JP2022531191A - 肝細胞増殖因子の操作された二量体断片を使用する眼の治療方法 - Google Patents

肝細胞増殖因子の操作された二量体断片を使用する眼の治療方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2022531191A
JP2022531191A JP2021564317A JP2021564317A JP2022531191A JP 2022531191 A JP2022531191 A JP 2022531191A JP 2021564317 A JP2021564317 A JP 2021564317A JP 2021564317 A JP2021564317 A JP 2021564317A JP 2022531191 A JP2022531191 A JP 2022531191A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
amino acid
seq
polypeptide
variant
hhgf
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021564317A
Other languages
English (en)
Inventor
コクラン，ジェニファー，アール．
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leland Stanford Junior University
Original Assignee
Leland Stanford Junior University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leland Stanford Junior University filed Critical Leland Stanford Junior University
Publication of JP2022531191A publication Critical patent/JP2022531191A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1833—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5021—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/5036—Polysaccharides, e.g. gums, alginate; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5021—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/5052—Proteins, e.g. albumin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/4753—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本発明は、治療で使用するための、特に眼疾患及び障害を治療するための、二量体を含むＨＧＦポリペプチドバリアントを提供する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年４月２９日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＯＣＵＬＡＲ ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ ＵＳＩＮＧ ＡＮ ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ ＤＩＭＥＲＩＣ ＦＲＡＧＭＥＮＴ ＯＦ ＨＥＰＡＴＯＣＹＴＥ ＧＲＯＷＴＨ ＦＡＣＴＯＲ」と題される米国仮特許出願第６２／８４０，２９６号の優先権を主張し、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
連邦支援による研究または開発の下で行われた発明に対する権利に関する声明
本発明は、国立衛生研究所によって授与された契約Ｋ０８ＥＹ０２８１７６及びＰ３０－ＥＹ０２６８７７に基づく政府の支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
本発明は、眼の治療において使用するためのポリペプチドバリアント、特に、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のバリアントの分野に関する。
ヒト増殖因子は、創傷治癒、組織再生、血管新生、及び腫瘍形成などの多くの複雑なプロセスを編成する上で重要な役割を果たす１～４。したがって、創傷治癒及び再生プロセスを加速させるためのタンパク質治療薬として増殖因子を利用すること、または様々な疾患及び状態においてがんの増殖及び血管新生を阻害することに非常に関心がある５～７。しかしながら、多数の組換え増殖因子が治療薬として開発されてきたにもかかわらず、少数の候補しか臨床承認を受けるのに十分に有効ではなかった８，９。これは、インビボでの増殖因子の有効半減期が短いことに大きく起因し、概して安定性が低く、血液クリアランスが速いことから生じる５，１０。治療用増殖因子は、有効であるために、創傷領域内で長期間活性を維持しなければならない。しかしながら、増殖因子は、生理学的温度及びプロテアーゼにさらされると変性するか、または分解され得る１１、１２。プロテアーゼ媒介性分解に対する耐性は、プラスミン及びメタロプロテイナーゼなどのプロテアーゼが組織リモデリングにおいて特に活性であるため、特に重要であり得る１３。
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、散乱因子（ＳＦ）としても知られ、主に間葉系細胞によって産生される多機能ヘテロ二量体タンパク質であり、Ｍｅｔチロシンキナーゼ受容体（「ｃ－Ｍｅｔ」）を発現する細胞のエフェクターである（Ｂｏｔｔａｒｏ ｅｔ ａｌ．（１９９１） ＳＣＩＥＮＣＥ ２５１：８０２－８０４、Ｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３） ＢＩＯＣＨＩＭ．ＢＩＯＰＨＹＳ．ＡＣＴＡ １１５５：３５７－３７１）。成熟ＨＧＦは、α鎖及びβ鎖の２つのポリペプチド鎖を含有する。公開されている研究は、それがＨＧＦのｃ－Ｍｅｔ受容体結合ドメインを含有するα鎖であることを示唆している。
成熟ＨＧＦは、α鎖及びβ鎖の２つのポリペプチド鎖を含有する。その同族受容体に結合すると、ＨＧＦはいくつかの細胞活性を媒介する。ＨＧＦ－Ｍｅｔシグナル伝達経路は、肝臓再生、創傷治癒、神経再生、血管新生、及び悪性腫瘍において役割を果たす。例えば、Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．（２００１） ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ９８：７４４３－７４４８、Ｂｕｒｇｅｓｓ ｅｔ ａｌ．（２００６） ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳ．６６：１７２１－１７２９、ならびに米国特許第５，９９７，８６８号及び同第５，７０７，６２４号を参照されたい。
増殖、生存、及び遊走を媒介する細胞シグナル伝達経路の調節不全は、多くのがんの根本的な原因である。特に、Ｍｅｔチロシンキナーゼ受容体の調節不全及び過剰発現は、多くのヒト腫瘍における予後不良と相関し、治療的介入のための魅力的な標的となる。
現在、Ｍｅｔ受容体を標的とするＦＤＡ承認の治療薬は存在しないが、いくつかの候補分子が、臨床試験の様々な段階にある。したがって、Ｍｅｔ受容体活性化を強力に阻害する分子は、がん療法に有意な影響を及ぼし得る。加えて、インビボでのＭｅｔ発現の非侵襲的可視化のためのＭｅｔ標的化分子造影剤を開発するための研究は、他のがん標的と比較して極めて限定されている。そのような造影剤の利用可能性は、がん診断、病期分類、及び疾患管理に役立ち、またＭｅｔ標的療法の良い候補となるであろう患者を特定するのに役立つであろう。
眼に関しては、ドーム状の眼の最も外側の組織として保護的な役割を果たしているにもかかわらず、通常透明な角膜は、損傷または疾患の結果として潰瘍化、瘢痕、及び混濁化を非常に起こしやすい。角膜の重度の損傷及び疾患では、主に対症手段であるが現在利用可能な多数の手段にもかかわらず、永久的な瘢痕及び視力低下が結果として生じることが多い。１末期角膜失明は、角膜の通常透明な層のうちの１つ以上の血管新生及び混濁化、その後の浮腫及び線維性瘢痕を特徴とする。眼表面のほぼすべての盲障害は、それが感染性（例えば、重度の角膜潰瘍またはヘルペス性角膜炎）、免疫媒介性（例えば、スティーブンス－ジョンソン症候群）、及びまたは外傷性（例えば、アルカリ熱傷）であるかにかかわらず、上皮欠損の治癒障害から始まり、不透明な角膜血管新生で終わる。血清点眼薬１及び羊膜２などの組織由来療法は、臨床的に広く使用されているが、両治療の分子組成及び根底にある機序は未だ明確に定義されていない。２逆に、上皮増殖因子（ＥＧＦ）などの単一の組換え増殖因子は、臨床試験で失敗しており、３角膜創傷治癒を完全に支援するために多因子介入が必要であることを示唆している。
本発明は、例えば、遷延性角膜上皮欠損（ＰＣＥＤ）ならびに角膜血管新生を含む眼疾患及び／または眼障害の治療及び／または予防に使用するための肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のバリアントを使用するための方法を提供することによって、この必要性を満たす。
本発明は、眼疾患及び／または眼障害の治療及び／または予防を必要とする対象においてそれらを治療及び／または予防する方法を提供し、これには、本明細書に記載のヒト肝細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）バリアントを対象に投与することが含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明は、眼の治療方法を提供し、本方法は、ヒト肝細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）バリアントを投与することを含む。いくつかの実施形態では、眼の治療は、遷延性角膜上皮欠損（ＰＣＥＤ）ならびに角膜血管新生のためのものである。
いくつかの実施形態では、眼疾患及び／または眼障害は、遷延性角膜上皮欠損（ＰＣＥＤ）である。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、配列番号８の野生型ｈＨＧＦと比較して、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸付加、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、ホモ二量体である。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、及び／または配列番号３０のいずれか１つに記載の配列、ならびに任意選択でリンカーを含むＮＫ１ホモ二量体である。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、６２位、１２７位、１３７位、１７０位、または１９３位に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、Ｋ６２Ｅ、Ｎ１２７Ｄ／Ａ／Ｋ／Ｒ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、及びＮ１９３Ｄからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、アミノ酸置換Ｋ６２Ｅ、Ｎ１２７Ｄ／Ａ／Ｋ／Ｒ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、及びＮ１９３Ｄを含む。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、Ｍｅｔのアンタゴニストである。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、Ｍｅｔのアゴニストである。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、検出可能な部分、水溶性ポリマー、水不溶性ポリマー、治療部分、標的化部分、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーにコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、６４位、７７位、９５位、１２５位、１３０位、１３２位、１４２位、１４８位、１５４位、及び１７３位のうちの１つ以上にアミノ酸置換をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、本明細書の図１０に提供される米国特許第９，５５６，２４８号からの配列番号２～２２からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、アミノ酸置換Ｋ６２Ｅ、Ｑ９５Ｒ、Ｉ１２５Ｔ、Ｎ１２７Ｄ／Ａ／Ｋ／Ｒ、Ｉ１３０Ｖ、Ｋ１３２Ｎ／Ｒ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、Ｑ１７３Ｒ、及びＮ１９３Ｄを含む。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、６４位、７７位、１４２位、１４８位、及び１５４位のうちの１つ以上にアミノ酸置換をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、アミノ酸置換Ｋ６２Ｅ、Ｑ９５Ｒ、Ｋ１３２Ｎ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、Ｑ１７３Ｒ、及びＮ１９３Ｄを含む。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、６４位、７７位、１２５位、１２７位、１３０位、１４２位、１４８位、及び１５４位のうちの１つ以上にアミノ酸置換をさらに含む。
いくつかの実施形態では、該ｈＨＧＦバリアントは、アミノ酸置換Ｋ６２Ｅ、Ｑ９５Ｒ、Ｎ１２７Ｄ／Ａ／Ｋ／Ｒ、Ｋ１３２Ｎ／Ｒ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、Ｑ１７３Ｒ、及びＮ１９３Ｄを含む。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、６４位、７７位、１２５位、１３０位、１４２位、１４８位、及び１５４位のうちの１つ以上にアミノ酸置換をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、配列番号２～２２からなる群から選択される配列を含む。
ＮＫ１ホモ二量体及び組換えＨＧＦの概略図。 Ｍｅｔ経路の概略図。 ｅＮＫ１及びＨＧＦで処理したＣＥＣ（角膜上皮細胞）が、改善された創傷閉鎖速度を有することを示すデータを提供する。 ｅＮＫ１及びＨＧＦ処理された細胞が増加した細胞増殖を有することを示すデータを提供する。 ＭＴＴ増殖アッセイが、ｅＮＫ１及びｒＨＧＦで４８時間処理したＣＥＣが、未処理の細胞と比較して改善された代謝活性を有した（ｐ＜０．０５）ことを示すデータを提供する。 ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４配列の例を提供する。 ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４配列の例を提供する。 ＨＧＦドメイン構造。Ｎ： Ｎ末端ＰＡＮモジュール、Ｋ： クリングルドメイン、ＳＰＨ：セリンプロテアーゼ相同性ドメイン。黒い矢印は、ＨＧＦをその２鎖活性形態に切断するための切断部位を示す。α鎖及びβ鎖は、ジスルフィド結合を介して接続される。Ｎ末端及び第１のクリングルドメインは、ＨＧＦのＮＫ１断片を含む。 ＮＫ１操作戦略の概要。１回目の指向性進化（Ｍ１）においてライブラリをＭｅｔへの機能的結合についてスクリーニングし、２回目（Ｍ２）では、ライブラリを、親和性の増強または安定性の増強のいずれかについて並行してスクリーニングし、３回目（Ｍ３）では、Ｍ２生成物をシャッフルし、親和性及び安定性の改善について同時にスクリーニングした。 （Ａ）ｔ＝０時間での角膜創傷、（Ｂ）ＨＡ／ＣＳゲル送達ビヒクルにおけるＭＳＣセクレトームでの治療の２４時間後の角膜創傷、（Ｃ）生理食塩水液滴単独の２４時間後の角膜創傷を比較する、アルカリ熱傷後の角膜創傷治癒研究。予備研究では、（Ｄ）Ｃｏｃｈｒａｎラボで開発されたｅＨＧＦ（挿入画像に示されるＰＤＢ構造）単独でも、インビボでのアルカリ熱傷ラット角膜における創傷閉鎖時間が加速されることが示された。 参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，５５６，２４８号からの配列番号２～２２のバリアント肝細胞増殖因子配列を提供する。
Ｉ．序文
Ｍｅｔ受容体は、単一の遺伝子産物から発現され、５０ｋＤのα鎖及び１４０ｋＤのβ鎖にタンパク質分解的に処理される。α鎖及びβ鎖の最初の２１２の残基は、複合体７枚羽βプロペラ折り畳みであるセマドメインを含む。Ｍｅｔ β鎖の残りの部分は、システインリッチドメイン、４つの免疫グロブリンドメイン、細胞内キナーゼドメイン、及びＣ末端尾を含む。リガンド結合及び二量体化の際、Ｍｅｔは、細胞内キナーゼドメインのＴｙｒ－１２３４及びＴｙｒ－１２３５上で架橋リン酸化される。この活性は、アダプタータンパク質ならびにシグナルトランスデューサーＳｈｃ、Ｇｒｂ２、Ｇａｂ１、ＰＩ－３キナーゼ、及びＰＬＣ－γのための多基質ドッキング部位であるＭｅｔのＣ末端においてＴｙｒ－１３４９及びＴｙｒ－１３５６のさらなるリン酸化をもたらす。
ＨＧＦは、プラスミノーゲンなどの凝固因子と同様の全体的なドメイン構造を示し、ＨＧＦ活性化因子、マトリプターゼ、ヘプシン、第ＸＩＩａ因子、及び第Ｘｉａ因子などの酵素によってその機能的に活性な形態に切断されなければならない一本鎖不活性前駆体として発現される。一本鎖ｐｒｏＨＧＦ及び切断された２本鎖ＨＧＦはいずれも高い親和性でＭｅｔに結合するが、２本鎖ＨＧＦのみがＭｅｔ活性化を誘導することができる。ＨＧＦ α鎖は、Ｎ末端ヘアピン含有ドメイン（ＰＡＮモジュール、ａｐｐｌｅドメイン）、続いて４つのクリングルドメインからなる（図１）。ＨＧＦ β鎖は、セリンプロテアーゼ相同性ドメインからなるが、触媒三残基に重要な残基が存在しないため、触媒活性を欠く。
いくつかのＨＧＦ断片が報告されており、ＮＫ１及びＮＫ２は、天然に存在するＨＧＦスプライスバリアントであり、ＮＫ４は、膵臓エラスターゼによるＨＧＦの消化によって最初に発見された。これらの断片は、Ｎ末端及び第１のクリングル（ＮＫ１）、第１及び第２のクリングル（ＮＫ２）、または第１～第４のクリングル（ＮＫ４）ドメインからなる。ＮＫ１及びＮＫ２は、Ｍｅｔアンタゴニストであることが最初に報告されたが、その後、弱いＭｅｔアゴニストとして機能することが決定されている。対照的に、ＮＫ４は、Ｍｅｔ（４００～６００ｐＭ）への強い結合を維持するが、Ｍｅｔ活性化を誘導せず、それによって競合ＨＧＦアンタゴニストとして機能する。ＮＫ１は、完全長ＨＧＦよりもはるかに弱いが、Ｍｅｔに結合し、活性化するため、ＨＧＦの最小機能単位を含むように見える。
本発明は、眼疾患及び障害に関連する治療方法において、本明細書に記載されるＨＧＦバリアントを使用するための方法を提供する。
ＩＩ．定義
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用される命名法、ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学及び核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションにおける実験手順は、当該技術分野で周知であり、一般に用いられるものである。核酸及びペプチド合成には、標準的な技法が使用される。技法及び手順は、当該技術分野における従来の方法、及び本文書全体を通して提供される様々な一般的な参考文献に従って一般に行われる（一般に、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｄ ｅｄ．（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。本明細書で使用される命名法、ならびに以下に記載される分析及び合成有機化学の実験手順は、当該技術分野で周知であり、一般に用いられるものである。標準的な技法またはその修正が、化学合成及び化学分析に使用される。
「Ｍ２．１」及び「Ｍ２．２」という用語は、以下の置換：それぞれ、（ｉ）Ｋ６２Ｅ、Ｎ１２７Ｄ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、Ｎ１９３Ｄ、及び（ｉｉ）Ｋ６２Ｅ、Ｑ９５Ｒ、Ｎ１２７Ｄ、Ｋ１３２Ｎ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、Ｑ１７３Ｒ、Ｎ１９３Ｄを有する配列番号２のバリアントを指す。
いくつかの実施形態では、「ｅＮＫ１」という用語は、配列番号２３を指す。
本明細書で使用する場合、「ＮＫ１」は、肝細胞増殖因子のＮ末端及び第１のクリングルドメインからなる。（例えば、Ｃｉｏｃｅ， ＪＢＣ， ２７１：１３１１０－１３１１５ （１９９６）を参照されたい。）本発明のポリペプチドにおける破壊点は、ヒト肝細胞増殖因子アイソフォーム１のアミノ酸２８～２１０（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＩＤ ＮＰ＿０００５９２）を含む。他は、３１～２１０及び３２～２１０の破壊点を使用している。代替のヒト肝細胞増殖因子アイソフォーム、アイソフォーム３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＩＤ ＮＰ＿００１０１９３２．１）は、第１のクリングルドメインにおける５つのアミノ酸欠失を除いて、ヒトＨＧＦ（ｈＨＧＦ）アイソフォーム１と同一である。ｈＨＧＦアイソフォーム１及びアイソフォーム３の両方は、Ｍｅｔ受容体を強力に活性化し、ｈＨＧＦアイソフォーム１またはアイソフォーム３に由来するＮＫ１タンパク質もまた、Ｍｅｔ受容体に結合し、それを活性化する。アイソフォーム３バリアントに基づくＮＫ１の２８～２０５、３１～２０５、及び３２～２０５の破壊点は、アイソフォーム１バリアントに基づくＮＫ１の２８～２１０、３１～２１０、及び３２～２１０の破壊点と同一であり、唯一の違いは、第１のクリングルドメイン（Ｋ１）からの５つのアミノ酸の欠失である。
いくつかの実施形態では、ＮＫ１は、二量体化のためのＮ末端システインを含む、以下に列挙される配列番号２５を指す：
ＹＡＥＧＱＲＫＲＲＮＴＩＨＥＦＫＫＳＡＫＴＴＬＩＫＩＤＰＡＬＫＩＫＴＥＫＶＮＴＡＤＱＣＡＮＲＣＴＲＮＫＧＬＰＦＴＣＫＡＦＶＦＤＫＡＲＫＲＣＬＷＦＰＦＮＳＭＳＳＧＶＫＫＥＦＧＨＥＦＤＬＹＥＮＫＤＹＩＲＮＣＩＩＧＮＧＲＳＹＲＧＴＶＳＩＴＫＳＧＩＫＣＱＰＷＳＳＭＩＰＨＥＨＳＦＬＰＳＳＹＲＧＥＤＬＲＥＮＹＣＲＮＰＲＧＥＥＧＧＰＷＣＦＴＳＤＰＥＶＲＹＥＶＣＤＩＰＱＣＳＥＶＥ （配列番号２５）
いくつかの実施形態では、ＮＫ１は、二量体化のためのＮ末端システインを含む、配列番号２６を指す：
ＣＹＡＥＧＱＲＫＲＲＮＴＩＨＥＦＫＫＳＡＫＴＴＬＩＫＩＤＰＡＬＫＩＫＴＥＫＶＮＴＡＤＱＣＡＮＲＣＴＲＮＫＧＬＰＦＴＣＫＡＦＶＦＤＫＡＲＫＲＣＬＷＦＰＦＮＳＭＳＳＧＶＫＫＥＦＧＨＥＦＤＬＹＥＮＫＤＹＩＲＮＣＩＩＧＮＧＲＳＹＲＧＴＶＳＩＴＫＳＧＩＫＣＱＰＷＳＳＭＩＰＨＥＨＳＦＬＰＳＳＹＲＧＥＤＬＲＥＮＹＣＲＮＰＲＧＥＥＧＧＰＷＣＦＴＳＤＰＥＶＲＹＥＶＣＤＩＰＱＣＳＥＶＥ （配列番号２６）
いくつかの実施形態では、ＮＫ１は、以下のＵｎｉｐｒｏｔ参照番号Ｐ１４２１０を指す：
ＭＷＶＴＫＬＬＰＡＬＬＬＱＨＶＬＬＨＬＬＬＬＰＩＡＩＰＹＡＥＧＱＲＫＲＲＮＴＩＨＥＦＫＫＳＡＫＴＴＬＩＫＩＤＰＡＬＫＩＫ
ＴＫＫＶＮＴＡＤＱＣＡＮＲＣＴＲＮＫＧＬＰＦＴＣＫＡＦＶＦＤＫＡＲＫＱＣＬＷＦＰＦＮＳＭＳＳＧＶＫＫＥＦＧＨＥＦＤＬＹＥ
ＮＫＤＹＩＲＮＣＩＩＧＫＧＲＳＹＫＧＴＶＳＩＴＫＳＧＩＫＣＱＰＷＳＳＭＩＰＨＥＨＳＦＬＰＳＳＹＲＧＫＤＬＱＥＮＹＣＲＮＰ
ＲＧＥＥＧＧＰＷＣＦＴＳＮＰＥＶＲＹＥＶＣＤＩＰＱＣＳＥＶＥＣＭＴＣＮＧＥＳＹＲＧＬＭＤＨＴＥＳＧＫＩＣＱＲＷＤＨＱＴＰ
ＨＲＨＫＦＬＰＥＲＹＰＤＫＧＦＤＤＮＹＣＲＮＰＤＧＱＰＲＰＷＣＹＴＬＤＰＨＴＲＷＥＹＣＡＩＫＴＣＡＤＮＴＭＮＤＴＤＶＰＬ
ＥＴＴＥＣＩＱＧＱＧＥＧＹＲＧＴＶＮＴＩＷＮＧＩＰＣＱＲＷＤＳＱＹＰＨＥＨＤＭＴＰＥＮＦＫＣＫＤＬＲＥＮＹＣＲＮＰＤＧＳ
ＥＳＰＷＣＦＴＴＤＰＮＩＲＶＧＹＣＳＱＩＰＮＣＤＭＳＨＧＱＤＣＹＲＧＮＧＫＮＹＭＧＮＬＳＱＴＲＳＧＬＴＣＳＭＷＤＫＮＭＥ
ＤＬＨＲＨＩＦＷＥＰＤＡＳＫＬＮＥＮＹＣＲＮＰＤＤＤＡＨＧＰＷＣＹＴＧＮＰＬＩＰＷＤＹＣＰＩＳＲＣＥＧＤＴＴＰＴＩＶＮＬ
ＤＨＰＶＩＳＣＡＫＴＫＱＬＲＶＶＮＧＩＰＴＲＴＮＩＧＷＭＶＳＬＲＹＲＮＫＨＩＣＧＧＳＬＩＫＥＳＷＶＬＴＡＲＱＣＦＰＳＲＤ
ＬＫＤＹＥＡＷＬＧＩＨＤＶＨＧＲＧＤＥＫＣＫＱＶＬＮＶＳＱＬＶＹＧＰＥＧＳＤＬＶＬＭＫＬＡＲＰＡＶＬＤＤＦＶＳＴＩＤＬＰ
ＮＹＧＣＴＩＰＥＫＴＳＣＳＶＹＧＷＧＹＴＧＬＩＮＹＤＧＬＬＲＶＡＨＬＹＩＭＧＮＥＫＣＳＱＨＨＲＧＫＶＴＬＮＥＳＥＩＣＡＧ
ＡＥＫＩＧＳＧＰＣＥＧＤＹＧＧＰＬＶＣＥＱＨＫＭＲＭＶＬＧＶＩＶＰＧＲＧＣＡＩＰＮＲＰＧＩＦＶＲＶＡＹＹＡＫＷＩＨＫＩＩ
ＬＴＹＫＶＰＱＳ （配列番号２７）
いくつかの実施形態では、ＮＫ１は、以下のＵｎｉｐｒｏｔ参照番号Ｐ１４２１０－２を指す：
ＭＷＶＴＫＬＬＰＡＬＬＬＱＨＶＬＬＨＬＬＬＬＰＩＡＩＰＹＡＥＧＱＲＫＲＲＮＴＩＨＥＦＫＫＳＡＫＴＴＬＩＫＩＤＰＡＬＫＩＫ
ＴＫＫＶＮＴＡＤＱＣＡＮＲＣＴＲＮＫＧＬＰＦＴＣＫＡＦＶＦＤＫＡＲＫＱＣＬＷＦＰＦＮＳＭＳＳＧＶＫＫＥＦＧＨＥＦＤＬＹＥ
ＮＫＤＹＩＲＮＣＩＩＧＫＧＲＳＹＫＧＴＶＳＩＴＫＳＧＩＫＣＱＰＷＳＳＭＩＰＨＥＨＳＦＬＰＳＳＹＲＧＫＤＬＱＥＮＹＣＲＮＰ
ＲＧＥＥＧＧＰＷＣＦＴＳＮＰＥＶＲＹＥＶＣＤＩＰＱＣＳＥＶＥＣＭＴＣＮＧＥＳＹＲＧＬＭＤＨＴＥＳＧＫＩＣＱＲＷＤＨＱＴＰ
ＨＲＨＫＦＬＰＥＲＹＰＤＫＧＦＤＤＮＹＣＲＮＰＤＧＱＰＲＰＷＣＹＴＬＤＰＨＴＲＷＥＹＣＡＩＫＴＣＥＴ （配列番号２８）
いくつかの実施形態では、ＮＫ１は、以下のＵｎｉｐｒｏｔ参照番号Ｐ１４２１０－４を指す：
ＭＷＶＴＫＬＬＰＡＬＬＬＱＨＶＬＬＨＬＬＬＬＰＩＡＩＰＹＡＥＧＱＲＫＲＲＮＴＩＨＥＦＫＫＳＡＫＴＴＬＩＫＩＤＰＡＬＫＩＫ
ＴＫＫＶＮＴＡＤＱＣＡＮＲＣＴＲＮＫＧＬＰＦＴＣＫＡＦＶＦＤＫＡＲＫＱＣＬＷＦＰＦＮＳＭＳＳＧＶＫＫＥＦＧＨＥＦＤＬＹＥ
ＮＫＤＹＩＲＮＣＩＩＧＫＧＲＳＹＫＧＴＶＳＩＴＫＳＧＩＫＣＱＰＷＳＳＭＩＰＨＥＨＳＦＬＰＳＳＹＲＧＫＤＬＱＥＮＹＣＲＮＰ
ＲＧＥＥＧＧＰＷＣＦＴＳＮＰＥＶＲＹＥＶＣＤＩＰＱＣＳＥＶＥＣＭＴＣＮＧＥＳＹＲＧＬＭＤＨＴＥＳＧＫＩＣＱＲＷＤＨＱＴＰ
ＨＲＨＫＦＬＰＥＲＹＰＤＫＧＦＤＤＮＹＣＲＮＰＤＧＱＰＲＰＷＣＹＴＬＤＰＨＴＲＷＥＹＣＡＩＫＮＭＲＤＩＴＷＡＬＮ （配列番号２９）
いくつかの実施形態では、ＮＫ１は、タンパク質データバンク番号（ＰＤＢ）１ＮＫ１＿Ａまたは１ＮＫ１＿Ｂを指し、これらはそれぞれ、以下の配列を列挙する：
ＹＶＥＧＱＲＫＲＲＮ ＴＩＨＥＦＫＫＳＡＫ ＴＴＬＩＫＩＤＰＡＬ ＫＩＫＴＫＫＶＮＴＡ ＤＱＣＡＮＲＣＴＲＮ ＫＧＬＰＦＴＣＫＡＦ
ＶＦＤＫＡＲＫＱＣＬ ＷＦＰＦＮＳＭＳＳＧ ＶＫＫＥＦＧＨＥＦＤ ＬＹＥＮＫＤＹＩＲＮ ＣＩＩＧＫＧＲＳＹＫ ＧＴＶＳＩＴＫＳＧＩ
ＫＣＱＰＷＳＳＭＩＰ ＨＥＨＳＦＬＰＳＳＹ ＲＧＫＤＬＱＥＮＹＣ ＲＮＰＲＧＥＥＧＧＰ ＷＣＦＴＳＮＰＥＶＲ ＹＥＶＣＤＩＰＱＣＳ
ＥＶＥ （配列番号３０）
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）及びそれらのポリマーを指す。特に限定されない限り、本用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別途示されない限り、特定の核酸配列は、その保存的修飾バリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補配列、ならびに明示的に示される配列も暗示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの第３の位置が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換される配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１ （１９９１）、Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）、及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８（１９９４））。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、及び遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと交換可能に使用される。さらに、本明細書で使用する場合、本発明のポリペプチドバリアントをコードする核酸は、この核酸配列に相補的な核酸配列を含むように定義される。
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味する。これは、コード領域の前後（リーダー及びトレーラー）の領域、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含み得る。
「単離された」という用語は、核酸またはタンパク質に適用されるとき、核酸またはタンパク質が、それが天然状態で会合する他の細胞構成要素を本質的に含まないことを意味する。好ましくは均質な状態であるが、乾燥溶液または水溶液のいずれであってもよい。純度及び均質性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技法を使用して決定される。調製物中に存在する主な種であるタンパク質は、実質的に精製される。特に、単離された遺伝子は、遺伝子に隣接し、目的の遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドを生じることを意味する。具体的には、それは、核酸またはタンパク質が少なくとも８５％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、最も好ましくは少なくとも９９％純粋であることを意味する。単離された核酸は発現ベクターの構成要素であり得る。
典型的には、本発明の単離されたポリペプチドは、好ましくは範囲として表される純度レベルを有する。ポリペプチドの純度範囲の下端は、約６０％、約７０％、または約８０％であり、純度範囲の上端は、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約９５％超である。ポリペプチドが約９０％超純粋である場合、その純度もまた好ましくは範囲として表される。純度範囲の下端は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％、または約９８％である。純度範囲の上端は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％、または約１００％の純度である。
純度は、任意の当技術分野で認識される分析方法（例えば、銀染色ゲル上のバンド強度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、質量分析、または同様の手段）によって決定される。
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、及びＯ－ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合するα炭素と同じ塩基性化学構造を有する化合物を指す。そのような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ塩基性化学構造を保持する。「アミノ酸模倣物」は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する化学化合物を指す。
「親水性アミノ酸」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５－１４２の正規化されたコンセンサス疎水性スケールに従って、０未満の疎水性を示すアミノ酸を指す。遺伝的にコードされた親水性アミノ酸には、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、及びＡｒｇ（Ｒ）が含まれる。
「酸性アミノ酸」は、７未満の側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を指す。酸性アミノ酸は、典型的には、水素イオンの喪失に起因して、生理学的ｐＨで負に荷電した側鎖を有する。遺伝的にコードされた酸性アミノ酸には、Ｇｌｕ（Ｅ）及びＡｓｐ（Ｄ）が含まれる。
「塩基性アミノ酸」は、７を超える側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を指す。塩基性アミノ酸は、典型的には、ヒドロニウムイオンとの会合に起因して、生理学的ｐＨで正に荷電した側鎖を有する。遺伝的にコードされた塩基性アミノ酸には、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ａｒｇ（Ｒ）、及びＬｙｓ（Ｋ）が含まれる。
「極性アミノ酸」は、生理学的ｐＨに荷電されていないが、２つの原子によって共有される電子対が原子のうちの１つによってより密接に保持される少なくとも１つの結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸を指す。遺伝的にコードされた極性アミノ酸には、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、及びＴｈｒ（Ｔ）が含まれる。
「疎水性アミノ酸」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，１９８４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５－１４２の正規化されたコンセンサス疎水性スケールに従って、０を超える疎水性を示すアミノ酸を指す。例示的な疎水性アミノ酸としては、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、及びプロリン類似体が挙げられる。
「芳香族アミノ酸」は、少なくとも１つの芳香族環または芳香族複素環を有する側鎖を有する疎水性アミノ酸を指す。芳香族環または芳香族複素環は、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＣＮ、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－ＮＯ２、－ＮＯ、－ＮＨ２、－ＮＨＲ、－ＮＲＲ、－Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、－Ｃ（Ｏ）ＮＲＲなどの１つ以上の置換基を含有し得、式中、各Ｒは、独立して、（Ｃｌ－Ｃ６）アルキル、置換された（Ｃｌ－Ｃ６）アルキル、（Ｃｌ－Ｃ６）アルケニル、置換された（Ｃｌ－Ｃ６）アルケニル、（Ｃｌ－Ｃ６）アルキニル、置換された（Ｃｌ－Ｃ６）アルキニル、（Ｃｌ－Ｃ６）アリール、置換された（Ｃ５－Ｃ２０）アリール、（Ｃ６－Ｃ２６）アルカリル、置換された（Ｃ６－Ｃ２６）アルカリル、５～２０員ヘテロアリール、置換された５～２０員ヘテロアリール、６～２６員アルキヘテロアリール、または置換された６～２６員アルキヘテロアリールである。遺伝的にコードされた芳香族アミノ酸には、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、及びＴｒｐ（Ｗ）が含まれる。
「非極性アミノ酸」は、生理学的ｐＨに荷電されておらず、２つの原子によって共有される電子対が一般に２つの原子の各々によって等しく保持される結合を有する側鎖を有する（すなわち、側鎖は極性ではない）疎水性アミノ酸を指す。遺伝的にコードされた非極性アミノ酸には、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、及びＡｌａ（Ａ）が含まれる。
「脂肪族アミノ酸」は、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸を指す。遺伝的にコードされた脂肪族アミノ酸には、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、及びＩｌｅ（Ｉ）が含まれる。
アミノ酸残基Ｃｙｓ（Ｃ）は、他のＣｙｓ（Ｃ）残基または他のスルホニル含有アミノ酸とジスルフィド架橋を形成することができるという点で珍しい。還元された遊離ＳＨまたは酸化ジスルフィド架橋形態のいずれかでペプチド中に存在するＣｙｓ（Ｃ）残基（及び－ＳＨ含有側鎖を有する他のアミノ酸）の能力は、Ｃｙｓ（Ｃ）残基がペプチドに正味の疎水性または親水性の特性を寄与するかどうかに影響を及ぼす。Ｃｙｓ（Ｃ）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，１９８４、上記）の正規化されたコンセンサススケールに従って０．２９の疎水性を示すが、本発明の目的のために、Ｃｙｓ（Ｃ）は、上記に定義される一般的な分類にかかわらず、極性親水性アミノ酸として分類されることを理解されたい。
「リンカー」という用語は、２つ以上のポリペプチドを共有結合するアミノ酸ポリペプチドスペーサーを指す。リンカーは、１～１５のアミノ酸残基であり得る。好ましくは、リンカーは、単一のシステイン残基である。リンカーはまた、アミノ酸配列番号２４：ＫＥＳＣＡＫＫＱＲＱＨＭＤＳを有し得る。
当業者には理解されるように、上記に定義されたカテゴリーは、相互排他的ではない。したがって、２つ以上の物理化学的特性を示す側鎖を有するアミノ酸は、複数のカテゴリーに含まれ得る。例えば、Ｔｙｒ（Ｙ）などの極性置換基でさらに置換されている芳香族部分を有するアミノ酸側鎖は、芳香族疎水性及び極性または親水性の両方を示し得、したがって、芳香族及び極性の両方のカテゴリーに含まれ得る。任意のアミノ酸の適切な分類は、特に本明細書に提供される詳細な開示に照らして、当業者には明らかであろう。
「ヘリックス破壊」アミノ酸と呼ばれるある特定のアミノ酸残基は、ヘリックス内の内部位置に含有される場合、αヘリックスの構造を破壊する傾向がある。そのようなヘリックス破壊特性を示すアミノ酸残基は、当該技術分野において周知であり（例えば、Ｃｈｏｕ ａｎｄ Ｆａｓｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１－２７６を参照されたい）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、及び潜在的にすべてのＤ－アミノ酸（Ｌ－ペプチドに含有される場合、逆にＬ－アミノ酸はＤ－ペプチドに含有される場合、ヘリックス構造を破壊する）、ならびにプロリン類似体を含む。これらのヘリックス破壊アミノ酸残基は、Ｇｌｙ（Ｇ）（以下に論じられる）を除いて、上記に定義されるカテゴリーに属するが、これらの残基は、ヘリックス内の内部位置でアミノ酸残基を置換するために使用されるべきではなく、それらは、ペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端で１～３つのアミノ酸残基を置換するためにのみ使用されるべきである。
上記に定義されるカテゴリーは、遺伝的にコードされたアミノ酸に関して例示されているが、アミノ酸置換は、遺伝的にコードされたアミノ酸に限定される必要はなく、ある特定の実施形態では、好ましくは限定されない。実際に、式（Ｉ）の好ましいペプチドの多くは、遺伝的にコードされていないアミノ酸を含有する。したがって、天然に存在する遺伝的にコードされたアミノ酸に加えて、式（Ｉ）のコアペプチドのアミノ酸残基は、天然に存在するコードされていないアミノ酸及び合成アミノ酸で置換され得る。
式（Ｉ）のコアペプチドの有用な置換を提供するある特定の一般的に遭遇するアミノ酸としては、β－アラニン（β－Ａｌａ）及び他のオメガ－アミノ酸、例えば、３－アミノプロピオン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、４－アミノ酪酸など；α－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε－アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ－アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ－メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ－ブチルアラニン（ｔ－ＢｕＡ）；ｔ－ブチルグリシン（ｔ－ＢｕＧ）；Ｎ－メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ナフチルアラニン（Ｎａｌ）；４－クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４－Ｃｌ））；２－フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（２－Ｆ））；３－フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３－Ｆ））；４－フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４－Ｆ））；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１／２／３／４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸（Ｔｉｃ）；β－２－チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ－アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）；２，４－ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，３－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；ｐ－アミノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（ｐＮＨ２））；Ｎ－メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）；ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）及びホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、ホモプロリン（ｈＰｒｏ）、Ｎ－メチル化アミノ酸及びペプトイド（Ｎ－置換グリシン）が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のコアペプチドのアミノ酸プロリンは、アゼチジン－２－カルボキシレート（Ａ２Ｃ）、Ｌ－チアゾリジン－４－カルボン酸、シス－４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン（ＣＨＰ）、３，４－デヒドロプロリン、チオプロリン、及びイソニペコチン酸（Ｉｎｐ）を含むがこれらに限定されない、プロリン類似体で実証される。
アミノ酸は、本明細書において、一般に知られている３文字記号またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学的命名委員会（ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨される１文字記号のいずれかによって参照され得る。ヌクレオチドは、同様に、それらの一般的に受け入れられている１文字コードによって参照され得る。
アミノ酸配列に関して、コード配列中の単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変更、付加、または欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、または付加は、「保存的に修飾されたバリアント」であり、その変更は、アミノ酸を化学的に類似するアミノ酸で置換することによりもたらされることを当業者は認識するであろう。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野で周知である。そのような保存的に修飾されたバリアントは、本発明の多型バリアント、種間相同体、及び対立遺伝子に加えられ、これらを除外しない。
以下の８つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照されたい）。
アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズ等の相対的類似性に基づく。前述の特徴のうちの１つ以上を考慮した例示的な置換は、当業者に周知であり、以下を含むが、これらに限定されない（元の残基：例示的な置換）： （Ａｌａ： Ｇｌｙ、Ｓｅｒ ）、（Ａｒｇ： Ｌｙｓ）、（Ａｓｎ：Ｇｌｎ、Ｈｉｓ）、（Ａｓｐ： Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ）、（Ｇｌｎ： Ａｓｎ）、（Ｇｌｕ：Ａｓｐ）、（Ｇｌｙ： Ａｌａ）、（Ｈｉｓ： Ａｓｎ、Ｇｌｎ ）、（Ｉｌｅ： Ｌｅｕ、Ｖａｌ）、（Ｌｅｕ：Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、（Ｌｙｓ： Ａｒｇ）、（Ｍｅｔ： Ｌｅｕ， Ｔｙｒ）、（Ｓｅｒ： Ｔｈｒ）、（Ｔｈｒ：Ｓｅｒ）、（Ｔｉｐ： Ｔｙｒ）、（Ｔｙｒ：Ｔｒｐ、Ｐｈｅ ）、及び（Ｖａｌ： Ｉｌｅ、Ｌｅｕ）。したがって、本開示の実施形態は、上述のポリペプチドまたはタンパク質の機能的もしくは生物学的等価物を考慮する。特に、本発明の実施形態は、親ポリペプチドと約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び９５％の配列同一性を有するバリアントを提供する。様々な実施形態では、本発明は、親ポリペプチド配列の一部、例えば、野生型ＨＧＦ（配列番号８）を含む、例えば、野生型増殖因子とこのレベルの同一性を有するバリアントを提供する。様々な実施形態では、バリアントは、本明細書に定義される親ポリペプチドまたは親ポリペプチド配列の一部、例えば、野生型ＨＧＦ（配列番号８）を含む、例えば、野生型増殖因子と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
「保存的に修飾されたバリアント」は、アミノ酸配列及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に修飾されたバリアント」は、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードするそれらの核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸は、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、及びＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって指定されるすべての位置において、コードされたポリペプチドを変更することなく、コドンを記載される対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸変異は、保存的に修飾された変異の１つの種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書のすべての核酸配列は、核酸のすべての可能なサイレント変異も記載する。当業者は、核酸中の各コドン（通常はメチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常はトリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が修飾されて、機能的に同一の分子を得ることができることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、各記載の配列において暗示的である。
「同一性」は、当該技術分野で知られているように、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチドまたはタンパク質配列間の関係である。当該技術分野において、「同一性」はまた、そのような配列の列間の一致によって決定される、ポリペプチドまたはタンパク質間の配列相関性の程度を指す。「同一性」は、既知の生体情報方法によって容易に計算することができる。
「ペプチド」は、単量体がアミノ酸であり、アミド結合を介して一緒に連結されるポリマーを指す。本発明のペプチドは、サイズが、例えば、２つのアミノ酸から数百または数千のアミノ酸まで変動し得る。より大きなペプチド（例えば、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、または少なくとも５０のアミノ酸残基）は、代替的に、「ポリペプチド」または「タンパク質」と称される。加えて、非天然アミノ酸、例えば、β－アラニン、フェニルグリシン、ホモアルギニン、及びホモフェニルアラニンも含まれる。遺伝的にコードされていないアミノ酸もまた、本発明において使用され得る。さらに、反応性基、グリコシル化配列、ポリマー、治療部分、生体分子などを含むように修飾されたアミノ酸も、本発明で使用され得る。本発明で使用されるアミノ酸のすべては、ＤまたはＬ異性体のいずれであってもよい。Ｌ異性体が一般に好ましい。加えて、他のペプチド模倣物も本発明において有用である。本明細書で使用する場合、「ペプチド」または「ポリペプチド」は、グリコシル化及び非グリコシル化ペプチドまたは「ポリペプチド」の両方を指す。ポリペプチドを発現する系によって不完全にグリコシル化されるポリペプチドも含まれる。一般的な考察については、Ｓｐａｔｏｌａ， Ａ． Ｆ．，ｉｎ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ，ＰＥＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）を参照されたい。
本出願では、アミノ酸残基は、「１」と番号付けされるポリペプチドのＮ末端アミノ酸（例えば、Ｎ末端メチオニン）からのそれらの相対位置に従って（典型的には上付き文字で）番号付けされる。Ｎ末端アミノ酸は、「１」と番号付けされたメチオニン（Ｍ）であり得る。各アミノ酸残基に関連する番号は、ポリペプチドのＮ末端がメチオニンなしで開始する場合、Ｎ末端メチオニンの不在を反映するように容易に調整することができる。例示的なポリペプチドのＮ末端は、メチオニンの有無にかかわらず開始することができることが理解される。したがって、アミノ酸リンカーが野生型ポリペプチドのＮ末端に付加される場合では、Ｎ末端アミノ酸に隣接する第１のリンカーアミノ酸は、番号－１などである。例えば、リンカーがアミノ酸配列ＫＥＳＣＡＫＫＱＲＱＨＭＤＳ（配列番号２）を有し、Ｓ残基が野生型ポリペプチドのＮ末端アミノ酸に隣接している場合、最もＮ末端のリンカーアミノ酸Ｋは－１４であり、最もＣ末端のリンカーアミノ酸Ｓは－１である。このようにして、野生型ポリペプチド及びリンカー結合野生型ポリペプチドにおけるアミノ酸の番号付けが保存される。
「親ポリペプチド」という用語は、野生型ポリペプチドを指し、野生型ポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、公的にアクセス可能なタンパク質データベース（例えば、ＥＭＢＬヌクレオチド配列データベース、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ、ＥｘＰａｓｙ、タンパク質データバンクなど）の一部である。
「変異ポリペプチド」または「ポリペプチドバリアント」または「ムテイン」または「バリアントポリペプチド」という用語は、ポリペプチドの形態を指し、そのアミノ酸配列は、その対応する野生型（親）形態、天然に存在する形態、または任意の他の親形態のアミノ酸配列とは異なる。変異ポリペプチドは、変異ポリペプチドをもたらす１つ以上の変異、例えば、置換、挿入、欠失等を含有し得る。
「親ポリペプチドに対応する」という用語（またはこの用語の文法的変形）は、本発明のポリペプチドを説明するために使用され、ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくともアミノ酸変異の存在によってのみ対応する親ポリペプチドのアミノ酸配列と異なる。典型的には、バリアントポリペプチド及び親ポリペプチドのアミノ酸配列は、高い割合の同一性を示す。一例では、「親ポリペプチドに対応する」とは、バリアントポリペプチドのアミノ酸配列が、親ポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の同一性を有することを意味する。別の例では、バリアントポリペプチドをコードする核酸配列は、親ポリペプチドをコードする核酸配列に対して少なくとも約５０％の同一性、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、親ポリペプチドは、配列番号２３のＮＫ１ホモ二量体に対応する。いくつかの実施形態では、親ポリペプチドは、配列番号２５のＮＫ１ホモ二量体に対応する。いくつかの実施形態では、親ポリペプチドは、配列番号２６のＮＫ１ホモ二量体に対応する。いくつかの実施形態では、親ポリペプチドは、配列番号２７のＮＫ１ホモ二量体に対応する。いくつかの実施形態では、親ポリペプチドは、配列番号２８のＮＫ１ホモ二量体に対応する。いくつかの実施形態では、親ポリペプチドは、配列番号２９のＮＫ１ホモ二量体に対応する。いくつかの実施形態では、親ポリペプチドは、配列番号３０のＮＫ１ホモ二量体に対応する。
「親ポリペプチドに変異を導入する（または付加する等）」という用語（またはその文法的変形）、または変異を含むように「親ポリペプチドを修飾する」（またはその文法的変形）は、親ポリペプチドがそのような変換のための物理的出発材料であることを必ずしも意味するわけではなく、むしろ親ポリペプチドがバリアントポリペプチドを作製するための誘導アミノ酸配列を提供することを意味する。一例では、「バリアントを親ポリペプチドに導入すること」は、バリアントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を作製するために、親ポリペプチドの遺伝子が適切な変異により修飾されることを意味する。別の例では、「バリアントを親ポリペプチドに導入すること」は、結果として生じるポリペプチドが、親ポリペプチド配列をガイドとして使用することにより理論的に設計されることを意味する。次いで、設計されたポリペプチドは、化学的または他の手段によって生成され得る。
「ライブラリ」という用語は、それぞれ共通の親ポリペプチドに対応する異なるポリペプチドの集合を指す。ライブラリ内の各ポリペプチド種は、ライブラリのメンバーと称される。好ましくは、本発明のライブラリは、リードポリペプチドを特定する集団を得るのに十分な数及び多様性のポリペプチドの集合を表す。ライブラリは、少なくとも２つの異なるポリペプチドを含む。一実施形態では、ライブラリは、約２～約１００，０００，０００のメンバーを含む。別の実施形態では、ライブラリは、約１０，０００～約１００，０００，０００のメンバーを含む。また別の実施形態では、ライブラリは、約１００，０００～約１００，０００，０００のメンバーを含む。さらなる実施形態では、ライブラリは、約１，０００，０００～約１００，０００，０００のメンバーを含む。別の実施形態では、ライブラリは、約１０，０００，０００～約１００，０００，０００のメンバーを含む。また別の実施形態では、ライブラリは、１００を超えるメンバーを含む。
ライブラリのメンバーは、混合物の一部であり得るか、または互いに単離され得る。一例では、ライブラリのメンバーは、任意選択で他の構成要素を含む混合物の一部である。例えば、少なくとも２つのポリペプチドが細胞培養ブロスの体積中に存在する。別の例では、ライブラリのメンバーはそれぞれ、別個に発現され、任意選択で単離される。単離されたポリペプチドは、任意選択で、各ウェルが異なる種類のポリペプチドを含有するマルチウェル容器に含有され得る。別の例では、ライブラリのメンバーはそれぞれ、酵母もしくは細菌細胞、またはファージもしくはウイルス粒子への融合物として発現される。
本明細書で使用する場合、「ポリマー修飾基」という用語は、少なくとも１つのポリマー部分（ポリマー）を含む修飾基である。ポリペプチドに付加されるポリマー修飾基は、そのようなポリペプチドの特性、例えば、その生物学的利用能、生物学的活性、または体内でのその半減期を変更することができる。例示的なポリマーとしては、水溶性及び水不溶性ポリマーが挙げられる。ポリマー修飾基は、直鎖状または分枝状であり得、ポリ（アルキレングリコール）及びその誘導体などの１つ以上の独立して選択されるポリマー部分を含み得る。一例では、ポリマーは非天然に存在する。例示的な実施形態では、ポリマー修飾基は、水溶性ポリマー、例えば、ポリ（エチレングリコール）及びその誘導体（ＰＥＧ、ｍ－ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）及びその誘導体（ＰＰＧ、ｍ－ＰＰＧ）などを含む。好ましい実施形態では、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（プロピレングリコール）は、本質的に均一分散（ｈｏｍｏｄｉｓｐｅｒｓｅ）である分子量を有する。一実施形態では、ポリマー修飾基は、天然に存在する多糖ではない。
本明細書で使用する場合、「標的化部分」という用語は、身体の特定の組織または領域に選択的に局在する種を指す。局在性は、分子決定基、標的化剤またはコンジュゲートの分子サイズ、イオン相互作用、疎水性相互作用などの特異的認識によって媒介される。当業者には、薬剤を特定の組織または領域に標的化する他の機序が知られている。例示的な標的化部分としては、抗体、抗体断片、トランスフェリン、ＨＳ－糖タンパク質、凝固因子、血清タンパク質、β－糖タンパク質、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＥＰＯなどが挙げられる。
本明細書で使用する場合、「Ｆｃ融合タンパク質」という用語は、本明細書で「Ｆｃ部分」と呼ばれる免疫グロブリン由来部分と、疾患の治療が意図されるか否かにかかわらず、本明細書で「治療部分」と呼ばれる第２の非免疫グロブリンタンパク質に由来する部分とを含むタンパク質、特に治療用タンパク質を包含することを意味する。
本明細書で使用する場合、「治療部分」は、抗生物質、抗炎症剤、抗腫瘍薬、細胞毒素、及び放射性剤を含むがこれらに限定されない、療法に有用な任意の薬剤を意味する。「治療部分」は、２つ以上の治療部分が担体、例えば、多価薬剤に結合する構築物である、生体活性剤のプロドラッグを含む。
治療部分はまた、タンパク質及びタンパク質を含む構築物も含む。
本明細書で使用する場合、「抗腫瘍薬」は、を含む、がんに対抗するのに有用な任意の薬剤を意味する。
本明細書で使用する場合、「細胞毒素または細胞傷害性薬」は、細胞に有害な任意の薬剤を意味する。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルキシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルコルコルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、ならびにそれらの類似体または相同体が挙げられる。他の毒素としては、例えば、リシン、ＣＣ－１０６５、及び類似体、デュオカルマイシンが挙げられる。さらに他の毒素としては、ジフテリア毒素、及び蛇毒（例えば、コブラ毒）が挙げられる。
本明細書で使用する場合、「放射性剤」は、腫瘍の診断または破壊に有効な任意の放射性同位体を含む。例としては、インジウム－１１１、コバルト－６０、フッ素－１８、銅－６４、銅－６７、ルテチウム－１７７、またはテクニシウム－９９ｍが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、放射性同位体の混合物を典型的に表すウラン、ラジウム、及びトリウムなどの天然に存在する放射性元素は、放射性剤の好適な例である。金属イオンは、典型的には、有機キレート部分とキレートされる。放射性剤または放射性核種は、造影剤の構成要素であり得る。
近赤外線色素は、光学撮像用途のための標準的な化学を使用してコンジュゲートすることもできる。「近赤外線」は、可視光に関連するその部分に隣接する電磁スペクトルの部分、例えば約０．７μｍ～約１μｍの放射線を指す。近赤外線色素としては、例えば、Ｃｙ５．５などのシアニンまたはインドシアニン誘導体を挙げることができる。赤外線色素はまた、ホスホラミダイト色素、例えば、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００（ＬＩ－ＣＯＲ（登録商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｃｎｅｓ）を含み得る。
多くの有用なキレート基、クラウンエーテル、クリプタン等が当該技術分野で既知であり、本発明の化合物に組み込まれ得る（例えば、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＮＴＡ、ＨＤＴＡ等、及びそれらのホスホネート類似体、例えば、ＤＴＰＰ、ＥＤＴＰ、ＨＤＴＰ、ＮＴＰ等）。例えば、 Ｐｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｒｏｎ Ｏｖｅｒｌｏａｄ，”Ｉｎ， ＩＮＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＩＮ ＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＥＤＩＣＩＮＥ； Ｍａｒｔｅｌｌ， Ｅｄ．；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．， １９８０，ｐｐ．２７９－３１２、Ｌｉｎｄｏｙ，ＴＨＥ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＭＡＣＲＯＣＹＣＬＩＣ ＬＩＧＡＮＤ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９８９、Ｄｕｇａｓ，ＢＩＯＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９、及びそれらに含まれる参照文献を参照されたい。さらに、キレート剤、クラウンエーテル、及びシクロデキストリンの他の分子への結合を可能にする多様な経路が当業者に利用可能である。例えば、Ｍｅａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｃｈｅｌａｔｅ－Ｔａｇｇｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．”Ｉｎ，ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ： ＦＯＯＤ，ＮＵＴＲＩＴＩＯＮＡＬ，ＡＮＤ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＡＳＰＥＣＴＳ；”、Ｆｅｅｎｅｙ， ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８２，ｐｐ．３７０－３８７、Ｋａｓｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，９：１０８－１１７（１９９８）、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，８：２４９－２５５（１９９７）を参照されたい。これらの金属結合剤を使用して、撮像法で検出可能な金属イオンを結合することができる。
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、コンジュゲートと組み合わせたときに、コンジュゲートの活性を保持し、対象の免疫系と非反応性である任意の材料を含む。「薬学的に許容される担体」には、固体及び液体、例えば、ビヒクル、希釈剤、及び溶媒が含まれる。例としては、標準的な薬学的担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルション、例えば、油／水エマルション、及び様々な種類の湿潤剤のうちの任意のものが挙げられるが、これらに限定されない。他の担体はまた、滅菌溶液、コーティングされた錠剤を含む錠剤、及びカプセルを含み得る。典型的には、そのような担体は、賦形剤、例えば、デンプン、牛乳、糖、ある特定の種類の粘土、ゼラチン、ステアリン酸もしくはその塩、ステアリン酸マグネシウムもしくはカルシウム、タルク、植物性脂肪もしくは油、ガム、グリコール、または他の既知の賦形剤を含有する。そのような担体はまた、風味及び着色添加物または他の成分を含んでもよい。そのような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤化される。
本明細書で使用する場合、「投与すること」は、経口投与、座薬としての投与、局所接触、静脈内、腹腔内、筋肉内、くも膜下腔内、病巣内、もしくは皮下投与、吸入による投与、または対象への徐放性デバイス、例えば、ミニ浸透圧ポンプの移植を意味する。投与は、非経口及び経粘膜（例えば、経口、経鼻、膣、直腸、または経皮）を含む任意の経路、特に吸入によるものである。非経口投与としては、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、皮下、腹腔内、心室内、及び頭蓋内が挙げられる。さらに、注射が腫瘍を治療する、例えば、アポトーシスを誘導する場合、投与は、腫瘍に直接及び／または腫瘍を取り囲む組織に直接行われ得る。他の送達モードとしては、リポソーム製剤、静脈内注入、経皮パッチ等の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
「回復すること」または「回復する」という用語は、症状の軽減、寛解、もしくは減少、または患者の心身の健康の改善などの任意の客観的または主観的パラメータを含む、病理または状態の治療における成功の任意の指標を指す。症状の回復は、客観的または主観的パラメータに基づいてもよく、身体検査及び／または精神科的評価の結果を含む。
「療法」という用語は、疾患にかかりやすいが、疾患の症状をまだ経験していないか、または示さない対象（例えば、ヒト）において疾患または状態が発生するのを予防すること（予防的治療）、疾患を阻害すること（その発症を緩徐または停止させる）、疾患の症状または副作用からの緩和を提供すること（対症治療を含む）、及び疾患を緩和すること（疾患の退縮を引き起こす）を含む、疾患または状態を「治療すること」またはその「治療」を指す。
「有効量」、または「に有効な量」、もしくは「治療有効量」という用語、または任意の文法的に等価な用語は、疾患を治療するために動物またはヒトに投与される場合、その疾患の治療をもたらすのに十分である量を意味する。有効量はまた、例えば、アポトーシス、細胞周期開始、及び／またはシグナル伝達を含む、細胞応答を引き起こすのに必要な量を指し得る。
「薬学的に許容される塩」という用語は、本明細書に記載の化合物で見られる特定の置換基に応じて、比較的非毒性の酸または塩基で調製される活性化合物の塩を含む。本発明の化合物が比較的酸性の官能基を含有する場合、塩基付加塩は、そのような化合物の中性形態を、十分な量の所望の塩基と、無溶媒で、または好適な不活性溶媒中で接触させることによって得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩の例としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、もしくはマグネシウム塩、または同様の塩が挙げられる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能基を含有する場合、酸付加塩は、そのような化合物の中性形態を、十分な量の所望の酸と、無溶媒で、または好適な不活性溶媒中で接触させることによって得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、またはリン酸等の無機酸、ならびに酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸等の比較的非毒性の有機酸に由来する塩が挙げられる。また、アルギニン酸等のアミノ酸の塩、及びグルクロン酸またはガラクツロン酸等の有機酸の塩も含まれる（例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ６６：１－１９（１９７７）を参照されたい）。本発明のある特定の具体的な化合物は、化合物を塩基または酸付加塩のいずれかに変換することを可能にする塩基性官能基及び酸性官能基の両方を含有する。
化合物の中性形態は、塩を塩基または酸と接触させ、従来の方法で親化合物を単離することによって再生されることが好ましい。化合物の親形態は、極性溶媒中の溶解度などのある特定の物理的特性において様々な塩形態とは異なるが、そうでなければ、塩は、本発明の目的のための化合物の親形態と同等である。
本発明の化合物は、そのような化合物を構成する原子のうちの１つ以上において、不自然な割合の原子同位体も含有し得る。例えば、化合物は、放射性同位体、例えば、トリチウム（３Ｈ）、ヨウ素－１２５（１２５Ｉ）または炭素－１４（１４Ｃ）で放射標識され得る。放射性であるか否かにかかわらず、本発明の化合物のすべての同位体変化は、本発明の範囲内に包含されることが意図される。
本明細書で使用する場合、「反応性官能基」は、オレフィン、アセチレン、アルコール、フェノール、エーテル、酸化物、ハロゲン化物、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、シアネート、イソシアネート、チオシアネート、イソチオシアネート、アミン、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドラジド、ジアゾ、ジアゾニウム、ニトロ、ニトリル、メルカプタン、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、アセタール、ケタール、無水物、硫酸、スルフェニン酸イソニトリル、アミジン、イミド、イミデート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、亜硫酸、エナミン、イナミン、尿素、シュードウレア（ｐｓｅｕｄｏｕｒｅａ）、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバメート、イミン、アジド、アゾ化合物、アゾキシ化合物、及びニトロソ化合物を含むがこれらに限定されない基を指す。反応性官能基には、バイオコンジュゲート、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミド等を調製するために使用されるものも含まれる。これらの官能基のそれぞれを調製するための方法は、当該技術分野で周知であり、特定の目的のためのそれらの適用または修飾は、当業者の能力の範囲内である（例えば、Ｓａｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｏ， ｅｄｓ．ＯＲＧＡＮＩＣ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＧＲＯＵＰ ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９８９を参照されたい）。
ＩＩＩ．ＨＦＧバリアント
いくつかの実施形態では、バリアントは、野生型増殖因子と比較してタンパク質分解的に安定したバリアントである。例示的な実施形態では、バリアントは、野生型と比較して、増加したタンパク質分解安定性を示す。いくつかの実施形態では、バリアントは、野生型増殖因子の任意のバリアントである。いくつかの実施形態では、バリアントは、野生型増殖因子が結合する増殖因子受容体のアンタゴニストである。
本発明は、このアミノ酸が親ｈＨＧＦポリペプチド（野生型）に見られない少なくとも１つの位置に少なくとも１つのアミノ酸を含むｈＨＧＦポリペプチドを提供する。本発明は、アイソフォーム１及び３を含むが、これらに限定されない、ｈＨＧＦのすべてのアイソフォームのバリアントを包含する。アイソフォーム３（ＮＣＢＩ受託ＮＰ＿００１０１０９３２）は、以下の配列番号８（アイソフォーム１）において下線で示される５つのアミノ酸欠失（ＳＦＬＰＳ）を含む。
例示的な実施形態では、本発明は、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する配列番号９のＨＧＦバリアントを提供する。
例示的な実施形態では、バリアントは、単離されたバリアントである。さらに、様々な実施形態では、バリアントは、本ポリペプチド中に存在しない少なくとも１つの望ましい特徴を示す。例示的な特徴としては、Ｍｅｔ受容体に対する親和性の増加、熱安定性の増加、立体配座柔軟性の増加または減少、及びＭｅｔ受容体に対する増加したアゴニストまたはアンタゴニスト活性が挙げられるが、これらに限定されない。当業者に理解されるように、バリアントは、これらの改善された特徴のうちの２つ以上の任意の組み合わせを示し得る。
例示的な実施形態では、ポリペプチドバリアントは、Ｍｅｔ受容体のアンタゴニストである。様々な実施形態では、バリアントは、Ｍｅｔ受容体のアゴニストである。
例示的な実施形態では、本発明は、配列番号９から選択されるメンバーである配列を有するｈＨＧＦポリペプチドバリアントを提供する。
例示的な親ポリペプチドは、野生型ＨＧＦアイソフォーム１（ＨＧＦ ＮＣＢＩ受託ＮＰ＿０００５９２）（配列番号８）である。
Figure 2022531191000001
配列番号８において、シグナルペプチドは、アミノ酸１～３１を含む。Ｎ末端ドメインは、アミノ酸３９～１２２を含む。クリングル１ドメインはアミノ酸１２６～２０７を含み、クリングル２はアミノ酸２０８～２８９を含み、クリングル３はアミノ酸３０２～３８４を含み、クリングル４はアミノ酸３８８～４７０を含む。セリンプロテアーゼ様ドメインは、４９５～７１９を含む。
例示的な実施形態では、本発明のバリアントは、親ポリペプチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する。様々な実施形態では、本発明のバリアントは、親ポリペプチドと少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．６％、または少なくとも約９９．８％の配列同一性を有する。
例示的な実施形態では、変異される配列番号９の位置は、６２、６４、７７、９５、１２５、１２７、１３０、１３２、１３７、１４２、１４８、１５４、１７０、１７３、及び１９３のうちの１つ以上を含む。当業者が認識するように、これらの位置の任意の組み合わせを変異させることができる。様々な実施形態では、アイソフォーム３の類似位置が変異される。
ＭＷＶＴＫＬＬＰＡＬＬＬＱＨＶＬＬＨＬＬＬＬＰＩＡＩＰＹＡＥＧＱＲＫＲＲＮＴＩＨＥＦＫＫＳＡＫＴＴＬＩＫＩＤＰＡＬＫＩＫ
ＴＥＫＡＮＴＡＤＱＣＡＮＲＣＩＲＮＫＧＬＰＦＴＣＫＡＦＶＦＤＫＡＲＫＲＣＬＷＦＰＶＮＳＭＳＳＧＶＫＫＥＦＧＨＥＦＤＬＹＥ
ＮＫＤＹＴＲＮＣＩＶＧＮＧＲＳＹＲＧＴＶＳＴＴＫＳＧＩＫＣＱＰＷＳＡＭＩＰＨＥＨＳＦＬＰＳＳＹＲＧＥＤＬＲＥＮＹＣＲＮＰ
ＲＧＥＥＧＧＰＷＣＹＴＳＤＰＥＶＲＹＥＶＣＤＩＰＱＣＳＥＶＥＣＭＴＣＮＧＥＳＹＲＧＬＭＤＨＴＥＳＧＫＩＣＱＲＷＤＨＱＴＰ
ＨＲＨＫＦＬＰＥＲＹＰＤＫＧＦＤＤＮＹＣＲＮＰＤＧＱＰＲＰＷＣＹＴＬＤＰＨＴＲＷＥＹＣＡＩＫＴＣＡＤＮＴＭＮＤＴＤＶＰＬ
ＥＴＴＥＣＩＱＧＱＧＥＧＹＲＧＴＶＮＴＩＷＮＧＩＰＣＱＲＷＤＳＱＹＰＨＥＨＤＭＴＰＥＮＦＫＣＫＤＬＲＥＮＹＣＲＮＰＤＧＳ
ＥＳＰＷＣＦＴＴＤＰＮＩＲＶＧＹＣＳＱＩＰＮＣＤＭＳＨＧＱＤＣＹＲＧＮＧＫＮＹＭＧＮＬＳＱＴＲＳＧＬＴＣＳＭＷＤＫＮＭＥ
ＤＬＨＲＨＩＦＷＥＰＤＡＳＫＬＮＥＮＹＣＲＮＰＤＤＤＡＨＧＰＷＣＹＴＧＮＰＬＩＰＷＤＹＣＰＩＳＲＣＥＧＤＴＴＰＴＩＶＮＬ
ＤＨＰＶＩＳＣＡＫＴＫＱＬＲＶＶＮＧＩＰＴＲＴＮＩＧＷＭＶＳＬＲＹＲＮＫＨＩＣＧＧＳＬＩＫＥＳＷＶＬＴＡＲＱＣＦＰＳＲＤ
ＬＫＤＹＥＡＷＬＧＩＨＤＶＨＧＲＧＤＥＫＣＫＱＶＬＮＶＳＱＬＶＹＧＰＥＧＳＤＬＶＬＭＫＬＡＲＰＡＶＬＤＤＦＶＳＴＩＤＬＰ
ＮＹＧＣＴＩＰＥＫＴＳＣＳＶＹＧＷＧＹＴＧＬＩＮＹＤＧＬＬＲＶＡＨＬＹＩＭＧＮＥＫＣＳＱＨＨＲＧＫＶＴＬＮＥＳＥＩＣＡＧ
ＡＥＫＩＧＳＧＰＣＥＧＤＹＧＧＰＬＶＣＥＱＨＫＭＲＭＶＬＧＶＩＶＰＧＲＧＣＡＩＰＮＲＰＧＩＦＶＲＶＡＹＹＡＫＷＩＨＫＩＩ
ＬＴＹＫＶＰＱＳ （配列番号９）
例示的な実施形態では、親ポリペプチドのアミノ酸は、Ｋから、Ｅ、Ｎ、及びＲから選択されるメンバーに変更される。例示的な実施形態では、親ポリペプチドのアミノ酸は、ＱからＲに変更される。例示的な実施形態では、親ポリペプチドのアミノ酸は、Ｉから、Ｔ及びＶから選択されるメンバーに変更される。例示的な実施形態では、親ポリペプチドのアミノ酸は、ＮからＤに変更される。いくつかの実施形態では、Ｄは、親ポリペプチドのＮに戻すことができる。
様々な実施形態では、４２位のアミノ酸は、ＦまたはＣである。様々な実施形態では、６２位のアミノ酸は、野生型親ポリペプチドに見られるＫからＥに変化する。様々な実施形態では、６４位は、ＶまたはＡである。様々な実施形態では、７７位は、ＮまたはＳである。様々な実施形態では、９５位のアミノ酸は、ＱまたはＲである。様々な実施形態では、１２５位のアミノ酸は、野生型親ポリペプチドに見られるＩからＴに変化する。様々な実施形態では、１２７位のアミノ酸は、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、またはＡであり得る。様々な実施形態では、１３０位のアミノ酸は、ＩからＶに変化する。様々な実施形態では、１３２位のアミノ酸は、ＫからＮまたはＲに変化する。様々な実施形態では、１３７位のアミノ酸は、ＫまたはＲである。様々な実施形態では、１５４位のアミノ酸は、ＳまたはＡである。様々な実施形態では、１７０位のアミノ酸は、ＫまたはＥである。様々な実施形態では、１７３位のアミノ酸は、ＱまたはＲである。様々な実施形態では、１９３位のアミノ酸は、ＮまたはＤである。様々な実施形態では、４２位のアミノ酸は、ＦまたはＣである。様々な実施形態では、９６位のアミノ酸は、ＣまたはＲである。当業者が理解するように、これらの変化の任意の組み合わせ、ならびに以下の表に記載されるそれらの任意の組み合わせは、本発明のポリペプチドバリアントに存在し得る。
いくつかの実施形態では、ＨＧＦバリアントは、野生型ＨＧＦ（配列番号９）と比較して、Ｋ６２Ｅ、Ｎ１２７Ｄ、Ｋ１７０Ｅ、及びＮ１９３Ｅを含む。いくつかの実施形態では、ＨＧＦバリアントは、野生型ＨＧＦ（配列番号９）と比較してＫ６２Ｅ、Ｑ９５Ｒ、Ｎ１２７Ｄ、Ｋ１３２Ｎ、Ｋ１７０Ｅ、Ｑ１７３Ｒ、及びＮ１９３Ｅを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＧＦバリアントは、野生型ＨＧＦ（配列番号９）と比較して、列挙される位置に以下の特異的アミノ酸を有するコンセンサス配列を含む：Ｋ６２Ｅ、Ｑ９５Ｒ、Ｉ１２５Ｔ、Ｎ１２７Ｄ、Ｉ１３０Ｖ、Ｋ１３２Ｎ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、Ｑ１７３Ｒ、及びＮ１９３Ｅ。
表１、２、及び３は、本明細書に記載のＨＧＦバリアントの例示的な変異を示す。
Figure 2022531191000002
Figure 2022531191000003
Figure 2022531191000004
ａ．コンジュゲート
本発明は、本発明のバリアントと、１つ以上のコンジュゲーションパートナーとのコンジュゲートを提供する。例示的なコンジュゲーションパートナーとしては、ポリマー、標的化剤、治療剤、細胞傷害性薬、キレート剤、及び検出可能な薬剤が挙げられる。当業者は、これらの非限定的な薬剤カテゴリー間に重複があることを認識するであろう。
コンジュゲーションパートナーまたは「修飾基」は、任意のコンジュゲート可能な部分であり得る。例示的な修飾基を以下に論じる。修飾基は、所与のポリペプチドの特性（例えば、生物学的または物理化学的特性）を変更するそれらの能力のために選択され得る。修飾基の使用によって変更され得る例示的なポリペプチドの特性としては、薬物動態学、薬力学、代謝安定性、生体分布、水溶性、親油性、組織標的化能力、及び治療活性プロファイルが挙げられるが、これらに限定されない。修飾基は、診断用途またはインビトロ生物学的アッセイ系で使用するポリペプチドの修飾に有用である。
いくつかの実施形態では、例えば、本明細書に記載されるＨＧＦバリアントを含む増殖因子バリアントが、Ｆｃ部分と組み合わされる。Ｆｃ部分は、好ましくはＩｇＧであるヒトまたは動物免疫グロブリン（Ｉｇ）に由来し得る。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４であり得る（例えば、図３４を参照されたい）。Ｆｃ部分が、免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧの重鎖に由来することも好ましい。より好ましくは、Ｆｃ部分は、免疫グロブリン重鎖定常領域の一部分、例えばドメインなどを含む。そのようなＩｇ定常領域は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインのいずれか、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのＩｇ定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ部分は、少なくともＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。Ｆｃ部分は、ＩｇＧヒンジ領域、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含むことがさらに好ましい。
Figure 2022531191000005
ＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインは、ＩｇＧ１が血清タンパク質のいずれかの中で最も長い血清半減期を有するため、Ｆｃ部分として使用されることが多い。長い血清半減期は、動物研究及び潜在的なヒト治療使用のための望ましいタンパク質の特徴であり得る。加えて、ＩｇＧ１サブクラスは、抗体媒介エフェクター機能を実行する最も強い能力を有する。
融合タンパク質において最も有用であり得る一次エフェクター機能は、ＩｇＧ１抗体が抗体依存性細胞傷害性を媒介する能力である。一方で、これは、主にアンタゴニストとして機能する融合タンパク質にとって望ましくない機能であり得る。ＩｇＧ１サブクラスにおいて抗体定常領域媒介活性に重要ないくつかの特定のアミノ酸残基が特定されている。したがって、これらの特異的アミノ酸の包含または除外は、特異的免疫グロブリン定常領域媒介活性の包含または除外を可能にする。
本発明によると、Ｆｃ部分はまた、エフェクター機能を調節するために修飾され得る。例えば、ＥＵインデックス位置による以下のＦｃ変異（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１）は、Ｆｃ部分がＩｇＧ１：Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ；Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ＋Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ；Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／ＡΔ２３６＋Ａ３２７Ｇ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ；Ｅ３３３Ａ；Ｋ３２２Ａに由来する場合、導入することができる。
さらなるＦｃ変異は、例えば、３３０、３３１、２３４、もしくは２３５、またはそれらの組み合わせから選択されるＥＵインデックス位置での置換であり得る。ＣＨ２ドメインに位置するＥＵインデックス位置２９７におけるアミノ酸置換は、本発明の文脈におけるＦｃ部分にも導入され得、Ｎ結合炭水化物結合の潜在的部位を排除する。ＥＵインデックス位置２２０におけるシステイン残基も置き換えられ得る。
本発明のＦｃ融合タンパク質は、単量体または二量体であり得る。Ｆｃ融合タンパク質はまた、二量体Ｆｃ部分（例えば、２つのジスルフィド架橋ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３構築物の二量体）を含有する「擬似二量体（ｐｓｅｕｄｏ－ｄｉｍｅｒ）」であってもよく、そのうちの１つのみが治療部分に融合される。
Ｆｃ融合タンパク質は、２つの異なる治療部分を含有するヘテロ二量体、または単一の治療部分の２つのコピーを含有するホモ二量体であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される増殖因子バリアント（例えば、ＨＧＦバリアントを含む）のインビボ半減期は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分で増強され得る。ＰＥＧ（ＰＥＧ化）によるポリペプチドの化学修飾は、それらの分子サイズを増加させ、典型的には、表面及び官能基の到達性を低下させ、それらの各々は、ポリペプチドに結合したＰＥＧ部分の数及びサイズに依存する。しばしば、この修飾は、血漿半減期の改善及びタンパク質分解安定性、ならびに免疫原性及び肝取り込みの減少をもたらす（Ｃｈａｆｆｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１６４３－１６５１（１９９２）、Ｐｙａｔａｋ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｃｈｅｍ．Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：１１３－１２７（１９８０））。例えば、インターロイキン－２のＰＥＧ化は、インビボでその抗腫瘍効力を増加させることが報告されており（Ｋａｔｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：１４８７－１４９１ （１９８７））、モノクローナル抗体Ａ７に由来するＦ（ａｂ’）２のＰＥＧ化は、その腫瘍局在性を改善した（Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８：１３８７－１３９４（１９９０））。したがって、別の実施形態では、本発明の方法によってＰＥＧ部分により誘導体化されたポリペプチドのインビボ半減期は、非誘導体化親ポリペプチドのインビボ半減期に対して増加する。
ポリペプチドインビボ半減期の増加は、親ポリペプチドに対して増加パーセントの範囲として最適に表される。パーセント増加の範囲の下端は、約４０％、約６０％、約８０％、約１００％、約１５０％、または約２００％である。範囲の上端は、約６０％、約８０％、約１００％、約１５０％、または約２５０％超である。
多くの水溶性ポリマーは当業者には既知であり、本発明の実施に有用である。「水溶性ポリマー」という用語は、糖類（例えば、デキストラン、アミロース、ヒアルロン酸、ポリ（シアル酸）、ヘパラン、ヘパリン等）；ポリ（アミノ酸）、例えば、ポリ（アスパラギン酸）、及びポリ（グルタミン酸）；核酸；合成ポリマー（例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エーテル）、例えば、ポリ（エチレングリコール）；ペプチド、タンパク質等の種を包含する。本発明は、ポリマーが、コンジュゲートの残りが結合され得る点を含まなければならないという唯一の制限を有する任意の水溶性ポリマーで実施することができる。例えば、Ｈａｒｒｉｓ，Ｍａｃｒｏｎｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃ２５：３２５－３７３（１９８５）、Ｓｃｏｕｔｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １３５：３０－６５（１９８７）、Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８６６－８７４（１９９２）、Ｄｅｌｇａｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ９：２４９－３０４（１９９２）、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６：１５０－１６５（１９９５）、及びＢｈａｄｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，５７：５－２９（２００２）．を参照されたい。
別の実施形態では、上に論じられるものと同様に、修飾糖は、水溶性ポリマーではなく水不溶性ポリマーを含む。本発明のコンジュゲートはまた、１つ以上の水不溶性ポリマーを含んでもよい。本発明のこの実施形態は、制御された様式で治療用ポリペプチドを送達するビヒクルとしてのコンジュゲートの使用によって図示される。ポリマー薬物送達系は当該技術分野で既知である。例えば、Ｄｕｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ ＤＲＵＧＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｖｏｌ．４６９，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９９１を参照されたい。当業者は、実質的に任意の既知の薬物送達系が本発明のコンジュゲートに適用可能であることを理解するであろう。
代表的な水不溶性ポリマーとしては、ポリホスファジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリハロゲン化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリグリコライド、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、ポリ（アクリル酸オクタデシル）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、プルロニック、及びポリビニルフェノール、ならびにそれらのコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のコンジュゲートに使用される代表的な生分解性ポリマーとしては、ポリラクチド、ポリグリコライド及びそれらのコポリマー、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド－コ－カプロラクトン）、ポリ（ラクチド－コ－グリコライド）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、それらのブレンド及びコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。特定の使用のものは、ゲルを形成する組成物、例えば、コラーゲン、プルロニック等を含むものである。
例示的な吸収性ポリマーとしては、例えば、ポリ（α－ヒドロキシ－カルボン酸）／ポリ（オキシアルキレン）の合成により生成された吸収性ブロックコポリマーが挙げられる（Ｃｏｈｎ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，８２６，９４５号）。これらのコポリマーは架橋されておらず、本体が分解性ブロックコポリマー組成物を排泄することができるように水溶性である。Ｙｏｕｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２１：１３０１－１３１６（１９８７）及びＣｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２２：９９３－１００９（１９８８）を参照されたい。
ヒドロゲルの構成要素であるポリマーも本発明において有用である。ヒドロゲルは、比較的大量の水を吸収することができるポリマー材料である。ヒドロゲル形成化合物の例としては、ポリアクリル酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリジン、ゼラチン、カラギーナン、及び他の多糖類、ヒドロキシエチレンメタクリル酸（ＨＥＭＡ）、ならびにそれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。安定した、生分解性、及び生体吸収性のヒドロゲルを生成することができる。さらに、ヒドロゲル組成物は、これらの特性のうちの１つ以上を示すサブユニットを含むことができる。
別の実施形態では、ゲルは熱可逆性ゲルである。プルロニック、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、多糖類、ポリウレタンヒドロゲル、ポリウレタン－尿素ヒドロゲルなどの構成要素を含む熱可逆性ゲル、及びそれらの組み合わせが現在好ましい。
さらに別の例示的な実施形態では、本発明のコンジュゲートは、リポソームの構成要素を含む。リポソームは、例えば、１９８５年６月１１日に発行されたＥｐｐｓｔｅｉｎらの米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように、当業者に既知の方法により調製され得る。例えば、リポソーム製剤は、適切な脂質（複数可）（ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリン、及びコレステロールなど）を無機溶媒に溶解し、その後蒸発させ、容器の表面上に乾燥脂質の薄膜を残すことによって調製され得る。次いで、活性化合物またはその薬学的に許容される塩の水溶液を容器中に導入する。次いで、容器を手で旋回させて、容器の側面から脂質材料を遊離し、脂質凝集体を分散させ、それによってリポソーム懸濁液を形成する。
本発明はまた、ポリペプチドが治療部分、診断部分、標的化部分、毒素部分等にコンジュゲートされる上述のものに類似するコンジュゲートを提供する。上に列記される部分のそれぞれは、小分子、天然ポリマー（例えば、ポリペプチド）、または合成ポリマーであり得る。
様々な実施形態では、バリアントは、組織再生のためにマトリックスの構成要素にコンジュゲートされる。例示的なマトリックスは、当該技術分野で既知であり、本発明の増殖因子バリアント（例えば、ＨＧＦバリアントを含む）の適切なマトリックスの選択及び修飾は、当業者の能力の範囲内である。本発明の増殖因子バリアント（例えば、ＨＧＦバリアントを含む）は、一般に、例えば、眼、肝臓、筋肉、神経、及び心臓組織の再生を含む再生医療用途に有用である。
いくつかの実施形態では、本発明は、コンジュゲートの構成要素としての標的化剤の存在に起因して特定の組織において選択的に局在するコンジュゲートを提供する。例示的な実施形態では、標的化剤は、タンパク質である。例示的なタンパク質としては、トランスフェリン（脳、血液プール）、ＨＳ－糖タンパク質（骨、脳、血液プール）、抗体（脳、抗体特異的抗原を有する組織、血液プール）、凝固因子Ｖ～ＸＩＩ（損傷組織、凝血塊、がん、血液プール）、血清タンパク質、例えばα－酸糖タンパク質、フェチュイン、α－胎児タンパク質（脳、血液プール）、β２－糖タンパク質（肝臓、粥状動脈硬化プラーク、脳、血液プール）、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、及びＥＰＯ（免疫刺激、がん、血液プール、赤血球過剰産生、神経保護）、アルブミン（半減期の増加）、ＩＬ－２、及びＩＦＮ－αが挙げられる。
別の実施形態では、本発明は、本発明の増殖因子バリアント（例えば、ＨＧＦバリアントを含む）と治療部分との間にコンジュゲートを提供する。本発明の実施において有用な治療部分としては、様々な薬理活性を有する広範な薬物クラスからの薬物が挙げられる。治療剤及び診断剤を様々な他の種にコンジュゲートする方法は、当業者に周知である。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９６及びＤｕｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ ＤＲＵＧＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｖｏｌ．４６９，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９９１を参照されたい。
有用な治療部分のクラスとしては、例えば、抗悪性腫瘍薬（例えば、抗アンドロゲン（例えば、ロイプロリドまたはフルタミド）、細胞破壊剤（例えば、アドリアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、シクロホスファミド、ブスルファン、シスプラチン、β－２－インターフェロン）、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）、抗代謝物（例えば、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、チオグアニン）が挙げられる。診断と療法の両方のための放射性同位体に基づく薬剤、ならびにコンジュゲートされた毒素、例えば、リシン、ゲルダナマイシン、ミタンシン、ＣＣ－１０６５、デュオカルマイシン、カリケアミシン、ならびにそれらの関連する構造及び類似体もこのクラス内に含まれる。
治療部分はまた、ホルモン（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラジオール、ロイプロリド、メゲストロール、オクトレオチド、またはソマトスタチン）；内分泌調節薬（例えば、避妊薬（例えば、エチノジオール、エチニルエストラジオール、ノルエチンドロン、メストラノール、デソゲストレル、メドロキシプロゲステロン）であり得る。本発明の様々な実施形態に有用なのは、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベステロール）、グルココルチコイド（例えば、トリアムシノロン、ベタメタゾン等）、及びプロゲストゲン、例えば、ノルエチンドロン、エチノジオール、ノルエチンドロン、レボノルゲストレルとのコンジュゲートであり、甲状腺剤（例えば、リオチロニンまたはレボチロキシン）または抗甲状腺剤（例えば、メチマゾール）、抗高プロラクチン血症薬（例えば、カベルゴリン）、ホルモン抑制剤（例えば、ダナゾールまたはゴセレリン）、分娩誘発薬（例えば、メチルエルゴノビンまたはオキシトシン）、ならびにプロスタグランジン、例えば、ミオプロストール、アルプロスタジル、またはジノプロストンも用いることができる。
他の有用な修飾基としては、免疫調節薬（例えば、抗ヒスタミン剤、肥満細胞安定剤、例えば、ロドキサミド及び／またはクロモリン、ステロイド（例えば、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、コルチゾン、デキサメタゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベクロメタゾン、またはクロベタゾール）、ヒスタミンＨ２アンタゴニスト（例えば、ファモチジン、シメチジン、ラニチジン）、免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、シクロスポリン）等が挙げられる。抗炎症活性を有する基、例えば、スリンダク、エトドラク、ケトプロフェン、及びケトロラックも有用である。本発明と併せて使用される他の薬物は、当業者には明らかであろう。
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、反応性アミノ酸と反応性アミノ酸の反応性コンジュゲーションパートナーとの間の反応によって形成される。反応性アミノ酸及び反応性コンジュゲーションパートナーの両方が、それらのフレームワーク内に１つ以上の反応性官能基を含む。２つの結合種のうちの１つは、酵素調節求核置換反応において容易に置換されるか、または代替的に、求核反応パートナー（例えば、スフヒドリル基を担持するアミノ酸部分）を利用する化学反応において置換されるこれらの部分を指す「脱離基」（または活性化基）を含んでもよい。各種類の反応に好適な脱離基を選択することは、当業者の能力の範囲内である。多くの活性化糖が当該技術分野で既知である。例えば、Ｖｏｃａｄｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ ＣＡＲＢＯＨＹＤＲＡＴＥ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．２，Ｅｒｎｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ： Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２０００、Ｋｏｄａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３４：６４１９（１９９３）、Ｌｏｕｇｈｅｅｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３７７１７（１９９９））を参照されたい。
様々な実施形態では、天然に存在するＨＧＦのバリアント（またはあるバリアント）であるアミノ酸置換は、コンジュゲーションパートナー、例えば、側鎖アミノ酸、例えば、システイン、リジン、セリン等の結合のための遺伝子座である。
本発明の実施において有用な反応基及び反応のクラスは、一般に、生体共役化学の分野において周知のものである。現在、反応性糖部分で利用可能な好ましい反応のクラスは、比較的穏やかな条件下で進行するものである。これらには、求核置換（例えば、アミン及びアルコールのアシルハロゲン化物、活性エステルとの反応）、求電子置換（例えば、エナミン反応）、ならびに炭素－炭素及び炭素－ヘテロ原子多重結合への付加（例えば、マイケル反応、ディールス－アルダー付加）が含まれるが、これらに限定されない。これら及び他の有用な反応は、例えば、Ｍａｒｃｈ，ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９６、及びＦｅｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ．１９８，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８２に論じられている。
ｂ．反応性官能基
反応性アミノ酸または反応性コンジュゲーションパートナー上の有用な反応性官能基としては、以下を含むが、それらに限定されない：
（ａ）カルボキシル基、ならびにＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ－ヒドロキシベンズトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ－ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、及び芳香族エステルを含むがこれらに限定されないその様々な誘導体；
（ｂ）例えば、エステル、エーテル、アルデヒド等に変換され得るヒドロキシル基、
（ｃ）ハロゲン化物が、後に、例えば、アミン、カルボキシレートアニオン、チオールアニオン、カルバニオン、またはアルコキシドイオン等の求核基で置換され得、それによって、ハロゲン原子の官能基において新しい基の共有結合をもたらす、ハロアルキル基；
（ｄ）例えば、マレイミド基などのディールス－アルダー反応に関与することができるジエノフィル基；
（ｅ）例えば、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンもしくはオキシムなどのカルボニル誘導体の形成を介して、またはグリニャール付加もしくはアルキルリチウム付加などの機構を介して、後続の誘導体化が可能であるような、アルデヒドまたはケトン基；
（ｆ）例えば、スルホンアミドを形成するための、アミンとの後続反応のための、ハロゲン化スルホニル基；
（ｇ）例えば、ジスルフィドに変換されるか、またはハロゲン化アシルと反応し得る、チオール基；
（ｈ）例えば、アシル化、アルキル化、または酸化され得る、アミンまたはスルフヒドリル基；
（ｉ）例えば、シクロ付加、アシル化、マイケル付加等を受けることができる、アルケン；ならびに
（ｊ）例えば、アミン及びヒドロキシル化合物と反応し得る、エポキシド。
反応性官能基は、反応性糖核または修飾基を組み立てるのに必要な反応に関与しないか、または干渉しないように選択され得る。あるいは、反応性官能基は、保護基の存在によって反応における関与から保護することができる。当業者は、選択された一連の反応条件に干渉しないように特定の官能基を保護する方法を理解する。有用な保護基の例については、例えば、Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１を参照されたい。
ポリペプチド及びコンジュゲーションパートナーを連結する基は、架橋基、例えば、ゼロまたは高次架橋基であってもよい（架橋試薬及び架橋手順の概説については、Ｗｏｌｄ，Ｆ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５：６２３－６５１，１９７２、Ｗｅｅｔａｌｌ，Ｈ．Ｈ．，ａｎｄ Ｃｏｏｎｅｙ，Ｄ．Ａ．，Ｉｎ： ＥＮＺＹＭＥＳ ＡＳ ＤＲＵＧＳ．（Ｈｏｌｃｅｎｂｅｒｇ，ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｄｓ．）ｐｐ．３９５－４４２，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８１、Ｊｉ，Ｔ．Ｈ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９１：５８０－６０９，１９８３、Ｍａｔｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１７：１６７－１８３，１９９３を参照されたく、それらのすべては、参照により本明細書に組み込まれる）。好ましい架橋試薬は、様々なゼロ長、ホモ二官能性、及びヘテロ二官能性架橋試薬に由来する。ゼロ長架橋試薬としては、外因性材料の導入を伴わない２つの内因性化学基の直接コンジュゲーションが挙げられる。ジスルフィド結合の形成を触媒する薬剤は、このカテゴリーに属する。別の例は、カルボキシルと一次アミノ基との縮合を誘導して、カルボジイミド、クロロギ酸エチル、ウッドワード試薬Ｋ（２－エチル－５－フェニルイソオキサゾリウム－３’－スルホネート）、及びカルボニルジイミダゾールなどのアミド結合を形成する試薬である。これらの化学試薬に加えて、酵素トランスグルタミナーゼ（グルタミルペプチドγ－グルタミルトランスフェラーゼ、ＥＣ ２．３．２．１３）がゼロ長架橋試薬として使用され得る。この酵素は、通常は基質として一次アミノ基を用いて、タンパク質結合グルタミニル残基のカルボキサミド基においてアシル転移反応を触媒する。好ましいホモ及びヘテロ二官能性試薬は、それぞれ、アミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、または非特異的基に対して反応性であり得る２つの同一のまたは２つの異なる部位を含有する。
本発明のポリペプチドに結合される例示的なコンジュゲーションパートナーとしては、ＰＥＧ誘導体（例えば、アルキル－ＰＥＧ、アシル－ＰＥＧ、アシル－アルキル－ＰＥＧ、アルキル－アシル－ＰＥＧ、カルバモイル－ＰＥＧ、アリール－ＰＥＧ）、ＰＰＧ誘導体（例えば、アルキル－ＰＰＧ、アシル－ＰＰＧ、アシル－アルキルＰＰＧ、アルキル－アシル－ＰＰＧ カルバモイル－ＰＰＧ、アリール－ＰＰＧ）、治療部分、診断部分、マンノース－６－ホスフェート、ヘパリン、ヘパラン、Ｓｌｅｘ、マンノース、マンノース－６－ホスフェート、シアリルルイスＸ、ＦＧＦ、ＶＦＧＦ、タンパク質、コンドロイチン、ケラタン、デルマタン、アルブミン、インテグリン、分岐型（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）オリゴ糖、ペプチド等が挙げられるが、これらに限定されない。
共有結合に加えて、本発明の増殖因子バリアント（例えば、ＨＧＦバリアントを含む）は、非共有相互作用を介して生体材料の表面上に結合することができる。非共有結合タンパク質組み込みは、例えば、封入または吸収によって行われ得る。本発明のポリペプチドの生体材料への結合は、ヘパリンを介して媒介され得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、Ｈａｒａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９４）９４：６２３－６３０、Ｌａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（１９９９）１８６５－１８７１、及びその中で引用される参照文献に記載されるヘパリン－アルギネートポリマー及びアルギネートに結合される。他の実施形態では、本発明のポリペプチドは、コラーゲンに基づく生体材料に結合される。
ｃ．造影剤
本発明の例示的なコンジュゲートは、本発明のバリアントと検出可能な部分とを含む造影剤であり、これは画像診断法において検出可能である。生体におけるＭｅｔ受容体を特異的に標的とし、患者特異的がん治療及び疾患管理のための腫瘍の非侵襲的特徴付けを可能にする分子撮像プローブが緊急に必要である。非侵襲的撮像を介してＭｅｔ発現腫瘍を検出する能力は、転移リスクの指標としても役立ち得る。
本発明のコンジュゲートが利用される例示的な画像診断法としては、本発明のバリアントに陽電子放射同位体がタグ付けされる陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）が挙げられるが、これに限定されない。典型的な同位体としては、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６２Ｃｕ、１２４Ｉ、７６Ｂｒ、８２Ｒｂ、及び６８Ｇａが挙げられ、１８Ｆが最も臨床的に利用される。バリアントはまた、超音波剤、磁気共鳴造影剤、Ｘ線剤、ＣＴ剤、ガンマカメラシンチグラフィー剤、及び蛍光造影剤に組み込まれ得る。さらなる検出可能な部分及び撮像方法を、以下の方法のセクションに記載する。
例示的な実施形態では、コンジュゲーションパートナーは、選択された条件下で切断される結合を介して本発明のポリペプチドバリアントに結合される。例示的な条件としては、選択されたｐＨ（例えば、胃、腸、細胞内空胞）、活性酵素（例えば、エステラーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ）、光、熱の存在が挙げられるが、これらに限定されない。多くの切断可能な基が当該技術分野で既知である。例えば、Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７６１：１５２－１６２（１９８３）、Ｊｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１４５１８－１４５２５（１９９０）、Ｚａｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２４：９１３－９２０（１９８０）、Ｂｏｕｉｚａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５５：１４１－１４７（１９８６）、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１：２０５－２１０（１９８６）、Ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３：１８５９－１８６７（１９８９）を参照されたい。
ＩＶ．薬学的組成物
例えば、ＨＧＦバリアントを含む本発明の増殖因子バリアント、及びそれらのコンジュゲートは、広範な薬学的用途を有する。
したがって、別の態様では、本発明は、少なくとも１つの本発明のポリペプチドまたはポリペプチドコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、担体、ビヒクル、添加物、またはそれらの組み合わせとを含む、薬学的組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、様々な薬物送達系において使用するのに好適である。本発明で使用される好適な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ， １７ｔｈ ｅｄ．（１９８５）に見出される。薬物送達のための方法の簡単な概説については、Ｌａｎｇｅｒ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３（１９９０）を参照されたい。
薬学的組成物は、例えば、局所、経口、経鼻、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下、または筋肉内投与を含む任意の適切な投与様式用に製剤化され得る。皮下注射などの非経口投与の場合、担体は、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、または緩衝液を含む。経口投与の場合、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、及び炭酸マグネシウムなどの上記担体または固体担体のいずれかが用いられ得る。微粒子（例えば、ポリラクテートポリグリコレート）などの生分解性マトリックスも、本発明の薬学的組成物の担体として用いられ得る。好適な生分解性微粒子は、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号及び同第５，０７５，１０９号に開示されている。
一般に、薬学的組成物は、皮下または非経口的に、例えば静脈内に投与される。したがって、本発明は、許容される担体、好ましくは水性担体、例えば、水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ等に溶解または懸濁された化合物を含む、非経口投与のための組成物を提供する。組成物はまた、Ｔｗｅｅｎ ２０及びＴｗｅｅｎ ８０などの洗剤、マンニトール、ソルビトール、スクロース、及びトレハロースなどの安定剤、ならびにＥＤＴＡ及びメタ－クレゾールなどの防腐剤を含有し得る。組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、張度調整剤、湿潤剤、洗剤等の生理学的条件に近づけるために必要な薬学的に許容される補助物質を含有し得る。
これらの組成物は、従来の滅菌技法によって滅菌され得るか、または滅菌濾過され得る。結果として生じる水溶液は、そのまま使用するためにパッケージ化されるか、または凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的には、３～１１、より好ましくは５～９、最も好ましくは７～８である。
いくつかの実施形態では、本発明のグリコペプチドは、標準的な小胞形成脂質から形成されるリポソームに組み込まれ得る。例えば、Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、及び同第４，８３７，０２８号に記載される、様々な方法がリポソームを調製するのに利用可能である。様々な標的化剤（例えば、本発明のシアリルガラクトシド）を使用するリポソームの標的化は、当該技術分野で周知である（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号及び第４，６０３，０４４号を参照されたい）。
標的化剤をリポソームに結合するための標準的な方法を使用することができる。これらの方法は、一般に、標的化剤の結合のために活性化され得るホスファチジルエタノールアミンなどの脂質構成要素、または本発明の脂質誘導体化グリコペプチドなどの誘導体化親油性化合物のリポソームへの組み込みを伴う。
標的化機序は、一般に、標的化部分が標的、例えば細胞表面受容体との相互作用のために利用可能であるように、標的化剤がリポソームの表面上に配置されることを必要とする。本発明の炭水化物は、リポソームが形成される前に、当業者に既知の方法（例えば、それぞれ、長鎖ハロゲン化アルキルまたは脂肪酸による炭水化物上に存在するヒドロキシル基のアルキル化またはアシル化）を使用して脂質分子に結合され得る。
あるいは、リポソームは、膜を形成するときにコネクタ部分が膜に最初に組み込まれるような方法で作製され得る。コネクタ部分には、膜にしっかりと埋め込まれ、固定された親油性部分が必要である。また、リポソームの水性表面上で化学的に利用可能な反応性部分を有する必要がある。反応性部分は、後に付加される標的化剤または炭水化物と安定した化学結合を形成するのに化学的に好適であるように選択される。いくつかの実施形態では、標的薬剤を直接コネクタ分子に結合させることが可能であるが、ほとんどの場合、化学架橋として作用するための第３の分子を使用することがより好適であり、したがって、膜中にあるコネクタ分子を標的化剤または小胞表面から３次元的に伸長される炭水化物と連結する。
本発明の方法によって調製される、例えばＨＧＦバリアントを含む、増殖因子バリアントはまた、診断試薬として用いられてもよい。例えば、標識された化合物を使用して、炎症を有すると疑われる患者の炎症または腫瘍転移の領域を特定することができる。この使用のために、化合物は、１２５Ｉ、１４Ｃ、またはトリチウムで標識され得る。
Ｖ．核酸
いくつかの実施形態では、本発明は、上述の実施形態のいずれかによる、例えば、ＨＧＦバリアントを含む、増殖因子バリアントをコードする単離された核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、この核酸に相補的な核酸を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された上述の実施形態のいずれかによるポリペプチドバリアントをコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。
ＶＩ．方法
ａ．化学合成
本発明のポリペプチドバリアントは、従来の段階的溶液または固相合成を使用して調製することができる（例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，１９９７，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ Ｆｌｏｒｉｄａ，ａｎｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ｃｉｔｅｄ ｔｈｅｒｅｉｎ；Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ａｔｈｅｒｔｏｎ ＆ Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｅｄｓ．，１９８９，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ、及びその中で引用される参考文献を参照されたい）。
あるいは、本発明のペプチドは、例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３７（７）９３３ ９３６、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：１８８１－１８８７、Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４５：２０９－２１６、Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ ａｎｄ Ｋｅｎｔ，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：２２１－２２５、Ｌｉｕ ａｎｄ Ｔａｍ，１９９４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６（１０）：４１４９－４１５３、Ｌｉｕ ａｎｄ Ｔａｍ，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：６５８４－６５８８、Ｙａｍａｓｈｉｒｏ ａｎｄ Ｌｉ，１９８８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３１：３２２－３３４に記載されるセグメント縮合により調製され得る。セグメント縮合は、内部グリシン残基を含有する実施形態を合成するための特に有用な方法である。本発明のペプチドの合成に有用な他の方法は、Ｎａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０７：７０８７－７０９２に記載されている。
Ｎ及び／またはＣ末端遮断基を含有するポリペプチドバリアントは、有機化学の標準的な技法を使用して調製することができる。例えば、ペプチドのＮ末端をアシル化する、またはペプチドのＣ末端をアミド化もしくはエステル化するための方法は、当該技術分野で周知である。当業者には、Ｎ及び／またはＣ末端に他の修飾を担持するモード、ならびに末端遮断基を結合するために必要であり得る任意の側鎖官能基を保護するモードは明らかであろう。薬学的に許容される塩（対イオン）は、当該技術分野で周知であるように、イオン交換クロマトグラフィーまたは他の方法によって便宜的に調製することができる。
タンデム型多量体の形態である本発明の化合物は、合成の適切なステップでリンカー（複数可）をペプチド鎖に付加することによって、便宜的に合成することができる。あるいは、ヘリックスセグメントを合成し、各セグメントをリンカーと反応させることができる。当然ながら、実際の合成方法はリンカーの組成に依存する。適切な保護スキーム及び化学は周知であり、当業者には明らかであろう。
分岐ネットワークの形態である本発明の化合物は、Ｔａｍ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５４０９－５４１３及びＤｅｍｏｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３９：７４－８４に記載の三量体及び四量体樹脂ならびに化学を使用して便宜的に合成することができる。高次または低次の分岐ネットワークを合成するための、または異なるコアペプチドヘリックスセグメントの組み合わせを含有する合成樹脂の修飾及び戦略は、ペプチド化学及び／または有機化学の当業者の能力の範囲内である。必要に応じて、ジスルフィド結合の形成は、一般に、弱い酸化剤の存在下で行われる。
化学酸化剤が使用され得るか、または化合物を単に大気酸素に曝露してこれらの結合をもたらしてもよい。例えば、Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７９， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ９５５－９５７、Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ、Ａｈｍｅｄ ｅｔ ａｌ．，１９７５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０：８４７７－８４８２、及びＰｅｎｎｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １９９０ １６４－１６６，Ｇｉｒａｌｔ ａｎｄ Ａｎｄｒｅｕ，Ｅｄｓ．，ＥＳＣＯＭ Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓによって記載されるものを含む様々な方法が当該技術分野で既知である。さらなる代替案が、Ｋａｍｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ６３：８９９－９１５によって記載される。固体支持体上で行われる方法は、Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ，１９８５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．２６：９２－９７によって記載される。これらの方法のいずれかを使用して、本発明のペプチドにおいてジスルフィド結合を形成することができる。
ＶＩＩ．ポリペプチドコード配列の取得
ａ．一般組換え技術
本発明のＯ結合グリコシル化配列を組み込むバリアント及び／または変異ポリペプチドの作製は、変異またはポリペプチドの完全な化学合成のいずれかによって、対応する親ポリペプチドのアミノ酸配列を変更することにより達成することができる。ポリペプチドアミノ酸配列は、好ましくは、ＤＮＡレベルでの変化を介して、特に、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を予め選択された塩基で変異させて、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成することによって変更される。ＤＮＡ変異（複数可）は、好ましくは、当該技術分野で既知の方法を使用して作製される。
本発明は、組換え遺伝学の分野における日常的な技法に依存する。本発明の一般的な使用方法を開示する基本的なテキストとしては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄ．２００１）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）が挙げられる。
核酸サイズは、キロベース（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）のいずれかで与えられる。これらは、アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動、配列決定された核酸、または公開されているＤＮＡ配列に由来する推定値である。タンパク質の場合、サイズはキロダルトン（ｋＤａ）またはアミノ酸残基番号で与えられる。タンパク質サイズは、ゲル電気泳動から、配列決定されたタンパク質から、導かれたアミノ酸配列から、または公開されているタンパク質配列から推定される。
市販されていないオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：６１５９－６１６８（１９８４）に記載されるように、自動合成機を使用して、最初に Ｂｅａｕｃａｇｅ ＆ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１８５９－１８６２（１９８１）によって記載された固相ホスホラミダイトトリエステル方法により化学合成され得る。全遺伝子を化学合成することもできる。オリゴヌクレオチドの精製は、当技術分野で認識されている任意の戦略、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｒｅａｎｉｅｒ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．２５５：１３７－１４９（１９８３）に記載されるように、天然アクリルアミドゲル電気泳動または陰イオン交換ＨＰＬＣを使用して行われる。
クローニングした野生型ポリペプチド遺伝子、変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び合成オリゴヌクレオチドの配列は、例えば、Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ，１６：２１－２６（１９８１）の二本鎖テンプレートを配列決定するための連鎖停止方法を使用して、クローニング後に検証され得る。
例示的な実施形態では、ポリヌクレオチドをシャッフルすることによってグリコシル化配列が付加される。候補ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡシャッフルプロトコルを用いて調節することができる。ＤＮＡシャッフルは、関連する遺伝子のプールのランダム断片化、続いてポリメラーゼ連鎖反応様プロセスによる断片の再組み立てによって行われる再帰的組換え及び変異のプロセスである。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１０７４７－１０７５１（１９９４）、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９－３９１（１９９４）、ならびに米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８３７，４５８号、同第５，８３０，７２１号、及び同第５，８１１，２３８号を参照されたい。
ｂ．野生型ペプチドコード配列のクローニング及びサブクローニング
例えば、ヒト成長ホルモン、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ０００５１５、ＮＭ００２０５９、ＮＭ０２２５５６、ＮＭ０２２５５７、ＮＭ０２２５５８、ＮＭ０２２５５９、ＮＭ０２２５６０、ＮＭ０２２５６１、及びＮＭ０２２５６２などの野生型ポリペプチドをコードする多くのポリヌクレオチド配列が決定されており、商業サプライヤーから入手可能である。
ヒトゲノムの研究の急速な進歩により、ヒトＤＮＡ配列データベースが、既知のヌクレオチド配列と一定の割合の配列相同性を有する任意の遺伝子セグメント、例えば、以前に特定されたポリペプチドをコードするものを検索することができるクローニングアプローチが可能になった。そのように特定された任意のＤＮＡ配列は、その後、化学合成及び／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法、例えば、オーバーラップ伸長法によって得ることができる。短い配列については、完全に新規の合成で十分であり得るが、より大きな遺伝子を得るためには、合成プローブを使用したヒトｃＤＮＡまたはゲノムライブラリからの全長コード配列のさらなる単離が必要であり得る。
あるいは、ポリペプチドをコードする核酸配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの標準的なクローニング技法を使用してヒトｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリから単離され得、相同性に基づくプライマーは、多くの場合、ポリペプチドをコードする既知の核酸配列に由来し得る。この目的のために最も一般的に使用される技法は、標準的なテキスト、例えば、上記の Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌに記載されている。
野生型ポリペプチドのコード配列を得るのに好適なｃＤＮＡライブラリは、市販されているか、または構築されてもよい。ｍＲＮＡを単離し、逆転写によりｃＤＮＡを作製し、ｃＤＮＡを組換えベクターにライゲーションし、増殖、スクリーニング、及びクローニングのために組換え宿主にトランスフェクトする一般的な方法は周知である（例えば、Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｇｅｎｅ，２５：２６３－２６９（１９８３）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，上記を参照されたい）。ＰＣＲによってヌクレオチド配列の増幅セグメントを得たら、セグメントをプローブとしてさらに使用して、ｃＤＮＡライブラリから野生型ポリペプチドをコードする全長ポリヌクレオチド配列を単離することができる。適切な手順の一般的な説明は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、上記に見出すことができる。
同様の手順に従って、ヒトゲノムライブラリから、野生型ポリペプチド、例えば、上述のＧｅｎＢａｎｋ受託番号のうちのいずれか１つをコードする全長配列を得ることができる。ヒトゲノムライブラリは、市販されているか、または様々な技術分野で認識された方法により構築することができる。一般に、ゲノムライブラリを構築するために、ＤＮＡは、最初に、ポリペプチドが見出される可能性が高い組織から抽出される。次いで、ＤＮＡを機械的に剪断するか、または酵素的に消化して、約１２～２０ｋｂの長さの断片を得る。その後、断片を望ましくないサイズのポリヌクレオチド断片から勾配遠心分離することにより分離し、バクテリオファージλベクターに挿入する。これらのベクター及びファージは、インビトロでパッケージ化される。組換えファージを、Ｂｅｎｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９６：１８０－１８２（１９７７）に記載されるように、プラークハイブリダイゼーションによって分析する。コロニーハイブリダイゼーションは、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２：３９６１－３９６５（１９７５）によって記載されるように行われる。
配列相同性に基づいて、変性オリゴヌクレオチドをプライマーセットとして設計することができ、ＰＣＲを好適な条件下で行って（例えば、Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３、Ｇｒｉｆｆｉｎ ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．１９９４を参照されたい）、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリからのヌクレオチド配列のセグメントを増幅することができる。増幅セグメントをプローブとして使用して、野生型ポリペプチドをコードする全長核酸を得る。
野生型ポリペプチドをコードする核酸配列を取得したら、結果として生じる構築物から組換え野生型ポリペプチドを産生することができるように、コード配列をベクター、例えば発現ベクターにサブクローニングすることができる。野生型ポリペプチドコード配列のさらなる修飾、例えば、ヌクレオチド置換は、その後、分子の特徴を変更するために行われ得る。
ｃ．ポリペプチド配列への変異の導入
コードポリヌクレオチド配列から、野生型ポリペプチドのアミノ酸配列を決定することができる。その後、このアミノ酸配列は、アミノ酸配列内の様々な位置に追加のグリコシル化配列（複数可）を導入することによって、タンパク質のグリコシル化パターンを変更するように修飾され得る。
様々な変異生成プロトコルが当該技術分野で確立されており、記載されている。例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：４５０４ －４５０９（１９９７）、及びＳｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３７０：３８９－３９１（１９９４）を参照されたい。手順は、一組の核酸のバリアント、したがって、コードされたポリペプチドのバリアントを産生するために、別個にまたは組み合わせて使用することができる。変異誘発、ライブラリ構築、及び他の多様性生成方法のためのキットが市販されている。
多様性を生成する変異方法としては、例えば、部位特異的変異誘発（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｓｈｏｒｔｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１１９３－１２０１（１９８５））、ウラシル含有テンプレートを使用した変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８－４９２（１９８５））、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発（Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１０：６４８７－６５００（１９８２））、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ変異誘発（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：８７４９－８７６４及び８７６５－８７８７（１９８５））、ならびにギャップ二本鎖ＤＮＡを使用した変異誘発（Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：９４４１－９４５６（１９８４））が挙げられる。
変異を生成するための他の方法としては、点ミスマッチ修復（Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３８：８７９－８８７（１９８４））、修復欠損宿主株を使用した変異誘発（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：４４３１－４４４３（１９８５））、欠失変異誘発（Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４：５１１５（１９８６））、制限選択及び制限精製（Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ，３１７：４１５－４２３（１９８６））、全遺伝子合成による変異誘発（Ｎａｍｂｉａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２３： １２９９－１３０１（１９８４））、二本鎖切断修復（Ｍａｎｄｅｃｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：７１７７－７１８１（１９８６））、ポリヌクレオチド連鎖停止法による変異誘発（米国特許第５，９６５，４０８号）、及びエラープローンＰＣＲ（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１：１１－１５（１９８９））が挙げられる。
ｄ．宿主生物における好ましいコドン使用のための核酸の修飾
ポリペプチドバリアントをコードするポリヌクレオチド配列は、特定の宿主の好ましいコドン使用と一致するようにさらに変更することができる。例えば、１つの細菌細胞株の好ましいコドン使用は、本発明のポリペプチドバリアントをコードし、この株によって好まれるコドンを含むポリヌクレオチドを導くために使用され得る。宿主細胞によって示される好ましいコドン使用頻度は、宿主細胞によって発現される多数の遺伝子における好ましいコドン使用頻度を平均化することによって計算することができる（例えば、計算サービスは、Ｋａｚｕｓａ ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｊａｐａｎのウェブサイトから入手可能である）。この分析は、好ましくは、宿主細胞によって高度に発現される遺伝子に限定される。例えば、米国特許第５，８２４，８６４号は、双子葉類植物及び単子葉植物によって示される高度に発現された遺伝子によるコドン使用頻度を提供する。
修飾の完了時に、ポリペプチドバリアントコード配列を配列決定によって検証し、次いで、野生型ポリペプチドと同じ様式で組換え産生のための適切な発現ベクターにサブクローニングする。
ＶＩＩＩ．変異ポリペプチドの発現
配列検証に続いて、本発明のポリペプチドバリアントは、本明細書に開示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に依存する、組換え遺伝学の分野で日常的な技法を使用して産生され得る。
ａ．発現系
本発明の変異ポリペプチドをコードする核酸の高レベル発現を得るために、典型的には、変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、翻訳を指向する強力なプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、及び翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含有する発現ベクターにサブクローニングする。好適な細菌プロモーターは当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、上記及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、上記に記載されている。野生型または変異ポリペプチドを発現するための細菌発現系は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、及びＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒにおいて利用可能である。そのような発現系のためのキットは、市販されている。哺乳類細胞、酵母、及び昆虫細胞のための真核生物発現系は、当該技術分野で周知であり、また市販されている。一実施形態では、真核生物発現ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ関連ベクター、またはレトロウイルスベクターである。
異種核酸の発現を指向するために使用されるプロモーターは、特定の用途に依存する。プロモーターは、任意選択で、その自然な設定における転写開始部位からと同じように、異種転写開始部位からほぼ同じ距離に配置される。しかしながら、当該技術分野で既知のように、この距離のある程度の変化は、プロモーター機能を失うことなく適合させることができる。
プロモーターに加えて、発現ベクターは、典型的には、宿主細胞における変異ポリペプチドの発現に必要なすべての追加要素を含有する転写単位または発現カセットを含む。したがって、典型的な発現カセットは、変異ポリペプチド、ならびに転写産物、リボソーム結合部位、及び翻訳終結の効率的なポリアデニル化に必要なシグナルをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含有する。ポリペプチドをコードする核酸配列は、典型的には、形質転換された細胞によるポリペプチドの分泌を促進するために切断可能なシグナルペプチド配列に連結される。そのようなシグナルペプチドには、とりわけ、組織プラスミノーゲン活性化因子、インスリン、及びニューロン増殖因子からのシグナルペプチド、ならびにＨｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓの若年性ホルモンエステラーゼが含まれる。カセットのさらなる要素は、エンハンサー、ならびにゲノムＤＮＡが構造遺伝子として使用される場合、機能的スプライスドナー及びアクセプター部位を有するイントロンを含み得る。
プロモーター配列に加えて、発現カセットは、効率的な終結を提供するために、構造遺伝子の下流に転写終結領域も含有するべきである。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得ることができるか、または異なる遺伝子から得ることができる。
遺伝子情報を細胞に輸送するために使用される特定の発現ベクターは、特に重要ではない。真核細胞または原核細胞において発現に使用される従来のベクターのいずれかを使用することができる。標準的な細菌発現ベクターとしては、ｐＢＲ３２２系プラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ、ならびにＧＳＴ及びＬａｃＺなどの融合発現系などのプラスミドが挙げられる。また、エピトープタグを組換えタンパク質に付加して、便宜的な単離方法、例えば、ｃ－ｍｙｃを提供することもできる。
真核生物ウイルスからの調節エレメントを含有する発現ベクターは、典型的には、真核生物発現ベクター、例えば、ＳＶ４０ベクター、乳頭腫ウイルスベクター、及びエプスタイン・バーウイルス由来のベクターにおいて使用される。他の例示的な真核生物ベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ－５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、及びＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞における発現に有効であることが示される他のプロモーターの指向下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる。
いくつかの例示的な実施形態では、発現ベクターは、参照により本明細書に組み込まれる、２００４年４月９日に出願された共同所有の米国特許出願に開示されるｐＣＷｉｎ１、ｐＣＷｉｎ２、ｐＣＷｉｎ２／ＭＢＰ、ｐＣＷｉｎ２－ＭＢＰ－ＳＢＤ（ｐＭＳ３９）、及びｐＣＷｉｎ２－ＭＢＰ－ＭＣＳ－ＳＢＤ（ｐＭＸＳ３９）から選択される。
いくつかの発現系は、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、及びジヒドロ葉酸還元酵素などの遺伝子増幅を提供するマーカーを有する。あるいは、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指向下で変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する、昆虫細胞におけるバキュロウイルスベクターなどの遺伝子増幅を伴わない高収率発現系も好適である。
発現ベクターに典型的に含まれる要素は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて機能するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、及び真核生物配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域における独特の制限部位も含む。選択される特定の抗生物質耐性遺伝子は重要ではなく、当該技術分野で知られている多くの耐性遺伝子のいずれも好適である。
原核生物配列は、必要に応じて、真核細胞内のＤＮＡの複製に干渉しないように、任意選択で選択される。
組換えタンパク質（例えば、本発明のｈｇｈ変異体）のペリプラズマ発現が所望される場合、発現ベクターは、発現されるタンパク質のコード配列の５’に直接接続される、Ｅ．ｃｏｌｉ ＯｐｐＡ（ペリプラズマオリゴペプチド結合タンパク質）分泌シグナルまたはその修飾型などの分泌シグナルをコードする配列をさらに含む。このシグナル配列は、細胞質において産生される組換えタンパク質を細胞膜を介して細胞質周辺腔に指向する。発現ベクターは、組換えタンパク質が細胞質周辺腔に入っているときにシグナル配列を酵素的に切断することができる、シグナルペプチダーゼ１のコード配列をさらに含んでもよい。組換えタンパク質のペリプラズム産生のためのより詳細な説明は、例えば、Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３９：２４７－２５４（１９８５）、米国特許第６，１６０，０８９号及び同第６，４３６，６７４号に見出すことができる。
上に論じられるように、当業者は、ポリペプチドの生物学的活性を依然として保持しながら、任意の野生型もしくは変異ポリペプチドまたはそのコード配列に対して様々な保存的置換が行われ得ることを認識するであろう。さらに、ポリヌクレオチドコード配列の修飾は、結果として生じるアミノ酸配列を変更することなく、特定の発現宿主における好ましいコドン使用に適合するようにも行われ得る。
ｂ．トランスフェクション方法
標準的なトランスフェクション方法を使用して、大量の変異ポリペプチドを発現する細菌、哺乳類、酵母、または昆虫細胞株を産生し、次いで標準的な技法を使用して精製する（例えば、Ｃｏｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７６１９－１７６２２（１９８９）、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８２（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，ｅｄ．， １９９０）を参照されたい）。真核細胞及び原核細胞の形質転換は、標準的な技法により行われる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１３２：３４９－３５１（１９７７）、Ｃｌａｒｋ－Ｃｕｒｔｉｓ ＆ Ｃｕｒｔｉｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：３４７－３６２（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，１９８３）を参照されたい）。
宿主細胞に外来ヌクレオチド配列を導入するための周知の手順のいずれかを使用することができる。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、細胞質ベクター、ウイルスベクター、ならびにクローニングしたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、または他の外来の遺伝子材料を宿主細胞に導入するための他の周知の方法のいずれかの使用が含まれる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、上記を参照されたい）。使用される特定の遺伝子操作手順が、変異ポリペプチドを発現することができる宿主細胞に少なくとも１つの遺伝子を良好に導入することができることのみが必要である。
ｃ．宿主細胞における変異ポリペプチドの発現の検出
発現ベクターを適切な宿主細胞に導入した後、トランスフェクトされた細胞を、変異ポリペプチドの発現を好む条件下で培養する。次いで、細胞を組換えポリペプチドの発現についてスクリーニングし、その後、標準的な技法を使用して培養物から回収する（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（１９８２）、米国特許第４，６７３，６４１号、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、上記、及びＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、上記を参照されたい）。
遺伝子発現をスクリーニングするためのいくつかの一般的な方法は、当業者の間で周知である。最初に、遺伝子発現は、核酸レベルで検出され得る。核酸ハイブリダイゼーション技法を使用した、様々な特異的ＤＮＡ及びＲＮＡの測定方法が一般的に使用される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、上記）。いくつかの方法は、電気泳動分離（例えば、ＤＮＡを検出するためのサザンブロット及びＲＮＡを検出するためのノーザンブロット）を伴うが、ＤＮＡまたはＲＮＡの検出は、電気泳動なしでも（例えば、ドットブロットなどによって）行うことができる。トランスフェクトされた細胞における変異ポリペプチドをコードする核酸の存在は、配列特異的プライマーを使用して、ＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲによって検出することもできる。
第２に、遺伝子発現は、ポリペプチドレベルで検出され得る。様々な免疫学的アッセイが、特に、本発明の変異ポリペプチドと特異的に反応するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用して、遺伝子産物のレベルを測定するために当業者によって日常的に使用される（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８８、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５－４９７（１９７５））。そのような技法は、変異ポリペプチドまたはその抗原部分に対して高い特異性を有する抗体を選択することによる抗体調製を必要とする。ポリクローナル及びモノクローナル抗体を産生する方法は十分に確立されており、それらの説明は、文献に見出すことができる。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、上記、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１－５１９（１９７６）を参照されたい。本発明の変異ポリペプチドに対する抗体の調製、及び変異ポリペプチドを検出する免疫学的アッセイの実施のより詳細な説明は、後のセクションに提供される。
ＩＸ．組換え産生された変異ポリペプチドの精製
トランスフェクトされた宿主細胞における組換え変異ポリペプチドの発現が確認されたら、次いで、宿主細胞は、組換えポリペプチドを精製する目的のために適切なスケールで培養される。
ａ．細菌からの精製
本発明の変異ポリペプチドが、形質転換された細菌によって大量に、典型的にはプロモーター誘導後に組換えにより産生される場合、発現は構成的であり得るが、タンパク質は、不溶性凝集体を形成し得る。タンパク質包含体の精製に好適ないくつかのプロトコルが存在する。例えば、凝集タンパク質（以下、包含体と称される）の精製は、典型的には、細菌細胞の破壊による、例えば、約１００～１５０μｇ／ｍｌのリゾチーム及び０．１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、非イオン性洗剤の緩衝液中でのインキュベーションによる、包含体の抽出、分離、及び／または精製を伴う。細胞懸濁液は、ポリトロン粉砕機（Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）を使用して粉砕することができる。あるいは、細胞を氷上で超音波処理することができる。細菌の溶解の代替方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら及びＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（いずれも
上記）に記載されており、当業者には明らかであろう。
細菌包含体から組換えポリペプチドを精製するさらなる説明については、例えば、Ｐａｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ １８：１８２－１９０（２０００）を参照されたい。
上清中に存在する組換えタンパク質は、当業者に周知の標準的な分離技法によって宿主タンパク質から分離され得る。
ｂ．変異ポリペプチド発現の検出のためのイムノアッセイ
組換え変異ポリペプチドの産生を確認するために、免疫学的アッセイは、試料中でポリペプチドの発現を検出するのに有用であり得る。免疫学的アッセイはまた、組換えホルモンの発現レベルを定量化するために有用である。変異ポリペプチドに対する抗体は、これらの免疫学的アッセイを行うために必要である。
ｃ．変異ポリペプチドに対する抗体の産生
目的の免疫原と特異的に反応するポリクローナル及びモノクローナル抗体の産生方法は、当業者に既知である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ，１９９１，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９，Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （４ｔｈ ｅｄ．） Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，ＣＡ、及びその中で引用されている参考文献、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ （２ｄ ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８６、ならびにＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７，１９７５を参照されたい）。そのような技法には、ファージまたは同様のベクターにおける組換え抗体のライブラリからの抗体の選択による抗体調製が含まれる（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－１２８１，１９８９及びＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６，１９８９を参照されたい）。
所望の特異性を有する抗血清含有抗体を産生するために、目的のポリペプチド（例えば、本発明の変異ポリペプチド）またはその抗原断片を使用して、好適な動物、例えば、マウス、ウサギ、または霊長類を免疫化することができる。フロイントのアジュバントなどの標準的なアジュバントは、標準的な免疫プロトコルに従って使用することができる。あるいは、その特定のポリペプチドに由来する合成抗原ペプチドを担体タンパク質にコンジュゲートさせ、その後免疫原として使用することができる。
免疫原調製物に対する動物の免疫応答は、試験出血を採取し、目的の抗原に対する反応性の力価を決定することによって監視される。抗原に対する抗体の適切に高い力価が得られる場合、動物から血液を収集し、抗血清を調製する。抗原に特異的に反応する抗体を濃縮するための抗血清のさらなる分画及び抗体の精製は、その後行われる。上記のＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、ならびに上に提供されるタンパク質精製の一般的な説明を参照されたい。
当業者に知られている様々な技法を使用して、モノクローナル抗体が得られる。典型的には、所望の抗原で免疫化された動物からの脾臓細胞は、通常、骨髄腫細胞との融合によって不死化される（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１－５１９，１９７６を参照されたい）。代替的な不死化方法としては、例えば、エプスタイン・バーウイルス、がん遺伝子、もしくはレトロウイルス、または当該技術分野で周知の他の方法を用いた形質転換が挙げられる。単一の不死化細胞から生じるコロニーは、抗原に対する所望の特異性及び親和性の抗体の産生についてスクリーニングされ、そのような細胞によって産生されるモノクローナル抗体の収率は、脊椎動物宿主の腹腔への注射を含む様々な技法によって増強され得る。
加えて、モノクローナル抗体はまた、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．、上記によって概説される一般的なプロトコルに従ってヒトＢ細胞ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによって、所望の特異性を有する抗体またはそのような抗体の結合断片をコードする核酸配列の特定時に組換えにより産生されてもよい。上に論じられる組換えポリペプチド産生の一般的な原理及び方法は、組換え方法による抗体産生に適用可能である。
所望される場合、本発明の変異ポリペプチドを特異的に認識することができる抗体を、野生型ポリペプチドに対するそれらの交差反応性について試験することができ、したがって、野生型タンパク質に対する抗体と区別することができる。例えば、変異ポリペプチドで免疫化された動物から得られた抗血清を、野生型ポリペプチドが固定化されたカラムに通すことができる。カラムを通過する抗血清の部分は、野生型ポリペプチドではなく変異ポリペプチドのみを認識する。同様に、変異ポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、野生型ポリペプチドではなく、変異体のみを認識する際のそれらの排他性についてスクリーニングすることもできる。
本発明の変異ポリペプチドのみを特異的に認識するが野生型ポリペプチドを認識しないポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、例えば、固体支持体上に固定化された変異ペプチド特異的ポリクローナルまたはモノクローナル抗体と共に試料をインキュベートすることによって、野生型タンパク質から変異タンパク質を単離するのに有用である。
Ｘ．治療及び診断方法
様々な実施形態では、本発明は、Ｍｅｔを阻害することによって、またはＨＧＦバリアントポリペプチドを投与することによりＭｅｔをわずかだけ活性化させることによって治療することができる、疾患状態を予防する、回復させる、または治療する方法を提供する。これらの実施形態では、本発明は、疾患状態、特に眼疾患状態または障害の予防、回復、または治療を必要とする対象において、それらを予防する、回復させる、または治療するのに十分な量の本発明のＨＧＦバリアントポリペプチドを投与することを含む方法を提供する。例示的な疾患状態は、角膜創傷治癒である。開示されるアゴニストバリアントは、細胞増殖の促進、場合によっては血管新生、及び角膜創傷治癒に有用であり得る。
いくつかの実施形態では、ＨＧＦバリアントポリペプチドを用いた療法は、角膜上皮細胞欠損の治療、予防、及び／または阻害のために使用される。
いくつかの実施形態では、ＨＧＦバリアントポリペプチドを用いた療法は、遷延性角膜上皮欠損の治療、予防、及び／または阻害のために使用される。いくつかの実施形態では、遷延性角膜上皮欠損は、上皮／角膜縁の病因を有する。いくつかの実施形態では、遷延性角膜上皮欠損には、限定されないが、上皮基底膜疾患、再発性びらん、外傷後瘢痕、ザルツマン結節状変性症、帯状角膜症、水疱性角膜症、薬物性毒性（ｔｏｘｉｃ ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｏｓａ）、栄養失調（ビタミンＡ欠損）、または角膜上皮幹細胞疲弊症が含まれる。いくつかの実施形態では、遷延性角膜上皮欠損は、上皮基底膜疾患、再発性びらん、外傷後瘢痕、ザルツマン結節状変性症、帯状角膜症、水疱性角膜症、薬物性毒性、栄養失調（ビタミンＡ欠損）、及び角膜上皮幹細胞疲弊症からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ＨＧＦバリアントポリペプチドを用いた療法は、遷延性角膜上皮欠損の治療、予防、及び／または阻害のために使用される。いくつかの実施形態では、遷延性角膜上皮欠損は、炎症性の病因を有する。いくつかの実施形態では、遷延性角膜上皮欠損には、限定されないが、乾性角結膜炎、眼の酒さ、化学的／熱損傷、感染後の角膜炎、自己免疫障害、シェーグレン症候群、類天疱瘡、スティーブンス－ジョンソン症候群、移植片対宿主病、辺縁潰瘍性角膜炎、モーレン潰瘍、またはリウマチ性関節炎が含まれる。いくつかの実施形態では、遷延性角膜上皮欠損は、乾性角結膜炎、眼の酒さ、化学的／熱損傷、感染後の角膜炎、自己免疫障害、シェーグレン症候群、類天疱瘡、スティーブンス－ジョンソン症候群、移植片対宿主病、辺縁潰瘍性角膜炎、モーレン潰瘍、及びリウマチ性関節炎からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ＨＧＦバリアントポリペプチドを用いた療法は、遷延性角膜上皮欠損の治療、予防、及び／または阻害のために使用される。いくつかの実施形態では、遷延性角膜上皮欠損は、神経栄養性の病因を有する。いくつかの実施形態では、遷延性角膜上皮欠損には、限定されないが、真性糖尿病、単純ヘルペス、帯状疱疹、ライリー・デイ症候群、麻酔または外用ＮＳＡＩＤ乱用、放射線後、または角膜移植後の脳神経Ｖ損傷が含まれる。いくつかの実施形態では、遷延性角膜上皮欠損は、真性糖尿病、単純ヘルペス、帯状疱疹、ライリー・デイ症候群、麻酔または外用ＮＳＡＩＤ乱用、放射線後、及び角膜移植後の脳神経Ｖ損傷からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ＨＧＦバリアントポリペプチドを用いた療法は、遷延性角膜上皮欠損の治療、予防、及び／または阻害のために使用される。いくつかの実施形態では、遷延性角膜上皮欠損は、機械的病因を有する。いくつかの実施形態では、遷延性角膜上皮欠損には、限定されないが、眼瞼内反／眼瞼外反、兎眼、睫毛乱生、眼瞼痙攣、偽膜／眼瞼瘢痕、トラコーマ、または作為（ｆａｃｔｉｔｉｏｕｓ）が含まれる。いくつかの実施形態では、遷延性角膜上皮欠損は、眼瞼内反／眼瞼外反、兎眼、睫毛乱生、眼瞼痙攣、偽膜／眼瞼瘢痕、トラコーマ、及び作為からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ＨＧＦバリアントポリペプチドを用いた療法は、遷延性角膜上皮欠損の治療、予防、及び／または阻害のために使用される。いくつかの実施形態では、遷延性角膜上皮欠損は、特発性の病因を有する。いくつかの実施形態では、遷延性角膜上皮欠損には、限定されないが、無虹彩症または角膜実質ジストロフィー（複数可）が含まれる。いくつかの実施形態では、遷延性角膜上皮欠損は、無虹彩症及び角膜実質ジストロフィー（複数可）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ＨＧＦバリアントポリペプチドを用いた療法は、遷延性角膜上皮欠損（ＰＣＥＤ）、角膜血管新生、急性角膜擦過傷の治療、予防、及び／または阻害のために使用される。いくつかの実施形態では、ＰＣＥＤは、眼の非治癒性潰瘍で、足の非治癒性（例えば、糖尿病性）潰瘍に等しい。いくつかの実施形態では、ＰＣＥＤは、上皮治癒及び欠損閉鎖のプロセスが遅延し、潰瘍、感染、瘢痕、穿孔、及び視力低下をもたらし得る角膜上皮欠損をもたらす場合に生じる。いくつかの実施形態では、ＰＣＥＤは、損傷、以前の眼の手術、感染（例えば、以前のヘルペス感染または重度の細菌性潰瘍）、または眼の疾患（重度のドライアイ疾患、糖尿病、眼瞼病理に起因する慢性露出、及び造血幹細胞移植後の眼移植片対宿主病などの基礎状態を含む）から生じ得る。いくつかの実施形態では、ＨＧＦバリアントポリペプチドを用いた療法は、損傷、以前の眼の手術、感染（例えば、以前のヘルペス感染または重度の細菌性潰瘍）、または眼の疾患（重度のドライアイ疾患、糖尿病、眼瞼病理に起因する慢性露出、及び造血幹細胞移植後の眼移植片対宿主病などの基礎状態を含む）の治療、予防、及び／または阻害のために使用される。
例えば、成人において、ＨＧＦ－Ｍｅｔ経路は、傷害後の筋肉再生に関与する。したがって、開示されるバリアントは、例えば、梗塞後の心臓組織再生を含む、筋肉損傷の修復に利用され得る。
開示されるバリアントを使用して、例えば、ウイルス感染（肝炎ウイルス、例えば、ＨＡＶ、ＨＢＶ、またはＨＣＶによる感染によるものなど）、または他の急性ウイルス性肝炎、自己免疫性慢性肝炎、妊娠の急性脂肪肝、バッド・キアリ症候群、及び静脈閉塞症、高熱、低酸素、悪性浸潤、ライ症候群、敗血症、ウィルソン病、ならびに移植拒絶を含む状態によって引き起こされる肝不全または疾患を治療または予防することができる。
一般に、治療有効量のポリペプチドバリアントは、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、任意選択で約１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、任意選択で約１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。投与量は、治療される疾患または適応症の種類及び程度、特定の患者の全体的な健康状態、送達されるポリペプチドバリアントの相対的な生物学的有効性、ポリペプチドバリアントの製剤化、製剤中の賦形剤の存在及び種類、ならびに投与経路などの変数に依存する。投与される初期投薬量は、所望の血液レベルまたは組織レベルを迅速に達成するために、上位レベルを超えて増加され得るか、または初期投薬量は、最適投薬量よりも小さくてもよく、１日の投薬量は、特定の状況に応じて、治療過程中に漸進的に増加されてもよい。ヒト投薬量は、例えば、０．５ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇを実行するように設計された従来の第Ｉ相用量漸増試験で最適化され得る。投与頻度は、投与経路、投薬量、及び治療される疾患状態などの要因に応じて変動し得る。例示的な投薬頻度は、１日１回、週に１回、及び２週間に１回である。好ましい投与経路は、非経口、例えば、静脈内注入である。タンパク質に基づく薬物の製剤化は、当業者の範囲内である。本発明のいくつかの実施形態では、ポリペプチドバリアント、例えば、タンパク質に基づくバリアントは、凍結乾燥され、投与時に緩衝生理食塩水中で再構成される。
ポリペプチドバリアントは、単独で、または他の薬学的に活性な成分と組み合わせたいずれかで投与することができる。他の活性成分、例えば、免疫調節剤は、ポリペプチドバリアントと一緒に投与され得るか、またはポリペプチドバリアントの前または後に投与され得る。
治療的使用のためのポリペプチドバリアントを含有する製剤は、典型的には、薬学的に許容される担体と組み合わせたポリペプチドバリアントを含む。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」とは、妥当な利益／リスク比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、健全な医学的判断の範囲内で、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに好適である緩衝液、担体、及び賦形剤を意味する。担体（複数可）は、製剤の他の成分と適合し、レシピエントに有害ではないという意味で「許容」されなければならない。薬学的に許容される担体は、この点において、薬学的投与と適合する任意及びすべての緩衝液、溶媒、分散媒体、コーティング、等張剤及び吸収遅延剤等を含むことが意図される。薬学的に活性な物質のためのそのような培地及び薬剤の使用は、当該技術分野で既知である。
製剤は、便宜的に、投薬単位形態で提示することができ、薬学分野において周知の方法のうちのいずれも含む、任意の好適な方法によって調製することができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）。
例示的な実施形態では、ポリペプチドバリアントは、インビトロまたはインビボのいずれかで診断目的のために使用され、ポリペプチドバリアントは、典型的には、検出可能な部分で直接または間接のいずれかで標識される。検出可能な部分は、直接的または間接的のいずれかで検出可能なシグナルを産生することができる任意の部分であり得る。例えば、検出可能な部分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉなどの放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、Ｃｙ５．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ（登録商標）色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＩＲＤｙｅ（登録商標）赤外線色素（ＬＩ－ＣＯＲ（登録商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ローダミン、もしくはルシフェリンなどの蛍光もしくは化学発光化合物、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素、スピン標識などのスピンプローブ、または着色粒子、例えばラテックスもしくは金粒子であり得る。ポリペプチドバリアントは、例えば、Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９６２） Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５、Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．（１９７４） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４、Ｐａｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８１） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ４０：２１９、及びＮｙｇｒｅｎ（１９８２） Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７に記載されるように、当該技術分野で既知のいくつかのアプローチを使用して検出可能な部分にコンジュゲートされ得ることが理解される。標識は、例えば、視覚的に、または分光光度計もしくは他の検出器もしくは他の適切な撮像システムの補助により検出され得る。
ポリペプチドバリアントは、当該技術分野で利用可能な広範なイムノアッセイ技法において用いることができる。例示的なイムノアッセイとしては、例えば、サンドイッチイムノアッセイ、競合イムノアッセイ、免疫組織化学的手順が挙げられる。
サンドイッチイムノアッセイでは、目的の分析物または抗原に結合する２つの抗体、例えば、１つは、固体支持体上に固定化され、１つは、溶液中で遊離であり、検出可能な部分で標識される抗体が使用される。抗原を含有する試料がこの系に導入されると、抗原は固定化された抗体及び標識された抗体の両方に結合し、支持体の表面上に「サンドイッチ」免疫複合体を形成する。複合体化タンパク質は、非結合試料構成要素及び過剰な標識された抗体を洗い流し、支持体表面上のタンパク質に複合体化された標識された抗体の量を測定することによって検出される。あるいは、溶液中で遊離である抗体は、遊離抗体に結合する検出可能な部分で標識された第３の抗体によって検出され得る。免疫アッセイ設計、理論及びプロトコルの詳細な概説は、Ｂｕｔｔ， ｅｄ．， （１９８４） Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．（１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、及びＤｉａｍａｎｄｉｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｓｔｏｎを含む、多くのテキストに見出すことができる。
標識されたポリペプチドバリアントがインビ造影剤として有用であることが企図され、それによって、ポリペプチドバリアントは、造影剤をレシピエントにおける目的の特定の組織に標的化することができる。インビボ撮像のための遠隔で検出可能な部分は、放射性原子９９ｍＴｃ、半減期が約６時間であるガンマ放射体を含む。放射性核種診断剤の非限定的な例としては、例えば、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４－１５８Ｇｄ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、８３Ｓｒ、または他のγ－、β－、または陽電子放射体が挙げられる。
インビボ撮像にも有用な非放射性部分には、窒素酸化物スピン標識、ならびにランタニド及び遷移金属イオンが含まれ、これらはすべて、インサイチュで陽子緩和を誘導する。撮像に加えて、複合体化放射性部分は、標的細胞を破壊するために、標準的な放射線免疫療法プロトコルで使用され得る。
フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリセリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｅｒｉｎ）、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ－フタルアルデヒド、及びフルオレスカミンを含むが、これらに限定されない、多種多様な蛍光標識が当該技術分野で既知である。有用な化学発光標識としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、またはシュウ酸エステルが挙げることができる。
開示されるポリペプチドバリアントはまた、インビボでの検出を可能にするために、蛍光マーカーで標識されてもよい。いくつかの実施形態では、蛍光標識はＣｙ５．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）である。他の実施形態では、蛍光標識は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ（登録商標）色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。いくつかの実施形態では、蛍光標識は、ＩＲＤｙｅ（登録商標）赤外線色素（ＬＩ－ＣＯＲ（登録商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。
高用量放射線療法のための例示的なヌクレオチドには、放射性原子９０Ｙｔ、１３１Ｉ、及び１１１Ｉｎが含まれる。ポリペプチドバリアントは、画像技術分野において既知のカップリング技法を使用して、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、及び９９ｍＴＣで標識することができる。同様に、造影剤を調製及び投与するための手順、ならびに画像を捕捉及び処理するための手順は、画像技術分野で周知であるため、本明細書では詳細に論じない。同様に、抗体に基づく免疫療法を行うための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、米国特許第５，５３４，２５４号を参照されたい。
実施例１．肝細胞増殖因子の操作された二量体断片は、インビトロで角膜上皮創傷治癒を改善する
背景
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、角膜創傷治癒において重要な役割を果たす天然に存在するマイトジェンである。ＮＫ１は、同じｃ－Ｍｅｔ受容体をわずかに活性化するＨＧＦの操作された断片である。ＮＫ１は、指向性進化を使用して、安定性及び組換え発現収率の増加のために以前に操作された。
Ｎ末端システイン残基の導入により、ジスルフィド結合ＮＫ１ホモ二量体を作製した。操作されたＮＫ１共有結合二量体は、野生型ＮＫ１と比較してほぼ１桁の改善されたアゴニスト活性を示し、全長ＨＧＦの活性に近づく。ＣＤ分光法は、二量体が野生型ＮＫ１よりも増加した熱安定性を有することを示した。
目的
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、角膜創傷治癒において重要な役割を果たす天然に存在するマイトジェンである。この実施例は、遊走及び増殖アッセイによる、ヒト一次角膜上皮細胞（ＣＥＣ）上のＨＧＦの操作された二量体断片、ｅＮＫ１二量体の創傷治癒特性を記載する。ＣＥＣ遊走及び増殖がｅＮＫ１で改善され、それが組換えＨＧＦ（ｒＨＧＦ）と同様に機能すると仮定した。
方法
ＮＫ１は、ｃ－Ｍｅｔ受容体をわずかに活性化するＨＧＦの断片である。ＮＫ１は、指向性進化を使用して、安定性及び組換え発現収率の増加のために以前に操作された。Ｎ末端システイン残基の導入により、ジスルフィド結合ＮＫ１ホモ二量体を作製した。遊走及び増殖アッセイを、それぞれ、不死化及び一次ＣＥＣで行った。不死化ＣＥＣ遊走を、１００ｎｇ／ｍＬのｅＮＫ１及びｒＨＧＦで処理するスクラッチアッセイによって評価した。創傷閉鎖を、倒立顕微鏡下で６時間及び１２時間で監視した。一次ＣＥＣ増殖及び代謝活性は、４８時間後に評価された。細胞を、まず増殖因子不含培地で飢餓させ、次いで１００ｎｇ／ｍＬのｅＮＫ１またはｒＨＧＦで処理した。Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵ及びＭＴＴアッセイをそれぞれ使用して、細胞増殖及び代謝活性を定量化した。
遊走及び増殖アッセイを、それぞれ、不死化及び一次ＣＥＣで行った。不死化ＣＥＣ遊走を、１００ｎｇ／ｍＬのｅＮＫ１及びｒＨＧＦで処理するスクラッチアッセイによって評価した。創傷閉鎖を、倒立顕微鏡下で６時間及び１２時間で監視した。一次ＣＥＣ増殖及び代謝活性は、処理の４８時間後に評価された。細胞を、まず増殖因子不含培地で飢餓させ、次いで１００ｎｇ／ｍＬのｅＮＫ１またはｒＨＧＦで処理した。Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵ及びＭＴＴアッセイをそれぞれ使用して、細胞増殖及び代謝活性を定量化した。
結果
ｅＮＫ１及びＨＧＦで処理したＣＥＣは、改善された創傷閉鎖速度を有する
ｅＮＫ１及びｒＨＧＦ処理ＣＥＣの両方は、未処理細胞と比較して、創傷閉鎖速度を改善した。スクラッチアッセイは、ｒＨＧＦ及びｅＮＫ１処理ＣＥＣの両方が、陰性対照と比較して著しく大きな創傷閉鎖を達成したことを示した（ｐ＜０．０１）。図３を参照されたい。
ｅＮＫ１及びＨＧＦ処理された細胞は増加した細胞増殖を有する
ＥｄＵアッセイは、ｅＮＫ１及びｒＨＧＦで４８時間処理したＣＥＣが、未処理細胞よりも有意にＥｄＵ陽性であったことを示した。赤色細胞は、新たに合成されたＤＮＡの蛍光標識を表し、ｒＨＧＦ及びｅＮＫ１処理された細胞におけるＤＮＡ合成及びしたがって増殖のレベルの増加を示す（ｐ＜０．０５）。図４を参照されたい。
ＭＴＴ増殖アッセイは、ｅＮＫ１及びｒＨＧＦで４８時間処理したＣＥＣが、未処理の細胞と比較して改善された代謝活性を有した（ｐ＜０．０５）ことを示した。図５を参照されたい。
操作されたＮＫ１共有結合二量体は、野生型ＮＫ１と比較してほぼ１桁の改善されたアゴニスト活性を示し、全長ＨＧＦの活性に近づく。ＣＤ分光法は、二量体が野生型ＮＫ１よりも増加した熱安定性を有することを示した。スクラッチアッセイは、ｒＨＧＦ及びｅＮＫ１処理ＣＥＣの両方が、陰性対照と比較して著しく大きな創傷閉鎖を達成したことを示した（ｐ＜０．０１）。ＥｄＵアッセイは、ｅＮＫ１及びｒＨＧＦで処理したＣＥＣが、未処理の細胞よりも有意にＥｄＵ陽性であったことを示し、ＤＮＡ合成及びしたがって増殖のレベルの増加を示した（ｐ＜０．０５）。ＭＴＴ増殖アッセイは、ｅＮＫ１及びｒＨＧＦで処理したＣＥＣが、未処理の細胞と比較して改善された代謝活性を有した（ｐ＜０．０５）ことを示した。
結論
この実施例で提供されるデータは、ｅＮＫ１が、全長組換えＨＧＦと同様のレベルに角膜上皮細胞の遊走、増殖、及び代謝活性に影響を与える安定したタンパク質であるという仮説を支持する。結果は、ｅＮＫ１が角膜上皮創傷治癒を改善し、組換えＨＧＦの治療的代替物としての可能性があり得ることを示唆する。
さらなるインビトロ及びインビボ研究は、角膜創傷治癒を増強し、瘢痕及び血管新生を予防するために、様々な濃度及び異なる生体力学的特性のビヒクルにおけるｅＮＫ１に焦点を当てる。
実施例２．ＮＫ１のタンパク質操作
１．１ 酵母表面提示を介したＮＫ１のタンパク質操作。酵母表面提示は、増強された標的結合親和性、適切な折り畳み、及び改善された安定性のためのタンパク質を設計するために使用されてきた強力な指向性進化技術である。ＮＫ１タンパク質のコンビナトリアルライブラリを、酵母交配凝集素タンパク質Ａｇａ２ｐへの遺伝的融合を介して酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅの表面上に提示した。Ａｇａ２ｐは、酵母細胞壁に共有結合するＡｇａ１ｐにジスルフィド結合される。ほとんどの酵母提示研究とは対照的に、本明細書で使用した構築物は、提示されたＮＫ１タンパク質をＡｇａ２ｐのＮ末端に係留した（米国特許第９，５５６，２４８号からの図２）。このリガンド－受容体系について、この配向が、以下に記載の受容体及び抗体標識の立体障害を低減したことが分かった。ＮＫ１タンパク質は、Ｎ末端血球凝集素（ＨＡ）及びＣ末端ｃ－ｍｙｃエピトープタグと隣接し、これらは酵母細胞表面上の構築物の発現を確認し、表面発現レベルを定量化するために使用された。提示されたＮＫ１タンパク質のＣ末端の柔軟な（Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ）３リンカーを使用して、タンパク質を酵母細胞表面から離れて突出させ、立体障害をさらに最小限に抑えた。
タンパク質操作研究のために、１０７～１０８の形質転換体のライブラリを日常的に作製し、各酵母細胞は、その表面に何千もの特定のＮＫ１変異体の同一のコピーを提示する。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用した数千万個の酵母提示ＮＫ１変異体のハイスループットスクリーニングは、所望の特性、この場合、増強されたＭｅｔ受容体結合親和性及び／または増強された発現を有するタンパク質バリアントの単離を可能にした。この目的のために、酵母提示ＮＫ１ライブラリを、蛍光標識されたＭｅｔ－Ｆｃ融合タンパク質、ならびにＨＡエピトープタグに対する一次及び二次抗体の両方で染色した（米国特許第９，５５６，２４８号からの図２Ｂ）。マルチカラーフローサイトメトリーの使用により、フィコエリトリン及びＡｌｅｘａ－４８８蛍光をそれぞれ検出することによって、相対表面発現レベル及びＭｅｔ結合の両方の同時及び独立した監視を可能にした。最も高いレベルのＭｅｔに結合し、最も高いＮＫ１発現レベルを有する酵母細胞を単離した。以前、酵母細胞表面上の発現レベルと熱的安定性及び可溶性発現収率との間に強い相関が示された。選別した酵母を培養下で増殖させ、スクリーニングプロセスを数回繰り返して、少数の独特のクローンからなる濃縮酵母集団を得た。
１．２ 概要：酵母表面提示を使用した高親和性及び安定性のためのＮＫ１の指向性進化。ＮＫ１断片を、１）増強された熱安定性、及び２）Ｍｅｔに対する高結合親和性のために操作した。１回目の指向性進化は主に、酵母細胞表面上の機能発現及びＭｅｔ結合親和性の適度の改善のためのＮＫ１を進化させることからなった。プールした生成物をさらに変異させ、それらを改善されたＭｅｔ結合親和性または増強された安定性のいずれかについて独立してスクリーニングした２回目の指向性進化に供した。次いで、２回目からのプールされた生成物に対してＤＮＡシャッフルを行い、続いて改善されたＭｅｔ結合親和性及び増強された安定性について同時にスクリーニングすることによって、３回目の指向性進化を行った（図３）。
１．３ 野生型ＮＫ１は酵母細胞表面上に機能的に発現しない。ＨＧＦは、２つの主要なアイソフォーム、アイソフォーム１（Ｉ１：Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５９２）及びアイソフォーム３（Ｉ３：Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０１０９３２、配列番号１０）に存在する。
配列番号４（ＮＰ＿００１０１９３２） ＭＷＶＴＫＬＬＰＡＬＬＬＱＨＶＬＬＨＬＬ ＬＬＰＩＡＩＰＹＡＥ ＧＱＲＫＲＲＮＴＩＨ ＥＦＫＫＳＡＫＴＴＬ ＩＫＩＤＰＡＬＫＩＫＴＫＫＶＮＴＡＤＱＣ ＡＮＲＣＴＲＮＫＧＬ ＰＦＴＣＫＡＦＶＦＤＫＡＲＫＱＣＬＷＦＰ ＦＮＳＭＳＳＧＶＫＫ ＥＦＧＨＥＦＤＬＹＥＮＫＤＹＩＲＮＣＩＩ ＧＫＧＲＳＹＫＧＴＶＳＩＴＫＳＧＩＫＣＱＰＷＳＳＭＩＰＨＥＨＳＹＲＧＫＤＬＱＥＮＹＣＲＮＰＲＧＥＥＧＧＰＷＣＦＴＳＮＰＥ ＶＲＹＥＶＣＤＩＰＱ ＣＳＥＶＥＣＭＴＣＮ ＧＥＳＹＲＧＬＭＤＨ ＴＥＳＧＫＩＣＱＲＷ ＤＨＱＴＰＨＲＨＫＦＬＰＥＲＹＰＤＫＧＦ ＤＤＮＹＣＲＮＰＤＧ ＱＰＲＰＷＣＹＴＬＤ ＰＨＴＲＷＥＹＣＡＩ ＫＴＣＡＤＮＴＭＮＤ ＴＤＶＰＬＥＴＴＥＣＩＱＧＱＧＥＧＹＲＧＴＶＮＴＩＷＮＧＩＰ ＣＱＲＷＤＳＱＹＰＨ ＥＨＤＭＴＰＥＮＦＫ ＣＫＤＬＲＥＮＹＣＲ ＮＰＤＧＳＥＳＰＷＣＦＴＴＤＰＮＩＲＶＧ ＹＣＳＱＩＰＮＣＤＭ ＳＨＧＱＤＣＹＲＧＮＧＫＮＹＭＧＮＬＳＱＴＲＳＧＬＴＣＳＭＷＤＫＮＭＥＤＬＨＲＨＩＦＷＥＰＤＡＳＫＬ ＮＥＮＹＣＲＮＰＤＤＤＡＨＧＰＷＣＹＴＧＮＰＬＩＰＷＤＹＣＰＩＳＲＣＥＧＤＴＴＰＴＩＶＮＬＤＨＰＶＩＳＣＡＫＴＫＱＬＲＶＶＮＧＩＰＴＲＴＮＩＧＷＭＶＳＬＲＹＲＮＫＨＩＣＧＧＳＬＩＫＥＳＷＶＬＴＡＲＱＣＦＰＳＲＤＬＫＤＹＥＡＷＬＧＩＨＤＶＨＧＲＧＤＥＫＣＫＱＶＬＮＶＳＱＬＶＹＧＰＥＧＳＤＬＶＬＭＫＬＡＲＰＡＶＬＤＤＦＶＳ ＴＩＤＬＰＮＹＧＣＴＩＰＥＫＴＳＣＳＶＹ ＧＷＧＹＴＧＬＩＮＹ ＤＧＬＬＲＶＡＨＬＹ ＩＭＧＮＥＫＣＳＱＨ ＨＲＧＫＶＴＬＮＥＳ ＥＩＣＡＧＡＥＫＩＧ ＳＧＰＣＥＧＤＹＧＧ ＰＬＶＣＥＱＨＫＭＲ ＭＶＬＧＶＩＶＰＧＲ ＧＣＡＩＰＮＲＰＧＩ ＦＶＲＶＡＹＹＡＫＷ ＩＨＫＩＩＬＴＹＫＶ ＰＱＳ
ＨＧＦ Ｉ１及びＩ３は、Ｉ３の第１のクリングルドメイン（Ｋ１）の５つのアミノ酸欠失を除いて、配列は同一である。酵母提示プラスミドｐＴＭＹ－ＨＡを使用して、酵母細胞壁タンパク質Ａｇａ２ｐへの遺伝的融合物として酵母細胞表面上にＮＫ１ Ｉ１またはＮＫ１ Ｉ３を発現させた（図２）。ＮＫ１ Ｉ１及びＮＫ１ Ｉ３の両方で同様の結果が見出された。酵母提示ＮＫ１ Ｉ１を、相対発現（ＨＡタグの抗体検出を介して）、及びＡｌｅｘａ ４８８で標識された２０または２００ｎＭのＭｅｔ－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）への結合について染色した。野生型ＮＫ１－Ｍｅｔ相互作用にはヘパリンが必要であるため、この実験は、２μＭのヘパリン（Ｌｏｖｅｎｏｘ、Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）の存在下（米国特許第９，５５６，２４８号からの図４Ａ、上部）及び不在下（図４Ａ、下部）の両方で行った。フローサイトメトリーを使用して、酵母細胞表面上でＮＫ １ Ｉ１を発現する酵母を検出した。可溶性Ｍｅｔ－Ｆｃへの低レベルの結合のみが観察された（図４、ｘ軸対ｙ軸）。結合レベルは、酵母提示ＮＫ１を７０℃に加熱した後に示される（米国特許第９，５５６，２４８号からの図４Ｂ）。以下に示すように、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓから産生される可溶性ＮＫ１ Ｉ１は、６０℃で完全にアンフォールドされる（米国特許第９，５５６，２４８号からの図４）。まとめると、このデータは、酵母提示野生型ＮＫ１が酵母細胞表面上で機能的に発現されないことを示す。
１．４ 酵母表面提示を使用した改善された親和性及び安定性のためのＮＫ１の操作。野生型ＮＫ１と比較して、安定性及びＭｅｔ結合親和性の改善のために、３回の別個の指向性進化を使用してＮＫ１を進化させた。ＮＫ１は、酵母細胞表面上で機能的に発現されなかったため、１回目の指向性進化は主に、酵母提示ＮＫ１変異体をスクリーニングして、Ｍｅｔ受容体に結合するクローンを単離することからなった。この目標に向けて、ヌクレオチド類似体８－オキソ－ｄＧＴＰ及びｄＰＴＰ（ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、エラープローンＰＣＲによって約３×１０７のＮＫ１変異体のライブラリを生成した。ＮＫ１ Ｉ１またはＮＫ１ Ｉ３のいずれも酵母細胞表面上で機能的に発現されないため、どのアイソフォームが指向性進化を介した親和性成熟に最も適しているか明らかではなかった。したがって、開始テンプレートとして等量のＮＫ１ Ｉ１及びＮＫ１ Ｉ３を使用して、Ｉ１及びＩ３の両方に基づく組み合わせたＮＫ１変異体ライブラリを生成した。酵母提示ライブラリからのランダムクローンの配列決定は、ＮＫ１ Ｉ１及びＮＫ１ Ｉ３の等しい表示を確認した。
酵母は３０℃で増殖することを好むが、それらは多くの場合、２０℃でより複雑なタンパク質の改善された発現を示す。したがって、２０℃で酵母細胞表面上のタンパク質発現を誘導して、ＮＫ１変異体の改善された折り畳みを可能にした後、２回目のライブラリ選別を行い、ＦＡＣＳを使用して、２００ｎＭのＡｌｅｘａ－４８８標識されたＭｅｔ－Ｆｃ（Ｍｅｔ－Ｆｃ Ａ４８８）への検出可能な結合を示した酵母細胞を単離した（米国特許第９，５５６，２４８号からの図５Ａ）。その後のライブラリ選別は、３０℃の発現温度を使用して改善された安定性を有する変異体についてスクリーニングすることを目的に、２０℃または３０℃のいずれかの誘導温度を使用して並行して行われた。各戦略で５回の選別後（２０℃の発現温度を使用して５回、または２０℃で２回、続いて３０℃の発現温度で３回）、ライブラリは、２００ｎＭのＭｅｔ－Ｆｃに結合したメンバーを明らかに含有した。
２回目の指向性進化について、１回目の指向性進化の最終選別からプールされた変異体を、エラープローンＰＣＲによってランダムに変異させて、約８×１０７の独特の変異体のライブラリを生成した。このライブラリの最初の２回の選別を、可溶性Ｍｅｔ－Ｆｃ Ａ４８８に結合した変異体を最初に回収するために２０℃の発現温度を使用して行った。その後の回について、改善された熱的安定性と相関することが示されている発現の改善（すなわち、折り畳み安定性）、またはＭｅｔ結合親和性の改善のいずれかについて並行して選別した（米国特許第９，５５６，２４８号からの図５Ｂ）。高温（３７℃）での発現を使用して、改善された安定性のために選別ストリンジェンシーを付与した一方で、低濃度の可溶性Ｍｅｔ－Ｆｃ Ａ４８８への改善された結合を親和性選別ストリンジェンシーに使用した。
最後に、３回目の指向性進化は、２回目の指向性進化からの安定性及び親和性増強された変異体の最終プールをＤＮＡシャッフルして、約２×１０７の独特な形質転換体の第３世代ライブラリを生成することからなった。このライブラリを、増強された安定性（３７℃の誘導時の高い細胞表面発現レベルを介して）及び増強された親和性（実質的に低濃度のＭｅｔ－Ｆｃ Ａ４８８への改善された結合を介して）の両方について同時にスクリーニングした。１回目、２回目、及び３回目の選別は、それぞれ４０、２０、及び２ｎＭのＭｅｔ－Ｆｃ Ａ４８８を使用した。３回目の選別の後、得られた変異体のプールは、３７℃で良好に発現し、２ｎＭのＭｅｔ－Ｆｃ Ａ４８８に強く結合した（米国特許第９，５５６，２４８号からの図６、中央）。２ｎＭのＭｅｔ－Ｆｃ Ａ４８８で標識し、続いて過剰な非標識競合体、この場合、組換えＨＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の存在下で非結合ステップを行うことによって、後続の選別を行った。過剰なＨＧＦ競合体の存在下で２４時間後にＭｅｔ結合を保持したクローンをＦＡＣＳによって単離した。このプロセスを、ＮＫ１変異体のプールがＭｅｔ－Ｆｃ競合体として過剰なＨＧＦの存在下での２日間の非結合ステップ後にＭｅｔ－Ｆｃ Ａ４８８への結合を保持するまで繰り返した（図６、右）。
過剰なＨＧＦ競合体の存在下での２日間の非結合ステップ後でも、バリアントが高温で酵母細胞表面上で効率的に発現され、２ｎＭの可溶性Ｍｅｔへの持続的結合を維持するＮＫ１バリアントのプールを特定した（米国特許第９，５５６，２４８号からの図６）。
１．５ 親和性及び安定性増強ＮＫ１変異体の配列分析。３回目の指向性進化の実施と並行して、２回目からの有望な変異体の特徴付けを開始した。各選別戦略（２０℃親和性選別戦略及び３７℃安定性選別戦略）の最終的な２つ選別回の各々から８つのランダム変異体を配列決定した。興味深いことに、配列決定された３２すべてのクローンは、初期ライブラリの配列決定が比較的等しい割合のＮＫ１アイソフォーム１及びアイソフォーム３を示したにもかかわらず、ＮＫ１ Ｉ１に基づいた。加えて、いくつかの好ましいまたはコンセンサス変異が明らかであった。１０の変異は、ライブラリ選別生成物からランダムに配列決定されたクローンに繰り返し出現し、これらの変異のうちの８つは、ランダムに選択されたクローンの半分を超えて存在した。これらの優性変異を、表１に太字で強調した。多種多様な変異に起因して、個々のクローンのいずれもこれらの変異の８つすべてを含有しなかった。しかしながら、１つのクローンは、８つの最も頻繁な変異のうちの５つを含有した（Ｋ６２Ｅ、Ｎ１２７Ｄ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、Ｎ１９３Ｄ、このクローンはＭ２．１と称される）。残りの３つの変異（Ｑ９５Ｒ、Ｋ１３２Ｎ、Ｑ１７３Ｒ）をこのクローンの背景に加えて、Ｍ２．２と称するＮＫ１変異体を生成した。これらの変異のさらなる配列分析は、以下でさらに論じられるいくつかの興味深い観察を強調した。
２つの戦略からの選別生成物は、完全に同じクローンの多くを産生しなかったが、コンセンサス配列において顕著なオーバーラップを示した。Ｍ２（２回目の指向性進化）生成物において観察されたＩ１２５ＴとＮ１２７Ｄとの間の負の相関は、Ｍ３（３回目の指向性進化）生成物に残存した。配列決定した３０のクローンのうち、２５は、Ｎ１２７Ｄ変異を含有し、そのいずれもＩ１２５Ｔ変異も含有しなかった。しかしながら、Ｎ１２７Ｄを含有しない５つのクローンの各々は、Ｉ１２５Ｔ変異を含有しなかった。Ｋ６２Ｅ／Ｖ６４Ａ及びＩ１３０Ｖ／Ｋ１３２Ｎコンセンサス変異は、２つのアミノ酸間隔のみで生じた。
Ｍ２生成物からの８つのコンセンサス変異のすべてがＭ３生成物に存在した（Ｍ２．２＝Ｋ６２Ｅ、Ｑ９５Ｒ、Ｎ１２７Ｄ、Ｋ１３２Ｎ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、Ｑ１７３Ｒ、Ｎ１９３Ｄを想起されたい）。Ｍ３生成物の５０％超で生じた５つの追加のコンセンサス変異があった：Ｖ６４Ａ、Ｎ７７Ｓ、Ｉ１３０Ｖ、Ｓ１５４Ａ、及びＦ１９０Ｙ。
Figure 2022531191000006
実施例３．ＮＫ１の産生
２．１ 酵母株Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける野生型ＮＫ１及びＮＫ１変異体の可溶性産生。簡潔には、Ｎ末端ＦＬＡＧエピトープタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）及びＣ末端ヘキサヒスチジンタグを含有する野生型ＮＫ１、Ｍ２．１、またはＭ２．２をコードするＤＮＡを、分泌プラスミドｐＰＩＣ９Ｋにクローニングした。構築物をＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓに形質転換し、４ｍｇ／ｍＬのジェネティシンを含有するＹＰＤ－寒天プレート上での増殖のために選択し、培養上清のウエスタンブロットによってＮＫ１発現についてスクリーニングした。図７Ａ（米国特許第９，５５６，２４８号から）は、Ｍ２．１及びＭ２．２が３０℃で良好に発現する一方で、野生型ＮＫ１がはるかに低いレベルで発現することを示す。このデータは、酵母表面提示を使用した増加したタンパク質安定性のための操作も改善された組換え発現レベルをもたらすことを報告する以前の研究と一致する。しかしながら、発現温度を２０℃に低下させることは、野生型ＮＫ１の効率的な発現を可能にした（データ図示せず）。ＮＫ１及び変異体発現を振盪フラスコ培養下で０．５Ｌまでスケールアップし、固定化ニッケル親和性クロマトグラフィーを使用して精製し、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でゲル濾過した。数ミリグラムの変異体Ｍ２．１及びＭ２．２が、任意の最適化なしに１つの０．５Ｌ振盪フラスコから得られ、誘導条件を修正することによって、または発酵を介してさらに高い収率を得ることができることを示唆する。
２．２ 変異体Ｍ２．１及びＭ２．２は野生型ＮＫ１よりも高い熱的安定性を示す。熱的安定性を試験するために、Ｍ２．１及びＭ２．２を酵母細胞表面上に発現させ、様々な温度に加熱し、蛍光標識されたＭｅｔ－Ｆｃへの結合の保持をフローサイトメトリーにより測定した（米国特許第９，５５６，２４８号からの図８Ａ）。ＮＫ１変異体Ｍ２．１及びＭ２．２は、酵母の表面でそれぞれ６１．０±１．４℃及び６１．４±０．７℃のＴｍ値を有する。酵母提示野生型ＮＫ１は、酵母細胞表面上に機能的に発現されなかったため、安定性を監視することができなかった。
可溶性タンパク質の安定性を試験するために、精製された可溶性変異体の二次構造アンフォールディングを、Ｊａｓｃｏ Ｊ－８１５ＣＤ分光計で円二色性（ＣＤ）を使用して監視した。変異タンパク質のＣＤスキャンは、主にβシート構造要素に起因して、２０８ｎｍでピークを特定した。Ｍ２．１及びＭ２．２のＣＤスキャンは、野生型ＮＫ１のＣＤスキャンと類似しており、変異タンパク質が野生型ＮＫ１と同じ全体的な二次構造要素を含有することを図示する（米国特許第９，５５６，２４８号からの図８Ｂ）。８０℃での野生型ＮＫ１のＣＤスペクトルはランダムコイルのＣＤスペクトルに似ており、円二色性を使用した二次構造要素のアンフォールディングを監視する能力を示す（図８Ｂ）。この情報を使用して、この二次構造のアンフォールディングを可変温度ＣＤスキャンによって監視した（図８Ｃ）。これらのアッセイのそれぞれにおいて、Ｍ２．１及びＭ２．２は、野生型ＮＫ１（Ｔｍ＝５０．９±０．２℃）と比較して、より高い熱的安定性（それぞれ、６３．６±０．３℃及び６７．８±０．２℃）を示した。これらの結果をさらに確認するために、Ｍ２．１のランダムコイルの融解に対する２３６ｎｍでの局所最大の融解を監視した。同じＴｍが２０８ｎｍでの融解について観察された。ＣＤ温度融解によって決定された野生型及び変異ＮＫ１タンパク質の熱的安定性（Ｔｍ）の要約を表８に示す。
Figure 2022531191000007
２．３ 塩濃度がタンパク質の安定性に与える影響。その構造完全性を維持するために、野生型ＮＫ１は、高い塩濃度（＞２００～３００ｍＭのＮａＣｌ）を含有する緩衝液中で維持されなければならないことが観察された。この要件のさらなる証拠として、野生型ＮＫ１は、中程度の塩濃度（１３７ｍＭ）を含有する緩衝液を用いたサイズ排除クロマトグラフィーで広範な遅延溶出プロファイルを示し（米国特許第９，５５６，２４８号からの図９及び挿入図）、これらの条件下でのアンフォールディング及び／またはカラムへの非特異的結合を示唆した。対照的に、Ｍ２．１及びＭ２．２は、同様の中等度の塩条件下でのサイズ排除クロマトグラフィーで、単一の鋭いピークとして溶出した（米国特許第９，５５６，２４８号からの図９）。
実施例４．ＮＫ１の特徴付け
３．１ ＮＫ１ホモ二量体化界面残基Ｎ１２７における点変異は、Ｎ及びＫ１ドメインを接続するリンカー領域内にある（図１）。このアスパラギン残基の側鎖は、２つの水素結合を形成する。Ｎ１２７Ｄバリアントは、ライブラリ単離されたバリアントの間で頻繁に観察された。（表２及び３）。Ｍ２．２内のＮ１２７Ｄ変異が生物学的活性に与える影響を調べるために、この位置で一連の点変異体を生成した。アラニン残基は、ＮＫ１ホモ二量体の安定化相互作用を妨害することによって、野生型ＮＫ１をアゴニストからアンタゴニストに変換する。この位置でのリジンまたはアルギニンへの変異の影響を試験した。これらの置換は、かさ高い荷電側鎖を介して立体及び静電妨害物を導入する。
加えて、点変異体Ｄ１２７Ｎを分析した。これにより、この位置を野生型アスパラギン残基に戻す。Ｎ１２７Ｄ変異を含有するＭ２．２の文脈内では、これらの変異は、Ｄ１２７Ａ、Ｄ１２７Ｋ、Ｄ１２７Ｒ、及びＤ１２７Ｎと称される。重要なことに、これらの変異体の各々は、Ｍ２．２に関連する高い熱的安定性を保持した（表５）。
３．２ Ｍｅｔ受容体アゴニストまたはアンタゴニストとしてのＮＫ１変異体の特徴付け。ＮＫ１変異体は、ＭＤＣＫ細胞散乱及びｕＰＡアッセイにおいて評価され、２つのアッセイは、哺乳類細胞におけるＭｅｔ受容体の活性化を研究するために広く使用されている。ＭＤＣＫ細胞散乱アッセイについて、１５００個の細胞／ウェルを１００μＬの完全成長培地の９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ ＣＯ２でインキュベートした。２４時間後、培地を吸引によって除去し、それぞれ０．１または１００ｎＭの濃度のＨＧＦまたはＮＫ１タンパク質を含有する培地に置き換えた。いくつかの実験では、ｌｏｖｅｎｏｘ（登録商標）ヘパリン（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）を２μＭの濃度で、または２：１のヘパリン：ＮＫ１のモル比で使用した。２４時間後、細胞を固定し、室温で１０分間、５０％エタノール中０．５％クリスタルバイオレットで染色し、水で洗浄し、風乾させた後、写真を撮った。細胞を２５０ｎＭのＮＫ１変異体と共に３０分間インキュベートした後、ＨＧＦを０．１ｎＭの最終濃度で加えたことを除いて、ＭＤＣＫ散乱阻害アッセイを同様の方法で行った。
ＭＤＣＫ ｕＰＡアッセイについて、４０００個の細胞／ウェルを１００μＬの完全成長培地の９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ ＣＯ２でインキュベートした。２４時間後、培地を吸引によって除去し、それぞれ１または１００ｎＭの濃度のＨＧＦまたはＮＫ１を含有する培地に置き換えた。２４時間後、細胞を２００μＬのフェノールレッド不含ＤＭＥＭで２回洗浄し、１００ｍＭのグリシン（ｐＨ３．５）
溶液中に５０ ％（体積／体積）の０．０５単位／ｍＬのプラスミノーゲン（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、４０％（体積／体積）の５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１０％（体積／体積）及び３ｍＭのｃｈｒｏｍｏｚｙｍ ＰＬ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を含有する２００μＬの反応緩衝液と共にインキュベートした。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．）を使用して４０５ｎｍで吸光度を測定した。
変異体Ｍ２．２ Ｄ１２７Ａ、Ｄ１２７Ｋ、及びＤ１２７Ｒは、ＭＤＣＫ細胞における散乱（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１０及び図１１Ａ）またはｕＰＡ活性化（図１１Ｂ）によって測定されるように、Ｍｅｔ活性化を誘導しなかった。Ｎ１２７Ｄ変異を含有する未修飾Ｍ２．２バリアントは、弱い（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１１Ａ）またはまったく（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１０及び図１１Ｂ）アゴニスト活性を示さなかった。
対照的に、１２７位を野生型アスパラギン残基に戻す（Ｍ２．２ Ｄ１２７Ｎ）ことは、ＭＤＣＫ散乱（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１０及び図１１Ａ）及びｕＰＡアッセイ（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１１Ｂ）の両方においてアゴニスト活性をもたらした。Ｍ２．２ Ｄ１２７Ｎの活性は、野生型ＮＫ１の活性と同様であり、両方とも可溶性ヘパリンの存在下での活性の増強を示した（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１１Ｃの上部対下部）。比較して、Ｍ２．２Ｄ１２７Ａ、Ｄ１２７Ｋ、及びＤ１２７Ｒは、ヘパリンの存在下または不在下のいずれにおいてもこれらのアッセイにおいてアゴニスト活性を示さなかった（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１０及び図１１Ａ～Ｃ）。
これらの変異体がＨＧＦ誘導Ｍｅｔ活性化を阻害する能力を試験した。対照として、Ｍ２．２ Ｄ１２７Ｎは、ＨＧＦ誘導活性を阻害せず、Ｍｅｔ受容体アゴニストとしてのその機能のさらなる証拠を提供した（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１２）。Ｍ２．２変異体Ｄ１２７Ａ、Ｄ１２７Ｋ、及びＤ１２７Ｒは、可溶性ヘパリンの不在下でＨＧＦ誘導ＭＤＣＫ散乱の弱いまたは最小限の阻害を示した（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１２、上部）。
対照的に、２μＭのヘパリンを加えたことにより強いアンタゴニスト活性を観察した（図１２、下部）。２：１のヘパリン：ＮＫ１のモル比でのＮＫ１変異体の予備製剤化は、このアンタゴニスト活性を付与するのに十分であり、アンタゴニスト活性の改善のために過剰なヘパリンを加える必要性を取り除いた（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１３）。未修飾Ｍ２．２（Ｍ２．２ Ｎ１２７Ｄ）は、ヘパリンの２：１のモル比で弱いアンタゴニスト活性のみを示し（米国特許第９，５５６，２４８号の図１３）、合理的に操作された点変異の有用性を支持する。Ｍ２．２ Ｄ１２７Ｋのアンタゴニスト活性は、以前に報告されたアンタゴニストＮＫ１ Ｎ１２７Ａのものと同様である（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１３）。しかしながら、Ｍ２．２ Ｄ１２７Ａ／Ｋ／及びＲ変異体は、ＮＫ１ Ｎ１２７Ａと比較して顕著に改善された安定性及び発現、つまり、より低い塩依存的安定性、約１５℃の増加したＴｍ、及び約４０倍の改善された組換え発現収率を有し、これらはすべて魅力的な特性である。
４．１ 組換えＡｒａｓ－４の生化学的及び生物学的特徴付け。配列分布、酵母表面発現レベル、及びＭｅｔ－Ｆｃ結合に基づいて、３回目の指向性進化からのクローンのうちの５つをさらなる調査のために選択した。これらのクローンは、Ａｒａｓ－１、－２、－３、－４、及び－５と称された（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１４）。これらのクローンのそれぞれは、Ａｒａｓ－１を除いて、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて十分に発現されることが分かった。
Ａｒａｓ－４をさらなる特徴付けのために選択した。ＣＤ温度融解によって決定されるように、それは高い熱的安定性を示した（Ｔｍ＝６４．９±１．２℃）。Ａｒａｓ－４は、ＭＤＣＫ細胞の培養物に加えられた場合、細胞Ｍｅｔを活性化せず、Ｍ２．２ Ｄ１２７Ａまたは野生型ＮＫ１に基づくアンタゴニストＮＫ１ Ｎ１２７Ａより約５倍低い濃度で、ＭｅｔのＨＧＦ誘導活性化を効果的に阻害した（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１５）。
４．２ 共有結合二量体を形成するためのジスルフィド結合の導入。遊離システイン残基をＭ２．２ Ｄ１２７ＮのＮ末端に導入し、これは組換え発現時に単量体及び二量体種の形成をもたらした。シスチン結合二量体タンパク質（ｃｄＤ１２７Ｎと称される）を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して単量体から精製した。還元及び非還元条件下でのｃｄＤ１２７ＮのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、二量体が共有結合のジスルフィド結合を介して形成されることを確認した。（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１６）。シスチン結合二量体Ｍ２．２ Ｄ１２７Ｋ（ｃｄＤ１２７Ｋと称される）及びＡｒａｓ－４（ｃｄＡｒａｓ－４と称される）ポリペプチドも生成した。
４．３ ｃｄＤ１２７Ｎ、ｃｄＤ１２７Ｋ、及びｃｄＡｒａｓ－４の生物学的活性。ｃｄＤ１２７Ｎ及びｃｄＤ１２７Ｋは、野生型ＮＫ１と同様のアゴニスト活性を有するＭ２．２ Ｄ１２７Ｎ単量体よりも１桁低い濃度でアゴニスト活性を示した（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１７）。親単量体Ｍ２．２ Ｄ１２７Ｋがアンタゴニストであるため、ｃｄＤ１２７Ｋのアゴニスト活性は驚くべきことである。同様に、共有結合がアンタゴニストＡｒａｓ－４をアゴニストに変換したｃｄＡｒａｓ－４の結果も驚くべきことである。観察されるアゴニスト活性のレベルは、全長ＨＧＦのものに近づくが、ｃｄＤ１２７Ｎ、ｃｄＤ１２７Ｋ、及びｃｄＡｒａｓ－４は、全長ＨＧＦに対して実質的に改善された安定性を有し、酵母において組換え発現され得る。
４．４ Ｎ末端システインのみがホモ二量体化を直接媒介する。ＮＫ１ホモ二量体の結晶構造に基づいて、１２７位が隣接するプロトマー上で近接していることが認識された。これは、この位置にシステイン残基を配置することによって共有結合ホモ二量体を形成する可能性を示唆した。この可能性を試験するために、残基Ｄ１２７をＣｙｓで置換したバリアントＡｒａｓ－４ポリペプチドを生成した。結果として生じるポリペプチドは、大部分は、図１８（米国特許第９，５５６，２４８号から）に示すように、自発的またはフェナトロリン硫酸銅処理後のいずれかで二量体を産生することができなかった。
ＮＫ１及びバリアントのＮ末端に遊離システインを付加することによる共有結合に加えて、他の位置及びリンカーを試験した。（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１９）。遊離システイン、または遊離システインとシステインタグとの組み合わせ（Ｂａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１３（４）：５０４－５０９）を、Ａｒａｓ－４バリアントのＮ末端またはＣ末端に結合させた。Ｎ末端の遊離システインのみが酵母における組換え発現時に二量体タンパク質をもたらした。
５．０ ヘパリンアルギン酸ペレットを含有するＨＧＦバリアントポリペプチドの調製。アルギン酸カルシウムペレットは、活性及び貯蔵時間の保持が増強したため、ＨＧＦに安定したプラットフォームを提供し得、したがって、ＨＧＦバリアント放出を制御するためのデバイスとして使用することができる。ヘパリン－セファロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ）は、紫外線下で３０分間滅菌され、次いで濾過滅菌アルギン酸ナトリウムと混合され得る。次いで、混合スラリーを、ＣａＣｌ２（１．５％重量／体積）の硬化溶液を含有するビーカー内に針を通して滴下することができる。ビーズがすぐに形成し得る。架橋カプセルエンベロープは、ＣａＣｌ２溶液中のカプセルを穏やかな混合下で５分間、次いで混合せずに１０分間インキュベートすることによって得ることができる。形成されたビーズを、滅菌水で洗浄し、０．９％ＮａＣｌ－１ｍｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ２中に４℃で貯蔵することができる。ＨＧＦ充填は、０．９％ＮａＣｌ－１ｍｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ２－０．０５％ゼラチン中の１０個のカプセルを、１２．５μｇ（１０μｇ用量の場合）もしくは１２５μｇ（１００μｇ用量の場合）、またはＨＧＦバリアントと共に、４℃で穏やかな撹拌下で１６時間インキュベートすることによって行うことができる。最終生成物は、紫外線下で３０分間滅菌され得る。

Claims (23)

  1. 眼疾患及び／または眼障害の治療及び／または予防を必要とする対象においてそれらを治療及び／または予防する方法であって、本明細書に記載のヒト肝細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）バリアントを前記対象に投与することを含む、前記方法。
  2. 前記眼疾患及び／または前記眼障害が、遷延性角膜上皮欠損（ＰＣＥＤ）である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ｈＨＧＦバリアントが、配列番号８の野生型ｈＨＧＦと比較して、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸付加、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記ｈＨＧＦバリアントが、ホモ二量体である、請求項１～３に記載の方法。
  5. 前記ｈＨＧＦバリアントが、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、及び／または配列番号３０のいずれか１つに記載の配列のホモ二量体、ならびに任意選択でリンカーを含むＮＫ１ホモ二量体である、請求項１～４に記載の方法。
  6. 前記ｈＨＧＦバリアントが、６２位、１２７位、１３７位、１７０位、または１９３位に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１～５に記載の方法。
  7. 前記ｈＨＧＦバリアントが、Ｋ６２Ｅ、Ｎ１２７Ｄ／Ａ／Ｋ／Ｒ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、及びＮ１９３Ｄからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１～６に記載の方法。
  8. 前記ｈＨＧＦバリアントが、アミノ酸置換Ｋ６２Ｅ、Ｎ１２７Ｄ／Ａ／Ｋ／Ｒ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、及びＮ１９３Ｄを含む、請求項１～７に記載の方法。
  9. 前記ｈＨＧＦバリアントが、Ｍｅｔのアンタゴニストである、請求項１～８に記載の方法。
  10. 前記ｈＨＧＦバリアントが、Ｍｅｔのアゴニストである、請求項１～９に記載の方法。
  11. 前記ｈＨＧＦバリアントが、検出可能な部分、水溶性ポリマー、水不溶性ポリマー、治療部分、標的化部分、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーにコンジュゲートされる、請求項１～１０に記載の方法。
  12. 前記ｈＨＧＦバリアントが、６４位、７７位、９５位、１２５位、１３０位、１３２位、１４２位、１４８位、１５４位、及び１７３位のうちの１つ以上にアミノ酸置換をさらに含む、請求項１～１１に記載の方法。
  13. 前記ｈＨＧＦバリアントが、本明細書の図１０に提供される米国特許第９，５５６，２４８号からの配列番号２～２２からなる群から選択される配列を含む、請求項１～１１に記載の方法。
  14. 前記ｈＨＧＦバリアントが、アミノ酸置換Ｋ６２Ｅ、Ｑ９５Ｒ、Ｉ１２５Ｔ、Ｎ１２７Ｄ／Ａ／Ｋ／Ｒ、Ｉ１３０Ｖ、Ｋ１３２Ｎ／Ｒ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、Ｑ１７３Ｒ、及びＮ１９３Ｄを含む、請求項１～１１に記載の方法。
  15. 前記ｈＨＧＦバリアントが、６４位、７７位、１４２位、１４８位、及び１５４位のうちの１つ以上にアミノ酸置換をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記ｈＨＧＦバリアントが、アミノ酸置換Ｋ６２Ｅ、Ｑ９５Ｒ、Ｋ１３２Ｎ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、Ｑ１７３Ｒ、及びＮ１９３Ｄを含む、請求項１～１１に記載の方法。
  17. 前記ｈＨＧＦバリアントが、６４位、７７位、１２５位、１２７位、１３０位、１４２位、１４８位、及び１５４位のうちの１つ以上にアミノ酸置換をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記ｈＨＧＦバリアントが、アミノ酸置換Ｋ６２Ｅ、Ｑ９５Ｒ、Ｎ１２７Ｄ／Ａ／Ｋ／Ｒ、Ｋ１３２Ｎ／Ｒ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、Ｑ１７３Ｒ、及びＮ１９３Ｄを含む、請求項１～１１に記載の方法。
  19. 前記ｈＨＧＦバリアントが、６４位、７７位、１２５位、１３０位、１４２位、１４８位、及び１５４位のうちの１つ以上にアミノ酸置換をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記ｈＨＧＦバリアントが、配列番号２～２２からなる群から選択される配列を含む、請求項１～１９に記載の方法。
  21. 前記ｈＨＧＦバリアントが、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、及び／または配列番号３０のいずれか１つに記載の配列のホモ二量体、ならびに任意選択でリンカーを含むＮＫ１ホモ二量体である、請求項１～１９に記載の方法。
  22. 前記ｈＨＧＦバリアントが、配列番号２５に記載の配列のホモ二量体を含むＮＫ１ホモ二量体である、請求項１～１９に記載の方法。
  23. 前記ｈＨＧＦバリアントが、配列番号２６に記載の配列のホモ二量体を含むＮＫ１ホモ二量体である、請求項１～４に記載の方法。
JP2021564317A 2019-04-29 2020-04-27 肝細胞増殖因子の操作された二量体断片を使用する眼の治療方法 Pending JP2022531191A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962840296P 2019-04-29 2019-04-29
US62/840,296 2019-04-29
PCT/US2020/030116 WO2020223169A1 (en) 2019-04-29 2020-04-27 Methods of ocular treatment using an engineered dimeric fragment of hepatocyte growth factor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2022531191A true JP2022531191A (ja) 2022-07-06

Family

ID=73029399

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021564317A Pending JP2022531191A (ja) 2019-04-29 2020-04-27 肝細胞増殖因子の操作された二量体断片を使用する眼の治療方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20220184181A1 (ja)
EP (1) EP3962511A4 (ja)
JP (1) JP2022531191A (ja)
KR (1) KR20220002271A (ja)
CN (1) CN113645989A (ja)
AU (1) AU2020265211A1 (ja)
CA (1) CA3135676A1 (ja)
MA (1) MA55814A (ja)
WO (1) WO2020223169A1 (ja)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011116396A2 (en) * 2010-03-19 2011-09-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Hepatocyte growth factor fragments that function as potent met receptor agonists and antagonists
DK2638173T3 (da) * 2010-11-08 2019-09-30 Univ Leland Stanford Junior Fusionsproteiner omfattende et manipuleret knottin-peptid og anvendelser deraf
AU2016320905B2 (en) * 2015-09-11 2021-10-07 The Schepens Eye Research Institute, Inc. Compositions and methods for prevention and treatment of corneal haze and scarring

Also Published As

Publication number Publication date
CN113645989A (zh) 2021-11-12
EP3962511A1 (en) 2022-03-09
AU2020265211A1 (en) 2021-10-07
WO2020223169A1 (en) 2020-11-05
US20220184181A1 (en) 2022-06-16
CA3135676A1 (en) 2020-11-05
KR20220002271A (ko) 2022-01-06
MA55814A (fr) 2022-03-09
EP3962511A4 (en) 2023-01-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220033453A1 (en) Hepatocyte growth factor fragments that function as potent met receptor agonists and antagonists
JP4793836B2 (ja) 線維芽細胞増殖因子様ポリペプチド
TWI526220B (zh) Ｆｇｆ２１突變體及其用途
KR101651703B1 (ko) Ｆｇｆ21 돌연변이체 및 이의 용도
JPH06508742A (ja) 組換えトロンビンレセプターおよびそれに関連した薬剤
JPH03195495A (ja) 骨形態形成タンパク
AU2004240553A1 (en) Compositions and methods for the preparation of human growth hormone glycosylation mutants
US10023624B2 (en) Long-acting recombinant human follicle-stimulating hormone-Fc fusion protein
JP2003530867A (ja) トロンボポエチン受容体モジュレートペプチド
JP2022531191A (ja) 肝細胞増殖因子の操作された二量体断片を使用する眼の治療方法
MXPA04008798A (es) Moleculas semejantes a interferon beta para el tratamiento de evento cerebrovascular.
KR20210090177A (ko) 치료를 위한 조작된 간세포 성장 인자 변이체와 결합된 조작된 섬유아세포 성장 인자 변이체
KR20210091147A (ko) 수용체 길항제로서의 조작된 섬유아세포 성장 인자 변이체
JP2004518638A (ja) 癌を予防及び／又は治療するためのタンパク質ｅｓｍ−１のアンタゴニスト化合物の使用、及び癌を予防及び／又は治療するための薬剤の製造
JP2024075579A (ja) 骨髄増殖性腫瘍関連骨髄線維症及び貧血を治療するための方法
JP2020524139A (ja) 骨髄増殖性腫瘍関連骨髄線維症及び貧血を治療するための方法

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230425

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240502