＢＭＰについてあ
らかじめ観察されたのと同レベルのポジティブな結果が
９組換えＢＭＰについて観察された。組換えＢＭＰ誘導
培養物においては、より高度な［３Ｈ］チミジンおよび
［３５Ｓ］硫酸のとりこみ、ならびに新しい軟骨および
軟骨生成が観察された。組換えＢＭＰを有しない対照培
養物では、軟骨も軟骨生成も見られながった。

■、ウシＢＭＰ遺伝子 プローブＡおよびＢ（第１図）を使用して、１つの強力
なおよび７つの弱いハイブリダイジングクローンを、ウ
シゲノムライブラリーの１０’の組換え体から単離した
。１つの強力にハイブリダイズするクローン（２９−ｂ
ｇ−３）を再びプローブＡ−Ｄ（第１図）でスクリーニ
ングした。３つのプローブ（Ａ　−Ｃ）は、　　２９−
ｂｇ−３にハイブリダイズした。

精製された２９−ｂｇ−３Ｄ　Ｎ　Ａのサザンプロット
分析によって、プローブＡおよびＢが１．９ｋｂ　Ｅｃ
ｏＲＩ断片。

そしてプローブＣが１．２ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−Ｓａｉ＋
断片であることが判明した。両方の断片を配列決定し、
そのトップリーディングフレームに、各々のトリプシン
ペプチドをコードする領域を含んでいることが観察され
た（第２図；箱型に区切ったアミノ酸）。

面白いことに、トリプシンペプチドＤもまた存在してい
たが、２つのエクソンに分裂していた。このことによっ
て、プローブＤとのハイブリダイゼーションの欠如を説
明することができる。インドＣ２７−ｘｙソン境界線は
、ＧＴ−ＡＧルールに適合し、縦線によって示される。

追加ウシＢＭＰエクソンは、単離されなかった。ウシＢ
ＭＰ遺伝子由来のエクソン配列をプローブとして使用し
、ウシＢＭＰ　　ｃＤＮＡクローンを単離することが試
みられた。

Ｉ　１．　　ウシＢＭＰ　　ｃＤＮＡ プローブＩを使用して、幾つかのウシ組織由来のポリ（
Ａ）”ＲＮＡをノーインプロット分析することによって
、子ウシの肝臓がウシＢＭＰ　　ｍＲＮＡの良好な起源
であることが判明した（データは示されていない）。次
いで、プローブＩを使用して、推定ウシＢＭＰ　　ｃＤ
ＮＡクローンを子ウシの肝臓ｃ　ＤＮＡライブラリーか
ら単離した。２つのクローン（＃１および＃７）を配列
決定すると、同一のオーバーラツプする配列および予想
されるコード化トリプシンペプチド（Ａ−Ｄ）が含まれ
ていることが示されたく第３図）。追加のＢＭＰ）リブ
シンペプチド（Ｅ　−Ｈ，第１図）もまた、ウシＢＭＰ
　　ｃＤＮＡにおいて、コード化されていることが観察
された。

Ｉ　Ｉ　１．　　ヒトＢＭＰ遺伝子 肝臓、腎臓、および骨肉腫を含む幾つかのヒト組織およ
び細胞系由来のポリ（Ａ）”ＲＮＡのノーインプロット
分析によって（プローブとしてウシＢＭＰ　　ｃＤＮＡ
＃１を使用）、ヒトＢＭＰを検出することはできなかっ
た。しかし、同一のハイブリダイゼーションおよび洗浄
条件下で行われたサザンプロットでは、ヒトＢＭＰ遺伝
子断片が検出された（データは示されていない）。

ノーインおよびサザンプロットの結果に基づいて、以下
の方法を適用して、　（ｉ）ヒトＢＭＰ遺伝子をクロー
ン化し、配列決定し９次いで（２）ＰＣＲ増幅によって
ヒトＢＭＰ　　ｍＲＮＡの組織源を同定しくヒトＢＭＰ
に基づくブライマー（ＢＭＰ／ＰＣＲｃＤＮＡ）を使用
）、そして生成物のサザンプロット分析を行い、　　（
３）ＰＣＨにより生成したヒトＢＭＰ　　ｃＤＮＡをク
ローン化し、単離した。

ウシＢＭＰ　　ｃＤＮＡ＃１をプローブとして使用して
７つの強力なおよび５つの弱いハイブリダイズするクロ
ーンを、ヒトゲノムライブラリーの１０６の組換え体か
ら単離した。１２のクローンの内、１１のクローンから
の精製されたＤＮＡのサザンプロット分析によって、３
つのクローンＨＧ４．５および９に共通の２つのハイブ
リダイズする旧ｎｄ　ｌ　ｌ　Ｉ断片（ｉ，７ｋｂおよ
び２．０ｋｂ）を同定した。ＨＯ２からの１，７ｋｂお
よび２．Ｏｋ　ｂ）Ｉｌｎｄｌｌ＋断片を配列決定し、
各々、第２図ａおよび第２図すに示すように、ウシＢＭ
Ｐエクソンに対して６３．４％および６２．２％のアミ
ノ酸相同性を有していることが示された。表１は、これ
らの結果および残りのヒトＢＭＰエクソンについてのサ
ザンプロットの結果をまとめている。各サブクローンの
エクソンを含む領域の配列を、第４図ａ−Ｃに示す。エ
クソン１の５′末端（キャップ部位）およびエクソン７
の３′末端（ポリ（Ａ）９付加部位）は、不明である。

イントロン／エクソン境界線は、ＧＴ−ＡＧルールに従
い、縦線によって示される。ＤＮＡは、３つの全てのリ
ーディングフレームにおいて翻訳された。中央および先
端のフレームは、各々、エクソン１−６およびエクソン
７についての正しいアミノ酸を含む（箱型で示す）。

ＩＶ、ヒトＢＭＰｃＤＮＡ 腎臓（細胞系、２９３）は、ＰＣＲ増幅およびサザンプ
ロット分析によってｈＢＭＰ　　ｍＲＮＡの源として同
定された。ｈＢＭＰ／ＰＣＲｃＤＮＡから作製、ｃＤＮ
Ａライブラリーの１０３の組換え体は、プローブＪ　（
ヒトエクソン３プローブ）でスクリーニングされ、１２
個の推定ｈＢＭＰｃＤＮＡクローンが、単離された。ク
ローンのＢａｍＨＩ／旧ｎｄｌｌｌ　消化後のアガロー
スゲル電気泳動により、各クローンが７００ｂｐまたは
６００ｂｐのｃＤＮＡ挿入物を含むことが示された。Ｄ
ＮＡの配列決定によって、７００ｂｐ種が、予想された
全長ＢＭＰ　　ｃＤＮＡ（第５図）であり、そして、ａ
ｏｏｂｐ種が、エクソン２を欠損した（示されていない
）切形のヒトＢＭＰ　　ｃＤＮＡであることが判明した
。この短いｃＤＮＡ種は、異常にスプライスされた。無
機能ｍＲＮＡを代表しているようである。なぜなら、翻
訳のフレームシフトが、新たに形成されたエクソン１／
工クソン３連結部において起こり、その結果、未熟な終
止コドンが生じる。

比丘 ｈＢＭＰは、３つの約１７ＫＤのタンパクの混金物とし
て酵母中に発現するが、ｂＢＭＰは９分子量が１９ＫＤ
および１６ＫＤの２つの組合せである３種の混合物とし
て発現される。サイズが不均一であるのは、酵母によっ
てコードされた酵素により１分泌中に各ＢＭＰがプロセ
ッシングされる結果である。ｂＢＭＰ混合物のアミノ末
端のアミノ酸配列の決定により、単一７ミノ末端（Ｐｈ
ｅ）が与えられ、このことにより、プロセッシングがタ
ンパクのカルボキシル領域において起こり、１６ＫＤ酵
母開裂類似体が生成することが示される。

この領域における幾つかの対の塩基性アミノ酸残基は９
分泌中におけるタンパク分解部位の候補であり得る。こ
の観察により２分子量が２０ｋＤより大きい推定タンパ
ク生成物を、各ＢＭＰ　　ｃＤＮＡがコードするという
事実と共に、ＢＭＰが。

インビボで、より大きな前駆体由来のタンパク分解プロ
セッシングの生成物であるという可能性が強調される。

表土 ゲノムクローン由来のヒトＢＭＰ　　エクソン含有ＤＮ
Ａを同定するサザンプロット結果の一覧鉱限販亙１ １　　　　　Ｑ、６　　　ｐｓｔ　Ｉ　　　　Ｈｇ　４
”　　ＢＭＰ　１０３２　　　　０．６　　　ｐｓｔ　
Ｉ　　　　ＨＧ　４３ｈＢＭＰ　ｃＤＮＡ３　　　　　
１．７　　　Ｈｉｎｄ　　ＩＩＩ　　ＨＧ　９　　　ｂ
ＢＭＰ　ｃＤＮＡ４　　　２、ＯＨｉｎｄ　ＩＩＩ　　
ＨＧ　９　　ｂＢＭＰ　ｃＤＮＡＳ　　　　　Ｇ、４　
　　Ｂｇｌ　　ＩＩ　　　　ｌ（Ｇ　５　　　ＢＭＰ　
　１１６６　　　　３．０　　　Ｂｇｌ　　ＩＩ　　　
ＨＧ　５３ＢＭＰ　１１６７　　　　　１．１　　　　
Ｂｇｌ　　Ｉｔ　　　　ＨＧ５　　　ＢＭＰ１０４１　
エクソン含有ＤＮＡ制限断片。

２　制限断片が得られるゲノムクローン。

３　エクソンｌおよび２　ＤＮＡは、ｐＵｃ１９にサブ
クローンされたＨＧ４の７ｋｂ　　Ｓａｌ■断片から得
られた。両方のエクソンは、同一のＰｓｔ　　Ｉ断片上
で見いだされたが、異なるプローブで同定された。エク
ソン６は、ｐＵｃ１９にサブクローン化されたＨＧ５の
１５ｋｂ　　５ａｌＩ挿入物から得られた。

４　エクソン含有ＤＮＡ制限断片を同定するのに使用し
たプローブ。プローブについては、　「オリゴヌクレオ
チド合成」の項の材料と方法において、説明されている
。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、実施例に
おいて、実施例３の［ライブラリーのスクリーニング（
Ｃ）　ヒトゲノムライブラリー」の項において、で説明
されている。

（発明の要約） 組換えＤＮＡ手法による骨形態形酸タンパクの精製およ
びクローニング、ならびにＢＭＰおよびその類似体の製
造が開示されている。ＢＭＰを含有する薬剤組成物およ
びそのような組成物の使用も開示されている。

４、　　　　の　　　な１ 第１図は、ウシＢＭＰのトリプシン消化物からの８つの
ペプチドのアミノ酸配列を示す。

第２図は、ウシＢＭＰ遺伝子の２つのエクソン含有領域
のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。

第３図は、ウシＢＭＰ　　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列
および前駆体ポリペプチドの確推定アミノ酸配列を示す
。

第４図ａから第４図Ｃは、ヒトＢＭＰ遺伝子のエクソン
含有領域の配列を示す。

第５図は、ヒトＢＭＰのヌクレオチド配列および前駆体
ポリペプチドの推定アミノ酸配列を示す。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、他の骨誘導関連因子を実質的に含まない、哺乳類骨
   形態形成タンパク（ＢＭＰ）およびその類似体からなる
   群より選択されるポリペプチドを含有する組成物。 ２、前記哺乳類骨形態形成タンパクがヒトＢＭＰである
   、請求項１に記載の組成物。 ３、前記哺乳類骨形態形成タンパクがウシＢＭＰである
   、請求項１に記載の組成物。 ４、前記ポリペプチドが、第５図に示されるアミノ酸配
   列ａａ＿１−ａａ＿１＿８＿２またはその断片を含有す
   る、請求項１に記載の組成物。 ５、前記ポリペプチドが、第３図に示されるアミノ酸配
   列ａａ＿１−ａａ＿１＿９＿６またはその断片を含有す
   る、請求項１に記載の組成物。 ６、前記ポリペプチドが、１６ＫＤ酵母開裂類似体を含
   有する、請求項５に記載の組成物。 ７、哺乳類ＢＭＰおよびその類似体のアミノ酸配列を含
   有するポリペプチドをコードする、イントロンを含まな
   いＤＮＡ配列またはその補体。 ８、前記ＤＮＡがヒトＢＭＰをコードする、請求項７に
   記載のＤＮＡ。 ９、前記ＤＮＡがウシＢＭＰをコードする、請求項７に
   記載のＤＮＡ。 １０、前記ポリペプチドが哺乳類ＢＭＰシグナル配列を
   含有する、請求項７に記載のＤＮＡ配列。 １１、前記ポリペプチドが哺乳類ＢＭＰシグナル配列を
   含有しない、請求項７に記載のＤＮＡ配列。 １２、前記ポリペプチドが、宿主酵母における分泌を提
   供するＮ末端酵母α因子シグナル配列を更に含有する、
   請求項７に記載のＤＮＡ配列。 １３、請求項８に記載のＤＮＡ配列を有するレプリコン
   。 １４、請求項８に記載のＤＮＡ配列を有するベクター。 １５、請求項１３に記載のレプリコンを有する細胞。 １６、請求項１４に記載のベクターを有する細胞。 １７、以下の工程を包含する組換え体哺乳類ＢＭＰまた
   はその類似体を調製する方法： （ａ）非相同のＤＮＡ配列を有する細胞集団を提供する
   工程、ここで、該ＤＮＡ配列は（ｉ）該細胞内で機能す
   る転写および翻訳制御配列、および（ｉｉ）哺乳類ＢＭ
   Ｐおよびその類似体を包含するポリペプチドをコードし
   、該転写および翻訳制御配列の制御下にあるコード配列
   を有する；および （ｂ）該ポリペプチドを発現するための条件下で該細胞
   集団を増殖させること。 １８、前記ポリペプチドがヒトＢＭＰである、請求項１
   ７に記載の方法。 １９、前記ポリペプチドがウシＢＭＰである、請求項１
   ７に記載の方法。 ２０、前記細胞集団が微生物である、請求項１７に記載
   の方法。 ２１、前記細胞集団が酵母である、請求項１７に記載の
   方法。 ２２、前記細胞集団がイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）であ
   る、請求項１７に記載の方法。 ２３、前記ポリペプチドが更に、該ポリペプチドのＮ末
   端にシグナル配列をコードする配列を有し、そして該ポ
   リペプチドが前記細胞から分泌される、請求項１８に記
   載の方法。 ２４、前記細胞が酵母細胞であり、そして、該シグナル
   配列が酵母α因子シグナル配列である、請求項２３に記
   載の方法。 ２５、骨組織を、有効量の、哺乳類ＢＭＰ組成物または
   その活性類似体組成物と接触させる工程を包含する骨増
   殖誘導方法。 ２６、哺乳類骨形態形成タンパクに対するモノクロナー
   ル抗体。