KR20210090177A - 치료를 위한 조작된 간세포 성장 인자 변이체와 결합된 조작된 섬유아세포 성장 인자 변이체 - Google Patents
치료를 위한 조작된 간세포 성장 인자 변이체와 결합된 조작된 섬유아세포 성장 인자 변이체 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 치료에 사용하기 위한 폴리펩타이드 변이체, 구체적으로 각막 상피 결손(PCED) 및/또는 각막 혈관신생을 치료하기 위해 조합하여 사용하기 위한 섬유아세포 성장 인자(FGF)의 변이체 및 간세포 성장 인자(HGF)의 변이체를 제공한다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 10월 9일자로 출원되고 명칭이 "Engineered Fibroblast Growth Factor Variants Combined With Engineered Hepatocyte Growth Factor Variants For Treatment"인 미국 가특허 출원 제62/743,416호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
본 발명의 분야
본 발명은 치료에 사용하기 위한 폴리펩타이드 변이체, 구체적으로 조합하여 사용하기 위한 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor: FGF)의 변이체 및 얻어지는 FGF1 변이체 성장 인자(hepatocyte growth factor: HGF)의 변이체의 분야에 관한 것이다.
인간 성장 인자는 상처 치유, 조직 재생, 혈관형성, 및 종양 형성과 같은 다수의 복잡한 과정을 조율하는 데 중추적인 역할을 한다1 -4. 따라서, 다양한 질환 및 병태에서 상처 치유 및 재생 과정을 가속화시키거나, 암 성장 및 혈관형성을 저해하기 위한 단백질 치료제로서 성장 인자를 이용하는 데 엄청난 관심이 있다5 -7. 그러나, 수많은 재조합 성장 인자가 치료제로 개발되었음에도 불구하고, 단지 소수의 후보만이 임상 승인을 받을 만큼 효과적이었다8,9. 이는 대부분, 일반적으로 낮은 안정성 및 빠른 혈액 청소율에 기인한 생체내 성장 인자의 짧은 유효 반감기로 인한 것이다5,10. 치료용 성장 인자는 효과적이기 위해 장기간 동안 상처 부위에서 활성 상태를 유지하여야 한다. 그러나, 성장 인자는 생리적 온도와 프로테아제에 노출시 변성되거나 분해될 수 있다11 ,12. 플라스민 및 메탈로프로테이나제와 같은 프로테아제는 특히 조직 리모델링에서 활성적이기 때문에, 프로테아제-매개 분해에 대한 내성이 특히 중요할 수 있다13.
눈과 관련하여, 눈의 돔 형상의 가장 바깥쪽 조직으로서의 보호 역할에도 불구하고, 보통 투명한 각막은 손상 또는 질환으로 인한 궤양, 흉터, 및 혼탁화에 매우 취약하다. 각막의 중증 손상 및 질환에 있어서, 현재 이용 가능한 수많은 그러나 대부분의 지지적 조치에도 불구하고 영구적인 흉터 및 시력 손실이 종종 뒤따른다.1 말기 각막 실명은 보통 투명한 각막 층 중 하나 이상의 혈관신생 및 혼탁화에 이은 부종 및 섬유증 흉터를 특징으로 한다. 안구 표면의 거의 모든 실명 장애는 그것이 감염성(예를 들어, 중증 각막 궤양 또는 헤르페스성 각막염), 면역-매개성(예를 들어, 스티븐스-존슨 증후군), 및 또는 외상성(예를 들어, 알칼리 화상)인지 여부에 관계없이, 상피 결손의 손상된 치유로 시작되고, 불투명한 혈관화 각막으로 끝난다. 혈청 점안액1 및 양막2과 같은 조직-유래 치료법은 임상적으로 널리 사용되지만, 두 치료법의 분자 조성 및 기본 메커니즘은 여전히 불분명하다.2 반대로, 표피 성장 인자(EGF)와 같은 단일 재조합 성장 인자는 임상 시험에서 실패하였으며,3 이는 각막 상처 치유를 충분히 지원하기 위해 다인성 개입이 필요함을 시사한다.
eHGF 및 항-FGFR의 조합의 경우, 각막 혈관신생은 목표 미충족 요구이며, 이는 매사추세츠 눈 및 귀/하버드 의과대학(Massachusetts Eye and Ear/Harvard Medical School) 연구에서 발표된 4.14% 유병률의 외삽을 기반으로 매년 140만 명의 환자에게 영향을 미치는 것으로 추정된다. 비정상적인 각막 혈관신생(이에 대해서는 FDA-승인 치료법이 없음)은 전형적으로 PCED의 말기 또는 중증 징후 및/또는 외상 또는 질환을 통한 각막 주변의 상피 줄기세포의 손실 또는 파괴로서 일어난다. 이의 고전적인 예는 화학적 각막 화상으로, 이는 100,000명당 10.7명(모든 안구 외상의 11.5% 내지 22.1%를 나타냄)에게 영향을 미치며, 여기서 말초 줄기세포가 심하게 고갈되어, 치유 지연 및 각막으로의 혈관 성장을 야기한다. 화학적 화상, 구체적으로 알칼리 화상은 눈에 의해 지속될 수 있는 가장 치명적인 손상이라는 것은 거의 틀림이 없으며, 현재 이용 가능한 모든(대부분 지지적) 조치에도 불구하고 거의 예외 없이 각막 및 결막의 반흔화, 각질화, 혼탁화 및 혈관신생을 통해 실명으로 이어진다. 따라서, 이는 제안된 eHGF/항-FGFR 병용 요법에 의해 표적화된 다중 경로뿐만 아니라 확립된 동물 모델에 대한 이상적인 표적이며, 여기서 이들의 조합은 혈관신생 및 섬유증을 저해하면서 상피화를 촉진시키는 것으로 나타났다(도 40). 각막의 화학적 화상 이외에, 현재 치료법이 없지만 스티븐스-존슨 증후군, 윤부 줄기세포 결핍, 및 심지어 콘택트 렌즈 과도착용을 포함하는 eHGF/항-FGFR 병용 기술에 의해 잠재적으로 해결 가능한 각막 혈관신생의 수많은 다른 원인이 있으며, 이들 모두는 코어에서 투명한 무혈관 각막과 이에 인접한 고도의 혈관 결막 조직 사이의 장벽에서 손상을 나타낸다. 이러한 병용 요법은 새로운 조작된 HGF(eHGF) 단편으로8-11 재조합 간세포 성장 인자(rHGF)6 ,7의 알려진 영양 효과(trophic effect)를 개선시키고 이를 섬유아세포 성장 인자(FGF)의 신생혈관 및 섬유화 효과의 조작된 길항제와 조합시킬 것이다.
본 발명은 지속성 각막 상피 결손(persistent corneal epithelial defect: PCED)뿐만 아니라 각막 혈관신생의 치료 및/또는 예방에서 사용하기 위한 섬유아세포 성장 인자(FGF)의 변이체 및 간세포 성장 인자(HGF)의 변이체를 포함하는 병용 요법인 방법을 제공함으로써 이러한 요구를 충족시킨다.
본 발명은 인간 간세포 성장 인자(human hepatocyte growth factor: hHGF) 변이체 및 인간 섬유아세포 성장 인자 1(FGF1) 변이체를 대상체에게 투여하여 지속성 각막 상피 결손(PCED)을 치료하는 단계를 포함하는, PCED의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 지속성 각막 상피 결손을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명은 hHGF 변이체 및 FGF1 변이체를 대상체에게 투여하여 각막 혈관신생을 치료, 감소 및/또는 예방하는 단계를 포함하는, 각막 혈관신생의 치료, 감소 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 각막 혈관신생을 치료, 감소 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, FGF1은 아미노산 치환, 아미노산 결실, 아미노산 부가 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 구성원을 포함하고, 여기서 얻어지는 FGF1 변이체는 서열번호 1의 야생형 FGF1과 비교하여 증가된 단백질분해 안정성을 나타낸다.
일부 실시형태에서, FGF1 변이체는 β-루프에서 또는 C-말단 근처에서 아미노산 치환, 아미노산 결실, 아미노산 부가 및 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, FGF1 변이체는 섬유아세포 성장 인자 수용체(fibroblast growth factor receptor: FGFR) 길항제이다.
일부 실시형태에서, FGF1 변이체는 28, 40, 47, 93 또는 131번 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시형태에서, FGF1 변이체는 D28N, Q40P, S47I, H93G, L131R 및 L131K로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시형태에서, FGF1 변이체는 아미노산 치환 L131R을 포함한다.
일부 실시형태에서, FGF1 변이체는 아미노산 치환 L131K를 포함한다.
일부 실시형태에서, FGF1 변이체는 아미노산 치환 D28N 및 L131R을 포함한다.
일부 실시형태에서, FGF1 변이체는 아미노산 치환 D28N 및 L131K를 포함한다.
일부 실시형태에서, FGF1 변이체는 아미노산 치환 Q40P, S47I, H93G 및 L131R을 포함한다.
일부 실시형태에서, FGF1 변이체는 아미노산 치환 Q40P, S47I, H93G 및 L131K를 포함한다.
일부 실시형태에서, FGF1 변이체는 아미노산 치환 D28N, Q40P, S47I, H93G 및 L131R을 포함한다.
일부 실시형태에서, FGF1 변이체는 아미노산 치환 D28N, Q40P, S47I, H93G 및 L131K를 포함한다.
일부 실시형태에서, FGF1 변이체는 아미노산 치환 L131A를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, hHGF 변이체는 서열번호 8의 야생형 hHGF와 비교하여 아미노산 치환, 아미노산 결실, 아미노산 부가 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 구성원을 포함한다.
일부 실시형태에서, hHGF 변이체는 62, 127, 137, 170, 또는 193번 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시형태에서, hHGF 변이체는 K62E, N127D/A/K/R, K137R, K170E 및 N193D로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시형태에서, hHGF 변이체는 아미노산 치환 K62E, N127D/A/K/R, K137R, K170E 및 N193D를 포함한다.
일부 실시형태에서, hHGF 변이체는 Met의 길항제이다.
일부 실시형태에서, hHGF 변이체는 Met의 효현제(agonist)이다.
일부 실시형태에서, hHGF 변이체는 검출 가능한 모이어티, 수용성 중합체, 수불용성 중합체, 치료용 모이어티, 표적화 모이어티, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원에 접합된다.
일부 실시형태에서, hHGF 변이체는 64, 77, 95, 125, 130, 132, 142, 148, 154 및 173번 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, hHGF 변이체는 미국 특허 제9,556,248호의 서열번호 2 내지 22(도 41에서 제공됨)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, hHGF 변이체는 아미노산 치환 K62E, Q95R, I125T, N127D/A/K/R, I130V, K132N/R, K137R, K170E, Q173R 및 N193D를 포함한다.
일부 실시형태에서, hHGF 변이체는 64, 77, 142, 148 및 154번 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, hHGF 변이체는 아미노산 치환 K62E, Q95R, K132N, K137R, K170E, Q173R 및 N193D를 포함한다.
일부 실시형태에서, hHGF 변이체는 64, 77, 125, 127, 130, 142, 148 및 154번 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 hHGF 변이체는 아미노산 치환 K62E, Q95R, N127D/A/K/R, K132N/R, K137R, K170E, Q173R 및 N193D를 포함한다.
일부 실시형태에서, hHGF 변이체는 64, 77, 125, 130, 142, 148 및 154번 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, hHGF 변이체는 서열번호 2 내지 22로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, HGF 변이체는 효현제이고 FGF1 변이체는 길항제이다.
도 1. 단백질분해 안정성의 조작을 위한 성장 인자의 효모 디스플레이. 관심 성장 인자(GF)는 부착 단백질 응집소 Aga2p에 대한 융합체로서 발현되며, 이는 2개의 이황화 결합에 의해 세포벽 단백질 Aga1p에 부착된다. 프로테아제와 함께 인큐베이션하면, 절단은 성장 인자 내에서(성장 인자-특이적 절단) 또는 효모 디스플레이 단백질 Aga1p 또는 Aga2p 내에서(비-특이적 절단) 일어날 수 있다. 성장 인자 수용체의 가용성 Fc 융합체(GFR-Fc)와 함께 인큐베이션한 후, 형광 항체를 사용하여 HA 태그, c-myc 태그, 및 Fc 도메인에 대하여 염색할 수 있다. HA 신호를 사용하여 성장 인자의 기본 발현 수준과 프로테아제에 의한 비-특이적 절단을 측정한다. c-myc 신호는 GF-특이적 절단을 측정하기 위한 HA 신호와 결합되어 있다. Fc 신호를 사용하여 GF 변성 수준 및 이의 수용체에 대한 GF의 결합 친화성을 측정한다.
도 2. 단백질분해 안정성 성장 인자 돌연변이체에 대한 FACS -기반 스크리닝 방법. 성장 인자 돌연변이체의 라이브러리를 EBY100 효모 세포로 형질전환시키고 효모 디스플레이에 의해 성장 인자를 디스플레이하도록 유도한다. 세포를 프로테아제와 함께 인큐베이션하고, 세척한 다음, 수용체의 가용성 Fc-융합체와 함께 인큐베이션한다. 적절한 형광 항체로 표지화한 후, 유동 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 단백질분해 절단의 수준이 낮고 가용성 수용체에 대한 결합의 수준이 높은 돌연변이체를 발현하는 세포를 게이팅하고 수집한다. 이러한 인큐베이션 및 세포 분류 과정을 여러 번 순환시켜 단백질분해 안정성 수준이 가장 높은 돌연변이체를 확인한다.
도 3. FGF1의 효모 디스플레이. (A) FGF1은 부착 단백질 응집소 Aga2p에 대한 융합체로서 발현되며, 이는 2개의 이황화 결합에 의해 세포벽 단백질 Aga1p에 부착된다. FGFR1-Fc는 FGF1에 결합하는 상응하는 가용성 수용체이다. (B) c-myc 태그의 형광 표지화는 FGF1이 효모의 표면 상에서 성공적으로 발현됨을 나타낸다. (C) FGFR1의 Fc 융합체는 효모-디스플레이 FGF1에 대한 특이적 결합을 나타낸다. 표면-디스플레이 FGF1을 발현하는 효모를 다양한 농도에서 3시간 동안 가용성 FGFR1-Fc와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고 가용성 FGFR1-Fc에 대한 항-Fc AlexaFluor488로 염색하였다. 효모 세포에 대한 결합과 연관된 형광을 유세포분석에 의해 측정하고 플롯팅하였다.
도 4. 소태아혈청을 이용한 단백질분해 안정성 분석. FGF1 돌연변이체 라이브러리를 디스플레이하는 효모 세포를 다양한 농도의 소태아혈청과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고 10nM FGFR1-Fc와 함께 인큐베이션한 후 세포를 c-myc 및 가용성 수용체의 Fc 도메인에 대한 형광 항체로 염색하였다. 유세포분석에 의한 분석은 FBS의 농도를 증가시키는 것이 FGF1-특이적 절단 신호뿐만 아니라 FGFR1-Fc 결합 신호에 대하여 상대적으로 거의 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
도 5. 트립신을 이용한 단백질분해 안정성 분석. FGF1을 디스플레이하는 효모 세포를 다양한 농도의 트립신과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고 10nM FGFR1-Fc와 함께 인큐베이션한 후, 세포를 c-myc 및 가용성 수용체의 Fc 도메인에 대한 형광 항체로 염색하였다. 유세포분석에 의한 분석은 트립신의 농도를 증가시키는 것이 효모 디스플레이 단백질의 절단(c-myc 감소) 및 FGFR1-Fc에 대한 결합 손실을 야기함을 나타낸다.
도 6. 키모트립신을 이용한 단백질분해 안정성 분석. FGF1을 디스플레이하는 효모 세포를 다양한 농도의 키모트립신과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고 10nM FGFR1-Fc와 함께 인큐베이션한 후, 세포를 c-myc 및 가용성 수용체의 Fc 도메인에 대한 형광 항체로 염색하였다. 유세포분석에 의한 분석은 키모트립신의 농도를 증가시키는 것이 효모 디스플레이 단백질의 절단(c-myc 감소) 및 FGFR1-Fc에 대한 결합 손실을 야기함을 나타낸다.
도 7a 내지 도 7b. 트립신에 의한 효모 디스플레이 단백질 Aga1 및 Aga2의 비-특이적 절단. FGF1을 디스플레이하는 효모 세포를 다양한 농도의 트립신과 함께 인큐베이션하였다. 세척한 후, 세포를 HA 및 c-myc에 대한 형광 항체로 염색하였다. 유세포분석에 의한 분석은 트립신의 농도를 증가시키는 것이 HA 신호의 손실을 야기함을 나타내며, 이는 효모 디스플레이 단백질 Aga1 및 Aga2의 비-특이적 절단을 나타낸다.
도 8a 내지 도 8b. 키모트립신에 의한 FGF1 -특이적 절단. FGF1을 표시하는 효모 세포를 다양한 농도의 트립신과 함께 인큐베이션하였다. 세척한 후, 세포를 HA 및 c-myc에 대한 형광 항체로 염색하였다. 유세포분석에 의한 분석은 키모트립신의 농도를 증가시키는 것이 c-myc 신호의 손실을 야기하지만 HA 신호의 손실은 야기하지 않음을 나타내며, 이는 FGF1-특이적 절단이 일어남을 나타낸다.
도 9. 플라스민을 이용한 단백질분해 안정성 분석. FGF1을 디스플레이하는 효모 세포를 다양한 농도의 플라스민과 함께 인큐베이션하였다. 세척한 후, 세포를 HA 및 c-myc에 대한 형광 항체로 염색하였다. 유세포분석에 의한 분석은 FGF1의 농도-의존적 절단이 있음을 나타낸다.
도 10. 플라스민에 의한 FGF1 -특이적 절단. FGF1을 디스플레이하는 효모 세포 및 효모 디스플레이 단백질 Aga1 및 Aga2만을 발현하는 빈 대조군을 125nM 플라스민과 함께 인큐베이션하였다. 세척한 후, 세포를 HA 및 c-myc에 대한 형광 항체로 염색하였다. 유세포분석에 의한 분석은 플라스민의 농도를 증가시키는 것이 FGF1을 디스플레이하는 효모 세포에 대한 c-myc 신호의 손실을 야기하지만 빈 대조군을 디스플레이하는 효모 세포에 대해서는 그렇지 않음을 나타낸다. 이는 플라스민에 의한 효모 디스플레이 단백질의 절단이 FGF1-특이적임을 확인시켜준다.
도 11. 야생형 FGF1 및 단백질분해 안정성 PM2의 구별에 의한 단백질분해 안정성 분석의 검증. 플라스민은 다양한 플라스민 농도에서 2일 인큐베이션 후 효모 표면 디스플레이에 의해 야생형 FGF1 및 단백질분해 안정성 돌연변이체(PM2)의 구별을 가능하게 한다. 이는 새로운 단백질분해 안정성 돌연변이체를 확인하는 플라스민-기반 스크린의 능력을 입증한다.
도 12. 분류 1: FGFR1 - Fc 결합제 선택. (A) FGFR1-Fc에 대한 결합제에 있어서 스크리닝 방법의 개략도. 효모 표면 상에서 FGF 돌연변이체의 발현을 위해 무작위 돌연변이유발 라이브러리를 유도하였다. 세포를 10nM FGFR1-F와 함께 인큐베이션하고, 세척한 후, 발현(α-c-myc) 및 FGFR1 결합(α-FGFR1-Fc)에 대한 형광 항체로 염색하였다. 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 높은 c-myc 신호 및 높은 FGFR1-Fc 신호를 나타내는 세포에 대하여 분석하고 게이팅하였다. (B) FACS 도트 플롯이 FGF1에 대하여 도시되 있다. 전체 집단으로부터 수집한 세포의 백분율은 도트 플롯 상에 그려진 게이트의 옆에 도시되어 있다.
도 13. 분류 2: FGF1 -특이적 절단에 대한 내성 선택 . (A) 분류 2에 대한 스크리닝 방법의 개략도. 발현을 위해 분류 1로부터의 세포를 유도하고 이를 플라스민과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세척한 후, 발현(α-HA) 및 FGF1-특이적 절단에 대한 내성(α-c-myc)에 대한 형광 항체로 염색하였다. 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 HA 발현 신호에 의해 정규화된 높은 c-myc 신호를 나타내는 세포에 대하여 분석하고 게이팅하였다. (B) FACS 도트 플롯이 FGF1에 대하여 도시되어 있다. 상세히 기술된 바와 같이 다양한 인큐베이션 시간 동안 다양한 플라스민 농도에서 각각의 라이브러리의 분류 1로부터의 세포를 인큐베이션하였다. 풍부화를 위해 세포의 게이팅 및 수집에 사용된 최종 조건은 빨강색으로 강조표시되어 있다. 모든 테스트 조건에 대하여 동일한 게이트가 그려져 있다.
도 14. 펩타이드 인공물의 단리. (A) FGF1 분류 2 라이브러리의 분류에 대해 FACS 도트 플롯이 도시되어 있다. FGF1-특이적 절단에 대한 내성 선택을 분류 2와 동일한 방식으로 적용하였다. 단백질분해 절단(c-myc)에 대해 상당히 더 높은 내성을 나타낸 세포의 하위집단 주위에 수집 게이트를 그렸다. (B) 게이트로부터 수집된 돌연변이체의 단백질 서열이 도시되어 있다. 대부분은 FGF1로부터 유래되지 않고 무작위 돌연변이유발의 인공물인 짧은 펩타이드로 이루어진다.
도 15. FGFR1 - Fc에 대한 펩타이드 인공물의 비-결합. 세포 표면 상에 RTTTS 또는 HTTS 펩타이드를 발현하는 효모 세포를 10nM FGFR1-Fc와 함께 인큐베이션하였다. 발현(α-c-myc) 및 결합(α-FGFR1-Fc)에 대한 형광 항체로 세포를 염색하였다. 유의한 결합 신호가 검출되지 않았으며, 이는 펩타이드가 FGFR1-Fc에 결합하지 않음을 나타낸다.
도 16. 분류 3 및 4에 대한 개략도 . 발현을 위해 이전의 세포를 유도하고 다양한 농도의 플라스민과 함께 인큐베이션한 다음, 세척하고, FGFR1-Fc와 함께 인큐베이션하였다. 최종 세척 후, 발현(α-HA), FGF1-특이적 절단에 대한 내성(α-c-myc), 및 FGFR1 결합(α-FGFR1-Fc)에 대한 형광 항체로 세포를 염색하였다. 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 HA 발현 신호에 의해 정규화된 높은 c-myc 신호 및/또는 높은 FGFR1-Fc 결합 신호를 나타낸 세포에 대하여 분석하고 게이팅하였다.
도 17. 분류 3: 프로테아제-내성인 FGFR1 - Fc 결합제 선택. 분류 2로부터의 유도된 세포를 표시된 농도의 플라스민에서 12시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 세포를 10nM FGFR1-Fc와 함께 인큐베이션하였다. 최종 세척 후, 발현(α-HA) 및 FGFR1 결합(α-FGFR1-Fc)에 대한 형광 항체로 세포를 염색하였다. 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 높은 HA 신호 및 높은 FGFR1-Fc 신호를 나타낸 세포에 대하여 분석하고 게이팅하였다. FACS 도트 플롯이 FGF1에 대하여 도시되어 있다. 전체 집단으로부터 수집한 세포의 백분율은 도트 플롯 상에 그려진 게이트의 옆에 도시되어 있다. 하단 패널: 24시간 동안 1.25μM 플라스민과 함께 인큐베이션한 후 FGFR1-Fc에 대한 결합을 유지한다.
도 18. 분류 4: 프로테아제-저항성인 FGFR1 - Fc 결합제 선택. 분류 3으로부터의 유도된 세포를 다양한 농도의 플라스민에서 36시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 세포를 10nM FGFR1-Fc와 함께 인큐베이션하였다. 최종 세척 후, 발현(α-c-myc) 및 FGFR1 결합(α-FGFR1-Fc)에 대한 형광 항체로 세포를 염색하였다. 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 높은 c-myc 신호 및 높은 FGFR1-Fc 신호를 나타낸 세포에 대하여 분석하고 게이팅하였다. FACS 도트 플롯이 FGF1에 대하여 도시되어 있다. 풍부화를 위해 세포의 게이팅 및 수집에 사용된 최종 조건은 빨강색으로 강조표시되어 있다. 주어진 FGF의 모든 조건에 대하여 동일한 게이트가 그려져 있다. 전체 집단으로부터 수집된 세포의 백분율은 도트 플롯 상에 그려진 게이트의 옆에 도시되어 있다. 하단 패널: 36시간 동안 3.75μM 플라스민과 함께 인큐베이션한 후 FGFR1-Fc에 대한 결합을 유지한다.
도 19. FGF1 구조 상의 BS4M1 돌연변이( PDB 코드 1E0O ). 단백질분해 안정성에 대한 스크린에 의해 확인된 풍부화된 돌연변이는 파랑색으로 강조표시되어 있다. D28N 돌연변이는 6-가닥 β-배럴 구조를 안정화시키는 3개의 β-헤어핀(빨강색으로 강조표시됨) 중 하나에 위치한다. L131R 돌연변이는 단백질의 C-말단 근처에 위치하며, 여기서 N-말단과 C-말단 사이에 안정화 β-헤어핀이 부족하다.
도 20. 가용성 야생형 FGF1의 재조합 발현. (A) 비-환원 쿠마씨-염색 겔(좌측) 및 FGF1에 대한 웨스턴 블롯(우측)에 의해 정제된 야생형 FGF1을 분석하였다. 2개의 중요한 밴드는 FGF1 단량체(19.7 kDa) 및 이량체(39.4 kDa)의 존재를 나타낸다. (B) FGF1의 적절한 접힘은 효모-디스플레이 FGFR3 작제물에 대한 특이적 결합을 관찰함으로써 확인된다.
도 21. pBAD 벡터에서 FGF2의 재조합 발현. (A) 환원 쿠마씨-염색 겔(좌측) 및 FGF2에 대한 웨스턴 블롯(우측)에 의해 pBAD에서 발현되고 정제된 야생형 FGF2-His를 분석하였다. 둘 다 발현된 FGF2에 의한 응집을 나타낸다. (B) pBAD에서 발현된 FGF2-His는 효모-디스플레이 FGFR3 작제물에 결합할 수 없다.
도 22. pET28b 벡터에서 FGF2의 재조합 발현. 야생형 FGF2 및 FGF2 돌연변이체(BS5M1, BS5M3, BS5M5)를 pET28b 벡터에서 슈퍼폴더(superfolder) GFP에 대한 융합체로서 발현시켰다. 환원 쿠마씨-염색 겔(좌측) 및 FGF2에 대한 웨스턴 블롯(우측)에 의해 pBAD에서 발현되고 정제된 야생형 FGF2-His를 분석하였다. 야생형 FGF2는 잘 발현되지 않은 반면, FGF2 돌연변이체는 응집 및/또는 올리고머화의 징후를 나타낸다.
도 23. pET32a 벡터에서 야생형 FGF2의 재조합 발현. (A) FGF2를 pET32a 벡터에서 티오레독신에 대한 융합체로서 발현시켰다. TEV로 절단하고 Ni-NTA 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제한 후, 본 발명자들은 FGF2에 대한 웨스턴 블롯에 의해 단백질을 분석하였다. 본 발명자들은 FGF2(19.3 kDa)의 성공적인 정제를 확인하였다.
도 24. 플라스민에서 FGF1 WT 및 BS4M1의 단백질분해 안정성 분석. FGF1 BS4M1(D28N/L131R) 돌연변이체는 야생형 FGF1과 비교하여 플라스민에서 더 큰 단백질분해 안정성을 나타낸다. 100ng의 FGF1을 37℃에서 다양한 인큐베이션 시간 동안 600nM 플라스민과 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 샘플을 FGF1에 대한 웨스턴 블롯의 별도 레인에서 실행하여 각각의 시점에서 단백질 분해 정도를 측정하였다. 빨강색 화살표로 표시된 단백질 밴드의 밴드 강도를 이미지 분석에 의해 정량화하여 남아있는 단백질의 양을 측정하였다. 각각의 단백질에 대하여 시점 t = 0에 의해 밴드 강도를 정규화하고 플롯팅하였다.
도 25. 플라스민에서 FGF1 WT, BS4M1 , PM2 및 PM3의 단백질분해 안정성 분 석. BS4M1(D28N, L131R)의 돌연변이를 PM2(Q40P, S47I, H93G)의 돌연변이와 조합하여 PM3을 생성한다. PM3은 BS4M1 또는 PM2와 비교하여 플라스민에서 더 큰 단백질분해 안정성을 나타낸다. 125ng의 FGF1을 다양한 농도의 플라스민과 함께 48시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 샘플을 FGF1에 대한 웨스턴 블롯의 별도 레인에서 실행하여 각각의 시점에서 단백질 분해 정도를 측정하였다. 빨강색 화살표로 표시된 단백질 밴드의 밴드 강도를 이미지 분석에 의해 정량화하여 남아있는 단백질의 양을 측정하였다. 0μM 플라스민과 함께 인큐베이션한 각각의 작제물에 대하여 단백질의 양에 의해 밴드 강도를 정규화하고 플롯팅하였다.
도 26. 트립신에서 FGF1 WT 및 BS4M1의 단백질분해 안정성 분석. FGF1 BS4M1(D28N/L131R) 돌연변이체는 야생형 FGF1과 비교하여 트립신에서 더 큰 단백질분해 안정성을 나타낸다. 100ng의 FGF1을 37℃에서 다양한 인큐베이션 시간 동안 트립신 대 FGF1의 몰비를 1:20으로 하여 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 샘플을 FGF1에 대한 웨스턴 블롯의 별도 레인에서 실행하여 각각의 시점에서 단백질 분해 정도를 측정하였다. 빨강색 화살표로 표시된 단백질 밴드의 밴드 강도를 이미지 분석에 의해 정량화하여 남아있는 단백질의 양을 측정하였다. 시점 t = 0에서 각각의 작제물에 대한 단백질의 양에 의해 밴드 강도를 정규화하고 플롯팅하였다.
도 27. 플라스민에서 FGF1 WT, BS4M1 , D28N 및 L131R 의 단백질분해 안정성 분석. FGF1 L131R 단일 돌연변이체는 BS4M1과 비교하여 대부분의 단백질분해 안정성을 유지한다. FGF1 D28N 단일 돌연변이체는 심지어 야생형 FGF1과 비교하여서도 더 낮은 단백질분해 안정성을 가진다. 100ng의 FGF1을 다양한 농도의 플라스민과 함께 48시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 샘플을 FGF1에 대한 웨스턴 블롯의 별도 레인에서 실행하여 각각의 시점에서 단백질 분해 정도를 측정하였다. 빨강색 화살표로 표시된 단백질 밴드의 밴드 강도를 이미지 분석에 의해 정량화하여 남아있는 단백질의 양을 측정하였다. 0μM 플라스민과 함께 인큐베이션할 때 각각의 작제물에 대하여 단백질의 양에 의해 밴드 강도를 정규화하고 플롯팅하였다.
도 28. 플라스민에서 FGF1 WT, L131R, L131A 및 L131K의 단백질 분해 안정성 분석. FGF1 L131K 단일 돌연변이체는 FGF1 L131R과 비교하여 대부분의 단백질분해 안정성을 유지한다. FGF1 L131A 단일 돌연변이체는 심지어 야생형 FGF1과 비교하여서도 더 낮은 단백질분해 안정성을 가진다. 100ng의 FGF1을 다양한 농도의 플라스민과 함께 48시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 샘플을 FGF1에 대한 웨스턴 블롯의 별도 레인에서 실행하여 각각의 시점에서 단백질 분해 정도를 측정하였다. 빨강색 화살표로 표시된 단백질 밴드의 밴드 강도를 이미지 분석에 의해 정량화하여 남아있는 단백질의 양을 측정하였다. 0μM 플라스민과 함께 인큐베이션할 때 각각의 작제물에 대하여 단백질의 양에 의해 밴드 강도를 정규화하고 플롯팅하였다.
도 29. FGF1 야생형 및 L131R 돌연변이체의 ThermoFluor 분석. FGF1 야생형 및 L131R 돌연변이체의 용융 온도를 3회 측정하고 플롯팅하였다. 2가지 단백질의 용융 온도 사이에는 통계적으로 유의한 차이가 없었다.
도 30. MDA-MB-231 배양물에서 FGF1 야생형 및 L131R 돌연변이체의 안정성. FGF1 L131R 돌연변체는 야생형 FGF1과 비교하여 MDA-MB-231을 이용한 배양에서 더 큰 안정성을 나타낸다. 500ng의 FGF1을 다양한 인큐베이션 시간 동안 37℃에서 MDA-Mb-231 세포와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 샘플을 농축하고 FGF1에 대한 웨스턴 블롯의 별도 레인에서 실행하여 각각의 시점에서 단백질 분해 정도를 측정하였다. 빨강색 화살표로 표시된 단백질 밴드의 밴드 강도를 이미지 분석에 의해 정량화하여 남아있는 단백질의 양을 측정하였다. 각각의 단백질에 대하여 시점 t = 0에 의해 밴드 강도를 정규화하고 플롯팅하였다.
도 31. NIH3T3 ERK 인산화 분석. FGF1 L131R 돌연변이체는 야생형 FGF1에 의한 NIH3T3 ERK 인산화를 저해한다. NIH3T3 세포를 FGF1 야생형 및/또는 다양한 농도의 FGF1 L131R 돌연변이체로 15시간 동안 자극하였다. 세포를 용해시키고 용해물을 웨스턴 블롯에서 항-포스포ERK로 조사하였다. 밴드 강도를 이미지 분석에 의해 정량화하여 FGF 경로 활성화의 정도를 측정하였다. 하단 패널: NIH3T3 세포를 FGF1 야생형 및/또는 다양한 농도의 FGF1 L131R 돌연변이체로 10시간 동안 자극하였다.
도 32. NIH3T3 세포에서 FGF1 L131R 돌연변이체에 의한 FGF1-자극 ERK 인산화의 저해. NIH3T3 세포를 1nM FGF1 및 다양한 농도의 FGF1 L131R과 함께 인큐베이션하였다. 각각의 조건에 대한 ERK 인산화의 정도를 포스포ERK에 대한 웨스턴 블롯에 의해 측정한다. 밴드 강도를 이미지 분석에 의해 정량화하고 플롯팅하여 IC50 값을 얻었다.
도 33. NIH3T3 세포에 대한 FGF1 야생형 및 L131R 돌연변이체의 결합. FGFR-발현 NIH3T3 세포에 대한 His-태그 FGF1 WT 및 L131R 돌연변이체의 평형 결합 적정. 세포를 다양한 농도의 각각의 단백질과 함께 4℃에서 인큐베이션하고, His에 대한 형광 항체로 염색하여 세포에 대한 결합을 정량화하였다.
도 34a 내지 도 34b. IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 서열의 예를 제공한다.
도 35. HGF 도메인 구조. N: N-말단 PAN 모듈: K: 크링글(Kringle) 도메인; SPH: 세린 프로테아제 상동성 도메인. 검정색 화살표는 HGF를 이의 2-사슬 활성 형태로 절단하는 절단 부위를 나타낸다. α- 및 β-사슬은 이황화 결합을 통해 연결된다. N-말단 및 제1 크링글 도메인은 HGF의 NK1 단편을 포함한다.
도 36. 효모 디스플레이 작제물 pTMY -HA. (A) pTMY-HA의 오픈 리딩 프레임. 단백질을 자유 N-말단으로 디스플레이하고 이의 C-말단을 통해 Aga2p에 연결한다. (B) 효모 표면 디스플레이의 개략도. 관심 단백질(NK1)을 Aga2p의 N-말단에 대한 유전적 연결을 통해 효모 세포 벽에 테더링한다. HA 에피토프 태그에 대한 항체를 사용하여 세포 표면 발현을 모니터링하고, 또한 (Met-Fc의 경우에) 결합 파트너와의 상호작용을 모니터링하였다.
도 37. NK1 조작 전략의 개요. 유도 진화의 제1 라운드(M1)에서 라이브러리를 Met에 대한 기능적 결합에 대해 스크리닝하였고; 제2 라운드(M2)에 있어서 라이브러리를 향상된 친화성 또는 향상된 안정성에 대해 동시에 스크리닝하였으며; 제3 라운드(M3)에 있어서 M2 생성물을 셔플링하고 개선된 친화성 및 안정성에 대해 동시에 스크리닝하였다.
도 38. 각막의 화학적 손상은 종종 혈관신생, 흉터, 및 실명을 초래한다.
도 39. (A) t=0시간에서 각막 상처, (B) HA/CS 겔 전달 비히클 중 MSC 분비체(secretome)로 처리하고 24시간 후 각막 상처, (C) 식염수만 점적하고 24시간 후 각막 상처를 비교하는 알칼리 화상 후 각막 상처 치유 연구. 본 발명자들은 예비 작업에서 (D) 코크런(Cochran) 실험실에서 개발한 eHGF(삽입 이미지에 나타낸 PDB 구조)만으로도 또한 생체내 알칼리-화상 래트 각막에서 상처 봉합 시간을 가속화한다는 것을 나타내었다.
도 40. (A) 알칼리-화상 각막 및 (B) 국소 분비체 처리 7일 후 각막. (C) 알칼리-화상 각막 및 (D) eHGF 및 항-FGF 처리 7일 후 각막. 비처리 각막에는 흉터가 있고 혈관이 생기며, 일부 경우에는 출혈의 증거가 있다. (E) 래트 왼쪽 눈의 알칼리 화상 7일 후 양측 래트 눈의 외관. (F) 초기 알칼리 화상 후 7일의 eHGF 및 항-FGF 처리를 한 양측 래트 눈의 외관.
도 41. 본 명세서에 전문이 참조에 의해 포함된 미국 특허 제9,556,248호의 서열번호 2 내지 22인 변이체 간세포 성장 인자 서열을 제공한다.
도 2. 단백질분해 안정성 성장 인자 돌연변이체에 대한 FACS -기반 스크리닝 방법. 성장 인자 돌연변이체의 라이브러리를 EBY100 효모 세포로 형질전환시키고 효모 디스플레이에 의해 성장 인자를 디스플레이하도록 유도한다. 세포를 프로테아제와 함께 인큐베이션하고, 세척한 다음, 수용체의 가용성 Fc-융합체와 함께 인큐베이션한다. 적절한 형광 항체로 표지화한 후, 유동 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 단백질분해 절단의 수준이 낮고 가용성 수용체에 대한 결합의 수준이 높은 돌연변이체를 발현하는 세포를 게이팅하고 수집한다. 이러한 인큐베이션 및 세포 분류 과정을 여러 번 순환시켜 단백질분해 안정성 수준이 가장 높은 돌연변이체를 확인한다.
도 3. FGF1의 효모 디스플레이. (A) FGF1은 부착 단백질 응집소 Aga2p에 대한 융합체로서 발현되며, 이는 2개의 이황화 결합에 의해 세포벽 단백질 Aga1p에 부착된다. FGFR1-Fc는 FGF1에 결합하는 상응하는 가용성 수용체이다. (B) c-myc 태그의 형광 표지화는 FGF1이 효모의 표면 상에서 성공적으로 발현됨을 나타낸다. (C) FGFR1의 Fc 융합체는 효모-디스플레이 FGF1에 대한 특이적 결합을 나타낸다. 표면-디스플레이 FGF1을 발현하는 효모를 다양한 농도에서 3시간 동안 가용성 FGFR1-Fc와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고 가용성 FGFR1-Fc에 대한 항-Fc AlexaFluor488로 염색하였다. 효모 세포에 대한 결합과 연관된 형광을 유세포분석에 의해 측정하고 플롯팅하였다.
도 4. 소태아혈청을 이용한 단백질분해 안정성 분석. FGF1 돌연변이체 라이브러리를 디스플레이하는 효모 세포를 다양한 농도의 소태아혈청과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고 10nM FGFR1-Fc와 함께 인큐베이션한 후 세포를 c-myc 및 가용성 수용체의 Fc 도메인에 대한 형광 항체로 염색하였다. 유세포분석에 의한 분석은 FBS의 농도를 증가시키는 것이 FGF1-특이적 절단 신호뿐만 아니라 FGFR1-Fc 결합 신호에 대하여 상대적으로 거의 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
도 5. 트립신을 이용한 단백질분해 안정성 분석. FGF1을 디스플레이하는 효모 세포를 다양한 농도의 트립신과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고 10nM FGFR1-Fc와 함께 인큐베이션한 후, 세포를 c-myc 및 가용성 수용체의 Fc 도메인에 대한 형광 항체로 염색하였다. 유세포분석에 의한 분석은 트립신의 농도를 증가시키는 것이 효모 디스플레이 단백질의 절단(c-myc 감소) 및 FGFR1-Fc에 대한 결합 손실을 야기함을 나타낸다.
도 6. 키모트립신을 이용한 단백질분해 안정성 분석. FGF1을 디스플레이하는 효모 세포를 다양한 농도의 키모트립신과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고 10nM FGFR1-Fc와 함께 인큐베이션한 후, 세포를 c-myc 및 가용성 수용체의 Fc 도메인에 대한 형광 항체로 염색하였다. 유세포분석에 의한 분석은 키모트립신의 농도를 증가시키는 것이 효모 디스플레이 단백질의 절단(c-myc 감소) 및 FGFR1-Fc에 대한 결합 손실을 야기함을 나타낸다.
도 7a 내지 도 7b. 트립신에 의한 효모 디스플레이 단백질 Aga1 및 Aga2의 비-특이적 절단. FGF1을 디스플레이하는 효모 세포를 다양한 농도의 트립신과 함께 인큐베이션하였다. 세척한 후, 세포를 HA 및 c-myc에 대한 형광 항체로 염색하였다. 유세포분석에 의한 분석은 트립신의 농도를 증가시키는 것이 HA 신호의 손실을 야기함을 나타내며, 이는 효모 디스플레이 단백질 Aga1 및 Aga2의 비-특이적 절단을 나타낸다.
도 8a 내지 도 8b. 키모트립신에 의한 FGF1 -특이적 절단. FGF1을 표시하는 효모 세포를 다양한 농도의 트립신과 함께 인큐베이션하였다. 세척한 후, 세포를 HA 및 c-myc에 대한 형광 항체로 염색하였다. 유세포분석에 의한 분석은 키모트립신의 농도를 증가시키는 것이 c-myc 신호의 손실을 야기하지만 HA 신호의 손실은 야기하지 않음을 나타내며, 이는 FGF1-특이적 절단이 일어남을 나타낸다.
도 9. 플라스민을 이용한 단백질분해 안정성 분석. FGF1을 디스플레이하는 효모 세포를 다양한 농도의 플라스민과 함께 인큐베이션하였다. 세척한 후, 세포를 HA 및 c-myc에 대한 형광 항체로 염색하였다. 유세포분석에 의한 분석은 FGF1의 농도-의존적 절단이 있음을 나타낸다.
도 10. 플라스민에 의한 FGF1 -특이적 절단. FGF1을 디스플레이하는 효모 세포 및 효모 디스플레이 단백질 Aga1 및 Aga2만을 발현하는 빈 대조군을 125nM 플라스민과 함께 인큐베이션하였다. 세척한 후, 세포를 HA 및 c-myc에 대한 형광 항체로 염색하였다. 유세포분석에 의한 분석은 플라스민의 농도를 증가시키는 것이 FGF1을 디스플레이하는 효모 세포에 대한 c-myc 신호의 손실을 야기하지만 빈 대조군을 디스플레이하는 효모 세포에 대해서는 그렇지 않음을 나타낸다. 이는 플라스민에 의한 효모 디스플레이 단백질의 절단이 FGF1-특이적임을 확인시켜준다.
도 11. 야생형 FGF1 및 단백질분해 안정성 PM2의 구별에 의한 단백질분해 안정성 분석의 검증. 플라스민은 다양한 플라스민 농도에서 2일 인큐베이션 후 효모 표면 디스플레이에 의해 야생형 FGF1 및 단백질분해 안정성 돌연변이체(PM2)의 구별을 가능하게 한다. 이는 새로운 단백질분해 안정성 돌연변이체를 확인하는 플라스민-기반 스크린의 능력을 입증한다.
도 12. 분류 1: FGFR1 - Fc 결합제 선택. (A) FGFR1-Fc에 대한 결합제에 있어서 스크리닝 방법의 개략도. 효모 표면 상에서 FGF 돌연변이체의 발현을 위해 무작위 돌연변이유발 라이브러리를 유도하였다. 세포를 10nM FGFR1-F와 함께 인큐베이션하고, 세척한 후, 발현(α-c-myc) 및 FGFR1 결합(α-FGFR1-Fc)에 대한 형광 항체로 염색하였다. 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 높은 c-myc 신호 및 높은 FGFR1-Fc 신호를 나타내는 세포에 대하여 분석하고 게이팅하였다. (B) FACS 도트 플롯이 FGF1에 대하여 도시되 있다. 전체 집단으로부터 수집한 세포의 백분율은 도트 플롯 상에 그려진 게이트의 옆에 도시되어 있다.
도 13. 분류 2: FGF1 -특이적 절단에 대한 내성 선택 . (A) 분류 2에 대한 스크리닝 방법의 개략도. 발현을 위해 분류 1로부터의 세포를 유도하고 이를 플라스민과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세척한 후, 발현(α-HA) 및 FGF1-특이적 절단에 대한 내성(α-c-myc)에 대한 형광 항체로 염색하였다. 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 HA 발현 신호에 의해 정규화된 높은 c-myc 신호를 나타내는 세포에 대하여 분석하고 게이팅하였다. (B) FACS 도트 플롯이 FGF1에 대하여 도시되어 있다. 상세히 기술된 바와 같이 다양한 인큐베이션 시간 동안 다양한 플라스민 농도에서 각각의 라이브러리의 분류 1로부터의 세포를 인큐베이션하였다. 풍부화를 위해 세포의 게이팅 및 수집에 사용된 최종 조건은 빨강색으로 강조표시되어 있다. 모든 테스트 조건에 대하여 동일한 게이트가 그려져 있다.
도 14. 펩타이드 인공물의 단리. (A) FGF1 분류 2 라이브러리의 분류에 대해 FACS 도트 플롯이 도시되어 있다. FGF1-특이적 절단에 대한 내성 선택을 분류 2와 동일한 방식으로 적용하였다. 단백질분해 절단(c-myc)에 대해 상당히 더 높은 내성을 나타낸 세포의 하위집단 주위에 수집 게이트를 그렸다. (B) 게이트로부터 수집된 돌연변이체의 단백질 서열이 도시되어 있다. 대부분은 FGF1로부터 유래되지 않고 무작위 돌연변이유발의 인공물인 짧은 펩타이드로 이루어진다.
도 15. FGFR1 - Fc에 대한 펩타이드 인공물의 비-결합. 세포 표면 상에 RTTTS 또는 HTTS 펩타이드를 발현하는 효모 세포를 10nM FGFR1-Fc와 함께 인큐베이션하였다. 발현(α-c-myc) 및 결합(α-FGFR1-Fc)에 대한 형광 항체로 세포를 염색하였다. 유의한 결합 신호가 검출되지 않았으며, 이는 펩타이드가 FGFR1-Fc에 결합하지 않음을 나타낸다.
도 16. 분류 3 및 4에 대한 개략도 . 발현을 위해 이전의 세포를 유도하고 다양한 농도의 플라스민과 함께 인큐베이션한 다음, 세척하고, FGFR1-Fc와 함께 인큐베이션하였다. 최종 세척 후, 발현(α-HA), FGF1-특이적 절단에 대한 내성(α-c-myc), 및 FGFR1 결합(α-FGFR1-Fc)에 대한 형광 항체로 세포를 염색하였다. 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 HA 발현 신호에 의해 정규화된 높은 c-myc 신호 및/또는 높은 FGFR1-Fc 결합 신호를 나타낸 세포에 대하여 분석하고 게이팅하였다.
도 17. 분류 3: 프로테아제-내성인 FGFR1 - Fc 결합제 선택. 분류 2로부터의 유도된 세포를 표시된 농도의 플라스민에서 12시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 세포를 10nM FGFR1-Fc와 함께 인큐베이션하였다. 최종 세척 후, 발현(α-HA) 및 FGFR1 결합(α-FGFR1-Fc)에 대한 형광 항체로 세포를 염색하였다. 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 높은 HA 신호 및 높은 FGFR1-Fc 신호를 나타낸 세포에 대하여 분석하고 게이팅하였다. FACS 도트 플롯이 FGF1에 대하여 도시되어 있다. 전체 집단으로부터 수집한 세포의 백분율은 도트 플롯 상에 그려진 게이트의 옆에 도시되어 있다. 하단 패널: 24시간 동안 1.25μM 플라스민과 함께 인큐베이션한 후 FGFR1-Fc에 대한 결합을 유지한다.
도 18. 분류 4: 프로테아제-저항성인 FGFR1 - Fc 결합제 선택. 분류 3으로부터의 유도된 세포를 다양한 농도의 플라스민에서 36시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 세포를 10nM FGFR1-Fc와 함께 인큐베이션하였다. 최종 세척 후, 발현(α-c-myc) 및 FGFR1 결합(α-FGFR1-Fc)에 대한 형광 항체로 세포를 염색하였다. 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 높은 c-myc 신호 및 높은 FGFR1-Fc 신호를 나타낸 세포에 대하여 분석하고 게이팅하였다. FACS 도트 플롯이 FGF1에 대하여 도시되어 있다. 풍부화를 위해 세포의 게이팅 및 수집에 사용된 최종 조건은 빨강색으로 강조표시되어 있다. 주어진 FGF의 모든 조건에 대하여 동일한 게이트가 그려져 있다. 전체 집단으로부터 수집된 세포의 백분율은 도트 플롯 상에 그려진 게이트의 옆에 도시되어 있다. 하단 패널: 36시간 동안 3.75μM 플라스민과 함께 인큐베이션한 후 FGFR1-Fc에 대한 결합을 유지한다.
도 19. FGF1 구조 상의 BS4M1 돌연변이( PDB 코드 1E0O ). 단백질분해 안정성에 대한 스크린에 의해 확인된 풍부화된 돌연변이는 파랑색으로 강조표시되어 있다. D28N 돌연변이는 6-가닥 β-배럴 구조를 안정화시키는 3개의 β-헤어핀(빨강색으로 강조표시됨) 중 하나에 위치한다. L131R 돌연변이는 단백질의 C-말단 근처에 위치하며, 여기서 N-말단과 C-말단 사이에 안정화 β-헤어핀이 부족하다.
도 20. 가용성 야생형 FGF1의 재조합 발현. (A) 비-환원 쿠마씨-염색 겔(좌측) 및 FGF1에 대한 웨스턴 블롯(우측)에 의해 정제된 야생형 FGF1을 분석하였다. 2개의 중요한 밴드는 FGF1 단량체(19.7 kDa) 및 이량체(39.4 kDa)의 존재를 나타낸다. (B) FGF1의 적절한 접힘은 효모-디스플레이 FGFR3 작제물에 대한 특이적 결합을 관찰함으로써 확인된다.
도 21. pBAD 벡터에서 FGF2의 재조합 발현. (A) 환원 쿠마씨-염색 겔(좌측) 및 FGF2에 대한 웨스턴 블롯(우측)에 의해 pBAD에서 발현되고 정제된 야생형 FGF2-His를 분석하였다. 둘 다 발현된 FGF2에 의한 응집을 나타낸다. (B) pBAD에서 발현된 FGF2-His는 효모-디스플레이 FGFR3 작제물에 결합할 수 없다.
도 22. pET28b 벡터에서 FGF2의 재조합 발현. 야생형 FGF2 및 FGF2 돌연변이체(BS5M1, BS5M3, BS5M5)를 pET28b 벡터에서 슈퍼폴더(superfolder) GFP에 대한 융합체로서 발현시켰다. 환원 쿠마씨-염색 겔(좌측) 및 FGF2에 대한 웨스턴 블롯(우측)에 의해 pBAD에서 발현되고 정제된 야생형 FGF2-His를 분석하였다. 야생형 FGF2는 잘 발현되지 않은 반면, FGF2 돌연변이체는 응집 및/또는 올리고머화의 징후를 나타낸다.
도 23. pET32a 벡터에서 야생형 FGF2의 재조합 발현. (A) FGF2를 pET32a 벡터에서 티오레독신에 대한 융합체로서 발현시켰다. TEV로 절단하고 Ni-NTA 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제한 후, 본 발명자들은 FGF2에 대한 웨스턴 블롯에 의해 단백질을 분석하였다. 본 발명자들은 FGF2(19.3 kDa)의 성공적인 정제를 확인하였다.
도 24. 플라스민에서 FGF1 WT 및 BS4M1의 단백질분해 안정성 분석. FGF1 BS4M1(D28N/L131R) 돌연변이체는 야생형 FGF1과 비교하여 플라스민에서 더 큰 단백질분해 안정성을 나타낸다. 100ng의 FGF1을 37℃에서 다양한 인큐베이션 시간 동안 600nM 플라스민과 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 샘플을 FGF1에 대한 웨스턴 블롯의 별도 레인에서 실행하여 각각의 시점에서 단백질 분해 정도를 측정하였다. 빨강색 화살표로 표시된 단백질 밴드의 밴드 강도를 이미지 분석에 의해 정량화하여 남아있는 단백질의 양을 측정하였다. 각각의 단백질에 대하여 시점 t = 0에 의해 밴드 강도를 정규화하고 플롯팅하였다.
도 25. 플라스민에서 FGF1 WT, BS4M1 , PM2 및 PM3의 단백질분해 안정성 분 석. BS4M1(D28N, L131R)의 돌연변이를 PM2(Q40P, S47I, H93G)의 돌연변이와 조합하여 PM3을 생성한다. PM3은 BS4M1 또는 PM2와 비교하여 플라스민에서 더 큰 단백질분해 안정성을 나타낸다. 125ng의 FGF1을 다양한 농도의 플라스민과 함께 48시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 샘플을 FGF1에 대한 웨스턴 블롯의 별도 레인에서 실행하여 각각의 시점에서 단백질 분해 정도를 측정하였다. 빨강색 화살표로 표시된 단백질 밴드의 밴드 강도를 이미지 분석에 의해 정량화하여 남아있는 단백질의 양을 측정하였다. 0μM 플라스민과 함께 인큐베이션한 각각의 작제물에 대하여 단백질의 양에 의해 밴드 강도를 정규화하고 플롯팅하였다.
도 26. 트립신에서 FGF1 WT 및 BS4M1의 단백질분해 안정성 분석. FGF1 BS4M1(D28N/L131R) 돌연변이체는 야생형 FGF1과 비교하여 트립신에서 더 큰 단백질분해 안정성을 나타낸다. 100ng의 FGF1을 37℃에서 다양한 인큐베이션 시간 동안 트립신 대 FGF1의 몰비를 1:20으로 하여 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 샘플을 FGF1에 대한 웨스턴 블롯의 별도 레인에서 실행하여 각각의 시점에서 단백질 분해 정도를 측정하였다. 빨강색 화살표로 표시된 단백질 밴드의 밴드 강도를 이미지 분석에 의해 정량화하여 남아있는 단백질의 양을 측정하였다. 시점 t = 0에서 각각의 작제물에 대한 단백질의 양에 의해 밴드 강도를 정규화하고 플롯팅하였다.
도 27. 플라스민에서 FGF1 WT, BS4M1 , D28N 및 L131R 의 단백질분해 안정성 분석. FGF1 L131R 단일 돌연변이체는 BS4M1과 비교하여 대부분의 단백질분해 안정성을 유지한다. FGF1 D28N 단일 돌연변이체는 심지어 야생형 FGF1과 비교하여서도 더 낮은 단백질분해 안정성을 가진다. 100ng의 FGF1을 다양한 농도의 플라스민과 함께 48시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 샘플을 FGF1에 대한 웨스턴 블롯의 별도 레인에서 실행하여 각각의 시점에서 단백질 분해 정도를 측정하였다. 빨강색 화살표로 표시된 단백질 밴드의 밴드 강도를 이미지 분석에 의해 정량화하여 남아있는 단백질의 양을 측정하였다. 0μM 플라스민과 함께 인큐베이션할 때 각각의 작제물에 대하여 단백질의 양에 의해 밴드 강도를 정규화하고 플롯팅하였다.
도 28. 플라스민에서 FGF1 WT, L131R, L131A 및 L131K의 단백질 분해 안정성 분석. FGF1 L131K 단일 돌연변이체는 FGF1 L131R과 비교하여 대부분의 단백질분해 안정성을 유지한다. FGF1 L131A 단일 돌연변이체는 심지어 야생형 FGF1과 비교하여서도 더 낮은 단백질분해 안정성을 가진다. 100ng의 FGF1을 다양한 농도의 플라스민과 함께 48시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 샘플을 FGF1에 대한 웨스턴 블롯의 별도 레인에서 실행하여 각각의 시점에서 단백질 분해 정도를 측정하였다. 빨강색 화살표로 표시된 단백질 밴드의 밴드 강도를 이미지 분석에 의해 정량화하여 남아있는 단백질의 양을 측정하였다. 0μM 플라스민과 함께 인큐베이션할 때 각각의 작제물에 대하여 단백질의 양에 의해 밴드 강도를 정규화하고 플롯팅하였다.
도 29. FGF1 야생형 및 L131R 돌연변이체의 ThermoFluor 분석. FGF1 야생형 및 L131R 돌연변이체의 용융 온도를 3회 측정하고 플롯팅하였다. 2가지 단백질의 용융 온도 사이에는 통계적으로 유의한 차이가 없었다.
도 30. MDA-MB-231 배양물에서 FGF1 야생형 및 L131R 돌연변이체의 안정성. FGF1 L131R 돌연변체는 야생형 FGF1과 비교하여 MDA-MB-231을 이용한 배양에서 더 큰 안정성을 나타낸다. 500ng의 FGF1을 다양한 인큐베이션 시간 동안 37℃에서 MDA-Mb-231 세포와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 샘플을 농축하고 FGF1에 대한 웨스턴 블롯의 별도 레인에서 실행하여 각각의 시점에서 단백질 분해 정도를 측정하였다. 빨강색 화살표로 표시된 단백질 밴드의 밴드 강도를 이미지 분석에 의해 정량화하여 남아있는 단백질의 양을 측정하였다. 각각의 단백질에 대하여 시점 t = 0에 의해 밴드 강도를 정규화하고 플롯팅하였다.
도 31. NIH3T3 ERK 인산화 분석. FGF1 L131R 돌연변이체는 야생형 FGF1에 의한 NIH3T3 ERK 인산화를 저해한다. NIH3T3 세포를 FGF1 야생형 및/또는 다양한 농도의 FGF1 L131R 돌연변이체로 15시간 동안 자극하였다. 세포를 용해시키고 용해물을 웨스턴 블롯에서 항-포스포ERK로 조사하였다. 밴드 강도를 이미지 분석에 의해 정량화하여 FGF 경로 활성화의 정도를 측정하였다. 하단 패널: NIH3T3 세포를 FGF1 야생형 및/또는 다양한 농도의 FGF1 L131R 돌연변이체로 10시간 동안 자극하였다.
도 32. NIH3T3 세포에서 FGF1 L131R 돌연변이체에 의한 FGF1-자극 ERK 인산화의 저해. NIH3T3 세포를 1nM FGF1 및 다양한 농도의 FGF1 L131R과 함께 인큐베이션하였다. 각각의 조건에 대한 ERK 인산화의 정도를 포스포ERK에 대한 웨스턴 블롯에 의해 측정한다. 밴드 강도를 이미지 분석에 의해 정량화하고 플롯팅하여 IC50 값을 얻었다.
도 33. NIH3T3 세포에 대한 FGF1 야생형 및 L131R 돌연변이체의 결합. FGFR-발현 NIH3T3 세포에 대한 His-태그 FGF1 WT 및 L131R 돌연변이체의 평형 결합 적정. 세포를 다양한 농도의 각각의 단백질과 함께 4℃에서 인큐베이션하고, His에 대한 형광 항체로 염색하여 세포에 대한 결합을 정량화하였다.
도 34a 내지 도 34b. IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 서열의 예를 제공한다.
도 35. HGF 도메인 구조. N: N-말단 PAN 모듈: K: 크링글(Kringle) 도메인; SPH: 세린 프로테아제 상동성 도메인. 검정색 화살표는 HGF를 이의 2-사슬 활성 형태로 절단하는 절단 부위를 나타낸다. α- 및 β-사슬은 이황화 결합을 통해 연결된다. N-말단 및 제1 크링글 도메인은 HGF의 NK1 단편을 포함한다.
도 36. 효모 디스플레이 작제물 pTMY -HA. (A) pTMY-HA의 오픈 리딩 프레임. 단백질을 자유 N-말단으로 디스플레이하고 이의 C-말단을 통해 Aga2p에 연결한다. (B) 효모 표면 디스플레이의 개략도. 관심 단백질(NK1)을 Aga2p의 N-말단에 대한 유전적 연결을 통해 효모 세포 벽에 테더링한다. HA 에피토프 태그에 대한 항체를 사용하여 세포 표면 발현을 모니터링하고, 또한 (Met-Fc의 경우에) 결합 파트너와의 상호작용을 모니터링하였다.
도 37. NK1 조작 전략의 개요. 유도 진화의 제1 라운드(M1)에서 라이브러리를 Met에 대한 기능적 결합에 대해 스크리닝하였고; 제2 라운드(M2)에 있어서 라이브러리를 향상된 친화성 또는 향상된 안정성에 대해 동시에 스크리닝하였으며; 제3 라운드(M3)에 있어서 M2 생성물을 셔플링하고 개선된 친화성 및 안정성에 대해 동시에 스크리닝하였다.
도 38. 각막의 화학적 손상은 종종 혈관신생, 흉터, 및 실명을 초래한다.
도 39. (A) t=0시간에서 각막 상처, (B) HA/CS 겔 전달 비히클 중 MSC 분비체(secretome)로 처리하고 24시간 후 각막 상처, (C) 식염수만 점적하고 24시간 후 각막 상처를 비교하는 알칼리 화상 후 각막 상처 치유 연구. 본 발명자들은 예비 작업에서 (D) 코크런(Cochran) 실험실에서 개발한 eHGF(삽입 이미지에 나타낸 PDB 구조)만으로도 또한 생체내 알칼리-화상 래트 각막에서 상처 봉합 시간을 가속화한다는 것을 나타내었다.
도 40. (A) 알칼리-화상 각막 및 (B) 국소 분비체 처리 7일 후 각막. (C) 알칼리-화상 각막 및 (D) eHGF 및 항-FGF 처리 7일 후 각막. 비처리 각막에는 흉터가 있고 혈관이 생기며, 일부 경우에는 출혈의 증거가 있다. (E) 래트 왼쪽 눈의 알칼리 화상 7일 후 양측 래트 눈의 외관. (F) 초기 알칼리 화상 후 7일의 eHGF 및 항-FGF 처리를 한 양측 래트 눈의 외관.
도 41. 본 명세서에 전문이 참조에 의해 포함된 미국 특허 제9,556,248호의 서열번호 2 내지 22인 변이체 간세포 성장 인자 서열을 제공한다.
I.
서론
섬유아세포 성장 인자는 매우 다양한 과정에서, 무엇보다도 특히 정상적인 발달에 중요한 요소로서 관여하는 세포 신호전달 단백질의 패밀리이다. 이러한 성장 인자는 일반적으로 세포 표면 수용체를 활성화시키는 세포외 기원의 전신 또는 국부 순환 분자로서 작용한다. 포유동물 섬유아세포 성장 인자 수용체 패밀리에는 FGFR1, FGFR2, FGFR3 및 FGFR4의 4개의 구성원이 있다. FGFR은 3개의 세포외 면역글로불린-유형 도메인(D1 내지 D3), 단일-스팬(single-span) 막관통 도메인 및 세포내 분할(split) 타이로신 키나제 도메인으로 이루어진다. FGF는 D2 및 D3 도메인과 상호작용하고, D3 상호작용은 주로 리간드-결합 특이성을 담당한다(하기 참조). 헤파란 설페이트 결합은 D3 도메인을 통해 매개된다. D1 및 D2 도메인 사이에 위치한 산성 아미노산의 짧은 구간은 자동-저해 기능을 가진다. 이러한 '산성 박스' 모티프는 헤파린 설페이트 결합 부위와 상호작용하여 FGF의 부재시 수용체 활성화를 방지한다. 각각의 FGFR은 FGF의 특정 하위세트에 결합한다. 유사하게, 대부분의 FGF는 여러 가지의 상이한 FGFR 하위유형에 결합할 수 있다. FGF1은 7가지의 상이한 FGFR을 모두 활성화시킬 수 있으므로 때때로 '유니버셜(universal) 리간드'로 지칭된다. 대조적으로, FGF7(각질형성세포 성장 인자, KGF)은 FGFR2b(KGFR)에만 결합한다.
본 발명은 스크리닝을 위해 효모 디스플레이 플랫폼 및 유동-활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 단백질분해 안정성 성장 인자를 조작하기 위한 조합 접근 방법을 제공한다. 모델 예로서 FGF1을 사용하여 스크리닝 방법을 설정하는 방법이 기재되며 예시적인 단백질분해 안정성 성장 인자를 조작하기 위한 방법이 제공된다. 본 발명은 또한 단백질분해 안정성 FGF1 돌연변이체의 특성화를 제공한다.
II.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용되는 명명법 및 세포 배양, 분자 유전학, 유기 화학 및 핵산 화학 및 혼성화에서의 실험실 절차는 당업계에 잘 알려져 있으며 일반적으로 이용되는 것이다. 표준 기법이 핵산 및 펩타이드 합성에 사용된다. 기법 및 절차는 일반적으로 당업계의 통상적인 방법, 및 본 문헌 전체에 걸쳐 제공되는 다양한 일반적인 참조문헌에 따라 수행된다(일반적으로, 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]을 참조하며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조에 의해 포함됨). 본 명세서에서 사용되는 명명법 및 하기 기재된 분석 및 합성 유기 화학의 실험실 절차는 당업계에 잘 알려져 있으며, 일반적으로 이용되는 것이다. 표준 기법, 또는 이의 변형이 화학 합성 및 화학 분석에 사용된다.
용어 "M2.1" 및 "M2.2"는, 각각 (i) K62E, N127D, K137R, K170E, N193D; 및 (ii) K62E, Q95R, N127D, K132N, K137R, K170E, Q173R, N193D의 치환을 가지는 서열번호 2의 변이체를 지칭한다.
용어 "BS4M1" 및 "PM2", 및 "PM3"은 (i) BS4M1(D28N 및 L131R), (ii) PM2(Q40P, S47I, H93G) 및 (iii) PM3(D28N, Q40P, S47I, H93G, L131R)의 치환을 가지는 서열번호 1의 변이체를 지칭한다. FGF1:
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 단일-가닥 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이들의 중합체를 지칭한다. 특별히 제한되지 않는 한, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 가지고 자연 발생 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오타이드의 알려진 유사체를 포함하는 핵산을 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 축퇴 코돈 치환), 대립유전자, 동원체(ortholog), SNP, 및 상보적 서열뿐만 아니라, 명시적으로 표시된 서열을 암시적으로 포함한다. 구체적으로, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세번째 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol . Chem . 260:2605-2608 (1985); 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). 용어 핵산은 유전자, cDNA, 및 유전자에 의해 인코딩되는 mRNA와 상호교환적으로 사용된다. 더욱이, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드 변이체를 인코딩하는 핵산은 이러한 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 것으로 정의된다.
용어 "유전자"는 폴리펩타이드 사슬을 생성하는 데 관여하는 DNA의 절편을 의미한다. 이는 코딩 영역(리더 및 트레일러(trailer)) 앞 및 뒤의 영역뿐만 아니라, 개별 코딩 절편(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)을 포함할 수 있다.
핵산 또는 단백질에 적용될 때, 용어 "단리된"은 핵산 또는 단백질이 자연 상태에서 회합되어 있는 다른 세포 구성성분이 본질적으로 없음을 의미한다. 건조 또는 수용액일 수 있지만 바람직하게는 균질한 상태이다. 순도와 균질성은 전형적으로 분석 화학 기법, 예컨대, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 결정된다. 제제에 존재하는 지배적인 종인 단백질은 실질적으로 정제된다. 구체적으로, 단리된 유전자는 유전자에 측접하고 관심 유전자 이외의 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)에서 분리된다. 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 본질적으로 하나의 밴드를 생성함을 의미한다. 특히, 이는 핵산 또는 단백질이 적어도 85% 순수하고, 보다 바람직하게는 적어도 95% 순수하며, 가장 바람직하게는 적어도 99% 순수함을 의미한다. 단리된 핵산은 발현 벡터의 구성요소일 수 있다.
전형적으로, 본 발명의 단리된 폴리펩타이드는 바람직하게는 범위로 표현되는 순도 수준을 가진다. 폴리펩타이드에 대한 순도 범위의 하한은 약 60%, 약 70% 또는 약 80%이고 순도 범위의 상한은 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 약 95% 초과이다. 폴리펩타이드가 약 90% 초과로 순수할 때, 그 순도는 또한 바람직하게는 범위로 표현된다. 순도 범위의 하한은 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 96% 또는 약 98%이다. 순도 범위의 상한은 약 92%, 약 94%, 약 96%, 약 98% 또는 약 100% 순도이다.
순도는 당업계에서 인정한 임의의 분석 방법(예를 들어, 은 염색 겔 상의 밴드 강도, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동, HPLC, 질량분석법, 또는 유사한 수단)에 의해 결정된다.
용어 "아미노산"은 자연 발생 및 합성 아미노산뿐만 아니라, 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 인코딩된 것뿐만 아니라 이후에 변형되는 아미노산, 예를 들어, 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학적 구조, 즉, 수소에 결합된 α 탄소, 카복실기, 아미노기, 및 R기를 가지는 화합물, 예를 들어, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 지칭한다. 이와 같은 유사체는 변형된 R기(예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩타이드 백본을 가지지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학적 구조를 유지한다. "아미노산 모방체"는 아미노산의 일반적인 화학 구조와는 상이하지만, 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 구조를 가지는 화학적 화합물을 지칭한다.
"친수성 아미노산"은 문헌[Eisenberg et al., 1984, J. Mol. Biol. 179: 125-142]의 정규화된 컨센서스 소수성 척도에 따라 0 미만의 소수성을 나타내는 아미노산을 지칭한다. 유전적으로 인코딩된 친수성 아미노산은 Thr(T), Ser(S), His(H), Glu(E), Asn(N), Gln(Q), Asp(D), Lys(K) 및 Arg(R)을 포함한다.
"산성 아미노산"은 측쇄 pK 값이 7 미만인 친수성 아미노산을 지칭한다. 산성 아미노산은 전형적으로 수소 이온의 손실로 인해 생리학적 pH에서 음으로 하전된 측쇄를 가진다. 유전적으로 인코딩된 산성 아미노산은 Glu(E) 및 Asp(D)를 포함한다.
"염기성 아미노산"은 측쇄 pK 값이 7 초과인 친수성 아미노산을 지칭한다. 염기성 아미노산은 전형적으로 하이드로늄 이온과의 회합으로 인해 생리학적 pH에서 양으로 하전된 측쇄를 가진다. 유전적으로 인코딩된 염기성 아미노산은 His(H), Arg(R) 및 Lys(K)을 포함한다.
"극성 아미노산"은 생리학적 pH에서 하전되지 않은 측쇄를 가지지만, 2개의 원자가 공통으로 공유하는 전자 쌍이 원자 중 하나에 의해 더 밀접하게 유지되는 적어도 하나의 결합을 가지는 친수성 아미노산을 지칭한다. 유전적으로 인코딩된 극성 아미노산은 Asn(N), Gln(Q), Ser(S) 및 Thr(T)을 포함한다.
"소수성 아미노산"은 문헌[Eisenberg, 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142]의 정규화된 컨센서스 소수성 척도에 따라 0 초과의 소수성을 나타내는 아미노산을 지칭한다. 예시적인 소수성 아미노산은 Ile(I), Phe(F), Val(V), Leu(L), Trp(W), Met(M), Ala(A), Gly(G), Tyr(Y), Pro(P) 및 프롤린 유사체를 포함한다.
"방향족 아미노산"은 적어도 하나의 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 가지는 측쇄가 있는 소수성 아미노산을 지칭한다. 방향족 또는 헤테로방향족 고리는 하나 이상의 치환기, 예컨대, -OH, -SH, -CN, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, -NO, -NH2, -NHR, -NRR, -C (O)R, -C(O)OH, -C(O)OR, -C(O)NH2, -C(O)NHR, -C(O)NRR 등을 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 R은 독립적으로 (Cl-C6) 알킬, 치환된 (Cl-C6) 알킬, (Cl-C6) 알켄일, 치환된 (Cl-C6) 알켄일, (Cl-C6) 알킨일, 치환된 (Cl-C6) 알킨일, (Cl-C21)) 아릴, 치환된 (C5-C20) 아릴, (C6-C26) 알크아릴, 치환된 (C6-C26) 알크아릴, 5 내지 20원 헤테로아릴, 치환된 5 내지 20원 헤테로아릴, 6 내지 26원 알크헤테로아릴 또는 치환된 6 내지 26원 알크헤테로아릴이다. 유전적으로 인코딩된 방향족 아미노산은 Phe(F), Tyr(Y) 및 Trp(W)을 포함한다.
"비극성 아미노산"은 생리학적 pH에서 하전되지 않은 측쇄를 가지지만, 2개의 원자가 공통으로 공유하는 전자 쌍이 일반적으로 2개의 원자 각각에 의해 동일하게 유지되는 측쇄(즉, 측쇄가 극성이 아님)를 가지는 소수성 아미노산을 지칭한다. 유전적으로 인코딩된 무극성 아미노산은 Leu(L), Val(V), Ile(I), Met(M), Gly(G) 및 Ala(A)를 포함한다.
"지방족 아미노산"은 지방족 탄화수소 측쇄를 가지는 소수성 아미노산을 지칭한다. 유전적으로 인코딩된 지방족 아미노산은 Ala(A), Val(V), Leu(L) 및 Ile(I)을 포함한다.
아미노산 잔기 Cys(C)은 다른 Cys(C) 잔기 또는 다른 설포닐-포함 아미노산과 이황화 가교를 형성할 수 있다는 점에서 특이하다. 환원된 유리-SH 또는 산화된 이황화-가교 형태로 펩타이드에 존재하는 Cys(C) 잔기(및 -SH 포함 측쇄를 가지는 다른 아미노산)의 능력은 Cys(C) 잔기가 펩타이드에 대한 순 소수성 또는 친수성 특징에 기여하는지 여부에 영향을 미친다. Cys(C)가 아이젠버그(Eisenberg)(상기 Eisenberg, 1984)의 정규화된 컨센서스 척도에 따라 0.29의 소수성을 나타내지만, 본 발명의 목적상 Cys(C)는 상기 정의된 일반 분류에도 불구하고 극성 친수성 아미노산으로 분류된다는 것이 이해되어야 한다.
용어 "링커"는 2개 이상의 폴리펩타이드를 공유적으로 연결하는 아미노산 폴리펩타이드 스페이서를 지칭한다. 링커는 1 내지 15개 아미노산 잔기일 수 있다. 바람직하게는 링커는 단일 시스테인 잔기이다. 링커는 또한 서열번호 1 KESCAKKQRQHMDS의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
당업자에 의해 이해될 바와 같이, 상기 정의된 카테고리는 상호 배타적이지 않다. 따라서, 2가지 이상의 물리-화학적 특성을 나타내는 측쇄를 가지는 아미노산은 여러 카테고리에 포함될 수 있다. 예를 들어, Tyr(Y)과 같이 극성 치환기로 추가로 치환된 방향족 모이어티를 가지는 아미노산 측쇄는 방향족 소수성 특성 및 극성 또는 친수성 특성을 둘 다 나타낼 수 있으므로, 방향족 및 극성 카테고리 둘 다에 포함될 수 있다. 임의의 아미노산의 적절한 범주화는, 특히 본 명세서에서 제공되는 상세한 개시내용에 비추어 당업자에게 명백할 것이다.
"나선 파괴" 아미노산으로 불리는 특정 아미노산 잔기는 나선 내의 내부 위치에 포함될 때 a-나선의 구조를 파괴하는 경향을 가진다. 이와 같은 나선-파괴 특성을 나타내는 아미노산 잔기는 당업계에 잘 알려져 있으며(예를 들어, 문헌[Chou and Fasman, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276] 참조), Pro(P), Gly(G) 및 잠재적으로 모든 D-아미노산(L-펩타이드에 포함될 때; 반대로, L-아미노산은 D-펩타이드에 포함될 때 나선형 구조를 파괴함)뿐만 아니라 프롤린 유사체를 포함한다. 이러한 나선-파괴 아미노산 잔기는 상기 정의된 카테고리에 속하지만, Gly(G)를 제외하고(하기 논의됨), 이러한 잔기는 나선 내의 내부 위치에서 아미노산 잔기를 치환하는 데 사용되어서는 안되며 - 이들 잔기는 단지 펩타이드의 N-말단 및/또는 C-말단에서 1 내지 3개의 아미노산 잔기를 치환하는 데 사용되어야 한다.
상기 정의된 카테고리는 유전적으로 인코딩된 아미노산의 관점에서 예시되었지만, 아미노산 치환은 유전적으로 인코딩된 아미노산으로 제한될 필요는 없으며, 특정 실시형태에서 바람직하게는 유전적으로 인코딩된 아미노산으로 제한되지 않는다. 실제로, 화학식 (I)의 바람직한 펩타이드 중 다수는 유전적으로 비-인코딩된 아미노산을 포함한다. 따라서, 자연적으로 발생하는 유전적으로 인코딩된 아미노산에 추가적으로, 화학식 (I)의 코어 펩타이드의 아미노산 잔기는 자연적으로 발생하는 비-인코딩된 아미노산 및 합성 아미노산으로 치환될 수 있다.
화학식 (I)의 코어 펩타이드에 유용한 치환을 제공하는 일반적으로 접하는 특정 아미노산은 β-알라닌(β-Ala) 및 다른 오메가-아미노산, 예컨대, 3-아미노프로피온산, 2, 3-다이아미노프로피온산(Dpr), 4-아미노뷰티르산 등; α-아미노아이소뷰티르산(Aib); ε-아미노헥산산(Aha); δ-아미노발레르산(Ava); N-메틸글리신 또는 살코신(MeGly); 오르니틴(Orn); 시트룰린(Cit); t-뷰틸알라닌(t-BuA); t-뷰틸글리신(t-BuG); N-메틸아이소류신(MeIle); 페닐글리신(Phg); 사이클로헥실알라닌(Cha); 노르류신(Nle); 나프틸알라닌(Nal); 4-클로로페닐알라닌(Phe(4-Cl)); 2-플루오로페닐알라닌(Phe(2-F)); 3-플루오로페닐알라닌(Phe(3-F)); 4-플루오로페닐알라닌(Phe(4-F)); 페니실라민(Pen); 1/2/3/4-테트라하이드로아이소퀴놀린-3-카복실산(Tic); β-2-티에닐알라닌(Thi); 메티오닌 설폭사이드(MSO); 호모아르기닌(hArg); N-아세틸 라이신(AcLys); 2,4-다이아미노뷰티르산(Dbu); 2,3-다이아미노뷰티르산(Dab); p-아미노페닐알라닌(Phe(pNH2)); N-메틸 발린(MeVal); 호모시스테인(hCys), 호모페닐알라닌(hPhe) 및 호모세린(hSer); 하이드록시프롤린(Hyp), 호모프롤린(hPro), N-메틸화 아미노산 및 펩토이드(N-치환된 글리신)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 추가적으로, 일부 실시형태에서 화학식 (I)의 코어 펩타이드에서 아미노산 프롤린은 아제티딘-2-카복실레이트(A2C), L-티아졸리딘-4-카복실산, 시스-4-하이드록시-L-프롤린(CHP), 3,4-데하이드로프롤린, 티오프롤린, 및 아이소니페코티산(Inp)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 프롤린 유사체로 구체화된다.
아미노산은 본 명세서에서 일반적으로 알려진 3개 문자 기호로 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)가 권장하는 1개 문자 기호로 지칭될 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오타이드는 일반적으로 허용되는 단일 문자 코드로 지칭될 수 있다.
아미노산 서열과 관련하여, 변경이 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환하는 결과를 가져오는 경우, 당업자는 인코딩된 서열에서 단일 아미노산 또는 소량의 아미노산을 변경, 추가 또는 결실시키는 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질 서열에 대한 개별적인 치환, 결실 또는 추가가 "보존적으로 변형된 변이체"임을 인식할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 잘 알려져 있다. 이와 같은 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형체 변이체, 종간 상동체, 및 대립유전자에 추가되고 이들을 배제하지 않는다.
다음 8개의 그룹 각각은 서로 보존적 치환인 아미노산을 포함한다:
1)
알라닌(A), 글리신(G);
2)
아스파르트산(D), 글루탐산(E);
3)
아스파라긴(N), 글루타민(Q);
4)
아르기닌(R), 라이신(K);
5)
아이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V);
6)
페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W);
7)
세린(S), 트레오닌(T); 및
8)
시스테인(C), 메티오닌(M)
(예를 들어, 문헌[Creighton, Proteins (1984)] 참조).
아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기의 상대적 유사성, 예를 들어, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 기반으로 한다. 상기한 특징 중 하나 이상을 고려하는 예시적인 치환은 당업자에게 잘 알려져 있으며, (Ala: Gly, Ser), (Arg: Lys), (Asn: Gln, His), (Asp: Glu, Cys, Ser), (Gln: Asn), (Glu: Asp), (Gly: Ala), (His: Asn, Gln), (Ile: Leu, Val), (Leu: Ile, Val), (Lys: Arg), (Met: Leu, Tyr), (Ser: Thr), (Thr: Ser), (Tip: Tyr), (Tyr: Trp, Phe), 및 (Val: Ile, Leu)(원래 잔기: 예시적인 치환)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 따라서, 본 개시내용의 실시형태는 상기 제시된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 단백질의 기능적 또는 생물학적 등가물을 고려한다. 구체적으로, 본 발명의 실시형태는 모 폴리펩타이드와 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 95% 서열 동일성을 가지는 변이체를 제공한다. 다양한 실시형태에서, 본 발명은 모 폴리펩타이드 서열, 예를 들어, 야생형 FGF1(서열번호 1)을 포함하는 야생형 성장 인자의 일부와 이러한 수준의 동일성을 가지는 변이체를 제공한다. 다양한 실시형태에서, 변이체는 모 폴리펩타이드 또는 모 폴리펩타이드의 일부, 예를 들어, 본 명세서에 정의된 바와 같은 야생형 FGF1(서열번호 1)을 포함하는 야생형 성장 인자와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진다.
"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, "보존적으로 변형된 변이체"는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 핵산이 아미노산 서열을 인코딩하지 않는 경우 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 인코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 인코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 코돈은 인코딩되는 폴리펩타이드를 변경하지 않으면서 기재된 상응하는 코돈 중 임의의 것으로 변경될 수 있다. 이와 같은 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이의 하나의 종인 "침묵 변이"이다. 폴리펩타이드를 인코딩하는 본 명세서의 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기재한다. 당업자는 핵산의 각각의 코돈(보통 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 보통 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG를 제외함)은 변형되어 기능적으로 동일한 분자를 산출할 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 기재된 서열에 내포되어 있다.
당업계에 공지된 바와 같이 "동일성"은 서열을 비교함으로써 결정되는 바와 같이, 2개 이상의 폴리펩타이드 또는 단백질 서열 사이의 관계이다. 당업계에서, "동일성"은 또한 이와 같은 서열의 스트링 사이의 일치에 의해 결정된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 단백질 사이의 서열 관련성의 정도를 지칭한다. "동일성"은 알려진 생체정보 방법으로 용이하게 계산될 수 있다.
"펩타이드"는 단량체가 아미노산이고 아마이드 결합을 통해 함께 결합된 중합체를 지칭한다. 본 발명의 펩타이드는, 예를 들어, 2개의 아미노산에서 수백 또는 수천개의 아미노산까지 크기가 다양할 수 있다. 더 큰 펩타이드(예를 들어, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30 또는 적어도 50개 아미노산 잔기)는 대안적으로 "폴리펩타이드" 또는 "단백질"로 지칭된다. 추가적으로, 비천연 아미노산, 예를 들어, β-알라닌, 페닐글리신, 호모아르기닌 및 호모페닐알리닌이 또한 포함된다. 유전자-인코딩되지 않은 아미노산이 또한 본 발명에서 사용될 수 있다. 또한, 반응성 기, 글리코실화 서열, 중합체, 치료용 모이어티, 생체분자 등을 포함하도록 변형된 아미노산이 또한 본 발명에서 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 모든 아미노산은 D- 또는 L-이성질체일 수 있다. L-이성질체가 일반적으로 바람직하다. 추가적으로, 다른 펩타이드모방체가 또한 본 발명에서 유용하다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "펩타이드" 또는 "폴리펩타이드"는 글리코실화 및 비-글리코실화 펩타이드 또는 "폴리펩타이드"를 둘 다 지칭한다. 또한 폴리펩타이드를 발현하는 시스템에 의해 불완전하게 글리코실화되는 폴리펩타이드가 포함된다. 일반적인 검토를 위해, 문헌[Spatola, A. F., in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983)]을 참조한다.
본 출원에서, 아미노산 잔기는 "1"로 번호가 매겨진 폴리펩타이드의 N-말단 아미노산(예를 들어, N-말단 메티오닌)으로부터 상대적인 위치에 따라 (전형적으로 위첨자로) 번호가 매겨진다. N-말단 아미노산은 "1"로 번호가 매겨진 메티오닌(M)일 수 있다. 폴리펩타이드의 N-말단이 메티오닌 없이 시작하는 경우, 각각의 아미노산 잔기와 연관된 숫자는 N-말단 메티오닌의 부재를 반영하도록 용이하게 조정될 수 있다. 예시적인 폴리펩타이드의 N-말단은 메티오닌과 함께 또는 메티오닌 없이 시작할 수 있는 것으로 이해된다. 따라서 아미노산 링커가 야생형 폴리펩타이드의 N-말단에 추가되는 경우, N-말단 아미노산에 인접한 제1 링커 아미노산은 번호가 -1 등이다. 예를 들어, 링커가 야생형 폴리펩타이드의 N-말단 아미노산에 인접한 S 잔기가 있는 KESCAKKQRQHMDS(서열번호 2)의 아미노산 잔기를 가진다면, 대부분의 N-말단 링커 아미노산 K는 -14일 것인 한편, 대부분의 C-말단 링커 아미노산 S는 -1일 것이다. 이러한 방식으로, 야생형 폴리펩타이드 및 링커 결합 야생형 폴리펩타이드에서 아미노산의 번호매김이 보존된다.
용어 "모 폴리펩타이드"는 야생형 폴리펩타이드를 말하고 야생형 폴리펩타이드의 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열은 공개적으로 접근 가능한 단백질 데이터베이스(예를 들어, EMBL Nucleotide Sequence Database, NCBI Entrez, ExPasy, Protein Data Bank 등)의 일부이다.
용어 "돌연변이 폴리펩타이드" 또는 "폴리펩타이드 변이체" 또는 "돌연변이단백질(mutein)" 또는 "변이 폴리펩타이드"는 폴리펩타이드의 형태를 말하며, 여기서 이의 아미노산 서열은 이의 상응하는 야생형(모) 형태, 자연적으로 존재하는 형태 또는 임의의 다른 모 형태의 아미노산 서열과 상이하다. 돌연변이 폴리펩타이드는 돌연변이 폴리펩타이드를 초래하는 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어, 대체, 삽입, 결실 등을 포함할 수 있다.
용어 "모 폴리펩타이드에 상응하는"(또는 이 용어의 문법적 변형)은 본 발명의 폴리펩타이드를 기재하는 데 사용되며, 여기서 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 적어도 아미노산 변이의 존재에 의해서만 상응하는 모 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 상이하다. 전형적으로, 변이 폴리펩타이드 및 모 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 높은 비율의 동일성을 나타낸다. 일 예에서, "모 폴리펩타이드에 상응하는"은 변이 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 모 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 적어도 약 50% 동일성, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 98% 동일성을 가진다. 또 다른 예에서, 변이 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열은 모 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열과 적어도 약 50% 동일성, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 98% 동일성을 가짐을 의미한다. 일부 실시형태에서, 모 폴리펩타이드는 서열번호 1의 FGF1에 상응한다.
용어 "모 폴리펩타이드에 변이를 도입하는 것(또는 첨가하는 것 등)"(또는 이의 문법적 변이형) 또는 변이를 포함하기 위해 "모 폴리펩타이드를 변형하는 것"(또는 이의 문법적 변형)은 반드시 모 폴리펩타이드가 이와 같은 전환을 위한 물리적 출발 물질임을 의미하지 않으며, 오히려 모 폴리펩타이드가 변이 폴리펩타이드를 만들기 위한 안내 아미노산 서열을 제공함을 의미한다. 일 예에서, "모 폴리펩타이드에 변이체를 도입하는 것"은 모 폴리펩타이드에 대한 유전자가 적절한 돌연변이를 통해 변형되어 변이 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 생성함을 의미한다. 또 다른 예에서, "모 폴리펩타이드에 변이체를 도입하는 것"은 이론적으로 생성된 폴리펩타이드가 가이드로서 모 폴리펩타이드 서열을 사용하여 설계됨을 의미한다. 그 다음, 설계된 폴리펩타이드는 화학적 또는 다른 수단에 의해 생성될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "NK1"은 간세포 성장 인자의 N-말단 및 제1 크링글 도메인으로 이루어진다. 본 발명의 폴리펩타이드에서 중단점은 인간 간세포 성장 인자 아이소형 1의 아미노산 28 내지 210번을 포함한다(Genbank 수탁 ID NP_000592). 다른 것들은 31 내지 210번 및 32 내지 210번의 중단점을 사용하였다. 대체 인간 간세포 성장 인자 아이소형인 아이소형 3(Genbank 수탁 ID NP_ 00101932.1)은 제1 크링글 도메인에서 5개 아미노산 결실을 제외하고, 인간 HGF(hHGF) 아이소형 1과 동일하다. hHGF 아이소형 1 및 아이소형 3은 둘 다 Met 수용체를 강력하게 활성화시키고 hHGF 아이소형 1 및 아이소형 3으로부터 유래된 NK1 단백질은 둘 다 Met 수용체에 결합하여 이를 활성화시킨다. 아이소형 3 변이체를 기반으로 한 NK1에 대한 28 내지 205번, 31 내지 205번, 및 32 내지 205번의 중단점은 아이소형 1 변이체를 기반으로 한 NK1에 대한 28 내지 210번, 31 내지 210번, 및 32번 내지 210번의 중단점과 동일할 것이며, 유일한 차이점은 제1 크링글 도메인(K1)에서 5개 아미노산의 결실이다.
용어 "라이브러리"는 각각 공통 모 폴리펩타이드에 상응하는 상이한 폴리펩타이드의 집합을 지칭한다. 라이브러리의 각각의 폴리펩타이드 종은 라이브러리의 구성원으로 지칭된다. 바람직하게는, 본 발명의 라이브러리는 리드 폴리펩타이드를 확인할 수 있는 집단을 제공하기에 충분한 수 및 다양성의 폴리펩타이드의 집합을 나타낸다. 라이브러리는 적어도 2가지의 상이한 폴리펩타이드를 포함한다. 일 실시형태에서, 라이브러리는 약 2 내지 약 100,000,000개 구성원을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 라이브러리는 약 10,000 내지 약 100,000,000개 구성원을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 라이브러리는 약 100,000 내지 약 100,000,000개 구성원을 포함한다. 추가 실시형태에서, 라이브러리는 약 1,000,000 내지 약 100,000,000개 구성원을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 라이브러리는 약 10,000,000 내지 약 100,000,000개 구성원을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 라이브러리는 100개 초과의 구성원을 포함한다.
라이브러리의 구성원은 혼합물의 일부이거나 서로 단리될 수 있다. 일 예에서, 라이브러리의 구성원은 선택적으로 다른 구성요소를 포함하는 혼합물의 일부이다. 예를 들어, 적어도 2가지 폴리펩타이드가 일정 부피의 세포-배양 브로스에 존재한다. 또 다른 예에서, 라이브러리의 구성원은 각각 개별적으로 발현되고 선택적으로 단리된다. 단리된 폴리펩타이드는 선택적으로 다수-웰 용기에 포함될 수 있으며, 여기서 각각의 웰은 상이한 유형의 폴리펩타이드를 포함한다. 또 다른 예에서, 라이브러리의 구성원은 각각 효모 또는 박테리아 세포 또는 파지 또는 바이러스 입자에 대한 융합체로서 발현된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "중합체 변형기"는 적어도 하나의 중합체 모이어티(중합체)를 포함하는 변형기이다. 폴리펩타이드에 추가되는 중합체 변형기는 이와 같은 폴리펩타이드의 특성, 예를 들어, 이의 생체이용률, 생물학적 활성 또는 이의 체내 반감기를 변경시킬 수 있다. 예시적인 중합체는 수용성 및 수불용성 중합체를 포함한다. 중합체 변형기는 선형 또는 분지형일 수 있고 하나 이상의 독립적으로 선택되는 중합체 모이어티, 예컨대, 폴리(알킬렌 글라이콜) 및 이의 유도체를 포함할 수 있다. 일 예에서, 중합체는 비-자연적으로 발생한다. 예시적인 실시형태에서, 중합체 변형기는 수용성 중합체, 예를 들어, 폴리(에틸렌 글라이콜) 및 이의 유도체(PEG, m-PEG), 폴리(프로필렌 글라이콜) 및 이의 유도체(PPG, m-PPG) 등을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 폴리(에틸렌 글라이콜) 또는 폴리(프로필렌 글라이콜)은 본질적으로 균일분산(homodisperse)된 분자량을 가진다. 일 실시형태에서, 중합체 변형기는 자연적으로 발생하는 다당류가 아니다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표적화 모이어티"는 신체의 특정 조직 또는 영역에 선택적으로 국소화될 종을 지칭한다. 국소화는 분자 결정인자의 특정 인식, 표적화제 또는 접합체의 분자 크기, 이온 상호작용, 소수성 상호작용 등에 의해 매개된다. 작용제를 특정 조직 또는 영역에 대해 표적화하는 다른 메커니즘은 당업자에게 알려져 있다. 예시적인 표적화 모이어티는 항체, 항체 단편, 트랜스페린, HS-당단백질, 응고 인자, 혈청 단백질, β-당단백질, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Fc-융합 단백질"은, 본 명세서에서 "Fc-모이어티"로 지칭될 면역글로불린-유래 모이어티, 및 질환의 치료가 의도되는지 여부에 관계없이 본 명세서에서 "치료용 모이어티"로 지칭될 제2의 비-면역글로불린 단백질로부터 유래된 모이어티를 포함하는 단백질, 구체적으로 치료용 단백질을 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "치료용 모이어티"는 항생제, 항염증제, 항-종양 약물, 세포독소, 및 방사성 작용제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 치료에 유용한 임의의 작용제를 의미한다. "치료용 모이어티"는 생물활성 작용제의 전구약물, 즉, 하나 초과의 치료용 모이어티가 담체, 예를 들어, 다가 작용제에 결합된 작제물을 포함한다.
치료용 모이어티는 또한 단백질 및 단백질을 포함하는 작제물을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "항-종양 약물"은 포함하는 암을 퇴치하는 데 유용한 임의의 작용제를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "세포독소 또는 세포독성제"는 세포에 해로운 임의의 작용제를 의미한다. 예는 택솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 다이하이드록시 안트라신다이온, 미토산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신 및 이들의 유사체 또는 동족체를 포함한다. 다른 독소는, 예를 들어, 라이신, CC-1065 및 유사체, 및 듀오카르마이신을 포함한다. 또 다른 독소는 디프테리아 독소, 및 뱀독(예를 들어, 코브라독)을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "방사성 작용제"는 종양을 진단하거나 파괴하는 데 효과적인 임의의 방사성 동위원소를 포함한다. 예는 인듐-111, 코발트-60, 플루오린-18, 구리-64, 구리-67, 루테튬-177 또는 테크니슘-99m을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 추가적으로, 전형적으로 방사성 동위원소의 혼합물을 나타내는 우리늄, 라듐, 및 토륨과 같은 자연적으로 발생하는 방사성 원소는 방사성 작용제의 적합한 예이다. 금속 이온은 전형적으로 유기 킬레이팅 모이어티를 이용하여 킬레이트화된다. 방사성 작용제 또는 방사성 핵종은 영상화제의 구성요소일 수 있다.
근적외선 염료는 또한 광 영상화(optical imaging) 응용을 위한 표준 화학물질을 사용하여 접합될 수 있다. "근적외선"은 가시광선과 연관된 부분에 인접한 전자기 스펙트럼 부분의 방사선, 예를 들어, 약 0.7㎛ 내지 약 1㎛를 지칭한다. 근적외선 염료는, 예를 들어, 사이아닌 또는 인도사이아닌 유도체, 예컨대, Cy5.5를 포함할 수 있다. 적외선 염료는 또한 포스포아미다이트 염료, 예를 들어, IRDye® 800(LI-COR® Biosciences)을 포함할 수 있다.
많은 유용한 킬레이팅기, 크라운 에터, 크립탠드 등이 당업계에 알려져 있으며, 본 발명의 화합물에 포함될 수 있다(예를 들어, EDTA, DTPA, DOTA, NTA, HDTA 등 및 이의 포스포네이트 유사체, 예컨대, DTPP, EDTP, HDTP, NTP 등). 예를 들어, 문헌[Pitt et al., "The Design of Chelating Agents for the Treatment of Iron Overload," In, Inorganic Chemistry in Biology and Medicine; Martell, Ed.; American Chemical Society, Washington, D.C., 1980, pp. 279-312; Lindoy, The Chemistry of Macrocyclic Ligand Complexes; Cambridge University Press, Cambridge,1989; Dugas, BIOORGANIC CHEMISTRY; Springer-Verlag, New York, 1989], 및 이에 포함된 참조문헌을 참조한다. 추가적으로, 킬레이팅 작용제, 크라운 에터 및 사이클로덱스트린을 다른 분자에 부착하는 것을 가능하게 하는 여러 가지 경로가 당업자에게 이용 가능하다. 예를 들어, 문헌[Meares et al., "Properties of In Vivo Chelate-Tagged Proteins and Polypeptides." In, Modification of Proteins: Food, Nutritional, and Pharmacological Aspects; Feeney, et al., Eds., American Chemical Society, Washington, D.C., 1982, pp. 370-387; Kasina et al., Bioconjugate Chem., 9: 108-117 (1998); Song et al., Bioconjugate Chem., 8: 249-255 (1997)]을 참조한다. 이러한 금속 결합제는 영상화 방식에서 검출 가능한 금속 이온을 결합하는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 접합체와 조합될 때 접합체의 활성을 유지하고 대상체의 면역계와 반응하지 않는 임의의 물질을 포함한다. "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 고체 및 액체, 예컨대, 비히클, 희석제 및 용매를 포함한다. 예는 표준 약제학적 담체, 예컨대, 포스페이트 완충 식염수 용액, 물, 에멀션, 예컨대, 오일/물 에멀션, 및 다양한 유형의 습윤제 중 임의의 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 담체는 또한 멸균 용액, 코팅 정제를 포함한 정제 및 캡슐을 포함할 수 있다. 전형적으로 이와 같은 담체는 부형제, 예컨대, 전분, 우유, 당, 특정 유형의 점토, 젤라틴, 스테아르산 또는 이의 염, 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트, 활석, 식물성 지방 또는 오일, 검, 글리콜, 또는 기타 알려진 부형제를 포함한다. 이와 같은 담체는 또한 향료 및 착색 첨가물 또는 다른 성분을 포함할 수 있다. 이와 같은 담체를 포함하는 조성물은 잘 알려진 통상적인 방법에 의해 제형화된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "투여하는"은 대상체에 대한, 경구 투여, 좌제로서의 투여, 국부 접촉, 정맥내, 복강내, 근육내, 척추강내, 병변내, 또는 피하 투여, 흡입에 의한 투여, 또는 서방형 장치, 예를 들어, 미니-삼투 펌프의 이식을 의미한다. 투여는 비경구 및 경점막(예를 들어, 경구, 비강, 질, 직장, 또는 경피)을 포함한 임의의 경로, 특히 흡입에 의해 이루어진다. 비경구 투여는, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 동맥내, 피내, 피하, 복강내, 심실내, 및 두개내 투여를 포함한다. 더욱이, 주사가 종양을 치료, 예를 들어, 아포토시스를 유도하기 위한 것인 경우, 투여는 직접 종양에 그리고/또는 종양을 둘러싼 조직 내로 이루어질 수 있다. 다른 전달 방식은 리포좀 제형, 정맥내 주입, 경피 패치 등의 사용을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
용어 "개선하는" 또는 "개선하다"는 증상의 경감, 완화 또는 감소 또는 환자의 신체적 또는 정신적 안녕의 개선과 같은 임의의 객관적 또는 주관적 매개변수를 포함하여, 병리 또는 병태의 치료에서 임의의 성공 표시를 지칭한다. 증상의 개선은, 신체 검사 및/또는 정신과 평가 결과를 포함하여, 객관적 또는 주관적 매개변수를 기반으로 할 수 있다.
용어 "치료법"은 질환에 취약하게 할 수 있지만 아직 질환의 증상을 경험하거나 나타내지 않은 대상체(예를 들어, 인간)에서 질환 또는 병태가 일어나는 것을 방지하는 것(예방적 치료), 질환을 저해하는 것(질환의 발달을 늦추거나 저지하는 것), 질환의 증상 또는 부작용으로부터 경감을 제공하는 것(완화적 치료를 포함함), 및 질환을 완화시키는 것(질환의 퇴행을 유발하는 것)을 포함하는 질환 또는 병태를 "치료하는 것" 또는 이의 "치료"를 지칭한다.
용어 "유효량" 또는 "~에 효과적인 양" 또는 "치료적 유효량" 또는 임의의 문법적으로 동등한 용어는 질환을 치료하기 위해 동물 또는 인간에게 투여될 때 해당 질환에 대한 치료를 이행하기에 충분한 양을 의미한다. 유효량은 또한, 예를 들어, 아포토시스, 세포 주기 개시, 및/또는 신호 전달을 포함하여 세포 반응을 유발하는 데 필요한 양을 말할 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한 염"은 본 명세서에 기재된 화합물에서 발견되는 특정 치환기에 따라, 상대적으로 무독성인 산 또는 염기로 제조된 활성 화합물의 염을 포함한다. 본 발명의 화합물이 상대적으로 산성인 작용기를 포함하는 경우, 염기 부가 염은 이와 같은 화합물의 중성 형태를 순수한 상태로 또는 적합한 불활성 용매에서 충분한 양의 원하는 염기와 접촉시킴으로써 수득될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 염기 부가 염의 예는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 유기 아미노, 또는 마그네슘 염, 또는 유사한 염을 포함한다. 본 발명의 화합물이 상대적으로 염기성인 작용기를 포함하는 경우, 산 부가 염은 이와 같은 화합물의 중성 형태를 순수한 상태로 또는 적합한 불활성 용매에서 충분한 양의 원하는 산과 접촉시킴으로써 수득될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 산 부가 염의 예는 염산, 브롬화수소산, 질산, 탄산, 일수소탄산, 인산, 일수소인산, 이수소인산, 황산, 일수소황산, 요오드화수소산, 또는 아인산 등과 같은 무기산으로부터 유래된 것뿐만 아니라, 아세트산, 프로피온산, 아이소뷰티르산, 말레산, 말론산, 벤조산, 숙신산, 수베르산, 푸마르산, 락트산, 말델산, 프탈산, 벤젠설폰산, p-톨릴설폰산, 시트르산, 타타르산, 메탄설폰산 등과 같은 비교적 무독성인 유기산으로부터 유래된 염을 포함한다. 또한 아르기네이트 등과 같은 아미노산의 염, 및 글루쿠론산 또는 갈락투노릭산 등과 같은 유기산의 염이 포함된다(예를 들어, 문헌[Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science, 66: 1-19 (1977)] 참조). 본 발명의 구체적인 특정 화합물은 화합물이 염기 또는 산 부가 염으로 전환될 수 있게 하는 염기성 및 산성 작용기를 둘 다 포함한다.
중성 형태의 화합물은 바람직하게는 염을 염기 또는 산과 접촉시키고 통상적인 방식으로 모 화합물을 분리함으로써 재생된다. 화합물의 모 형태는 특정 물리적 특성, 예컨대, 극성 용매 중 용해도에서 다양한 염 형태와 상이하지만, 그 외에는 염은 본 발명의 목적상 화합물의 모 형태와 동등하다.
본 발명의 화합물은 또한 이와 같은 화합물을 구성하는 하나 이상의 원자에서 비자연적인 비율의 원자 동위원소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 화합물은, 예를 들어, 삼중수소(3H), 요오드-125(125I) 또는 탄소-14(14C)와 같은 방사성 동위원소로 방사선 표지화될 수 있다. 본 발명의 화합물의 모든 동위원소 변이는 방사성 여부에 관계없이 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "반응성 작용기"는 올레핀, 아세틸렌, 알코올, 페놀, 에터, 옥사이드, 할라이드, 알데하이드, 케톤, 카복실산, 에스터, 아마이드, 시아네이트, 아이소시아네이트, 티오시아네이트, 아이소티오시아네이트, 아민, 하이드라진, 하이드라존, 하이드라지드, 다이아조, 다이아조늄, 나이트로, 나이트릴, 머캅탄, 설파이드, 다이설파이드, 설폭사이드, 설폰, 설폰산, 설핀산, 아세탈, 케탈, 안하이드라이드, 설페이트, 설펜산 아이소나이트릴, 아미딘, 이미드, 이미데이트, 나이트론, 하이드록실아민, 옥심, 하이드록삼산 티오하이드록삼산, 알렌, 오쏘 에스터, 설파이트, 엔아민, 인아민, 우레아, 슈도우레아, 세미카바자이드, 카보다이이미드, 카바메이트, 이민, 아지드, 아조 화합물, 아족시 화합물, 및 나이트로소 화합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 기를 지칭한다. 반응성 작용기는 또한 생체 접합체, 예를 들어, N-하이드록시석신이미드 에스터, 말레이미드 등을 제조하는 데 사용되는 것을 포함한다. 이들 작용기 각각을 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 특정 목적을 위한 이들의 적용 또는 변형은 당업자의 능력 내에 있다(예를 들어, 문헌[Sandler and Karo, eds. Organic Functional Group Preparations, Academic Press, San Diego, 1989] 참조).
III.
변이체
:
HGF
및
FGF
일부 실시형태에서, 변이체는 야생형 성장 인자와 비교하여 단백질분해에 안정적인 변이체이다. 예시적인 실시형태에서, 변이체는 야생형과 비교하여 증가된 단백질분해 안정성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 변이체는 야생형 성장 인자의 임의의 변이체이다. 일부 실시형태에서, 변이체는 야생형 성장 인자가 결합하는 성장 인자 수용체에 대한 길항제이다.
일부 실시형태에서, 변이체는 FGF1의 변이체이다. 일부 실시형태에서, 아미노산 치환, 아미노산 결실, 아미노산 부가 및 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 구성원을 포함하는 인간 섬유아세포 성장 인자 1(FGF1)의 변이체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 얻어지는 FGF1 변이체가 서열번호 1의 야생형 FGF1과 비교하여 증가된 단백질분해 안정성을 나타내는 아미노산 치환, 아미노산 결실, 아미노산 부가 및 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 구성원을 포함하는 인간 섬유아세포 성장 인자 1(FGF1)의 변이체가 제공된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체는 β-루프에서 또는 C-말단 근처에서 아미노산 치환, 아미노산 결실, 아미노산 부가 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체는 섬유아세포 성장 인자 수용체(FGFR) 길항제이다. 본 발명은 적어도 하나의 위치에 모 FGF1 폴리펩타이드(야생형, 서열번호 1)에서 발견되지 않는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 FGF1 폴리펩타이드를 제공한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 1의 FGF1 변이체는 적어도 하나의 아미노산 치환을 가진다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체는 28, 40, 47, 93 또는 131번 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체는 D28N, Q40P, S47I, H93G, L131R 및 L131K로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체는 아미노산 치환 L131R을 포함한다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체는 아미노산 치환 L131K를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체는 아미노산 치환 D28N 및 L131R를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체는 아미노산 치환 D28N 및 L131K를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체는 아미노산 치환 Q40P, S47I, H93G 및 L131R을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체는 아미노산 치환 Q40P, S47I, H93G 및 L131K를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체는 아미노산 치환 D28N, Q40P, S47I, H93G 및 L131R를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체는 아미노산 치환 D28N, Q40P, S47I, H93G 및 L131K를 포함한다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체는 아미노산 치환 L131A를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 변이체 FGF1은 BS4M1(D28N 및 L131R) 변이체로 지칭되는 변이체이다. 일부 실시형태에서, BS4M1은 하기 서열을 포함한다:
일부 실시형태에서, 변이체 FGF1은 PM2(Q40P, S47I, H93G)로 지칭되는 변이체이다. 일부 실시형태에서, PM2는 하기 서열을 포함한다:
일부 실시형태에서, 변이체 FGF1은 PM3(D28N, Q40P, S47I, H93G, L131R)으로 지칭되는 변이체이다. 일부 실시형태에서, PM3은 하기 서열을 포함한다:
일부 실시형태에서, 변이체 FGF1은 하기 서열을 포함한다:
일부 실시형태에서, 변이체 FGF1은 하기 서열을 포함한다:
일부 실시형태에서, 변이체는 단리된 변이체이다. 일부 실시형태에서, 변이체는 본 폴리펩타이드에 존재하지 않는 적어도 하나의 바람직한 특징을 나타낸다. 예시적인 특징은 단백질분해 안정성의 증가, 열 안정성의 증가, 형태적 유연성의 증가 또는 감소 및 길항 활성의 증가를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 변이체는 이들 개선된 특징 중 2가지 이상의 임의의 조합을 나타낼 수 있다.
일부 실시형태에서, 변이체 FGF1은 FGFR 수용체에 대한 길항제이다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가진다.
일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체는 모 폴리펩타이드와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가진다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 성장 인자 변이체는 모 폴리펩타이드와 적어도 약 99.2%, 적어도 약 99.4%, 적어도 약 99.6% 또는 적어도 약 99.8%의 서열 동일성을 가진다.
일부 실시형태에서, FGF1 변이체는 모 폴리펩타이드와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가진다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 FGF1 변이체는 모 폴리펩타이드와 적어도 약 99.2%, 적어도 약 99.4%, 적어도 약 99.6% 또는 적어도 약 99.8%의 서열 동일성을 가진다.
일부 실시형태에서, 돌연변이된 서열번호 1의 위치는 28, 40, 47, 93 또는 131번 중 하나 이상을 포함한다. 당업자가 인식할 바와 같이, 이들 위치의 임의의 조합이 돌연변이될 수 있다.
일부 실시형태에서, 28번 위치에서 모 폴리펩타이드의 아미노산은 야생형 FGF1(예를 들어, 서열번호 )와 비교하여 N으로 변경된다.
일부 실시형태에서, 40번 위치에서 모 폴리펩타이드의 아미노산은 P로 변경된다.
일부 실시형태에서, 47번 위치에서 모 폴리펩타이드의 아미노산은 I로 변경된다.
일부 실시형태에서, 93번 위치에서 모 폴리펩타이드의 아미노산은 G로 변경된다.
일부 실시형태에서, 131번 위치에서 모 폴리펩타이드의 아미노산은 R로 변경된다. 일부 실시형태에서, 131번 위치에서 모 폴리펩타이드의 아미노산은 K로 변경된다.
본 발명은 적어도 하나의 위치에서 모 hHGF 폴리펩타이드(야생형)에서 발견되지 않는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 hHGF 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명은 아이소형 1 및 3을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 hHGF의 모든 아이소형의 변이체를 포함한다. 아이소형 3(NCBI 수탁번호 NP_001010932)은 하기 서열번호 8(아이소형 1)에 밑줄이 그어진 5개의 아미노산 결실(SFLPS)을 포함한다.
예시적인 실시형태에서, 본 발명은 적어도 하나의 아미노산 치환을 가지는 서열번호 9의 변이체를 제공한다.
예시적인 실시형태에서, 변이체는 단리된 변이체이다. 또한, 다양한 실시형태에서, 변이체는 본 폴리펩타이드에 존재하지 않는 적어도 하나의 바람직한 특징을 나타낸다. 예시적인 특징은 Met 수용체에 대한 친화성의 증가, 열 안정성의 증가, 형태적 유연성의 증가 또는 감소 및 Met 수용체에 대한 효현제 또는 길항 활성의 증가를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 변이체는 이들 개선된 특징 중 2가지 이상의 임의의 조합을 나타낼 수 있다.
예시적인 실시형태에서, 폴리펩타이드 변이체는 Met 수용체에 대한 길항제이다. 다양한 실시형태에서, 변이체는 Met 수용체에 대한 효현제이다.
예시적인 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 9로부터 선택되는 구성원인 서열을 가지는 hHGF 폴리펩타이드 변이체를 제공한다.
예시적인 모 폴리펩타이드는 야생형 HGF 아이소형 1(HGF NCBI 수탁번호 NP_000592)(서열번호 8)이다.
서열번호 8에서, 신호 펩타이드는 1 내지 31번 아미노산을 포함한다. N-말단 도메인은 39 내지 122번 아미노산을 포함한다. 크링글 1 도메인은 126 내지 207번 아미노산을 포함하고; 크링글 2는 208 내지 289번 아미노산을 포함하며; 크링글 3은 302 내지 384번 아미노산을 포함하고; 크링글 4는 388 내지 470번 아미노산을 포함한다. 세린 프로테아제-유사 도메인은 495 내지 719번을 포함한다.
예시적인 실시형태에서, 본 발명의 변이체는 모 폴리펩타이드와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가진다. 다양한 실시형태에서, 본 발명의 변이체는 모 폴리펩타이드와 적어도 약 99.2%, 적어도 약 99.4%, 적어도 약 99.6% 또는 적어도 약 99.8%의 서열 동일성을 가진다.
예시적인 실시형태에서, 돌연변이되는 서열번호 9의 위치는 62, 64, 77, 95, 125, 127, 130, 132, 137, 142, 148, 154, 170, 173 및 193번 중 하나 이상을 포함한다. 당업자가 인식할 바와 같이, 이들 위치의 임의의 조합이 돌연변이될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 아이소형 3의 유사 위치가 돌연변이된다.
예시적인 실시형태에서, 모 폴리펩타이드의 아미노산은 K에서 E, N 및 R로부터 선택되는 구성원으로 변경된다. 예시적인 실시형태에서, 모 폴리펩타이드의 아미노산은 Q에서 R로 변경된다. 예시적인 실시형태에서, 모 폴리펩타이드의 아미노산은 I에서 T 및 V로부터 선택되는 구성원으로 변경된다. 예시적인 실시형태에서, 모 폴리펩타이드의 아미노산은 N에서 D로 변경된다. 일부 실시형태에서, D는 모 포리펩타이드의 N으로 복귀할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 42번 위치에서 아미노산은 F 또는 C이다. 다양한 실시형태에서, 62번 위치에서 아미노산은 야생형 모 폴리펩타이드에서 발견되는 K에서 E로 변화된다. 다양한 실시형태에서, 64번 위치는 V 또는 A이다. 다양한 실시형태에서, 77번 위치는 N 또는 S이다. 다양한 실시형태에서, 95번 위치에서 아미노산은 Q, 또는 R이다. 다양한 실시형태에서, 125번 위치에서 아미노산은 야생형 모 폴리펩타이드에서 발견되는 I에서 T로 변화된다. 다양한 실시형태에서, 127번 위치에서 아미노산은 D, N, K, R 또는 A일 수 있다. 다양한 실시형태에서, 130번 위치에서 아미노산은 I에서 V로 변화된다. 다양한 실시형태에서, 132번 위치에서 아미노산은 K에서 N 또는 R로 변화된다. 다양한 실시형태에서, 137번 위치에서 아미노산은 K 또는 R이다. 다양한 실시형태에서, 154번 위치의 아미노산은 S 또는 A이다. 다양한 실시형태에서, 170번 위치에서 아미노산은 K, 또는 E이다. 다양한 실시형태에서, 173번 위치에서 아미노산은 Q 또는 R이다. 다양한 실시형태에서, 193번 위치에서 아미노산은 N 또는 D이다. 다양한 실시형태에서, 42번 위치에서 아미노산은 F 또는 C이다. 다양한 실시형태에서, 96번 위치에서 아미노산은 C 또는 R이다. 당업자가 이해할 바와 같이, 이들 변화의 임의의 조합뿐만 아니라 하기 표에 제시된 것의 임의의 조합은 본 발명의 폴리펩타이드 변이체에 존재할 수 있다.
일부 실시형태에서, HGF 변이체는 야생형 HGF(서열번호 9)와 비교하여 K62E, N127D, K170E 및 N193E를 포함한다. 일부 실시형태에서, HGF 변이체는 야생형 HGF(서열번호 9)와 비교하여 K62E, Q95R, N127D, K132N, K170E, Q173R 및 N193E를 포함한다.
일부 실시형태에서, HGF 변이체는 야생형 HGF(서열번호 9)와 비교하여, 나열된 위치에서 하기와 같은 특정 아미노산을 가지는 컨센서스 서열을 포함한다: K62E, Q95R, I125T, N127D, I130V, K132N, K137R, K170E, Q173R 및 N193E.
표 1, 2 및 3은 본 발명의 예시적인 돌연변이를 나타낸다.
a.
접합체
본 발명은 하나 이상의 접합 파트너를 가지는 본 발명의 변이체의 접합체를 제공한다. 예시적인 접합 파트너는 중합체, 표적화제, 치료제, 세포독성제, 킬레이트제 및 검출 가능한 작용제를 포함한다. 당업자는 이들 비제한적인 작용제 카테고리 간에 중복이 있음을 인식할 것이다.
접합 파트너 또는 "변형기"는 임의의 접합가능한 모이어티일 수 있다. 예시적인 변형기는 하기에서 논의된다. 변형기는 주어진 폴리펩타이드의 특성(예를 들어, 생물학적 또는 물리화학적 특성)을 변형하는 능력에 대하여 선택될 수 있다. 변형기의 사용에 의해 변경될 수 있는 예시적인 폴리펩타이드 특성은 약동학, 약력학, 대사 안정성, 생체분포, 수용성, 친유성, 조직 표적화 능력 및 치료 활성 프로파일을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 변형기는 진단 응용 또는 시험관내 생물학적 분석 시스템에서 사용되는 폴리펩타이드의 변형에 유용하다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 FGF1 변이체를 포함하는 성장 인자 변이체는 Fc 모이어티와 조합된다. Fc-모이어티는 바람직하게는 IgG인 인간 또는 동물 면역글로불린(Ig)으로부터 유래될 수 있다. IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4일 수 있다(예를 들어, 도 34 참조). 또한 Fc-모이어티는 면역글로불린, 바람직하게는 IgG의 중쇄로부터 유래되는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는, Fc-모이어티는 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 일부, 예를 들어, 도메인을 포함한다. 이와 같은 Ig 불변 영역은 바람직하게는 힌지, CH2, CH3 도메인, 또는 이들의 임의의 조합 중 임의의 것으로부터 선택되는 적어도 하나의 Ig 불변 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc-모이어티는 적어도 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. Fc-모이어티는 IgG 힌지 영역, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것이 더 바람직하다.
IgG1이 임의의 혈청 단백질 중 가장 긴 혈청 반감기를 가지기 때문에, IgG1 하위부류의 Fc 도메인은 종종 Fc 모이어티로 사용된다. 긴 혈청 반감기는 동물 연구 및 잠재적인 인간 치료 용도에 바람직한 단백질 특징일 수 있다. 추가적으로, IgG1 하위부류는 항체 매개 이펙터 기능을 수행하는 가장 강력한 능력을 가진다.
융합 단백질에서 가장 유용할 수 있는 주된 이펙터 기능은 IgG1 항체가 항체 의존성 세포의 세포독성을 매개하는 능력이다. 다른 한편, 이는 주로 길항제로 기능하는 융합 단백질에 대해 바람직하지 않은 기능일 수 있다. IgG1 하위부류에서 항체 불변 영역-매개 활성에 중요한 몇 가지 특정 아미노산 잔기가 확인되었다. 따라서 이러한 특정 아미노산의 포함 또는 배제는 특정 면역글로불린 불변 영역-매개 활성의 포함 또는 배제를 가능하게 한다.
본 발명에 따르면, Fc-모이어티는 또한 이펙터 기능을 조절하기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, Fc-모이어티가 IgG1에서 유래된 경우, EU 인덱스 위치(Kabat et al., 1991)에 따라 하기 Fc 돌연변이가 도입될 수 있다: T250Q/M428L; M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F; E233P/L234V/L235A/A△236+A327G/A330S/P331S; E333A; K322A.
추가 Fc 돌연변이는, 예를 들어, 330, 331, 234 또는 235번 위치, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 EU 인덱스 위치에서의 치환일 수 있다. CH2 도메인에 위치한 EU 인덱스 위치 297번에서 아미노산 치환은 또한 본 발명의 맥락에서 Fc-모이어티에 도입되어 N-연결 탄수화물 부착의 잠재적인 부위를 제거할 수 있다. EU 인덱스 위치 220번에서 시스테인 잔기도 또한 대체될 수 있다.
본 발명의 Fc-융합 단백질은 단량체 또는 이량체일 수 있다. Fc-융합 단백질은 또한 이량체 Fc-모이어티(예를 들어, 2개의 이황화-가교 힌지-CH2-CH3 작제물의 이량체)를 포함하는 "허위-이량체(pseudo-dimer)"일 수 있으며, 이 중 하나만 치료용 모이어티에 융합된다.
Fc-융합 단백질은 2개의 상이한 치료용 모이어티를 포함하는 이종이량체, 또는 단일 치료용 모이어티의 2개 복제물을 포함하는 동종이량체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 FGF1 변이체를 포함하는 성장 인자 변이체의 생체내 반감기는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) 모이어티를 이용하여 향상될 수 있다. PEG를 이용한 폴리펩타이드의 화학적 변형(페길화(PEGylation))은 분자 크기를 증가시키고 전형적으로 표면- 및 기능성 기-접근 가능성을 감소시키며, 이들 각각은 폴리펩타이드에 부착된 PEG 모이어티의 수 및 크기에 따라 달라진다. 종종, 이러한 변형은 혈장 반감기 및 단백질분해-안정성 개선뿐만 아니라, 면역원성 및 간 흡수의 감소를 초래한다(Chaffee et al. J. Clin . Invest. 89: 1643-1651 (1992); Pyatak et al. Res. Commun . Chem . Pathol Pharmacol. 29: 113-127 (1980)). 예를 들어, 인터루킨-2의 페길화는 생체내에서 항종양 효능을 증가시키는 것으로 보고되었고(Katre et al. Proc . Natl . Acad . Sci. USA. 84: 1487-1491 (1987)) 단클론성 항체 A7로부터 유래된 F(ab')2의 페길화는 이의 종양 국재화를 개선시켰다(Kitamura et al. Biochem . Biophys . Res. Commun. 28: 1387-1394 (1990)). 따라서, 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 PEG 모이어티로 유도체화된 폴리펩타이드의 생체내 반감기는 비-유도체화 모 폴리펩타이드의 생체내 반감기에 비해 증가된다.
폴리펩타이드 생체내 반감기의 증가는 모 폴리펩타이드에 비한 증가율 범위로 가장 잘 표현된다. 증가율 범위의 하한은 약 40%, 약 60%, 약 80%, 약 100%, 약 150% 또는 약 200%이다. 범위의 상한은 약 60%, 약 80%, 약 100%, 약 150% 또는 약 250% 초과이다.
다수의 수용성 중합체가 당업자에게 알려져 있고, 본 발명을 실시하는 데 유용하다. 용어 수용성 중합체는, 당류(예를 들어, 덱스트란, 아밀로스, 히알루론산, 폴리(시알산), 헤파란, 헤파린 등); 폴리(아미노산), 예를 들어, 폴리(아스파르트산) 및 폴리(글루탐산); 핵산; 합성 중합체(예를 들어, 폴리(아크릴산), 폴리(에터), 예를 들어, 폴리(에틸렌 글라이콜)); 펩타이드, 단백질 등과 같은 종을 포함한다. 본 발명은 임의의 수용성 중합체로 실시될 수 있으며, 이때 유일한 제한은 중합체가 접합체의 나머지 부분이 부착될 수 있는 지점을 포함해야 한다는 것이다. 예를 들어, 문헌[Harris, Macronol . Chem . Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb . Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995); 및 Bhadra, et al., Pharmazie, 57:5-29 (2002)]을 참조한다.
상기 논의된 것과 유사한 또 다른 실시형태에서, 변형된 당은 수용성 중합체보다는 수불용성 중합체를 포함한다. 본 발명의 접합체는 또한 하나 이상의 수불용성 중합체를 포함할 수 있다. 이러한 본 발명의 실시형태는 제어된 방식으로 치료용 폴리펩타이드를 전달하는 비히클로서 접합체의 사용에 의해 설명된다. 중합체 약물 전달 시스템은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Dunn et al., Eds. Polymeric Drugs And Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991]을 참조한다. 당업자는 실질적으로 임의의 알려진 약물 전달 시스템이 본 발명의 접합체에 적용될 수 있음을 인식할 것이다.
대표적인 수불용성 중합체는 폴리포스파진, 폴리(비닐 알코올), 폴리아마이드, 폴리카보네이트, 폴리알킬렌, 폴리아크릴아마이드, 폴리알킬렌 글라이콜, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리알킬렌 테레프탈레이트, 폴리비닐 에터, 폴리비닐 에스터, 폴리비닐 할라이드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리글라이콜라이드, 폴리실록산, 폴리우레탄, 폴리(메틸 메트아크릴레이트), 폴리(에틸 메트아크릴레이트), 폴리(뷰틸 메트아크릴레이트), 폴리(아이소뷰틸 메트아크릴레이트), 폴리(헥실 메트아크릴레이트), 폴리(아이소데실 메트아크릴레이트), 폴리(라우릴 메트아크릴레이트), 폴리(페닐 메트아크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(아이소프로필 아크릴레이트), 폴리(아이소뷰틸 아크릴레이트), 폴리(옥타데실 아크릴레이트) 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(에틸렌 글라이콜), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리(비닐 아세테이트), 폴리비닐 클로라이드, 폴리스타이렌, 폴리비닐 피롤리돈, 플루로닉(pluronic) 및 폴리비닐페놀 및 이들의 공중합체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명의 접합체에서 사용되는 대표적인 생분해성 중합체는 폴리락타이드, 폴리글라이콜라이드 및 이들의 공중합체, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리(뷰티르산), 폴리(발레르산), 폴리(락타이드-코-카프로락톤), 폴리(락타이드-코-글라이콜라이드), 폴리안하이드라이드, 폴리오쏘에스터, 이들의 배합물 및 공중합체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특히 콜라겐, 플루로닉 등을 포함하는 것과 같이 겔을 형성하는 조성물이 사용된다.
예시적인 재흡수성 중합체는, 예를 들어, 합성적으로 생성된 폴리(α-하이드록시-카복실산)/폴리(옥시알킬렌)의 재흡수성 블록 공중합체를 포함한다(예를 들어, 콘(Cohn)외 다수의 미국 특허 제4,826,945호 참조). 이러한 공중합체는 가교결합되지 않고 수용성이므로 신체가 분해된 블록 공중합체 조성물을 배설할 수 있다. 문헌[Younes et al., J Biomed . Mater. Res. 21: 1301-1316 (1987); 및 Cohn et al., J Biomed . Mater. Res. 22: 993-1009 (1988)]을 참조한다.
하이드로겔의 구성성분인 중합체도 또한 본 발명에서 유용하다. 하이드로겔은 비교적 다량의 물을 흡수할 수 있는 중합체 물질이다. 하이드로겔 형성 화합물의 예는 폴리아크릴산, 소듐 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 젤라틴, 카라기난 및 기타 다당류, 하이드록시에틸렌메트아크릴산(HEMA)뿐만 아니라, 이들의 유도체 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 안정적이고 생분해성이며 생체흡수성인 하이드로겔을 생성할 수 있다. 더욱이, 하이드로겔 조성물은 이러한 특성 중 하나 이상을 나타내는 서브유닛을 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 겔은 열가역성 겔이다. 플루로닉, 콜라겐, 젤라틴, 히알루론산, 다당류, 폴리우레탄 하이드로겔, 폴리우레탄-우레아 하이드로겔 및 이들의 조합을 포함하는 열가역성 겔이 현재 바람직하다.
또 다른 예시적인 실시형태에서, 본 발명의 접합체는 리포좀의 구성성분을 포함한다. 리포좀은, 예를 들어, Eppstein 외 미국 특허 제4,522,811호(1985년 6월 11일 공고)에 기재된 바와 같은, 당업자에게 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 리포좀 제형은 이후에 증발되는 무기 용매 중에 적절한 지질(들)(예컨대, 스테아로일 포스파티딜 에탄올아민, 스테아로일 포스파티딜 콜린, 아라카도일 포스파티딜 콜린, 및 콜레스테롤)을 용해시키고, 용기의 표면 상에 건조된 지질 박막을 남김으로써 제조될 수 있다. 그 후 활성 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 수용액을 용기에 도입한다. 그 후 용기를 손으로 빙빙 돌려 용기 측면에서 지질 물질을 제거하고 지질 응집체를 분산시켜, 리포좀 현탁액을 형성한다.
본 발명은 또한 폴리펩타이드가 치료용 모이어티, 진단 모이어티, 표적화 모이어티, 독소 모이어티 등에 접합된 상기 기재된 것과 유사한 접합체를 제공한다. 상기 언급된 모이어티 각각은 소분자, 천연 중합체(예를 들어, 폴리펩타이드) 또는 합성 중합체일 수 있다.
다양한 실시형태에서, 변이체는 조직 재생을 위한 매트릭스의 구성성분에 접합된다. 예시적인 매트릭스는 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, FGF1 변이체를 포함하여 본 발명의 성장 인자 변이체의 적절한 매트릭스를 선택하고 이를 변형시키는 것은 당업자의 능력 내에 있다. 예를 들어, FGF1 변이체를 포함하여 본 발명의 성장 인자 변이체는 일반적으로 예를 들어, 눈, 간, 근육, 신경 및 심장 조직의 재생을 포함하여 재생 의학 응용에서 사용된다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 접합체의 구성성분으로서 표적화제의 존재로 인해 특정 조직에 선택적으로 국재화되는 접합체를 제공한다. 예시적인 실시형태에서, 표적화제는 단백질이다. 예시적인 단백질은 트랜스페린(뇌, 혈액 풀), HS-당단백질(뼈, 뇌, 혈액 풀), 항체(뇌, 항체-특이적 항원이 있는 조직, 혈액 풀), 응고 인자 V 내지 XII(손상된 조직, 혈전, 암, 혈액 풀), 혈청 단백질, 예를 들어, α-산 당단백질, 페투인, α-태아 단백질(뇌, 혈액 풀), β2-당단백질(간, 죽상경화증 플라크, 뇌, 혈액 풀), G-CSF, GM-CSF, M-CSF, 및 EPO(면역 자극, 암, 혈액 풀, 적혈구 과잉생산, 신경보호), 알부민(반감기 증가), IL-2 및 IFN-α를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 예를 들어, FGF1 변이체를 포함하여 본 발명의 성장 인자 변이체와 치료용 모이어티 사이의 접합체를 제공한다. 본 발명을 실시하는 데 유용한 치료용 모이어티는 다양한 약리학적 활성을 가지는 광범위한 약물 부류로부터의 약물을 포함한다. 치료제 및 진단제를 다양한 다른 종에 접합시키는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; 및 Dunn et al., Eds. Polymeric Drugs And Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991]을 참조한다.
유용한 치료용 모이어티의 부류는, 예를 들어, 항신생물 약물(예를 들어, 항안드로겐(예를 들어, 류프로라이드 또는 플루타마이드), 세포파괴제(예를 들어, 아드리아마이신, 독소루비신, 택솔, 사이클로포스파마이드, 부설판, 시스플라틴, β-2-인터페론), 항-에스트로겐(예를 들어, 타목시펜), 대사길항물질(예를 들어, 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 머캅토퓨린, 티오구아닌)을 포함한다. 또한 이 부류에는 진단 및 치료 둘 다를 위한 방사성 동위원소-기반 작용제, 및 접합된 독소, 예컨대, 라이신, 겔다나마이신, 미탄신, CC-1065, 듀오카마이신, 클리케아마이신 및 이들의 관련 구조체 및 유사체가 포함된다.
치료용 모이어티는 또한 호르몬(예를 들어, 메드록시프로게스테론, 에스트라다이올, 류프로라이드, 메게스트롤, 옥트레오타이드 또는 소마토스타틴); 내분비 조절 약물(예를 들어, 피임약(예를 들어, 에티노다이올, 에티닐 에스트라다이올, 노르에틴드론, 메스트라놀, 데소게스트렐, 메드록시프로게스테론)일 수 있다. 본 발명의 다양한 실시형태에서 에스트로겐(예를 들어, 다이에틸스틸베스테롤), 글루코코르티코이드(예를 들어, 트라이암시놀론, 베타메타손 등), 및 프로게스테론, 예컨대, 노르에틴드론, 에티노다이올, 노르에틴드론, 레보노르게스트렐; 갑상선제(예를 들어, 리오타이로닌 또는 레보티록신) 또는 항-갑상선제(예를 들어, 메티마졸); 항고프로락틴혈증 약물(예를 들어, 카베골린); 호르몬 억제제(예를 들어, 다나졸 또는 고세렐린), 자궁수축제(예를 들어, 메틸에르고노빈 또는 옥시토신) 및 프로스타글란딘, 예컨대, 미오프로스톨, 알프로스타딜 또는 디노프로스톤과의 접합체가 또한 이용될 수 있다.
다른 유용한 변형기는 면역조절 약물(예를 들어, 항히스타민, 비만세포 안정화제, 예컨대, 로독사마이드 및/또는 크로몰린), 스테로이드(예를 들어, 트리암시놀론, 베클로메타존, 코르티손, 덱사메타손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 베클로메타손, 또는 클로베타솔), 히스타민 H2 길항제(예를 들어, 파모티딘, 시메티딘, 라니티딘), 면역억제제(예를 들어, 아자티오프린, 사이클로스포린) 등을 포함한다. 항-염증 활성을 가지는 기, 예컨대, 설린닥, 에토돌락, 케토프로펜 및 케토롤락이 또한 사용된다. 본 발명과 함께 사용되는 다른 약물은 당업자에게 명백할 것이다.
일부 실시형태에서, 접합체는 반응성 아미노산과 반응성 아미노산에 대한 반응성 접합 파트너 사이의 반응에 의해 형성된다. 반응성 아미노산과 반응성 접합 파트너 둘 다 프레임워크 내에 하나 이상의 반응성 작용기를 포함한다. 2개의 결합 종 중 하나는 이들 모이어티를 지칭하는 "이탈기"(또는 활성화기)를 포함할 수 있으며, 이는 효소-조절 친핵성 치환 반응에서 용이하게 대체되거나 대안적으로 친핵성 반응 파트너(예를 들어, 서프하이드릴기를 가지는 아미노산 모이어티)를 이용하는 화학 반응에서 대체되는 모이어티를 지칭한다. 각각의 반응 유형에 적합한 이탈기를 선택하는 것은 당업자의 능력 내에 있다. 다수의 활성 당이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Vocadlo et al., In Carbohydrate Chemistry and Biology, Vol. 2, Ernst et al. Ed., Wiley-VCH Verlag: Weinheim, Germany, 2000; Kodama et al., Tetrahedron Lett. 34: 6419 (1993); Lougheed, et al., J. Biol . Chem . 274: 37717 (1999)]을 참조한다.
다양한 실시형태에서, 자연적으로 발생하는 FGF1의 변이체(또는 변이체)인 아미노산 치환은 접합 파트너, 예를 들어, 측쇄 아미노산, 예를 들어, 시스테인, 라이신, 세린 등의 부착을 위한 유전자좌이다.
본 발명을 실시하는 데 유용한 반응성기 및 반응 부류는 일반적으로 생체접합체 화학 분야에서 잘 알려져 있는 것이다. 반응성 당 모이어티로 이용 가능한 현재 선호되는 반응 부류는 비교적 온화한 조건 하에서 진행되는 반응이다. 이는 친핵성 치환(예를 들어, 아민 및 알코올과 아실 할라이드, 활성 에스터와의 반응), 친전자성 치환(예를 들어, 엔아민 반응) 및 탄소-탄소 및 탄소-헤테로원자 다중 결합에 대한 첨가(예를 들어, 마이클(Michael) 반응, 디엘스-앨더(Diels-Alder) 첨가)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이들 및 다른 유용한 반응은, 예를 들어, 문헌[March, Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, 1985; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; 및 Feeney et al., Modification of Proteins; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982]에서 논의된다.
b.
반응성 작용기
반응성 아미노산 또는 반응성 접합 파트너 상의 유용한 반응성 작용기는 다음을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다:
(a) N-하이드록시석신이미드 에스터, N-하이드록시벤즈트라이아졸 에스터, 산 할라이드, 아실 이미다졸, 티오에스터, p-나이트로페닐 에스터, 알킬, 알켄일, 알킨일 및 방향족 에스터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 카복실기 및 이의 다양한 유도체;
(b) 예를 들어, 에스터, 에터, 알데하이드 등으로 전환될 수 있는 하이드록실기;
(c) 할로알킬기, 여기서 할라이드는 이후에, 예를 들어, 아민, 카복실레이트 음이온, 티올 음이온, 카보음이옴(carbanion), 또는 알콕사이드 이온과 같은 친핵성기로 대체되어, 할로겐 원자의 작용기에서 새로운 기의 공유 부착을 초래할 수 있음;
(d) 예를 들어, 말레이미도기와 같은 디엘스-앨더 반응에 참여할 수 있는 친다이엔기;
(e) 예를 들어, 이민, 하이드로존, 세미카바존 또는 옥심과 같은 카보닐 유도체의 형성을 통해, 또는 그리냐르(Grignard) 첨가 또는 알킬리튬 첨가와 같은 메커니즘을 통해 후속 유도체화가 가능하도록 하는 알데하이드 또는 케톤기;
(f) 예를 들어, 설폰아마이드를 형성하기 위해 아민과의 후속 반응을 위한 설폰일 할라이드기;
(g) 예를 들어, 다이설파이드로 전환되거나 아실 할라이드와 반응할 수 있는 티올기;
(h) 예를 들어, 아실화, 알킬화 또는 산화될 수 있는 아민 또는 설프하이드릴기;
(i) 예를 들어, 고리화첨가, 아실화, 마이클 첨가 등을 겪을 수 있는 알켄; 및
(j) 예를 들어, 아민 및 하이드록실 화합물과 반응할 수 있는 에폭사이드.
반응성 작용기는 이들이 반응성 당 핵 또는 변형기를 조립하는 데 필요한 반응에 방해하거나 참여하지 않도록 선택될 수 있다. 대안적으로, 반응성 작용기는 보호기의 존재에 의해 반응에 참여하지 못하도록 보호될 수 있다. 당업자는 특정작용기가 선택된 일련의 반응 조건을 방해하지 않도록 특정 작용기를 보호하는 방법을 이해한다. 유용한 보호기의 예에 있어서, 예를 들어, 문헌[Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991]을 참조한다.
폴리펩타이드와 접합 파트너를 연결하는 기는 또한 가교결합기, 예를 들어, 0차 또는 고차 가교결합기일 수 있다(가교결합 시약 및 가교결합 절차의 검토에 대해서는 문헌[Wold, F., Meth . Enzymol . 25: 623-651, 1972; Weetall, H. H., and Cooney, D. A., In: Enzymes as Drugs. (Holcenberg, and Roberts, eds.) pp. 395-442, Wiley, New York, 1981; Ji, T. H., Meth . Enzymol . 91: 580-609, 1983; Mattson et al., Mol . Biol . Rep. 17: 167-183, 1993]을 참조하며, 이들 모두 본 명세서에 참조에 의해 포함됨). 바람직한 가교결합 시약은 다양한 길이가 0인 동종이작용성 및 이종이작용성 가교결합 시약으로부터 유래된다. 길이가 0인 가교결합 시약은 외인성 물질의 도입 없이 2개의 내인성 화학기의 직접 접합을 포함한다. 이황화 결합의 형성에 촉매 작용을 미치는 작용제는 이 카테고리에 속한다. 또 다른 예는 카복실 및 1차 아미노기의 축합을 유도하여 아마이드 결합, 예컨대, 카보디이미드, 에틸클로로폼에이트, 우드워드 시약(Woodward's reagent) K(2-에틸-5-페닐아이소옥사졸리늄-3'-설폰에이트), 및 카보닐다이이미다졸을 형성하는 시약이다. 이러한 화학 시약에 추가적으로, 효소 트랜스글루타미나제(글루타밀-펩타이드 γ-글루타밀트랜스퍼라제; EC 2.3.2.13)가 길이가 0인 가교결합 시약으로서 사용될 수 있다. 이 효소는 보통 기질로서 1차 아미노기를 이용하여, 단백질-결합 글루타미닐 잔기의 카복스아마이드기에서의 아실 전달 반응에 촉매 작용을 미친다. 바람직한 동종- 및 이종-이작용성 시약은 2개의 동일한 또는 2개의 상이한 부위를 포함하며, 이들은 각각 아미노, 설프하이드릴, 구아니디노, 인돌, 또는 비특이적기에 대해 반응성일 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드에 부착된 예시적인 접합 파트너는 PEG 유도체(예를 들어, 알킬-PEG, 아실-PEG, 아실-알킬-PEG, 알킬-아실-PEG 카바모일-PEG, 아릴-PEG), PPG 유도체(예를 들어, 알킬-PPG, 아실-PPG, 아실-알킬-PPG, 알킬-아실-PPG 카바모일-PPG, 아릴-PPG), 치료용 모이어티, 진단 모이어티, 만노스-6-포스페이트, 헤파린, 헤파란, Slex, 만노스, 만노스-6-포스페이트, 시알릴 루이스 X, FGF, VFGF, 단백질, 콘드로이틴, 케라탄, 더마탄, 알부민, 인테그린, 안테나 올리고당, 펩타이드 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
공유 부착에 추가적으로, 예를 들어, FGF1 변이체를 포함하여 본 발명의 성장 인자 변이체는 비-공유 상호작용을 통해 생체재료의 표면에 부착될 수 있다. 비공유 단백질 혼입은, 예를 들어, 캡슐화 또는 흡수를 통해 수행될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드의 생체물질에의 부착은 헤파린을 통해 매개될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 헤파린-알지네이트 중합체 및 문헌[Harada et al., J. Clin. Invest. (1994) 94:623-630; Laham et al., Circulation (1999) 1865-1871] 및 여기에 인용된 참고문헌에 기재된 바와 같은 알지네이트에 부착된다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 콜라겐 기반 생체물질에 부착된다.
c.
영상화제
본 발명의 예시적인 접합체는 본 발명의 변이체 및 영상화 양식에서 검출 가능한, 검출 가능한 모이어티를 포함하는 영상화제이다. 살아있는 대상체에서 Met 수용체를 특이적으로 표적화하고 환자-특이적 암 치료 및 질환 관리를 위한 종양의 비침습적 특성화를 가능하게 할 분자 이미징 프로브에 대한 중요한 요구가 있다. 또한 비-침습적 영상화를 통해 Met-발현 종양을 검출하는 능력은 전이 위험의 지표로도 사용할 수 있다.
본 발명의 접합체가 사용되는 예시적인 영상화 양식은 본 발명의 변이체가 양전자 방출 동위원소로 태깅된 양전자 방출 단층촬영술(PET)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 전형적인 동위원소는 11C, 13N, 15O, 18F, 64Cu, 62Cu, 124I, 76Br, 82Rb 및 68Ga를 포함하며, 18F가 임상적으로 가장 많이 이용된다. 변이체는 또한 초음파 작용제, 자기 공명 영상화제, X-선 작용제, CT 작용제, 감마 카메라 신티그래피 작용제 및 형광 영상화제에 통합될 수 있다. 추가적인 검출 가능한 모이어티 및 영상화 방법은 하기 방법 섹션에 제시되어 있다.
예시적인 실시형태에서, 접합 파트너는 선택된 조건 하에서 절단되는 연결을 통해 본 발명의 폴리펩타이드 변이체에 부착된다. 예시적인 조건은 선택된 pH(예를 들어, 위, 장, 세포내도입 액포), 활성 효소(예를 들어, 에스테라제, 환원효소, 산화효소)의 존재, 빛, 열 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다수의 절단가능한 기가 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Jung et al., Biochem . Biophys . Acta, 761: 152-162 (1983); Joshi et al., J. Biol . Chem ., 265: 14518-14525 (1990); Zarling et al., J. Immunol., 124: 913-920 (1980); Bouizar et al., Eur. J. Biochem ., 155: 141-147 (1986); Park et al., J. Biol . Chem., 261: 205-210 (1986); Browning et al., J. Immunol., 143: 1859-1867 (1989)]을 참조한다.
IV.
약제학적 조성물
예를 들어, FGF1 변이체를 포함하는 성장 인자 변이체, 및 본 발명의 이들의 접합체는 광범위한 약제학적 응용을 가진다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 접합체 및 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 담체, 비히클, 첨가제 또는 이들의 조합을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 다양한 약물 전달 시스템에서 사용하기에 적합하다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 제형은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)]에서 확인된다. 약물 전달 방법에 대한 간략한 검토에 대해서는, 문헌[Langer, Science 249:1527-1533 (1990)]을 참조한다.
약제학적 조성물은, 예를 들어, 국소, 경구, 비강, 정맥내, 두개내, 복강내, 피하 또는 근육내 투여를 포함하는 임의의 적절한 투여 방식을 위해 제형화될 수 있다. 피하 주사와 같은 비경구 투여의 경우, 담체는 바람직하게는 물, 식염수, 알코올, 지방, 왁스 또는 완충액을 포함한다. 경구 투여의 경우, 상기 담체 또는 고체 담체, 예컨대, 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 활석, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스, 및 마그네슘 카보네이트 중 임의의 것이 이용될 수 있다. 마이크로스피어(예를 들어, 폴리락테이트 폴리글라이콜레이트)와 같은 생분해성 매트릭스가 또한 본 발명의 약제학적 조성물을 위한 담체로 이용될 수 있다. 적합한 생분해성 마이크로스피어는, 예를 들어, 미국 특허 제4,897,268호 및 제5,075,109호에 개시되어 있다.
일반적으로, 약제학적 조성물은 피하 또는 비경구, 예를 들어, 정맥내로 투여된다. 따라서, 본 발명은 비경구 투여용 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 허용 가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체, 예를 들어, 물, 완충수, 식염수, PBS 등에 용해되거나 현탁된 화합물을 포함한다. 조성물은 또한 세제, 예컨대, 트윈(Tween) 20 및 트윈 80; 안정화제, 예컨대, 만니톨, 솔비톨, 수크로스, 및 트레할로스; 및 방부제, 예컨대, EDTA 및 메타-크레졸을 포함할 수 있다. 조성물은 생리학적 조건과 비슷하게 하는 데 필요한 약제학적으로 허용 가능한 보조 물질, 예컨대, pH 조정제 및 완충제, 긴장성 조절제, 습윤제, 세제 등을 포함할 수 있다.
이들 조성물은 통상적인 멸균 기법에 의해 멸균될 수 있거나, 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액은 그대로 사용하기 위해 포장될 수 있거나, 동결건조될 수 있으며, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 수성 담체와 합하여진다. 제제의 pH는 전형적으로 3 내지 11, 더 바람직하게는 5 내지 9, 가장 바람직하게는 7 내지 8일 것이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 글라이코펩타이드는 표준 소포-형성 지질로부터 형성된 리포좀에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980)], 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호 및 제4,837,028호에 기재된 바와 같이 다양한 방법이 리포좀을 제조하는 데 이용 가능하다. 다양한 표적화제(예를 들어, 본 발명의 시알릴 갈락토사이드)를 사용한 리포좀의 표적화는 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,957,773호 및 제4,603,044호 참조).
표적화제를 리포좀에 커플링시키기 위한 표준 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로, 표적화제, 또는 유도체화된 친유성 화합물, 예컨대, 본 발명의 지질-유도체화 글라이코펩타이드의 부착을 위해 활성화될 수 있는 지질 구성성분, 예컨대, 포스파티딜에탄올아민의 리포좀에의 혼입을 포함한다.
표적화 메커니즘은 일반적으로 표적 모이어티가 표적, 예를 들어, 세포 표면 수용체와의 상호작용을 위해 이용 가능한 방식으로 리포좀의 표면 상에 위치할 것을 요구한다. 본 발명의 탄수화물은 리포좀이 당업자에게 알려진 방법(예를 들어, 장쇄 알킬 할라이드 또는 지방산을 각각 이용하여 탄수화물에 존재하는 하이드록실기의 알킬화 또는 아실화)을 사용하여 형성되기 전에 지질 분자에 부착될 수 있다.
대안적으로, 리포좀은 막을 형성할 때 커넥터 부분이 먼저 막에 통합되는 방식으로 제작될 수 있다. 커넥터 부분은 막에 단단히 포매되고 고정되는 친유성 부분을 가져야 한다. 이는 또한 리포좀의 수성 표면에서 화학적으로 이용 가능한 반응성 부분을 가져야 한다. 반응성 부분은 이후에 첨가되는 표적화제 또는 탄수화물과 안정적인 화학적 결합을 형성하기에 화학적으로 적합하도록 선택된다. 일부 실시형태에서, 표적화제를 커넥터 분자에 직접 부착하는 것이 가능하지만, 대부분의 경우 화학적 가교 역할을 하는 제3 분자를 사용하는 것이 더 적합하며, 따라서 막에 있는 커넥터 분자를 소포 표면에서 3차원적으로 확장되는 표적화제 또는 탄수화물과 연결시킨다.
예를 들어, FGF1 변이체를 포함하여 본 발명의 방법에 의해 제조되는 성장 인자 변이체는 진단 시약으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 표지화된 화합물은 염증이 있는 것으로 의심되는 환자에서 염증 또는 종양 전이 영역을 찾아내는 데 사용될 수 있다. 이러한 용도를 위해, 화합물은 125I, 14C, 또는 삼중수소로 표지화될 수 있다.
V.
핵산
일부 실시형태에서, 본 발명은 예를 들어, FGF1 변이체를 포함하여 상기 제시된 임의의 실시형태에 따른 성장 인자 변이체를 인코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 이러한 핵산에 상보적인 핵산을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 프로모터에 작동 가능하게 연결된 상기 제시된 임의의 실시형태에 따른 폴리펩타이드 변이체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
VI.
라이브러리 및 스크리닝 방법
또한 다양한 실시형태에서, 예를 들어, FGF1 변이 폴리펩타이드를 포함하여, 복수의 상이한 구성원을 포함하는 성장 인자 변이 폴리펩타이드의 라이브러리가 제공되며, 여기서 라이브러리의 각각의 구성원은 공통 모 성장 인자 폴리펩타이드 또는 FGF1 모 폴리펩타이드에 해당하고, 라이브러리의 각각의 구성원은 해당 아미노산이 모 폴리펩타이드에서 발견되지 않는 위치의 아미노산을 포함한다.
a.
라이브러리 생성
FGF1 또는 다른 성장 인자의 무작위화 라이브러리를 생성하기 위해, 다양한 FGF1 또는 다른 성장 인자 서열을 코딩하는 올리고뉴클레오타이드를 제조하였다. 예를 들어, 효모에서 FGF1 변이 폴리펩타이드를 포함하여 성장 인자 변이 폴리펩타이드를 발현시키는 데 사용되는 DNA를 합성으로 또는 표준 재조합 기법에 의해 제조하였다. 아미노산이 변해야 하는 경우, 각각 상이한 아미노산을 코딩하는 20가지의 상이한 코돈을 주어진 위치에 대해 합성하였다. 무작위화 올리고뉴클레오타이드 합성을 사용하여 약 5 내지 약 15개 아미노산이 무작위화되는 코딩 카세트를 생성하였다(예를 들어, 문헌[Burritt et al., (1996) Anal. Biochem. 238:1 13; Lowman (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:410 24; Wilson (1998) Can. J. Microbiol. 44:313 329] 참조).
개선된 돌연변이체의 진화에 전형적으로 사용되는 효모 디스플레이 벡터는 "pCT"라고 불린다. 벡터는 2004년 7월 29일에 공개되고 명칭이 "단백질의 효모 세포 효면 디스플레이 및 이의 용도(Yeast cell surface display of proteins and uses thereof)"인 US 2004/0146976(Wittrup 외)에 추가로 기재되어 있다. 상기 출원에 기재된 바와 같이, 벡터는 효모 Aga2p 세포벽 단백질의 C-말단에 관심 폴리펩타이드의 N 말단의 유전자 융합체를 제공한다. 각각의 효모 세포의 외벽은 대략 104 내지 105개 단백질 응집소를 디스플레이할 수 있다. 벡터는 특정 제한 부위를 포함하고 갈락토스, N-말단 HA 및 C-말단 c-myc 에피토프 태그 및 인자 Xa 프로테아제 절단 부위에 의한 전사 조절을 설명한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 고친화성 결합제를 조작하는 데 일반적으로 사용되는 효모 디스플레이 플랫폼은 또한 더 큰 단백질분해 안정성을 가지는 단백질을 조작하는 데 이용된다(예를 들어, 도 1 참조). 일부 실시형태에서, 단일 성장 인자 변이체의 수천개의 복제물이 테더링된 융합체로서 효모의 표면에 디스플레이된다. 일부 실시형태에서, 혈구응집소(HA) 태그는 성장 인자의 상류에서 발현되는 한편, c-myc 태그는 성장 인자의 하류에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 세포는 효모 디스플레이 성장 인자에 결합할 수 있는 상응하는 수용체의 가용성 Fc 융합체와 함께 인큐베이션될 수 있다.
일부 실시형태에서, 효모 디스플레이 플랫폼은 유동-활성화 세포 분류(FACS)와 조합되어 더 높은 단백질분해 안정성을 가지는 성장 인자를 조작한다(예를 들어, 도 2 참조). 일부 실시형태에서, 성장 인자 돌연변이체의 라이브러리는 무작위 돌연변이유발, 유도 돌연변이유발, 또는 DNA 셔플링, 또는 상기 논의되거나 당업계에 알려진 다른 재조합 기법에 의해 생성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 효모 세포의 라이브러리는 효모 표면 디스플레이 단백질의 절단이 일어나는 동안 관심 프로테아제와 함께 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, 단백질분해 안정성이 더 큰 성장 인자 돌연변이체는 효모 세포 표면에서의 절단에 대해 더 내성이 있다. 일부 실시형태에서, 프로테아제 인큐베이션 후, 세포는 세척되고 수용체 결합 친화성이 유지된 적절하게 접힌 성장 인자 돌연변이체에 결합하는 기능성 수용체의 가용성 Fc 융합체와 함께 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, FACS는 적절하게 접히고, 절단되지 않은 성장 인자 돌연변이체를 분류하는 데 사용되며, 이는 다음 분류 라운드를 위해 확장되고 유도된다.
일부 실시형태에서, Fc 도메인, c-myc 도메인, 및 HA 태그에 대한 형광 항체 마커가 수용체 결합, 성장 인자-특이적 절단, 및 비-특이적 절단을 측정하는 데 사용된다(예를 들어, 하기 표 2 참조). 일부 실시형태에서, 결합된 Fc-융합 수용체의 검출은 성장 인자의 돌연변이가 수용체에 대한 결합 친화성을 심각하게 감소시키지 않거나 부적절한 단백질 접힘을 야기하지 않음을 확인할 수 있게 한다. 일부 실시형태에서, 성장 인자-특이적 절단은 성장 인자의 단백질분해 안정성의 직접적인 척도이다. 일부 실시형태에서, 절단된 성장 인자는 C-말단 c-myc 태그가 제거될 것이므로, 성장 인자-특이적 절단은 c-myc 신호에 의해 검출된다. 일부 실시형태에서, 효모 표면 디스플레이 단백질, 예를 들어, 효모 디스플레이 단백질 Aga1p 및 Aga2p 내에서 프로테아제가 절단할 때 비-특이적 절단이 일어난다. 일부 실시형태에서, 비-특이적 절단 동안, 3가지 모든 마커에 대한 형광 신호가 감소된다. 일부 실시형태에서, 이는 성장 인자 절단 및 결합 활성을 검출하기 위한 동적 범위가 감소하기 때문에 바람직하지 않다. 일부 실시형태에서, HA 신호는 관심 프로테아제에 의한 비-특이적 절단이 최소임을 보장하는 데 사용된다.
일부 실시형태에서, 야생형 성장 인자 및 이의 변이체는 pCT 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 일부 실시형태에서, 야생형 성장 인자 및 이의 변이체는 Aga2p 교배 단백질에 대한 융합체로서 에스. 세레비시에(S. cerevisiae) 효모 세포의 표면에서 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 효모 세포 표면에서 야생형 성장 인자 및 이의 변이체의 성공적인 발현은 단백질의 C-말단 상의 c-myc 태그의 검출에 의해 확인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 효모-디스플레이 야생형 성장 인자 및 이의 변이체의 적절한 접힘은 야생형 성장 인자-Fc에 대한 특이적 결합 활성을 측정함으로써 확인될 수 있다.
일부 실시형태에서, 서열번호 1의 FGF1 폴리펩타이드는 단백질분해 안정성 스크린의 설정을 입증하기 위한 모델로서 이용되었다. 일부 실시형태에서, 야생형 FGF1은 pCT 벡터 내로 클로닝되었다. 일부 실시형태에서, 이러한 FGF1 폴리펩타이드 및 이의 FGF1 변이체는 Aga2p 교배 단백질에 대한 융합체로서 에스. 세레비시에 효모 세포의 표면에서 발현될 수 있다(예를 들어, 도 3A 참조). 일부 실시형태에서, 효모 세포 표면에서 FGF1의 성공적인 발현은 단백질의 C-말단 상의 c-myc 태그의 검출에 의해 확인될 수 있다(예를 들어, 도 3B 참조). 일부 실시형태에서, 효모-디스플레이 FGF의 적절한 접힘은 FGFR1-Fc에 대한 특이적 결합 활성을 측정함으로써 확인될 수 있다(예를 들어, 도 3C 참조).
일부 실시형태에서, 혈청, 트립신, 키모트립신, 및 플라스민은, 예를 들어, FGF1 변이 폴리펩타이드를 포함하여 성장 인자 변이 폴리펩타이드에 대한 단백질분해 안정성 스크린을 개발하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들 프로테아제는, 예를 들어, FGF1 변이 폴리펩타이드를 포함하여 성장 인자 변이 폴리펩타이드에 대한 과학적 및 생물학적 관련성을 기반으로 선택되었다. 일부 실시형태에서, 스크린에 대한 프로테아제의 적합성은 효모 디스플레이 단백질의 비-특이적 절단을 최소화하면서 합리적인 속도로 성장 인자를 절단하는 능력에 의해 결정되었다. 일부 실시형태에서, 혈청은, 예를 들어, FGF1 변이 폴리펩타이드를 포함하여 성장 인자 변이 폴리펩타이드에 대한 단백질분해 안정성 스크린을 개발하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 트립신은, 예를 들어, FGF1 변이 폴리펩타이드를 포함하여 성장 인자 변이 폴리펩타이드에 대한 단백질분해 안정성 스크린을 개발하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 키모트립신은, 예를 들어, FGF1 변이 폴리펩타이드를 포함하여 성장 인자 변이 폴리펩타이드에 대한 단백질분해 안정성 스크린을 개발하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 플라스민은, 예를 들어, FGF1 변이 폴리펩타이드를 포함하여 성장 인자 변이 폴리펩타이드에 대한 단백질분해 안정성 스크린을 개발하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 안정성은 야생형 성장 인자의 단백질분해 절단을 변이체 성장 인자의 단백질분해 절단과 비교함으로써 결정된다. 일부 실시형태에서, 안정성은 야생형 FGF1의 단백질분해 절단을 FGF1 변이체의 단백질분해 절단과 비교함으로써 결정된다.
일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 5% 내지 적어도 95%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 10% 내지 적어도 90%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 5% 내지 적어도 90%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 5% 내지 적어도 85%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 5% 내지 적어도 80%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 5% 내지 적어도 75%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 5% 내지 적어도 70%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 10% 내지 적어도 70%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 5%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 10%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 15%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 20%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 25%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 30%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 35%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 40%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 45%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 50%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 5%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 60%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 65%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 70%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 75%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 80%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 85%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 90%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 95%만큼 증가된다.
일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 5% 내지 적어도 95%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 10% 내지 적어도 90%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 5% 내지 적어도 90%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 5% 내지 적어도 85%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 5% 내지 적어도 80%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 5% 내지 적어도 75%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 5% 내지 적어도 70%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 10% 내지 적어도 70%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 5%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 10%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 15%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 20%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 25%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 30%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 35%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 40%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 45%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 50%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 5%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 60%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 65%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 70%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 75%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 80%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 85%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 90%만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 95%만큼 증가된다.
일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 1배 내지 적어도 10배만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 1배만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 2배만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 3배만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 4배만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 5배만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 6배만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 7배만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 8배만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 9배만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체의 안정성은 야생형 성장 인자와 비교하여 적어도 10배만큼 증가된다.
일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 1배 내지 적어도 10배만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 1배만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 2배만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 3배만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 4배만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 5배만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 6배만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 7배만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 8배만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 9배만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체의 안정성은 야생형 FGF1과 비교하여 적어도 10배만큼 증가된다.
b.
형광 세포 분류
일부 실시형태에서, 스크리닝은 세포 분류기의 사용을 포함할 수 있다. 상업적으로 입수 가능한 유세포분석기는 초당 대략 50,000개 세포의 속도로 4개 이상의 파장에서 단일-세포 수준에서 형광 방출을 측정할 수 있다(Ashcroft and Lopez, 2000). 단백질 발현 수준과 결합된 가용성 리간드(예를 들어, 성장 인자 수용체)를 측정하기 위해 효모가 2가지의 상이한 색상 형광 프로브로 표지화된 전형적인 유세포분석 데이터가 나타내어질 수 있다. 세포의 "대각선" 집단은 1개 세포를 기반으로 단백질 발현 수중에서의 변이로 인해 초래되며: 더 많은 단백질을 발현하는 세포는 더 많은 리간드에 결합할 것이다. 평형 결합 상수(KD)는 가용성 리간드의 적정에 의해 결정될 수 있고, 해리 속도 상수(koff)는 표지화되지 않은 리간드의 경쟁 결합을 통해 측정될 수 있다. 효모의 경우, 테더링된 단백질의 단분산성이 세포 표면에 걸쳐 존재하고, 가용성 리간드가 결합 및 테스트에 사용되므로, 고정 리간드를 사용하는 다른 디스플레이 방법과 달리 결합 효과가 관찰되지 않는다. 현재까지, 효소 세포 표면에서 발현되는 대부분의 단백질의 특성은 안정성 및 결합 친화성의 측면에서 용액에서 보이는 것과 흡사하다(Bader et al., 2000; Feldhaus et al., 2003; Holler et al., 2000; VanAntwerp and Wittrup, 2000). 또한, 문헌[Weaver-Feldhaus et al., "Directed evolution for the development of conformation-specific affinity reagents using yeast display," Protein Engineering Design and Selection Sep. 26, 2005 18(11):527-536]을 참조한다.
세포 분류는 FACS Vantage(BD Biosciences) 다중 매개변수 레이저 유세포분석기 및 세포 분류기에서 수행될 수 있다. 분류하기 전에, 상기 기재된 바와 같이 형광 염색을 수행하여, 상기 기재된 바와 같이 다양한 폴리펩타이드 수준의 분석을 검출하였다.
VII.
방법
a.
화학적 합성
본 발명의 폴리펩타이드 변이체는 통상적인 단계적 용액 또는 고체상 합성을 사용하여 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., 1997, CRC Press, Boca Raton Florida], 및 여기에 인용된 참고문헌; [Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Atherton & Sheppard, Eds., 1989, IRL Press, Oxford, England], 및 여기에 인용된 참고문헌 참조).
대안적으로, 본 발명의 펩타이드는, 예를 들어, 문헌[Liu et al., 1996, Tetrahedron Lett. 37(7)933 936; Baca, et al., 1995, J. Am. Chem. Soc. 117:1881-1887; Tam et al., 1995, Int. J. Peptide Protein Res. 45:209-216; 
and Kent, 1992, Science 256:221-225; Liu and Tam, 1994, J. Am. Chem. Soc. 116(10):4149-4153; Liu and Tam, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6584-6588; Yamashiro and Li, 1988, Int. J. Peptide Protein Res. 31:322-334]에 기재된 바와 같은 분절 축합 방법에 의해 제조될 수 있다. 분절 축합은 내부 글리신 잔기를 포함하는 실시형태를 합성하는 데 특히 유용한 방법이다. 본 발명의 펩타이드를 합성하는 데 유용한 다른 방법은 문헌[Nakagawa et al., 1985, J. Am. Chem. Soc. 107 : 7087-7092]에 기재되어 있다.
N- 및/또는 C-말단 차단기를 포함하는 폴리펩타이드 변이체는 유기 화학의 표준 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드의 N-말단을 아실화하거나 펩타이드의 C-말단을 아마이드화 또는 에스터화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 말단 차단기를 부착하는 데 필요할 수 있는 임의의 측쇄 작용기를 보호하는 방식과 같이, N- 및/또는 C-말단에서 다른 변형을 전달하는 방식은 당업자에게 명백할 것이다. 약제학적으로 허용 가능한 염(반대 이온)은 이온-교환 크로마토그래피 또는 당업계에 잘 알려진 다른 방법에 의해 통상적으로 제조될 수 있다.
탠덤 다량체의 형태인 본 발명의 화합물은 합성의 적절한 단계에서 링커(들)를 펩타이드 사슬에 첨가함으로써 편리하게 합성될 수 있다. 대안적으로, 나선 분절이 합성될 수 있고 각각의 분절은 링커와 반응할 수 있다. 물론, 실제 합성 방법은 링커의 구성에 따라 달라질 것이다. 적합한 보호 체계 및 화학은 잘 알려져 있으며, 당업자에게 명백할 것이다.
분지형 네트워크의 형태인 본 발명의 화합물은 문헌[Tam, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5409-5413 및 Demoor et al., 1996, Eur. J. Biochem. 239:74-84]에 기재된 삼량체 및 사량체 수지 및 화학을 사용하여 편리하게 합성될 수 있다. 합성 수지 및 전략을 변형하여 고차 또는 저차의 분지형 네트워크를 합성하거나, 상이한 코어 펩타이드 나선 분절의 조합을 포함하는 것은 펩타이드 화학 및/또는 유기 화학 분야의 당업자의 능력 내에 있다. 원하는 경우 이황화 연결의 형성은 일반적으로 온화한 산화제의 존재 하에 수행된다.
화학적 산화제를 사용할 수 있거나, 화합물을 단순히 대기 산소에 노출시켜 이러한 연결을 이행할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Tam et al., 1979, Synthesis 955-957; Stewart et al., 1984, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d Ed., Pierce Chemical Company Rockford, IL; Ahmed et al., 1975, J. Biol. Chem. 250:8477-8482; 및 Pennington et al., 1991 Peptides 1990 164-166, Giralt and Andreu, Eds., ESCOM Leiden, The Netherlands]에 기재된 것을 포함하여 다양한 방법이 당업계에 알려져 있다. 추가적인 대안은 문헌[Kamber et al., 1980, Helv. Chim. Acta 63:899-915]에 기재되어 있다. 고체 지지체 상에서 수행되는 방법은 문헌[Albericio, 1985, Int. J. Peptide Protein Res. 26:92-97]에 기재되어 있다. 이들 방법 중 임의의 것이 본 발명의 펩타이드에서 이황화 연결을 형성하는 데 사용될 수 있다.
VIII.
폴리펩타이드 코딩 서열의 획득
a.
일반적인 재조합 기술
본 발명의 O-연결 글리코실화 서열을 포함하는 변이체 및/또는 돌연변이 폴리펩타이드의 형성은 상응하는 모 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변경함으로써, 폴리펩타이드의 돌연변이 또는 완전한 화학적 합성에 의해 달성될 수 있다. 폴리펩타이드 아미노산 서열은 바람직하게는 DNA 수준에서의 변화를 통해, 특히 원하는 아미노산으로 번역될 코돈을 생성하기 위해 미리 선택된 염기에서 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA 서열을 돌연변이시킴으로써 변경된다. DNA 돌연변이(들)는 바람직하게는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 이루어진다.
본 발명은 재조합 유전학 분야의 일상적인 기법에 의존한다. 본 발명에서 일반적인 사용 방법을 개시하는 기본 텍스트는 문헌[Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); 및 Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology (1994)]을 포함한다.
핵산 크기는 킬로베이스(kb) 또는 염기쌍(bp)로 제공된다. 이는 아가로스 또는 아크릴아마이드 겔 전기영동으로부터, 서열결정된 핵산으로부터, 또는 공개된 DNA 서열로부터 유래된 추정치이다. 단백질의 경우, 크기는 킬로달톤(kDa) 또는 아미노산 잔기 수로 제공된다. 단백질 크기는 겔 전기영동으로부터, 서열결정된 단백질로부터, 유래된 아미노산 서열로부터, 또는 공개된 단백질 서열로부터 추정된다.
상업적으로 입수할 수 없는 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어, 문헌[Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Lett . 22: 1859-1862 (1981)]에 처음 기재된 고체상 포스포아미다이트 트라이에스터 방법에 따라, 문헌[Van Devanter et. al., Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168 (1984)]에 기재된 바와 같은 자동화 합성기를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 전체 유전자는 또한 화학적으로 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드의 정제는 임의의 업계에서 인정된 전략, 예를 들어, 문헌[Pearson & Reanier, J. Chrom. 255: 137-149 (1983)]에 기재된 바와 같이 천연 아크릴아마이드 겔 전기영동 또는 음이온-교환 HPLC를 사용하여 수행된다.
클로닝된 야생형 폴리펩타이드 유전자, 돌연변이 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 합성 올리고뉴클레오타이드의 서열은, 예를 들어, 문헌[Wallace et al., Gene 16: 21-26 (1981)]의 이중-가닥 주형의 서열결정을 위한 사슬 종결 방법을 사용하여 클로닝 후에 검증될 수 있다.
예시적인 실시형태에서, 글리코실화 서열은 폴리뉴클레오타이드를 셔플링함으로써 추가된다. 후보 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 DNA 셔플링 프로토콜로 조절될 수 있다. DNA 셔플링은 관련 유전자 풀을 무작위로 단편화한 다음 중합효소 연쇄 반응-유사 과정에 의해 단편을 재조립함으로써 수행되는, 반복적 재조합 및 돌연변이 과정이다. 예를 들어, 문헌[Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751 (1994); Stemmer, Nature 370:389-391 (1994)]; 및 미국 특허 제5,605,793호, 제5,837,458호, 제5,830,721호 및 제5,811,238호를 참조한다.
b.
야생형 펩타이드 코딩 서열의 클로닝 및 서브클로닝
야생형 폴리펩타이드를 인코딩하는 수많은 폴리뉴클레오타이드 서열이 결정되었으며 상업적 공급업체로부터, 예를 들어, 인간 성장 호르몬은 예를 들어, Genbank(GenBank) 수탁 번호 NM 000515, NM 002059, NM 022556, NM 022557, NM 022558, NM 022559, NM 022560, NM 022561 및 NM 022562로부터 입수 가능하다.
인간 게놈 연구의 급속한 진전으로 인간 DNA 서열 데이터베이스가 알려진 뉴클레오타이드 서열, 예컨대, 이전에 확인된 폴리펩타이드를 인코딩하는 것에 대해 특정 비율의 상동성을 가지는 임의의 유전자 분절에 대해 검색할 수 있는 클로닝 접근법이 가능하게 되었다. 이렇게 확인된 임의의 DNA 서열은 이후에 화학적 합성 및/또는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기법, 예컨대, 중복 확장 방법에 의해 얻어질 수 있다. 짧은 서열의 경우, 완전히 새로운 합성으로 충분할 수 있는 반면; 더 큰 유전자를 얻기 위해서 합성 프로브를 사용하여 인간 cDNA 또는 게놈 라이브러리로부터 전장 코딩 서열을 추가로 단리하는 것이 필요할 수 있다.
대안적으로, 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열은 표준 클로닝 기법, 예컨대, 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 인간 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리로부터 단리될 수 있으며, 여기서 상동성-기반 프라이머는 종종 폴리펩타이드를 인코딩하는 알려진 핵산 서열로부터 유래될 수 있다. 이러한 목적을 위해 가장 일반적으로 사용되는 기법은, 표준 텍스트, 예를 들어, 상기한 문헌[Sambrook and Russell]에 기재되어 있다.
야생형 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열을 얻기에 적합한 cDNA 라이브러리는 상업적으로 입수할 수 있거나 구축될 수 있다. mRNA를 단리하고, 역전사에 의해 cDNA를 제조하며, cDNA를 재조합 벡터에 결찰하고, 증식, 스크리닝, 및 클로닝을 위해 재조합 숙주로 형질감염시키는 일반적인 방법은 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Gubler and Hoffman, Gene, 25: 263-269 (1983); 상기 Ausubel et al.,] 참조). PCR에 의해 뉴클레오타이드 서열의 증폭된 분절을 얻을 때, 분절은 cDNA 라이브러리로부터 야생형 폴리펩타이드를 인코딩하는 전장 폴리뉴클레오타이드 서열을 단리하기 위한 프로브로서 추가로 사용될 수 있다. 적절한 절차의 일반적인 설명은 상기한 문헌[Sambrook and Russell]에서 찾을 수 있다.
유사한 절차에 따라 인간 게놈 라이브러리로부터 야생형 폴리펩타이드, 예를 들어, 상기 언급한 Genbank 수탁 번호 중 어느 하나를 인코딩하는 전장 서열을 얻을 수 있다. 인간 게놈 라이브러리는 상업적으로 입수 가능하거나 다양한 업계에서 인식된 방법에 따라 구축될 수 있다. 일반적으로, 게놈 라이브러리를 구축하기 위해, 먼저 폴리펩타이드가 발견될 가능성이 있는 조직에서 DNA를 추출한다. 그 다음 DNA를 기계적으로 전단하거나 효소적으로 분해하여 길이가 약 12 내지 20 kb인 단편을 산출한다. 단편은 이후 원하지 않는 크기의 폴리뉴클레오타이드 단편으로부터 구배 원심분리에 의해 분리되고 박테리오파지 λ 벡터에 삽입된다. 이들 벡터 및 파지는 시험관내에서 포장된다. 재조합 파지는 문헌[Benton and Davis, Science, 196: 180-182 (1977)]에 기재된 바와 같이 플라크 혼성화에 의해 분석된다. 콜로니 혼성화는 문헌[Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 3961-3965 (1975)]에 기재된 바와 같이 수행된다.
서열 상동성을 기반으로 하여, 축퇴 올리고뉴클레오타이드를 프라이머 세트로서 설계할 수 있고 PCR을 적합한 조건 하에서 수행하여(예를 들어, 문헌[White et al., PCR Protocols: Current Methods and Applications, 1993; Griffin and Griffin, PCR Technology, CRC Press Inc. 1994] 참조) cDNA 또는 게놈 라이브러리로부터 뉴클레오타이드 서열의 분절을 증폭시킬 수 있다. 프로브로서 증폭된 분절을 사용하면, 야생형 폴리펩타이드를 인코딩하는 전장 핵산이 얻어진다.
야생형 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 획득할 때, 코딩 서열은 벡터, 예를 들어, 발현 벡터 내로 서브클로닝될 수 있어서, 재조합 야생형 폴리펩타이드가 생성된 작제물로부터 생성될 수 있다. 야생형 폴리펩타이드 코딩 서열에 대한 추가 변형, 예를 들어, 뉴클레오타이드 치환이 추후 분자의 특징을 변경시키기 위해 이루어질 수 있다.
c.
폴리펩타이드 서열에 돌연변이의 도입
인코딩 폴리뉴클레오타이드 서열로부터, 야생형 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 결정될 수 있다. 그 후, 아미노산 서열은 변형되어 아미노산 서열의 다양한 위치에서 추가적인 글리코실화 서열(들)을 도입함으로써 단백질의 글리코실화 패턴을 변경할 수 있다.
다양한 돌연변이-생성 프로토콜이 당업계에 확립되고 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[Zhang et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 94: 4504-4509 (1997); 및 Stemmer, Nature, 370: 389-391 (1994)]을 참조한다. 절차는 개별적으로 또는 조합하여 사용되어 일련의 핵산 변이체, 및 이에 따라 인코딩된 폴리펩타이드의 변이체를 생성할 수 있다. 돌연변이유발, 라이브러리 구축, 및 다른 다양성-생성 방법을 위한 키트가 상업적으로 입수 가능하다.
다양성을 생성하는 돌연변이 방법은, 예를 들어, 부위-지정 돌연변이유발(Botstein and Shortle, Science, 229: 1193-1201 (1985)), 우라실-함유 주형을 사용하는 돌연변이유발(Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 488-492 (1985)), 올리고뉴클레오타이드-지정 돌연변이유발(Zoller and Smith, Nucl. Acids Res., 10: 6487-6500 (1982)), 포스포로티오에이트-변형 DNA 돌연변이유발(Taylor et al., Nucl . Acids Res., 13: 8749-8764 및 8765-8787 (1985)), 및 갭이 있는 이중나선 DNA를 사용하는 돌연변이유발(Kramer et al., Nucl. Acids Res., 12: 9441-9456 (1984))을 포함한다.
돌연변이를 생성하기 위한 다른 방법은 점 불일치 복구(point mismatch repair)(Kramer et al., Cell, 38: 879-887 (1984)), 복구-결핍 숙주 균주를 사용한 돌연변이유발(Carter et al., Nucl . Acids Res., 13: 4431-4443 (1985)), 결실 돌연변이유발(Eghtedarzadeh and Henikoff, Nucl . Acids Res., 14: 5115 (1986)), 제한-선택 및 제한-정제(Wells et al., Phil. Trans. R. Soc . Lond . A, 317: 415-423 (1986)), 전체 유전자 합성에 의한 돌연변이유발(Nambiar et al., Science, 223: 1299-1301 (1984)), 이중-가닥 파손 복구(Mandecki, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 83: 7177-7181 (1986)), 폴리뉴클레오타이드 사슬 종결 방법에 의한 돌연변이유발(미국 특허 제5,965,408호), 및 오류 발생 가능성이 높은 PCR(Leung et al., Biotechniques, 1: 11-15 (1989))을 포함한다.
d.
숙주 유기체에서 바람직한 코돈 사용 빈도를 위한 핵산의 변형
폴리펩타이드 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 특정 숙주의 바람직한 코돈 사용 빈도와 일치하도록 추가로 변경될 수 있다. 예를 들어, 한 균주의 박테리아 세포의 바람직한 코돈 사용 빈도는 본 발명의 폴리펩타이드 변이체를 인코딩하고 이러한 균주가 선호하는 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 유도하는 데 사용될 수 있다. 숙주 세포가 나타내는 바람직한 코돈 사용의 빈도는 숙주 세포가 발현하는 다수의 유전자에서 바람직한 코돈 사용의 빈도의 평균을 냄으로써 계산될 수 있다(예를 들어, 계산 서비스는 카주사 DNA 연구소(Kazusa DNA Research Institute; 일본 소재)의 웹 사이트에서 이용 가능함). 이러한 분석은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 고도로 발현되는 유전자로 제한된다. 예를 들어, 미국 특허 제5,824,864호는 쌍떡잎 식물 및 외떡잎 식물이 나타내는 고도로 발현된 유전자에 의한 코돈 사용의 빈도를 제공한다.
변형 완료시, 폴리펩타이드 변이체 코딩 서열은 서열결정에 의해 확인되고, 그 후 야생형 폴리펩타이드와 동일한 방식으로 재조합 생성을 위한 적절한 발현 벡터로 서브클로닝된다.
IX.
돌연변이
폴리펩타이드의
발현
서열 확인 후, 본 발명의 폴리펩타이드는 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의존하여, 재조합 유전학 분야의 일상적인 기법을 사용하여 생성될 수 있다.
a.
발현 시스템
본 발명의 돌연변이 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산의 고수준 발현을 얻기 위해, 전형적으로 돌연변이 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 전사를 지시하는 강력한 프로모터, 전사/번역 종결자 및 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위를 포함하는 발현 벡터로 서브클로닝한다. 적합한 박테리아 프로모터는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[상기 Sambrook and Russell], 및 [상기 Ausubel et al.]에 기재되어 있다. 야생형 또는 돌연변이 폴리펩타이드를 발현하기 위한 박테리아 발현 시스템은, 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli), 바실러스 종(Bacillus sp .), 살모넬라(Salmonella), 및 카울로박터(Caulobacter)에서 이용 가능하다. 이와 같은 발현 시스템을 위한 키트가 상업적으로 입수 가능하다. 포유동물 세포, 효모, 및 곤충 세포를 위한 진핵 발현 시스템은 당업계에 잘 알려져 있으며 또한 상업적으로 입수 가능하다. 일 실시형태에서, 진핵 발현 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터이다.
이종 핵산의 발현을 지시하는 데 사용되는 프로모터는 특정 적용에 따라 다르다. 프로모터는 선택적으로 자연 환경에서 전사 시작 부위에서와 같이 이종 전사 시작 부위로부터 거의 동일한 거리에 위치한다. 그러나, 당업계에 알려진 바와 같이, 이러한 거리의 일부 변화는 프로모터 기능의 손실없이 제공될 수 있다.
프로모터에 추가적으로, 발현 벡터는 전형적으로 숙주 세포에서 돌연변이 폴리펩타이드의 발현에 필요한 모든 추가적인 요소를 포함하는 전사 단위 또는 발현 카세트를 포함한다. 따라서 전형적인 발현 카세트는 돌연변이 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 및 전사체의 효율적인 폴리아데닐화, 리보솜 결합 부위, 및 번역 종결에 필요한 신호를 포함한다. 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열은 전형적으로 절단가능한 신호 펩타이드 서열에 연결되어 형질전환된 세포에 의한 폴리펩타이드의 분비를 촉진시킨다. 이와 같은 신호 펩타이드는 특히 조직 플라스미노겐 활성화제, 인슐린, 및 뉴런 성장 인자 유래의 신호 펩타이드, 및 헬리오티스 비레센스(Heliothis virescens)의 유충호르몬 에스테라제를 포함한다. 카세트의 추가적인 요소는 인핸서, 및 게놈 DNA가 구조 유전자로서 사용되는 경우 기능적 스플라이스 공여체 및 수용체 부위가 있는 인트론을 포함할 수 있다.
프로모터 서열에 추가적으로, 발현 카세트는 또한 효율적인 종결을 제공하기위해 구조 유전자의 하류에 전사 종결 영역을 포함하여야 한다. 종결 영역은 프로모터 서열과 동일한 유전자로부터 얻을 수 있거나 상이한 유전자로부터 얻을 수 있다.
유전 정보를 세포로 수송하는 데 사용되는 특정 발현 벡터는 특히 중요하지 않다. 진핵 또는 원핵 세포에서 발현에 사용되는 임의의 통상적인 벡터가 사용될 수 있다. 표준 박테리아 발현 벡터는 플라스미드, 예컨대, pBR322-기반 플라스미드, pSKF, pET23D, 및 융합 발현 시스템, 예컨대, GST 및 LacZ를 포함한다. 에피토프 태그, 예를 들어, c-myc는 또한 재조합 단백질에 추가되어 통상적인 단리 방법을 제공할 수 있다.
진핵 바이러스 유래의 조절 요소를 포함하는 발현 벡터는 전형적으로 진핵 발현 벡터, 예를 들어, SV40 벡터, 유도종 바이러스 벡터 및 엡스타인-바 바이러스로부터 유래된 벡터에 사용된다. 다른 예시적인 진핵 벡터는 pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, 바큘로바이러스 pDSVE, 및 SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린 유선 종양 바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 또는 진핵 세포에서 발현에 효과적인 것으로 나타난 다른 프로모터의 지시 하에서 단백질의 발현을 가능하게 하는 임의의 다른 벡터를 포함한다.
일부 예시적인 실시형태에서, 발현 벡터는 본 명세서에 참고로 포함되는 2004년 4월 9일에 출원된 공동 소유의 미국 특허 출원에 개시된 바와 같이 pCWin1, pCWin2, pCWin2/MBP, pCWin2-MBP-SBD(pMS39) 및 pCWin2-MBP-MCS-SBD(pMXS39)로부터 선택된다.
일부 발현 시스템은 유전자 증폭을 제공하는 마커, 예컨대, 티미딘 키나제, 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제, 및 다이하이드로폴레이트 환원효소를 가진다. 대안적으로, 유전자 증폭을 포함하지 않는 고수율 발현 시스템, 예컨대, 폴리헤드린 프로모터 또는 다른 강력한 바큘로바이러스 프로모터의 지시 하에 돌연변이 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 가지는 곤충 세포의 바큘로 바이러스 벡터도 또한 적합하다.
발현 벡터에 전형적으로 포함되는 요소는 또한 이 콜라이에서 기능하는 레플리콘, 재조합 플라스미드를 보유하는 박테리아의 선택을 가능하게 하는 항생제 내성을 인코딩하는 유전자, 및 진핵 서열의 삽입을 가능하게 하는 플라스미드의 비필수 영역에서 고유한 제한 부위를 포함한다. 선택된 특정 항생제 내성 유전자는 중요하지 않으며, 당업계에 알려진 다수의 내성 유전자 중 임의의 것이 적합하다.
원핵 서열은 필요한 경우 진핵세포에서 DNA의 복제를 방해하지 않도록 선택적으로 선택된다.
재조합 단백질(예를 들어, 본 발명의 hgh 돌연변이체)의 주변세포질 발현이 요구되는 경우, 발현 벡터는 분비 신호를 인코딩하는 서열, 예컨대, 발현될 단백질의 코딩 서열의 5'에 직접 연결되는 이. 콜라이 OppA(주변세포질 올리고펩타이드 결합 단백질) 분비 신호 또는 이의 변형된 형태를 더 포함한다. 이러한 신호 서열은 세포질에서 생성된 재조합 단백질을 세포막을 통해 주변세포질 공간으로 유도한다. 발현 벡터는 신호 펩티다제 1에 대한 코딩 서열을 더 포함하며, 이는 재조합 단백질이 주변세포질 공간에 들어갈 때 신호 서열을 효소로 절단할 수 있다. 재조합 단백질의 주변세포질 생성에 대한 보다 상세한 설명은, 예를 들어, 문헌[Gray et al., Gene 39: 247-254 (1985)], 미국 특허 제6,160,089호 및 제6,436,674호에서 찾을 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 당업자는 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 여전히 유지하면서 임의의 야생형 또는 돌연변이 폴리펩타이드 또는 이의 코딩 서열에 대한 다양한 보존적 치환이 이루어질 있음을 인식할 것이다. 더욱이, 생성되는 아미노산 서열을 변경하지 않고 특정 발현 숙주에서 바람직한 코돈 사용 빈도를 제공하도록 폴리뉴클레오타이드 코딩 서열의 변형이 또한 이루어질 수 있다.
b.
형질감염 방법
표준 형질감염 방법은 다량의 돌연변이 폴리펩타이드를 발현하고, 그 다음 표준 기법을 사용하여 정제되는 박테리아, 포유동물, 효모 또는 곤충 세포주를 생성하는 데 사용된다(예를 들어, 문헌[Colley et al., J. Biol . Chem . 264: 17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)] 참조). 진핵 및 원핵 세포의 형질전환은 표준 기법에 따라 수행된다(예를 들어, 문헌[Morrison, J. Bact . 132: 349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101: 347-362 (Wu et al., eds, 1983)] 참조).
외래 뉴클레오타이드 서열을 숙주 세포에 도입하기 위한 잘 알려진 임의의 절차가 사용될 수 있다. 이들 절차는 칼슘 포스페이트 형질감염, 폴리브렌, 원형질체 융합, 전기천공, 리포좀, 미세주입, 혈장 벡터, 바이러스 벡터 및 클로닝된 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA, 또는 다른 외래 유전 물질을 숙주 세포에 도입하기 위한 다른 잘 알려진 임의의 방법의 사용을 포함한다(예를 들어, 문헌[상기 Sambrook and Russell] 참조). 사용되는 특정 유전 공학 절차가 적어도 하나의 유전자를 돌연변이 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 숙주 세포에 성공적으로 도입할 수 있는 것만 필요하다.
c.
숙주 세포에서 돌연변이
폴리펩타이드의
발현 검출
발현 벡터를 적절한 숙주 세포로 도입한 후, 돌연변이 폴리펩타이드의 발현에 유리한 조건 하에서 형질감염된 세포를 배양한다. 그 후, 세포를 재조합 폴리펩타이드의 발현에 대해 스크리닝하고, 재조합 폴리펩타이드를 후속적으로 표준 기법을 사용하여 배양물로부터 회수한다(예를 들어, 문헌[Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982)]; 미국 특허 제4,673,641호; 문헌[상기 Ausubel et al.]; 및 문헌[상기 Sambrook and Russell] 참조).
유전자 발현을 스크리닝하기 위한 몇 가지 일반적인 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 먼저, 유전자 발현을 핵산 수준에서 검출할 수 있다. 핵산 혼성화 기법을 사용하는 다양한 특정 DNA 및 RNA 측정 방법이 일반적으로 사용된다(예를 들어, 문헌[상기 Sambrook and Russell]). 일부 방법은 전기영동 분리(예를 들어, DNA를 검출하기 위한 서던 블롯 및 RNA를 검출하기 위한 노던 블롯)를 포함하지만, DNA 또는 RNA의 검출은 또한 전기영동 없이도 (예컨대, 도트 블롯에 의해) 수행될 수 있다. 형질감염된 세포에서 돌연변이 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산의 존재는 또한 서열-특이적 프라이머를 사용하는 PCR 또는 RT-PCR에 의해 검출될 수 있다.
둘째, 유전자 발현은 폴리펩타이드 수준에서 검출될 수 있다. 특히 본 발명의 돌연변이 폴리펩타이드와 특이적으로 반응하는 다클론성 또는 단클론성 항체를 사용하여, 유전자 생성물의 수준을 측정하기 위해 다양한 면역 분석이 당업자에 의해 일상적으로 사용된다(예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor, 1988; Kohler and Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975)]). 이와 같은 기법은 돌연변이 폴리펩타이드 또는 이의 항원성 부분에 대한 높은 특이성을 가지는 항체의 선택에 의한 항체 제조를 필요로 한다. 다클론성 및 단클론성 항체를 생성하는 방법은 잘 확립되어 있고, 이의 설명은 문헌에서 찾을 수 있으며, 예를 들어, 문헌[상기 Harlow and Lane; Kohler and Milstein, Eur . J. Immunol ., 6: 511-519 (1976)]을 참조한다. 본 발명의 돌연변이 폴리펩타이드에 대한 항체를 제조하고 면역분석을 수행하여 돌연변이 폴리펩타이드를 검출하는 보다 상세한 설명은 이후 섹션에서 제공된다.
X.
재조합적으로
생성된 돌연변이
폴리펩타이드의
정제
일단 형질감염된 숙주 세포에서 재조합 돌연변이 폴리펩타이드의 발현이 확인되면, 그 후 숙주 세포는 재조합 폴리펩타이드를 정제하기 위한 목적에 적절한 규모로 배양된다.
a.
박테리아로부터 정제
본 발명의 돌연변이 폴리펩타이드가 형질전환된 박테리아에 의해 대량으로, 전형적으로 프로모터 유도 후에 재조합적으로 생성될 때, 발현이 구성적일 수 있지만, 단백질은 불용성 응집체를 형성할 수 있다. 단백질 봉입체의 정제에 적합한 몇 가지 프로토콜이 있다. 예를 들어, 응집체 단백질(이하, 봉입체라고 지칭함)의 정제는 전형적으로 박테리아 세포의 파괴에 의한, 예를 들어, 약 100 내지 150 ㎍/㎖ 라이소자임 및 비이온성 세제인 0.1% Nonidet P40의 완충액 중에서의 인큐베이션에 의한 봉입체의 추출, 분리 및/또는 정제를 포함한다. 세포 현탁액은 Polytron 그라인더(Brinkman Instruments, 미국 뉴욕주 웨스트버리 소재)를 사용하여 분쇄될 수 있다. 대안적으로, 세포는 얼음 상에서 음파처리될 수 있다. 박테리아를 용해하는 대안적인 방법은 문헌[상기 Ausubel et al. 및 상기 Sambrook and Russell]에 기재되어 있으며, 당업자에게 명백할 것이다.
박테리아 봉입체로부터 재조합 폴리펩타이드를 정제하는 것에 대한 추가 설명에 대하여는, 예를 들어, 문헌[Patra et al., Protein Expression and Purification 18: 182-190 (2000)]을 참조한다.
상청액에 존재하는 재조합 단백질은 당업자에게 잘 알려진 표준 분리 기법에 의해 숙주 단백질로부터 분리될 수 있다.
b.
돌연변이
폴리펩타이드
발현의 검출을 위한 면역 분석
재조합 돌연변이 폴리펩타이드의 생성을 확인하기 위해, 면역학적 분석은 샘플에서 폴리펩타이드의 발현을 검출하는 데 유용할 수 있다. 면역학적 분석은 또한 재조합 호르몬의 발현 수준을 정량화하는 데 유용하다. 돌연변이 폴리펩타이드에 대한 항체는 이러한 면역학적 분석을 수행하는 데 필요하다.
c.
돌연변이
폴리펩타이드에
대한 항체의 생성
관심 면역원과 특이적으로 반응하는 다클론성 및 단클론성 항체를 생성하는 방법은 당업자에게 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Coligan, Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY, 1991; Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY, 1989; Stites et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, 및 여기에 인용된 참고문헌; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed.) Academic Press, New York, NY, 1986; 및 Kohler and Milstein Nature 256: 495-497, 1975] 참조). 이와 같은 기법은 파지 또는 유사한 벡터에서 재조합 항체의 라이브러리로부터 항체의 선택에 의한 항체 제조를 포함한다(예를 들어, 문헌[Huse et al., Science 246: 1275-1281, 1989; 및 Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989] 참조).
원하는 특이성을 가지는 항체를 포함하는 항혈청을 생성하기 위해, 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 본 발명의 돌연변이 폴리펩타이드) 또는 이의 항원성 단편이 적합한 동물, 예를 들어, 마우스, 토끼, 또는 영장류를 면역화하는 데 사용될 수 있다. 표준 애주번트, 예컨대, 프로인드 애주번트는 표준 면역화 프로토콜에 따라서 사용될 수 있다. 대안적으로, 특정 폴리펩타이드로부터 유래된 합성 항원성 펩타이드는 담체 단백질에 접합되고 이어서 면역원으로 사용될 수 있다.
면역원 제제에 대한 동물의 면역 반응은 테스트 출혈을 취하고 관심 항원에 대한 반응성의 역가를 결정함으로써 모니터링된다. 항원에 대한 항체의 적절하게 높은 역가가 얻어질 때, 혈액을 동물로부터 수집하고 항혈청을 준비한다. 항원에 대해 특이적으로 반응하는 항체를 풍부화하기 위한 항혈청의 추가 분획화 및 항체의 정제가 후속적으로 수행될 수 있으며, 문헌[상기 Harlow and Lane] 및 상기 제공된 단백질 정제에 대한 일반적인 설명을 참조한다.
단클론성 항체는 당업자에게 친숙한 다양한 기법을 사용하여 수득된다. 전형적으로, 원하는 항원으로 면역화된 동물 유래의 비장 세포는 일반적으로 골수종 세포와의 융합에 의해 무한증식화된다(문헌[Kohler and Milstein, Eur . J. Immunol. 6:511-519, 1976] 참조). 대안적인 무한증식 방법은, 예를 들어, 엡스타인 바 바이러스, 종양유전자, 또는 레트로바이러스를 이용하는 형질전환, 또는 당업계에 잘 알려진 다른 방법을 포함한다. 단일 무한증식화 세포로부터 생성되는 콜로니는 항원에 대한 원하는 특이성과 친화성의 항체의 생성에 대해 스크리닝되며, 이와 같은 세포에 의해 생성되는 단클론성 항체의 수율은 척추동물 숙주의 복막강 내로의 주사를 포함하여 다양한 기법에 의해 향상될 수 있다.
추가적으로, 단클론성 항체는 또한 문헌[상기 Huse et al.]에 개괄된 일반 프로토콜에 따라 인간 B 세포 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 원하는 특이성을 가지는 항체 또는 이와 같은 항체의 결합 단편을 인코딩하는 핵산 서열의 확인시 재조합적으로 생성될 수 있다. 상기 논의된 재조합 폴리펩타이드 생성의 일반 원리 및 방법은 재조합 방법에 의한 항체 생성에 적용가능하다.
원하는 경우, 본 발명의 돌연변이 폴리펩타이드를 특이적으로 인식할 수 있는 항체가 야생형 폴리펩타이드에 대한 교차 반응성에 대해 테스트될 수 있고 따라서 야생형 단백질에 대한 항체와 구별될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 폴리펩타이드로 면역화된 동물로부터 얻은 항혈청은 야생형 폴리펩타이드가 고정화된 칼럼을 통과할 수 있다. 칼럼을 통과하는 항혈청의 부분은 돌연변이 폴리펩타이드만 인식하고 야생형 폴리펩타이드는 인식하지 않는다. 유사하게, 돌연변이 폴리펩타이드에 대한 단클론성 항체는 또한 돌연변이체만 인식하고 야생형 폴리펩타이드는 인식하지 않는 독점성에 대해 스크리닝될 수 있다.
본 발명의 돌연변이 폴리펩타이드만 특이적으로 인식하고 야생형 폴리펩타이드는 인식하지 않는 다클론성 또는 단클론성 항체는, 예를 들어, 샘플을 고체 지지체 상에 고정화된 돌연변이 펩타이드-특이적 다클론성 또는 단클론성 항체와 함께 인큐베이션함으로써, 돌연변이 단백질을 야생형 단백질로부터 단리하는 데 유용하다.
XI.
치료 및 진단 방법
다양한 실시형태에서, 본 발명은, FGF1 변이 폴리펩타이드 및 HGF 변이 폴리펩타이드의 병용 요법을 투여함으로써, Met 및/또는 FGFR을 저해하여 치료될 수 있는 질환 상태를 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다. 이들 실시형태에서, 본 발명은 질환 상태를 예방, 개선 또는 치료하는 데 충분한 양의 본 발명의 FGF1 변이 폴리펩타이드 및 HGF 변이 폴리펩타이드를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 예시적인 질환 상태는 암이다. 개시된 효현제 변이체는, 특히 혈관신생을 위한 세포 성장의 촉진, 및 심혈관, 간, 근골격 및 신경 질환의 치료에 유용할 수 있다.
일부 실시형태에서, FGF1 변이 폴리펩타이드 및 HGF 변이 폴리펩타이드의 병용 요법은 (1) 지속성 각막 상피 결손(PCED), 및 (2) 각막 혈관신생의 치료, 예방, 및/또는 저해에 사용된다. 일부 실시형태에서, PCED는 발의 치유되지 않은(예를 들어, 당뇨병성) 궤양에 상응하는 안구 질환이다. 일부 실시형태에서, PCED는 상피 치유 및 결손 봉합의 과정이 지연되어, 궤양, 감염, 흉터, 천공 및 시력 손실을 초래할 수 있는 각막 상피 결손을 야기할 때 일어난다. 일부 실시형태에서, PCED는 손상, 이전 안구 수술, 감염(예를 들어, 이전 헤르페스성 감염 또는 중증 세균성 궤양) 또는 안 질환(중증 안구건조증, 당뇨병, 눈꺼풀 이상으로 인한 만성 노출, 및 조혈 줄기세포 이식 후 안구 이식편대숙주병과 같은 기저 병태를 포함함)으로 인해 발생할 수 있다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이 폴리펩타이드 및 HGF 변이 폴리펩타이드의 병용 요법은 손상, 이전 안구 수술, 감염(예를 들어, 이전 헤르페스성 감염 또는 중증 세균성 궤양) 또는 안 질환(중증 안구건조증, 당뇨병, 눈꺼풀 이상으로 인한 만성 노출, 및 조혈 줄기세포 이식 후 안구 이식편대숙주병과 같은 기저 병태를 포함함)의 치료, 예방, 및/또는 저해에 사용된다.
예를 들어, 성인에서 HGF-MEt 경로는 손상 후 근육 재생에 관여한다. 따라서, 개시된 변이체는, 예를 들어, 경색 후 심장 조직 재생을 포함하는 근육 손상을 복구하는 데 사용될 수 있다.
개시된 변이체는, 예를 들어, 바이러스 감염(예컨대, 간염 바이러스, 예를 들어, HAV, HBV 또는 HCV에 의한 감염), 또는 다른 급성 바이러스 간염, 자가면역 만성 간염, 임신성 급성 지방간, 버드-키아리 증후군 및 정맥폐쇄성 질환, 고열, 저산소증, 악성 침윤, 라이 증후군, 패혈증, 윌슨병을 포함하는 병태에 의해 그리고 이식거부반응에서 유발되는 간부전 또는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있다.
개시된 변이체는 버섯 중독(예를 들어, 팔로이드 버섯(Amanita phalloides), 비소, 사염화탄소(또는 다른 염소화 탄화수소), 구리, 에탄올, 철, 메토트렉세이트 및 인으로부터 선택되는 독소를 포함하여, 독소에 의해 유발된 급성 간부전 또는 질환을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드의 특정 용도는 N-아세틸-p-아미노페놀(상업적으로 파라세타몰 또는 아세트아미노펜으로 알려짐)에 의한 중독에 의해 유발된 간 손상의 치료 또는 예방에 있다.
또한, 개시된 변이체는 신부전 후의 치료, 신장 유지 및 재생 지원에 유용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드 변이체는 HGF의 활성을 중화시키기 때문에, 다양한 치료 적용에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 특정 폴리펩타이드 변이체는 과증식성 질환 또는 장애, 예를 들어, 다양한 형태의 암의 예방 또는 치료에 유용하다.
예시적인 실시형태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 본 발명의 폴리펩타이드 변이체의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 폴리펩타이드 변이체가, 예를 들어, 다양한 눈 장애, 폐암, 유방암, 결장암, 전립선암, 난소암, 두경부암, 난소암, 다발성 골수종, 간암, 위암, 식도암, 신장암, 비인두암, 췌장암, 중피종, 흑색종 및 교모세포종에서 FGF 반응성 종양 세포를 포함하는 다양한 FGF 반응성 장애의 치료에 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
예시적인 실시형태에서, 암은, 예를 들어, 결장직장, 편평 세포, 간세포, 신장, 유방 또는 폐의 암종이다.
폴리펩타이드 변이체는 종양 세포의 증식을 저해하거나 감소시키는 데 사용될 수 있다. 이와 같은 접근법에서, 종양 세포는 종양 세포의 증식을 저해하거나 감소시키기 위해 치료적 유효량의 폴리펩타이드 변이체에 노출된다. 특정 실시형태에서, 폴리펩타이드 변이체는 종양 세포 증식을 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%만큼 저해한다.
특정 실시형태에서, 폴리펩타이드 변이체는 종양 세포의 증식을 저해하거나 감소시키는 데 사용되며, 여기서 변이체는 FGFR에 결합하는 FGF1의 능력을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, FGF1 폴리펩타이드 변이체는 상처 치유를 저해하거나 촉진시키는 데 사용된다.
추가적으로, 폴리펩타이드 변이체는 포유동물에서 종양 성장 또는 발달을 저해하거나 늦추는 데 사용될 수 있다. 이와 같은 방법에서, 유효량의 폴리펩타이드 변이체는 포유동물에서 종양 성장을 저해하거나 늦추기 위해 포유동물에게 투여된다. 따라서, 폴리펩타이드 변이체는 예를 들어, 포유동물에서 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 방법은 치료적 유효량의 폴리펩타이드 변이체를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 폴리펩타이드 변이체는 종양을 치료하기 위해 단독으로 또는 또 다른 약제학적으로 활성인 분자와 조합하여 투여될 수 있다.
일반적으로, 폴리펩타이드 변이체의 치료적 유효량은 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏, 선택적으로 약 1 ㎎/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏, 선택적으로 약 1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏의 범위일 것이다. 투여되는 양은 치료될 질환 또는 적응증의 유형 및 정도, 특정 환자의 전반적인 건강 상태, 전달될 폴리펩타이드 변이체의 상대적인 생물학적 효능, 폴리펩타이드 변이체의 제형, 제형 중 부형제의 존재 및 유형, 및 투여 경로와 같은 변수에 따라 달라질 것이다. 투여되는 초기 투약량은 원하는 혈중 농도 또는 조직 수준을 빠르게 달성하기 위해 상한 수준을 초과하여 증가될 수 있거나, 초기 투약량은 최적 투약량보다 적을 수 있고 일일 투약량은 특정 상황에 따라 치료 과정 동안 점차적으로 증가될 수 있다. 인간 투약량은, 예를 들어, 0.5 ㎎/㎏ 내지 20 ㎎/㎏에서 실행되도록 설계된 종래의 I상 용량 증가 요법 연구에서 최적화될 수 있다. 투약 빈도는, 투여 경로, 투약량 및 치료될 질환 상태와 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 예시적인 투약 빈도는 1일 1회, 1주 1회 및 2주마다 1회이다. 바람직한 투여 경로는 비경구, 예를 들어, 정맥내 주입이다. 단백질-기반 약물의 제형은 당업계의 통상의 기술 내에 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 변이체, 예를 들어, 단백질-기반의 폴리펩타이드 변이체는 동결건조되고 투여시에 완충 식염수에서 재구성된다.
폴리펩타이드 변이체는 단독으로 또는 다른 약제학적으로 활성인 성분과 조합하여 투여될 수 있다. 다른 활성 성분, 예를 들어, 면역조절제는 폴리펩타이드 변이체와 함께 투여될 수 있거나, 폴리펩타이드 변이체 전 또는 후에 투여될 수 있다.
치료 용도를 위한 폴리펩타이드 변이체를 포함하는 제형은, 전형적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체와 조합된 폴리펩타이드 변이체를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 건전한 의학적 판단 범주 내에서, 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 완충액, 담체, 및 부형제를 의미한다. 담체(들)는 제형의 다른 성분과 양립 가능하고 수용체에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용 가능"해야 한다. 이와 관련하여, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 약제학적 투여와 양립 가능한 임의의 및 모든 완충액, 용매, 분산매질, 코팅제, 등장화제 및 흡수지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 약제학적으로 활성인 물질에 대한 이와 같은 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 알려져 있다.
제형은 투약 단위 형태로 편리하게 제공될 수 있고, 약제학적 분야에 잘 알려진 임의의 방법을 포함하여 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (Mack Publishing Company, 1990)].
예시적인 실시형태에서, 폴리펩타이드 변이체는 시험관내 또는 생체내에서 진단 목적으로 사용되며, 폴리펩타이드 변이체는 전형적으로 검출 가능한 모이어티로 직접 또는 간접적으로 표지화된다. 검출 가능한 모이어티는 검출 가능한 신호를 직접 또는 간접적으로 생성할 수 있는 임의의 모이어티일 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 모이어티는 방사성 동위원소, 예컨대, 3H, 14C, 32P, 35S, 또는 125I; 형광 또는 화학발광 화합물, 예컨대, 플루오레세인 아이소티오시아네이트인 Cy5.5(GE Healthcare), Alexa Fluro® 염료(Invitrogen), IRDye® 적외선 염료(LI-COR® Biosciences), 로다민, 또는 루시페린; 효소, 예컨대, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 또는 호스래디쉬 퍼옥시다제; 스핀 프로브, 예컨대, 스핀 표지; 또는 착색 입자, 예를 들어, 라텍스 또는 금 입자일 수 있다. 폴리펩타이드 변이체는, 예를 들어, 문헌[Hunter et al. (1962) Nature 144: 945; David et al. (1974) Biochemistry 13: 1014; Pain et al. (1981) J. Immunol Meth 40: 219; 및 Nygren (1982) J. Histochem and Cytochem. 30: 407]에 기재된 바와 같이 당업계에 알려진 다수의 접근법을 사용하여 검출 가능한 모이어티에 접합될 수 있다. 표지는, 예를 들어, 시각적으로 또는 분광광도계 또는 다른 검출기 또는 다른 적절한 영상화 시스템의 도움을 이용하여 검출될 수 있다.
폴리펩타이드 변이체는 당업계에서 이용 가능한 광범위한 면역분석 기법에 이용될 수 있다. 예시적인 면역분석은, 예를 들어, 샌드위치 면역분석, 경쟁 면역분석, 면역조직화학적 절차를 포함한다.
샌드위치 면역분석에서, 관심 분석물 또는 항원에 결합하는 2가지 항체, 예를 들어, 하나는 고체 지지체 상에 고정화된 것, 및 하나는 용액에서 유리 상태이고 검출 가능한 모이어티로 표지화된 것이 사용된다. 항원을 포함하는 샘플이 이러한 시스템에 도입될 때, 항원은 고정화된 항체 및 표지화된 항체 둘 다에 결합하여 지지체의 표면 상에 "샌드위치" 면역 복합체를 형성한다. 복합체화 단백질은 결합하지 않은 샘플 성분과 과잉 표지화 항체를 씻어내고 지지체 표면 상에서 단백질에 복합체화된 표지화 항체의 양을 측정함으로써 검출된다. 대안적으로, 용액에서 유리 상태인 항체는 유리 항체에 결합하는 검출 가능한 모이어티로 표지화된 제3 항체에 의해 검출될 수 있다. 면역학적 분석 설계, 이론 및 프로토콜의 상세한 검토는, 문헌[Butt, ed., (1984) Practical Immunology, Marcel Dekker, New York; Harlow et al. eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Laboratory; 및 Diamandis et al., eds. (1996) Immunoassay, Academic Press, Boston]을 포함하여, 다수의 텍스트에서 찾을 수 있다.
표지화된 폴리펩타이드 변이체는 생체내 영상화제로서 유용하며, 이에 의해 폴리펩타이드 변이체는 수용체에서 관심 특정 조직에 대해 영상화제를 표적으로 할 수 있다고 고려된다. 생체내 영상화를 위한 원격 검출 가능한 모이어티는 반감기가 약 6시간인 감마 방출기인 방사성 원자 99mTc를 포함한다. 방사성핵종 진단제의 비제한적인 예는, 예를 들어, 110In, 111In, 177Lu, 18F, 52Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 90Y, 89Zr, 94mTc, 94Tc, 99mTc, 120I, 123I, 124I, 125I, 131I, 154- 158Gd, 32P, 11C, 13N, 15O, 186Re, 188Re, 51Mn, 52mMn, 55Co, 72As, 75Br, 76Br, 82mRb, 83Sr, 또는 다른 γ-, β-, 또는 양전자 방출기를 포함한다.
또한 생체내 영상화에 유용한 비-방사성 모이어티는 나이트록사이드 스핀 표지뿐만 아니라 모두 동일계내 양성자 이완을 유도하는 란단족 및 전이금속 이온을 포함한다. 영상화에 추가적으로 복합체화 방사성 모이어티는 표적화 세포를 파괴하기 위해 표준 방사성면역요법 프로토콜에서 사용될 수 있다.
플루오레세인 아이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코사이아닌, 알로피코사이아닌, o-프탈알데하이드 및 플루오레사민을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 매우 다양한 형광 표지가 당업계에 알려져 있다. 사용되는 화학발광 표지는, 루미놀, 아이소루미놀, 방향족 아크리디늄 에스터, 이미다졸, 아크리디늄 염 또는 옥살레이트 에스터를 포함할 수 있다.
개시된 폴리펩타이드 변이체는 또한 생체내 검출을 가능하게 하기 위해 형광 마커로 표지화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 형광 표지는 Cy5.5(GE Healthcare)이다. 다른 실시형태에서, 형광 표지는 Alexa Fluro® 염료(Invitrogen)이다. 일부 실시형태에서, 형광 표지는 IRDye® 적외선 염료(LI-COR® Biosciences)이다.
고선량 방사선요법을 위한 예시적인 뉴클레오타이드는 방사성 원자 90Yt, 131I 및 111In을 포함한다. 폴리펩타이드 변이체는 영상화 분야에 알려진 커플링 기법을 사용하여 131I, 111In 및 99mTC로 표지화될 수 있다. 유사하게, 영상화제를 제조하고 투여하기 위한 절차뿐만 아니라, 영상을 포착하고 처리하기 위한 절차는 영상화 분야에 잘 알려져 있으므로 본 명세서에서는 상세하게 논의하지 않는다. 유사하게, 항체-기반 면역요법을 수행하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,534,254호를 참조한다.
실시예
실시예
1: 단백질분해 안정성 성장 인자를 조작하기 위한
고속대량
스크리닝 방법
요약
성장 인자는 재생 의학 및 암 치료를 위한 치료용 분자로서 개발될 가능성이 큰 조절 단백질의 중요한 부류이다. 그러나, 치료용 분자로서 성장 인자의 활성 및 효능은 좋지 않은 열 안정성 및 단백질분해 안정성에 의해 크게 제한된다. 열 안정성이 증가된 성장 인자를 조작하기 위해 많은 방법이 개발되었지만, 단백질분해 안정성이 증가된 성장 인자를 조작하기 위한 초점 및 이에 대한 개발 방법은 부족하였다. 플라스민, 엘라스타제, uPA, 카텝신, 및 MMP와 같은 프로테아제는, 특히 상처 치유 및 종양 형성에서 세포외 기질 분해 및 신호 전달에 중요한 역할을 한다. 이러한 프로테아제는 또한 일반적으로 성장 인자를 분해하는 것으로 보고되었다. 이 연구에서, 본 발명자들은 단백질분해 안정성의 증가를 위해 성장 인자를 조작하기 위한 일반화가능한 방법을 기재한다. 본 발명자들은 단백질분해 안정성이 증가된 돌연변이체를 선택하는 조합 접근법으로서 효모 디스플레이 플랫폼 및 FACS 스크리닝을 이용한다. 이 방법은 문헌에 보고된 야생형 FGF1 및 단백질분해에 안정적인 FGF1 돌연변이체를 구별하는 스크린의 능력을 입증함으로써 검증되었다.
도입
이 실시예는 스크리닝을 위해 효모 디스플레이 플랫폼 및 유동-활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 단백질분해에 안정적인 성장 인자를 조작하는 조합 접근법을 기재한다. 모델 예로서 FGF1을 사용하는 스크리닝 방법을 설정하는 과정을 설명한다. 극도로 좋지 않은 열 안정성 및 단백질분해 안정성으로 인해 스크리닝을 FGF1에 대해 설정하였다14 ,21. 안정성이 가장 좋지 않은 야생형 성장 인자는 치료제에 사용하기 위해 안정적인 형태를 조작해야 할 필요성이 가장 크다. 따라서, 안정성이 좋지 않은 모델 성장 인자를 선택함으로써 성장 인자를 조작하기 위한 방법의 유용성을 입증하는 것이 본 발명자들에게 중요하였다. 이 실시예에서, 스크리닝을 위한 선택적인 압력으로서 혈청 또는 여러 가지 상이한 프로테아제를 사용하는 것을 탐색하였다. 마지막으로, 상이한 단백질분해 안정성의 FGF 변이체를 구별하는 스크린의 능력을 검증하였다. 실시예 2에서, 단백질분해에 안정적인 FGF1 돌연변이체의 조작 및 특성화를 통한 조합 스크리닝의 능력을 나타낸다.
결과
단백질분해에 안정적인 단백질을 조작하기 위한 조합 스크리닝 방법의 작업흐름
고친화성 결합제를 조작하는 데 일반적으로 사용되는 효모 디스플레이 플랫폼은 또한 단백질분해 안정성이 더 큰 단백질을 조작하는 데 이용된다(도 1). 단일 성장 인자 변이체의 수천개의 복제물이 테더링된 융합체로서 효모의 표면 상에 디스플레이된다. 혈구응집소(HA) 태그가 성장 인자의 상류에서 발현되는 한편, c-myc 태그는 성장 인자의 하류에서 발현된다. 세포는 상응하는 수용체의 가용성 Fc 융합체와 함께 인큐베이션될 수 있고, 상기 융합체는 효모 디스플레이 성장 인자에 결합할 수 있다.
효모 디스플레이 플랫폼은 유동-활성화 세포 분류(FACS)와 결합되어 단백질분해 안정성이 더 높은 성장 인자를 조작한다(도 2). 성장 인자 돌연변이체의 라이브러리는 무작위 돌연변이유발, 유도 돌연변이유발, 또는 DNA 셔플링에 의해 생성된다. 효모 세포의 라이브러리는, 효모 표면 디스플레이 단백질의 절단이 일어나는 동안, 관심 프로테아제와 함께 인큐베이션된다. 단백질분해 안정성이 더 큰 성장 인자 돌연변이체는 효모 세포 표면 상에서의 절단에 대해 내성이 더 크다. 프로테아제 인큐베이션 후, 세포를 세척하고 수용체 결합 친화성이 유지된 적절하게 접힌 성장 인자 돌연변이체에 결합하는 기능성 수용체의 가용성 Fc 융합체와 함께 인큐베이션한다. FACS는 적절하게 접히고, 절단되지 않은 성장 인자 돌연변이체를 정렬하는 데 사용되며, 이는 다음 분류 라운드를 위해 확장되고 유도된다.
Fc 도메인, c-myc 도메인, 및 HA 태그에 대한 형광 항체 마커를 사용하여 수용체 결합, 성장 인자-특이적 절단, 및 비-특이적 절단을 측정한다(표 2.1). 결합된 Fc-융합 수용체의 검출은 성장 인자의 돌연변이가 수용체에 대한 결합 친화성을 심각하게 감소시키지 않거나 부적절한 단백질 접힘을 야기하지 않는 것을 보장하는 것이 중요하다. 성장 인자-특이적 절단은 성장 인자의 단백질분해 안정성의 직접적인 척도이다. 절단된 성장 인자는 C-말단 c-myc 태그가 제거될 것이므로, 성장 인자-특이적 절단은 c-myc 신호에 의해 검출된다. 효모 표면 디스플레이 단백질 Aga1p 및 Aga2p 내에서 프로테아제가 절단할 때 비-특이적 절단이 일어난다. 비-특이적 절단 동안, 3가지 모든 마커에 대한 형광 신호가 감소된다. 이는 성장 인자 절단 및 결합 활성을 검출하기 위한 동적 범위가 감소하기 때문에 바람직하지 않다. 따라서, HA 신호는 관심 프로테아제에 의한 비-특이적 절단이 최소임을 보장하는 데 사용된다.
FGF1의 효모 디스플레이
단백질분해 안정성 스크린의 설정을 입증하기 위한 모델로서 FGF1을 선택하였다. 야생형 FGF1을 pCT 벡터내로 클로닝하여, Aga2p 교배 단백질에 대한 융합체로서 에스. 세레비시에 효모 세포의 표면에서 발현되게 하였다(도 3a). 효모 세포 표면에서 FGF1의 성공적인 발현을 단백질의 C-말단 상의 c-myc 태그의 검출에 의해 확인하였다(도 3b). 마지막으로, 본 발명자들은 FGFR1-Fc에 대한 특이적 결합 활성을 측정함으로써 효모-디스플레이 FGF의 적절한 접힘을 확인하였다(도 3c).
단백질분해에 안정적인 FGF1을 조작하기 위한 프로테아제의 선택
본 발명자들은 FGF1에 대한 단백질분해 안정성 스크린을 개발하기 위해 혈청, 트립신, 키모트립신, 및 플라스민의 사용을 테스트하였다. 이들 프로테아제는 FGF1에 대한 과학적 및 생물학적 관련성을 기반으로 선택되었다. 스크린에 대한 프로테아제의 적합성은 효모 디스플레이 단백질의 비-특이적 절단을 최소화하면서 합리적인 속도로 성장 인자를 절단하는 능력에 의해 결정되었다.
본 발명자들은 먼저 체내 성장 인자가 접할 수 있는 수많은 프로테아제로 이루어진 천연 혈액 생성물인 혈청을 사용하여 스크린을 개발하려고 시도하였다22 -24. 본 발명자들은 FGF1 절단 및 FGFR1-Fc 결합 신호의 감소를 관찰할 수 있는지를 알아보기 위해 다양한 농도의 소태아혈청(FBS)과 함께 FGF1 돌연변이체의 라이브러리를 인큐베이션하였다(도 4). 본 발명자들은 심지어 FBS의 농도가 100%로 증가될 때에도, 본 발명자들은 단지 FGF1 절단 신호(α-c-myc) 및 FGFR1-Fc 결합 신호의 최소 감소만을 관찰하였음을 발견하였다. 따라서, 본 발명자들은 혈청이 단백질분해 안정성이 낮은 효모-디스플레이 FGF1 돌연변이체를 절단하기에 충분히 엄격한 선택적인 압력을 제공하지 않는다는 결론을 내렸다.
그 다음에, 본 발명자들은 단백질의 단백질분해 안정성을 측정하고 보고하는 데 일반적으로 사용되는 2가지 프로테아제인 트립신과 키모트립신을 사용하여 스크린의 개발의 테스트하였다. 본 발명자들은 다양한 농도의 트립신(도 5) 및 키모트립신(도 6)과 함께 효모-디스플레이 야생형 FGF1을 인큐베이션한 다음, 단백질 절단(α-c-myc) 및 FGFR1-Fc에 대한 결합 정도를 측정하였다. 본 발명자들은 트립신과 키모트립신이 둘 다 관찰된 단백질 절단 및 FGFR1-Fc에 대한 결합 정도에 농도-의존적 효과를 미침을 발견하였다. 그 다음, 본 발명자들은 관찰된 단백질 절단이 비-특이적 절단(α-HA) 또는 FGF1-특이적 절단(α-c-myc)으로 인한 것인지 여부를 결정하였다. 본 발명자들은 HA 신호가 더 높은 트립신 농도로 인큐베이션할 때 현저하게 감소됨을 발견하였으며, 이는 트립신에 의한 관찰된 많은 단백질 절단이 비-특이적 절단으로 인한 것임을 나타낸다(도 7). 따라서, 본 발명자들은 트립신이 단백질분해 안정성 스크린에 사용될 수 없다는 결론을 내렸다. 한편, 본 발명자들은 c-myc 신호만 감소하는 한편, HA 신호는 더 높은 키모트립신 농도로의 인큐베이션에 의해 상대적으로 영향을 받지 않음을 발견하였으며, 이는 키모트립신에 의한 단백질 절단이 주로 FGF1 내의 절단에 기인함을 나타낸다(도 8). 따라서, 본 발명자들은 키모트립신이 단백질분해 안정성 스크린에 사용하기에 합리적인 후보자라는 결론을 내렸다.
마지막으로, 본 발명자들은 세포외 기질 단백질을 분해하고 FGF1을 분해하는 것으로 보고된 프로테아제인 플라스민을 사용하는 단백질분해 안정성 스크린의 개발을 평가하였다25. 본 발명자들은 다양한 농도의 플라스민과 함께 효모-디스플레이 야생형 FGF1을 인큐베이션하고 효모-디스플레이 단백질이 농도-의존적 방식으로 절단되었음을 발견하였다(도 9). 관찰된 절단이 비-특이적이 아니라 FGF1-특이적임을 확인하기 위해, 본 발명자들은 효모-디스플레이 FGF1의 절단을 효모 디스플레이 단백질인 Aga1 및 Aga2뿐만 아니라, HA 및 c-myc 태그만을 발현하는 빈 대조군과 비교하였다(도 10). 96시간에 걸쳐 플라스민과 함께 인큐베이션하는 동안, 본 발명자들은 효모-디스플레이 FGF1이 절단된 반면, 빈 대조군은 절단되지 않음을 발견하였다. 따라서, 본 발명자들은 관찰된 절단이 FGF1-특이적이라는 결론을 내렸다.
야생형 FGF1과 단백질분해에 안정적인 FGF1 돌연변이체의 구별에 의한 스크리닝 방법의 검증
상이한 단백질분해 안정성의 FGF를 구별하는 플라스민-기반 스크리닝의 능력을 테스트하기 위해, 본 발명자들은 야생형(WT) FGF1을 합리적인 설계에 의해 문헌에서 개발된 열 안정화 FGF1 돌연변이체(PM2)와 비교하였다14. PM2는 트립신의 존재 하에 더 안정적인 것으로 자크르제브스카(Zakrzewska)외 다수에 의해 특성화되었다. 본 발명자들은 플라스민이 트립신과 1차 서열 특이성을 공유하기 때문에, PM2가 플라스민에 의한 절단에 더 저항성이 있을 것이라고 가정하였다. 따라서, 본 발명자들은 플라스민을 사용하는 기능적 단백질분해 안정성 스크리닝 방법이 WT FGF1과 비교하여 본 발명자들이 PM2에서 더 적은 FGF1-특이적 절단을 관찰하게 할 수 있을 것으로 예측하였다.
PM2 또는 WT FGF1을 디스플레이하는 효모 세포를 다양한 농도의 플라스민과 함께 48시간 동안 인큐베이션하고 비-특이적 절단(항-HA) 및 FGF1-특이적 절단(항-c-myc)에 대해 염색하였다(도 11). c-myc 신호의 차이에 의해 집단의 깨끗한 분리를 얻을 수 있으며, HA 신호에 대해서는 상대적으로 영향을 거의 미치지 않는 것을 발현하였다. 절단 신호에서 이러한 차이로 플라스민을 사용하면 스크린이 단백질분해 안정성이 더 큰 새로운 FGF 돌연변이체를 적절하게 확인하는 것을 가능하게 하고, FACS에 의해 이러한 집단을 분류할 수 있음을 확인하였다.
논의
이 실시예에서는 효모 디스플레이 플랫폼을 사용하여 단백질분해에 안정적인 성장 인자를 조작하기 위한 고속대량의 일반화가능 스크리닝 방법의 개발을 기재하며, 유동-활성화 세포 분류가 기재되어 있다. 예로서, 매우 불안정한 성장 인자인 FGF1에 대한 스크린의 설정이 제공된다.
관심 성장 인자에 대한 스크리닝을 확립할 때, 제1 단계는 성장 인자가 효모의 표면 상에서 발현될 수 있고 이의 수용체의 가용성 형태에 결합할 수 있음을 보장하는 것이다. FGF1이 Aga2 효모 디스플레이 단백질에 대한 C-말단 융합체로서 pCT 벡터에서 발현될 수 있고, FGFR1-Fc에 특이적으로 결합함을 확인하였다. 과거에는, VEGF, EGF, 및 HGF가 효모 디스플레이에 의해 성공적으로 발현되었다6,26,27. 이는 효모-디스플레이-기반 단백질분해 스크리닝 방법이 또한 다른 성장 인자에도 더 일반적으로 적용될 수 있음을 시사한다. 성장 인자가 pCT 벡터에서 발현될 수 없는 경우, pTMY 벡터는 대신 Aga2에 대한 N-말단 융합체로서 성장 인자를 성공적으로 발현하는 데 사용될 수 있었다. HGF의 경우에, pCT 벡터에서 발현될 수 없었지만, pTMY에서는 성공적으로 발현되었다.
제2 단계는 단백질분해 스크린에 사용될 프로테아제를 결정하는 것이었다. 본 발명자들은 효모-디스플레이 FGF1을 조작하기 위한 혈청, 트립신, 키모트립신, 및 플라스민의 사용을 테스트하였다. 본 발명자들은 소태아혈청(FBS)이 심지어 고농도에서도 너무 약한 선택적 압력을 제공한다는 것을 발견하였다. 프로테아제가 FBS에서 발견되지만, FBS에서 발견되는 프로테아제 저해제, 예컨대, α-1-항프로테이나제 및 α-1-항키모트립신은 이의 활성을 낮출 수 있다28. FGF1이 특히 불안정한 성장 인자라는 것을 고려하면, FBS는 또한 다른 성장 인자를 조작하기 위한 적절한 선택적 단백질분해 압력이 아닐 가능성이 높다. 그러나, 조성이 상이한 다른 유형의 혈청, 예컨대, 신생아 송아지 혈청, 성체 소 혈청, 또는 인간 혈청을 고려할 수 있었다. 본 발명자들은 문헌에서 단백질의 단백질분해 안정성을 측정하는 데 일반적으로 사용되는 프로테아제인 트립신 및 키모트립신의 사용을 테스트하였다. 이는 트립신과 키모트립신이 활성이 높고 특이성이 낮아, 특정 분해 속도에서 거의 모든 단백질을 절단할 수 있기 때문일 수 있다29. 그러나, 이러한 특성은 단백질분해 안정성 스크린에 사용하기에는 이들 프로테아제를 매력적이지 않게 할 수 있다. 본 발명자들은 트립신의 경우, 발현(c-myc) 신호의 많은 손실이 효모 디스플레이 단백질의 비-특이적 절단으로 인한 것이며, 이는 트립신이 임의의 성장 인자의 단백질분해 안정성 스크리닝에 대한 적합하지 않은 후보로 만든다는 것을 발견하였다. 키모트립신은 상당한 수준의 비-특이적 절단을 나타내지 않는 것으로 보였지만, 프로테아제는 주로 소화관에서 발견되고 혈류의 성장 인자와 생물학적으로 관련이 없을 것 같다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 마지막으로, 본 발명자들은 사실상 모든 조직에서 발견되고 FGF1을 분해하는 것으로 나타난 프로테아제인 플라스민의 사용을 테스트하였다13,25. 플라스민은 또한 다른 성장 인자, 예컨대, VEGF의 분해와 관련이 있다30. 본 발명자들은 플라스민이 효모 디스플레이 FGF1을 특이적으로 절단할 수 있으며, 효모 디스플레이 단백질은 상대적으로 적게 비-특이적 절단을 할 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명자들이 테스트할 수 있었던 프로테아제를 기반으로, 본 발명자들은 플라스민이 스크린에 있어서 선택적 압력으로서 사용하기에 가장 적절한 프로테아제가 될 것이라는 결론을 내렸다. 성장 인자와 생물학적으로 관련이 있는 다른 프로테아제, 예컨대, 엘라스타제, uPA, 카텝신, 및 MMP는 또한 기재된 바와 같은 효모 디스플레이 단백질의 높은 성장-인자-특이적 절단 및 낮은 비-특이적 절단에 대해 테스트함으로써 검증될 수 있다.
스크린 설정의 마지막 단계는 단백질분해 안정성이 상이한 성장 인자 돌연변이체가 구별될 수 있는지 여부를 결정하는 것이다. 이 선택적인 단계는 단백질분해에 안정적인 돌연변이체를 선택하는 스크린의 능력에 대한 확신을 제공하는 중요한 기준점을 제공한다. FGF1에 있어서, 본 발명자들은 열 안정성 및 단백질분해 안정성이 증가된 FGF1 돌연변이체인 PM2가 효모의 표면 상에서 디스플레이될 때 야생형 FGF1과 구별될 수 있음을 확인하였다. 이용 가능한 단백질분해 안정화된 성장 인자 돌연변이체의 부재시, 프로테아제가 효모 디스플레이 단백질의 높은 성장 인자-특이적 절단 및 낮은 비-특이적 절단을 나타내는 한 스크린은 여전히 수행될 수 있다. 실시예 2에서, 본 발명자들은 본 발명자들이 개발한 방법을 사용하여 단백질분해 안정성을 위한 FGF1의 조작을 보고한다.
물질 및 방법
효모 디스플레이 작제물의 클로닝
효모 디스플레이를 위해 인간 FGF1 cDNA(MGC 클론: 9218, 이미지(IMAGE): 3896359, 잔기: Phe16에서 Asp155)를 pCT 벡터(제한 부위: NheI, BamHI)로 FGF1을 클로닝하였다. 단백질분해에 안정적인 FGF1 돌연변이체인 PM2의 경우, 부위-지정 돌연변이유발을 사용하여 FGF1에 대하여 돌연변이 Q40P(CAA에서 CCA), S47I(TCC에서 ATC), 및 H93G(CAT에서 GGT)가 이루어졌다.
효모-디스플레이 FGF1에 대한 결합 분석
50,000개의 유도된 효모 세포를 실온에서 1 g/ℓ BSA(PBSA)가 있는 인산염 완충 식염수 중에서 다양한 농도의 인간 FGFR1 베타(IIIc)-Fc(R&D Systems)와 함께 인큐베이션하였다. 리간드 고갈을 회피하기 위해 충분히 많은 양으로 그리고 평형에 도달하는 데 충분한 긴 시간(전형적으로 3 내지 24시간)으로 세포를 인큐베이션하였다. 인큐베이션 마지막 30분 동안, PBSA 중에서 닭 항-c-Myc(Invitrogen)의 1:2500 희석물과 함께 효모 세포를 인큐베이션하였다. 효모를 펠릿화하고 세척한 다음, 얼음 상에서 10분 동안 2차 항체, 즉, 항-c-myc에 대한 항-인간 IgG-FITC(Sigma Aldrich) 및 항-닭-IgY-PE(Santa Cruz Biotechnology)의 1:200 희석물과 함께 인큐베이션하였다. 효모를 세척하고, 펠릿화한 다음 PBSA에 재현탁시킨 직후 EMD Millipore Guava EasyCyte를 사용하여 유세포분석에 의해 분석하였다. FlowJo(FlowJo)(v7.6.1)를 사용하여 유세포분석 데이터를 분석하였다. 결합 곡선을 플롯팅하고 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 6을 사용하여 Kd 값을 얻었다.
스크리닝을 위한 단백질분해 안정성 분석
소태아혈청(Gibco), 소 췌장 유래의 트립신(Sigma Aldrich), 소 췌장 유래의 VII형 키모트립신(Sigma Aldrich), 또는 인간 혈장 유래의 플라스민(Sigma Aldrich)을 인큐베이션을 위한 프로테아제 또는 프로테아제 혼합물로서 사용하였다. 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium; Gibco)에 소태아혈청을 희석하였다. 트립신 완충액(100mM 트리스(Tris)-HCl(pH 8), 1mM CaCl2, 1% BSA)에 트립신 및 키모트립신을 희석하였다. 플라스민 완충액(100mM 트리스-HCl, 0.01% BSA, pH 8.5)에 플라스민을 희석하였다.
적절한 완충액 중에서 1백만개의 유도된 효모 세포를 다양한 농도의 프로테아제와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션의 종료 시, 세포를 PBSA(PBS + 0.1% BSA)로 1회 세척하고 완충 프로테아제 저해제 칵테일(Sigma Aldrich)에 재현탁하여 잔류 프로테아제 활성을 퀀칭시켰다. 5분 후, 세포를 PBSA로 1회 더 세척하였다. FGFR 결합 활성을 측정한 실험의 경우에만, 세포를 pBSA 중 10nM 인간 FGFR1 베타(IIIc)-Fc(R&D Systems)에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 최종 세척 후, 세포를 적절한 형광 항체와 함께 인큐베이션하였다.
FGFR1 결합 활성 및 c-myc 신호를 측정하는 실험을 위해, PBSA 중에서 닭 항-c-Myc(Invitrogen)의 1:2000 희석물과 함께 세포를 30분 동안 인큐베이션하였다. 세척한 다음, 세포를 얼음 상에서 10분 동안 2차 항체(항-c-myc에 대한 항-인간 IgG-FITC(Sigma Aldrich) 및 항-닭-IgY-PE(Santa Cruz Biotechnology))에서 인큐베이션하였다.
HA 및 c-myc 신호를 측정하는 실험을 위해, 항-HA-Tag(6E2) 마우스 mAb(Cell Signaling)의 1:1000 희석물 및 닭 항-c-Myc(Invitrogen)의 1:2000 희석물과 함께 세포를 30분 동안 인큐베이션하였다. 세척한 다음, 세포를 얼음 상에서 10분 동안 2차 항체(염소 항-마우스-PE(Invitrogen) 및 염소 항-닭-IgY-AlexaFluor488(Santa Cruz Biotechnology))에서 인큐베이션하였다.
효모를 세척하고, 펠릿화한 다음 PBSA에 재현탁시킨 직후 EMD Millipore Guava EasyCyte를 사용하여 유세포분석에 의해 분석하였다. FlowJo(v7.6.1)를 사용하여 유세포분석 데이터를 분석하였다. 결합 곡선을 플롯팅하고 그래프패드 프리즘 6을 사용하여 Kd 값을 얻었다.
실시예
2: 단백질분해 안정화 섬유아세포 성장 인자의 조작
요약
FGF1은 상처 치유, 조직 재생, 종양 형성, 및 다른 혈관신생-의존성 질환 동안 세포 분화 및 혈관신생의 유도에 중요한 역할을 한다. 따라서, FGF1을 기반으로 한 효현제 및 길항제는 세포 배양 및 단백질 치료제에 중요한 응용을 가질 수 있다. 그러나, FGF1은 배양물에서 프로테아제에 노출될 때 분해에 대한 민감성을 나타내는 것으로 보고되었다. 이의 좋지 않은 단백질분해 안정성은 세포 배양물에서 또는 치료용 분자로서 개발될 때 이들의 활성 및 효능을 저해할 수 있다. 이 실시예에서, 실시예 1에 기재된 호모 디스플레이-기반 스크리닝 방법을 사용하여 단백질분해 안정성을 위해 FGF1 펩타이드를 조작하였다. 단백질분해에 안정적인 FGF를 선택하고 특성화를 위한 후보를 성공적으로 식별하기 위한 게이팅 전략들(gating strategies)을 탐색하였다.
도입
섬유아세포 성장 인자(FGF)는 배아 발달, 세포 분화, 세포 증식, 세포 이동, 혈관신생, 대사, 및 상처 치유를 포함한 생물학적 활성을 조절하는 중요한 성장 인자 패밀리의 일부이다1 ,31-35. 따라서, FGF-기반 치료제는 암 치료, 상처 치유, 조직 재생, 및 대사 장애의 치료에 적용되는 데 관심이 있다32 ,36,37. 많은 FGF 패밀리 구성원 중에서, FGF1은 FGFR1 및 FGFR2를 통해 신호전달함으로써 내피 세포에서 혈관신생 유발(pro-angiogenic) 표현형을 유도하는 것으로 알려진 가장 중요한 FGF 리간드 중 하나로서 특히 관심이 있다38.
FGF1은 기능성 혈관을 퇴행으로부터 보호하고, 동맥 성장을 유도하며, 모세혈관 증식을 촉진시키는 것으로 보고되었다39 ,40. 인간 제대 혈관 내피 세포(HUVEC)의 튜브 형성 및 Matrigel 플러그 분석에서 혈관의 형성을 유도하는 것으로 밝혀졌다41.
상처 치유 및 조직 재생을 위한 혈관신생의 유도에서 FGF1의 효능에도 불구하고, 치료제로서 FGF1을 이용하려는 노력은 대체로 성공적이지 못했다. FGF1을 인코딩하는 주사가능한 근육내 플라스미드 플라스미드 형태의 유전자 요법은 말기 하지 허혈 환자에서 관류를 개선시키고 절단에 대한 필요성을 감소시키기 위해 I상 및 II상 임상 연구에서 나타냈다42 ,43. 그러나, 중증 하지 허혈 환자에서 절단 또는 사망률의 감소에 대한 III상 임상 연구에서 임상 효능을 나타내지 못하였다44. CardioVascular BioTherapeutics는 또한 궤양, 관상 심장 질환, 및 말초 동맥 질환의 치료를 위해 재조합 야생형 FGF1(CVBT-141)을 개발하였지만, 임상 시험은 거의 20년 동안 성공하지 못하였다45.
재조합 FGF1이 많은 임상 적용에서 효과적이지 못한 것은 부분적으로 이의 좋지 않은 안정성에서 기인한 것일 수 있다. 야생형 FGF1은 대략 25분의 분해 반감기로 컨디셔닝된 배지 또는 배양물에서 37℃에서 배양시 빠르게 분해된다14 ,21. 구체적으로 상처 치유 부위에서 발견되는 핵심 프로테아제인 플라스민은 FGF1 및 FGF2를 둘 다 분해시킬 수 있는 것으로 나타났다25 ,46,47.
이 실시예는 실시예 1에 기재된 개발된 스크리닝 방법을 사용하여 플라스민에 대한 단백질분해 안정성의 개선을 위한 FGF1의 조작을 설명한다. 유전자-대-단백질 연결을 확립하기 위해 효모 표면 디스플레이 플랫폼을 사용하여 FGF1을 조작하였다. 각각의 성장 인자에 대한 무작위 돌연변이유발 라이브러리를 FGFR1 결합제, 그 다음 프로테아제와 함께 인큐베이션한 후 절단되지 않은 상태로 남아있는 돌연변이체, 그리고 마지막으로 프로테아제와 함께 인큐베이션한 후 절단되지 않은 상태로 남아있으며 FGFR1 결합을 유지하는 돌연변이체에 대해 스크리닝하였다. 각각의 성장 인자에 대한 단백질분해 안정성을 증가시키는 것으로 보이는 몇 가지 유망한 돌연변이를 확인하였고 실시예 3에 기재된 바와 같이 특성화를 위한 후보를 생성하였다.
결과
야생형 FGF의 효모 디스플레이 및 무작위 돌연변이유발 라이브러리의 생성
적절하게 접힌 야생형 FGF1의 성공적인 효모 디스플레이는 하기에 기재되어 있다. 오류 발생 가능성이 높은 PCR을 뉴클레오타이드 유사체와 함께 사용하여 야생형 FGF1 내에 돌연변이를 무작위로 생성하였다. 본 발명자들은 3.3×107개의 돌연변이로 라이브러리를 생성하였다. 뉴클레오타이드 유사체의 농도를 변화시킴으로써, 돌연변이체당 평균 3.1개의 돌연변이(2.1% 돌연변이율)를 생성할 수 있었으며, 이는 단백질분해가 개선된 돌연변이체를 생성하기에 충분히 높고 적절한 단백질 접힘 또는 FGFR1 수용체에 대한 결합 친화성을 손상시킬 돌연변이의 축적을 회피할 수 있을 만큼 충분히 낮은 다양성이라고 가정하였다.
분류 1: FGFR1-Fc에 대한 결합제 선택
제1 분류를 위해, FGFR1-Fc에 대한 결합 친화성을 유지한 FGF1 돌연변이체를 분류하였다(도 12a). 대부분의 무작위 돌연변이는 결합 친화성의 상실로 이어질 것이라고 가정하였다. FGFR1-Fc와 함께 인큐베이션한 후, 본 발명자들은 높은 발현(α-c-myc) 및 높은 결합 신호(α-FGFR1-Fc)를 나타내는 세포를 게이팅하고 수집하였다. FGF1 라이브러리의 경우, 비-결합제인 돌연변이체와 FGFR 결합 친화성을 유지한 돌연변이체 사이의 명확한 분리가 관찰되었다(도 12b).
분류 2: FGF1-특이적 절단에 대한 내성 선택
제2 분류의 경우, 분류 1로부터의 세포를 확장시키고 플라스민과 함께 인큐베이션할 때 절단에 대한 내성을 유지하는 FGF1 돌연변이체를 분류하였다(도 13a). 효과적인 동적 범위를 얻고 단백질분해 안정성이 상이한 돌연변이체를 구별하기 위해, 다양한 농도 및 인큐베이션 기간으로 세포의 인큐베이션을 테스트하였다. FGF1 라이브러리의 경우, 절단된 돌연변이체와 절단되지 않은 돌연변이체 집단 사이의 명확한 분리를 달성하기 위해 36시간 동안 400nM 플라스민과 함께 인큐베이션하는 것이 필요하다는 것을 발견하였다(도 13b). 발현 수준(α-HA)에 의해 정규화된 가장 높은 수준의 프로테아제 내성을 나타내는 세포의 상위 1 내지 2%를 수집하였다(높은 α-c-myc).
스크리닝 동안 펩타이드 인공물의 단리.
FGF1 라이브러리의 제2 분류를 확장하고 여기에 HA 및 c-myc 신호를 사용하여 FGF1-특이적 절단에 대한 내성에 대하여 또 다른 선택 라운드를 수행하였다. 36시간의 인큐베이션 동안 200nM 플라스민과 함께 인큐베이션할 때, 라이브러리의 나머지와 비교하여 훨씬 더 높은 c-myc 신호를 나타낸 세포 집단이 플라스민에 의한 절단에 대한 효모 디스플레이 단백질의 현저하게 더 큰 내성을 나타내는 것이 명확하게 관찰되었다(도 14A). 이러한 집단을 수집하고 분석을 위해 개별 클론을 서열결정하였다(도 14B). 대부분의 세포는 세포 표면 상에 FGF2 돌연변이체를 발현하지 않지만, 대신 무작위 돌연변이유발 동안 생성되었을 수 있는 짧은 펩타이드 인공물을 발현하는 것을 발견하였다.
이들 펩타이드는 FGFR1-Fc에 대한 임의의 특이적 결합을 나타내지 않은 것으로 확인되었으며, 이는 FGF1-특이적 절단에 대한 내성에 대한 분류가 이들 펩타이드 인공물을 발현하는 매우 작은 세포 집단의 신속한 풍부화를 야기함을 나타낸다(도 15). 따라서, 모든 후속 분류에 대해, 본 발명자들은 FGFR1 결합 친화성을 유지하기 위한 선택적 압력을 포함하는 것을 계속하였다.
분류 3 내지 4: 프로테아제-저항성인 FGFR1-Fc 결합제에 대한 선택
나머지 분류 3 및 4의 경우, 라이브러리를 플라스민과 함께 인큐베이션한 다음, 선택 전에 FGFR1-Fc와 함께 인큐베이션하였다(도 16). α-HA, α-c-myc, 및 α-FGFR1-Fc의 상이한 조합을 사용하여 절단되지 않은 상태로 남아있고 FGFR1에 대한 결합 친화성을 유지하는 FGF1 돌연변이체에 대해 선택하였다.
FGF1의 제3 분류의 경우, 본 발명자들은 분류 2로부터의 세포를 확장하고 플라스민과 함께 인큐베이션한 후 FGFR1 결합을 유지하는 FGF 돌연변이체에 대해 분류하였다(도 17). 더 높은 농도의 플라스민과 함께 12시간 인큐베이션을 수행하였다. 궁극적으로 FGF1 라이브러리를 분류하는 데 1.5μM 플라스민을 사용하였다. 본 발명자들은 높은 결합 신호(α-FGFR1-Fc) 및 높은 발현(α-HA)을 나타낸 세포에 대해 게이팅하고 이를 수집하였다.
FGF1의 제4 분류의 경우, 본 발명자들은 분류 3으로부터의 세포를 확장하고 12시간에서 36시간으로 플라스민 인큐베이션 시간을 증가시켰다. 분류 3으로부터의 세포를 1.5μM 플라스민 또는 500nM 플라스민에서 인큐베이션하였다. 본 발명자들은 궁극적으로 500nM 플라스민과 함께 인큐베이션한 세포를 분류하였다(도 18). 본 발명자들은 절단에 대한 높은 내성(α-c-myc) 및 높은 결합 신호(α-FGFR1-Fc)를 나타낸 세포에 대해 게이팅하고 이를 수집하였다. 분류 4에 의해, FGF1 라이브러리에 대한 완전한 컨센서스에 도달하였고 이를 포착하여 추가적인 분류 라운드를 수행하였다.
분류된 FGF1 돌연변이체의 서열 분석
최종 분류 4의 경우, 개별 클론을 무작위로 선택하고 분석을 위하여 서열결정하였다. 본 발명자들은 4개 라운드의 분류 내에서 완전한 컨센서스에 도달할 수 있었다. 돌연변이체(BS4M1)는 2개의 돌연변이, 즉, D28N 및 L131R을 포함한다(도 19). 아스파르트산 28은 FGF1의 6-가닥 β-배럴 구조를 폐쇄시키는 3개의 핵심 β-헤어핀 중 첫번째 부분(LPDG)이다. 류신 131은 FGF1의 N-말단과 C-말단 사이의 β-가닥 쌍 내에서 발견된다.
논의
이 실시예에서, 플라스민에 대한 단백질분해 안정성을 위한 FGF1의 조작이 기재되었다. 제1 단계로서, 본 발명자들은 야생형 FGF1 및 야생형 FGF2를 성공적으로 발현할 수 있었다. 단백질은 FGFR1-Fc 또는 sFGFR3-D2D3-Fc에 대한 특이적 결합에 대한 c-myc 태그 테스트의 검출에 의해 성공적으로 발현되고 적절하게 접히는 것으로 나타났다. FGF1은 상대적으로 높은 발현 신호를 나타내는 것으로 관찰되었으며, 이는 FGF1이 짧은 반감기 및 낮은 용융 온도로 불안정한 것으로 간주된다는 것을 고려할 때 흥미롭다21. 효모 디스플레이 발현 및 분비 효율은 안정성이 좋지 않은 단백질에 대한 단백질 안정성과 살짝 상관관계가 있는 것으로 보고되지만, 항상 그런 것은 아니다48 ,49. 따라서, 이 실시예는 호모 디스플레이가 조작을 위한 불안정한 야생형 성장 인자의 발현을 제공할 수 있음을 입증하였다.
효모 디스플레이에 의한 FGF1의 높은 발현은 FGF1 무작위 돌연변이유발 라이브러리의 분류 및 후속 분류 동안 우수한 동적 범위의 신호를 야기하였다. FGF1 분류에는 엄격함을 증가시키기 위해 높은 농도의 플라스민과 긴 인큐베이션 시간이 적용될 수 있었다. 이는 특히 분류 2에서 가치가 크며, 여기서 절단된 FGF1 돌연변이체와 절단되지 않은 FGF1 돌연변이체 사이의 명확한 분리가 달성되었다.
분류 1에서 FGFR 결합제를 선택하기 위해 초기 분류 라운드를 수행하였지만, 본 발명자들은 단지 절단을 측정하기 위해 HA 및 c-myc 신호를 사용하면 분류에서 비-FGFR-결합 펩타이드의 신속한 풍부화를 야기한다는 것을 발견하였다. 단지 2가지의 이와 같은 분류에서, 라이브러리의 나머지로부터 펩타이드-발현 집단의 명확한 분리가 확인되었다. 스캐폴드로서 야생형 FGF를 이용한 무작위 돌연변이유발에 의해 라이브러리를 구축하였지만, 무작위 돌연변이유발 과정에서의 드문 오류는 아마도 극히 적은 세포 집단이 펩타이드 인공물을 발현하게 하였다. 이러한 인공물은 친화성 성숙을 위한 보다 전통적인 효모 디스플레이 스크리닝에 대하여 거의 중요하지 않지만, 이들 인공물은 수용체 결합에 대한 선택적 압력 없이 빠르게 유의해졌다. 따라서, 결합 친화성을 측정하기 위한 선택적 압력이 필수적이며, 절단 활성만을 기반으로 돌연변이체를 선택함으로써 하나 초과의 분류를 수행해서는 안된다는 결론을 내렸다.
스크리닝 과정을 통해, 본 발명자들은 단백질분해 안정성을 개선시키는 데 중요할 수 있는 몇 가지 풍부화 돌연변이를 확인하였다. 흥미롭게도, 돌연변이는 단백질의 β-루프 영역에서 또는 C-말단 근처에서 발견되며, 이는 단백질 안정성을 결정하기 위한 핵심 영역과 관련이 있다. FGF1 라이브러리의 경우, 4개 라운드의 분류 내에서 완전한 컨센서스에 도달하였다. FGF1 BS4M1 돌연변이체는 2개의 돌연변이, 즉, D28N 및 L131R을 포함한다. 아스파르트산 28은 FGF1의 6-가닥 β-배럴 구조를 폐쇄시키는 3개의 핵심 β-헤어핀 중 첫번째 부분(LPDG)이다. FGF1의 안정성에 기여하는 Asx-Pro-Asx-Gly 모티프의 중요성은 이전에 연구되었으며, Asx 잔기를 알라닌으로 치환하는 것은 FGF1을 크게 불안정화시키는 것으로 나타났다50. 그러나, D28N의 치환은 실제로 깁스(Gibbd) 자유 에너지를 약 2.5 kJ/㏖만큼 증가시키는 것으로 나타났으며, 이는 단백질분해 안정성이 열안정성과 항상 상관관계가 있지 않을 수 있음을 시사한다. 류신 131은 FGF1의 N-말단과 C-말단 사이의 β-가닥 쌍 내에서 발견된다. 이러한 β-가닥 쌍에 인접한 β-배럴 구조를 안정화시키는 β-헤어핀이 없기 때문에, 이 쌍에서 아미노산이 2개 가닥 사이의 결합 강도에 의해 또는 β-배럴 구조를 폐쇄시키는 방식으로 주요 사슬이 위치하는 것을 입체적으로 유리하게 함으로써 배럴을 안정화시키는 데 중요하다고 가정하였다. 실제로, 프롤린 134의 시스테인, 트레오닌, 또는 발린으로의 돌연변이는 FGF1의 안정성을 -6 내지 -8 kJ/㏖만큼 증가시키는 것으로 나타났다51.
결론적으로, 단백질분해 안정성에 대한 스크린은 문헌에서 FGF1 단백질 안정성에 중요하다고 보고된 위치에서 돌연변이를 성공적으로 풍부하게 할 수 있는 것으로 나타났다. 실시예 3에서, 본 발명자들은 가용성으로 발현된 FGF1의 안정성 및 FGF 경로를 조절하는 리간드의 능력에 미치는 영향에 대해 최종 FGF1 BS4M1 돌연변이체에서 확인된 돌연변이를 특성화한다.
물질 및 방법
단백질의 효모 표면 디스플레이
YPD 배지는 20 g/ℓ 덱스트로스, 20 g/ℓ 펩톤 및 10 g/ℓ 효모 추출물로 이루어진다. 선택적 SD-CAA 배지는 20 g/ℓ 덱스트로스, 6.7 g/ℓ 아미노산이 없는 효모 질소성 염기(디프코(Difco)), 5 g/ℓ 카사미노산(박토(Bacto)), 5.4 g/ℓ Na2HPO4, 및 8.56 g/ℓ NaH2PO4·H2O로 이루어진다. SD-CAA 플레이트는 182 g/ℓ 솔비톨 및 15 g/ℓ의 한천이 첨가된 배지와 동일한 구성성분을 포함한다. SG-CAA 유도 배지는 SD-CAA와 동일하지만 덱스트로스 대신에 20 g/ℓ 갈락토스를 포함한다. 235 rpm으로 진탕시키면서 30℃에서 효모를 성장시키고 유도하였다.
pCT 효모 디스플레이 플라스미드를 전기천공에 의해 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) 균주 EBY100으로 형질전환하고 YPD에서 1시간 동안 30℃에서 회수한 후 SD-CAA 플레이트에 도말하였다. 3일 후, 효모 콜로니를 SD-CAA에 밤새 접종하였다. 단백질의 발현 및 효모 디스플레이를 확립된 프로토콜에 따라서 SG-CAA에서 24시간 동안 30℃에서 유도하였다52.
라이브러리 생성
효모 디스플레이를 위해 인간 FGF1 cDNA(MGC 클론: 9218, 이미지: 3896359, 잔기: Phe16에서 Asp155)를 pCT 벡터(제한 부위: NheI, BamHI)로 FGF1을 클로닝하였다. 앞서 기재된 바와 같이 오류 발생 가능성이 높은 PCR을 사용하여 FGF1 무작위 돌연변이유발 라이브러리를 생성하였다52 ,53. FGF1을 주형으로서 사용하고, 택(Taq) 중합효소(New England Biolabs) 및 뉴클레오타이드 유사체 8-옥소-dGTP 및 dPTP(TriLink Biotech)를 사용하여 돌연변이를 도입하였다. 정방향 및 역방향으로 pCT 플라스미드와 50 bp 중첩을 포함하는 프라이머를 사용하여 효모 상동성 재조합을 통해 pCT 벡터로 돌연변이 유전자의 삽입이 가능하게 하였다. 다양한 돌연변이 빈도를 가지는 클론을 얻기 위해, 다양한 농도의 뉴클레오타이드 유사체(40μM, 20μM, 10μM, 5μM, 2.5μM, 1.25μM)를 이용하여 20회의 PCR 주기에 걸쳐 6가지의 PCR을 수행하였다. PCR 생성물을 뉴클레오타이드 유사체의 부재 하에 증폭시키고 겔 전기영동을 사용하여 정제하였다. NheI 및 BamHI를 이용하여 벡터로서 pCT 플라스미드를 분해하였다. 5㎍의 정제된 DNA 삽입물과 1㎍의 제한 효소 분해 pCT의 8가지 형질전환체를 전기적격성(electrocompetent) EBY100 효모 세포로 전기천공하였다. 형질전환된 효모 세포를 YPD에서 1시간 동안 30℃에서 회수한 다음, 선택적 SD-CAA 배지에서 성장시켰다. 각각의 PCR로부터의 클론을 샘플링하여 돌연변이발생 빈도를 결정하였다. 5μM 및 2.5μM PCR로부터의 클론을 조합하여 클론 당 평균 3개의 돌연변이가 있는 최종 라이브러리를 생성하였다. 2회 계대 후, 세포를 SG-CAA로 옮겨 단백질 발현을 유도하였다. 희석 도말(dilution plating)에 의해 추정된 바와 같이 2×107개의 형질전환체의 라이브러리 크기를 얻었다.
라이브러리 스크리닝
FGF1 돌연변이체를 디스플레이하는 유도된 EBY100 효모 세포를 각각의 분류에 대해 기재된 바와 같이 37℃에서 플라스민 분해 완충액(100mM 트리스-HCl, 0.01% BSA, pH 8.5) 중 플라스민과 함께 및/또는 실온에서 PBS + 0.1% BSA(PBSA) 중 FGFR1-Fc와 함께 인큐베이션하였다. 프로테아제 분해 단계 후, 세포를 PBSA로 세척하고, PBSA 중 프로테아제 저해제 칵테일(Sigma)의 1:100 희석물과 함께 5분 동안 인큐베이션 한 다음, PBSA로 다시 세척하였다. FGFR 인큐베이션 단계 후, 세포를 PBSA로 세척하였다. 각각의 분류에 대해 인큐베이션한 효모 세포의 수는 이전 분류에서 수집한 세포 수의 약 10배였다. ㎖당 2백만개 세포의 밀도의 부피로 세포를 인큐베이션하였다. 모든 인큐베이션 단계 후, 세포를 1차 및 2차 항체로 염색하였다. 1차 염색을 위해, 세포를 항-HA-태그(6E2) 마우스 mAb(Cell Signaling)의 1:1000 희석물 및/또는 닭 항-c-Myc(Invitrogen)의 1:2000 희석물과 함께 30분 동안 적절하게 인큐베이션하였다. 1차 염색 후 세포를 PBSA로 세척하였다. 2차 염색을 얼음 상에서 10분 동안 수행하였다. 2차 염색을 위해, 각각의 분류에 다음 항체를 사용하였다: 분류 1, 3, 4 - 항-c-myc에 대한 항-닭-IgY-PE(Santa Cruz Biotechnology) 및 FGFR1-Fc에 대한 항-인간 IgG-FITC(Sigma Aldrich); 분류 2 - 염소 항-마우스-PE(Invitrogen) 및 염소 항-닭-IgY-AlexaFluor488(Santa Cruz Biotechnology).
표지된 효모 세포를 BD FACS Aria II(Stanford Shared FACS Facility)를 사용하여 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 표지화 효모 세포를 분류하였다. 각각의 분류에서, 각각의 분류에 대해 설정된 기준을 기반으로 0.5 내지 10%의 효모 세포를 수집하였다. 5 내지 8의 OD에 도달할 때까지 각각의 분류에서 수집된 세포를 며칠 동안 SD-CAA(박테리아 오염을 제한하기 위해 pH 5)에서 성장시켰다. 다음 라운드의 분류 이전에 SG-CAA에서 24시간 동안 30℃에서 효모 디스플레이 발현을 위해 클론을 유도하였다.
서열결정 및 클로닝을 위해, 자이모프렙 효모 플라스미드 미니프렙 I 키트(Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep I Kit)(Zymo Research)를 사용하여 효모 세포로부터 플라스미드 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA를 DH10B 전기적격성 세포에 형질전환하고 도말하였다. 단일 콜로니를 선택하고 LB 배지(Fisher Scientific)에서 성장시켰다. 플라스미드 미니프렙 키트(GeneJet)를 사용하여 단일 콜로니 배양물로부터 플라스미드 DNA를 단리하였다. MCLAB에 의해 DNA 서열결정을 수행하였다.
효모-디스플레이 펩타이드 RTTTS 및 HTTS에 대한 결합 친화성 분석
50,000개의 유도된 효모 세포를 실온에서 1 g/ℓ BSA(PBSA)가 있는 인산염-완충 식염수에서 다양한 농도의 FGFR1-Fc와 함께 인큐베이션하였다. 리간드 고갈을 회피하기 위해 충분히 많은 부피로 그리고 평형에 도달하는 데 충분한 긴 시간(전형적으로 3 내지 24시간)으로 세포를 인큐베이션하였다. 인큐베이션 마지막 30분 동안, PBSA에서 닭 항-c-Myc(Invitrogen)의 1:2500 희석물과 함께 효모 세포를 인큐베이션하였다. 효모를 펠릿화하고 세척한 다음, 얼음 상에서 10분 동안 2차 항체, 즉, FGFR1-Fc에 대한 항-인간 IgG-FITC(Sigma Aldrich) 및 항-c-myc에 대한 항-닭-IgY-PE(Santa Cruz Biotechnology)의 1:200 희석물과 함께 인큐베이션하였다. 효모를 세척하고, 펠릿화한 다음 PBSA에 재현탁시킨 직후 EMD Millipore Guava EasyCyte를 사용하여 유세포분석에 의해 분석하였다. FlowJo(v7.6.1)를 사용하여 유세포분석 데이터를 분석하였다. 결합 곡선을 플롯팅하고 그래프패드 프리즘 6을 사용하여 Kd 값을 얻었다.
실시예 3: 단백질분해 안정화된 섬유아세포 성장 인자의 특성화
요약
단백질분해 안정성은 불안정한 성장 인자, 예컨대, FGF1의 효능을 개선시키는 데 중요한 역할을 할 수 있다. 연구에 따르면, FGF1은 부분적으로 혈청에서 발견되거나 세포에 의해 발견되는 프로테아제로 인해 배양물에서 빠르게 분해되는 것으로 나타났다. 실시예 2에서, 단백질분해 안정성의 증가를 위한 FGF1의 조작이 기재된다. 본 발명자들은 표면 효모에서 향상된 단백질분해 안정성을 나타낸 FGF1 돌연변이체에 대한 FGF1 무작위 돌연변이유발 라이브러리를 스크리닝하였다. 이 예에서, 가용성 FGF1의 재조합 발현 및 FGF1에서 단백질분해 안정성을 개선시키기 위한 고속대량 스크린에 의해 확인된 돌연변이의 특성화가 기재되어 있다. FGF1 및 FGF2는 이. 콜라이 발현 시스템에서 재조합적으로 발현되고 정제되었다. FGF1 BS4M1(D28N, L131R) 및 L131R 돌연변이체는 야생형 FGF1과 비교하여 단백질분해에 더 안정적이고 FGF1 L131R 돌연변이체는 강력한 FGF 경로 길항제 역할을 하는 것을 확인하였다.
도입
FGF1은 혈관신생 유도를 위한 강력한 조절 분자이지만, 이의 좋지 않은 안정성은 단백질 활성을 유지하고 연장된 효능을 달성하는 능력을 제한한다. 실시예 2에서, ECM 분해를 위한 질환 영역에서 발견된 중요한 프로테아제인 플라스민과 함께 인큐베이션할 때 단백질분해 안정성의 증가를 입증하는 FGF1 돌연변이체를 선택하기 위한 고속대량 스크린의 사용이 기재된다. FGF1 라이브러리의 4가지 분류 후 완전한 컨센서스에 도달하였고 FGF1 BS4M1(D28N, L131R) 돌연변이체를 확인하였다. 돌연변이는 FGF의 안정성에 중요한 것으로 보고된 단백질의 영역에서 발견되었다.
본 실시예에서는, FGF1 BS4M1 돌연변이체로부터 유래된 돌연변이체 FGF의 가용성 발현 및 특성화가 스크리닝에서 확인되었음을 기재한다. 야생형 및 FGF1 BS4M1 돌연변이체를 효모 디스플레이 벡터로부터 클로닝하고 이. 콜라이 발현 벡터내로 삽입하였다. 정제 후, 재조합 FGF1의 적절한 접힘을 효모-디스플레이 FGFR3 작제물에 대한 특이적 결합의 검출에 의해 테스트하였다.
FGF1 BS4M1 돌연변이체 및 야생형 FGF1의 경우, 이들의 가용성 안정성 및 FGF 경로를 조절하는 능력을 추가로 특성화하였다. 플라스민 또는 트립신에서 단백질의 단백질분해 안정성을 테스트하였고, 웨스턴 블롯 및 밴드 강도 정량화를 사용하여 상이한 시점에서의 이들의 분해 정도를 측정하였다. 본 발명자들은 돌연변이 D28N 및 L131R의 중요성과 단백질 안정성에 대한 기여도를 조사하였다. FGF1의 열 안정성을 측정하여 단백질분해 안정성과의 관계를 분석하였다. 보다 생물학적으로 관련된 조건에서 FGF1의 안정성을 테스트하기 위해, MDA-MB-231 유방암 세포 배양물에서 분해 정도를 특성화하였다. 추가적으로, ERK와 같은 FGFR 활성화의 하류에 있는 신호전달 분자의 활성화를 조절하는 능력을 특성화하기 위해 NIH3T3 세포에서 ERK 인산화 분석을 수행하였다. 이러한 특성화 연구로부터의 결과는 조작된 FGF1 돌연변이체의 개선된 단백질분해 안정성 및 길항 활성, 및 항-혈관신생 요법에 사용될 가능성을 입증하였다.
결과
FGF의 재조합 발현
조작된 FGF1 돌연변이체를 가용성 형태로 발현시키고 이를 야생형 단백질과 비교하기 위해, 단백질을 이. 콜라이 발현 시스템에서 재조합적으로 발현시켰다. FGF1 및 FGF1 돌연변이체를 재조합 단백질의 세포내 발현을 위해 pBAD 벡터에 클로닝하였다. 이. 콜라이에서 드물게 사용되는 코돈으로 진핵 단백질의 발현을 향상시키는 이. 콜라이 균주 로세타(Rosetta)로 pBAD FGF1 발현 벡터를 형질전환하였다. 세제-기반 용액을 사용하여 세포를 용해시켰다. 그 다음, Ni-NTA 칼럼 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 정제하였다. 야생형 FGF1의 동일성 및 순도를 쿠마씨-염색 단백질 겔 및 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다(도 20a). 효모-디스플레이 FGFR3 작제물에 대한 특이적 결합을 관찰함으로써 FGF1의 적절한 접힘을 확인하였다(도 20b).
플라스민에서 FGF1 돌연변이체 BS4M1의 단백질분해 안정성
야생형 FGF1 및 FGF1 돌연변이체 BS4M1(D28N/L131R)의 단백질분해 안정성을 측정하기 위해, 100ng의 가용성 FGF를 다양한 인큐베이션 시간 동안 플라스민에서 인큐베이션하였다. 그 다음, 웨스턴 블롯에서 샘플을 실행하고 항-FGF에 대하여 염색함으로써 이의 분해 속도를 평가하였다. 각각의 조건에 대한 밴드 강도를 측정하고 플라스민 인큐베이션 없는 단백질의 밴드 강도에 의해 정규화함으로써 잔류 FGF의 양을 계산하였다. BS4M1(D28N, L131R) 돌연변이체는 야생형 FGF1과 비교하여 플라스민에서의 모든 인큐베이션 시점에서 더 낮은 수준의 분해를 나타냄을 발견하였다(도 21). 따라서, 플라스민에 대한 FGF1의 단백질분해 안정성을 증가시키는 스크리닝이 성공적임을 확인하였다.
BS4M1(D28N 및 L131R)로부터의 돌연변이는 안정화된 PM2(Q40P, S47I, H93G) 돌연변이체에 통합되어 PM3(D28N, Q40P, S47I, H93G, L131R)을 생성하였다. 본 발명자들은 48시간 인큐베이션 후 상이한 플라스민 농도에서 각각의 작제물의 분해를 측정하였다. BS4M1의 돌연변이를 PM2의 돌연변이에 도입하면 모든 테스트 농도에서 단백질 분해에 대한 내성의 현저한 증가를 야기함을 발견하였다(도 22). 따라서, BS4M1에서 새로 확인된 돌연변이는 PM2의 돌연변이와 조합될 때 단백질분해 안정성에 추가적인 영향을 미친다는 결론을 내렸다.
트립신에서 조작된 FGF 돌연변이체의 단백질분해 안정성
야생형 FGF1 및 FGF1 돌연변이체 BS4M1의 단백질분해 안정성을 유사한 방식으로 트립신에서 측정하였다. 플라스민과 트립신이 라이신 및 아르기닌의 동일한 1차 특이성을 공유하기 때문에 플라스민에 대한 단백질분해 안정성을 위한 조작은 트립신에서 단백질분해 안정성을 증가시킬 수 있다고 가정하였다. 추가적으로, 트립신에 의한 분해에 더 내성이 있는 FGF1 돌연변이체 PM2(Q40P, S47I, H93G)는 또한 플라스민에 의한 절단에도 더 내성이 있음을 확인하였다. BS4M1(D28N, L131R) 돌연변이체는 야생형 FGF1과 비교하여 트립신에서의 모든 인큐베이션 시점에서 더 낮은 수준의 분해를 나타냄을 발견하였다(도 23). 따라서, 플라스민에서 FGF1의 단백질분해 안정성을 위한 조작은 또한 트립신에서의 단백질분해 안정성을 증가시키는 데 성공적이라는 결론을 내렸다.
FGF1 돌연변이체 BS4M1에서 돌연변이의 중요성
D28N 및 L131R 돌연변이 둘 다 BS4M1 돌연변이체에 단백질분해 안정성을 부여하는 데 중요한지 여부를 결정하기 위해, D28N 또는 L131R 돌연변이만을 가지는 FGF1의 형태를 생성하였다. 시간 경과에 따라 플라스민에서 분해 속도를 평가함으로써 이러한 돌연변이체의 단백질분해 안정성을 측정하였다. L131R 돌연변이체는 BS4M1(D28N/L131R) 돌연변이체와 비교하여 비슷한 단백질분해 안정성을 나타냈지만, D28N 돌연변이체는 심지어 야생형 FGF1과 비교하여서도 훨씬 더 낮은 단백질분해 안정성을 나타냄을 발견하였다(도 24). D28N 돌연변이는 가용성으로 발현된 단백질에 통합될 때 FGF1의 단백질분해 안정성을 현저하게 증가시키는 것으로 해석되지 않았다는 결론을 내렸다. 따라서, L131R 돌연변이체를 이용한 추가 특성화를 계속하였다.
또한 본 발명자들은 131번 위치에서 아르기닌으로의 돌연변이가 단백질분해 안정성을 부여하는 데 특유한 것인지 여부, 또는 류신에서 떨어진 돌연변이가 중요한지 여부를 결정하고자 하였다. 따라서, 131번 위치를 대안적으로 알라닌(L131A) 또는 라이신(L131K)으로 돌연변이시켜 이들 단일 돌연변이체가 단백질분해 안정성의 향상을 유지하거나 상실했는지 여부를 알아보았다. 이들의 분해율을 플라스민에서 평가하였고; L131K는 L131R과 비교하여 유사한 수준의 분해를 유지한 반면, L131A는 심지어 야생형 FGF1과 비교하여서도 더 높은 수준의 분해를 나타냄을 발견하였다(도 25).
야생형 FGF1 및 FGF1 L131R 돌연변이체의 열 안정성
FGF1 L131R 돌연변이체의 단백질분해 안정성의 개선이 열 안정성의 개선에 기인하는지 여부를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 야생형 FGF1 및 FGF L131R 돌연변이체의 용융 온도를 측정하였다. 본 발명자들은 온도가 점차적으로 증가함에 따라 각각의 단백질의 풀림을 측정하기 위해 소수성 염료와 함께 ThermoFluor 분석을 사용하였다54 ,55. L131R 돌연변이는 야생형 FGF1과 비교하여 용융 온도를 약간 증가시키는 반면, 그 차이는 통계적으로 유의하지 않음을 발견하였다(도 26). 따라서, 열 안정성은 FGF1 L131R 돌연변이체에 대한 단백질분해 안정성 증가에 상당히 기여하지 않는다는 결론을 내렸다.
세포 배양물에서 FGF1 L131R 돌연변이체의 안정성
유로키나제 플라스미노겐 활성화제(uPA)를 발현하여 플라스미노겐을 활성화시키고 플라스미노겐을 플라스민으로 전환시키는 유방암 세포주인 MDA-MB-231과의 배양에서 FGF1 L131R 돌연변이체의 안정성을 테스트하였다. 배양물에서 MDA-MB-231과의 다양한 인큐베이션 시간 동안 500ng의 단백질을 인큐베이션하였다. 각각의 조건에 대하여 모든 단백질을 농축시키고 웨스턴 블롯에 의한 분석을 위해 각각의 조건을 별도의 웰에 로딩하였다. 밴드 강도를 측정하고 배양물에서 인큐베이션되지 않은 500ng의 단백질에 의해 정량화함으로써 남은 단백질 양을 정량화하였다. FGF1 L131R 돌연변이체는 야생형 단백질과 비교하여 배양물에서 증가된 안정성을 나타냄을 발견하였다(도 27).
FGF1 L131R 돌연변이체는 FGFR 길항체이다.
FGF 경로를 조절하는 FGF1 L131R의 능력을 특성화하기 위해, 본 발명자들은 FGFR 활성화의 하류에 있고 세포 증식의 유도에 중요한 핵심 신호전달 분자인 ERK(MAPK)의 인산화를 조절하는 능력을 평가하였다56 ,57. FGFR을 발현하는 NIH3T3 세포를 야생형 FGF1 단독, FGF1 L131R 돌연변이체 단독, 또는 다양한 농도의 FGF1 L131R 돌연변이체와 함께 야생형 FGF1과 함께 인큐베이션하였다. FGF1 L131R 돌연변이체는 ERK 인산화를 유도할 수 없지만, 돌연변이체는 야생형 FGF1에 의한 ERK 인산화를 효과적으로 저해할 수 있음을 발견하였다(도 28). 1nM 야생형 FGF1의 경우, 본 발명자들은 FGF1 L131R 돌연변이체에 의한 ERK 인산화의 저해에 대한 용량--반응 곡선을 생성하였고, 이의 IC50(1nM)이 야생형 FGF1의 농도와 등몰농도임을 발견하였다(도 29).
NIH3T3 세포에 대한 FGF1 L131R 돌연변이체의 결합
FGF1 L131R 돌연변이체의 결합 친화성을 특성화하고 야생형 FGF1과 비교하였다. FGFR을 발현하는 NIH3T3 세포를 인큐베이션을 방지하기 위해 4℃에서 다양한 농도의 FGF1과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 형광으로 태그된 항-His 항체로 표지화하여 결합된 His-태그 FGF1을 검출하였다. FGF1 WT 및 FGF1 L131R 돌연변이체 둘 다 NIH3T3 세포에 대해 10nM의 결합 친화성을 나타냄을 발견하였다(도 30).
논의
이 실시예에서, 본 발명자들은 실시예 2로부터 플라스민에서 단백질분해 안정성에 대한 스크린에서 확인된 FGF 돌연변이체를 가용성으로 발현하고 특성화하였다. 재조합 발현시, FGF1을 발현하고 용이하게 정제함을 발견하였다. 그러나, 발현 수율은 1 내지 3 ㎎/ℓ의 발현에서 상당히 낮은 것을 발견하였다. 이러한 낮은 단백질 수율은 FGF1의 좋지 않은 안정성으로 인한 것일 수 있다.
가용성 FGF1 BS4M1(D28N, L131R) 돌연변이체는 야생형 FGF1과 비교하여 플라스민에서 증가된 단백질분해 안정성을 나타내는 것으로 성공적으로 확인되었다. 돌연변이 D28N 및 L131R이 자크르제브스카(Zakrzewska)외 다수14의 안정화된 FGF1 PM2 돌연변이체(Q40P, S47I, H93G)의 돌연변이와 조합될 때, 새로운 돌연변이가 플라스민에서 FGF1의 단백질분해 안정성을 추가로 향상시킴을 발견하였다. 추가적으로, BS4M1 돌연변이체는 플라스민과 유사한 방식으로 라이신 및 아르기닌 다음을 절단하는 프로테아제인 트립신에서 더 안정적임을 확인하였다58. 이는 선택에 사용된 프로테아제와 1차 특이성을 공유하는 다른 프로테아제의 존재 하에서 단백질의 단백질분해 안정성을 증가시키는 스크린의 능력을 입증한다. 예를 들어, BS4M1 돌연변이체는 또한, 리소좀 분해를 담당하고 플라스민과 1차 공유성을 공유하는 카텝신의 존재 하에서 단백질분해에 더 안정적일 수 있다.
FGF1 D28N 및 L131R 단일 돌연변이체의 특성화를 통해, 증가된 단백질분해 안정성의 대부분은 L131R에 기인하는 반면, D28N 단일 돌연변이체는 야생형보다 단백질분해에 훨씬 덜 안정적임을 발견하였다. 효모-디스플레이 FGF1과 가용성 이. 콜라이-유래 FGF1 사이의 D28N 돌연변이의 중요성의 차이는 효모 디스플레이 단백질에서만 일어나는 글리코실화에 기인할 수 있다. 아스파르트산에서 아스프라긴으로의 돌연변이는 진핵생물에 대한 NGx 글리코실화 부위의 도입을 야기한다59. 따라서, 효모 또는 포유동물 세포에서 발현되는 FGF1 BS4M1 돌연변이체는 추가적인 단백질분해 안정성을 가질 수 있다.
플라스민이 아르기닌에 대해 1차 특이성을 가지기 때문에, L131R 돌연변이는 반-직관적인 돌연변이이다. 실제로, 어떠한 합리적인 설계 전략도 단백질에 새로운 잠재적인 절단 부위를 도입하는 것을 포함하지 않을 것이다. 그러나, 실시예 1에서 논의된 바와 같이, 1차 특이성은 단백질 절단이 잠재적인 절단 부위에서 일어나는지에 대한 유일한 결정인자가 아니고; 상기 부위 주위의 다수의 아미노산 및 프로테아제에 대한 상기 부위의 입체적 접근성이 또한 크게 기여한다. 131번 위치에서 류신에서 떨어진 돌연변이 또는 아르기닌으로의 돌연변이가 단백질분해 안정성을 증가시키는 데 중요한지 여부를 추가로 조사하기 위해, FGF1 L131A 및 L131K 단일 돌연변이체를 특성화하였다. 류신 131에서, 합리적 설계에 의해 프로테아제 절단 부위의 치환에 일반적으로 사용되는 아미노산인 알라닌으로의 변경은 심지어 야생형 FGF1과 비교하여서도 단백질분해 안정성의 감소를 야기함을 발견하였다. 그러나, 류신 131에서, 플라스민이 1차 특이성을 가지는 다른 아미노산인 라이신으로의 돌연변이는 플라스민에서 증가된 단백질분해 안정성의 유지를 야기하였다. 플라스민에 의한 131번 위치에서 FGF1 단백질의 절단이 생성된 단백질 단편의 증가된 단백질분해 안정성을 야기하는지 여부를 고려할 때, 스크린은 이와 같은 돌연변이를 선택할 수 없다는 결론을 내렸다. 효모 디스플레이 FGF1 내의 임의의 절단은 c-myc 신호의 손실 및 이 돌연변이체로부터 떨어진 선택을 야기할 것이다. 라이신과 아르기닌은 둘 다 양으로 하전된 아미노산이기 때문에, 대신 이 위치에 양 전하를 추가하는 것이 FGF1의 단백질분해 안정성을 증가시키는 데 중요할 수 있다. 본 발명자들은 야생형 FGF1과 FGF1 L131R 돌연변이체 사이의 용융 온도에 통계적으로 유의한 차이가 없음을 발견했으며, 이는 열 안정성의 증가가 단백질분해 안정성의 증가를 설명하지 않음을 시사한다. 따라서, 단백질분해 안정성을 증가시키기 위한 L131R의 메커니즘을 명확하게 찾는 추가 연구가 필요할 것이다.
또한, FGF1 L131R 돌연변이체는 MDA-MB-231 유방암 세포와의 세포 배양에서 야생형 FGF1보다 더 안정적인 것으로 보임을 발견하였다. 이러한 세포는, 플라스미노겐을 플라스민으로 절단하고 활성화시키는 유로키나제 플라스미노겐 활성화제(uPA)를 발현한다. 그 결과는 FGF1 L131R 돌연변이체가 생물학적으로 더 관련된 맥락에서 증가된 안정성을 나타냄을 입증하는 데 중요하였다.
마지막으로, NIH3T3 세포에서 ERK 인산화를 사용하여, L131R 돌연변이가 FGF1을 FGF 경로 길항제로 바꾸는 것을 발견하였다. 이러한 결과는, 단백질분해 안정성을 증가시키는 것에 대한 스크린이 FGFR에 결합하는 돌연변이체만 선택하고 단백질이 효현제 또는 길항제로서 작용하는 여부를 선택하지 않는다는 것을 고려할 때, 흥미롭지만 합리적이다. FGF1 L131R 돌연변이체의 NIH3T3 세포로의 결합 친화성은 야생형 FGF1과 거의 동일하며, 이는 FGF1 L131R 돌연변이체의 IC50이 저해 분석에서 사용된 야생형 FGF1의 농도와 거의 등몰농도인 이유를 설명한다. FGF1 L131R 돌연변이체에 의한 ERK 인산화의 저해는 완전하지 않은데, 그 이유는 야생형 FGF1의 존재 하에 가장 높은 농도로의 FGF L13R 돌연변이체로 처리된 샘플이 비처리 세포의 ERK 인산화 수준보다 낮은 수준의 ERK 인산화를 나타내기 때문이다. 그러나, 이러한 현상은 문헌에서 길항제 역할을 하는 것으로 보고된 유일한 다른 FGF1 돌연변이체인 FGF1 R50E 돌연변이체에서도 관찰된다60. FGF 경로-연관 세포 증식의 유도 및 사이클린 D1과 같은 하류 이펙터 단백질의 활성화를 위해 지속적이고 높은 수준의 ERK 인산화가 보고되어 있다57 ,61. FGF1 R50E 돌연변이체는 인테그린 αvβ3에 대한 결합에 결함이 있으며, 또한 ERK 인산화의 불완전한 저해를 나타낸다. 그러나, 모리(Mori)외 다수에 의한 후속 연구에서, 이들은 FGF1 R50E 길항제가 FGF1-유도 세포 이동, HUVEC 관 형성, Matrigel 플러그 분석에서 혈관신생, 및 대동맥 고리 분석에서 세포의 결과물을 저해할 수 있음을 성공적으로 보여준다41. 따라서, 이 실시예는 기능적 생물학적 분석에서 FGF1 L131R이 FGF 경로 길항제로서 유사하게 작용할 수 있다는 좋은 증거를 제공한다.
결론적으로, 이 실시예 2 및 3에 기재된 결과는 플라스민에서 FGF1의 단백질분해 안정성을 증가시키기 위해 본 발명자들의 고속대량 스크린을 성공적으로 이용하고 FGF2에 대한 핵심 단백질분해에 안정화된 후보를 확인할 수 있음을 나타낸다. FGF1 돌연변이체는 플라스민 및 트립신에서 증가된 단백질분해 안정성 및 배양물에서 증가된 안정성을 나타내는 것으로 나타났다. FGF1 L131R 돌연변이체는 NIH3T3 세포에서 FGF1-유도 ERK 인산화를 저해하는 데 사용될 수 있는 강력한 FGF 경로 길항제로서 작용한다는 것이 입증되었다. FGF1 돌연변이체는 암 및 눈에서 원치않는 신혈관형성과 같은 질환의 치료에서 항-혈관신생 요법에 대한 단백질분해에 안정화된 치료용 분자의 개발에 대한 전망을 나타낸다.
재료 및 방법
재조합 FGF1 발현 및 정제
로세타(DE3) 컴피턴트 세포(Novagen)를 사용하여 FGF1을 발현하였다. 인간 FGF1 cDNA(Dharmacon)로부터 N-말단 6× His 태그 및 아라비노스-유도성 프로모터가 있는 pBAD/His B 벡터(Invitrogen)에 유전자를 클로닝하였다. 제한 부위 XhoI 및 HindIII을 클로닝에 사용하였다. pBAD FGF1-His 플라스미드를 화학적 컴피턴트 로세타(DE3) 세포로 형질전환하고, 37℃에서 235 rpm으로 진탕시키면서 1㎖ LB에서 회수하고, 암피실린(Amp) 선택으로 LB 플레이트에 도말하였다. 콜로니를 5㎖ LB Amp로 접종하고 37℃에서 밤새 성장시켰다. 1㎖의 밤새 배양물을 100㎖ LB Amp 발현 배양물을 접종하는 데 사용하였다. 235 rpm으로 2 내지 2.5시간 동안 진탕시키면서 세포를 37℃에서 성장시켰다. OD600가 약 0.5일 때, 세포를 0.2% L-아라비노스(Sigma Aldrich)를 이용하여 유도하였다. 세포 세포질에서 단백질을 발현하고 유지하였다. 발현 배양물을 6시간 동안 37℃에서 성장시킨 후 세포를 회전시켜 가라앉히고 수집하였다.
라이소자임, DN아제 I, 및 헤파린 설페이트를 이용하여 B-PER 박테리아 단백질 추출 시약(Thermo Scientific)에서 30분 동안 세포를 용해시켰다. 추출 혼합물을 15,000 g에서 10분 동안 회전시켜 가라앉히고, 상청액을 수집한 다음 0.22㎛ 필터를 통해 여과하였다. 섹션 2.5.6.1에 상세히 기술된 바와 같이 Ni-NTA 친화성 정제를 위한 결합 완충액을 이용하여 1:10 희석으로 FGF1을 포함하는 상청액을 희석하였다. 상청액 및 결합 완충액 혼합물을 Ni-NTA 칼럼 상에 로딩하였다. Ni-NTA 친화성 정제로부터의 용리액을 농축시키고 10 kDA 컷오프를 갖는 아미콘 울트라-4 원심 필터 유닛(Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit)을 사용하여 PBS로 완충액을 교환하였다. 섹션 2.5.6.1에 기재된 바와 같이 Superdex 75 칼럼을 이용하는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 최종 FGF1-His 단백질을 정제하였다.
FGF1 단일 돌연변이체의 클로닝
중첩 확장 PCR을 사용하여 야생형 FGF1을 단일 아미노산 돌연변이체로 돌연변이시켰다62. 코돈 돌연변이는 다음과 같다: D28N - GAT에서 AAT; L131R - CTA에서 CGA; L131A - CTA에서 GCA; L131K - CTA에서 AAA. 부위-특이적 돌연변이유발 프라이머는 코돈 돌연변이뿐만 아니라 야생형 FGF1 서열과 중첩되는 각 면의 20 bp 오버행을 통합하였다.
단백질분해 안정성 분석
각각의 조건에 대해, 125ng의 단백질을 20㎕의 플라스민 분해 완충액(100mM 트리스-HCl, 0.01% BSA, pH 8.5)에서 다양한 농도의 플라스민과 함께 또는 다양한 인큐베이션 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 각각의 샘플에 대한 적절한 인큐베이션 시간의 종료 시, -20℃에서 샘플을 보관함으로써 프로테아제 분해를 정지시켰다. 모든 인큐베이션의 완료 후, 분석을 위해 샘플을 얼음 상에서 해동하였다. 각각의 20㎕ 샘플을 5㎕의 NuPAGE LDS 샘플 완충액 및 2㎕의 NuPAGE 샘플 환원제와 혼합하였다. SDS-PAGE 겔을 실행하기 전에 샘플을 95℃로 10분 동안 가열하였다. Invitrogen iBlot Gel Transfer Device(프로그램 0, 7분)를 사용하여 나이트로셀룰로스 막으로 블롯팅하기 전에 겔을 20% 에탄올과 함께 10분 동안 인큐베이션하였다.
TBST(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 25mM 트리스, 0.1% 트윈 20) 중 5% 탈지 분유(Bio-Rad)로 1시간 동안 웨스턴 블롯을 차단하였다. TBST 중 5% 우유에서 마우스 항-FGF1(Sigma Aldrich, 클론 2E12)의 1:1000 희석물로 1시간 동안 1차 염색을 수행하였다. TBST에서 15분 동안 3회 세척한 후, 염소 항-마우스 HRP(ThermoFisher Scientific)의 1:2500 희석물로 2시간 동안 2차 염색을 수행하였다. TBST에서 15분 동안 3회 더 세척한 후, Chemi Hi 감도 모드로 BioRad ChemiDoc XRS System에 의해 블롯을 영상화하였다. ImageJ를 사용하여 밴드 강도를 정량화하고 그래프패드 프리즘 6을 사용하여 정규화된 밴드 강도를 플롯팅하였다.
용융 온도를 측정하기 위한 ThermoFluor 분석
50㎕의 1.2 ㎎/㎖ 단백질을 96-웰의 박막 PCR 플레이트(Bio-Rad)에 로딩하였다. 0.5㎕의 SYPRO Orange(Molecular Probes)를 샘플에 첨가하고 완전히 혼합하였다. 바이오래드 CFX96 RT 시스템 C1000 터치(BioRad CFX96 RT System C1000 Touch)를 이용하여 플레이트를 분석하기 전에 플레이트를 플라스틱 커버로 밀봉하였다. 플레이트를 4℃로 5분 동안 냉각시킨 다음 플레이트를 분당 1℃의 속도로 100℃까지 천천히 가열하였다. 형광 변화를 모니터링하고 각각의 ℃에서 측정하였다. 온도에 따른 형광을 마이크로소프트 엑셀에 플롯팅하고 형광이 최대 및 최소 형광 신호의 평균과 같은 온도를 찾음으로써 용융 온도를 계산하였다.
세포 배양 안정성 분석
MDA-MB-231 세포를 10% 소태아혈청(FBS)(Gibco)이 있는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 100,000개 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트(Sigma Aldrich)에 시딩하고 37℃, 5% CO2에서 성장시켰다. 24시간 후, 배지를 흡인하고 혈청 고갈을 위해 DMEM으로 교체하였다. 24시간 후, DMEM을 흡인하였다. 각각의 샘플에 대해, 1㎖의 DMEM 중 500ng의 단백질을 각각의 웰에 첨가하고 다양한 인큐베이션 시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 각각의 인큐베이션 종료 시, 상청액을 수집하고 0.22㎛ 필터를 이용하여 여과한 다음, 분석 전에 -20℃에서 냉동시켰다. 모든 인큐베이션이 완료된 후, 상청액을 얼음 상에서 해동하였다. 각각의 상청액 샘플을 아미콘 3K MWCO 울트라-0.5㎖ 원심 필터를 사용하여 50㎕ 부피로 농축시켰다. 15㎕의 농축된 샘플을 5㎕의 NuPAGE LDS 샘플 완충액 및 2㎕의 NuPAGE 샘플 환원제와 혼합하였다. SDS-PAGE 겔을 실행하기 전에 샘플을 95℃로 10분 동안 가열하였다. Invitrogen iBlot Gel Transfer Device(프로그램 0, 7분)를 사용하여 나이트로셀룰로스 막으로 블롯팅하기 전에 겔을 20% 에탄올과 함께 10분 동안 인큐베이션하였다.
TBST(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 25mM 트리스, 0.1% 트윈 20) 중 5% 탈지 분유(Bio-Rad)로 1시간 동안 웨스턴 블롯을 차단하였다. TBST 중 5% 우유에서 마우스 항-FGF1(Sigma Aldrich, 클론 2E12)의 1:1000 희석물로 1시간 동안 1차 염색을 수행하였다. TBST에서 15분 동안 3회 세척한 후, 염소 항-마우스 HRP(ThermoFisher Scientific)의 1:2500 희석물로 2시간 동안 2차 염색을 수행하였다. TBST에서 15분 동안 3회 더 세척한 후, Chemi Hi 감도 모드로 BioRad ChemiDoc XRS System에 의해 블롯을 영상화하였다. ImageJ를 사용하여 밴드 강도를 정량화하고 그래프패드 프리즘 6을 사용하여 정규화된 밴드 강도를 플롯팅하였다.
NIH3T3 ERK 인산화 분석
MDA-MB-231 세포를 10% 신생아 송아지 혈청(NBCS)(Gibco)이 있는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 100,000개 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트(Sigma Aldrich)에 시딩하고 37℃, 5% CO2에서 성장시켰다. 24시간 후, 배지를 흡인하고 혈청 고갈을 위해 DMEM으로 교체하였다. 24시간 후, DMEM을 흡인하였다. 어떠한 포스파타제 저해제 없이 야생형 FGF1 및/또는 다양한 농도의 FGF1 L131R 돌연변이체로 15 내지 18시간 동안 37℃에서 세포를 자극하였다. 자극 후, 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 세척하고 1× 포스파타제 저해제 칵테일 2 및 1× 프로테아제 저해제 칵테일 2(Sigma)가 있는 100㎕의 용해 완충액(20mM 트리스-HCl, pH 8.0, 137mM NaCl, 10% 글리세롤, 1% Nonidet P-40)으로 1시간 동안 4℃에서 처리하였다. 분석 전에 용해물을 -80℃에서 냉동하였다. 용해물을 얼음 상에서 해동시키고 원심분리로 정화시켰다. Pierce BCA 단백질 분석으로 단백질 농도를 정량화하였다. MilliQ H2O를 이용하여 각각의 샘플에 대해 2㎍의 단백질 용해물을 14.6 ㎕로 희석하였다. 각각의 희석된 샘플을 5.6㎕의 NuPAGE LDS 샘플 완충액 및 2.25㎕의 NuPAGE 샘플 환원제와 혼합하였다. SDS-PAGE 겔을 실행하기 전에 샘플을 95℃로 10분 동안 가열하였다. Invitrogen iBlot Gel Transfer Device(프로그램 0, 7분)를 사용하여 나이트로셀룰로스 막으로 블롯팅하기 전에 겔을 20% 에탄올과 함께 10분 동안 인큐베이션하였다.
TBST(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 25mM 트리스, 0.1% 트윈 20) 중 5% 탈지 분유(Bio-Rad)로 1시간 동안 웨스턴 블롯을 차단하였다. TBST 중 5% 우유에서 토끼 항-포스포-ERK1/2(Y202/Y204) 항체(Cell Signaling) 또는 토끼 항-ERK1/2(Cell Signaling)의 1:1000 희석물로 1시간 동안 1차 염색을 수행하였다. TBST에서 15분 동안 3회 세척한 후, 염소 항-토끼 HRP(Santa Cruz Biotechnology)의 1:2500 희석물로 2시간 동안 2차 염색을 수행하였다. TBST에서 15분 동안 3회 더 세척한 후, Chemi Hi 감도 모드로 BioRad ChemiDoc XRS System에 의해 블롯을 영상화하였다. ImageJ를 사용하여 밴드 강도를 정량화하고 그래프패드 프리즘 6을 사용하여 플롯팅하였다.
NIH3T3 세포 결합 분석
NIH3T3 세포를 결합 완충액(1mM MgCl2, 1mM MnCl2, 2mM CaCl2, 100mM NaCl, 및 0.1% BSA가 있는 20mM 트리스-HCl(pH 7.5))에서 3시간 동안 4℃에서 다양한 농도의 야생형 FGF1 또는 FGF1 BS4M1 돌연변이체와 함께 인큐베이션하였다. 리간드 고갈을 회피하기 위해 충분히 많은 양으로 세포를 인큐베이션하였다. FGF와 함께 인큐베이션한 후, 세포를 세척하고 얼음 상에서 15분 동안 항-His Hilyte Fluor 488(Anaspec)의 1:100 희석물과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, 펠릿화한 다음 결합 완충액에 재현탁시킨 직후 EMD Millipore Guava EasyCyte를 사용하여 유세포분석에 의해 분석하였다. FlowJo(v7.6.1)를 사용하여 유세포분석 데이터를 분석하였다. 결합 곡선을 플롯팅하고 그래프패드 프리즘 6을 사용하여 Kd 값을 얻었다.
실시예
1 내지 3에서 인용된 참조문헌
실시예
4: NK1의 단백질 조작
1.1 효모 표면 디스플레이를 통한 NK1의 단백질 조작. 효모 표면 디스플레이는 결합 친화성 향상, 적절한 접힘, 및 안정성 개선을 위해 단백질을 조작하는 데 사용된 강력한 유도 진화 기술이다. NK1 단백질의 조합 라이브러리를 효모 교배 응집소 단백질 Aga2p에 대한 유전자 융합체를 통해 효모 균주 사카로마이세스 세레비시에의 표면 상에 디스플레이하였다. Aga2p는 Aga1p에 이황화 결합되며, 이는 효모 세표 벽에 공유 결합된다. 대부분의 효모 디스플레이 연구와 대조적으로, 본 발명자들이 여기서 사용한 작제물은 디스플레이된 NK1 단백질을 Aga2p의 N-말단에 테더링하였다(미국 특허 제9,556,248호의 도 2). 이러한 리간드-수용체 시스템의 경우 이러한 배향이 하기 기재된 수용체 및 항체 표지의 입체적 제약을 감소시킴을 발견하였다. NK1 단백질에는 N-말단 혈구응집소(HA) 및 C-말단 c-myc 에피토프 태그가 측접하며, 이들은 효모 세포 표면 상에서 작제물의 발현을 확인하고 표면 발현 수준을 정량화하는 데 사용되었다. 디스플레이된 NK1 단백질의 C-말단에서 가요성 (Gly4Ser)3 링커는 단백질을 효모 세포 표면에서 멀리 돌출시켜 입체 제약을 추가로 최소화하는 데 사용되었다.
107 내지 108개 형질전환체의 라이브러리를 단백질 조작 연구를 위해 일상적으로 생성하였으며, 이때 각각의 효모 세포는 이의 표면 상에 특정 NK1 돌연변이체의 수천개의 동일한 복사체를 디스플레이한다. 형광-활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 수천만개의 효모-디스플레이 NK1 돌연변이체의 고속대량 스크리닝은 원하는 특성, 이 경우 향상된 Met 수용체 결합 친화성 및/또는 향상된 발현을 가지는 단백질 변이체의 단리를 가능하게 하였다. 이를 위해, 형광-표지화 Met-Fc 융합 단백질 및 HA 에피토프 태그에 대한 1차 및 2차 항체 모두로 효모-디스플레이 NK1 라이브러리를 염색하였다(미국 특허 제9,556,248호의 도 2B). 다색 유세포분석의 사용은 각각 피코에리트린 및 Alexa-488 형광을 검출함으로써 상대적인 표면 발현 수준 및 Met 결합을 동시에 그리고 독립적으로 모니터링할 수 있게 하였다. 가장 높은 수준의 Met에 결합하고 가장 높은 NK1 발현 수준을 보유한 효모 세포를 단리하였다. 이전에는, 효모 세포 표면 상에서의 발현 수준과, 열 안정성 및 가용성 발현 수율 사이에 강한 상관관계가 보였다. 분류된 효모를 배양으로 번식시키고, 스크리닝 과정을 여러번 반복하여 소수의 고유한 클론으로 이루어진 풍부화된 효모 집단을 수득하였다.
1.2 개괄: 효모 표면 디스플레이를 사용하는 높은 친화성 및 안정성에 대한 NK1의 유도 진화. 1) 열 안정성 향상 및 2) Met에 대한 높은 결합 친화성을 위해 NK1 단편을 조작하였다. 유도 진화의 제1 라운드는 대체로 효모 세포 표면 상에서 기능적 발현과 Met 결합 친화성에서 적당한 개선을 위해 NK1을 진화시키는 것으로 이루어졌다. 풀링된 생성물을 추가로 돌연변이시키고 유도 진화의 제2 라운드를 수행하여 Met 결합 친화성 개선 또는 안정성 향상에 대해 독립적으로 스크리닝하였다. 그 다음 유도 진화의 제3 라운드를 제2 라운드로부터 풀링된 생성물에서 DNA 셔플링을 수행한 다음 Met 결합 친화성 개선 및 안정성 향상에 대해 동시에 스크리닝함으로써 수행하였다(도 3).
1.3 야생형 NK1은 효모 세포 표면 상에서 기능적으로 발현되지 않는다. HGF는 2가지 주요 아이소형인 아이소형 1(I1: Genbank 수탁 번호 NP_000592) 및 아이소형 3(I3: Genbank 수탁 번호 NP_001010932; 서열번호 10)으로 존재한다.
서열번호 4(NP_00101932)
HGF I1 및 I3은 I3의 첫번째 크링글 도메인(K1)에서 5개 아미노산 결실을 제외하고, 서열이 동일하다. 효모 디스플레이 플라스미드인 pTMY-HA를 효모 세포벽 단백질 Aga2p에 대한 유전자 융합체로서 효모 세포 표면 상에 NK1 I1 또는 NK1 I3을 발현하는 데 사용하였다(도 2). 유사한 결과를 NK1 I1 및 NK1 I3 둘 다에 대하여 발견하였다. 상대적 발현(HA 태그의 항체 검출을 통함) 및 Alexa 488로 표지된 20 또는 200nM의 Met-Fc(R&D Systems)에 대한 결합에 대해 효모-디스플레이 NK1 I1을 염색하였다. 야생형 NK1-Met 상호작용에는 헤파린이 필요하므로, 2μM 헤파린(Lovenox, Sanofi-Aventis)의 존재(미국 특허 제9,556,248호의 도 4A, 상단) 및 부재(도 4A, 하단) 둘 다에서 이 실험을 수행하였다. 유세포분석을 효모 세포 표면 상에서 NK 1 I1을 발현하는 효모를 검출하는 데 사용하였다. 가용성 Met-Fc에 대한 낮은 수준의 결합만이 관찰되었다(도 4, x-축 대 t-축). 효모-디스플레이 NK1을 70℃로 가열한 후 결합 수준이 표시되어 있다(미국 특허 제9,556,248호의 도 4B). 하기 나타낸 바와 같이, 효모 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)로부터 생성된 가용성 NK1 I1은 60℃에서 완전히 풀린다(미국 특허 제9,556,248호의 도 4). 종합적으로, 이 데이터는 효모-디스플레이 야생형 NK1이 효모 세포 표면 상에서 기능적으로 발현되지 않음을 입증한다.
1.4 효모 표면 디스플레이를 사용하는 개선된 친화성 및 안정성에 대한 NK1의 조작. 야생형 NK1과 비교하여 안정성 및 Met 결합 친화성의 개선을 위해 NK1을 진화시키는 데 유도 진화의 3가지 별개 라운드를 사용하였다. NK1은 효모 세포 표면 상에서 기능적으로 발현되지 않으므로, 유도 진화의 제1 라운드는 대체로 Met 수용체에 결합한 클론을 단리하기 위해 효모-디스플레이 NK1 돌연변이체를 스크리닝하는 것으로 이루어졌다. 이러한 목표를 위해, 본 발명자들은 뉴클레오타이드 유사체 8-옥소-dGTP 및 dPTP(TriLink BioTechnologies)를 사용하여 오류 발생 가능성이 높은 PCR에 의해 대략 3×107개 NK1 돌연변이체의 라이브러리를 생성하였다. NK1 I1도 NK1 I3도 효모 세포 표면 상에서 기능적으로 발현되지 않으므로, 어떠한 아이소형이 유도 진화 동안 친화성 돌연변이에 가장 적합할 것인지 명확하지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 출발 주형으로서 동일한 양의 NK1 I1 및 NK1 I3을 사용하여 I1 및 I3 둘 다를 기반으로 조합된 NK1 돌연변이체 라이브러리를 생성하였다. 효모-디스플레이 라이브러리로부터 무작위 클론의 서열결정으로 NK1 I1 및 NK1 I3의 동일한 표현을 확인하였다.
효모는 30℃에서 성장하는 것을 선호하지만, 종종 20℃에서 보다 복잡한 단백질의 개선된 발현을 나타낸다. 따라서, NK1 돌연변이체의 개선된 접힘을 가능하게 하기 위해 20℃에서 효모 세포 표면 상에서 단백질 발현을 유도한 후 2개 라운드의 라이브러리 분류를 수행하였고, FACS를 사용하여 200nM Alexa-488 표지화 Met-Fc(Met-Fc A488)에 대한 검출 가능한 결합을 나타내는 효모 세포를 단리하였다(미국 특허 제9,556,248호의 도 5A). 30℃ 발현 온도를 사용하여 안정성이 개선된 돌연변이체에 대한 스크리닝을 목표로 20℃ 또는 30℃ 유도 온도를 사용하여 후속 라이브러리 분류를 동시에 수행하였다. 각각의 전략으로 5개 라운드의 분류 후(20℃ 발현 온도를 사용하여 5개 라운드, 또는 20℃로 2개 라운드 그 다음 30℃ 발현 온도로 3개 라운드), 라이브러리는 200nM Met-Fc에 결합한 구성원을 명확하게 포함하였다.
유도 진화의 제2 라운드를 위해 유도 진화 제1 라운드의 최종 분류로부터 풀링된 돌연변이체를 오류 발생 가능성이 높은 PCR에 의해 무작위 돌연변이시켜 대략 8×107개 고유한 돌연변이체의 라이브러리를 생성하였다. 이러한 라이브러리의 처음 2개 라운드의 분류를 20℃ 발현 온도를 사용하여 수행하여 가용성 Met-Fc A488에 결합한 돌연변이체를 먼저 회수하였다. 후속 라운드에 있어서, 본 발명자들은, 열 안정성 개선과 상관관계가 있는 것으로 나타났던 발현 개선(즉, 접힘 안정성), 또는 Met 결합 친화성의 개선을 위해 동시에 분류하였다(미국 특허 제9,556,248호의 도 5B). 상승된 온도(37℃)에서의 발현은 안정성 개선에 대한 분류 엄격성을 부여하는 데 사용된 한편, 가용성 Met-Fc A488의 농도 감소에 대한 결합 개선은 친화성 분류 엄격성에 사용되었다.
마지막으로, 유도 진화의 제3 라운드는 대략 2×107개 고유한 형질전환체의 3세대 라이브러리를 생성하기 위해 유도 진화의 제2 라운드로부터의 안정성- 및 친화성-향상 돌연변이체의 최종 풀의 DNA 셔플링으로 이루어졌다. 안정성 향상(37℃ 유도시 높은 세포 표면 발현 수준을 통함) 및 친화성 향상(Met-Fc A488의 실질적으로 감소하는 농도에 대한 결합 개선을 통함) 둘 다에 대하여 이 라이브러리를 동시에 스크리닝하였다. 제1, 제2 및 제3 라운드의 분류는 각각 40, 20 및 2nM Met-Fc A488을 사용하였다. 3개 라운드의 분류 후, 생성된 돌연변이체 풀은 37℃에서 잘 발현되었고 2nM Met-Fc A488에 강하게 결합하였다(미국 특허 제9,556,248호의 도 6, 중간). 2nM Met-Fc A488로 표지화한 다음 과잉의 표지화되지 않은 경쟁자, 이 경우 재조합 HGF(R&D Systems)의 존재 하에 결합해제 단계에 의해 후속 분류를 수행하였다. 과잉의 HGF 경쟁자의 존재 하에서 24시간 후 Met 결합을 유지한 클론을 FACS에 의해 단리하였다. NK1 돌연변이체의 풀이 Met-Fc 경쟁자로서 과잉의 HGF의 존재 하에 2일의 결합해제 단계 이후 Met-Fc A488에 대한 결합을 유지할 때까지 이 과정을 반복하였다(도 6, 우측).
NK1 변이체의 풀을 확인하였으며, 여기서 변이체는 상승된 온도에서 효모 세포 표면 상에서 효율적으로 발현되고 과잉의 HGF 경쟁자의 존재 하에 심지어 2일의 결합해제 단계 후에도 2nM 가용성 Met에 지속적인 결합을 유지한다(미국 특허 제9,556,248호의 표 6).
1.5 친화성 및 안정성-향상 NK1 돌연변이체의 서열 분석. 유도 진화의 라운드 3을 수행하는 것과 동시에, 라운드 2로부터 유망한 돌연변이체의 특성화가 시작되었다. 각각의 분류 전략(20℃ 친화성 분류 전략, 및 37℃ 안정성 분류 전략)에 대해 최종 2개의 분류 라운드 각각으로부터 8개의 무작위 돌연변이체를 서열결정하였다. 흥미롭게도, 초기 라이브러리의 서열결정이 상대적으로 동일한 비율의 NK1 아이소형 1 및 아이소형 3을 나타내었지만, 서열결정된 32개 모든 클론은 NK1 I1을 기반으로 하였다. 추가적으로, 다수의 선호되는 돌연변이 또는 컨센서스 돌연변이가 분명하였다. 라이브러리 분류 생성물로부터 무작위로 서열결정된 클론에서 10개의 돌연변이가 반복적으로 나타났으며, 이들 돌연변이 중 8개가 무작위로 선택된 클론의 절반 이상에 존재하였다. 이러한 지배적인 돌연변이는 표 1에 굵게 강조표시되어 있다. 매우 다양한 돌연변이로 인해, 개별 클론 중 어느 것도 이들 돌연변이 중 8개 모두를 포함하지 않았다. 그러나, 하나의 클론은 8개의 가장 빈번한 돌연변이 중 5개(K62E, N127D, K137R, K170E, N193D; 이 클론은 M2.1이라고 명명함)를 포함하였다. 나머지 3개 돌연변이(Q95R, K132N, Q173R)를 이 클론의 배경에 추가하여 본 발명자들이 M2.2라고 칭한 NK1 돌연변이체를 생성하였다. 이러한 돌연변이의 추가 서열 분석은 다수의 관심 관찰을 강조하였으며, 이는 하기에서 추가로 논의된다.
2가지 전략으로부터의 분류 생성물은 다수의 정확히 똑같은 클론을 생성하지 않지만, 그러나 컨센서스 서열에서 현저한 중첩을 나타내었다. M2(제2 라운드의 유도 진화) 생성물에서 관찰된 I125T 및 N127D 간의 음의 상관관계는 M3(제3 라운드의 유도 진화) 생성물에서도 지속되었다. 30개의 서열결정된 클론 중, 25개는 N127D 돌연변이를 포함하였고, 또한 이들 중 어느 것도 I125T 돌연변이를 포함하지 않았다. 그러나, N127D를 포함하지 않는 5개의 클론 각각은 I125T 돌연변이를 포함하였다. K62E/V64A 및 I130V/K132N 컨센서스 돌연변이는 단지 2개 아미노산 간격으로 일어났다.
M2 생성물로부터의 8개 컨센서스 돌연변이 모두가 M3 생성물에 존재하였다(M2.2 = K62E, Q95R, N127D, K132N, K137R, K170E, Q173R, N193D임을 상기함). M3 생성물의 50% 이상에서 발생하는 5가지의 추가적인 컨센서스 돌연변이, 즉, V64A, N77S, I130V, S154A 및 F190Y가 있었다.
실시예
5: NK1의 생성
2.1 효모 균주 피. 파스토리스(P. pastoris)에서 야생형 NK1 및 NK1 돌연변이체의 가용성 생성. 간단히, N-말단 FLAG 에피토프 태그(DYKDDDDK) 및 C-말단 헥사히스티딘 태그를 포함하는 야생형 NK1, M2.1, 또는 M2.2를 인코딩하는 DNA를 분비 플라스미드 pPIC9K에 클로닝하였다. 작제물을 피. 파스토리스에 형질전환시키고, 4 ㎎/㎖ Geneticin을 포함하는 YPD-한천 플레이트 상에서 성장에 대하여 선택하고 배양 상청액의 웨스턴 블롯팅에 의해 NK1 발현에 대해 스크리닝하였다. 도 7A(미국 특허 제9,556,248호)는 M2.1 및 M2.2가 30℃에서 잘 발현하는 한편, 야생형 NK1은 훨씬 더 낮은 수준으로 발현함을 나타낸다. 이러한 데이터는 효모-표면 디스플레이를 사용하여 단백질 안정성 향상을 위한 조작이 또한 개선된 재조합 발현 수준을 부여한다고 보고한 이전 연구와 일치한다. 그러나, 발현 온도를 20℃로 낮추면 야생형 NK1의 효율적인 발현이 가능하게 되었다(데이터는 나타내지 않음). NK1 및 돌연변이체 발현을 진탕 플라스크 배양에서 0.5ℓ까지 규모를 확장하였고 고정화 니켈 친화성 크로마토그래피에 이어 Superdex™ 75 칼럼(GE Healthcare) 상에서 겔 여과를 사용하여 정제하였다. 수 밀리그램의 돌연변이체 M2.1 및 M2.2를 임의의 최적화없이 하나의 0.5ℓ 진탕 플라스크로부터 수득하였으며, 이는 유도 조건을 변형하거나 발효를 통해 훨씬 더 높은 수율을 얻을 수 있음을 나타낸다.
2.2 돌연변이체 M2.1 및 M2.2는 야생형 NK1보다 더 높은 열 안정성을 나타낸 다. 열 안정성을 테스트하기 위해, 효모 세포 표면 상에서 M2.1 및 M2.2를 발현하고 다양한 온도로 가열한 다음, 형광으로 표지된 Met-Fc에 대한 결합 유지를 유세포분석으로 측정하였다(미국 특허 제9,556,248호의 도 8A). NK1 돌연변이체 M2.1 및 M2.2는 효모의 표면 상에서 Tm 값이 각각 61.0±1.4℃ 및 61.4±0.7℃이다. 효모-디스플레이 야생형 NK1은 효모 세포 표면 상에서 기능적으로 발현되지 않았으므로, 이의 안정성을 모니터링하는 것은 가능하지 않았다.
가용성 단백질의 안정성을 테스트하기 위해, 정제된 가용성 돌연변이체의 2차 구조 풀림을 Jasco J-815 CD 분광기 상에서 원평광 이색성(CD)을 사용하여 모니터링하였다. 돌연변이체 단백질의 CD 스캔은 대체로 β-시트 구조 요소로 인해 208㎚에서 피크를 확인하였다. M2.1 및 M2.2의 CD 스캔은 야생형 NK1의 것과 유사하며, 이는 돌연변이체 단백질이 야생형 NK1과 동일한 전체 2차 구조 요소를 포함함을 설명한다(미국 특허 제9,556,248호의 도 8B). 80℃에서 야생형 NK1의 CD 스펙트럼은 무작위 코일과 유사하며, 이는 원평광 이색성을 사용하여 2차 구조 요소의 풀림을 모니터링하는 능력을 입증한다(도 8B). 이러한 정보를 사용하여, 이러한 2차 구조의 풀림을 가변 온도 CD 스캔에 의해 모니터링하였다(도 8C). 이들 분석의 각각에서, M2.1 및 M2.2는 야생형 NK1(Tm = 50.9±0.2℃)과 비교하여 더 높은 열 안정성(각각 63.6±0.3℃ 및 67.8±0.2℃)을 나타내었다. 이러한 결과를 추가로 확인하기 위해, M2.1에 대한 무작위 코일에 대한 236㎚에서 국소 최대값의 용융을 모니터링하였다. 동일한 Tm이 208㎚에서의 용융에 대하여 관찰되었다. CD 온도 용융에 의해 결정된 바와 같이 야생형 및 돌연변이 NK1 단백질의 열 안정성(Tm)의 요약은 표 8에 표시되어 있다.
2.3 단백질 안정성에 대한 염 농도의 영향. 구조적 무결성을 유지하기 위해, 야생형 NK1은 높은 염 농도(> 200 내지 300mM NaCl)를 포함하는 완충액에서 유지되어야 하는 것으로 관찰되었다. 이러한 필요조건의 추가의 증거로서, 야생형 NK1은 적당한 염 농도(137 mM)를 포함하는 완충액을 이용하는 크기 배제 크로마토그래피에서 광범위하고 지연된 용리 프로파일을 나타내었으며(미국 특허 제9,556,248호의 도 9 및 삽화), 이는 이러한 조건 하에서 풀림 및/또는 칼럼에 대한 비-특이적 결합을 시사한다. 대조적으로, M2.1 및 M2.2는 유사한 적당한 염 조건 하에서의 크기 배제 크로마토그래피에서 단일의 날카로운 피크로서 용리되었다(미국 특허 제9,556,248호의 도 9).
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6: NK1의 특성화
3.1 NK1 동종이량체화 인터페이스에서 점 돌연변이 잔기 N127은 N과 K1 도메인을 연결하는 링커 영역 내에 존재한다(도 1). 이 아스파라긴 잔기의 측쇄는 2개의 수소 결합을 형성한다. N127D 변이체는 라이브러리-단리 변이체 사이에서 자주 관찰되었다(표 2 및 표 3). 생물학적 활성에 대한 M2.2 내 N127D 돌연변이의 영향을 조사하기 위해, 이 위치에 일련의 점 돌연변이를 생성하였다. 알라닌 잔기는 NK1 동종이량체의 안정화 상호작용을 방해함으로써 야생형 NK1을 효현제에서 길항제로 변환시킨다. 이 위치에서 라이신 또는 아르기닌으로의 돌연변이의 효과를 테스트하였다. 이들 치환은 부피가 크고 하전된 측쇄를 통해 입체 및 정전기 장애를 유도한다.
추가적으로, 점 돌연변이 D127N을 분석하였으며; 이는 이 위치를 야생형 아스프라긴 잔기로 되돌린다. N127D 돌연변이를 포함하는 M2.2의 맥락에서 이러한 돌연변이는 D127A, D127K, D127R 및 D127N로 지칭된다. 중요한 것은, 이들 돌연변이체 각각은 M2.2와 연관된 높은 열 안정성을 유지한다는 것이다(표 5).
3.2 Met 수용체 효현제 또는 길항제로서 NK1 돌연변이체의 특성화. 포유동물 세포에서 Met 수용체의 활성화를 연구하는 데 널리 사용되는 2가지 분석인 MDCK 세포 산란기 및 uPA 분석에서 NK 1 돌연변이체를 평가하였다. MDCK 세포 산란 분석의 경우, 100㎕의 완전 성장 배지에서 96-웰 플레이트에 1500개 세포/웰을 시딩하고 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 24시간 후, 배지를 흡인에 의해 제거하고 HGF 또는 NK1 단백질을 각각 0.1 또는 100nM의 농도로 포함하는 배지로 교체하였다. 일부 실험에서 2μM의 농도로 또는 헤파린:NK1의 2:1몰비로 Lovenox® 헤파린(Sanofi-Aventis)을 사용하였다. 24시간 후, 세포를 고정하고 50% 에탄올 중 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 10분 동안 실온에서 염색한 다음, 물로 세척하고, 공기 중에서 건조시킨 후 사진촬영하였다. HGF를 0.1nM의 최종 농도로 첨가하기 전에 30분 동안 세포를 250nM NK1 돌연변이체와 인큐베이션한 것을 제외하고는, MDCK 산란 저해 분석을 유사한 방식으로 수행하였다.
MDCK uPA 분석의 경우, 100㎕의 완전 성장 배지에서 96-웰 플레이트에 4000개 세포/웰을 시딩하고 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 24시간 후, 배지를 흡인에 의해 제거하고 HGF 또는 NK1을 각각 1 또는 100nM의 농도로 포함하는 배지로 교체하였다. 24시간 후, 200㎕ 페놀 레드-프리 DMEM으로 2회 세척하고 100mM 글리신 pH 3.5 용액 중 50%(vol/vol)의 0.05 유닛/㎖ 플라스미노겐(plasminogen)(Roche Applied Science), 40%(vol/vol) 50mM 트리스 pH 8.0, 10%(vol/vol) 및 3mM chromozym PL(Roche Applied Science)을 포함하는 200㎕ 반응 완충액과 함께 인큐베이션하였다. Infinite M1000 마이크로플레이트 판독기(Tecan Group Ltd.)를 사용하여 405㎚에서 흡광도를 측정하기 전에 플레이트를 4시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다.
돌연변이체 M2.2 D127A, D127K, 및 D127R은 산란(미국 특허 제9,556,248호의 도 10 및 도 11A) 또는 MDCK세포에서 uPA 활성화(도 11B)에 의해 측정된 바와 같이, Met 활성화를 유도하지 않았다. N127D 돌연변이를 포함하는 비변형 M2.2 변이체는 약한 효현 활성을 나타내거나(미국 특허 제9,556,248호의 도 11A) 또는 어떠한 효현 활성을 나타내지 않았다(미국 특허 제9,556,248호의 도 10 및 도 11B).
대조적으로, 127번 위치에서 야생형 아스파라긴 잔기로의 복귀(M2.2 D127N)는 MDCK 산란(미국 특허 제9,556,248호의 도 10 및 도 11A) 및 uPA 분석(미국 특허 제9,556,248호의 도 11B) 둘 다에서 효현 활성을 초래하였다. M2.2 D127N의 활성은 야생형 NK1과 유사하고 둘 다 가용성 헤파린의 존재 하에 활성 향상을 나타내었다(미국 특허 제9,556,248호의 도 11C 상단 대 하단). 비교하면, M2.2D127A, D127K, 및 D127R은 헤파린의 존재 또는 부재 하에 이들 분석에서 효현 활성을 나타내지 않았다(미국 특허 제9,556,248호의 도 10 및 도 11A 내지 도 11C).
HGF-유도 Met 활성화를 저해하는 이들 돌연변이체의 능력을 테스트하였다. 대조군으로서, M2.2 D127N은 HGF-유도 활성을 저해하지 않았으며, 이는 Met 수용체 효현제로서 이의 기능에 대한 추가의 증거를 제공하였다(미국 특허 제9,556,248호의 도 12). M2.2 돌연변이체 D127A, D127K, 및 D127R은 가용성 헤파린의 부재 하에 HGF-유도 MDCK 산란의 약하거나 최소한의 저해를 나타내었다(미국 특허 제9,556,248호의 도 12 상단).
대조적으로, 2μM 헤파린을 첨가한 경우 강한 길항 활성이 관찰되었다(도 12 하단). 2:1 몰비의 헤파린:NK1로 NK1 돌연변이체를 미리 제형화하는 것은 길항 활성을 부여하기에 충분했고 개선된 길항 활성을 위해 과량을 헤파린을 추가할 필요성을 제거하였다(미국 특허 제9,556,248호의 도 13). 비변형 M2.2(M2.2 N127D)는 2:1 몰비의 헤파린으로 단지 약한 길항 활성만 나타내었으며(미국 특허 제9,556,248호의 도 13), 이는 합리적으로 조작된 점 돌연변이의 유용성을 뒷받침한다. M2.2 D127K의 길항 활성은 이전에 보고된 길항제 NK1 N127A와 유사하다(미국 특허 제9,556,248호의 도 13). 그러나, M2.2 D127A/K/및 R 돌연변이체는 NK1 N127A와 비교하여 현저하게 개선된 안정성 및 발현, 즉, 더 낮은 염-의존성 안정성, 약 15℃의 증가된 Tm 및 약 40배의 개선된 재조합 발현 수율을 보유하며, 이들은 모두 매력적인 특성이다.
4.1 재조합 Aras-4의 생화학적 및 생물학적 특성화. 서열 분포, 효모 표면 발현 수준, 및 Met-Fc 결합을 기반으로 추가 조사를 위해 제3 라운드의 유도 진화로부터의 클론 중 5개를 선택하였다. 이들 클론을 Aras-1, -2, -3, -4, 및 -5로 지칭한다(미국 특허 제9,556,248호의 도 14). 이들 클론 각각은 Aras-1을 제외하고 효모 피치아 파스토리스에서 잘 발현되는 것으로 발견되었다.
추가 특성화를 취해 Aras-4를 선택하였다. 이는 CD 온도 용융(Tm = 64.9±1.2℃)에 의해 결정될 때 높은 열 안정성을 나타내었다. Aras-4는 MDCK 세포의 배양물에 첨가될 때 세포 Met를 활성화시키지 않으며 M2.2 D127A 또는 야생형 NK1-기반 길항제 NK1 N127A보다 대략 5배 더 낮은 농도에서 Met의 HGF-유도 활성화를 효과적으로 저해하였다(미국 특허 제9,556,248호의 도 15).
4.2 공유 결합된 이량체를 형성하기 위한 이황화 결합의 도입. M2.2 D127N의 N-말단에 유리 시스테인 잔기를 도입하였으며, 이는 재조합 발현 시 단량체 및 이량체 종의 형성을 초래하였다. 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여 단량체로부터 시스틴-연결 이량체 단백질(cdD127N으로 명명됨)을 정제하였다. 환원 및 비-환원 조건 하에서 cdD127N의 SDS-PAGE 분석으로 공유 이황화 결합을 통해 이량체가 형성됨을 확인하였다. (미국 특허 제9,556,248호의 도 16). 시스틴-연결 이량체 M2.2 D127K(cdD127K로 명명됨) 및 Aras-4(cdAras-4로 명명됨) 폴리펩타이드를 또한 생성하였다.
4.3 cdD127N, cdD127K, 및 cdAras-4의 생물학적 활성. cdD127N 및 cdD127K는 야생형 NK1과 유사한 효현 활성을 보유하는 M2.2 D127N 단량체보다 10배 더 낮은 농도에서 효현 활성을 나타내었다(미국 특허 제9,556,248호의 도 17). 모 단량체인 M2.2 D127K는 길항제이므로, cdD127K의 효현 활성은 놀라운 것이다. 유사하게 놀라운 것은 공유 결합으로 길항제 Aras-4를 효현제로 전환시킨 cdAras-4에 대한 결과이다. 관찰된 효현 활성 수준은 전장 HGF에 근접한 것이지만, cdD127N, cdD127K, 및 cdAras-4는 전장 HGF에 비해 실질적으로 개선된 안정성을 보유하고 효모에서 재조합적으로 발현될 수 있다.
4.4 N-말단 시스테인만이 동종이량체화를 직접 매개한다. NK1 동종이량체의 결정 구조를 기반으로, 127번 위치가 인접한 프로모터에 매우 근접한 것을 인식하였다. 이는 이 위치에서 시스테인 잔기를 배치함으로써 공유 결합된 동종이량체를 형성할 가능성을 시사하였다. 이러한 가능성을 테스트하기 위해, 잔기 D127을 Cys로 치환한 변이체 Aras-4 폴리펩타이드를 생성하였다. 생성된 폴리펩타이드는 대체로 (미국 특허 제9,556,248호의) 도 18에 나타낸 바와 같이 페나트롤린-황산구리 처리 후 또는 자발적으로 이량체를 생성하지 못하였다.
NK1 및 변이체의 N-말단에서 유리 시스테인의 추가를 통한 공유 결합에 추가적으로, 다른 위치 및 링커를 테스트하였다. (미국 특허 제9,556,248호의 도 19). 유리 시스테인 또는 유리 시스테인과 시스테인 태그의 조합(Backer et al. (2006) Nat. Med. 13(4):504-509)을 Aras-4 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 부착하였다. N-말단의 유리 시스테인만 효모에서 재조합 발현시 이량체 단백질을 생성하였다.
5.0 헤파린 알지네이트 펠릿을 포함하는 HGF 변이체 폴리펩타이드의 제조. 칼슘 알지네이트 펠릿은 향상된 활성 유지 및 저장 시간으로 인해 HGF에 대한 안정적인 플랫폼을 제공할 수 있으므로 제어된 HGF 변이체 방출을 위한 장치로서 사용될 수 있다. 헤파린-세파로스 비드(Pharmacia LKB)를 자외선 하에서 30분 동안 멸균한 다음 필터-멸균된 소듐 알지네이트와 혼합할 수 있다. 그 다음 혼합한 슬러리를 바늘을 통해 CaCl2(1.5% wt/vol.)의 경화 용액이 들어있는 비커에 떨어뜨릴 수 있다. 비드가 즉시 형성될 수 있다. CaCl2 용액에서 5분 동안 부드럽게 혼합한 다음 혼합하지 않으면서 10분 동안 캡슐을 인큐베이션함으로써 가교-결합된 캡슐 외피를 얻을 수 있다. 형성된 비드를 멸균수로 세척하고 4℃에서 0.9% NaCl-1 mmol/L CaCl2에 저장할 수 있다. 4℃에서 부드럽게 교반하면서 0.9% NaCl-1 mmol/ℓ CaCl2-0.05% 젤라틴에서 10개의 캡슐을 12.5 ㎍(10 ㎍ 용량의 경우) 또는 125 ㎍(100 ㎍ 용량의 경우) 또는 HGF 변이체와 함께 16시간 동안 인큐베이션함으로써 HGF 로딩을 수행할 수 있다. 최종 생성물을 자외선 하에서 30분 동안 멸균할 수 있다.
실시예 7: HGF/FGF의 조합을 사용하는 각막 치료
눈의 돔 형상의 가장 바깥쪽 조직으로서의 보호 역할에도 불구하고, 보통 투명한 각막은 손상 또는 질환으로 인한 궤양, 흉터 및 혼탁화에 매우 취약하다. 각막의 중증 손상 및 질환에 있어서, 현재 이용 가능한 수많은 그러나 대부분의 지지적 조치에도 불구하고 영구적인 흉터 및 시력 손실이 종종 뒤따른다1. 말기 각막 실명은 각막의 보통 투명한 각막 층 중 하나 이상의 혈관신생 및 혼탁화에 이은 부종과 섬유성 흉터를 특징으로 한다(도 38). 안구 표면의 거의 모든 실명 장애는 그것이 감염성(예를 들어, 중증 각막 궤양 또는 헤르페스성 각막염), 면역-매개성(예를 들어, 스티븐스-존슨 증후군), 및 또는 외상성(예를 들어, 알칼리 화상)인지 여부에 관계없이, 상피 결손의 손상된 치유로 시작되고, 불투명한 혈관화 각막으로 끝난다. 혈청 점안액1 및 양막2과 같은 조직-유래 치료법은 임상적으로 널리 사용되지만, 두 치료법의 분자 조성 및 기본 메커니즘은 여전히 불분명하다2. 반대로, 표피 성장 인자(EGF)와 같은 단일 재조합 성장 인자는 임상 시험에서 실패하였으며3, 이는 각막 상처 치유를 충분히 지원하기 위해 다인성 개입이 필요함을 시사한다. 이러한 가설과 일치하여, 본 발명자들의 예비 데이터4 및 다른 그룹의 데이터는 상처입은 눈에 적용된 인간 중간엽 줄기세포(MSC)의 분비 인자(분비체)가 상피화를 가속화하고 동물 모델에서 혈관신생 및 흉터를 억제한다는 것을 나타내었다5. 그렇지만, 이들 영향의 원인이 되는 정확한 요인은 아직 알려져 있지 않다. 이들의 치료적 가능성은 부인할 수 없지만, 안구 표면에 MSC를 직접 투여하는 것은 물류 문제와 예측불가능을 수반한다. 예비 데이터가 동기를 부여하여, 본 발명자들은 MSC 분비체의 재생 효과가 (i) 상피 세포 증식 및 이동을 유도하고, (ii) 각막의 혈관신생 및 흉터를 줄이는 경로로 변할 수 있다고 판단하였다. 본 발명자들은 MSC 분비체의 상처 치유 효과에 의해 정보를 얻고 영감을 받은 조작된 치료적 생체분자로 구성된 합리적으로 설계되고, 정의된 조합 국소 치료법을 개발하고 있다. 이러한 정의된 치료법은 새로운 조작된 HGF(eHGF) 단편으로8-11 재조합 간세포 성장 인자(rHGF)6,7의 알려진 영양 효과를 개선시키고 이를 섬유아세포 성장 인자(FGF)의 신생혈관 및 섬유화 효과의 조작된 길항제와 조합시킬 것이다.
도 39에 요약된 바와 같이, 히알루론산(HA) 및 콘드로이틴 설페이트(CS)의 점탄성 겔 담체 내에서 전달된 골수-유래 MSC의 분비체의 단지 1일 1회의 적용으로 래트에서 상피 상처 치유를 가속화하고 각막 알칼리 화상 후 혈관신생 및 흉터를 방지하는 것으로 나타났다4. 재조합 HGF(rHGF)는 각막 상피 상처 치유를 촉진시키고7, 동물에서 정맥 주사 MSC의 효과를 복제하는 것으로 나타났다6. 그러나, rHGF는 제조하기 어렵고, 수용액에서 상대적으로 불안정하며, 전형적으로 안과 용도로 요구되는 고용량에서 엄청나게 비싸다. 단백질 조작 방법은 야생형 성장 인자와 비교하여 안정성, 효현 활성, 및 재조합 발현 수율이 상당히 개선된 HGF의 신규한 단편을 생성하는 데 사용되었다8-11.
이 실시예는 이러한 조작된 HGF(eHGF) 단편 단독으로 알칼리 화상 후 각막에서 상피 치유를 가속화할 수 있음을 나타낸다(도 39). 추가적으로, 세포 배양물 분석에서 FGF 수용체(FGFR) 길항제로서 유망한 속성을 가지는 FGF의 변이체를 개발하기 위해 고속대량 스크리닝 접근법을 수행하였다. FGFR 길항제는 FGF가 상류를 조절하는 것으로 알려진 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-매개 혈관신생 및 전환 성장 인자(TGF) 베타-매개 섬유화 효과를 저해할 수 있었다12,13. 이러한 HGF 수용체 효현제 및 FGFR 길항제 조합을 래트 및 예비 작업에서의 각막 알칼리 화상 모델에서 함께 테스트하였으며, 이는 현저하게 전체 MSC 분비체의 상처 치유, 항-섬유화, 및 항-신생혈관 효과를 복제하는 것으로 보인다(도 40).
이러한 병용 요법은 (1) 지속성 각막 상피 결손(PCED), 및 (2) 각막 혈관신생에 사용하기 위한 잠재력을 가진다. PCED는 발의 치유되지 않은(예를 들어, 당뇨병성) 궤양에 상응하는 안구 질환이다. PCED는 상피 치유 및 결손 봉합의 과정이 지연되어 궤양, 감염, 흉터, 천공 및 시력 손실을 초래할 수 있는 각막 상피 결손을 야기할 때 일어난다. eHGF 분자 단독은 PCED를 해결할 수 있는 잠재력을 가지며, 여기서 유일한 목표는 상피 미란, 찰과상, 또는 궤양의 봉합이다. PCED는 손상, 이전 안구 수술, 감염(예를 들어, 이전 헤르페스성 감염 또는 중증 세균성 궤양) 또는 안 질환(중증 안구건조증, 당뇨병, 눈꺼풀 이상으로 인한 만성 노출, 및 조혈 줄기세포 이식 후 안구 이식편대숙주병과 같은 기저 병태를 포함함)으로 인해 발생할 수 있다. 안구건조증 및 당뇨병은 PCED 사례의 50% 초과를 차지하는 것으로 추정된다1. 당뇨병은 전신 손상 조직 복구에 기여하고, 각막 표면에는 영향을 미치지 않는다. 보건 의료인의 경우, 당뇨병성 각막 질환과 안구건조증으로 인한 상피 결손 환자를 관리하는 것은 어렵고 시간과 비용이 많이 들고, 자원-집중적이다. 환자는 종종 장기적인 질환의 치료를 위해 반복적으로 진료 방문을 해야 한다. 유사하게, 중등도에서 중증의 안구건조증의 영향은 범주에서 투석 및 중증 협심증과 같은 병태와 비슷하며, 상당한 불편함, 역할 제한, 낮은 활력 및 좋지 않은 일반 건강과 연관된다1,2. 전반적으로, 미국에서 연간 PCED의 추정된 수치는 대략 73,434 내지 99,465건이다. 200,000 미만인 PCED 자체는 희귀 질환으로 간주된다4. 현재 치료법은 다양한 결과를 생성하며, 환자에 대하여 침습적이고, 비용이 많이 들며, 불편할 수 있다. 기존의 승인된 약리 치료법이 없는 PCED는 충족되지 않은 주요한 의학적 요구를 나타낸다14.
현재 PCED를 치유하기 위한 치료법은 윤활제, 붕대(콘택트 렌즈, 패치 및 침습적 수술 그래프), 및 자가 혈청, 양막 및 제대 유체를 통해 제공되는 내인성 성장 인자로 이루어지는 일시적 조치를 이용한 차선책이다. 그러나, 이러한 치료는 시기적절한 방식으로 각막 결손을 완전히 치유하지 못할 수 있다. 당뇨병성 각막 상피증에서는, 당뇨병성 신경 관여로 인해 각막 감각이 감소한다5. 치료용의 액체로 채워진 아치형의 콘택트 렌즈 및 수술적 개입, 예컨대, 안검봉합술이 또한 사용되었다. 신선-냉동 또는 냉동-건조 제제에서 양막은 PCED 위의 장소로 넣고 봉합될 수 있다. (환자 자신의 스핀다운된 혈액으로부터의) 자가 혈청 눈물은 안구 표면에 필수적인 인자를 제공함으로써 치유를 촉진시키는 것으로 나타났다. PCED 또는 심하게 건조한 안구 표면의 정확한 원인에 관계없이, 최종 목표는 눈의 손상된 외부 상피층을 폐쇄하고 치유하는 것이다. 이러한 방식으로, 국소 eHGF 화합물 단독은 근본적인 원인과 무관한 보다 보수적인 조치에 저항성인 PCED 환자에 대한 매력적인 선택권이 될 것이다.
eHGF 및 항-FGFR의 조합의 경우, 각막 혈관신생은 목표 미충족 요구이며, 이는 매사추세츠 눈 및 귀/하버드 의과대학 연구에서 발표된 4.14% 유병률의 외삽을 기반으로 매년 140만 명의 환자에게 영향을 미치는 것으로 추정된다. 비정상적인 각막 혈관신생(이에 대해서는 FDA-승인된 치료법이 없음)은 전형적으로 PCED의 말기 또는 중증 징후 및/또는 외상 또는 질환을 통한 각막 주변의 상피 줄기세포의 손실 또는 파괴로서 일어난다. 이의 고전적인 예는 화학적 각막 화상으로, 이는 100,000명당 10.7명(모든 안구 외상의 11.5% 내지 22.1%를 나타냄)에게 영향을 미치며, 여기서 말초 줄기세포가 심하게 고갈되어, 치유 지연 및 각막으로의 혈관 성장을 야기한다. 화학적 화상, 구체적으로 알칼리 화상은 눈에 의해 지속될 수 있는 가장 치명적인 손상이라는 것은 거의 틀림이 없으며, 현재 이용 가능한 모든(대부분 지지적) 조치에도 불구하고 거의 예외 없이 각막 및 결막의 반흔화, 각질화, 혼탁화, 및 혈관신생을 통해 실명으로 이어진다. 따라서, 이는 제안된 eHGF/항-FGFR 병용 요법에 의해 표적화된 다중 경로뿐만 아니라 확립된 동물 모델에 대한 이상적인 표적이며, 여기서 이들의 조합은 혈관신생 및 섬유증을 저해하면서 상피화를 촉진시키는 것으로 나타났다(도 40). 각막의 화학적 화상 이외에, 현재 치료법이 없지만 스티븐스-존슨 증후군, 윤부 줄기세포 결핍, 및 심지어 콘택트 렌즈 과도착용을 포함하는 eHGF/항-FGFR 병용 기술에 의해 잠재적으로 해결 가능한 각막 혈관신생의 수많은 다른 원인이 있으며, 이들 모두는 코어에서 투명한 무혈관 각막과 이에 인접한 고도의 혈관 결막 조직 사이의 장벽에서 손상을 나타낸다.
방법:
동물
7 내지 8주령의 야생형 래트(Charles River Laboratories)를 이 실험에서 사용하였다. 래트를 마취시키고 절차 전에 좌측 눈에 0.5 ㎎/㎏ 부프레노르핀 SR, 및 0.5% 프로파라카인 하이드로클로라이드 1방울을 피하 투여하였다.
각막 손상
각막의 중앙부에 4㎜ 직경의 1N NaOH-포화 여과지를 1분 동안 적용한 다음 100㎖의 멸균 식염수 용액으로 헹굼으로써 알칼리 화상 손상을 수행하였다.
성장 인자 투여 및 각막 상처 복구의 평가
알칼리 화상 직후, 백색 및 코발트 블루 광 조건 하에서 각막의 사진 이미지를 촬영하였다. 플루오레세인 염료를 각막 표면에 도포하여 코발트 블루 광 하에서 상피 결손 영역을 평가하였다.
31마리의 래트를 처리 군 당 4 내지 5마리의 래트로 7개의 처리 군으로 나누었다. 처리 군은 음성 대조군으로서 멸균 식염수, 히알루론산 겔(DisCoVisc) 식염수(HA/CS) 혼합물, 식염수 현탁액 중 0.01% eHGF, 식염수 현탁액 중 0.01% FGF-1 길항제, 식염수 현탁액 중 0.02% eHGF-FGF-1 길항제, HA/CS 겔 중 0.02% eHGF-FGF-1 길항제, 및 식염수 현탁액 중 0.01% eHGF에 이어, 1% 프레드니솔론 아세테이트를 포함하였다. 손상 당일 사진을 촬영한 후, 각각의 래트에 10㎕ 결막하 주사 1회 및 적절한 물질의 20㎕ 국소 처리 1회를 투여하였다. 결막하 주사가 10㎕의 eHGF이고, 국소 치료가 20㎕의 eHGF에 이어 20㎕의 프레드니솔론 아세테이트인 스테로이드 군의 경우를 제외하고, 각각의 래트에서 결막하 치료 및 국소 치료는 동일한 물질과 농도로 이루어졌다.
매일 사진을 촬영하고 국소 치료를 1일 1회 총 14일 동안 투여하였다. 손상 후 14일째 날에 최종 사진을 촬영하고 래트를 안락사시키고 적출을 수행하였다. NIH ImageJ 소프트웨어를 이용하여 매일 사진을 검사함으로써 상피 결손 영역을 계산하였다. 각막 혼탁화 및 혈관신생을 평가하는 데 사진을 사용하였다.
면역조직화학
전체 안구의 동결절단물을 고정하였다. 절단물을 면역염색하고 공초점 현미경으로 검사하였다.
RNA 단리 및 실시간 qPCR
RNeasy 마이크로 키트를 사용하여 총 RNA를 단리하였다. 단리된 RNA를 cDNA로 역전사하였다. 실시간 qPCR을 수행하고 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH), 알파 평활근 액틴에 대한 프라이머로 수행하였다. 결과를 분석하고 GAPDH에 대해 정규화하였다.
미래 연구:
기계적 각막 손상 모델에서 조작된 HGF의 상처 치유 효과의 특성화 및 제어. 인산화 분석을 사용하여 이전에 혈관 내피 세포에서 수행된 것과 같이 일차 배양된 각막 상피 세포의 HGF 수용체에 대한 eHGF의 활성을 확인하고 설명할 것이다8. 각막 상피화에 대한 eHGF 대 rHGF 및 전체 MSC 분비체의 농도 및 담체-의존성 효과를 시험관 내 및 기관 배양물-기반 상처 치유 분석 둘 다를 통해 테스트할 것이다. 중증 안구 건조 상태(다른 곳에 기재된 확립된 모델을 통해), 또는 기계적 변연절제술 모델의 유도 후 생체 내에서 기계적으로 손상된 래트 각막으로 전달된 히알루론산-기반 겔 담체의 유무에 관계없이 eHGF를 평가하고, rHGF 및 전체 MSC 분비체의 상처 치유 효과에 대한 농도 및 담체-의존성 효과를 적정할 계획이다.
알칼리 각막 화상 모델에서 흉터 및 혈관신생을 방지하기 위해 정의된 조합 요법을 최적화한다. 항-섬유화제와 HGF의 영양 효과를 결합하면 MSC 분비체의 재생 효과를 반복할 것이 예상된다. eHGF는, 또한 HGF 수용체의 HGF-매개 활성화를 통해 상피 상처 치유를 촉진하면서 각막의 알칼리 화상 후 일어나는 기질 섬유증 및 혈관신생을 감소시킬 목적으로, (a) 조작된 FGFR 길항제, (b) 항-VEGF 작용제인 베바시주맙, 또는 (c) 국소 스테로이드와 짝을 이룰 것이다. 이 쌍은 생체내에서 알칼리-화상을 입은 래트 각막으로 전달되는 히알루론산-기반 겔 담체 유무에 관계없이 테스트될 것이며, 이를 전체 MSC 분비체의 상처 치유 효과에 대하여 비교함으로써 상대 비율을 적정할 것이다. 상피 및 기질 무결성 및 표현형, 각막 투명도, 혈관신생, 및 염증에 대한 임상 및 조직학적 증거는 치료 후 결과 척도로서 사용될 것이다.
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Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu
1 5 10 15
Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln
20 25 30
Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr
35 40 45
Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val
50 55 60
Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu
65 70 75 80
Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys
85 90 95
Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe
100 105 110
Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys
115 120 125
Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys
130 135 140
Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His
145 150 155 160
Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr
165 170 175
Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser
180 185 190
Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu
195 200 205
Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp
210 215 220
His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro
225 230 235 240
His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp
245 250 255
Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr
260 265 270
Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys
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325 330 335
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385 390 395 400
Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp
405 410 415
Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala
420 425 430
Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His
435 440 445
Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys
450 455 460
Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu
465 470 475 480
Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val
485 490 495
Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg
500 505 510
Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp
515 520 525
Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr
530 535 540
Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys
545 550 555 560
Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly
565 570 575
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Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu
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Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu
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Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly
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Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile
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<400> 2
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Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr
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Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln
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Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr
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Ile Ile Gly Asn Gly Arg Ser Tyr Arg Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys
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465 470 475 480
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<212> PRT
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<300>
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580 585 590
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595 600 605
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625 630 635 640
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660 665 670
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Pro Gln Ser
<210> 24
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker amino acid
<400> 24
Lys Glu Ser Cys Ala Lys Lys Gln Arg Gln His Met Asp Ser
1 5 10
<210> 25
<211> 140
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF1 Polypeptide
<400> 25
Phe Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys
1 5 10 15
Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp
20 25 30
Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Ser Ala
35 40 45
Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln Tyr
50 55 60
Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn
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Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr
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<210> 26
<211> 140
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF1 variant BS4M1
<400> 26
Phe Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys
1 5 10 15
Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asn Gly Thr Val Asp
20 25 30
Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Ser Ala
35 40 45
Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln Tyr
50 55 60
Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn
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Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr
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Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys
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Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn
65 70 75 80
Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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65 70 75 80
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385 390 395 400
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420 425 430
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450 455 460
Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu
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Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val
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565 570 575
Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp
580 585 590
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595 600 605
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725
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Immunoglobulin IgG1
<400> 33
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65 70 75 80
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225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Immunoglobulin IgG2
<400> 34
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1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
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225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 35
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Immunoglobulin IgG3
<400> 35
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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210 215 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
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260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
275 280 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 36
<211> 327
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Immunoglobulin IgG4
<400> 36
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 37
<211> 723
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu
1 5 10 15
Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln
20 25 30
Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr
35 40 45
Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val
50 55 60
Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu
65 70 75 80
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85 90 95
Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe
100 105 110
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195 200 205
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210 215 220
Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe
225 230 235 240
Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg
245 250 255
Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro His
260 265 270
Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys Ala Asp Asn Thr Met
275 280 285
Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln
290 295 300
Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro
305 310 315 320
Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu His Asp Met Thr Pro
325 330 335
Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro
340 345 350
Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg
355 360 365
Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp Met Ser His Gly Gln
370 375 380
Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Gln
385 390 395 400
Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp
405 410 415
Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Glu
420 425 430
Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr
435 440 445
Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys
450 455 460
Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu Asp His Pro Val Ile
465 470 475 480
Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val Asn Gly Ile Pro Thr
485 490 495
Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His
500 505 510
Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp Val Leu Thr Ala Arg
515 520 525
Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly
530 535 540
Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gln Val Leu
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Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp Leu Val Leu
565 570 575
Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp Phe Val Ser Thr Ile
580 585 590
Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr Ser Cys Ser
595 600 605
Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn Tyr Asp Gly Leu Leu
610 615 620
Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His
625 630 635 640
His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu Ile Cys Ala Gly Ala
645 650 655
Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu
660 665 670
Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu Gly Val Ile Val Pro
675 680 685
Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe Val Arg Val
690 695 700
Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile Leu Thr Tyr Lys Val
705 710 715 720
Pro Gln Ser
Claims (33)
- 인간 간세포 성장 인자(hHGF) 변이체 및 인간 섬유아세포 성장 인자 1(FGF1) 변이체를 대상체에게 투여하여 지속성 각막 상피 결손(PCED)을 치료 및/또는 예방하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 PCED를 치료 및/또는 예방하는 방법.
- hHGF 변이체 및 FGF 변이체를 대상체에게 투여하여 각막 혈관신생을 치료, 감소 및/또는 예방하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 각막 혈관신생을 치료, 감소 및/또는 예방하는 방법.
- 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 FGF1 변이체는 아미노산 치환, 아미노산 결실, 아미노산 부가 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 구성원을 포함하고, 얻어진 FGF1 변이체는 서열번호 1의 야생형 FGF1과 비교하여 증가된 단백질분해 안정성을 나타내는 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 FGF1 변이체는 β-루프에서 또는 C-말단 근처에서 아미노산 치환, 아미노산 결실, 아미노산 부가 및 이들의 조합을 포함하는 방법. - 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
상기 FGF1 변이체는 섬유아세포 성장 인자 수용체(FGFR) 길항제인 방법. - 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
상기 FGF1 변이체는 28, 40, 47, 93 또는 131번 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 방법. - 청구항 6에 있어서,
상기 FGF1 변이체는 D28N, Q40P, S47I, H93G, L131R, 및 L131K로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 방법. - 청구항 6에 있어서,
상기 FGF1 변이체는 아미노산 치환 L131R을 포함하는 방법. - 청구항 6에 있어서,
상기 FGF1 변이체는 아미노산 치환 L131K를 포함하는 방법. - 청구항 6에 있어서,
상기 FGF1 변이체는 아미노산 치환 D28N 및 L131R을 포함하는 방법. - 청구항 6에 있어서,
상기 FGF1 변이체는 아미노산 치환 D28N 및 L131K를 포함하는 방법 - 청구항 6에 있어서,
상기 FGF1 변이체는 아미노산 치환 Q40P, S47I, H93G 및 L131R을 포함하는 방법. - 청구항 6에 있어서,
상기 FGF1 변이체는 아미노산 치환 Q40P, S47I, H93G 및 L131K를 포함하는 방법. - 청구항 6에 있어서,
상기 FGF1 변이체는 아미노산 치환 D28N, Q40P, S47I, H93G 및 L131R을 포함하는 방법. - 청구항 6에 있어서,
상기 FGF1 변이체는 아미노산 치환 D28N, Q40P, S47I, H93G 및 L131K를 포함하는 방법. - 청구항 6에 있어서,
상기 FGF1 변이체는 아미노산 치환 L131A를 포함하지 않는 방법. - 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서,
상기 hHGF는 서열번호 8의 야생형 hHGF와 비교하여 아미노산 치환, 아미노산 결실, 아미노산 부가 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 구성원을 포함하는 방법. - 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서,
상기 hHGF 변이체는 62, 127, 137, 170, 또는 193번 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 방법. - 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서,
상기 hHGF 변이체는 K62E, N127D/A/K/R, K137R, K170E, 및 N193D로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 방법. - 청구항 1 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서,
상기 hHGF 변이체는 아미노산 치환 K62E, N127D/A/K/R, K137R, K170E, 및 N193D를 포함하는 방법. - 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 있어서,
상기 hHGF 변이체는 Met의 길항제인 방법. - 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 있어서,
상기 hHGF 변이체는 Met의 효현제인 방법. - 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서,
상기 hHGF 변이체는 검출 가능한 모이어티, 수용성 중합체, 수불용성 중합체, 치료용 모이어티, 표적화 모이어티, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원에 접합되는 방법. - 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서,
상기 hHGF 변이체는 64, 77, 95, 125, 130, 132, 142, 148, 154, 및 173번 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함하는 방법. - 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서,
상기 hHGF 변이체는 도 41에서 제공되는 미국 특허 제9,556,248호의 서열번호 2 내지 서열번호 22로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 방법. - 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서,
상기 hHGF 변이체는 아미노산 치환 K62E, Q95R, I125T, N127D/A/K/R, I130V, K132N/R, K137R, K170E, Q173R, 및 N193D를 포함하는 방법. - 청구항 26에 있어서,
상기 hHGF 변이체는 64, 77, 142, 148, 및 154번 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함하는 방법. - 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서,
상기 hHGF 변이체는 아미노산 치환 K62E, Q95R, K132N, K137R, K170E, Q173R, 및 N193D를 포함하는 방법. - 청구항 28에 있어서,
상기 hHGF 변이체는 64, 77, 125, 127, 130, 142, 148, 및 154번 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함하는 방법. - 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서,
상기 hHGF 변이체는 아미노산 치환 K62E, Q95R, N127D/A/K/R, K132N/R, K137R, K170E, Q173R, 및 N193D를 포함하는 방법. - 청구항 30에 있어서,
상기 hHGF 변이체는 64, 77, 125, 130, 142, 148, 및 154번 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함하는 방법. - 청구항 1 내지 청구항 31 중 어느 한 항에 있어서,
상기 hHGF 변이체는 서열번호 2 내지 서열번호 22로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 방법. - 청구항 1 내지 청구항 31 중 어느 한 항에 있어서,
상기 HGF 변이체는 효현제이고, 상기 FGF1 변이체는 길항제인 방법.
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