JP2022513196A - 治療のために操作された肝細胞増殖因子バリアントと組み合わされた操作された線維芽細胞増殖因子バリアント - Google Patents

治療のために操作された肝細胞増殖因子バリアントと組み合わされた操作された線維芽細胞増殖因子バリアント Download PDF

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Abstract

本発明は、治療で使用するためのポリペプチドバリアント、特に、角膜上皮欠損（ＰＣＥＤ）及び／または角膜血管新生を治療するために組み合わせて使用するための線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のバリアント及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のバリアントを提供する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月０９日に出願された「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｖａｒｉａｎｔｓ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｗｉｔｈ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｖａｒｉａｎｔｓ Ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」と題される米国仮特許出願第６２／７４３，４１６号の優先権を主張し、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、治療において使用するためのポリペプチドバリアント、特に、組み合わせて使用するための線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のバリアント及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のバリアントの分野に関する。
ヒト増殖因子は、創傷治癒、組織再生、血管新生、及び腫瘍形成などの多くの複雑なプロセスを編成する上で重要な役割を果たす1～4。したがって、創傷治癒及び再生プロセスを加速させるためのタンパク質治療薬として増殖因子を利用すること、または様々な疾患及び状態においてがんの増殖及び血管新生を阻害することに非常に関心がある5～7。しかしながら、多数の組換え増殖因子が治療薬として開発されてきたにもかかわらず、少数の候補しか臨床承認を受けるのに十分に有効ではなかった8,9。これは、インビボでの増殖因子の有効半減期が短いことに大きく起因し、概して安定性が低く、血液クリアランスが速いことから生じる5,10。治療用増殖因子は、有効であるために、創傷領域内で長期間活性を維持しなければならない。しかしながら、増殖因子は、生理学的温度及びプロテアーゼにさらされると変性するか、または分解され得る11,12。プロテアーゼ媒介性分解に対する耐性は、プラスミン及びメタロプロテイナーゼなどのプロテアーゼが組織リモデリングにおいて特に活性であるため、特に重要であり得る13。
眼に関しては、ドーム状の眼の最も外側の組織として保護的な役割を果たしているにもかかわらず、通常透明な角膜は、損傷または疾患の結果として潰瘍化、瘢痕、及び混濁化を非常に起こしやすい。角膜の重度の損傷及び疾患では、主に対症手段であるが現在利用可能な多数の手段にもかかわらず、永久的な瘢痕及び視力低下が結果として生じることが多い。1末期角膜失明は、角膜の通常透明な層のうちの１つ以上の血管新生及び混濁化、その後の浮腫及び線維性瘢痕を特徴とする。眼表面のほぼすべての盲障害は、それが感染性（例えば、重度の角膜潰瘍またはヘルペス性角膜炎）、免疫媒介性（例えば、スティーブンス－ジョンソン症候群）、及びまたは外傷性（例えば、アルカリ熱傷）であるかにかかわらず、上皮欠損の治癒障害から始まり、不透明な角膜血管新生で終わる。血清点眼薬1及び羊膜2などの組織由来療法は、臨床的に広く使用されているが、両治療の分子組成及び根底にある機序は未だ明確に定義されていない。2逆に、上皮増殖因子（ＥＧＦ）などの単一の組換え増殖因子は、臨床試験で失敗しており、3角膜創傷治癒を完全に支援するために多因子介入が必要であることを示唆している。
ｅＨＧＦと抗ＦＧＦＲとの組み合わせに関して、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｅｙｅ ａｎｄ Ｅａｒ／Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌの研究で公表された４．１４％の有病率の外挿に基づき、年間推定１４０万人の患者に影響を及ぼす角膜血管新生は、目標の必要性を満たしていない。ＦＤＡ承認の治療がない異常な角膜血管新生は、典型的には、ＰＣＥＤの後期もしくは重度の兆候、及び／または外傷もしくは疾患を介して角膜の周辺にある上皮幹細胞の喪失もしくは破壊として生じる。この典型例は、化学角膜熱傷であり、これは１０万人当たり１０．７人（すべての眼の外傷の１１．５％～２２．１％を表す）に影響を及ぼし、末梢幹細胞が重度に枯渇し、治癒の遅延及び角膜上への血管増殖につながる。化学熱傷、特にアルカリ熱傷は、ほぼ間違いなく眼が受け得る最も破壊的な損傷であり、ほぼ例外なく、現在利用可能なすべての（主に対症）手段にもかかわらず、角膜及び結膜の瘢痕化、角質化、混濁化、及び血管新生により失明につながる。したがって、それは、提案されるｅＨＧＦ／抗ＦＧＦＲ併用療法によって標的とされる複数の経路、ならびにそれらの組み合わせが血管新生及び線維症を阻害しながら上皮化を促進することが示されている確立された動物モデルの理想的な標的である（図４０）。角膜化学熱傷の他にも、現在治療法はないが、スティーブンス－ジョンソン症候群、輪部幹細胞欠損、さらにはコンタクトレンズ過剰装用を含む、ｅＨＧＦ／抗ＦＧＦＲ併用技術によって潜在的に対処可能である他の多くの角膜血管新生の原因があり、これらのすべてが、根本的には、透明な無血管角膜とそれに隣接する高血管結膜組織との間の障壁の不全を表している。この併用療法は、新規の操作されたＨＧＦ（ｅＨＧＦ）断片8～11を用いて組換え肝細胞増殖因子（ｒＨＧＦ）6、7の既知の栄養効果を改善し、それを線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の新生血管及び線維化効果の操作されたアンタゴニストと組み合わせる。
本発明は、遷延性角膜上皮欠損（ＰＣＥＤ）ならびに角膜血管新生の治療及び／または予防に使用するための線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のバリアント及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のバリアントを含む併用療法の方法を提供することによって、この必要性を満たす。
本発明は、遷延性角膜上皮欠損（ＰＣＥＤ）の治療及び／または予防を必要とする対象においてそれを治療及び／または予防する方法を提供し、本方法は、ヒト肝細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）バリアント及びヒト線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ１）バリアントを対象に投与し、それによって該ＰＣＥＤを治療することを含む。
本発明は、角膜血管新生の治療、低減、及び／または予防を必要とする対象においてそれを治療、低減、及び／または予防する方法を提供し、本方法は、ｈＨＧＦバリアント及びＦＧＦ１バリアントを対象に投与し、それによって該角膜血管新生を治療、低減、及び／または予防することを含む。
いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１は、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸付加、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含み、結果として生じるＦＧＦ１バリアントは、配列番号１の野生型ＦＧＦ１と比較して、増加したタンパク質分解安定性を示す。
いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントは、βループまたはＣ末端付近においてアミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸付加、及びそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントは、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）アンタゴニストである。
いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントは、２８位、４０位、４７位、９３位、または１３１位に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントは、Ｄ２８Ｎ、Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、Ｌ１３１Ｒ、及びＬ１３１Ｋからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントは、アミノ酸置換Ｌ１３１Ｒを含む。
いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントは、アミノ酸置換Ｌ１３１Ｋを含む。
いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントは、アミノ酸置換Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｒを含む。
いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントは、アミノ酸置換Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｋを含む。
いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントは、アミノ酸置換Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、及びＬ１３１Ｒを含む。
いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントは、アミノ酸置換Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、及びＬ１３１Ｋを含む。
いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントは、アミノ酸置換Ｄ２８Ｎ、Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、及びＬ１３１Ｒを含む。
いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントは、アミノ酸置換Ｄ２８Ｎ、Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、及びＬ１３１Ｋを含む。
いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントは、アミノ酸置換Ｌ１３１Ａを含まない。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、配列番号８の野生型ｈＨＧＦと比較して、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸付加、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、６２位、１２７位、１３７位、１７０位、または１９３位に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、Ｋ６２Ｅ、Ｎ１２７Ｄ／Ａ／Ｋ／Ｒ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、及びＮ１９３Ｄからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、アミノ酸置換Ｋ６２Ｅ、Ｎ１２７Ｄ／Ａ／Ｋ／Ｒ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、及びＮ１９３Ｄを含む。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、Ｍｅｔのアンタゴニストである。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、Ｍｅｔのアゴニストである。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、検出可能な部分、水溶性ポリマー、水不溶性ポリマー、治療部分、標的化部分、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーにコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、６４位、７７位、９５位、１２５位、１３０位、１３２位、１４２位、１４８位、１５４位、及び１７３位のうちの１つ以上にアミノ酸置換をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、図４１に提供される米国特許第９，５５６，２４８号からの配列番号２～２２からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、アミノ酸置換Ｋ６２Ｅ、Ｑ９５Ｒ、Ｉ１２５Ｔ、Ｎ１２７Ｄ／Ａ／Ｋ／Ｒ、Ｉ１３０Ｖ、Ｋ１３２Ｎ／Ｒ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、Ｑ１７３Ｒ、及びＮ１９３Ｄを含む。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、６４位、７７位、１４２位、１４８位、及び１５４位のうちの１つ以上にアミノ酸置換をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、アミノ酸置換Ｋ６２Ｅ、Ｑ９５Ｒ、Ｋ１３２Ｎ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、Ｑ１７３Ｒ、及びＮ１９３Ｄを含む。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、６４位、７７位、１２５位、１２７位、１３０位、１４２位、１４８位、及び１５４位のうちの１つ以上にアミノ酸置換をさらに含む。
いくつかの実施形態では、該ｈＨＧＦバリアントは、アミノ酸置換Ｋ６２Ｅ、Ｑ９５Ｒ、Ｎ１２７Ｄ／Ａ／Ｋ／Ｒ、Ｋ１３２Ｎ／Ｒ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、Ｑ１７３Ｒ、及びＮ１９３Ｄを含む。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、６４位、７７位、１２５位、１３０位、１４２位、１４８位、及び１５４位のうちの１つ以上にアミノ酸置換をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｈＨＧＦバリアントは、配列番号２～２２からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＧＦバリアントは、アゴニストであり、ＦＧＦ１バリアントは、アンタゴニストである。
タンパク質分解安定性を操作するための増殖因子の酵母提示。目的の増殖因子（ＧＦ）は、２つのジスルフィド結合によって細胞壁タンパク質Ａｇａ１ｐに結合される接着タンパク質凝集素Ａｇａ２ｐへの融合物として発現される。プロテアーゼとインキュベートすると、切断は、増殖因子内（増殖因子特異的切断）または酵母提示タンパク質Ａｇａ１ｐもしくはＡｇａ２ｐ内（非特異的切断）のいずれかで生じ得る。増殖因子受容体（ＧＦＲ－Ｆｃ）の可溶性Ｆｃ融合物とインキュベートした後、蛍光抗体を使用して、ＨＡタグ、ｃ－ｍｙｃタグ、及びＦｃドメインについて染色することができる。ＨＡシグナルを使用して、増殖因子の基底発現レベル及びプロテアーゼによる非特異的切断を測定する。Ｃ－ｍｙｃシグナルをＨＡシグナルと併用して、ＧＦ特異的切断を測定する。Ｆｃシグナルを使用して、ＧＦ変性のレベル及びその受容体に対するＧＦの結合親和性を測定する。 タンパク質分解的に安定した増殖因子変異体のためのＦＡＣＳに基づくスクリーニング方法。増殖因子変異体のライブラリは、ＥＢＹ１００酵母細胞に形質転換され、酵母提示によって増殖因子を提示するように誘導される。細胞をプロテアーゼと共にインキュベートし、洗浄した後、受容体の可溶性Ｆｃ融合物と共にインキュベートする。適切な蛍光抗体で標識した後、フロー活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、低レベルのタンパク質分解切断及び高レベルの可溶性受容体への結合を有する変異体を発現する細胞をゲートし、収集する。このインキュベーション及び細胞選別プロセスを複数回繰り返して、最大レベルのタンパク質分解安定性を有する変異体を特定する。 ＦＧＦ１の酵母提示。（Ａ）ＦＧＦ１は、２つのジスルフィド結合によって細胞壁タンパク質Ａｇａ１ｐに結合される接着タンパク質凝集素Ａｇａ２ｐへの融合物として発現される。ＦＧＦＲ１－Ｆｃは、ＦＧＦ１に結合する対応する可溶性受容体である。（Ｂ）ｃ－ｍｙｃタグの蛍光標識は、ＦＧＦ１が酵母の表面上で良好に発現されることを示す。（Ｃ）ＦＧＦＲ１のＦｃ融合は、酵母提示ＦＧＦ１への特異的結合を示す。表面提示ＦＧＦ１を発現する酵母を、様々な濃度で可溶性ＦＧＦＲ１－Ｆｃと共に３時間インキュベートした。細胞を洗浄し、可溶性ＦＧＦＲ１－Ｆｃについて抗Ｆｃ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８で染色した。酵母細胞への結合に関連する蛍光をフローサイトメトリーにより測定し、プロットした。 ウシ胎仔血清によるタンパク質分解安定性アッセイ。ＦＧＦ１変異体ライブラリを提示する酵母細胞を、異なる濃度のウシ胎仔血清と共にインキュベートした。細胞を洗浄し、１０ｎＭのＦＧＦＲ１－Ｆｃと共にインキュベートした後、細胞を、ｃ－ｍｙｃ及び可溶性受容体のＦｃドメインについて蛍光抗体で染色した。フローサイトメトリーによる分析は、ＦＢＳの濃度の増加は、ＦＧＦ１特異的切断シグナルならびにＦＧＦＲ１－Ｆｃ結合シグナルに対する影響が比較的少ないことを示す。 トリプシンを用いたタンパク質分解安定性アッセイ。ＦＧＦ１を提示する酵母細胞を、異なる濃度のトリプシンと共にインキュベートした。細胞を洗浄し、１０ｎＭのＦＧＦＲ１－Ｆｃと共にインキュベートした後、細胞を、ｃ－ｍｙｃ及び可溶性受容体のＦｃドメインについて蛍光抗体で染色した。フローサイトメトリーによる分析は、トリプシンの濃度の増加は、酵母提示タンパク質の切断（ｃ－ｍｙｃの減少）及びＦＧＦＲ１－Ｆｃへの結合の喪失をもたらすことを示す。 キモトリプシンを用いたタンパク質分解安定性アッセイ。ＦＧＦ１を提示する酵母細胞を、異なる濃度のキモトリプシンと共にインキュベートした。細胞を洗浄し、１０ｎＭのＦＧＦＲ１－Ｆｃと共にインキュベートした後、細胞を、ｃ－ｍｙｃ及び可溶性受容体のＦｃドメインについて蛍光抗体で染色した。フローサイトメトリーによる分析は、キモトリプシンの濃度の増加は、酵母提示タンパク質の切断（ｃ－ｍｙｃの減少）及びＦＧＦＲ１－Ｆｃへの結合の喪失をもたらすことを示す。 トリプシンによる酵母提示タンパク質Ａｇａ１及びＡｇａ２の非特異的切断。ＦＧＦ１を提示する酵母細胞を、異なる濃度のトリプシンと共にインキュベートした。洗浄後、細胞を、ＨＡ及びｃ－ｍｙｃについて蛍光抗体で染色した。フローサイトメトリーによる分析は、トリプシンの濃度の増加は、ＨＡシグナルの喪失をもたらすことを示し、酵母提示タンパク質Ａｇａ１及びＡｇａ２の非特異的切断を示す。 トリプシンによる酵母提示タンパク質Ａｇａ１及びＡｇａ２の非特異的切断。ＦＧＦ１を提示する酵母細胞を、異なる濃度のトリプシンと共にインキュベートした。洗浄後、細胞を、ＨＡ及びｃ－ｍｙｃについて蛍光抗体で染色した。フローサイトメトリーによる分析は、トリプシンの濃度の増加は、ＨＡシグナルの喪失をもたらすことを示し、酵母提示タンパク質Ａｇａ１及びＡｇａ２の非特異的切断を示す。 キモトリプシンによるＦＧＦ１特異的切断。ＦＧＦ１を提示する酵母細胞を、異なる濃度のトリプシンと共にインキュベートした。洗浄後、細胞を、ＨＡ及びｃ－ｍｙｃについて蛍光抗体で染色した。フローサイトメトリーによる分析は、キモトリプシンの濃度の増加は、ｃ－ｍｙｃシグナルの喪失をもたらすが、ＨＡシグナルの喪失はもたらさないことを示し、ＦＧＦ１特異的切断が生じることを示す。 キモトリプシンによるＦＧＦ１特異的切断。ＦＧＦ１を提示する酵母細胞を、異なる濃度のトリプシンと共にインキュベートした。洗浄後、細胞を、ＨＡ及びｃ－ｍｙｃについて蛍光抗体で染色した。フローサイトメトリーによる分析は、キモトリプシンの濃度の増加は、ｃ－ｍｙｃシグナルの喪失をもたらすが、ＨＡシグナルの喪失はもたらさないことを示し、ＦＧＦ１特異的切断が生じることを示す。 プラスミンを用いたタンパク質分解安定性アッセイ。ＦＧＦ１を提示する酵母細胞を、異なる濃度のプラスミンと共にインキュベートした。洗浄後、細胞を、ＨＡ及びｃ－ｍｙｃについて蛍光抗体で染色した。フローサイトメトリーによる分析は、ＦＧＦ１の濃度依存的切断があることを示す。 プラスミンによるＦＧＦ１特異的切断。ＦＧＦ１を提示する酵母細胞ならびに酵母提示タンパク質Ａｇａ１及びＡｇａ２のみを発現する空の対照を、１２５ｎＭのプラスミンと共にインキュベートした。洗浄後、細胞を、ＨＡ及びｃ－ｍｙｃについて蛍光抗体で染色した。フローサイトメトリーによる分析は、プラスミンの濃度の増加は、ＦＧＦ１を提示する酵母細胞に関してはｃ－ｍｙｃシグナルの喪失をもたらすが、空の対照を提示する酵母細胞に関しては喪失をもたらさないことを示す。これにより、プラスミンによる酵母提示タンパク質の切断がＦＧＦ１特異的であることが確認される。 野生型ＦＧＦ１とタンパク質分解的に安定したＰＭ２との区別によるタンパク質分解安定性アッセイの検証。プラスミンは、様々なプラスミン濃度で２日間インキュベートした後に、酵母表面提示により野生型ＦＧＦ１とタンパク質分解的に安定した変異体（ＰＭ２）との区別を可能にする。これは、プラスミンに基づくスクリーニングが新しいタンパク質分解的に安定した変異体を特定する能力を示す。 選別１：ＦＧＦＲ１－Ｆｃバインダーの選択。（Ａ）ＦＧＦＲ１－Ｆｃに対するバインダーのスクリーニング方法の概略図。ランダム変異誘発ライブラリを、酵母の表面上のＦＧＦ変異体の発現のために誘導した。細胞を１０ｎＭのＦＧＦＲ１－Ｆｃと共にインキュベートし、洗浄した後、発現（α－ｃ－ｍｙｃ）及びＦＧＦＲ１結合（α－ＦＧＦＲ１－Ｆｃ）について蛍光抗体で染色した。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、高いｃ－ｍｙｃシグナル及び高いＦＧＦＲ１－Ｆｃシグナルを示した細胞について分析し、ゲートした。（Ｂ）ＦＧＦ１のＦＡＣＳドットプロットを示す。全集団から収集した細胞の割合を、ドットプロット上の描画ゲートの隣に示す。 選別２：ＦＧＦ１特異的切断に対する耐性の選択。（Ａ）選別２のスクリーニング方法の概略図。選別１からの細胞を発現のために誘導し、プラスミンと共にインキュベートした。細胞を洗浄した後、発現（α－ＨＡ）及びＦＧＦ１特異的切断に対する耐性（α－ｃ－ｍｙｃ）について蛍光抗体で染色した。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、ＨＡ発現シグナルによって正規化された高ｃ－ｍｙｃシグナルを示した細胞について分析し、ゲートした。（Ｂ）ＦＧＦ１のＦＡＣＳドットプロットを示す。各ライブラリの選別１からの細胞を、詳述されるように、様々なインキュベーション時間にわたって、様々な濃度のプラスミン中でインキュベートした。富化のための細胞のゲーティング及び収集に使用された最終条件を赤色でハイライトする。同じゲートがすべての試験条件に対して描画される。 ペプチドアーチファクトの単離。（Ａ）ＦＧＦ１選別２ライブラリの選別についてのＦＡＣＳドットプロットを示す。ＦＧＦ１特異的切断に対する耐性の選択を、選別２と同じ方法で適用した。タンパク質分解切断に対して顕著に高い耐性を示した細胞（ｃ－ｍｙｃ）の亜集団の周囲に収集ゲートを描画した。（Ｂ）ゲートから収集した変異体のタンパク質配列を示す。大半は、ランダム変異誘発のアーチファクトであり、ＦＧＦ１に由来しない短いペプチドからなる。 ＦＧＦＲ１－Ｆｃへのペプチドアーチファクトの非結合。細胞表面上にＲＴＴＴＳまたはＨＴＴＳペプチドを発現する酵母細胞を、１０ｎＭのＦＧＦＲ１－Ｆｃと共にインキュベートした。細胞を発現（α－ｃ－ｍｙｃ）及び結合（α－ＦＧＦＲ１－Ｆｃ）について蛍光抗体で染色した。有意な結合シグナルは検出されず、ペプチドがＦＧＦＲ１－Ｆｃに結合しないことを示した。 選別３及び４の概略図。前のものからの細胞を発現のために誘導し、様々な濃度のプラスミンと共にインキュベートし、洗浄し、ＦＧＦＲ１－Ｆｃと共にインキュベートした。最終洗浄後、細胞を、次いで、発現（α－ＨＡ）、ＦＧＦ１特異的切断に対する耐性（α－ｃ－ｍｙｃ）、及びＦＧＦＲ１結合（α－ＦＧＦＲ１－Ｆｃ）について蛍光抗体で染色した。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、ＨＡ発現シグナル及び／または高ＦＧＦＲ１－Ｆｃ結合シグナルによって正規化された高ｃ－ｍｙｃシグナルを示した細胞について分析し、ゲートした。 選別３：プロテアーゼ耐性ＦＧＦＲ１－Ｆｃバインダーの選択。選別２からの誘導した細胞を、示される濃度のプラスミン中で１２時間インキュベートした。洗浄後、細胞を１０ｎＭのＦＧＦＲ１－Ｆｃと共にインキュベートした。最終洗浄後、細胞を、発現（α－ＨＡ）及びＦＧＦＲ１結合（α－ＦＧＦＲ１－Ｆｃ）について蛍光抗体で染色した。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、高いＨＡシグナル及び高いＦＧＦＲ１－Ｆｃシグナルを示した細胞について分析し、ゲートした。ＦＧＦ１のＦＡＣＳドットプロットを示す。全集団から収集した細胞の割合を、ドットプロット上の描画ゲートの隣に示す。下部パネル：１．２５μＭのプラスミンと共に２４時間インキュベートした後、ＦＧＦＲ１－Ｆｃへの結合を保持する。 選別４：プロテアーゼ耐性ＦＧＦＲ１－Ｆｃバインダーの選択。選別３からの誘導した細胞を、様々な濃度のプラスミン中で３６時間インキュベートした。洗浄後、細胞を１０ｎＭのＦＧＦＲ１－Ｆｃと共にインキュベートした。最終洗浄後、細胞を、発現（α－ｃ－ｍｙｃ）及びＦＧＦＲ１結合（α－ＦＧＦＲ１－Ｆｃ）について蛍光抗体で染色した。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、高いｃ－ｍｙｃシグナル及び高いＦＧＦＲ１－Ｆｃシグナルを示した細胞について分析し、ゲートした。ＦＧＦ１のＦＡＣＳドットプロットを示す。富化のための細胞のゲーティング及び収集に使用された最終条件を赤色でハイライトする。同じゲートが所与のＦＧＦのすべての条件に対して描画される。全集団から収集した細胞の割合を、ドットプロット上の描画ゲートの隣に示す。下部パネル：３．７５μＭのプラスミンと共に３６時間インキュベートした後、ＦＧＦＲ１－Ｆｃへの結合を保持する。 ＦＧＦ１構造上のＢＳ４Ｍ１変異（ＰＤＢコード１Ｅ０Ｏ）。タンパク質分解安定性のスクリーニングによって特定された富化された変異は、青色でハイライトされる。Ｄ２８Ｎ変異は、６本鎖βバレル構造を安定化させる３つのβヘアピン（赤色でハイライトされる）のうちの１つに位置する。Ｌ１３１Ｒ変異は、Ｎ末端とＣ末端との間に安定化βヘアピンが欠如している、タンパク質のＣ末端付近に位置する。 可溶性野生型ＦＧＦ１の組換え発現。（Ａ）精製した野生型ＦＧＦ１を、非還元クマシー染色ゲル（左）及びＦＧＦ１に対するウエスタンブロット（右）によって分析した。２つの有意なバンドは、ＦＧＦ１単量体（１９．７ｋＤａ）及び二量体（３９．４ｋＤａ）の存在を示す。（Ｂ）ＦＧＦ１の適切な折り畳みは、酵母提示ＦＧＦＲ３構築物への特異的結合を観察することによって確認される。 ｐＢＡＤベクターにおけるＦＧＦ２の組換え発現。（Ａ）ｐＢＡＤにおいて発現させ、精製した野生型ＦＧＦ２－Ｈｉｓを、還元クマシー染色ゲル（左）及びＦＧＦ２に対するウエスタンブロット（右）によって分析した。どちらも、発現したＦＧＦ２による凝集を示す。（Ｂ）ｐＢＡＤにおいて発現させたＦＧＦ２－Ｈｉｓは、酵母提示ＦＧＦＲ３構築物に結合することができない。 ｐＥＴ２８ｂベクターにおけるＦＧＦ２の組換え発現。野生型ＦＧＦ２及びＦＧＦ２変異体（ＢＳ５Ｍ１、ＢＳ５Ｍ３、ＢＳ５Ｍ５）を、ｐＥＴ２８ｂベクター中のスーパーフォルダーＧＦＰとの融合物として発現させた。ｐＢＡＤにおいて発現させ、精製した野生型ＦＧＦ２－Ｈｉｓを、還元クマシー染色ゲル（左）及びＦＧＦ２に対するウエスタンブロット（右）によって分析した。野生型ＦＧＦ２の発現が不十分である一方で、ＦＧＦ２変異体は凝集及び／またはオリゴマー化の徴候を示す。 ｐＥＴ３２ａベクターにおける野生型ＦＧＦ２の組換え発現。（Ａ）ＦＧＦ２は、ｐＥＴ３２ａベクターにおけるチオレドキシンへの融合物として発現した。ＴＥＶで切断し、Ｎｉ－ＮＴＡ及びサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した後、ＦＧＦ２に対してウエスタンブロットによりタンパク質を分析した。ＦＧＦ２（１９．３ｋＤａ）の精製に成功したことを確認した。 プラスミンにおけるＦＧＦ１ ＷＴ及びＢＳ４Ｍ１のタンパク質分解安定性アッセイ。ＦＧＦ１ ＢＳ４Ｍ１（Ｄ２８Ｎ／Ｌ１３１Ｒ）変異体は、野生型ＦＧＦ１と比較して、プラスミンにおいてより高いタンパク質分解安定性を示す。１００ｎｇのＦＧＦ１を、６００ｎＭのプラスミンと共に、様々なインキュベーション時間にわたって、３７℃でインキュベートした。インキュベートした試料を、ＦＧＦ１に対するウエスタンブロットの別個のレーン上で実行して、各時点でのタンパク質分解の程度を測定した。赤い矢印によって示されるタンパク質バンドのバンド強度を画像分析によって定量化して、残りのタンパク質の量を測定した。各タンパク質の時点ｔ＝０によってバンド強度を正規化し、プロットした。 プラスミンにおけるＦＧＦ１ ＷＴ、ＢＳ４Ｍ１、ＰＭ２、及びＰＭ３のタンパク質分解安定性アッセイ。ＢＳ４Ｍ１からの変異（Ｄ２８Ｎ、Ｌ１３１Ｒ）を、ＰＭ２からの変異（Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ）と組み合わせてＰＭ３を作製する。ＰＭ３は、ＢＳ４Ｍ１またはＰＭ２のいずれかと比較して、プラスミンにおいてより高いタンパク質分解安定性を示す。１２５ｎｇのＦＧＦ１を、様々な濃度のプラスミンと共に３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベートした試料を、ＦＧＦ１に対するウエスタンブロットの別個のレーン上で実行して、各時点でのタンパク質分解の程度を測定した。赤い矢印によって示されるタンパク質バンドのバンド強度を画像分析によって定量化して、残りのタンパク質の量を測定した。０μＭのプラスミンと共にインキュベートした場合、バンド強度を各構築物のタンパク質の量によって正規化し、プロットした。 トリプシンにおけるＦＧＦ１ ＷＴ及びＢＳ４Ｍ１のタンパク質分解安定性アッセイ。ＦＧＦ１ ＢＳ４Ｍ１（Ｄ２８Ｎ／Ｌ１３１Ｒ）変異体は、野生型ＦＧＦ１と比較して、トリプシンにおいてより高いタンパク質分解安定性を示す。１００ｎｇのＦＧＦ１を、１：２０のトリプシン対ＦＧＦ１のモル比で、様々なインキュベーション時間にわたって、３７℃でインキュベートした。インキュベートした試料を、ＦＧＦ１に対するウエスタンブロットの別個のレーン上で実行して、各時点でのタンパク質分解の程度を測定した。赤い矢印によって示されるタンパク質バンドのバンド強度を画像分析によって定量化して、残りのタンパク質の量を測定した。時点ｔ＝０での各構築物のタンパク質の量によってバンド強度を正規化し、プロットした。 プラスミンにおけるＦＧＦ１ ＷＴ、ＢＳ４Ｍ１、Ｄ２８Ｎ、及びＬ１３１Ｒのタンパク質分解安定性アッセイ。ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ単一変異体は、ＢＳ４Ｍ１と比較して、そのタンパク質分解安定性の大部分を保持する。ＦＧＦ１ Ｄ２８Ｎ単一変異体は、野生型ＦＧＦ１と比較しても、タンパク質分解安定性が低い。１００ｎｇのＦＧＦ１を、様々な濃度のプラスミンと共に３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベートした試料を、ＦＧＦ１に対するウエスタンブロットの別個のレーン上で実行して、各時点でのタンパク質分解の程度を測定した。赤い矢印によって示されるタンパク質バンドのバンド強度を画像分析によって定量化して、残りのタンパク質の量を測定した。０μＭのプラスミンと共にインキュベートした場合、バンド強度を各構築物のタンパク質の量によって正規化し、プロットした。 プラスミンにおけるＦＧＦ１ ＷＴ、Ｌ１３１Ｒ、Ｌ１３１Ａ、及びＬ１３１Ｋのタンパク質分解安定性アッセイ。ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｋ単一変異体は、ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒと比較して、そのタンパク質分解安定性の大部分を保持する。ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ａ単一変異体は、野生型ＦＧＦ１と比較しても、タンパク質分解安定性が低い。１００ ｎｇのＦＧＦ１を、様々な濃度のプラスミンと共に３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベートした試料を、ＦＧＦ１に対するウエスタンブロットの別個のレーン上で実行して、各時点でのタンパク質分解の程度を測定した。赤い矢印によって示されるタンパク質バンドのバンド強度を画像分析によって定量化して、残りのタンパク質の量を測定した。０μＭのプラスミンと共にインキュベートした場合、バンド強度を各構築物のタンパク質の量によって正規化し、プロットした。 ＦＧＦ１野生型及びＬ１３１Ｒ変異体のＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒアッセイ。ＦＧＦ１野生型及びＬ１３１Ｒ変異体の融解温度を３つ組で測定し、プロットした。２つのタンパク質の融解温度間に統計的に有意な差異はなかった。 ＭＤＡ－ＭＢ－２３１培養におけるＦＧＦ１野生型及びＬ１３１Ｒ変異体の安定性。ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体は、野生型ＦＧＦ１と比較して、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１での培養においてより高い安定性を示す。５００ｎｇのＦＧＦ１を、ＭＤＡ－Ｍｂ－２３１細胞と共に、様々なインキュベーション時間にわたって、３７℃でインキュベートした。インキュベートした試料を濃縮し、ＦＧＦ１に対するウエスタンブロットの別個のレーン上で実行して、各時点でのタンパク質分解の程度を測定した。赤い矢印によって示されるタンパク質バンドのバンド強度を画像分析によって定量化して、残りのタンパク質の量を測定した。各タンパク質の時点ｔ＝０によってバンド強度を正規化し、プロットした。 ＮＩＨ３Ｔ３ ＥＲＫリン酸化アッセイ。ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体は、野生型ＦＧＦ１によるＮＩＨ３Ｔ３ ＥＲＫリン酸化を阻害する。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＦＧＦ１野生型及び／または様々な濃度のＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体で１５時間刺激した。細胞を溶解し、溶解物をウエスタンブロットで抗リンＥＲＫでプローブした。バンド強度を画像分析によって定量化して、ＦＧＦ経路活性化の程度を測定した。下部パネル： ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＦＧＦ１野生型及び／または様々な濃度のＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体で１０時間刺激した。 ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体によるＦＧＦ１刺激ＥＲＫリン酸化の阻害。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、１ｎＭのＦＧＦ１及び様々な濃度のＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒと共にインキュベートした。各条件のＥＲＫリン酸化の程度を、リンＥＲＫに対するウエスタンブロットによって測定する。バンド強度を画像分析により定量化し、プロットして、ＩＣ５０値を得た。 ＦＧＦ１野生型及びＬ１３１Ｒ変異体のＮＩＨ３Ｔ３細胞への結合。ＦＧＦＲ発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対するＨｉｓタグＦＧＦ１ ＷＴ及びＬ１３１Ｒ変異体の平衡結合滴定。細胞を、様々な濃度の各タンパク質と共に４℃でインキュベートし、Ｈｉｓに対する蛍光抗体で染色して、細胞への結合を定量化した。 ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４配列の例を提供する。 ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４配列の例を提供する。 ＨＧＦドメイン構造。Ｎ： Ｎ末端ＰＡＮモジュール、Ｋ： クリングルドメイン、ＳＰＨ：セリンプロテアーゼ相同性ドメイン。黒い矢印は、ＨＧＦをその２鎖活性形態に切断するための切断部位を示す。α鎖及びβ鎖は、ジスルフィド結合を介して接続される。Ｎ末端及び第１のクリングルドメインは、ＨＧＦのＮＫ１断片を含む。 酵母提示構築物ｐＴＭＹ－ＨＡ。（Ａ）ｐＴＭＹ－ＨＡのオープンリーディングフレーム。タンパク質は、遊離Ｎ末端で提示され、そのＣ末端を介してＡｇａ２ｐに連結される。（Ｂ）酵母表面提示の概略図。目的のタンパク質（ＮＫ１）は、Ａｇａ２ｐのＮ末端への遺伝連鎖を介して酵母細胞壁に係留される。ＨＡエピトープタグに対する抗体を使用して、細胞表面発現を監視し、結合パートナー（この場合はＭｅｔ－Ｆｃ）との相互作用も監視した。 ＮＫ１操作戦略の概要。１回目の指向性進化（Ｍ１）においてライブラリをＭｅｔへの機能的結合についてスクリーニングし、２回目（Ｍ２）では、ライブラリを、親和性の増強または安定性の増強のいずれかについて並行してスクリーニングし、３回目（Ｍ３）では、Ｍ２生成物をシャッフルし、親和性及び安定性の改善について同時にスクリーニングした。 角膜の化学的損傷は、多くの場合、血管新生、瘢痕、及び失明をもたらす。 （Ａ）ｔ＝０時間での角膜創傷、（Ｂ）ＨＡ／ＣＳゲル送達ビヒクルにおけるＭＳＣセクレトームでの治療の２４時間後の角膜創傷、（Ｃ）生理食塩水液滴単独の２４時間後の角膜創傷を比較する、アルカリ熱傷後の角膜創傷治癒研究。予備研究では、（Ｄ）Ｃｏｃｈｒａｎラボで開発されたｅＨＧＦ（挿入画像に示されるＰＤＢ構造）単独でも、インビボでのアルカリ熱傷ラット角膜における創傷閉鎖時間が加速されることが示された。 （Ａ）アルカリ熱傷角膜、及び（Ｂ）局所セクレトーム治療の７日後の角膜。（Ｃ）アルカリ熱傷角膜、及び（Ｄ）ｅＨＧＦ及び抗ＦＧＦ治療の７日後の角膜。未治療の角膜は瘢痕があり、血管が形成され、場合によっては出血のエビデンスがある。（Ｅ）ラットの左眼のアルカリ熱傷の７日後の両側ラット眼の外観。（Ｆ）初期のアルカリ熱傷の７日後のｅＨＧＦ及び抗ＦＧＦ治療のラットの両眼の外観。 参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，５５６，２４８号からの配列番号２～２２のバリアント肝細胞増殖因子配列を提供する。
Ｉ．序文
線維芽細胞増殖因子は、多種多様なプロセス、最も顕著には、正常な発達のための重要な要素として関与する細胞シグナル伝達タンパク質のファミリーである。これらの増殖因子は、一般に、細胞表面受容体を活性化する細胞外起源の全身または局所循環分子として作用する。哺乳類の線維芽細胞増殖因子受容体ファミリーは、４つのメンバー、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、及びＦＧＦＲ４を有する。ＦＧＦＲは、３つの細胞外免疫グロブリン型ドメイン（Ｄ１～Ｄ３）、シングルスパン膜貫通ドメイン、及び細胞内スプリットチロシンキナーゼドメインからなる。ＦＧＦは、Ｄ２及びＤ３ドメインと相互作用し、Ｄ３相互作用は、主にリガンド結合特異性に関与する（下記を参照されたい）。ヘパラン硫酸塩結合は、Ｄ３ドメインを介して媒介される。Ｄ１ドメインとＤ２ドメインとの間に位置する酸性アミノ酸の短い伸長は、自己阻害機能を有する。この「酸ボックス」モチーフは、ヘパリン硫酸塩結合部位と相互作用して、ＦＧＦの不在下で受容体活性化を阻止する。各ＦＧＦＲは、ＦＧＦの特定のサブセットに結合する。同様に、大半のＦＧＦは、いくつかの異なるＦＧＦＲサブタイプに結合することができる。ＦＧＦ１は、７つすべての異なるＦＧＦＲを活性化することができるため、「ユニバーサルリガンド」と称されることがある。対照的に、ＦＧＦ７（ケラチノサイト増殖因子、ＫＧＦ）は、ＦＧＦＲ２ｂ（ＫＧＦＲ）にのみ結合する。
本発明は、酵母提示プラットフォーム及びスクリーニングのためのフロー活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、タンパク質分解的に安定した増殖因子を操作するためのコンビナトリアルアプローチのための方法を提供する。ＦＧＦ１をモデル例として使用するスクリーニング方法を設定するプロセスが記載され、例示的なタンパク質分解的に安定した増殖因子を操作するための方法が提供される。本発明はまた、タンパク質分解的に安定したＦＧＦ１変異体の特徴付けをさらに提供する。
ＩＩ．定義
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用される命名法、ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学及び核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションにおける実験手順は、当該技術分野で周知であり、一般に用いられるものである。核酸及びペプチド合成には、標準的な技法が使用される。技法及び手順は、当該技術分野における従来の方法、及び本文書全体を通して提供される様々な一般的な参考文献に従って一般に行われる（一般に、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｄ ｅｄ．（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。本明細書で使用される命名法、ならびに以下に記載される分析及び合成有機化学の実験手順は、当該技術分野で周知であり、一般に用いられるものである。標準的な技法またはその修正が、化学合成及び化学分析に使用される。
「Ｍ２．１」及び「Ｍ２．２」という用語は、以下の置換：それぞれ、（ｉ）Ｋ６２Ｅ、Ｎ１２７Ｄ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、Ｎ１９３Ｄ、及び（ｉｉ）Ｋ６２Ｅ、Ｑ９５Ｒ、Ｎ１２７Ｄ、Ｋ１３２Ｎ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、Ｑ１７３Ｒ、Ｎ１９３Ｄを有する配列番号２のバリアントを指す。
「ＢＳ４Ｍ１」ならびに「ＰＭ２」及び「ＰＭ３」という用語は、以下の置換：（ｉ）ＢＳ４Ｍ１（Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｒ）、（ｉｉ）ＰＭ２（Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ）、ならびに（ｉｉｉ）ＰＭ３（Ｄ２８Ｎ、Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、Ｌ１３１Ｒ）を有する配列番号１のバリアントを指す。ＦＧＦ１：
Figure 2022513196000002
 配列番号１は、プロペプチドを含まないＦＧＦ１配列である（Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ、ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｂｌａｓｔ／？ａｂｏｕｔ＝Ｐ０５２３０［１６－１５５］＆ｋｅｙ＝Ｃｈａｉｎ＆ｉｄ＝ＰＲＯ＿００００００８９０８に記載される）。本明細書に記載される番号付けは、上記の配列の第１のアミノ酸が１位（例えば、Ｆ１、Ｎ２など）であることに基づく。ＦＧＦ１の他の番号付けは、番号付けにプロペプチド配列を含み得、これにより、番号付けが１４大きくなるであろう。しかしながら、本明細書における番号付けは配列番号１に基づいており、ＦＧＦ１プロペプチドを含まない。
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）及びそれらのポリマーを指す。特に限定されない限り、本用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別途示されない限り、特定の核酸配列は、その保存的修飾バリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補配列、ならびに明示的に示される配列も暗示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの第３の位置が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換される配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１ （１９９１）、Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）、及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８（１９９４））。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、及び遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと交換可能に使用される。さらに、本明細書で使用する場合、本発明のポリペプチドバリアントをコードする核酸は、この核酸配列に相補的な核酸配列を含むように定義される。
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味する。これは、コード領域の前後（リーダー及びトレーラー）の領域、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含み得る。
「単離された」という用語は、核酸またはタンパク質に適用されるとき、核酸またはタンパク質が、それが天然状態で会合する他の細胞構成要素を本質的に含まないことを意味する。好ましくは均質な状態であるが、乾燥溶液または水溶液のいずれであってもよい。純度及び均質性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技法を使用して決定される。調製物中に存在する主な種であるタンパク質は、実質的に精製される。特に、単離された遺伝子は、遺伝子に隣接し、目的の遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドを生じることを意味する。具体的には、それは、核酸またはタンパク質が少なくとも８５％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、最も好ましくは少なくとも９９％純粋であることを意味する。単離された核酸は発現ベクターの構成要素であり得る。
典型的には、本発明の単離されたポリペプチドは、好ましくは範囲として表される純度レベルを有する。ポリペプチドの純度範囲の下端は、約６０％、約７０％、または約８０％であり、純度範囲の上端は、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約９５％超である。ポリペプチドが約９０％超純粋である場合、その純度もまた好ましくは範囲として表される。純度範囲の下端は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％、または約９８％である。純度範囲の上端は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％、または約１００％の純度である。
純度は、任意の当技術分野で認識される分析方法（例えば、銀染色ゲル上のバンド強度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、質量分析、または同様の手段）によって決定される。
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、及びＯ－ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合するα炭素と同じ塩基性化学構造を有する化合物を指す。そのような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ塩基性化学構造を保持する。「アミノ酸模倣物」は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する化学化合物を指す。
「親水性アミノ酸」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５－１４２の正規化されたコンセンサス疎水性スケールに従って、０未満の疎水性を示すアミノ酸を指す。遺伝的にコードされた親水性アミノ酸には、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、及びＡｒｇ（Ｒ）が含まれる。
「酸性アミノ酸」は、７未満の側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を指す。酸性アミノ酸は、典型的には、水素イオンの喪失に起因して、生理学的ｐＨで負に荷電した側鎖を有する。遺伝的にコードされた酸性アミノ酸には、Ｇｌｕ（Ｅ）及びＡｓｐ（Ｄ）が含まれる。
「塩基性アミノ酸」は、７を超える側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を指す。塩基性アミノ酸は、典型的には、ヒドロニウムイオンとの会合に起因して、生理学的ｐＨで正に荷電した側鎖を有する。遺伝的にコードされた塩基性アミノ酸には、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ａｒｇ（Ｒ）、及びＬｙｓ（Ｋ）が含まれる。
「極性アミノ酸」は、生理学的ｐＨに荷電されていないが、２つの原子によって共有される電子対が原子のうちの１つによってより密接に保持される少なくとも１つの結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸を指す。遺伝的にコードされた極性アミノ酸には、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、及びＴｈｒ（Ｔ）が含まれる。
「疎水性アミノ酸」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，１９８４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５－１４２の正規化されたコンセンサス疎水性スケールに従って、０を超える疎水性を示すアミノ酸を指す。例示的な疎水性アミノ酸としては、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、及びプロリン類似体が挙げられる。
「芳香族アミノ酸」は、少なくとも１つの芳香族環または芳香族複素環を有する側鎖を有する疎水性アミノ酸を指す。芳香族環または芳香族複素環は、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＣＮ、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－ＮＯ2、－ＮＯ、－ＮＨ2、－ＮＨＲ、－ＮＲＲ、－Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、－Ｃ（Ｏ）ＮＲＲなどの１つ以上の置換基を含有し得、式中、各Ｒは、独立して、（Ｃl－Ｃ6）アルキル、置換された（Ｃl－Ｃ6）アルキル、（Ｃl－Ｃ6）アルケニル、置換された（Ｃl－Ｃ6）アルケニル、（Ｃl－Ｃ6）アルキニル、置換された（Ｃl－Ｃ6）アルキニル、（Ｃl－Ｃ21）アリール、置換された（Ｃ5－Ｃ20）アリール、（Ｃ6－Ｃ26）アルカリル、置換された（Ｃ6－Ｃ26）アルカリル、５～２０員ヘテロアリール、置換された５～２０員ヘテロアリール、６～２６員アルキヘテロアリール、または置換された６～２６員アルキヘテロアリールである。遺伝的にコードされた芳香族アミノ酸には、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、及びＴｒｐ（Ｗ）が含まれる。
「非極性アミノ酸」は、生理学的ｐＨに荷電されておらず、２つの原子によって共有される電子対が一般に２つの原子の各々によって等しく保持される結合を有する側鎖を有する（すなわち、側鎖は極性ではない）疎水性アミノ酸を指す。遺伝的にコードされた非極性アミノ酸には、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、及びＡｌａ（Ａ）が含まれる。
「脂肪族アミノ酸」は、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸を指す。遺伝的にコードされた脂肪族アミノ酸には、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、及びＩｌｅ（Ｉ）が含まれる。
アミノ酸残基Ｃｙｓ（Ｃ）は、他のＣｙｓ（Ｃ）残基または他のスルホニル含有アミノ酸とジスルフィド架橋を形成することができるという点で珍しい。還元された遊離ＳＨまたは酸化ジスルフィド架橋形態のいずれかでペプチド中に存在するＣｙｓ（Ｃ）残基（及び－ＳＨ含有側鎖を有する他のアミノ酸）の能力は、Ｃｙｓ（Ｃ）残基がペプチドに正味の疎水性または親水性の特性を寄与するかどうかに影響を及ぼす。Ｃｙｓ（Ｃ）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，１９８４、上記）の正規化されたコンセンサススケールに従って０．２９の疎水性を示すが、本発明の目的のために、Ｃｙｓ（Ｃ）は、上記に定義される一般的な分類にかかわらず、極性親水性アミノ酸として分類されることを理解されたい。
「リンカー」という用語は、２つ以上のポリペプチドを共有結合するアミノ酸ポリペプチドスペーサーを指す。リンカーは、１～１５のアミノ酸残基であり得る。好ましくは、リンカーは、単一のシステイン残基である。リンカーはまた、アミノ酸配列番号１：ＫＥＳＣＡＫＫＱＲＱＨＭＤＳを有し得る。
当業者には理解されるように、上記に定義されたカテゴリーは、相互排他的ではない。したがって、２つ以上の物理化学的特性を示す側鎖を有するアミノ酸は、複数のカテゴリーに含まれ得る。例えば、Ｔｙｒ（Ｙ）などの極性置換基でさらに置換されている芳香族部分を有するアミノ酸側鎖は、芳香族疎水性及び極性または親水性の両方を示し得、したがって、芳香族及び極性の両方のカテゴリーに含まれ得る。任意のアミノ酸の適切な分類は、特に本明細書に提供される詳細な開示に照らして、当業者には明らかであろう。
「ヘリックス破壊」アミノ酸と呼ばれるある特定のアミノ酸残基は、ヘリックス内の内部位置に含有される場合、αヘリックスの構造を破壊する傾向がある。そのようなヘリックス破壊特性を示すアミノ酸残基は、当該技術分野において周知であり（例えば、Ｃｈｏｕ ａｎｄ Ｆａｓｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１－２７６を参照されたい）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、及び潜在的にすべてのＤ－アミノ酸（Ｌ－ペプチドに含有される場合、逆にＬ－アミノ酸はＤ－ペプチドに含有される場合、ヘリックス構造を破壊する）、ならびにプロリン類似体を含む。これらのヘリックス破壊アミノ酸残基は、Ｇｌｙ（Ｇ）（以下に論じられる）を除いて、上記に定義されるカテゴリーに属するが、これらの残基は、ヘリックス内の内部位置でアミノ酸残基を置換するために使用されるべきではなく、それらは、ペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端で１～３つのアミノ酸残基を置換するためにのみ使用されるべきである。
上記に定義されるカテゴリーは、遺伝的にコードされたアミノ酸に関して例示されているが、アミノ酸置換は、遺伝的にコードされたアミノ酸に限定される必要はなく、ある特定の実施形態では、好ましくは限定されない。実際に、式（Ｉ）の好ましいペプチドの多くは、遺伝的にコードされていないアミノ酸を含有する。したがって、天然に存在する遺伝的にコードされたアミノ酸に加えて、式（Ｉ）のコアペプチドのアミノ酸残基は、天然に存在するコードされていないアミノ酸及び合成アミノ酸で置換され得る。
式（Ｉ）のコアペプチドの有用な置換を提供するある特定の一般的に遭遇するアミノ酸としては、β－アラニン（β－Ａｌａ）及び他のオメガ－アミノ酸、例えば、３－アミノプロピオン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、４－アミノ酪酸など；α－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε－アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ－アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ－メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ－ブチルアラニン（ｔ－ＢｕＡ）；ｔ－ブチルグリシン（ｔ－ＢｕＧ）；Ｎ－メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ナフチルアラニン（Ｎａｌ）；４－クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４－Ｃｌ））；２－フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（２－Ｆ））；３－フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３－Ｆ））；４－フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４－Ｆ））；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１／２／３／４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸（Ｔｉｃ）；β－２－チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ－アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）；２，４－ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，３－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；ｐ－アミノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（ｐＮＨ２））；Ｎ－メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）；ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）及びホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、ホモプロリン（ｈＰｒｏ）、Ｎ－メチル化アミノ酸及びペプトイド（Ｎ－置換グリシン）が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のコアペプチドのアミノ酸プロリンは、アゼチジン－２－カルボキシレート（Ａ２Ｃ）、Ｌ－チアゾリジン－４－カルボン酸、シス－４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン（ＣＨＰ）、３，４－デヒドロプロリン、チオプロリン、及びイソニペコチン酸（Ｉｎｐ）を含むがこれらに限定されない、プロリン類似体で実証される。
アミノ酸は、本明細書において、一般に知られている３文字記号またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学的命名委員会（ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨される１文字記号のいずれかによって参照され得る。ヌクレオチドは、同様に、それらの一般的に受け入れられている１文字コードによって参照され得る。
アミノ酸配列に関して、コード配列中の単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変更、付加、または欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、または付加は、「保存的に修飾されたバリアント」であり、その変更は、アミノ酸を化学的に類似するアミノ酸で置換することによりもたらされることを当業者は認識するであろう。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野で周知である。そのような保存的に修飾されたバリアントは、本発明の多型バリアント、種間相同体、及び対立遺伝子に加えられ、これらを除外しない。
以下の８つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照されたい）。
アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズ等の相対的類似性に基づく。前述の特徴のうちの１つ以上を考慮した例示的な置換は、当業者に周知であり、以下を含むが、これらに限定されない（元の残基：例示的な置換）：（Ａｌａ：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ）、（Ａｒｇ：Ｌｙｓ）、（Ａｓｎ：Ｇｌｎ、Ｈｉｓ）、（Ａｓｐ：Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ）、（Ｇｌｎ：Ａｓｎ）、（Ｇｌｕ：Ａｓｐ）、（Ｇｌｙ：Ａｌａ）、（Ｈｉｓ：Ａｓｎ、Ｇｌｎ）、（Ｉｌｅ：Ｌｅｕ、Ｖａｌ）、（Ｌｅｕ：Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、（Ｌｙｓ：Ａｒｇ）、（Ｍｅｔ：Ｌｅｕ，Ｔｙｒ）、（Ｓｅｒ：Ｔｈｒ）、（Ｔｈｒ：Ｓｅｒ）、（Ｔｉｐ：Ｔｙｒ）、（Ｔｙｒ：Ｔｒｐ、Ｐｈｅ）、及び（Ｖａｌ：Ｉｌｅ、Ｌｅｕ）。したがって、本開示の実施形態は、上述のポリペプチドまたはタンパク質の機能的もしくは生物学的等価物を考慮する。特に、本発明の実施形態は、親ポリペプチドと約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び９５％の配列同一性を有するバリアントを提供する。様々な実施形態では、本発明は、親ポリペプチド配列の一部、例えば、野生型ＦＧＦ１（配列番号１）を含む、例えば、野生型増殖因子とこのレベルの同一性を有するバリアントを提供する。様々な実施形態では、バリアントは、本明細書に定義される親ポリペプチドまたは親ポリペプチド配列の一部、例えば、野生型ＦＧＦ１（配列番号１）を含む、例えば、野生型増殖因子と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
「保存的に修飾されたバリアント」は、アミノ酸配列及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に修飾されたバリアント」は、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードするそれらの核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸は、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、及びＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって指定されるすべての位置において、コードされたポリペプチドを変更することなく、コドンを記載される対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸変異は、保存的に修飾された変異の１つの種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書のすべての核酸配列は、核酸のすべての可能なサイレント変異も記載する。当業者は、核酸中の各コドン（通常はメチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常はトリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が修飾されて、機能的に同一の分子を得ることができることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、各記載の配列において暗示的である。
「同一性」は、当該技術分野で知られているように、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチドまたはタンパク質配列間の関係である。当該技術分野において、「同一性」はまた、そのような配列の列間の一致によって決定される、ポリペプチドまたはタンパク質間の配列相関性の程度を指す。「同一性」は、既知の生体情報方法によって容易に計算することができる。
「ペプチド」は、単量体がアミノ酸であり、アミド結合を介して一緒に連結されるポリマーを指す。本発明のペプチドは、サイズが、例えば、２つのアミノ酸から数百または数千のアミノ酸まで変動し得る。より大きなペプチド（例えば、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、または少なくとも５０のアミノ酸残基）は、代替的に、「ポリペプチド」または「タンパク質」と称される。加えて、非天然アミノ酸、例えば、β－アラニン、フェニルグリシン、ホモアルギニン、及びホモフェニルアラニンも含まれる。遺伝的にコードされていないアミノ酸もまた、本発明において使用され得る。さらに、反応性基、グリコシル化配列、ポリマー、治療部分、生体分子などを含むように修飾されたアミノ酸も、本発明で使用され得る。本発明で使用されるアミノ酸のすべては、ＤまたはＬ異性体のいずれであってもよい。Ｌ異性体が一般に好ましい。加えて、他のペプチド模倣物も本発明において有用である。本明細書で使用する場合、「ペプチド」または「ポリペプチド」は、グリコシル化及び非グリコシル化ペプチドまたは「ポリペプチド」の両方を指す。ポリペプチドを発現する系によって不完全にグリコシル化されるポリペプチドも含まれる。一般的な考察については、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，ｉｎ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ，ＰＥＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）を参照されたい。
本出願では、アミノ酸残基は、「１」と番号付けされるポリペプチドのＮ末端アミノ酸（例えば、Ｎ末端メチオニン）からのそれらの相対位置に従って（典型的には上付き文字で）番号付けされる。Ｎ末端アミノ酸は、「１」と番号付けされたメチオニン（Ｍ）であり得る。各アミノ酸残基に関連する番号は、ポリペプチドのＮ末端がメチオニンなしで開始する場合、Ｎ末端メチオニンの不在を反映するように容易に調整することができる。例示的なポリペプチドのＮ末端は、メチオニンの有無にかかわらず開始することができることが理解される。したがって、アミノ酸リンカーが野生型ポリペプチドのＮ末端に付加される場合では、Ｎ末端アミノ酸に隣接する第１のリンカーアミノ酸は、番号－１などである。例えば、リンカーがアミノ酸配列ＫＥＳＣＡＫＫＱＲＱＨＭＤＳ（配列番号２）を有し、Ｓ残基が野生型ポリペプチドのＮ末端アミノ酸に隣接している場合、最もＮ末端のリンカーアミノ酸Ｋは－１４であり、最もＣ末端のリンカーアミノ酸Ｓは－１である。このようにして、野生型ポリペプチド及びリンカー結合野生型ポリペプチドにおけるアミノ酸の番号付けが保存される。
「親ポリペプチド」という用語は、野生型ポリペプチドを指し、野生型ポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、公的にアクセス可能なタンパク質データベース（例えば、ＥＭＢＬヌクレオチド配列データベース、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ、ＥｘＰａｓｙ、タンパク質データバンクなど）の一部である。
「変異ポリペプチド」または「ポリペプチドバリアント」または「ムテイン」または「バリアントポリペプチド」という用語は、ポリペプチドの形態を指し、そのアミノ酸配列は、その対応する野生型（親）形態、天然に存在する形態、または任意の他の親形態のアミノ酸配列とは異なる。変異ポリペプチドは、変異ポリペプチドをもたらす１つ以上の変異、例えば、置換、挿入、欠失等を含有し得る。
「親ポリペプチドに対応する」という用語（またはこの用語の文法的変形）は、本発明のポリペプチドを説明するために使用され、ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくともアミノ酸変異の存在によってのみ対応する親ポリペプチドのアミノ酸配列と異なる。典型的には、バリアントポリペプチド及び親ポリペプチドのアミノ酸配列は、高い割合の同一性を示す。一例では、「親ポリペプチドに対応する」とは、バリアントポリペプチドのアミノ酸配列が、親ポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の同一性を有することを意味する。別の例では、バリアントポリペプチドをコードする核酸配列は、親ポリペプチドをコードする核酸配列に対して少なくとも約５０％の同一性、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、親ポリペプチドは、配列番号１のＦＧＦ１に対応する。
「親ポリペプチドに変異を導入する（または付加する等）」という用語（またはその文法的変形）、または変異を含むように「親ポリペプチドを修飾する」（またはその文法的変形）は、親ポリペプチドがそのような変換のための物理的出発材料であることを必ずしも意味するわけではなく、むしろ親ポリペプチドがバリアントポリペプチドを作製するための誘導アミノ酸配列を提供することを意味する。一例では、「バリアントを親ポリペプチドに導入すること」は、バリアントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を作製するために、親ポリペプチドの遺伝子が適切な変異により修飾されることを意味する。別の例では、「バリアントを親ポリペプチドに導入すること」は、結果として生じるポリペプチドが、親ポリペプチド配列をガイドとして使用することにより理論的に設計されることを意味する。次いで、設計されたポリペプチドは、化学的または他の手段によって生成され得る。
本明細書で使用する場合、「ＮＫ１」は、肝細胞増殖因子のＮ末端及び第１のクリングルドメインからなる。本発明のポリペプチドにおける破壊点は、ヒト肝細胞増殖因子アイソフォーム１のアミノ酸２８～２１０（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＩＤ ＮＰ＿０００５９２）を含む。他は、３１～２１０及び３２～２１０の破壊点を使用している。代替のヒト肝細胞増殖因子アイソフォーム、アイソフォーム３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＩＤ ＮＰ＿００１０１９３２．１）は、第１のクリングルドメインにおける５つのアミノ酸欠失を除いて、ヒトＨＧＦ（ｈＨＧＦ）アイソフォーム１と同一である。ｈＨＧＦアイソフォーム１及びアイソフォーム３の両方は、Ｍｅｔ受容体を強力に活性化し、ｈＨＧＦアイソフォーム１またはアイソフォーム３に由来するＮＫ１タンパク質もまた、Ｍｅｔ受容体に結合し、それを活性化する。アイソフォーム３バリアントに基づくＮＫ１の２８～２０５、３１～２０５、及び３２～２０５の破壊点は、アイソフォーム１バリアントに基づくＮＫ１の２８～２１０、３１～２１０、及び３２～２１０の破壊点と同一であり、唯一の違いは、第１のクリングルドメイン（Ｋ１）からの５つのアミノ酸の欠失である。
「ライブラリ」という用語は、それぞれ共通の親ポリペプチドに対応する異なるポリペプチドの集合を指す。ライブラリ内の各ポリペプチド種は、ライブラリのメンバーと称される。好ましくは、本発明のライブラリは、リードポリペプチドを特定する集団を得るのに十分な数及び多様性のポリペプチドの集合を表す。ライブラリは、少なくとも２つの異なるポリペプチドを含む。一実施形態では、ライブラリは、約２～約１００，０００，０００のメンバーを含む。別の実施形態では、ライブラリは、約１０，０００～約１００，０００，０００のメンバーを含む。また別の実施形態では、ライブラリは、約１００，０００～約１００，０００，０００のメンバーを含む。さらなる実施形態では、ライブラリは、約１，０００，０００～約１００，０００，０００のメンバーを含む。別の実施形態では、ライブラリは、約１０，０００，０００～約１００，０００，０００のメンバーを含む。また別の実施形態では、ライブラリは、１００を超えるメンバーを含む。
ライブラリのメンバーは、混合物の一部であり得るか、または互いに単離され得る。一例では、ライブラリのメンバーは、任意選択で他の構成要素を含む混合物の一部である。例えば、少なくとも２つのポリペプチドが細胞培養ブロスの体積中に存在する。別の例では、ライブラリのメンバーはそれぞれ、別個に発現され、任意選択で単離される。単離されたポリペプチドは、任意選択で、各ウェルが異なる種類のポリペプチドを含有するマルチウェル容器に含有され得る。別の例では、ライブラリのメンバーはそれぞれ、酵母もしくは細菌細胞、またはファージもしくはウイルス粒子への融合物として発現される。
本明細書で使用する場合、「ポリマー修飾基」という用語は、少なくとも１つのポリマー部分（ポリマー）を含む修飾基である。ポリペプチドに付加されるポリマー修飾基は、そのようなポリペプチドの特性、例えば、その生物学的利用能、生物学的活性、または体内でのその半減期を変更することができる。例示的なポリマーとしては、水溶性及び水不溶性ポリマーが挙げられる。ポリマー修飾基は、直鎖状または分枝状であり得、ポリ（アルキレングリコール）及びその誘導体などの１つ以上の独立して選択されるポリマー部分を含み得る。一例では、ポリマーは非天然に存在する。例示的な実施形態では、ポリマー修飾基は、水溶性ポリマー、例えば、ポリ（エチレングリコール）及びその誘導体（ＰＥＧ、ｍ－ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）及びその誘導体（ＰＰＧ、ｍ－ＰＰＧ）などを含む。好ましい実施形態では、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（プロピレングリコール）は、本質的に均一分散（ｈｏｍｏｄｉｓｐｅｒｓｅ）である分子量を有する。一実施形態では、ポリマー修飾基は、天然に存在する多糖ではない。
本明細書で使用する場合、「標的化部分」という用語は、身体の特定の組織または領域に選択的に局在する種を指す。局在性は、分子決定基、標的化剤またはコンジュゲートの分子サイズ、イオン相互作用、疎水性相互作用などの特異的認識によって媒介される。当業者には、薬剤を特定の組織または領域に標的化する他の機序が知られている。例示的な標的化部分としては、抗体、抗体断片、トランスフェリン、ＨＳ－糖タンパク質、凝固因子、血清タンパク質、β－糖タンパク質、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＥＰＯなどが挙げられる。
本明細書で使用する場合、「Ｆｃ融合タンパク質」という用語は、本明細書で「Ｆｃ部分」と呼ばれる免疫グロブリン由来部分と、疾患の治療が意図されるか否かにかかわらず、本明細書で「治療部分」と呼ばれる第２の非免疫グロブリンタンパク質に由来する部分とを含むタンパク質、特に治療用タンパク質を包含することを意味する。
本明細書で使用する場合、「治療部分」は、抗生物質、抗炎症剤、抗腫瘍薬、細胞毒素、及び放射性剤を含むがこれらに限定されない、療法に有用な任意の薬剤を意味する。「治療部分」は、２つ以上の治療部分が担体、例えば、多価薬剤に結合する構築物である、生体活性剤のプロドラッグを含む。
治療部分はまた、タンパク質及びタンパク質を含む構築物も含む。
本明細書で使用する場合、「抗腫瘍薬」は、を含む、がんに対抗するのに有用な任意の薬剤を意味する。
本明細書で使用する場合、「細胞毒素または細胞傷害性薬」は、細胞に有害な任意の薬剤を意味する。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルキシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルコルコルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、ならびにそれらの類似体または相同体が挙げられる。他の毒素としては、例えば、リシン、ＣＣ－１０６５及び類似体、ならびにデュオカルマイシンが挙げられる。さらに他の毒素としては、ジフテリア毒素、及び蛇毒（例えば、コブラ毒）が挙げられる。
本明細書で使用する場合、「放射性剤」は、腫瘍の診断または破壊に有効な任意の放射性同位体を含む。例としては、インジウム－１１１、コバルト－６０、フッ素－１８、銅－６４、銅－６７、ルテチウム－１７７、またはテクニシウム－９９ｍが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、放射性同位体の混合物を典型的に表すウラン、ラジウム、及びトリウムなどの天然に存在する放射性元素は、放射性剤の好適な例である。金属イオンは、典型的には、有機キレート部分とキレートされる。放射性剤または放射性核種は、造影剤の構成要素であり得る。
近赤外線色素は、光学撮像用途のための標準的な化学を使用してコンジュゲートすることもできる。「近赤外線」は、可視光に関連するその部分に隣接する電磁スペクトルの部分、例えば約０．７μｍ～約１μｍの放射線を指す。近赤外線色素としては、例えば、Ｃｙ５．５などのシアニンまたはインドシアニン誘導体を挙げることができる。赤外線色素はまた、ホスホラミダイト色素、例えば、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００（ＬＩ－ＣＯＲ（登録商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｃｎｅｓ）を含み得る。
多くの有用なキレート基、クラウンエーテル、クリプタン等が当該技術分野で既知であり、本発明の化合物に組み込まれ得る（例えば、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＮＴＡ、ＨＤＴＡ等、及びそれらのホスホネート類似体、例えば、ＤＴＰＰ、ＥＤＴＰ、ＨＤＴＰ、ＮＴＰ等）。例えば、 Ｐｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｒｏｎ Ｏｖｅｒｌｏａｄ，”Ｉｎ，ＩＮＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＩＮ ＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＥＤＩＣＩＮＥ； Ｍａｒｔｅｌｌ，Ｅｄ．；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８０，ｐｐ．２７９－３１２、Ｌｉｎｄｏｙ，ＴＨＥ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＭＡＣＲＯＣＹＣＬＩＣ ＬＩＧＡＮＤ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９８９、Ｄｕｇａｓ，ＢＩＯＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９、及びそれらに含まれる参照文献を参照されたい。さらに、キレート剤、クラウンエーテル、及びシクロデキストリンの他の分子への結合を可能にする多様な経路が当業者に利用可能である。例えば、Ｍｅａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｃｈｅｌａｔｅ－Ｔａｇｇｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．”Ｉｎ，ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ： ＦＯＯＤ，ＮＵＴＲＩＴＩＯＮＡＬ，ＡＮＤ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＡＳＰＥＣＴＳ；”、Ｆｅｅｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８２，ｐｐ．３７０－３８７、Ｋａｓｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，９：１０８－１１７（１９９８）、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，８：２４９－２５５（１９９７）を参照されたい。これらの金属結合剤を使用して、撮像法で検出可能な金属イオンを結合することができる。
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、コンジュゲートと組み合わせたときに、コンジュゲートの活性を保持し、対象の免疫系と非反応性である任意の材料を含む。「薬学的に許容される担体」には、固体及び液体、例えば、ビヒクル、希釈剤、及び溶媒が含まれる。例としては、標準的な薬学的担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルション、例えば、油／水エマルション、及び様々な種類の湿潤剤のうちの任意のものが挙げられるが、これらに限定されない。他の担体はまた、滅菌溶液、コーティングされた錠剤を含む錠剤、及びカプセルを含み得る。典型的には、そのような担体は、賦形剤、例えば、デンプン、牛乳、糖、ある特定の種類の粘土、ゼラチン、ステアリン酸もしくはその塩、ステアリン酸マグネシウムもしくはカルシウム、タルク、植物性脂肪もしくは油、ガム、グリコール、または他の既知の賦形剤を含有する。そのような担体はまた、風味及び着色添加物または他の成分を含んでもよい。そのような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤化される。
本明細書で使用する場合、「投与すること」は、経口投与、座薬としての投与、局所接触、静脈内、腹腔内、筋肉内、くも膜下腔内、病巣内、もしくは皮下投与、吸入による投与、または対象への徐放性デバイス、例えば、ミニ浸透圧ポンプの移植を意味する。投与は、非経口及び経粘膜（例えば、経口、経鼻、膣、直腸、または経皮）を含む任意の経路、特に吸入によるものである。非経口投与としては、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、皮下、腹腔内、心室内、及び頭蓋内が挙げられる。さらに、注射が腫瘍を治療する、例えば、アポトーシスを誘導する場合、投与は、腫瘍に直接及び／または腫瘍を取り囲む組織に直接行われ得る。他の送達モードとしては、リポソーム製剤、静脈内注入、経皮パッチ等の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
「回復すること」または「回復する」という用語は、症状の軽減、寛解、もしくは減少、または患者の心身の健康の改善などの任意の客観的または主観的パラメータを含む、病理または状態の治療における成功の任意の指標を指す。症状の回復は、客観的または主観的パラメータに基づいてもよく、身体検査及び／または精神科的評価の結果を含む。
「療法」という用語は、疾患にかかりやすいが、疾患の症状をまだ経験していないか、または示さない対象（例えば、ヒト）において疾患または状態が発生するのを予防すること（予防的治療）、疾患を阻害すること（その発症を緩徐または停止させる）、疾患の症状または副作用からの緩和を提供すること（対症治療を含む）、及び疾患を緩和すること（疾患の退縮を引き起こす）を含む、疾患または状態を「治療すること」またはその「治療」を指す。
「有効量」、または「に有効な量」、もしくは「治療有効量」という用語、または任意の文法的に等価な用語は、疾患を治療するために動物またはヒトに投与される場合、その疾患の治療をもたらすのに十分である量を意味する。有効量はまた、例えば、アポトーシス、細胞周期開始、及び／またはシグナル伝達を含む、細胞応答を引き起こすのに必要な量を指し得る。
「薬学的に許容される塩」という用語は、本明細書に記載の化合物で見られる特定の置換基に応じて、比較的非毒性の酸または塩基で調製される活性化合物の塩を含む。本発明の化合物が比較的酸性の官能基を含有する場合、塩基付加塩は、そのような化合物の中性形態を、十分な量の所望の塩基と、無溶媒で、または好適な不活性溶媒中で接触させることによって得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩の例としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、もしくはマグネシウム塩、または同様の塩が挙げられる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能基を含有する場合、酸付加塩は、そのような化合物の中性形態を、十分な量の所望の酸と、無溶媒で、または好適な不活性溶媒中で接触させることによって得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、またはリン酸等の無機酸、ならびに酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸等の比較的非毒性の有機酸に由来する塩が挙げられる。また、アルギニン酸等のアミノ酸の塩、及びグルクロン酸またはガラクツロン酸等の有機酸の塩も含まれる（例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６：１－１９（１９７７）を参照されたい）。本発明のある特定の具体的な化合物は、化合物を塩基または酸付加塩のいずれかに変換することを可能にする塩基性官能基及び酸性官能基の両方を含有する。
化合物の中性形態は、塩を塩基または酸と接触させ、従来の方法で親化合物を単離することによって再生されることが好ましい。化合物の親形態は、極性溶媒中の溶解度などのある特定の物理的特性において様々な塩形態とは異なるが、そうでなければ、塩は、本発明の目的のための化合物の親形態と同等である。
本発明の化合物は、そのような化合物を構成する原子のうちの１つ以上において、不自然な割合の原子同位体も含有し得る。例えば、化合物は、放射性同位体、例えば、トリチウム（3Ｈ）、ヨウ素－１２５（125Ｉ）または炭素－１４（14Ｃ）で放射標識され得る。放射性であるか否かにかかわらず、本発明の化合物のすべての同位体変化は、本発明の範囲内に包含されることが意図される。
本明細書で使用する場合、「反応性官能基」は、オレフィン、アセチレン、アルコール、フェノール、エーテル、酸化物、ハロゲン化物、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、シアネート、イソシアネート、チオシアネート、イソチオシアネート、アミン、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドラジド、ジアゾ、ジアゾニウム、ニトロ、ニトリル、メルカプタン、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、アセタール、ケタール、無水物、硫酸、スルフェニン酸イソニトリル、アミジン、イミド、イミデート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、亜硫酸、エナミン、イナミン、尿素、シュードウレア（ｐｓｅｕｄｏｕｒｅａ）、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバメート、イミン、アジド、アゾ化合物、アゾキシ化合物、及びニトロソ化合物を含むがこれらに限定されない基を指す。反応性官能基には、バイオコンジュゲート、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミド等を調製するために使用されるものも含まれる。これらの官能基のそれぞれを調製するための方法は、当該技術分野で周知であり、特定の目的のためのそれらの適用または修飾は、当業者の能力の範囲内である（例えば、Ｓａｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｏ，ｅｄｓ．ＯＲＧＡＮＩＣ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＧＲＯＵＰ ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９８９を参照されたい）。
ＩＩＩ．バリアント：ＨＧＦ及びＦＧＦ
いくつかの実施形態では、バリアントは、野生型増殖因子と比較してタンパク質分解的に安定したバリアントである。例示的な実施形態では、バリアントは、野生型と比較して、増加したタンパク質分解安定性を示す。いくつかの実施形態では、バリアントは、野生型増殖因子の任意のバリアントである。いくつかの実施形態では、バリアントは、野生型増殖因子が結合する増殖因子受容体のアンタゴニストである。
いくつかの実施形態では、バリアントは、ＦＧＦ１のバリアントである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸付加、及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのメンバーを含むヒト線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ１）のバリアントが提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸付加、及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのメンバーを含むヒト線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ１）のバリアントが提供され、結果として生じるＦＧＦ１バリアントは、配列番号１の野生型ＦＧＦ１と比較して、増加したタンパク質分解安定性を示す。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントは、βループまたはＣ末端付近においてアミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸付加、及びそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントは、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）アンタゴニストである。本発明は、このアミノ酸が親ＦＧＦ１ポリペプチド（野生型、配列番号１）に見られない少なくとも１つの位置に少なくとも１つのアミノ酸を含むＦＧＦ１ポリペプチドを提供する。
Figure 2022513196000003
いくつかの実施形態では、配列番号１のＦＧＦ１バリアントは、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントは、２８位、４０位、４７位、９３位、または１３１位に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントは、Ｄ２８Ｎ、Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、Ｌ１３１Ｒ、及びＬ１３１Ｋからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントは、アミノ酸置換Ｌ１３１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントは、アミノ酸置換Ｌ１３１Ｋを含む。いくつかの実施形態では、バリアントは、アミノ酸置換Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、バリアントは、アミノ酸置換Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｋを含む。いくつかの実施形態では、バリアントは、アミノ酸置換Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、及びＬ１３１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、バリアントは、アミノ酸置換Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、及びＬ１３１Ｋを含む。いくつかの実施形態では、バリアントは、アミノ酸置換Ｄ２８Ｎ、Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、及びＬ１３１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、バリアントは、アミノ酸置換Ｄ２８Ｎ、Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、及びＬ１３１Ｋを含む。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントは、アミノ酸置換Ｌ１３１Ａを含まない。
いくつかの実施形態では、バリアントＦＧＦ１は、ＢＳ４Ｍ１（Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｒ）バリアントと称されるバリアントである。いくつかの実施形態では、ＢＳ４Ｍ１は、配列
Figure 2022513196000004
 を含む。
いくつかの実施形態では、バリアントＦＧＦ１は、ＰＭ２（Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ）と称されるバリアントである。いくつかの実施形態では、ＰＭ２は、配列
Figure 2022513196000005
 を含む。
いくつかの実施形態では、バリアントＦＧＦ１は、ＰＭ３（Ｄ２８Ｎ、Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、Ｌ１３１Ｒ）と称されるバリアントである。いくつかの実施形態では、ＰＭ３は、配列
Figure 2022513196000006
 を含む。
いくつかの実施形態では、バリアントＦＧＦ１は、配列
Figure 2022513196000007
 を含む。
いくつかの実施形態では、バリアントＦＧＦ１は、配列
Figure 2022513196000008
 を含む。
いくつかの実施形態では、バリアントは、単離されたバリアントである。いくつかの実施形態では、バリアントは、本ポリペプチド中に存在しない少なくとも１つの望ましい特徴を示す。例示的な特徴としては、タンパク質分解安定性の増加、熱安定性の増加、立体配座柔軟性の増加または減少、及び増加したアンタゴニストが挙げられるが、これらに限定されない。当業者に理解されるように、バリアントは、これらの改善された特徴のうちの２つ以上の任意の組み合わせを示し得る。
いくつかの実施形態では、バリアントＦＧＦ１は、ＦＧＦＲ受容体のアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６からなる群から選択される配列を有する。
いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントは、親ポリペプチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、本発明の増殖因子バリアントは、親ポリペプチドと少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．６％、または少なくとも約９９．８％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントは、親ポリペプチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、本発明のＦＧＦ１バリアントは、親ポリペプチドと少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．６％、または少なくとも約９９．８％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、変異される配列番号１の位置は、２８、４０、４７、９３、または１３１のうちの１つ以上を含む。当業者が認識するように、これらの位置の任意の組み合わせを変異させることができる。
いくつかの実施形態では、２８位にある親ポリペプチドのアミノ酸は、野生型ＦＧＦ１（例えば、配列番号と比較してＮに変更される。
いくつかの実施形態では、４０位にある親ポリペプチドのアミノ酸は、Ｐに変更される。
いくつかの実施形態では、４７位にある親ポリペプチドのアミノ酸は、Ｉに変更される。
いくつかの実施形態では、９３位にある親ポリペプチドのアミノ酸は、Ｇに変更される。
いくつかの実施形態では、１３１位にある親ポリペプチドのアミノ酸は、Ｒに変更される。いくつかの実施形態では、１３１位にある親ポリペプチドのアミノ酸は、Ｋに変更される。
本発明は、このアミノ酸が親ｈＨＧＦポリペプチド（野生型）に見られない少なくとも１つの位置に少なくとも１つのアミノ酸を含むｈＨＧＦポリペプチドを提供する。本発明は、アイソフォーム１及び３を含むが、これらに限定されない、ｈＨＧＦのすべてのアイソフォームのバリアントを包含する。アイソフォーム３（ＮＣＢＩ受託ＮＰ＿００１０１０９３２）は、以下の配列番号８（アイソフォーム１）において下線で示される５つのアミノ酸欠失（ＳＦＬＰＳ）を含む。
例示的な実施形態では、本発明は、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する配列番号９のバリアントを提供する。
例示的な実施形態では、バリアントは、単離されたバリアントである。さらに、様々な実施形態では、バリアントは、本ポリペプチド中に存在しない少なくとも１つの望ましい特徴を示す。例示的な特徴としては、Ｍｅｔ受容体に対する親和性の増加、熱安定性の増加、立体配座柔軟性の増加または減少、及びＭｅｔ受容体に対する増加したアゴニストまたはアンタゴニスト活性が挙げられるが、これらに限定されない。当業者に理解されるように、バリアントは、これらの改善された特徴のうちの２つ以上の任意の組み合わせを示し得る。
例示的な実施形態では、ポリペプチドバリアントは、Ｍｅｔ受容体のアンタゴニストである。様々な実施形態では、バリアントは、Ｍｅｔ受容体のアゴニストである。
例示的な実施形態では、本発明は、配列番号９から選択されるメンバーである配列を有するｈＨＧＦポリペプチドバリアントを提供する。
例示的な親ポリペプチドは、野生型ＨＧＦアイソフォーム１（ＨＧＦ ＮＣＢＩ受託ＮＰ＿０００５９２）（配列番号８）である。
Figure 2022513196000009
配列番号８において、シグナルペプチドは、アミノ酸１～３１を含む。Ｎ末端ドメインは、アミノ酸３９～１２２を含む。クリングル１ドメインはアミノ酸１２６～２０７を含み、クリングル２はアミノ酸２０８～２８９を含み、クリングル３はアミノ酸３０２～３８４を含み、クリングル４はアミノ酸３８８～４７０を含む。セリンプロテアーゼ様ドメインは、４９５～７１９を含む。
例示的な実施形態では、本発明のバリアントは、親ポリペプチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する。様々な実施形態では、本発明のバリアントは、親ポリペプチドと少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．６％、または少なくとも約９９．８％の配列同一性を有する。
例示的な実施形態では、変異される配列番号９の位置は、６２、６４、７７、９５、１２５、１２７、１３０、１３２、１３７、１４２、１４８、１５４、１７０、１７３、及び１９３のうちの１つ以上を含む。当業者が認識するように、これらの位置の任意の組み合わせを変異させることができる。様々な実施形態では、アイソフォーム３の類似位置が変異される。
ＭＷＶＴＫＬＬＰＡＬＬＬＱＨＶＬＬＨＬＬＬＬＰＩＡＩＰＹＡＥＧＱＲＫＲＲＮＴＩＨＥＦＫＫＳＡＫＴＴＬＩＫＩＤＰＡＬＫＩＫ
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ＬＴＹＫＶＰＱＳ（配列番号９）
例示的な実施形態では、親ポリペプチドのアミノ酸は、Ｋから、Ｅ、Ｎ、及びＲから選択されるメンバーに変更される。例示的な実施形態では、親ポリペプチドのアミノ酸は、ＱからＲに変更される。例示的な実施形態では、親ポリペプチドのアミノ酸は、Ｉから、Ｔ及びＶから選択されるメンバーに変更される。例示的な実施形態では、親ポリペプチドのアミノ酸は、ＮからＤに変更される。いくつかの実施形態では、Ｄは、親ポリペプチドのＮに戻すことができる。
様々な実施形態では、４２位のアミノ酸は、ＦまたはＣである。様々な実施形態では、６２位のアミノ酸は、野生型親ポリペプチドに見られるＫからＥに変化する。様々な実施形態では、６４位は、ＶまたはＡである。様々な実施形態では、７７位は、ＮまたはＳである。様々な実施形態では、９５位のアミノ酸は、ＱまたはＲである。様々な実施形態では、１２５位のアミノ酸は、野生型親ポリペプチドに見られるＩからＴに変化する。様々な実施形態では、１２７位のアミノ酸は、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、またはＡであり得る。様々な実施形態では、１３０位のアミノ酸は、ＩからＶに変化する。様々な実施形態では、１３２位のアミノ酸は、ＫからＮまたはＲに変化する。様々な実施形態では、１３７位のアミノ酸は、ＫまたはＲである。様々な実施形態では、１５４位のアミノ酸は、ＳまたはＡである。様々な実施形態では、１７０位のアミノ酸は、ＫまたはＥである。様々な実施形態では、１７３位のアミノ酸は、ＱまたはＲである。様々な実施形態では、１９３位のアミノ酸は、ＮまたはＤである。様々な実施形態では、４２位のアミノ酸は、ＦまたはＣである。様々な実施形態では、９６位のアミノ酸は、ＣまたはＲである。当業者が理解するように、これらの変化の任意の組み合わせ、ならびに以下の表に記載されるそれらの任意の組み合わせは、本発明のポリペプチドバリアントに存在し得る。
いくつかの実施形態では、ＨＧＦバリアントは、野生型ＨＧＦ（配列番号９）と比較して、Ｋ６２Ｅ、Ｎ１２７Ｄ、Ｋ１７０Ｅ、及びＮ１９３Ｅを含む。いくつかの実施形態では、ＨＧＦバリアントは、野生型ＨＧＦ（配列番号９）と比較してＫ６２Ｅ、Ｑ９５Ｒ、Ｎ１２７Ｄ、Ｋ１３２Ｎ、Ｋ１７０Ｅ、Ｑ１７３Ｒ、及びＮ１９３Ｅを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＧＦバリアントは、野生型ＨＧＦ（配列番号９）と比較して、列挙される位置に以下の特異的アミノ酸を有するコンセンサス配列を含む：Ｋ６２Ｅ、Ｑ９５Ｒ、Ｉ１２５Ｔ、Ｎ１２７Ｄ、Ｉ１３０Ｖ、Ｋ１３２Ｎ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、Ｑ１７３Ｒ、及びＮ１９３Ｅ。
表１、２、及び３は、本発明の例示的な変異を示す。
Figure 2022513196000010
 表２.３回目の指向性進化から単離されたＮＫ１変異体の個々の配列変異。配列番号１は野生型であり、野生型配列との違いのみが配列番号９に示され、空白は、野生型ｈＨＧＦ残基が保持されることを意味する。
Figure 2022513196000011
 ｂｐ：塩基対変異の数
ＡＡ：アミノ酸変異の数
表３.３回目の指向性進化から単離されたＮＫ１変異体の個々の配列変異。配列番号９は野生型であり、野生型配列との相違のみが配列番号９に示される。
Figure 2022513196000012
 ｂｐ：塩基対変異の数
ＡＡ：アミノ酸変異の数
ａ．コンジュゲート
本発明は、本発明のバリアントと、１つ以上のコンジュゲーションパートナーとのコンジュゲートを提供する。例示的なコンジュゲーションパートナーとしては、ポリマー、標的化剤、治療剤、細胞傷害性薬、キレート剤、及び検出可能な薬剤が挙げられる。当業者は、これらの非限定的な薬剤カテゴリー間に重複があることを認識するであろう。
コンジュゲーションパートナーまたは「修飾基」は、任意のコンジュゲート可能な部分であり得る。例示的な修飾基を以下に論じる。修飾基は、所与のポリペプチドの特性（例えば、生物学的または物理化学的特性）を変更するそれらの能力のために選択され得る。修飾基の使用によって変更され得る例示的なポリペプチドの特性としては、薬物動態学、薬力学、代謝安定性、生体分布、水溶性、親油性、組織標的化能力、及び治療活性プロファイルが挙げられるが、これらに限定されない。修飾基は、診断用途またはインビトロ生物学的アッセイ系で使用するポリペプチドの修飾に有用である。
いくつかの実施形態では、例えば、本明細書に記載されるＦＧＦ１バリアントを含む増殖因子バリアントが、Ｆｃ部分と組み合わされる。Ｆｃ部分は、好ましくはＩｇＧであるヒトまたは動物免疫グロブリン（Ｉｇ）に由来し得る。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４であり得る（例えば、図３４を参照されたい）。Ｆｃ部分が、免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧの重鎖に由来することも好ましい。より好ましくは、Ｆｃ部分は、免疫グロブリン重鎖定常領域の一部分、例えばドメインなどを含む。そのようなＩｇ定常領域は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインのいずれか、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのＩｇ定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ部分は、少なくともＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。Ｆｃ部分は、ＩｇＧヒンジ領域、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含むことがさらに好ましい。
表４：例示的なＩｇＧ配列：
Figure 2022513196000013
ＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインは、ＩｇＧ１が血清タンパク質のいずれかの中で最も長い血清半減期を有するため、Ｆｃ部分として使用されることが多い。長い血清半減期は、動物研究及び潜在的なヒト治療使用のための望ましいタンパク質の特徴であり得る。加えて、ＩｇＧ１サブクラスは、抗体媒介エフェクター機能を実行する最も強い能力を有する。
融合タンパク質において最も有用であり得る一次エフェクター機能は、ＩｇＧ１抗体が抗体依存性細胞傷害性を媒介する能力である。一方で、これは、主にアンタゴニストとして機能する融合タンパク質にとって望ましくない機能であり得る。ＩｇＧ１サブクラスにおいて抗体定常領域媒介活性に重要ないくつかの特定のアミノ酸残基が特定されている。したがって、これらの特異的アミノ酸の包含または除外は、特異的免疫グロブリン定常領域媒介活性の包含または除外を可能にする。
本発明によると、Ｆｃ部分はまた、エフェクター機能を調節するために修飾され得る。例えば、ＥＵインデックス位置による以下のＦｃ変異（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１）は、Ｆｃ部分がＩｇＧ１：Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ；Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ＋Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ；Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／ＡΔ２３６＋Ａ３２７Ｇ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ；Ｅ３３３Ａ；Ｋ３２２Ａに由来する場合、導入することができる。
さらなるＦｃ変異は、例えば、３３０、３３１、２３４、もしくは２３５、またはそれらの組み合わせから選択されるＥＵインデックス位置での置換であり得る。ＣＨ２ドメインに位置するＥＵインデックス位置２９７におけるアミノ酸置換は、本発明の文脈におけるＦｃ部分にも導入され得、Ｎ結合炭水化物結合の潜在的部位を排除する。ＥＵインデックス位置２２０におけるシステイン残基も置き換えられ得る。
本発明のＦｃ融合タンパク質は、単量体または二量体であり得る。Ｆｃ融合タンパク質はまた、二量体Ｆｃ部分（例えば、２つのジスルフィド架橋ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３構築物の二量体）を含有する「擬似二量体（ｐｓｅｕｄｏ－ｄｉｍｅｒ）」であってもよく、そのうちの１つのみが治療部分に融合される。
Ｆｃ融合タンパク質は、２つの異なる治療部分を含有するヘテロ二量体、または単一の治療部分の２つのコピーを含有するホモ二量体であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される増殖因子バリアント（例えば、ＦＧＦ１バリアントを含む）のインビボ半減期は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分で増強され得る。ＰＥＧ（ＰＥＧ化）によるポリペプチドの化学修飾は、それらの分子サイズを増加させ、典型的には、表面及び官能基の到達性を低下させ、それらの各々は、ポリペプチドに結合したＰＥＧ部分の数及びサイズに依存する。しばしば、この修飾は、血漿半減期の改善及びタンパク質分解安定性、ならびに免疫原性及び肝取り込みの減少をもたらす（Ｃｈａｆｆｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１６４３－１６５１（１９９２）、Ｐｙａｔａｋ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｃｈｅｍ．Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：１１３－１２７（１９８０））。例えば、インターロイキン－２のＰＥＧ化は、インビボでその抗腫瘍効力を増加させることが報告されており（Ｋａｔｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：１４８７－１４９１ （１９８７））、モノクローナル抗体Ａ７に由来するＦ（ａｂ’）２のＰＥＧ化は、その腫瘍局在性を改善した（Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８：１３８７－１３９４（１９９０））。したがって、別の実施形態では、本発明の方法によってＰＥＧ部分により誘導体化されたポリペプチドのインビボ半減期は、非誘導体化親ポリペプチドのインビボ半減期に対して増加する。
ポリペプチドインビボ半減期の増加は、親ポリペプチドに対して増加パーセントの範囲として最適に表される。パーセント増加の範囲の下端は、約４０％、約６０％、約８０％、約１００％、約１５０％、または約２００％である。範囲の上端は、約６０％、約８０％、約１００％、約１５０％、または約２５０％超である。
多くの水溶性ポリマーは当業者には既知であり、本発明の実施に有用である。「水溶性ポリマー」という用語は、糖類（例えば、デキストラン、アミロース、ヒアルロン酸、ポリ（シアル酸）、ヘパラン、ヘパリン等）；ポリ（アミノ酸）、例えば、ポリ（アスパラギン酸）、及びポリ（グルタミン酸）；核酸；合成ポリマー（例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エーテル）、例えば、ポリ（エチレングリコール）；ペプチド、タンパク質等の種を包含する。本発明は、ポリマーが、コンジュゲートの残りが結合され得る点を含まなければならないという唯一の制限を有する任意の水溶性ポリマーで実施することができる。例えば、Ｈａｒｒｉｓ，Ｍａｃｒｏｎｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃ２５：３２５－３７３（１９８５）、Ｓｃｏｕｔｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １３５：３０－６５（１９８７）、Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８６６－８７４（１９９２）、Ｄｅｌｇａｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ９：２４９－３０４（１９９２）、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６：１５０－１６５（１９９５）、及びＢｈａｄｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，５７：５－２９（２００２）．を参照されたい。
別の実施形態では、上に論じられるものと同様に、修飾糖は、水溶性ポリマーではなく水不溶性ポリマーを含む。本発明のコンジュゲートはまた、１つ以上の水不溶性ポリマーを含んでもよい。本発明のこの実施形態は、制御された様式で治療用ポリペプチドを送達するビヒクルとしてのコンジュゲートの使用によって図示される。ポリマー薬物送達系は当該技術分野で既知である。例えば、Ｄｕｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ ＤＲＵＧＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｖｏｌ．４６９，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９９１を参照されたい。当業者は、実質的に任意の既知の薬物送達系が本発明のコンジュゲートに適用可能であることを理解するであろう。
代表的な水不溶性ポリマーとしては、ポリホスファジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリハロゲン化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリグリコライド、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、ポリ（アクリル酸オクタデシル）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、プルロニック（登録商標）、及びポリビニルフェノール、ならびにそれらのコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のコンジュゲートに使用される代表的な生分解性ポリマーとしては、ポリラクチド、ポリグリコライド及びそれらのコポリマー、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド－コ－カプロラクトン）、ポリ（ラクチド－コ－グリコライド）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、それらのブレンド及びコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。特定の使用のものは、ゲルを形成する組成物、例えば、コラーゲン、プルロニック（登録商標）等を含むものである。
例示的な吸収性ポリマーとしては、例えば、ポリ（α－ヒドロキシ－カルボン酸）／ポリ（オキシアルキレン）の合成により生成された吸収性ブロックコポリマーが挙げられる（Ｃｏｈｎ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，８２６，９４５号）。これらのコポリマーは架橋されておらず、本体が分解性ブロックコポリマー組成物を排泄することができるように水溶性である。Ｙｏｕｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２１：１３０１－１３１６（１９８７）及びＣｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２２：９９３－１００９（１９８８）を参照されたい。
ヒドロゲルの構成要素であるポリマーも本発明において有用である。ヒドロゲルは、比較的大量の水を吸収することができるポリマー材料である。ヒドロゲル形成化合物の例としては、ポリアクリル酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリジン、ゼラチン、カラギーナン、及び他の多糖類、ヒドロキシエチレンメタクリル酸（ＨＥＭＡ）、ならびにそれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。安定した、生分解性、及び生体吸収性のヒドロゲルを生成することができる。さらに、ヒドロゲル組成物は、これらの特性のうちの１つ以上を示すサブユニットを含むことができる。
別の実施形態では、ゲルは熱可逆性ゲルである。プルロニック（登録商標）、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、多糖類、ポリウレタンヒドロゲル、ポリウレタン－尿素ヒドロゲルなどの構成要素を含む熱可逆性ゲル、及びそれらの組み合わせが現在好ましい。
さらに別の例示的な実施形態では、本発明のコンジュゲートは、リポソームの構成要素を含む。リポソームは、例えば、１９８５年６月１１日に発行されたＥｐｐｓｔｅｉｎらの米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように、当業者に既知の方法により調製され得る。例えば、リポソーム製剤は、適切な脂質（複数可）（ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリン、及びコレステロールなど）を無機溶媒に溶解し、その後蒸発させ、容器の表面上に乾燥脂質の薄膜を残すことによって調製され得る。次いで、活性化合物またはその薬学的に許容される塩の水溶液を容器中に導入する。次いで、容器を手で旋回させて、容器の側面から脂質材料を遊離し、脂質凝集体を分散させ、それによってリポソーム懸濁液を形成する。
本発明はまた、ポリペプチドが治療部分、診断部分、標的化部分、毒素部分等にコンジュゲートされる上述のものに類似するコンジュゲートを提供する。上に列記される部分のそれぞれは、小分子、天然ポリマー（例えば、ポリペプチド）、または合成ポリマーであり得る。
様々な実施形態では、バリアントは、組織再生のためにマトリックスの構成要素にコンジュゲートされる。例示的なマトリックスは、当該技術分野で既知であり、本発明の増殖因子バリアント（例えば、ＦＧＦ１バリアントを含む）のマトリックスの適切な選択及び修正は、当業者の能力の範囲内である。本発明の増殖因子バリアント（例えば、ＦＧＦ１バリアントを含む）は、一般に、例えば、眼、肝臓、筋肉、神経、及び心臓組織の再生を含む再生医療用途に有用である。
いくつかの実施形態では、本発明は、コンジュゲートの構成要素としての標的化剤の存在に起因して特定の組織において選択的に局在するコンジュゲートを提供する。例示的な実施形態では、標的化剤は、タンパク質である。例示的なタンパク質としては、トランスフェリン（脳、血液プール）、ＨＳ－糖タンパク質（骨、脳、血液プール）、抗体（脳、抗体特異的抗原を有する組織、血液プール）、凝固因子Ｖ～ＸＩＩ（損傷組織、凝血塊、がん、血液プール）、血清タンパク質、例えばα－酸糖タンパク質、フェチュイン、α－胎児タンパク質（脳、血液プール）、β２－糖タンパク質（肝臓、粥状動脈硬化プラーク、脳、血液プール）、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、及びＥＰＯ（免疫刺激、がん、血液プール、赤血球過剰産生、神経保護）、アルブミン（半減期の増加）、ＩＬ－２、及びＩＦＮ－αが挙げられる。
別の実施形態では、本発明は、本発明の増殖因子バリアント（例えば、ＦＧＦ１バリアントを含む）と治療部分との間にコンジュゲートを提供する。本発明の実施において有用な治療部分としては、様々な薬理活性を有する広範な薬物クラスからの薬物が挙げられる。治療剤及び診断剤を様々な他の種にコンジュゲートする方法は、当業者に周知である。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９６及びＤｕｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ ＤＲＵＧＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｖｏｌ．４６９，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９９１を参照されたい。
有用な治療部分のクラスとしては、例えば、抗悪性腫瘍薬（例えば、抗アンドロゲン（例えば、ロイプロリドまたはフルタミド）、細胞破壊剤（例えば、アドリアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、シクロホスファミド、ブスルファン、シスプラチン、β－２－インターフェロン）、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）、抗代謝物（例えば、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、チオグアニン）が挙げられる。診断と療法の両方のための放射性同位体に基づく薬剤、ならびにコンジュゲートされた毒素、例えば、リシン、ゲルダナマイシン、ミタンシン、ＣＣ－１０６５、デュオカルマイシン、カリケアミシン、ならびにそれらの関連する構造及び類似体もこのクラス内に含まれる。
治療部分はまた、ホルモン（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラジオール、ロイプロリド、メゲストロール、オクトレオチド、またはソマトスタチン）；内分泌調節薬（例えば、避妊薬（例えば、エチノジオール、エチニルエストラジオール、ノルエチンドロン、メストラノール、デソゲストレル、メドロキシプロゲステロン）であり得る。本発明の様々な実施形態に有用なのは、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベステロール）、グルココルチコイド（例えば、トリアムシノロン、ベタメタゾン等）、及びプロゲストゲン、例えば、ノルエチンドロン、エチノジオール、ノルエチンドロン、レボノルゲストレルとのコンジュゲートであり、甲状腺剤（例えば、リオチロニンまたはレボチロキシン）または抗甲状腺剤（例えば、メチマゾール）、抗高プロラクチン血症薬（例えば、カベルゴリン）、ホルモン抑制剤（例えば、ダナゾールまたはゴセレリン）、分娩誘発薬（例えば、メチルエルゴノビンまたはオキシトシン）、ならびにプロスタグランジン、例えば、ミオプロストール、アルプロスタジル、またはジノプロストンも用いることができる。
他の有用な修飾基としては、免疫調節薬（例えば、抗ヒスタミン剤、肥満細胞安定剤、例えば、ロドキサミド及び／またはクロモリン、ステロイド（例えば、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、コルチゾン、デキサメタゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベクロメタゾン、またはクロベタゾール）、ヒスタミンＨ２アンタゴニスト（例えば、ファモチジン、シメチジン、ラニチジン）、免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、シクロスポリン）等が挙げられる。抗炎症活性を有する基、例えば、スリンダク、エトドラク、ケトプロフェン、及びケトロラックも有用である。本発明と併せて使用される他の薬物は、当業者には明らかであろう。
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、反応性アミノ酸と反応性アミノ酸の反応性コンジュゲーションパートナーとの間の反応によって形成される。反応性アミノ酸及び反応性コンジュゲーションパートナーの両方が、それらのフレームワーク内に１つ以上の反応性官能基を含む。２つの結合種のうちの１つは、酵素調節求核置換反応において容易に置換されるか、または代替的に、求核反応パートナー（例えば、スフヒドリル基を担持するアミノ酸部分）を利用する化学反応において置換されるこれらの部分を指す「脱離基」（または活性化基）を含んでもよい。各種類の反応に好適な脱離基を選択することは、当業者の能力の範囲内である。多くの活性化糖が当該技術分野で既知である。例えば、Ｖｏｃａｄｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ ＣＡＲＢＯＨＹＤＲＡＴＥ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．２，Ｅｒｎｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ： Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２０００、Ｋｏｄａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３４：６４１９（１９９３）、Ｌｏｕｇｈｅｅｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３７７１７（１９９９））を参照されたい。
様々な実施形態では、天然に存在するＦＧＦ１のバリアント（またはあるバリアント）であるアミノ酸置換は、コンジュゲーションパートナー、例えば、側鎖アミノ酸、例えば、システイン、リジン、セリン等の結合のための遺伝子座である。
本発明の実施において有用な反応基及び反応のクラスは、一般に、生体共役化学の分野において周知のものである。現在、反応性糖部分で利用可能な好ましい反応のクラスは、比較的穏やかな条件下で進行するものである。これらには、求核置換（例えば、アミン及びアルコールのアシルハロゲン化物、活性エステルとの反応）、求電子置換（例えば、エナミン反応）、ならびに炭素－炭素及び炭素－ヘテロ原子多重結合への付加（例えば、マイケル反応、ディールス－アルダー付加）が含まれるが、これらに限定されない。これら及び他の有用な反応は、例えば、Ｍａｒｃｈ，ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９６、及びＦｅｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ．１９８，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８２に論じられている。
ｂ．反応性官能基
反応性アミノ酸または反応性コンジュゲーションパートナー上の有用な反応性官能基としては、以下を含むが、それらに限定されない：
（ａ）カルボキシル基、ならびにＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ－ヒドロキシベンズトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ－ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、及び芳香族エステルを含むがこれらに限定されないその様々な誘導体；
（ｂ）例えば、エステル、エーテル、アルデヒド等に変換され得るヒドロキシル基、
（ｃ）ハロゲン化物が、後に、例えば、アミン、カルボキシレートアニオン、チオールアニオン、カルバニオン、またはアルコキシドイオン等の求核基で置換され得、それによって、ハロゲン原子の官能基において新しい基の共有結合をもたらす、ハロアルキル基；
（ｄ）例えば、マレイミド基などのディールス－アルダー反応に関与することができるジエノフィル基；
（ｅ）例えば、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンもしくはオキシムなどのカルボニル誘導体の形成を介して、またはグリニャール付加もしくはアルキルリチウム付加などの機構を介して、後続の誘導体化が可能であるような、アルデヒドまたはケトン基；
（ｆ）例えば、スルホンアミドを形成するための、アミンとの後続反応のための、ハロゲン化スルホニル基；
（ｇ）例えば、ジスルフィドに変換されるか、またはハロゲン化アシルと反応し得る、チオール基；
（ｈ）例えば、アシル化、アルキル化、または酸化され得る、アミンまたはスルフヒドリル基；
（ｉ）例えば、シクロ付加、アシル化、マイケル付加等を受けることができる、アルケン；ならびに
（ｊ）例えば、アミン及びヒドロキシル化合物と反応し得る、エポキシド。
反応性官能基は、反応性糖核または修飾基を組み立てるのに必要な反応に関与しないか、または干渉しないように選択され得る。あるいは、反応性官能基は、保護基の存在によって反応における関与から保護することができる。当業者は、選択された一連の反応条件に干渉しないように特定の官能基を保護する方法を理解する。有用な保護基の例については、例えば、Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１を参照されたい。
ポリペプチド及びコンジュゲーションパートナーを連結する基は、架橋基、例えば、ゼロまたは高次架橋基であってもよい（架橋試薬及び架橋手順の概説については、Ｗｏｌｄ，Ｆ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５：６２３－６５１，１９７２、Ｗｅｅｔａｌｌ，Ｈ．Ｈ．，ａｎｄ Ｃｏｏｎｅｙ，Ｄ．Ａ．，Ｉｎ： ＥＮＺＹＭＥＳ ＡＳ ＤＲＵＧＳ．（Ｈｏｌｃｅｎｂｅｒｇ，ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｄｓ．）ｐｐ．３９５－４４２，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８１、Ｊｉ，Ｔ．Ｈ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９１：５８０－６０９，１９８３、Ｍａｔｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１７：１６７－１８３，１９９３を参照されたく、それらのすべては、参照により本明細書に組み込まれる）。好ましい架橋試薬は、様々なゼロ長、ホモ二官能性、及びヘテロ二官能性架橋試薬に由来する。ゼロ長架橋試薬としては、外因性材料の導入を伴わない２つの内因性化学基の直接コンジュゲーションが挙げられる。ジスルフィド結合の形成を触媒する薬剤は、このカテゴリーに属する。別の例は、カルボキシルと一次アミノ基との縮合を誘導して、カルボジイミド、クロロギ酸エチル、ウッドワード試薬Ｋ（２－エチル－５－フェニルイソオキサゾリウム－３’－スルホネート）、及びカルボニルジイミダゾールなどのアミド結合を形成する試薬である。これらの化学試薬に加えて、酵素トランスグルタミナーゼ（グルタミルペプチドγ－グルタミルトランスフェラーゼ、ＥＣ ２．３．２．１３）がゼロ長架橋試薬として使用され得る。この酵素は、通常は基質として一次アミノ基を用いて、タンパク質結合グルタミニル残基のカルボキサミド基においてアシル転移反応を触媒する。好ましいホモ及びヘテロ二官能性試薬は、それぞれ、アミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、または非特異的基に対して反応性であり得る２つの同一のまたは２つの異なる部位を含有する。
本発明のポリペプチドに結合される例示的なコンジュゲーションパートナーとしては、ＰＥＧ誘導体（例えば、アルキル－ＰＥＧ、アシル－ＰＥＧ、アシル－アルキル－ＰＥＧ、アルキル－アシル－ＰＥＧ、カルバモイル－ＰＥＧ、アリール－ＰＥＧ）、ＰＰＧ誘導体（例えば、アルキル－ＰＰＧ、アシル－ＰＰＧ、アシル－アルキルＰＰＧ、アルキル－アシル－ＰＰＧ カルバモイル－ＰＰＧ、アリール－ＰＰＧ）、治療部分、診断部分、マンノース－６－ホスフェート、ヘパリン、ヘパラン、Ｓｌｅx、マンノース、マンノース－６－ホスフェート、シアリルルイスＸ、ＦＧＦ、ＶＦＧＦ、タンパク質、コンドロイチン、ケラタン、デルマタン、アルブミン、インテグリン、分岐型（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）オリゴ糖、ペプチド等が挙げられるが、これらに限定されない。
共有結合に加えて、本発明の増殖因子バリアント（例えば、ＦＧＦ１バリアントを含む）は、非共有相互作用を介して生体材料の表面上に結合することができる。非共有結合タンパク質組み込みは、例えば、封入または吸収によって行われ得る。本発明のポリペプチドの生体材料への結合は、ヘパリンを介して媒介され得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、Ｈａｒａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９４）９４：６２３－６３０、Ｌａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（１９９９）１８６５－１８７１、及びその中で引用される参照文献に記載されるヘパリン－アルギネートポリマー及びアルギネートに結合される。他の実施形態では、本発明のポリペプチドは、コラーゲンに基づく生体材料に結合される。
ｃ．造影剤
本発明の例示的なコンジュゲートは、本発明のバリアントと検出可能な部分とを含む造影剤であり、これは画像診断法において検出可能である。生体におけるＭｅｔ受容体を特異的に標的とし、患者特異的がん治療及び疾患管理のための腫瘍の非侵襲的特徴付けを可能にする分子撮像プローブが緊急に必要である。非侵襲的撮像を介してＭｅｔ発現腫瘍を検出する能力は、転移リスクの指標としても役立ち得る。
本発明のコンジュゲートが利用される例示的な画像診断法としては、本発明のバリアントに陽電子放射同位体がタグ付けされる陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）が挙げられるが、これに限定されない。典型的な同位体としては、11Ｃ、13Ｎ、15Ｏ、18Ｆ、64Ｃｕ、62Ｃｕ、124Ｉ、76Ｂｒ、82Ｒｂ、及び68Ｇａが挙げられ、18Ｆが最も臨床的に利用される。バリアントはまた、超音波剤、磁気共鳴造影剤、Ｘ線剤、ＣＴ剤、ガンマカメラシンチグラフィー剤、及び蛍光造影剤に組み込まれ得る。さらなる検出可能な部分及び撮像方法を、以下の方法のセクションに記載する。
例示的な実施形態では、コンジュゲーションパートナーは、選択された条件下で切断される結合を介して本発明のポリペプチドバリアントに結合される。例示的な条件としては、選択されたｐＨ（例えば、胃、腸、細胞内空胞）、活性酵素（例えば、エステラーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ）、光、熱の存在が挙げられるが、これらに限定されない。多くの切断可能な基が当該技術分野で既知である。例えば、Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７６１：１５２－１６２（１９８３）、Ｊｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１４５１８－１４５２５（１９９０）、Ｚａｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２４：９１３－９２０（１９８０）、Ｂｏｕｉｚａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５５：１４１－１４７（１９８６）、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１：２０５－２１０（１９８６）、Ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３：１８５９－１８６７（１９８９）を参照されたい。
ＩＶ．薬学的組成物
例えば、ＦＧＦ１バリアントを含む本発明の増殖因子バリアント、及びそれらのコンジュゲートは、広範な薬学的用途を有する。
したがって、別の態様では、本発明は、少なくとも１つの本発明のポリペプチドまたはポリペプチドコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、担体、ビヒクル、添加物、またはそれらの組み合わせとを含む、薬学的組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、様々な薬物送達系において使用するのに好適である。本発明で使用される好適な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１７ｔｈ ｅｄ．（１９８５）に見出される。薬物送達のための方法の簡単な概説については、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３（１９９０）を参照されたい。
薬学的組成物は、例えば、局所、経口、経鼻、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下、または筋肉内投与を含む任意の適切な投与様式用に製剤化され得る。皮下注射などの非経口投与の場合、担体は、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、または緩衝液を含む。経口投与の場合、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、及び炭酸マグネシウムなどの上記担体または固体担体のいずれかが用いられ得る。微粒子（例えば、ポリラクテートポリグリコレート）などの生分解性マトリックスも、本発明の薬学的組成物の担体として用いられ得る。好適な生分解性微粒子は、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号及び同第５，０７５，１０９号に開示されている。
一般に、薬学的組成物は、皮下または非経口的に、例えば静脈内に投与される。したがって、本発明は、許容される担体、好ましくは水性担体、例えば、水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ等に溶解または懸濁された化合物を含む、非経口投与のための組成物を提供する。組成物はまた、Ｔｗｅｅｎ ２０及びＴｗｅｅｎ ８０などの洗剤、マンニトール、ソルビトール、スクロース、及びトレハロースなどの安定剤、ならびにＥＤＴＡ及びメタ－クレゾールなどの防腐剤を含有し得る。組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、張度調整剤、湿潤剤、洗剤等の生理学的条件に近づけるために必要な薬学的に許容される補助物質を含有し得る。
これらの組成物は、従来の滅菌技法によって滅菌され得るか、または滅菌濾過され得る。結果として生じる水溶液は、そのまま使用するためにパッケージ化されるか、または凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的には、３～１１、より好ましくは５～９、最も好ましくは７～８である。
いくつかの実施形態では、本発明のグリコペプチドは、標準的な小胞形成脂質から形成されるリポソームに組み込まれ得る。例えば、Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、及び同第４，８３７，０２８号に記載される、様々な方法がリポソームを調製するのに利用可能である。様々な標的化剤（例えば、本発明のシアリルガラクトシド）を使用するリポソームの標的化は、当該技術分野で周知である（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号及び第４，６０３，０４４号を参照されたい）。
標的化剤をリポソームに結合するための標準的な方法を使用することができる。これらの方法は、一般に、標的化剤の結合のために活性化され得るホスファチジルエタノールアミンなどの脂質構成要素、または本発明の脂質誘導体化グリコペプチドなどの誘導体化親油性化合物のリポソームへの組み込みを伴う。
標的化機序は、一般に、標的化部分が標的、例えば細胞表面受容体との相互作用のために利用可能であるように、標的化剤がリポソームの表面上に配置されることを必要とする。本発明の炭水化物は、リポソームが形成される前に、当業者に既知の方法（例えば、それぞれ、長鎖ハロゲン化アルキルまたは脂肪酸による炭水化物上に存在するヒドロキシル基のアルキル化またはアシル化）を使用して脂質分子に結合され得る。
あるいは、リポソームは、膜を形成するときにコネクタ部分が膜に最初に組み込まれるような方法で作製され得る。コネクタ部分には、膜にしっかりと埋め込まれ、固定された親油性部分が必要である。また、リポソームの水性表面上で化学的に利用可能な反応性部分を有する必要がある。反応性部分は、後に付加される標的化剤または炭水化物と安定した化学結合を形成するのに化学的に好適であるように選択される。いくつかの実施形態では、標的薬剤を直接コネクタ分子に結合させることが可能であるが、ほとんどの場合、化学架橋として作用するための第３の分子を使用することがより好適であり、したがって、膜中にあるコネクタ分子を標的化剤または小胞表面から３次元的に伸長される炭水化物と連結する。
本発明の方法によって調製される、例えばＦＧＦ１バリアントを含む、増殖因子バリアントはまた、診断試薬として用いられてもよい。例えば、標識された化合物を使用して、炎症を有すると疑われる患者の炎症または腫瘍転移の領域を特定することができる。この使用のために、化合物は、125Ｉ、14Ｃ、またはトリチウムで標識され得る。
Ｖ．核酸
いくつかの実施形態では、本発明は、上述の実施形態のいずれかによる、例えば、ＦＧＦ１バリアントを含む、増殖因子バリアントをコードする単離された核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、この核酸に相補的な核酸を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された上述の実施形態のいずれかによるポリペプチドバリアントをコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。
ＶＩ．ライブラリ及びスクリーニングの方法
様々な実施形態では、複数の異なるメンバーを含む、例えば、ＦＧＦ１バリアントポリペプチドを含む、増殖因子バリアントポリペプチドのライブラリも提供され、ライブラリの各メンバーは、共通の親増殖因子ポリペプチドまたはＦＧＦ１親ポリペプチドに対応し、ライブラリの各メンバーは、アミノ酸が親ポリペプチドでは見られない位置にアミノ酸を含む。
ａ．ライブラリの作製
ＦＧＦ１または他の増殖因子のランダム化ライブラリを生成するために、様々なＦＧＦ１または他の増殖因子配列をコードするオリゴヌクレオチドを調製した。例えば、酵母中のＦＧＦ１バリアントポリペプチドを含む、増殖因子バリアントポリペプチドを発現するために使用されるＤＮＡを、合成により、または標準的な組換え技法によって調製した。アミノ酸が変化する場合、それぞれが異なるアミノ酸をコードする２０の異なるコドンが所与の位置に対して合成された。約５～約１５のアミノ酸がランダム化されるコーディングカセットを作製するために、ランダム化オリゴヌクレオチド合成が使用されている（例えば、Ｂｕｒｒｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３８：１ １３；、Ｌｏｗｍａｎ（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：４１０ ２４、Ｗｉｌｓｏｎ（１９９８）Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：３１３ ３２９を参照されたい）。
改善された変異体の進化に典型的に使用される酵母提示ベクターは、「ｐＣＴ」と呼ばれる。ベクターは、２００４年７月２９日に公開された「Ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ」と題するＷｉｔｔｒｕｐらのＵＳ２００４／０１４６９７６にさらに記載される。そこに記載されるように、ベクターは、目的のポリペプチドのＮ末端の、酵母Ａｇａ２ｐ細胞壁タンパク質のＣ末端への遺伝的融合を提供する。各酵母細胞の外壁は、約１０4～１０5のタンパク質凝集素を提示することができる。ベクターは、特定の制限部位を含有し、ガラクトース、Ｎ末端ＨＡ及びＣ末端ｃ－ｍｙｃエピトープタグ、ならびに第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位による転写調節を例示する。
本発明のいくつかの実施形態では、高親和性バインダーを操作するために一般的に使用される酵母提示プラットフォームは、より大きなタンパク質分解安定性を有するタンパク質を操作するためにも利用される（例えば、図１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、単一増殖因子バリアントの数千のコピーがテザー融合物として酵母の表面に提示される。いくつかの実施形態では、血球凝集素（ＨＡ）タグは、増殖因子の上流で発現される一方で、ｃ－ｍｙｃタグは、増殖因子の下流で発現される。いくつかの実施形態では、細胞は、対応する受容体の可溶性Ｆｃ融合物と共にインキュベートすることができ、これは酵母提示増殖因子に結合することができる。
いくつかの実施形態では、酵母提示プラットフォームは、より高いタンパク質分解安定性を有する増殖因子を操作するために、フロー活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）と組み合わされる（例えば、図２を参照されたい）。いくつかの実施形態では、増殖因子変異体のライブラリは、ランダム変異誘発、指向性変異誘発、もしくはＤＮＡシャッフル、または上に論じられるかまたは当該技術分野で既知である他の組換え技法によって生成することができる。いくつかの実施形態では、酵母細胞のライブラリは、目的のプロテアーゼと共にインキュベートされ、その間に、酵母表面提示タンパク質の切断が生じる。いくつかの実施形態では、より大きなタンパク質分解安定性を有する増殖因子変異体は、酵母細胞表面上の切断に対してより耐性がある。いくつかの実施形態では、プロテアーゼインキュベーションの後、細胞を洗浄し、保持された受容体結合親和性を有する適切に折り畳まれた増殖因子変異体に結合する機能性受容体の可溶性Ｆｃ融合物と共にインキュベートする。いくつかの実施形態では、ＦＡＣＳを使用して、拡張され、次回の選別のために誘導される、適切に折り畳まれた未切断の増殖因子変異体について選別する。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン、ｃ－ｍｙｃドメイン、及びＨＡタグに対する蛍光抗体マーカーを使用して、受容体結合、増殖因子特異的切断、及び非特異的切断を測定する（例えば、以下の表２を参照されたい）。いくつかの実施形態では、結合したＦｃ融合受容体の検出は、増殖因子における変異が受容体に対する結合親和性を著しく低下させないか、または不適切なタンパク質折り畳みをもたらさないことを確認することを可能にする。いくつかの実施形態では、増殖因子特異的切断は、増殖因子のタンパク質分解安定性の直接的尺度である。いくつかの実施形態では、切断された増殖因子はＣ末端ｃ－ｍｙｃタグを除去するため、増殖因子特異的切断は、ｃ－ｍｙｃシグナルによって検出される。いくつかの実施形態では、非特異的切断は、プロテアーゼが酵母表面提示タンパク質、例えば、酵母提示タンパク質Ａｇａ１ｐ及びＡｇａ２ｐ内で切断されるときに生じる。いくつかの実施形態では、非特異的切断中、３つすべてのマーカーの蛍光シグナルが減少する。いくつかの実施形態では、増殖因子切断及び結合活性を検出するためのダイナミックレンジが減少するため、これは望ましくない。いくつかの実施形態では、目的のプロテアーゼによる非特異的切断が最小限であることを確実にするために、ＨＡシグナルが使用される。
表５：蛍光抗体マーカーからの観察されたシグナルに対する異なる事象の影響。
Figure 2022513196000014
いくつかの実施形態では、野生型増殖因子及びそのバリアントは、ｐＣＴベクターにクローニングされ得る。いくつかの実施形態では、野生型増殖因子及びそのバリアントは、Ａｇａ２ｐ交配タンパク質への融合物としてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母細胞の表面上で発現することができる。いくつかの実施形態では、酵母細胞表面上での野生型増殖因子及びそのバリアントの良好な発現は、タンパク質のＣ末端上のｃ－ｍｙｃタグの検出によって確認することができる。いくつかの実施形態では、酵母提示野生型増殖因子及びそのバリアントの適切な折り畳みは、野生型増殖因子－Ｆｃへの特異的結合活性を測定することによって確認することができる。
いくつかの実施形態では、配列番号１のＦＧＦ１ポリペプチドが、タンパク質分解安定性スクリーニングのセットアップを示すためのモデルとして用いられた。いくつかの実施形態では、野生型ＦＧＦ１がｐＣＴベクターにクローニングされた。いくつかの実施形態では、このＦＧＦ１ポリペプチド及びそのＦＧＦ１バリアントは、Ａｇａ２ｐ交配タンパク質への融合物としてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母細胞の表面上で発現することができる（例えば、図３Ａを参照されたい）。いくつかの実施形態では、酵母細胞表面上でのＦＧＦ１の良好な発現は、タンパク質のＣ末端上のｃ－ｍｙｃタグの検出によって確認することができる（例えば、図３Ｂを参照されたい）。いくつかの実施形態では、酵母提示ＦＧＦの適切な折り畳みは、ＦＧＦＲ１－Ｆｃへの特異的結合活性を測定することによって確認することができる（例えば、図３Ｃを参照されたい）。
いくつかの実施形態では、血清、トリプシン、キモトリプシン、及びプラスミンは、例えば、ＦＧＦ１バリアントポリペプチドを含む、増殖因子バリアントポリペプチドのタンパク質分解安定性スクリーニングを開発するために使用され得る。いくつかの実施形態では、これらのプロテアーゼは、例えば、ＦＧＦ１バリアントポリペプチドを含む、増殖因子バリアントポリペプチドに対するそれらの科学的及び生物学的関連性に基づいて選択された。いくつかの実施形態では、スクリーニングに対するプロテアーゼの適合性は、酵母提示タンパク質の最小限の非特異的切断によって、合理的な速度で増殖因子を切断するその能力によって決定された。いくつかの実施形態では、血清は、例えば、ＦＧＦ１バリアントポリペプチドを含む、増殖因子バリアントポリペプチドのタンパク質分解安定性スクリーニングを開発するために使用され得る。いくつかの実施形態では、トリプシンは、例えば、ＦＧＦ１バリアントポリペプチドを含む、増殖因子バリアントポリペプチドのタンパク質分解安定性スクリーニングを開発するために使用され得る。いくつかの実施形態では、キモトリプシンは、例えば、ＦＧＦ１バリアントポリペプチドを含む、増殖因子バリアントポリペプチドのタンパク質分解安定性スクリーニングを開発するために使用され得る。いくつかの実施形態では、プラスミンは、例えば、ＦＧＦ１バリアントポリペプチドを含む、増殖因子バリアントポリペプチドのタンパク質分解安定性スクリーニングを開発するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、安定性は、野生型増殖因子のタンパク質分解切断を、バリアント増殖因子のタンパク質分解切断と比較することによって決定される。いくつかの実施形態では、安定性は、野生型ＦＧＦ１のタンパク質分解切断を、ＦＧＦ１バリアントのタンパク質分解切断と比較することによって決定される。
いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも５％～少なくとも９５％増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも１０％～少なくとも９０％増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも５％～少なくとも９０％増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも５％～少なくとも８５％増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも５％～少なくとも８０％増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも５％～少なくとも７５％増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも５％～少なくとも７０％増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも１０％～少なくとも７０％増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも５％増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも１０％増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも１５％増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも２０％増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも２５％増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも３０％増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも３５％増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも４０％増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも４５％増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも５０％増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも５％増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも６０％増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも６５％増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも７０％増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも７５％増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも８０％増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも８５％増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも９０％増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも９５％増加する。
いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも５％～少なくとも９５％増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも１０％～少なくとも９０％増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも５％～少なくとも９０％増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも５％～少なくとも８５％増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも５％～少なくとも８０％増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも５％～少なくとも７５％増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも５％～少なくとも７０％増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも１０％～少なくとも７０％増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも５％増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも１０％増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも１５％増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも２０％増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも２５％増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも３０％増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも３５％増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも４０％増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも４５％増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも５０％増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも５％増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも６０％増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも６５％増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも７０％増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも７５％増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも８０％増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも８５％増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも９０％増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも９５％増加する。
いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも１倍～少なくとも１０倍増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも１倍増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも２倍増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも３倍増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも４倍増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも５倍増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも６倍増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも７倍増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも８倍増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも９倍増加する。いくつかの実施形態では、増殖因子バリアントの安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも１０倍増加する。
いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも１倍～少なくとも１０倍増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも１倍増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも２倍増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも３倍増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも４倍増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも５倍増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも６倍増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも７倍増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも８倍増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも９倍増加する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントの安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも１０倍増加する。
ｂ．蛍光細胞選別
いくつかの実施形態では、スクリーニングは、細胞選別機の使用を含み得る。市販のフローサイトメーターは、毎秒約５０，０００の細胞の速度で、単一細胞レベルで４つ以上の波長で蛍光放射を測定することができる（Ａｓｈｃｒｏｆｔ ａｎｄ Ｌｏｐｅｚ，２０００）。典型的なフローサイトメトリーデータは、タンパク質発現レベル及び結合した可溶性リガンド（例えば、増殖因子受容体）を測定するために、酵母が２つの異なる色蛍光プローブで標識されていることを示し得る。細胞の「対角線」集団は、細胞ごとのタンパク質発現レベルの変化に起因する結果をもたらし、より多くのタンパク質を発現する細胞は、より多くのリガンドに結合する。平衡結合定数（ＫD）は、可溶性リガンドの滴定によって決定することができ、解離速度定数（ｋoff）は、非標識リガンドの競合結合によって測定することができる。酵母では、テザータンパク質の単分散が細胞表面上に存在し、可溶性リガンドが結合及び試験に使用され、その結果、固定化リガンドを使用する他の提示方法とは異なり、結合活性効果は観察されない。これまでに、酵母細胞表面上で発現されたほとんどのタンパク質の特性は、安定性及び結合親和性の観点から溶液に見られるものを模倣する（Ｂａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００、Ｆｅｌｄｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．，２００３、Ｈｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００、ＶａｎＡｎｔｗｅｒｐ ａｎｄ Ｗｉｔｔｒｕｐ，２０００）。Ｗｅａｖｅｒ－Ｆｅｌｄｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．，”Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅａｇｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｙｅａｓｔ ｄｉｓｐｌａｙ，” Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｓｅｐ．２６，２００５ １８（１１）：５２７－５３６も参照されたい。
細胞選別は、ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ （ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）マルチパラメータレーザーフローサイトメーター及び細胞選別機で行うことができる。上述のように様々なポリペプチドレベルの分析が検出されるように、選別の前に、蛍光染色を上述のように行った。
ＶＩＩ．方法
ａ．化学合成
本発明のポリペプチドバリアントは、従来の段階的溶液または固相合成を使用して調製することができる（例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，１９９７，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ Ｆｌｏｒｉｄａ，ａｎｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ｃｉｔｅｄ ｔｈｅｒｅｉｎ；Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ａｔｈｅｒｔｏｎ ＆Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｅｄｓ．，１９８９，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ、及びその中で引用される参考文献を参照されたい）。
あるいは、本発明のペプチドは、例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３７（７）９３３ ９３６、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：１８８１－１８８７、Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４５：２０９－２１６、Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ ａｎｄ Ｋｅｎｔ，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：２２１－２２５、Ｌｉｕ ａｎｄ Ｔａｍ，１９９４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６（１０）：４１４９－４１５３、Ｌｉｕ ａｎｄ Ｔａｍ，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：６５８４－６５８８、Ｙａｍａｓｈｉｒｏ ａｎｄ Ｌｉ，１９８８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３１：３２２－３３４に記載されるセグメント縮合により調製され得る。セグメント縮合は、内部グリシン残基を含有する実施形態を合成するための特に有用な方法である。本発明のペプチドの合成に有用な他の方法は、Ｎａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０７：７０８７－７０９２に記載されている。
Ｎ及び／またはＣ末端遮断基を含有するポリペプチドバリアントは、有機化学の標準的な技法を使用して調製することができる。例えば、ペプチドのＮ末端をアシル化する、またはペプチドのＣ末端をアミド化もしくはエステル化するための方法は、当該技術分野で周知である。当業者には、Ｎ及び／またはＣ末端に他の修飾を担持するモード、ならびに末端遮断基を結合するために必要であり得る任意の側鎖官能基を保護するモードは明らかであろう。薬学的に許容される塩（対イオン）は、当該技術分野で周知であるように、イオン交換クロマトグラフィーまたは他の方法によって便宜的に調製することができる。
タンデム型多量体の形態である本発明の化合物は、合成の適切なステップでリンカー（複数可）をペプチド鎖に付加することによって、便宜的に合成することができる。あるいは、ヘリックスセグメントを合成し、各セグメントをリンカーと反応させることができる。当然ながら、実際の合成方法はリンカーの組成に依存する。適切な保護スキーム及び化学は周知であり、当業者には明らかであろう。
分岐ネットワークの形態である本発明の化合物は、Ｔａｍ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５４０９－５４１３及びＤｅｍｏｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３９：７４－８４に記載の三量体及び四量体樹脂ならびに化学を使用して便宜的に合成することができる。高次または低次の分岐ネットワークを合成するための、または異なるコアペプチドヘリックスセグメントの組み合わせを含有する合成樹脂の修飾及び戦略は、ペプチド化学及び／または有機化学の当業者の能力の範囲内である。必要に応じて、ジスルフィド結合の形成は、一般に、弱い酸化剤の存在下で行われる。
化学酸化剤が使用され得るか、または化合物を単に大気酸素に曝露してこれらの結合をもたらしてもよい。例えば、Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ９５５－９５７、Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ、Ａｈｍｅｄ ｅｔ ａｌ．，１９７５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０：８４７７－８４８２、及びＰｅｎｎｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １９９０ １６４－１６６，Ｇｉｒａｌｔ ａｎｄ Ａｎｄｒｅｕ，Ｅｄｓ．，ＥＳＣＯＭ Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓによって記載されるものを含む様々な方法が当該技術分野で既知である。さらなる代替案が、Ｋａｍｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ６３：８９９－９１５によって記載される。固体支持体上で行われる方法は、Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ，１９８５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．２６：９２－９７によって記載される。これらの方法のいずれかを使用して、本発明のペプチドにおいてジスルフィド結合を形成することができる。
ＶＩＩＩ．ポリペプチドコード配列の取得
ａ．一般組換え技術
本発明のＯ結合グリコシル化配列を組み込むバリアント及び／または変異ポリペプチドの作製は、変異またはポリペプチドの完全な化学合成のいずれかによって、対応する親ポリペプチドのアミノ酸配列を変更することにより達成することができる。ポリペプチドアミノ酸配列は、好ましくは、ＤＮＡレベルでの変化を介して、特に、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を予め選択された塩基で変異させて、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成することによって変更される。ＤＮＡ変異（複数可）は、好ましくは、当該技術分野で既知の方法を使用して作製される。
本発明は、組換え遺伝学の分野における日常的な技法に依存する。本発明の一般的な使用方法を開示する基本的なテキストとしては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄ．２００１）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）が挙げられる。
核酸サイズは、キロベース（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）のいずれかで与えられる。これらは、アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動、配列決定された核酸、または公開されているＤＮＡ配列に由来する推定値である。タンパク質の場合、サイズはキロダルトン（ｋＤａ）またはアミノ酸残基番号で与えられる。タンパク質サイズは、ゲル電気泳動から、配列決定されたタンパク質から、導かれたアミノ酸配列から、または公開されているタンパク質配列から推定される。
市販されていないオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：６１５９－６１６８（１９８４）に記載されるように、自動合成機を使用して、最初に Ｂｅａｕｃａｇｅ ＆Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１８５９－１８６２（１９８１）によって記載された固相ホスホラミダイトトリエステル方法により化学合成され得る。全遺伝子を化学合成することもできる。オリゴヌクレオチドの精製は、当技術分野で認識されている任意の戦略、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆Ｒｅａｎｉｅｒ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．２５５：１３７－１４９（１９８３）に記載されるように、天然アクリルアミドゲル電気泳動または陰イオン交換ＨＰＬＣを使用して行われる。
クローニングした野生型ポリペプチド遺伝子、変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び合成オリゴヌクレオチドの配列は、例えば、Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ，１６：２１－２６（１９８１）の二本鎖テンプレートを配列決定するための連鎖停止方法を使用して、クローニング後に検証され得る。
例示的な実施形態では、ポリヌクレオチドをシャッフルすることによってグリコシル化配列が付加される。候補ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡシャッフルプロトコルを用いて調節することができる。ＤＮＡシャッフルは、関連する遺伝子のプールのランダム断片化、続いてポリメラーゼ連鎖反応様プロセスによる断片の再組み立てによって行われる再帰的組換え及び変異のプロセスである。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１０７４７－１０７５１（１９９４）、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９－３９１（１９９４）、ならびに米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８３７，４５８号、同第５，８３０，７２１号、及び同第５，８１１，２３８号を参照されたい。
ｂ．野生型ペプチドコード配列のクローニング及びサブクローニング
例えば、ヒト成長ホルモン、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ０００５１５、ＮＭ００２０５９、ＮＭ０２２５５６、ＮＭ０２２５５７、ＮＭ０２２５５８、ＮＭ０２２５５９、ＮＭ０２２５６０、ＮＭ０２２５６１、及びＮＭ０２２５６２などの野生型ポリペプチドをコードする多くのポリヌクレオチド配列が決定されており、商業サプライヤーから入手可能である。
ヒトゲノムの研究の急速な進歩により、ヒトＤＮＡ配列データベースが、既知のヌクレオチド配列と一定の割合の配列相同性を有する任意の遺伝子セグメント、例えば、以前に特定されたポリペプチドをコードするものを検索することができるクローニングアプローチが可能になった。そのように特定された任意のＤＮＡ配列は、その後、化学合成及び／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法、例えば、オーバーラップ伸長法によって得ることができる。短い配列については、完全に新規の合成で十分であり得るが、より大きな遺伝子を得るためには、合成プローブを使用したヒトｃＤＮＡまたはゲノムライブラリからの全長コード配列のさらなる単離が必要であり得る。
あるいは、ポリペプチドをコードする核酸配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの標準的なクローニング技法を使用してヒトｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリから単離され得、相同性に基づくプライマーは、多くの場合、ポリペプチドをコードする既知の核酸配列に由来し得る。この目的のために最も一般的に使用される技法は、標準的なテキスト、例えば、上記の Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌに記載されている。
野生型ポリペプチドのコード配列を得るのに好適なｃＤＮＡライブラリは、市販されているか、または構築されてもよい。ｍＲＮＡを単離し、逆転写によりｃＤＮＡを作製し、ｃＤＮＡを組換えベクターにライゲーションし、増殖、スクリーニング、及びクローニングのために組換え宿主にトランスフェクトする一般的な方法は周知である（例えば、Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｇｅｎｅ，２５：２６３－２６９（１９８３）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，上記を参照されたい）。ＰＣＲによってヌクレオチド配列の増幅セグメントを得たら、セグメントをプローブとしてさらに使用して、ｃＤＮＡライブラリから野生型ポリペプチドをコードする全長ポリヌクレオチド配列を単離することができる。適切な手順の一般的な説明は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、上記に見出すことができる。
同様の手順に従って、ヒトゲノムライブラリから、野生型ポリペプチド、例えば、上述のＧｅｎＢａｎｋ受託番号のうちのいずれか１つをコードする全長配列を得ることができる。ヒトゲノムライブラリは、市販されているか、または様々な技術分野で認識された方法により構築することができる。一般に、ゲノムライブラリを構築するために、ＤＮＡは、最初に、ポリペプチドが見出される可能性が高い組織から抽出される。次いで、ＤＮＡを機械的に剪断するか、または酵素的に消化して、約１２～２０ｋｂの長さの断片を得る。その後、断片を望ましくないサイズのポリヌクレオチド断片から勾配遠心分離することにより分離し、バクテリオファージλベクターに挿入する。これらのベクター及びファージは、インビトロでパッケージ化される。組換えファージを、Ｂｅｎｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９６：１８０－１８２（１９７７）に記載されるように、プラークハイブリダイゼーションによって分析する。コロニーハイブリダイゼーションは、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２：３９６１－３９６５（１９７５）によって記載されるように行われる。
配列相同性に基づいて、変性オリゴヌクレオチドをプライマーセットとして設計することができ、ＰＣＲを好適な条件下で行って（例えば、Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３、Ｇｒｉｆｆｉｎ ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．１９９４を参照されたい）、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリからのヌクレオチド配列のセグメントを増幅することができる。増幅セグメントをプローブとして使用して、野生型ポリペプチドをコードする全長核酸を得る。
野生型ポリペプチドをコードする核酸配列を取得したら、結果として生じる構築物から組換え野生型ポリペプチドを産生することができるように、コード配列をベクター、例えば発現ベクターにサブクローニングすることができる。野生型ポリペプチドコード配列のさらなる修飾、例えば、ヌクレオチド置換は、その後、分子の特徴を変更するために行われ得る。
ｃ．ポリペプチド配列への変異の導入
コードポリヌクレオチド配列から、野生型ポリペプチドのアミノ酸配列を決定することができる。その後、このアミノ酸配列は、アミノ酸配列内の様々な位置に追加のグリコシル化配列（複数可）を導入することによって、タンパク質のグリコシル化パターンを変更するように修飾され得る。
様々な変異生成プロトコルが当該技術分野で確立されており、記載されている。例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：４５０４ －４５０９（１９９７）、及びＳｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３７０：３８９－３９１（１９９４）を参照されたい。手順は、一組の核酸のバリアント、したがって、コードされたポリペプチドのバリアントを産生するために、別個にまたは組み合わせて使用することができる。変異誘発、ライブラリ構築、及び他の多様性生成方法のためのキットが市販されている。
多様性を生成する変異方法としては、例えば、部位特異的変異誘発（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｓｈｏｒｔｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１１９３－１２０１（１９８５））、ウラシル含有テンプレートを使用した変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８ －４９２（１９８５））、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発（Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１０：６４８７－６５００（１９８２））、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ変異誘発（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：８７４９－８７６４及び８７６５－８７８７（１９８５））、ならびにギャップ二本鎖ＤＮＡを使用した変異誘発（Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：９４４１－９４５６（１９８４））が挙げられる。
変異を生成するための他の方法としては、点ミスマッチ修復（Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３８：８７９－８８７（１９８４））、修復欠損宿主株を使用した変異誘発（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：４４３１－４４４３（１９８５））、欠失変異誘発（Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４：５１１５（１９８６））、制限選択及び制限精製（Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ，３１７：４１５－４２３（１９８６））、全遺伝子合成による変異誘発（Ｎａｍｂｉａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２３： １２９９－１３０１（１９８４））、二本鎖切断修復（Ｍａｎｄｅｃｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：７１７７－７１８１（１９８６））、ポリヌクレオチド連鎖停止法による変異誘発（米国特許第５，９６５，４０８号）、及びエラープローンＰＣＲ（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１：１１－１５（１９８９））が挙げられる。
ｄ．宿主生物における好ましいコドン使用のための核酸の修飾
ポリペプチドバリアントをコードするポリヌクレオチド配列は、特定の宿主の好ましいコドン使用と一致するようにさらに変更することができる。例えば、１つの細菌細胞株の好ましいコドン使用は、本発明のポリペプチドバリアントをコードし、この株によって好まれるコドンを含むポリヌクレオチドを導くために使用され得る。宿主細胞によって示される好ましいコドン使用頻度は、宿主細胞によって発現される多数の遺伝子における好ましいコドン使用頻度を平均化することによって計算することができる（例えば、計算サービスは、Ｋａｚｕｓａ ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｊａｐａｎのウェブサイトから入手可能である）。この分析は、好ましくは、宿主細胞によって高度に発現される遺伝子に限定される。例えば、米国特許第５，８２４，８６４号は、双子葉類植物及び単子葉植物によって示される高度に発現された遺伝子によるコドン使用頻度を提供する。
修飾の完了時に、ポリペプチドバリアントコード配列を配列決定によって検証し、次いで、野生型ポリペプチドと同じ様式で組換え産生のための適切な発現ベクターにサブクローニングする。
ＩＸ．変異ポリペプチドの発現
配列検証に続いて、本発明のポリペプチドバリアントは、本明細書に開示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に依存する、組換え遺伝学の分野で日常的な技法を使用して産生され得る。
ａ．発現系
本発明の変異ポリペプチドをコードする核酸の高レベル発現を得るために、典型的には、変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、翻訳を指向する強力なプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、及び翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含有する発現ベクターにサブクローニングする。好適な細菌プロモーターは当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、上記及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、上記に記載されている。野生型または変異ポリペプチドを発現するための細菌発現系は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、及びＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒにおいて利用可能である。そのような発現系のためのキットは、市販されている。哺乳類細胞、酵母、及び昆虫細胞のための真核生物発現系は、当該技術分野で周知であり、また市販されている。一実施形態では、真核生物発現ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ関連ベクター、またはレトロウイルスベクターである。
異種核酸の発現を指向するために使用されるプロモーターは、特定の用途に依存する。プロモーターは、任意選択で、その自然な設定における転写開始部位からと同じように、異種転写開始部位からほぼ同じ距離に配置される。しかしながら、当該技術分野で既知のように、この距離のある程度の変化は、プロモーター機能を失うことなく適合させることができる。
プロモーターに加えて、発現ベクターは、典型的には、宿主細胞における変異ポリペプチドの発現に必要なすべての追加要素を含有する転写単位または発現カセットを含む。したがって、典型的な発現カセットは、変異ポリペプチド、ならびに転写産物、リボソーム結合部位、及び翻訳終結の効率的なポリアデニル化に必要なシグナルをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含有する。ポリペプチドをコードする核酸配列は、典型的には、形質転換された細胞によるポリペプチドの分泌を促進するために切断可能なシグナルペプチド配列に連結される。そのようなシグナルペプチドには、とりわけ、組織プラスミノーゲン活性化因子、インスリン、及びニューロン増殖因子からのシグナルペプチド、ならびにＨｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓの若年性ホルモンエステラーゼが含まれる。カセットのさらなる要素は、エンハンサー、ならびにゲノムＤＮＡが構造遺伝子として使用される場合、機能的スプライスドナー及びアクセプター部位を有するイントロンを含み得る。
プロモーター配列に加えて、発現カセットは、効率的な終結を提供するために、構造遺伝子の下流に転写終結領域も含有するべきである。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得ることができるか、または異なる遺伝子から得ることができる。
遺伝子情報を細胞に輸送するために使用される特定の発現ベクターは、特に重要ではない。真核細胞または原核細胞において発現に使用される従来のベクターのいずれかを使用することができる。標準的な細菌発現ベクターとしては、ｐＢＲ３２２系プラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ、ならびにＧＳＴ及びＬａｃＺなどの融合発現系などのプラスミドが挙げられる。また、エピトープタグを組換えタンパク質に付加して、便宜的な単離方法、例えば、ｃ－ｍｙｃを提供することもできる。
真核生物ウイルスからの調節エレメントを含有する発現ベクターは、典型的には、真核生物発現ベクター、例えば、ＳＶ４０ベクター、乳頭腫ウイルスベクター、及びエプスタイン・バーウイルス由来のベクターにおいて使用される。他の例示的な真核生物ベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ+、ｐＭＴＯ１０／Ａ+、ｐＭＡＭｎｅｏ－５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、及びＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞における発現に有効であることが示される他のプロモーターの指向下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる。
いくつかの例示的な実施形態では、発現ベクターは、参照により本明細書に組み込まれる、２００４年４月９日に出願された共同所有の米国特許出願に開示されるｐＣＷｉｎ１、ｐＣＷｉｎ２、ｐＣＷｉｎ２／ＭＢＰ、ｐＣＷｉｎ２－ＭＢＰ－ＳＢＤ（ｐＭＳ39）、及びｐＣＷｉｎ２－ＭＢＰ－ＭＣＳ－ＳＢＤ（ｐＭＸＳ39）から選択される。
いくつかの発現系は、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、及びジヒドロ葉酸還元酵素などの遺伝子増幅を提供するマーカーを有する。あるいは、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指向下で変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する、昆虫細胞におけるバキュロウイルスベクターなどの遺伝子増幅を伴わない高収率発現系も好適である。
発現ベクターに典型的に含まれる要素は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて機能するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、及び真核生物配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域における独特の制限部位も含む。選択される特定の抗生物質耐性遺伝子は重要ではなく、当該技術分野で知られている多くの耐性遺伝子のいずれも好適である。
原核生物配列は、必要に応じて、真核細胞内のＤＮＡの複製に干渉しないように、任意選択で選択される。
組換えタンパク質（例えば、本発明のｈｇｈ変異体）のペリプラズマ発現が所望される場合、発現ベクターは、発現されるタンパク質のコード配列の５’に直接接続される、Ｅ．ｃｏｌｉ ＯｐｐＡ（ペリプラズマオリゴペプチド結合タンパク質）分泌シグナルまたはその修飾型などの分泌シグナルをコードする配列をさらに含む。このシグナル配列は、細胞質において産生される組換えタンパク質を細胞膜を介して細胞質周辺腔に指向する。発現ベクターは、組換えタンパク質が細胞質周辺腔に入っているときにシグナル配列を酵素的に切断することができる、シグナルペプチダーゼ１のコード配列をさらに含んでもよい。組換えタンパク質のペリプラズム産生のためのより詳細な説明は、例えば、Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３９：２４７－２５４（１９８５）、米国特許第６，１６０，０８９号及び同第６，４３６，６７４号に見出すことができる。
上に論じられるように、当業者は、ポリペプチドの生物学的活性を依然として保持しながら、任意の野生型もしくは変異ポリペプチドまたはそのコード配列に対して様々な保存的置換が行われ得ることを認識するであろう。さらに、ポリヌクレオチドコード配列の修飾は、結果として生じるアミノ酸配列を変更することなく、特定の発現宿主における好ましいコドン使用に適合するようにも行われ得る。
ｂ．トランスフェクション方法
標準的なトランスフェクション方法を使用して、大量の変異ポリペプチドを発現する細菌、哺乳類、酵母、または昆虫細胞株を産生し、次いで標準的な技法を使用して精製する（例えば、Ｃｏｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７６１９－１７６２２（１９８９）、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８２（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，ｅｄ．，１９９０）を参照されたい）。真核細胞及び原核細胞の形質転換は、標準的な技法により行われる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１３２：３４９－３５１（１９７７）、Ｃｌａｒｋ－Ｃｕｒｔｉｓｓ ＆Ｃｕｒｔｉｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：３４７－３６２（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，１９８３）を参照されたい）。
宿主細胞に外来ヌクレオチド配列を導入するための周知の手順のいずれかを使用することができる。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、細胞質ベクター、ウイルスベクター、ならびにクローニングしたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、または他の外来の遺伝子材料を宿主細胞に導入するための他の周知の方法のいずれかの使用が含まれる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、上記を参照されたい）。使用される特定の遺伝子操作手順が、変異ポリペプチドを発現することができる宿主細胞に少なくとも１つの遺伝子を良好に導入することができることのみが必要である。
ｃ．宿主細胞における変異ポリペプチドの発現の検出
発現ベクターを適切な宿主細胞に導入した後、トランスフェクトされた細胞を、変異ポリペプチドの発現を好む条件下で培養する。次いで、細胞を組換えポリペプチドの発現についてスクリーニングし、その後、標準的な技法を使用して培養物から回収する（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（１９８２）、米国特許第４，６７３，６４１号、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、上記、及びＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、上記を参照されたい）。
遺伝子発現をスクリーニングするためのいくつかの一般的な方法は、当業者の間で周知である。最初に、遺伝子発現は、核酸レベルで検出され得る。核酸ハイブリダイゼーション技法を使用した、様々な特異的ＤＮＡ及びＲＮＡの測定方法が一般的に使用される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、上記）。いくつかの方法は、電気泳動分離（例えば、ＤＮＡを検出するためのサザンブロット及びＲＮＡを検出するためのノーザンブロット）を伴うが、ＤＮＡまたはＲＮＡの検出は、電気泳動なしでも（例えば、ドットブロットなどによって）行うことができる。トランスフェクトされた細胞における変異ポリペプチドをコードする核酸の存在は、配列特異的プライマーを使用して、ＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲによって検出することもできる。
第２に、遺伝子発現は、ポリペプチドレベルで検出され得る。様々な免疫学的アッセイが、特に、本発明の変異ポリペプチドと特異的に反応するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用して、遺伝子産物のレベルを測定するために当業者によって日常的に使用される（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８８、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５－４９７（１９７５））。そのような技法は、変異ポリペプチドまたはその抗原部分に対して高い特異性を有する抗体を選択することによる抗体調製を必要とする。ポリクローナル及びモノクローナル抗体を産生する方法は十分に確立されており、それらの説明は、文献に見出すことができる。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、上記、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１－５１９（１９７６）を参照されたい。本発明の変異ポリペプチドに対する抗体の調製、及び変異ポリペプチドを検出する免疫学的アッセイの実施のより詳細な説明は、後のセクションに提供される。
Ｘ．組換え産生された変異ポリペプチドの精製
トランスフェクトされた宿主細胞における組換え変異ポリペプチドの発現が確認されたら、次いで、宿主細胞は、組換えポリペプチドを精製する目的のために適切なスケールで培養される。
ａ．細菌からの精製
本発明の変異ポリペプチドが、形質転換された細菌によって大量に、典型的にはプロモーター誘導後に組換えにより産生される場合、発現は構成的であり得るが、タンパク質は、不溶性凝集体を形成し得る。タンパク質包含体の精製に好適ないくつかのプロトコルが存在する。例えば、凝集タンパク質（以下、包含体と称される）の精製は、典型的には、細菌細胞の破壊による、例えば、約１００～１５０μｇ／ｍｌのリゾチーム及び０．１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、非イオン性洗剤の緩衝液中でのインキュベーションによる、包含体の抽出、分離、及び／または精製を伴う。細胞懸濁液は、ポリトロン粉砕機（Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）を使用して粉砕することができる。あるいは、細胞を氷上で超音波処理することができる。細菌の溶解の代替方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら及びＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（いずれも
上記）に記載されており、当業者には明らかであろう。
細菌包含体から組換えポリペプチドを精製するさらなる説明については、例えば、Ｐａｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ １８：１８２－１９０（２０００）を参照されたい。
上清中に存在する組換えタンパク質は、当業者に周知の標準的な分離技法によって宿主タンパク質から分離され得る。
ｂ．変異ポリペプチド発現の検出のためのイムノアッセイ
組換え変異ポリペプチドの産生を確認するために、免疫学的アッセイは、試料中でポリペプチドの発現を検出するのに有用であり得る。免疫学的アッセイはまた、組換えホルモンの発現レベルを定量化するために有用である。変異ポリペプチドに対する抗体は、これらの免疫学的アッセイを行うために必要である。
ｃ．変異ポリペプチドに対する抗体の産生
目的の免疫原と特異的に反応するポリクローナル及びモノクローナル抗体の産生方法は、当業者に既知である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ，１９９１，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９，Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （４ｔｈ ｅｄ．） Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，ＣＡ、及びその中で引用されている参考文献、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ （２ｄ ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８６、ならびにＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７，１９７５を参照されたい）。そのような技法には、ファージまたは同様のベクターにおける組換え抗体のライブラリからの抗体の選択による抗体調製が含まれる（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－１２８１，１９８９及びＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６，１９８９を参照されたい）。
所望の特異性を有する抗血清含有抗体を産生するために、目的のポリペプチド（例えば、本発明の変異ポリペプチド）またはその抗原断片を使用して、好適な動物、例えば、マウス、ウサギ、または霊長類を免疫化することができる。フロイントのアジュバントなどの標準的なアジュバントは、標準的な免疫プロトコルに従って使用することができる。あるいは、その特定のポリペプチドに由来する合成抗原ペプチドを担体タンパク質にコンジュゲートさせ、その後免疫原として使用することができる。
免疫原調製物に対する動物の免疫応答は、試験出血を採取し、目的の抗原に対する反応性の力価を決定することによって監視される。抗原に対する抗体の適切に高い力価が得られる場合、動物から血液を収集し、抗血清を調製する。抗原に特異的に反応する抗体を濃縮するための抗血清のさらなる分画及び抗体の精製は、その後行われる。上記のＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、ならびに上に提供されるタンパク質精製の一般的な説明を参照されたい。
当業者に知られている様々な技法を使用して、モノクローナル抗体が得られる。典型的には、所望の抗原で免疫化された動物からの脾臓細胞は、通常、骨髄腫細胞との融合によって不死化される（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１－５１９，１９７６を参照されたい）。代替的な不死化方法としては、例えば、エプスタイン・バーウイルス、がん遺伝子、もしくはレトロウイルス、または当該技術分野で周知の他の方法を用いた形質転換が挙げられる。単一の不死化細胞から生じるコロニーは、抗原に対する所望の特異性及び親和性の抗体の産生についてスクリーニングされ、そのような細胞によって産生されるモノクローナル抗体の収率は、脊椎動物宿主の腹腔への注射を含む様々な技法によって増強され得る。
加えて、モノクローナル抗体はまた、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．、上記によって概説される一般的なプロトコルに従ってヒトＢ細胞ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによって、所望の特異性を有する抗体またはそのような抗体の結合断片をコードする核酸配列の特定時に組換えにより産生されてもよい。上に論じられる組換えポリペプチド産生の一般的な原理及び方法は、組換え方法による抗体産生に適用可能である。
所望される場合、本発明の変異ポリペプチドを特異的に認識することができる抗体を、野生型ポリペプチドに対するそれらの交差反応性について試験することができ、したがって、野生型タンパク質に対する抗体と区別することができる。例えば、変異ポリペプチドで免疫化された動物から得られた抗血清を、野生型ポリペプチドが固定化されたカラムに通すことができる。カラムを通過する抗血清の部分は、野生型ポリペプチドではなく変異ポリペプチドのみを認識する。同様に、変異ポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、野生型ポリペプチドではなく、変異体のみを認識する際のそれらの排他性についてスクリーニングすることもできる。
本発明の変異ポリペプチドのみを特異的に認識するが野生型ポリペプチドを認識しないポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、例えば、固体支持体上に固定化された変異ペプチド特異的ポリクローナルまたはモノクローナル抗体と共に試料をインキュベートすることによって、野生型タンパク質から変異タンパク質を単離するのに有用である。
ＸＩ．治療及び診断方法
様々な実施形態では、本発明は、ＦＧＦ１バリアントポリペプチド及びＨＧＦバリアントポリペプチドの併用療法を施すことによって、Ｍｅｔ及び／またはＦＧＦＲを阻害することによって治療することができる、疾患状態を予防する、回復させる、または治療する方法を提供する。これらの実施形態では、本発明は、疾患状態の予防、回復、または治療を必要とする対象において、それを予防する、回復させる、または治療するのに十分な量の本発明のＦＧＦ１バリアントポリペプチド及びＨＧＦバリアントポリペプチドを投与することを含む方法を提供する。例示的な疾患状態は、がんである。開示されるアゴニストバリアントは、細胞増殖の促進、特に血管新生、ならびに心血管、肝臓、筋骨格、及び神経細胞疾患の治療に有用であり得る。
いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントポリペプチドとＨＧＦバリアントポリペプチドとの併用療法は、（１）遷延性角膜上皮欠損（ＰＣＥＤ）、及び（２）角膜血管新生の治療、予防、及び／または阻害のために使用される。いくつかの実施形態では、ＰＣＥＤは、眼の非治癒性潰瘍で、足の非治癒性（例えば、糖尿病性）潰瘍に等しい。いくつかの実施形態では、ＰＣＥＤは、上皮治癒及び欠損閉鎖のプロセスが遅延し、潰瘍、感染、瘢痕、穿孔、及び視力低下をもたらし得る角膜上皮欠損をもたらす場合に生じる。いくつかの実施形態では、ＰＣＥＤは、損傷、以前の眼の手術、感染（例えば、以前のヘルペス感染または重度の細菌性潰瘍）、または眼の疾患（重度のドライアイ疾患、糖尿病、眼瞼病理に起因する慢性露出、及び造血幹細胞移植後の眼移植片対宿主病などの基礎状態を含む）から生じ得る。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ１バリアントポリペプチドとＨＧＦバリアントポリペプチドとの併用療法は、損傷、以前の眼の手術、感染（例えば、以前のヘルペス感染または重度の細菌性潰瘍）、または眼の疾患（重度のドライアイ疾患、糖尿病、眼瞼病理に起因する慢性露出、及び造血幹細胞移植後の眼移植片対宿主病などの基礎状態を含む）の治療、予防、及び／または阻害のために使用される。
例えば、成人において、ＨＧＦ－Ｍｅｔ経路は、傷害後の筋肉再生に関与する。したがって、開示されるバリアントは、例えば、梗塞後の心臓組織再生を含む、筋肉損傷の修復に利用され得る。
開示されるバリアントを使用して、例えば、ウイルス感染（肝炎ウイルス、例えば、ＨＡＶ、ＨＢＶ、またはＨＣＶによる感染によるものなど）、または他の急性ウイルス性肝炎、自己免疫性慢性肝炎、妊娠の急性脂肪肝、バッド・キアリ症候群、及び静脈閉塞症、高熱、低酸素、悪性浸潤、ライ症候群、敗血症、ウィルソン病、ならびに移植拒絶を含む状態によって引き起こされる肝不全または疾患を治療または予防することができる。
開示されるバリアントを使用して、キノコ中毒（例えば、Ａｍａｎｉｔａ ｐｈａｌｌｏｉｄｅｓ）、ヒ素、四塩化炭素（または他の塩化炭化水素）、銅、エタノール、鉄、メトトレキサート、及びリンから選択される毒素を含む、毒素によって誘導される急性肝不全または疾患を治療または予防することができる。本発明のポリペプチドの特定の使用は、Ｎ－アセチル－ｐ－アミノフェノール（商業的にパラセタモールまたはアセトアミノフェンとして知られる）による中毒によって引き起こされる肝損傷の治療または予防にある。
さらに、開示されるバリアントは、腎不全後の治療において有用であり得、腎臓の維持及び再生を支持する。
本発明のポリペプチドバリアントは、ＨＧＦの活性を中和するため、様々な治療用途に使用され得る。例えば、本発明のある特定のポリペプチドバリアントは、過剰増殖性疾患または障害、例えば、様々な形態のがんの予防または治療において有用である。
例示的な実施形態では、本発明は、がんの治療を必要とする対象において、それを治療する方法を提供する。本方法は、治療有効量の本発明のポリペプチドバリアントを対象に投与することを含む。
本発明のポリペプチドバリアントを使用して、例えば、様々な眼障害、肺癌、乳癌、結腸癌、前立腺癌、卵巣癌、頭頸部癌、卵巣癌、多発性骨髄腫、肝臓癌、胃癌、食道癌、腎臓癌、鼻咽頭癌、膵臓癌、中皮腫、黒色腫、及び神経膠芽腫におけるＦＧＦ応答性腫瘍細胞を含む、様々なＦＧＦ応答性障害を治療することができることが企図される。
例示的な実施形態では、がんは、癌腫、例えば、結腸直腸、扁平上皮細胞、肝細胞、腎臓、乳房、または肺である。
ポリペプチドバリアントを使用して、腫瘍細胞の増殖を阻害または低減することができる。このようなアプローチでは、腫瘍細胞の増殖を阻害または減少させるために、腫瘍細胞は、治療有効量のポリペプチドバリアントに曝露される。ある特定の実施形態では、ポリペプチドバリアントは、腫瘍細胞の増殖を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％阻害する。
ある特定の実施形態では、ポリペプチドバリアントは、腫瘍細胞の増殖を阻害または低減するために使用され、バリアントは、ＦＧＦ１がＦＧＦＲに結合する能力を低下させる。ある特定の実施形態では、ＦＧＦ１ポリペプチドバリアントは、創傷治癒を阻害または促進するために使用される。
加えて、ポリペプチドバリアントは、哺乳動物における腫瘍増殖または発達を阻害するか、または緩徐させるために使用され得る。そのような方法では、有効量のポリペプチドバリアントは、哺乳動物における腫瘍増殖を阻害するか、または緩徐させるために哺乳動物に投与される。したがって、ポリペプチドバリアントを使用して、例えば、哺乳動物における腫瘍を治療することができる。本方法は、治療有効量のポリペプチドバリアントを哺乳動物に投与することを含む。ポリペプチドバリアントは、腫瘍を治療するために、単独で、または別の薬学的に活性な分子と組み合わせて投与することができる。
一般に、治療有効量のポリペプチドバリアントは、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、任意選択で約１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、任意選択で約１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。投与量は、治療される疾患または適応症の種類及び程度、特定の患者の全体的な健康状態、送達されるポリペプチドバリアントの相対的な生物学的有効性、ポリペプチドバリアントの製剤化、製剤中の賦形剤の存在及び種類、ならびに投与経路などの変数に依存する。投与される初期投薬量は、所望の血液レベルまたは組織レベルを迅速に達成するために、上位レベルを超えて増加され得るか、または初期投薬量は、最適投薬量よりも小さくてもよく、１日の投薬量は、特定の状況に応じて、治療過程中に漸進的に増加されてもよい。ヒト投薬量は、例えば、０．５ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇを実行するように設計された従来の第Ｉ相用量漸増試験で最適化され得る。投与頻度は、投与経路、投薬量、及び治療される疾患状態などの要因に応じて変動し得る。例示的な投薬頻度は、１日１回、週に１回、及び２週間に１回である。好ましい投与経路は、非経口、例えば、静脈内注入である。タンパク質に基づく薬物の製剤化は、当業者の範囲内である。本発明のいくつかの実施形態では、ポリペプチドバリアント、例えば、タンパク質に基づくバリアントは、凍結乾燥され、投与時に緩衝生理食塩水中で再構成される。
ポリペプチドバリアントは、単独で、または他の薬学的に活性な成分と組み合わせたいずれかで投与することができる。他の活性成分、例えば、免疫調節剤は、ポリペプチドバリアントと一緒に投与され得るか、またはポリペプチドバリアントの前または後に投与され得る。
治療的使用のためのポリペプチドバリアントを含有する製剤は、典型的には、薬学的に許容される担体と組み合わせたポリペプチドバリアントを含む。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」とは、妥当な利益／リスク比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、健全な医学的判断の範囲内で、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに好適である緩衝液、担体、及び賦形剤を意味する。担体（複数可）は、製剤の他の成分と適合し、レシピエントに有害ではないという意味で「許容」されなければならない。薬学的に許容される担体は、この点において、薬学的投与と適合する任意及びすべての緩衝液、溶媒、分散媒体、コーティング、等張剤及び吸収遅延剤等を含むことが意図される。薬学的に活性な物質のためのそのような培地及び薬剤の使用は、当該技術分野で既知である。
製剤は、便宜的に、投薬単位形態で提示することができ、薬学分野において周知の方法のうちのいずれも含む、任意の好適な方法によって調製することができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）。
例示的な実施形態では、ポリペプチドバリアントは、インビトロまたはインビボのいずれかで診断目的のために使用され、ポリペプチドバリアントは、典型的には、検出可能な部分で直接または間接のいずれかで標識される。検出可能な部分は、直接的または間接的のいずれかで検出可能なシグナルを産生することができる任意の部分であり得る。例えば、検出可能な部分は、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、または125Ｉなどの放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、Ｃｙ５．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ（登録商標）色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＩＲＤｙｅ（登録商標）赤外線色素（ＬＩ－ＣＯＲ（登録商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ローダミン、もしくはルシフェリンなどの蛍光もしくは化学発光化合物、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素、スピン標識などのスピンプローブ、または着色粒子、例えばラテックスもしくは金粒子であり得る。ポリペプチドバリアントは、例えば、Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９６２） Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５、Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．（１９７４） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４、Ｐａｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８１） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ４０：２１９、及びＮｙｇｒｅｎ（１９８２） Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７に記載されるように、当該技術分野で既知のいくつかのアプローチを使用して検出可能な部分にコンジュゲートされ得ることが理解される。標識は、例えば、視覚的に、または分光光度計もしくは他の検出器もしくは他の適切な撮像システムの補助により検出され得る。
ポリペプチドバリアントは、当該技術分野で利用可能な広範なイムノアッセイ技法において用いることができる。例示的なイムノアッセイとしては、例えば、サンドイッチイムノアッセイ、競合イムノアッセイ、免疫組織化学的手順が挙げられる。
サンドイッチイムノアッセイでは、目的の分析物または抗原に結合する２つの抗体、例えば、１つは、固体支持体上に固定化され、１つは、溶液中で遊離であり、検出可能な部分で標識される抗体が使用される。抗原を含有する試料がこの系に導入されると、抗原は固定化された抗体及び標識された抗体の両方に結合し、支持体の表面上に「サンドイッチ」免疫複合体を形成する。複合体化タンパク質は、非結合試料構成要素及び過剰な標識された抗体を洗い流し、支持体表面上のタンパク質に複合体化された標識された抗体の量を測定することによって検出される。あるいは、溶液中で遊離である抗体は、遊離抗体に結合する検出可能な部分で標識された第３の抗体によって検出され得る。免疫学的アッセイ設計、理論及びプロトコルの詳細な概説は、Ｂｕｔｔ，ｅｄ．，（１９８４） Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、及びＤｉａｍａｎｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎを含む、多くのテキストに見出すことができる。
標識されたポリペプチドバリアントがインビ造影剤として有用であることが企図され、それによって、ポリペプチドバリアントは、造影剤をレシピエントにおける目的の特定の組織に標的化することができる。インビボ撮像のための遠隔で検出可能な部分は、放射性原子99ｍＴｃ、半減期が約６時間であるガンマ放射体を含む。放射性核種診断剤の非限定的な例としては、例えば、110Ｉｎ、111Ｉｎ、177Ｌｕ、18Ｆ、52Ｆｅ、62Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、86Ｙ、90Ｙ、89Ｚｒ、94ｍＴｃ、94Ｔｃ、99ｍＴｃ、120Ｉ、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、154-158Ｇｄ、32Ｐ、11Ｃ、13Ｎ、15Ｏ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、51Ｍｎ、52ｍＭｎ、55Ｃｏ、72Ａｓ、75Ｂｒ、76Ｂｒ、82ｍＲｂ、83Ｓｒ、または他のγ－、β－、または陽電子放射体が挙げられる。
インビボ撮像にも有用な非放射性部分には、窒素酸化物スピン標識、ならびにランタニド及び遷移金属イオンが含まれ、これらはすべて、インサイチュで陽子緩和を誘導する。撮像に加えて、複合体化放射性部分は、標的細胞を破壊するために、標準的な放射線免疫療法プロトコルで使用され得る。
フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリセリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｅｒｉｎ）、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ－フタルアルデヒド、及びフルオレスカミンを含むが、これらに限定されない、多種多様な蛍光標識が当該技術分野で既知である。有用な化学発光標識としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、またはシュウ酸エステルが挙げることができる。
開示されるポリペプチドバリアントはまた、インビボでの検出を可能にするために、蛍光マーカーで標識されてもよい。いくつかの実施形態では、蛍光標識はＣｙ５．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）である。他の実施形態では、蛍光標識は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ（登録商標）色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。いくつかの実施形態では、蛍光標識は、ＩＲＤｙｅ（登録商標）赤外線色素（ＬＩ－ＣＯＲ（登録商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。
高用量放射線療法のための例示的なヌクレオチドには、放射性原子90Ｙｔ、131Ｉ、及び111Ｉｎが含まれる。ポリペプチドバリアントは、画像技術分野において既知のカップリング技法を使用して、131Ｉ、111Ｉｎ、及び99ｍＴＣで標識することができる。同様に、造影剤を調製及び投与するための手順、ならびに画像を捕捉及び処理するための手順は、画像技術分野で周知であるため、本明細書では詳細に論じない。同様に、抗体に基づく免疫療法を行うための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、米国特許第５，５３４，２５４号を参照されたい。
実施例１．タンパク質分解的に安定した増殖因子を操作するためのハイスループットスクリーニング方法
摘要
増殖因子は、再生医療及びがん治療のための治療分子として開発される可能性が大きい重要な調節タンパク質のクラスである。しかしながら、治療分子としての増殖因子の活性及び有効性は、それらの熱的及びタンパク質分解安定性が低いため大きく制限される。増加した熱的安定性を有する増殖因子を操作するための多くの方法が開発されているが、増加したタンパク質分解安定性を有する増殖因子を操作することに重点を置き、そのための方法の開発が欠如している。プラスミン、エラスターゼ、ｕＰＡ、カテプシン、及びＭＭＰなどのプロテアーゼは、細胞外マトリックス分解及びシグナル伝達において、特に創傷治癒及び腫瘍形成において重要な役割を果たす。これらのプロテアーゼは、通常、増殖因子も分解することが報告されている。この研究では、増加したタンパク質分解安定性のために増殖因子を操作するための一般化可能な方法を記載する。酵母提示プラットフォーム及びＦＡＣＳスクリーニングを、増加したタンパク質分解安定性を有する変異体を選択するための組み合わせアプローチとして利用する。この方法は、スクリーニングが野生型ＦＧＦ１と文献に報告されるタンパク質分解的に安定したＦＧＦ１変異体とを区別する能力を示すことによって検証された。
序文
この実施例は、酵母提示プラットフォーム及びスクリーニングのためのフロー活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、タンパク質分解的に安定した増殖因子を操作するための組み合わせアプローチを記載する。ＦＧＦ１をモデル例としてスクリーニング方法を設定するプロセスが示される。ＦＧＦ１の熱的及びタンパク質分解安定性は極めて低いため、そのスクリーニングが設定された14、21。最も安定性が低い野生型増殖因子は、治療薬で使用するための安定したバージョンを操作するために最も必要である。したがって、安定性が低いモデル増殖因子を選択することによって、増殖因子を操作する方法の有用性を示すことが重要であった。この実施例では、スクリーニングのための選択圧として血清またはいくつかの異なるプロテアーゼの使用を探索した。最後に、スクリーンが異なるタンパク質分解安定性のＦＧＦバリアントを区別する能力を検証した。実施例２では、タンパク質分解的に安定したＦＧＦ１変異体の操作及び特徴付けによる組み合わせスクリーニングの能力が示される。
結果
タンパク質分解的に安定したタンパク質を操作するためのコンビナトリアルスクリーニング方法のワークフロー
高親和性バインダーを操作するために一般的に使用される酵母提示プラットフォームは、より大きなタンパク質分解安定性を有するタンパク質を操作するためにも利用される（図１）。単一の増殖因子バリアントの数千のコピーが、テザー融合物として酵母の表面上に提示される。血球凝集素（ＨＡ）タグは、増殖因子の上流で発現される一方で、ｃ－ｍｙｃタグは、増殖因子の下流で発現される。細胞は、酵母提示増殖因子に結合することができる、対応する受容体の可溶性Ｆｃ融合物と共にインキュベートされ得る。
酵母提示プラットフォームは、より高いタンパク質分解安定性を有する増殖因子を操作するために、フロー活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）と組み合わされる（図２）。増殖因子変異体のライブラリは、ランダム変異誘発、指向性変異誘発、またはＤＮＡシャッフルによって生成される。酵母細胞のライブラリは、目的のプロテアーゼと共にインキュベートされ、その間に、酵母表面提示タンパク質の切断が生じる。より大きなタンパク質分解安定性を有する増殖因子変異体は、酵母細胞表面上の切断に対してより耐性がある。プロテアーゼインキュベーションの後、細胞を洗浄し、保持された受容体結合親和性を有する適切に折り畳まれた増殖因子変異体に結合する機能性受容体の可溶性Ｆｃ融合物と共にインキュベートする。ＦＡＣＳを使用して、適切に折り畳まれた未切断の増殖因子変異体について選別し、これらを拡張し、次回の選別のために誘導する。
Ｆｃドメイン、ｃ－ｍｙｃドメイン、及びＨＡタグに対する蛍光抗体マーカーを使用して、受容体結合、増殖因子特異的切断、及び非特異的切断を測定する（表２．１）。結合したＦｃ融合受容体の検出は、増殖因子における変異が受容体に対する結合親和性を著しく低下させないか、または不適切なタンパク質折り畳みをもたらさないことを確実にすることが重要である。増殖因子特異的切断は、増殖因子のタンパク質分解安定性の直接的尺度である。切断された増殖因子はＣ末端ｃ－ｍｙｃタグを除去するため、それはｃ－ｍｙｃシグナルによって検出される。非特異的切断は、プロテアーゼが酵母表面提示タンパク質Ａｇａ１ｐ及びＡｇａ２ｐ内で切断されるときに生じる。非特異的切断中、３つすべてのマーカーの蛍光シグナルが減少する。増殖因子切断及び結合活性を検出するためのダイナミックレンジが減少するため、これは望ましくない。したがって、目的のプロテアーゼによる非特異的切断が最小限であることを確実にするために、ＨＡシグナルが使用される。
ＦＧＦ１の酵母提示
ＦＧＦ１が、タンパク質分解安定性スクリーニングの設定を示すためのモデルとして選択された。野生型ＦＧＦ１をｐＣＴベクターにクローニングし、Ａｇａ２ｐ交配タンパク質への融合物としてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母細胞の表面上に発現させた（図３Ａ）。酵母細胞表面上でのＦＧＦ１の良好な発現は、タンパク質のＣ末端上のｃ－ｍｙｃタグの検出によって確認された（図３Ｂ）。最後に、酵母提示ＦＧＦの適切な折り畳みは、ＦＧＦＲ１－Ｆｃに対する特異的結合活性を測定することによって確認した（図３Ｃ）。
タンパク質分解的に安定したＦＧＦ１を操作するためのプロテアーゼの選択
ＦＧＦ１のタンパク質分解安定性スクリーニングを開発するための血清、トリプシン、キモトリプシン、及びプラスミンの使用を試験した。これらのプロテアーゼは、ＦＧＦ１に対するそれらの科学的及び生物学的関連性に基づいて選択された。スクリーニングに対するプロテアーゼの適合性は、酵母提示タンパク質の最小限の非特異的切断で、合理的な速度で増殖因子を切断するその能力によって決定された。
我々は、最初に、体内の増殖因子が遭遇する可能性がある多数のプロテアーゼからなる天然血液生成物である血清を使用してスクリーニングを開発しようと試みた22～24。様々な濃度のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と共にＦＧＦ１変異体のライブラリをインキュベートして、ＦＧＦ１切断及びＦＧＦＲ１－Ｆｃ結合シグナルの減少を観察することができるかどうかを確かめた（図４）。ＦＢＳの濃度が１００％に増加した場合でも、ＦＧＦ１切断シグナル（α－ｃ－ｍｙｃ）及びＦＧＦＲ１－Ｆｃ結合シグナルの最小限の減少しか観察されなかったことが分かった。したがって、血清は、タンパク質分解安定性が低い酵母提示ＦＧＦ１変異体を切断するのに十分にストリンジェントな選択圧を提供しなかったと結論付けた。
次に、タンパク質のタンパク質分解安定性を測定及び報告するために一般的に使用される２つのプロテアーゼ、トリプシン及びキモトリプシンを使用してスクリーニングの開発を試験した。我々は、様々な濃度のトリプシン（図５）及びキモトリプシン（図６）と共に酵母提示野生型ＦＧＦ１をインキュベートし、次いでタンパク質切断（α－ｃ－ｍｙｃ）及びＦＧＦＲ１－Ｆｃへの結合の程度を測定した。トリプシン及びキモトリプシンの両方が、観察されたタンパク質切断及びＦＧＦＲ１－Ｆｃへの結合の程度に濃度依存的効果を有したことが分かった。次に、観察されたタンパク質切断が非特異的切断（α－ＨＡ）またはＦＧＦ１特異的切断（α－ｃ－ｍｙｃ）に起因するかどうかを決定した。より高いトリプシン濃度とのインキュベーション時にＨＡシグナルが有意に減少したことが分かり、観察されたトリプシンによるタンパク質切断の多くが非特異的切断に起因することを示した（図７）。したがって、トリプシンをタンパク質分解安定性スクリーニングに使用することはできないと結論付けた。ｃ－ｍｙｃシグナルのみが減少する一方で、ＨＡシグナルがより高いキモトリプシン濃度とのインキュベーションによって比較的影響を受けなかったことが分かり、キモトリプシンによるタンパク質切断が主にＦＧＦ１内の切断に起因することを示した（図８）。したがって、キモトリプシンは、タンパク質分解安定性スクリーニングで使用するための合理的な候補であると結論付けた。
最後に、細胞外マトリックスタンパク質を分解し、ＦＧＦ１を分解することが報告されている25プロテアーゼであるプラスミンを使用したタンパク質分解安定性スクリーニングの開発を評価した。様々な濃度のプラスミンと共に酵母提示野生型ＦＧＦ１をインキュベートし、酵母提示タンパク質が濃度依存的様式で切断されたことが分かった（図９）。観察された切断が非特異的ではなくＦＧＦ１特異的であることを確認するために、酵母提示ＦＧＦ１の切断を、酵母提示タンパク質Ａｇａ１及びＡｇａ２、ならびにＨＡ及びｃ－ｍｙｃタグのみを発現する空の対照と比較した（図１０）。９６時間にわたるプラスミンとのインキュベーション中、酵母提示ＦＧＦ１が切断されている一方で、空の対照は切断されなかったことが分かった。したがって、観察された切断はＦＧＦ１特異的であると結論付けた。
野生型ＦＧＦ１とタンパク質分解的に安定したＦＧＦ１変異体を区別することによるスクリーニング方法の検証
異なるタンパク質分解安定性を有するＦＧＦを区別するプラスミンに基づくスクリーニングの能力を試験するために、野生型（ＷＴ）ＦＧＦ１を、合理的設計によって文献中で開発された熱安定化ＦＧＦ１変異体（ＰＭ２）14と比較した。ＰＭ２は、トリプシンの存在下でより安定するようにＺａｋｒｚｅｗｓｋａらによって特徴付けられた。我々は、プラスミンがトリプシンと一次配列特異性を共有するため、ＰＭ２はプラスミンによる切断に対してより耐性が高いであろうと仮定した。したがって、プラスミンを使用する機能的タンパク質分解安定性スクリーニング方法によって、ＷＴ ＦＧＦ１と比較して、ＰＭ２において少ないＦＧＦ１特異的切断が観察されるだろうと予測した。
ＰＭ２またはＷＴ ＦＧＦ１を提示する酵母細胞を、様々な濃度のプラスミンと共に４８時間インキュベートし、非特異的切断（抗ＨＡ）及びＦＧＦ１特異的切断（抗ｃ－ｍｙｃ）について染色した（図１１）。集団の明確な分離は、ＨＡシグナルに対して比較的少ない影響との、ｃ－ｍｙｃシグナルにおける差異によって得られることが分かった。切断シグナルのこの差異は、プラスミンを使用することにより、スクリーニングがより高いタンパク質分解安定性を有する新しいＦＧＦ変異体を適切に特定し、ＦＡＣＳによってこれらの集団を選別することが可能となるであろうことを立証した。
考察
この実施例では、酵母提示プラットフォーム及びフロー活性化細胞選別を使用してタンパク質分解的に安定した増殖因子を操作するためのハイスループットの一般化可能なスクリーニング方法の開発を記載する。例として、非常に不安定な増殖因子であるＦＧＦ１のスクリーニングの設定が提供される。
目的の増殖因子のスクリーニングを確立する際、第１のステップは、増殖因子が酵母の表面上で発現され得、それがその受容体の可溶性型に結合することができることを確実にすることである。ＦＧＦ１が、Ａｇａ２酵母提示タンパク質へのＣ末端融合物としてｐＣＴベクターにおいて発現することができ、ＦＧＦＲ１－Ｆｃに特異的に結合することが確認された。過去に、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、及びＨＧＦは、酵母提示によって良好に発現されている6、26、27。これは、酵母提示に基づくタンパク質分解スクリーニング方法が他の増殖因子にもより一般的に適用され得ることを示唆する。増殖因子がｐＣＴベクターにおいて発現することができない場合、ｐＴＭＹベクターを使用して、代わりにＡｇａ２へのＮ末端融合物として増殖因子を良好に発現させることができる。ＨＧＦの場合、ｐＣＴベクターにおいて発現させることはできなかったが、ｐＴＭＹにおいて発現させることに成功した。
第２のステップは、タンパク質分解スクリーニングに使用されるプロテアーゼを決定することであった。酵母提示ＦＧＦ１を操作するための血清、トリプシン、キモトリプシン、及びプラスミンの使用を試験した。ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）は、高濃度であっても選択圧が弱すぎることが分かった。プロテアーゼはＦＢＳに見られるが、α－１－抗プロテイナーゼ及びα－１－抗キモトリプシンなどのＦＢＳに見られるプロテアーゼ阻害剤は、それらの活性を低くし得る28。ＦＧＦ１が特に不安定な増殖因子であることを考慮すると、ＦＢＳも他の増殖因子を操作するための適切な選択的タンパク質分解圧ではない可能性がある。しかしながら、新生仔ウシ血清、成体ウシ血清、またはヒト血清などの異なる組成を有する他の種類の血清が考慮され得る。文献においてタンパク質のタンパク質分解安定性を測定するために一般的に使用されるプロテアーゼであるトリプシン及びキモトリプシンの使用を試験した。これは、トリプシン及びキモトリプシンが高い活性及び低い特異性を有し、これにより、それらがある一定の分解速度でほぼすべてのタンパク質を切断することを可能にするためである可能性が高い29。しかしながら、これらの特性は、それらをタンパク質分解安定性スクリーニングで使用するためには魅力的ではない場合がある。トリプシンについて、発現（ｃ－ｍｙｃ）シグナルの損失の多くは酵母提示タンパク質の非特異的切断に起因し、トリプシンを任意の増殖因子のタンパク質分解安定性スクリーニングの候補にするには不十分であることが分かった。キモトリプシンは有意なレベルの非特異的切断を示さないように思われたが、プロテアーゼは主に消化管において見出され、血流中の増殖因子に生物学的に関連する可能性は低いことに留意することが重要である。最後に、実質的にすべての組織において見出され、ＦＧＦ１を分解することが示されている13、25プロテアーゼであるプラスミンの使用を試験した。プラスミンはまた、ＶＥＧＦなどの他の増殖因子の分解に関与している30。酵母提示タンパク質の非特異的切断が比較的少なく、プラスミンが酵母提示ＦＧＦ１を特異的に切断することができたことが分かった。試験することができたプロテアーゼに基づいて、プラスミンがスクリーニングの選択圧として使用するのに最も適切なプロテアーゼであると結論付けた。エラスターゼ、ｕＰＡ、カテプシン、及びＭＭＰなどの増殖因子に生物学的に関連する他のプロテアーゼも、記載されるように、酵母提示タンパク質の高増殖因子特異的切断及び低非特異的切断について試験することによって検証され得る。
スクリーニングの設定における最終ステップは、異なるタンパク質分解安定性を有する増殖因子変異体を区別することができるかどうかを決定することである。この任意のステップは、スクリーニングがタンパク質分解的に安定した変異体を選択する能力の信用性を提供する重要なベンチマークを提供する。ＦＧＦ１について、増加した熱的及びタンパク質分解安定性を有するＦＧＦ１変異体であるＰＭ２が酵母の表面上に提示されるときに野生型ＦＧＦ１と区別され得ることを確認した。利用可能なタンパク質分解的に安定した増殖因子変異体の不在下で、プロテアーゼが酵母提示タンパク質の高増殖因子特異的切断及び低非特異的切断を示す限り、スクリーニングは依然として行うことができる。実施例２では、我々が開発した方法を使用したタンパク質分解安定性のためのＦＧＦ１の操作を報告する。
材料及び方法
酵母提示構築物のクローニング
酵母提示のために、ＦＧＦ１を、ヒトＦＧＦ１ ｃＤＮＡ（ＭＧＣクローン：９２１８、画像：３８９６３５９、残基：Ｐｈｅ１６～Ａｓｐ１５５）からｐＣＴベクター（制限部位：ＮｈｅＩ、ＢａｍＨＩ）にクローニングした。タンパク質分解的に安定したＦＧＦ１変異体ＰＭ２について、部位特異的変異誘発を使用して、変異Ｑ４０Ｐ（ＣＡＡ～ＣＣＡ）、Ｓ４７Ｉ（ＴＣＣ～ＡＴＣ）、及びＨ９３Ｇ（ＣＡＴ～ＧＧＴ）をＦＧＦ１に作製した。
酵母提示ＦＧＦ１の結合アッセイ
５０，０００個の誘導した酵母細胞を、室温で、１ｇ／ＬのＢＳＡ（ＰＢＳＡ）を含むリン酸緩衝生理食塩水中で、様々な濃度のヒトＦＧＦＲ１ベータ（ＩＩＩｃ）－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共にインキュベートした。リガンド枯渇を回避するために十分な量で、及び平衡に到達するのに十分に長い時間（典型的には３～２４時間）、細胞をインキュベートした。インキュベーションの最後の３０分間、酵母細胞を、ＰＢＳＡ中１：２５００希釈のニワトリ抗ｃ－Ｍｙｃ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にインキュベートした。酵母をペレット化し、洗浄し、次いで、１：２００希釈の二次抗体：抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）及び抗ｃ－ｍｙｃに対する抗ニワトリ－ＩｇＹ－ＰＥ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に１０分間氷上でインキュベートした。ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅを使用したフローサイトメトリーによる分析の直前に、酵母を洗浄し、ペレット化し、ＰＢＳＡに再懸濁した。フローサイトメトリーデータを、ＦｌｏｗＪｏ（ｖ７．６．１）を使用して分析した。結合曲線をプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用してＫd値を得た。
スクリーニングのためのタンパク質分解安定性アッセイ
ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）、ウシ膵臓からのトリプシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ウシ膵臓からのキモトリプシンＶＩＩ型（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、またはヒト血漿からのプラスミン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、インキュベーションのためのプロテアーゼまたはプロテアーゼミックスとして使用した。ウシ胎仔血清を、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）に希釈した。トリプシン及びキモトリプシンをトリプシン緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭのＣａＣｌ2、１％ＢＳＡ）に希釈した。プラスミンをプラスミン緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、０．０１％ＢＳＡ、ｐＨ８．５）に希釈した。
１００万個の誘導した酵母細胞を、適切な緩衝液中の様々な濃度のプロテアーゼと共にインキュベートした。インキュベーションの最後に、細胞をＰＢＳＡ（ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ）で１回洗浄し、緩衝プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に再懸濁して、残留プロテアーゼ活性をクエンチした。５分後、細胞をＰＢＳＡでもう一度洗浄した。ＦＧＦＲ結合活性を測定した実験のみについて、細胞を、ｐＢＳＡ中１０ｎＭのヒトＦＧＦＲ１ベータ（ＩＩＩｃ）－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）中で１時間インキュベートした。最終洗浄後、適切な蛍光抗体と共に細胞をインキュベートした。
ＦＧＦＲ１結合活性及びｃ－ｍｙｃシグナルを測定する実験について、細胞を、ＰＢＳＡ中１：２０００希釈のニワトリ抗ｃ－Ｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に３０分間インキュベートした。次いで、細胞を、二次抗体：抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）及び抗ｃ－ｍｙｃに対する抗ニワトリ－ＩｇＹ－ＰＥ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）において、氷上で１０分間インキュベートした。
ＨＡ及びｃ－ｍｙｃシグナルを測定する実験について、細胞を、１：１０００希釈の抗ＨＡタグ（６Ｅ２）マウスｍＡｂ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及び１：２０００希釈のニワトリ抗ｃ－ ｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に３０分間インキュベートした。次いで、細胞を、二次抗体：ヤギ抗マウス－ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びヤギ抗ニワトリ－ＩｇＹ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）において、氷上で１０分間インキュベートした。
ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅを使用したフローサイトメトリーによる分析の直前に、酵母を洗浄し、ペレット化し、ＰＢＳＡに再懸濁した。フローサイトメトリーデータを、ＦｌｏｗＪｏ（ｖ７．６．１）を使用して分析した。結合曲線をプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用してＫd値を得た。
表６．蛍光抗体マーカーからの観察されたシグナルに対する異なる事象の影響。
Figure 2022513196000015
実施例２．タンパク質分解的安定化線維芽細胞増殖因子の操作
摘要
ＦＧＦ１は、創傷治癒、組織再生、腫瘍形成、及び他の血管新生依存性疾患中の細胞分化及び血管新生の誘導において重要な役割を果たす。したがって、ＦＧＦ１に基づくアゴニスト及びアンタゴニストは、細胞培養及びタンパク質治療薬のための重要な用途を有し得る。しかしながら、ＦＧＦ１は、培養下でプロテアーゼに曝露されたときに分解に対する感受性を示すことが報告されている。その不十分なタンパク質分解安定性は、細胞培養において、または治療用分子として開発される場合、それらの活性及び有効性を妨げ得る。この実施例では、実施例１に記載の酵母提示に基づくスクリーニング方法を使用して、タンパク質分解安定性のためにＦＧＦ１ペプチドを操作した。タンパク質分解的に安定したＦＧＦの選択のためのゲーティング戦略、及び特徴付けのための良好な特定候補を探索した。
序文
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、胚発達、細胞分化、細胞増殖、細胞遊走、血管新生、代謝、及び創傷治癒を含む生物学的活性を調節する重要な増殖因子ファミリーの一部である1、31～35。したがって、ＦＧＦに基づく治療薬は、がん療法、創傷治癒、組織再生、及び代謝障害の治療における適用に関心がある32、36、37。多くのＦＧＦファミリーメンバーのうち、ＦＧＦ１は、ＦＧＦＲ１及びＦＧＦＲ２を介したシグナル伝達によって内皮細胞において血管新生促進表現型を誘導することが知られている最も重要なＦＧＦリガンドの１つとして特に関心がある38。
ＦＧＦ１は、機能的血管を退縮から保護し、動脈成長を誘導し、毛細血管の増殖を促進することが報告されている39、40。ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）における管形成及びマトリゲルプラグアッセイにおける血管の形成を誘導することが分かった41。
創傷治癒及び組織再生のための血管新生の誘導におけるＦＧＦ１の有効性にもかかわらず、治療剤としてＦＧＦ１を利用するための努力は、ほとんど成功していない。ＦＧＦ１をコードする注射可能な筋肉内プラスミドの形態の遺伝子療法が、灌流を改善し、末期下肢虚血を有する患者における切断の必要性を低減するための第Ｉ相及び第ＩＩ相臨床試験において示された42、43。しかしながら、それは、重篤な肢虚血を有する患者における切断または死亡率の低減に関する第ＩＩＩ相臨床試験において臨床的有効性を示すことができなかった44。ＣａｒｄｉｏＶａｓｃｕｌａｒ ＢｉｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓはまた、潰瘍、冠動脈疾患、及び末梢動脈疾患の治療のための組換え野生型ＦＧＦ１（ＣＶＢＴ－１４１）を開発したが、臨床試験はほぼ２年間失敗し続けている45。
多くの臨床用途において有効である組換えＦＧＦ１の失敗は、その不十分な安定性に部分的に起因する可能性がある。野生型ＦＧＦ１は、条件培地または培養下で３７℃でインキュベートすると、急速に分解され、分解半減期は約２５分である14、21。創傷治癒の領域に見られる主要なプロテアーゼであるプラスミンが、ＦＧＦ１及びＦＧＦ２の両方を分解し得ることが具体的に示されている25、46、47。
この実施例は、実施例１に記載の開発されたスクリーニング方法を使用して、プラスミンに対する改善されたタンパク質分解安定性のためのＦＧＦ１の操作を記載する。酵母表面提示プラットフォームを使用してＦＧＦ１を操作して、遺伝子－タンパク質結合を確立した。各増殖因子のランダム変異誘発ライブラリを、ＦＧＦＲ１バインダーについてスクリーニングし、次いで、プロテアーゼとのインキュベーション後に切断されていないままであった変異体、及び最後に、プロテアーゼとのインキュベーション後に切断されていないままであり、ＦＧＦＲ１結合を保持した変異体についてスクリーニングした。各増殖因子のタンパク質分解安定性を増加させると思われるいくつかの有望な変異を特定し、実施例３に記載されるように、特徴付けのための候補を生成した。
結果
野生型ＦＧＦの酵母提示及びランダム変異誘発ライブラリの生成
適切に折り畳まれた野生型ＦＧＦ１の良好な酵母提示について、以下に記載する。エラープローンＰＣＲをヌクレオチド類似体と共に使用して、野生型ＦＧＦ１内に変異をランダムに生成した。３．３×１０7の変異体を有するライブラリを生成した。ヌクレオチド類似体の濃度を変化させることにより、変異体当たり平均３．１の変異を生成することができた（変異率２．１％）。これは、改善されたタンパク質分解性を有する変異体を生成するのに十分に高く、ＦＧＦＲ１受容体に対する適切なタンパク質折り畳みまたは結合親和性を損なうであろう変異体の蓄積を回避するのに十分に低い多様性であると仮定した。
選別１： ＦＧＦＲ１－Ｆｃへのバインダーの選択
第１の選別について、ＦＧＦ１変異体を、ＦＧＦＲ１－Ｆｃに対する結合親和性を保持したものについて選別した（図１２Ａ）。ほとんどのランダム変異は結合親和性の喪失をもたらすと仮定した。ＦＧＦＲ１－Ｆｃとのインキュベーション後、高発現（α－ｃ－ｍｙｃ）及び高結合シグナル（α－ＦＧＦＲ１－Ｆｃ）を示した細胞についてゲーティングし、収集した。ＦＧＦ１ライブラリについて、非バインダーであった変異体とＦＧＦＲ結合親和性を保持した変異体との間の明確な分離が観察された（図１２Ｂ）。
選別２：ＦＧＦ１特異的切断に対する耐性の選択
第２の選別について、選別１からの細胞を拡張し、プラスミンと共にインキュベートしたときに切断に対して耐性を維持したＦＧＦ１変異体について選別した（図１３Ａ）。有効なダイナミックレンジを得、異なるタンパク質分解安定性を有する変異体を区別するために、細胞のインキュベーションを様々な濃度及びインキュベーション期間で試験した。ＦＧＦ１ライブラリについては、切断された変異体と未切断変異体の集団との間の明確な分離を達成するために、４００ｎＭのプラスミンと共に３６時間インキュベートすることが必要であることが分かった（図１３Ｂ）。最高レベルのプロテアーゼ耐性を示す細胞の上位１～２％を収集し（高α－ｃ－ｍｙｃ）、発現レベル（α－ＨＡ）により正規化した。
スクリーニング中のペプチドアーチファクトの単離。
第２の選別のＦＧＦ１ライブラリを拡張し、ＨＡ及びｃ－ｍｙｃシグナルを使用して、ＦＧＦ１特異的切断に対する耐性のための選択にもう一回供した。３６時間のインキュベーションのために２００ｎＭのプラスミンでインキュベートすると、ある細胞集団が残りのライブラリと比較してはるかに高いｃ－ｍｙｃシグナルを示したことが明らかに観察され、プラスミンによる切断に対して酵母提示タンパク質の有意に大きな耐性を示した（図１４Ａ）。この集団を収集し、分析のために個々のクローンを配列決定した（図１４Ｂ）。細胞の大部分は、細胞表面上にＦＧＦ２変異体を発現せず、代わりにランダム変異誘発中に生成された可能性がある短いペプチドアーチファクトを発現することが分かった。
これらのペプチドがＦＧＦＲ１－Ｆｃに対していかなる特異的結合も示さないことが確認され、ＦＧＦ１特異的切断に対する耐性についての選別が、これらのペプチドアーチファクトを発現する非常に少数の細胞集団の急速な富化をもたらしたことを示した（図１５）。したがって、すべての後続の選別について、ＦＧＦＲ１結合親和性を保持するための選択圧を含むように進めた。
選別３～４：プロテアーゼ耐性ＦＧＦＲ１－Ｆｃバインダーの選択
残りの選別３及び４について、ライブラリを、プラスミン、その後ＦＧＦＲ１－Ｆｃと共にインキュベートした後に選択した（図１６）。α－ＨＡ、α－ｃ－ｍｙｃ、及びα－ＦＧＦＲ１－Ｆｃの異なる組み合わせを使用して、未切断のままであり、ＦＧＦＲ１に対する結合親和性を保持したＦＧＦ１変異体を選択した。
第３の選別のＦＧＦ１について、選別２からの細胞を拡張し、プラスミンとのインキュベーション後にＦＧＦＲ１結合を保持したＦＧＦ変異体について選別した（図１７）。より高い濃度のプラスミンと共に１２時間のインキュベーションを行った。ＦＧＦ１ライブラリの選別に１．５μＭのプラスミンを最終的に使用した。高結合シグナル（α－ＦＧＦＲ１－Ｆｃ）及び高発現（α－ＨＡ）を示した細胞についてゲーティングし、収集した。
第４の選別のＦＧＦ１について、選別３からの細胞を拡張し、プラスミンインキュベーション時間を１２時間から３６時間に増加した。選別３からの細胞を、１．５μＭのプラスミンまたは５００ｎＭのプラスミンのいずれかでインキュベートした。最終的に、５００ｎＭのプラスミンと共にインキュベートした細胞について選別した（図１８）。切断に対する高い耐性（α－ｃ－ｍｙｃ）及び高い結合シグナル（α－ＦＧＦＲ１－Ｆｃ）を示した細胞についてゲーティングし、収集した。選別４によって、ＦＧＦ１ライブラリの完全なコンセンサスが得られ、さらなる回の選別を行うために捕捉された。
選別したＦＧＦ１変異体の配列分析
最終選別４について、個々のクローンをランダムに選択し、分析のために配列決定した。４回以内の選別で完全なコンセンサスに達することができた。変異体（ＢＳ４Ｍ１）は、２つの変異：Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｒを含有する（図１９）。アスパラギン酸２８は、ＦＧＦ１の６本鎖βバレル構造を閉じる３つの主要なβヘアピンのうちの最初（ＬＰＤＧ）の一部である。ロイシン１３１は、ＦＧＦ１のＮ末端とＣ末端との間のβ鎖対内に見られる。
考察
この実施例では、プラスミンに対するタンパク質分解安定性のためのＦＧＦ１の操作を記載した。最初のステップとして、野生型ＦＧＦ１及び野生型ＦＧＦ２を良好に発現することができた。タンパク質は、ＦＧＦＲ１－ＦｃまたはｓＦＧＦＲ３－Ｄ２Ｄ３－Ｆｃに対する特異的結合についてのｃ－ｍｙｃタグ試験の検出によって、良好に発現され、適切に折り畳まれることが示された。ＦＧＦ１が比較的高い発現シグナルを示すことが観察され、これは、ＦＧＦ１が短い半減期及び低い融解温度で不安定であると見なされることを考えると興味深い21。酵母提示発現及び分泌効率は、不安定なタンパク質のタンパク質安定性と大まかに相関することが報告されているが、これは常にそうではない48、49。したがって、この実施例は、酵母提示が操作のための不安定な野生型増殖因子の発現に対応することができたことを示した。
酵母提示によるＦＧＦ１の高発現は、ＦＧＦ１ランダム変異誘発ライブラリの選別及びその後の選別中にシグナルの良好なダイナミックレンジをもたらした。ＦＧＦ１の選別は、ストリンジェンシーを増加させるために、高濃度のプラスミン及び長いインキュベーション時間に供され得る。これは、切断されたＦＧＦ１変異体と非切断ＦＧＦ１変異体との間の明確な分離が達成された選別２において特に有用であった。
選別１におけるＦＧＦＲバインダーを選択するために初回の選別を行ったが、切断を測定するためにＨＡ及びｃ－ｍｙｃシグナルのみを使用することは、選別における非ＦＧＦＲ結合ペプチドの急速な富化をもたらすことが分かった。わずか２回のそのような選別において、残りのライブラリからのペプチド発現集団の明確な分離が特定された。ライブラリは、野生型ＦＧＦを足場とするランダム変異誘発によって構築されたが、ランダム変異誘発プロセスにおける稀なエラーは、おそらくペプチドアーチファクトを発現する極めて少数の細胞集団をもたらした。これらのアーチファクトは、親和性成熟のためのより伝統的な酵母提示スクリーニングにあまり重要ではないであろうが、それらは、受容体結合のための選択圧なしでは急速に有意になった。したがって、結合親和性を測定するための選択圧は不可欠であり、切断活性のみに基づいて変異体を選択することによって、１回の選別が行われるべきであると結論付けられた。
スクリーニングプロセスを通して、タンパク質分解安定性の改善に有意であり得るいくつかの富化された変異を特定した。興味深いことに、変異は、タンパク質のβループ領域またはＣ末端付近に見られ、タンパク質安定性を決定するための重要な領域であることが示唆される。ＦＧＦ１ライブラリについては、４回以内の選別で完全なコンセンサスに達した。ＦＧＦ１ ＢＳ４Ｍ１変異体は、２つの変異：Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｒを含有する。アスパラギン酸２８は、ＦＧＦ１の６本鎖βバレル構造を閉じる３つの主要なβヘアピンのうちの最初（ＬＰＤＧ）の一部である。ＦＧＦ１の安定性への寄与におけるＡｓｘ－Ｐｒｏ－Ａｓｘ－Ｇｌｙモチーフの重要性は以前に研究されており、Ａｓｘ残基をアラニンで置き換えることは、ＦＧＦ１を大きく不安定化させることが示されている50。しかしながら、Ｄ２８Ｎの置換が実際にそのＧｉｂｂｓ遊離エネルギーを約２．５ｋＪ／ｍｏｌ増加させることが示され、タンパク質分解安定性が常に熱的安定性と相関するとは限らないことを示唆する。ロイシン１３１は、ＦＧＦ１のＮ末端とＣ末端との間のβ鎖対内に見られる。このβ鎖対に隣接してβバレル構造を安定化するためのβヘアピンが存在しないため、この対のアミノ酸は、２つの鎖間の結合強度、または主鎖がβバレル構造を閉じるように位置付けられるのを立体的に好ましくすることのいずれかによってバレルを安定化するために重要であると仮定されている。実際、プロリン１３４のシステイン、スレオニン、またはバリンへの変異は、ＦＧＦ１の安定性を－６～－８ｋＪ／ｍｏｌ増加させることが示されている51。
結論として、タンパク質分解安定性のスクリーニングは、文献中のＦＧＦ１タンパク質安定性に重要であると報告されている位置の変異のために良好に濃縮することができたことが示された。実施例３では、可溶性に発現したＦＧＦ１の安定性及びＦＧＦ経路を調節するリガンドの能力に対するそれらの影響について、最終的なＦＧＦ１ ＢＳ４Ｍ１変異体において特定された変異を特徴付ける。
材料及び方法
タンパク質の酵母表面提示
ＹＰＤ培地は、２０ｇ／Ｌのデキストロース、２０ｇ／Ｌのペプトン、及び１０ｇ／Ｌの酵母抽出物からなる。選択的ＳＤ－ＣＡＡ培地は、２０ｇ／Ｌのデキストロース、６．７ｇ／Ｌのアミノ酸不含酵母ニトロゲンベース（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇ／Ｌのカザミノ酸（Ｂａｃｔｏ）、５．４ｇ／ＬのＮａ2ＨＰＯ4、及び８．５６ｇ／ＬのＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏからなる。ＳＤ－ＣＡＡプレートは、培地と同じ構成要素を含有し、１８２ｇ／Ｌのソルビトール及び１５ｇ／Ｌの寒天が加えられる。ＳＧ－ＣＡＡ誘導培地はＳＤ－ＣＡＡと同一であるが、デキストロースの代わりに２０ｇ／Ｌのガラクトースを含有する。酵母を増殖させ、２３５ｒｐｍで振盪しながら３０℃で誘導した。
ｐＣＴ酵母提示プラスミドをエレクトロポレーションによりＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＥＢＹ１００に形質転換し、３０℃で１時間、ＹＰＤ中で回収した後、ＳＤ－ＣＡＡプレート上にプレーティングした。３日後、酵母コロニーをＳＤ－ＣＡＡに一晩播種した。タンパク質の発現及び酵母提示を、確立されたプロトコル52に従って、３０℃で２４時間ＳＧ－ＣＡＡ中で誘導した。
ライブラリ作製
酵母提示のために、ＦＧＦ１を、ヒトＦＧＦ１ ｃＤＮＡ（ＭＧＣクローン：９２１８、画像：３８９６３５９、残基：Ｐｈｅ１６～Ａｓｐ１５５）からｐＣＴベクター（制限部位：ＮｈｅＩ、ＢａｍＨＩ）にクローニングした。ＦＧＦ１ランダム変異誘発ライブラリを、前述52、53のエラープローンＰＣＲを使用して生成した。ＦＧＦ１をテンプレートとして使用し、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）ならびにヌクレオチド類似体８－オキソ－ｄＧＴＰ及びｄＰＴＰ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して変異を導入した。順方向及び逆方向のｐＣＴプラスミドと５０ｂｐのオーバーラップを含有したプライマーを使用して、酵母相同組換えを介して変異遺伝子をｐＣＴベクターに挿入することを可能にした。様々な変異頻度を有するクローンを得るために、２０のＰＣＲサイクルにわたって様々な濃度のヌクレオチド類似体（４０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭ）を用いて６回のＰＣＲを行った。ＰＣＲ生成物をヌクレオチド類似体の不在下で増幅し、ゲル電気泳動を使用して精製した。ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩを用いて、ＰＣＴプラスミドをベクターとして消化した。５μｇの精製したＤＮＡ挿入物及び１μｇの制限酵素消化ｐＣＴの８つの形質転換物を、エレクトロコンピテントＥＢＹ１００酵母細胞にエレクトロポレーションした。形質転換された酵母細胞を、３０℃で１時間、ＹＰＤ中で回収し、次いで選択的ＳＤ－ＣＡＡ培地中で増殖させた。各ＰＣＲからのクローンをサンプリングして、変異誘発頻度を決定した。５μＭ及び２．５μＭのＰＣＲからのクローンを組み合わせて、クローン当たり平均３つの変異を有する最終ライブラリを作製した。２回の継代後、細胞をＳＧ－ＣＡＡに移し、タンパク質発現を誘導した。希釈プレーティングにより推定されるように、２×１０7の形質転換体のライブラリサイズを得た。
ライブラリスクリーニング
ＦＧＦ１変異体を提示する誘導されたＥＢＹ１００酵母細胞を、各選別について記載されるように、３７℃でプラスミン消化緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、０．０１％ＢＳＡ、ｐＨ８．５）中のプラスミン、及び／または室温でＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ（ＰＢＳＡ）中のＦＧＦＲ１－Ｆｃと共にインキュベートした。プロテアーゼ消化ステップ後、細胞をＰＢＳＡで洗浄し、ＰＢＳＡ中１：１００希釈のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）と共に５分間インキュベートした後、ＰＢＳＡで再度洗浄した。ＦＧＦＲのインキュベーションステップ後、細胞をＰＢＳＡで洗浄した。各選別についてインキュベートした酵母細胞の数は、前の選別で収集した細胞の数の約１０倍であった。細胞を、１ｍＬ当たり２００万個の細胞密度の体積でインキュベートした。すべてのインキュベーションステップ後、細胞を一次及び二次抗体で染色した。一次染色について、細胞を、１：１０００希釈の抗ＨＡタグ（６Ｅ２）マウスｍＡｂ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及び／または１：２０００希釈のニワトリ抗ｃ－Ｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に３０分間適切にインキュベートした。一次染色後、細胞をＰＢＳＡで洗浄した。二次染色を１０分間氷上で行った。二次染色のために、次の抗体を各選別に使用した：選別１、３、４－抗ｃ－ｍｙｃに対する抗ニワトリ－ＩｇＹ－ＰＥ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びＦＧＦＲ１－Ｆｃに対する抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）；選別２－ヤギ抗マウス－ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びヤギ抗ニワトリ－ＩｇＹ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｌｏｇｙ）。
標識した酵母細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｓｈａｒｅｄ ＦＡＣＳ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）を使用して蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により選別した。各選別において、各選別について設定された基準に基づいて、０．５～１０％の酵母細胞を収集した。各選別で収集した細胞を、ＯＤが５～８に達するまで、数日間ＳＤ－ＣＡＡ（細菌汚染を制限するためにｐＨ５）中で増殖させた。次回の選別の前に、クローンを、３０℃で２４時間、ＳＧ－ＣＡＡ中で酵母提示発現のために誘導した。
配列決定及びクローニングのために、プラスミドＤＮＡを、Ｚｙｍｏｐｒｅｐ Ｙｅａｓｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｉ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して酵母細胞から抽出した。抽出したＤＮＡをＤＨ１０Ｂエレクトロコンピテント細胞に形質転換し、プレーティングした。単一のコロニーを選択し、ＬＢ培地（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で増殖させた。プラスミドＤＮＡを、ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＧｅｎｅＪｅｔ）を使用して単一のコロニー培養物から単離した。ＤＮＡ配列決定をＭＣＬＡＢにより行った。
酵母提示ペプチドＲＴＴＴＳ及びＨＴＴＳの結合親和性アッセイ
５０，０００個の誘導した酵母細胞を、室温で、１ｇ／ＬのＢＳＡ（ＰＢＳＡ）を含むリン酸緩衝生理食塩水中で、様々な濃度のＦＧＦＲ１－Ｆｃと共にインキュベートした。リガンド枯渇を回避するために十分な量で、及び平衡に到達するのに十分に長い時間（典型的には３～２４時間）、細胞をインキュベートした。インキュベーションの最後の３０分間、酵母細胞を、ＰＢＳＡ中１：２５００希釈のニワトリ抗ｃ－Ｍｙｃ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にインキュベートした。酵母をペレット化し、洗浄し、次いで、１：２００希釈の二次抗体：ＦＧＦＲ１－Ｆｃに対する抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）及び抗ｃ－ｍｙｃに対する抗ニワトリ－ＩｇＹ－ＰＥ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に氷上で１０分間インキュベートした。ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅを使用したフローサイトメトリーによる分析の直前に、酵母を洗浄し、ペレット化し、ＰＢＳＡに再懸濁した。フローサイトメトリーデータを、ＦｌｏｗＪｏ（ｖ７．６．１）を使用して分析した。結合曲線をプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用してＫd値を得た。
実施例３．タンパク質分解的安定化線維芽細胞増殖因子の特徴付け
摘要
タンパク質分解安定性は、ＦＧＦ１などの不安定な増殖因子の有効性を改善するのに重要な役割を果たし得る。研究は、ＦＧＦ１が、部分的には、血清中に見られるか、または細胞によって発現されるプロテアーゼに起因して、培養下で急速に分解されることを示した。実施例２では、増加したタンパク質分解安定性のためのＦＧＦ１の操作が記載される。表面酵母上に増強されたタンパク質分解安定性を示したＦＧＦ１変異体について、ＦＧＦ１ランダム変異誘発ライブラリをスクリーニングした。この実施例では、可溶性ＦＧＦ１の組換え発現及びＦＧＦ１におけるタンパク質分解安定性を改善するためのハイスループットスクリーニングによって特定される変異の特徴付けが記載される。ＦＧＦ１及びＦＧＦ２を、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系において組換え発現し、精製した。ＦＧＦ１ ＢＳ４Ｍ１（Ｄ２８Ｎ、Ｌ１３１Ｒ）及びＬ１３１Ｒ変異体は、野生型ＦＧＦ１と比較してよりタンパク質分解的に安定しており、ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体は、強力なＦＧＦ経路アンタゴニストとして作用することが確認された。
序文
ＦＧＦ１は、血管新生の誘導のための強力な調節分子であるが、その不十分な安定性は、タンパク質活性を維持し、長期間の有効性を達成する能力を制限する。実施例２では、ＥＣＭ分解に関する疾患領域で見られる重要なプロテアーゼであるプラスミンとのインキュベーション時に増加したタンパク質分解安定性を示すＦＧＦ１変異体を選択するためのハイスループットスクリーニングの使用が記載される。ＦＧＦ１ライブラリの４回の選別後に完全なコンセンサスが達成され、ＦＧＦ１ ＢＳ４Ｍ１（Ｄ２８Ｎ、Ｌ１３１Ｒ）変異体を特定した。変異は、ＦＧＦの安定性に重要であることが報告されているタンパク質の領域で見られた。
この実施例では、ＦＧＦ１ ＢＳ４Ｍ１変異体に由来する変異ＦＧＦの可溶性発現及び特徴付けがスクリーニングで特定されていることが記載される。野生型及びＦＧＦ１ ＢＳ４Ｍ１変異体を酵母提示ベクターからクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターに挿入した。精製後、酵母提示されたＦＧＦＲ３構築物への特異的結合の検出によって、組換えＦＧＦ１の適切な折り畳みを試験した。
ＦＧＦ１ ＢＳ４Ｍ１変異体及び野生型ＦＧＦ１について、それらの可溶性安定性及びＦＧＦ経路を調節するそれらの能力をさらに特徴付けた。プラスミンまたはトリプシン中のタンパク質のタンパク質分解安定性を試験し、ウエスタンブロット及びバンド強度定量化を用いて異なる時点でのそれらの分解の程度を測定した。変異Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｒの有意性、ならびにタンパク質安定性へのそれらの寄与について調査した。ＦＧＦ１の熱的安定性を測定して、タンパク質分解安定性とのそれらの関係を分析した。より生物学的に関連した条件下でのＦＧＦ１の安定性を試験するために、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞培養物におけるそれらの分解の程度を特徴付けた。加えて、ＥＲＫなどのＦＧＦＲ活性化の下流であるシグナル伝達分子の活性化を調節する能力を特徴付けるためのＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＥＲＫリン酸化アッセイを行った。これらの特徴付け研究の結果は、操作されたＦＧＦ１変異体の改善されたタンパク質分解安定性及びアンタゴニスト活性、ならびに抗血管新生療法に使用される可能性を示した。
結果
ＦＧＦの組換え発現
操作されたＦＧＦ１変異体をそれらの可溶性において発現させ、それらを野生型タンパク質と比較するために、タンパク質をＥ．ｃｏｌｉ発現系において組換え発現させた。組換えタンパク質の細胞内発現のために、ＦＧＦ１及びＦＧＦ１変異体をｐＢＡＤベクターにクローニングした。ｐＢＡＤ ＦＧＦ１発現ベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてほとんど使用されないコドンを有する真核生物タンパク質の発現を増強するＥ．ｃｏｌｉ株Ｒｏｓｅｔｔａに形質転換した。細胞を洗剤ベースの溶液を使用して溶解した。次いで、Ｎｉ－ＮＴＡカラムクロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用してタンパク質を精製した。野生型ＦＧＦ１の同一性及び純度を、クマシー染色タンパク質ゲル及びウエスタンブロットによって確認した（図２０Ａ）。ＦＧＦ１の適切な折り畳みは、酵母提示ＦＧＦＲ３構築物への特異的結合の観察によって確認された（図２０Ｂ）。
プラスミンにおけるＦＧＦ１変異体ＢＳ４Ｍ１のタンパク質分解安定性
野生型ＦＧＦ１及びＦＧＦ１変異体ＢＳ４Ｍ１（Ｄ２８Ｎ／Ｌ１３１Ｒ）のタンパク質分解安定性を測定するために、１００ｎｇの可溶性ＦＧＦをプラスミン中で様々なインキュベーション時間にわたってインキュベートした。次いで、試料をウエスタンブロットで実行し、抗ＦＧＦについて染色することによって、それらの分解速度を評価した。残りのＦＧＦの量を、各条件のバンド強度を測定し、プラスミンインキュベーションなしのタンパク質のバンド強度により正規化することによって計算した。ＢＳ４Ｍ１（Ｄ２８Ｎ、Ｌ１３１Ｒ）変異体は、野生型ＦＧＦ１と比較して、プラスミン中のすべてのインキュベーション時点でより低いレベルの分解を示したことが分かった（図２１）。したがって、プラスミンに対するＦＧＦ１のタンパク質分解安定性を増加させるためのスクリーニングが成功したことが確認された。
ＢＳ４Ｍ１（Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｒ）からの変異を安定化ＰＭ２（Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ）変異体に組み込み、ＰＭ３（Ｄ２８Ｎ、Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、Ｌ１３１Ｒ）を作製した。４８時間のインキュベーション後、異なるプラスミン濃度で各構築物の分解を測定した。ＢＳ４Ｍ１からの変異をＰＭ２からの変異に導入することにより、すべての試験濃度でタンパク質分解に対する耐性が顕著に増加したことが分かった（図２２）。したがって、ＢＳ４Ｍ１において新たに特定された変異は、ＰＭ２からの変異と組み合わせたとき、タンパク質分解安定性に相加的効果を有したと結論付けた。
トリプシンにおる操作されたＦＧＦ変異体のタンパク質分解安定性
野生型ＦＧＦ１及びＦＧＦ１変異体ＢＳ４Ｍ１のタンパク質分解安定性をトリプシンにおいて同様の方法で測定した。プラスミン及びトリプシンは、リジン及びアルギニンと同じ一次特異性を共有するため、プラスミンに対するタンパク質分解安定性のための操作は、トリプシンにおけるタンパク質分解安定性を増加させることができると仮定した。加えて、トリプシンによる分解に対してより耐性があるＦＧＦ１変異体ＰＭ２（Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ）もプラスミンによる切断に対してより耐性があることが確認された。ＢＳ４Ｍ１（Ｄ２８Ｎ、Ｌ１３１Ｒ）変異体は、野生型ＦＧＦ１と比較して、トリプシンにおけるすべてのインキュベーション時点でより低いレベルの分解を示したことが分かった（図２３）。したがって、プラスミンにおけるＦＧＦ１のタンパク質分解安定性のための操作は、トリプシンにおけるタンパク質分解安定性を増加させることにも成功したと結論付けた。
ＦＧＦ１変異体ＢＳ４Ｍ１における変異の有意性
Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｒ変異の両方がＢＳ４Ｍ１変異体にタンパク質分解安定性を付与するために重要であるかどうかを決定するために、Ｄ２８ＮまたはＬ１３１Ｒ変異のみを有するＦＧＦ１のバージョンを作製した。経時的なプラスミンにおけるそれらの分解速度を評価することによって、これらの変異体のタンパク質分解安定性を測定した。Ｌ１３１Ｒ変異体は、ＢＳ４Ｍ１（Ｄ２８Ｎ／Ｌ１３１Ｒ）変異体と比較して、同等のタンパク質分解安定性を示したが、Ｄ２８Ｎ変異体は、野生型ＦＧＦ１と比較しても、はるかに低いタンパク質分解安定性を示したことが分かった（図２４）。Ｄ２８Ｎ変異は、可溶性発現タンパク質に組み込まれたときに、ＦＧＦ１のタンパク質分解安定性を大幅に増加させるように翻訳されなかったと結論付けた。したがって、Ｌ１３１Ｒ変異体によるさらなる特徴付けを継続した。
また、１３１位のアルギニンへの変異がタンパク質分解安定性を付与するのに独特であったかどうか、またはロイシンから離れた変異が有意であったかを決定したかった。したがって、１３１位を代替的にアラニン（Ｌ１３１Ａ）またはリジン（Ｌ１３１Ｋ）のいずれかに変異させて、これらの単一の変異体がタンパク質分解安定性においてそれらの増強を維持したか、または失ったかどうかを確認した。それらの分解速度をプラスミンで評価した。Ｌ１３１Ｋが、Ｌ１３１Ｒと比較して同様のレベルの分解を維持した一方で、Ｌ１３１Ａは、野生型ＦＧＦ１と比較しても、より高いレベルの分解を示したことが分かった（図２５）。
野生型ＦＧＦ１及びＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体の熱的安定性
ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体のタンパク質分解安定性の改善が熱安定性の改善に起因するかどうかを決定するために、野生型ＦＧＦ１及びＦＧＦ Ｌ１３１Ｒ変異体の融解温度を測定した。温度が徐々に増加するときの各タンパク質のアンフォールディングを測定するために、疎水性色素を用いたＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒアッセイを使用した54、55。Ｌ１３１Ｒ変異は、野生型ＦＧＦ１と比較して融解温度のわずかな増加をもたらすが、その差異は統計的に有意ではないことが分かった（図２６）。したがって、熱的安定性は、ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体のタンパク質分解安定性の増加に著しく寄与しないと結論付けた。
細胞培養下でのＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体の安定性
プラスミノーゲンを活性化し、プラスミンに変換するために、ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体の安定性を、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）を発現する乳癌細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１を用いた培養下で試験した。５００ｎｇのタンパク質を、培養下でＭＤＡ－ＭＢ－２３１と共に様々なインキュベーション時間にわたってインキュベートした。各条件のすべてのタンパク質を濃縮し、ウエスタンブロットによる分析のために各条件を別個のウェルに充填した。残ったタンパク質の量を、バンド強度を測定し、培養下でインキュベートされなかった５００ｎｇのタンパク質により正規化することによって定量化した。ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体は、野生型タンパク質と比較して、培養下で増加した安定性を示したことが分かった（図２７）。
ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体は、ＦＧＦＲアンタゴニストである
ＦＧＦ１ Ｌ１３１ＲがＦＧＦ経路を調節する能力を特徴付けるために、ＦＧＦＲ活性化の下流であり、細胞増殖の誘導に重要である主要なシグナル伝達分子であるＥＲＫ（ＭＡＰＫ）のリン酸化を調節する能力を評価した56,57。ＦＧＦＲを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を、野生型ＦＧＦ１のみ、ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体のみ、または様々な濃度のＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体を有する野生型ＦＧＦ１と共にインキュベートした。ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体は、ＥＲＫリン酸化を誘導することができないが、変異体は、野生型ＦＧＦ１によるＥＲＫリン酸化を効果的に阻害することができることが分かった（図２８）。１ｎＭの野生型ＦＧＦ１について、ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体によるＥＲＫリン酸化の阻害のための用量応答曲線を生成し、そのＩＣ５０（１ｎＭ）が野生型ＦＧＦ１の濃度と等モルであることが分かった（図２９）。
ＮＩＨ３Ｔ３細胞へのＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体の結合
ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体の結合親和性を特徴付け、野生型ＦＧＦ１の結合親和性と比較した。ＦＧＦＲを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を、インキュベートを防止するために、４℃で様々な濃度のＦＧＦ１と共にインキュベートした。結合したＨｉｓタグＦＧＦ１を検出するために、細胞を蛍光タグ抗Ｈｉｓ抗体で標識した。ＦＧＦ１ ＷＴ及びＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体の両方が、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対して１０ｎＭの結合親和性を示すことが分かった（図３０）。
考察
この実施例では、実施例２からのプラスミンにおけるタンパク質分解安定性についてスクリーニングで特定されたＦＧＦ変異体を可溶性発現させ、特徴付けた。組換え発現の際に、ＦＧＦ１が発現し、容易に精製されることが分かった。しかしながら、発現の収量は、１～３ｍｇ／Ｌの発現でかなり低いことが分かった。この低いタンパク質収量は、ＦＧＦ１の不十分な安定性に起因し得る。
可溶性ＦＧＦ１ ＢＳ４Ｍ１（Ｄ２８Ｎ、Ｌ１３１Ｒ）変異体は、野生型ＦＧＦ１と比較して、プラスミンにおいて増加したタンパク質分解安定性を示すことが良好に確認された。変異Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｒを、Ｚａｋｒｚｅｗｓｋａら14からの安定化ＦＧＦ１ ＰＭ２変異体（Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ）からの変異と組み合わせると、新たな変異が、プラスミンにおけるＦＧＦ１のタンパク質分解安定性をさらに増強させることが分かった。加えて、ＢＳ４Ｍ１変異体は、プラスミン58と同様の方法でリジン及びアルギニンの後で切断するプロテアーゼであるトリプシンにおいてより安定していることが分かった。これは、選択に使用されるプロテアーゼと一次特異性を共有する他のプロテアーゼの存在下でタンパク質のタンパク質分解安定性を増加させるスクリーニング能力を示す。例えば、ＢＳ４Ｍ１変異体はまた、リソソーム分解に関与し、プラスミンと一次特異性を共有するカテプシンの存在下でよりタンパク質分解的に安定し得る。
ＦＧＦ１ Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｒ単一変異体の特徴付けを通して、増加したタンパク質分解安定性のほとんどがＬ１３１Ｒに起因するが、Ｄ２８Ｎ単一変異体は野生型よりもさらにタンパク質分解安定性が低いことが分かった。酵母提示ＦＧＦ１と可溶性Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＦＧＦ１との間のＤ２８Ｎ変異の有意性の差異は、酵母提示タンパク質にのみ生じるグリコシル化に起因し得る。アスパラギン酸のアスパラギンへの変異は、真核生物のＮＧｘグリコシル化部位の導入をもたらす59。したがって、酵母または哺乳類細胞において発現するＦＧＦ１ ＢＳ４Ｍ１変異体は、さらなるタンパク質分解安定性を有し得る。
Ｌ１３１Ｒ変異は、プラスミンがアルギニンに対する一次特異性を有するため、反直感的なものである。実際、合理的な設計戦略は、タンパク質に新しい潜在的な切断部位を導入することを伴わないだろう。しかしながら、実施例１で論じられるように、一次特異性は、タンパク質切断が潜在的な切断部位で生じるかどうかの唯一の決定因子ではなく、部位の周囲の複数のアミノ酸、及び部位のプロテアーゼへの立体アクセス性も大きく寄与する。ロイシンから離れた変異または１３１位のアルギニンへの変異がタンパク質分解安定性を増加させるために重要であるかどうかをさらに調査するために、ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ａ及びＬ１３１Ｋ単一変異体を特徴付けた。ロイシン１３１をアラニン（合理的設計によるプロテアーゼ切断部位の置換に一般的に使用されるアミノ酸）に変化させることは、野生型ＦＧＦ１と比較してもタンパク質分解安定性の低下をもたらしたことが分かった。しかしながら、ロイシン１３１のリジン（プラスミンが一次特異性を有する他のアミノ酸）への変異は、プラスミンにおける増加したタンパク質分解安定性の保持をもたらした。プラスミンによる１３１位でのＦＧＦ１タンパク質の切断が、結果として生じるタンパク質断片の増加したタンパク質分解安定性をもたらすかどうかを検討したが、スクリーニングはそのような変異について選択することができなかったと結論付けた。酵母提示ＦＧＦ１内の任意の切断は、ｃ－ｍｙｃシグナルの喪失及びこの変異体から離れた選択をもたらすであろう。リジン及びアルギニンは共に正荷電アミノ酸であるため、代わりに、この位置に正荷電を付加することが、ＦＧＦ１のタンパク質分解安定性を増加させるために重要である可能性がある。野生型ＦＧＦ１とＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体との間で融解温度に統計的に有意な差異がないことが分かり、熱的安定性の増加がタンパク質分解安定性の増加を説明しないことを示唆する。したがって、タンパク質分解安定性を増加させるためのＬ１３１Ｒの機序を確実に見つけるためには、さらなる研究が必要であろう。
また、ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞を有する細胞培養下で、野生型ＦＧＦ１よりも安定しているように思われることも分かった。これらの細胞は、プラスミノーゲンをプラスミンに切断し、活性化するウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）を発現する。その結果は、ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体が、より生物学的に関連する文脈において増加した安定性を示すことを示すために有意であった。
最後に、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＥＲＫリン酸化アッセイを使用して、Ｌ１３１Ｒ変異がＦＧＦ１をＦＧＦ経路アンタゴニストに変換することが分かった。この結果は、タンパク質分解安定性を増加させるためのスクリーニングはＦＧＦＲに結合する変異体のみを選択するが、タンパク質がアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するかどうかを選択しないことを考慮すると、合理的であるが興味深い。ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対するＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体の結合親和性は、野生型ＦＧＦ１とほぼ同等であり、これは、ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体のＩＣ５０が阻害アッセイで使用される野生型ＦＧＦ１の濃度とほぼ等モルである理由を説明する。ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体によるＥＲＫリン酸化の阻害は、野生型ＦＧＦ１の存在下で最高濃度のＦＧＦ Ｌ１３Ｒ変異体で処理した試料が、未処理細胞のものを上回る低いＥＲＫリン酸化レベルを示すため、完全ではない。しかしながら、この現象は、文献60においてアンタゴニストとして作用することが報告されている唯一の他のＦＧＦ１変異体であるＦＧＦ１ Ｒ５０Ｅ変異体においても観察される。ＦＧＦ経路関連細胞増殖の誘導及びサイクリンＤ１などの下流エフェクタータンパク質の活性化のための持続的な高いＥＲＫリン酸化レベルが報告されている57、61。ＦＧＦ１ Ｒ５０Ｅ変異体は、インテグリンαｖβ３へのその結合に欠損があり、ＥＲＫリン酸化の不完全な阻害も示す。しかしながら、Ｍｏｒｉらによるフォローアップ研究では、それらのＦＧＦ１ Ｒ５０Ｅアンタゴニストが、ＦＧＦ１誘導細胞遊走、ＨＵＶＥＣ管形成、マトリゲルプラグアッセイにおける血管新生、及び大動脈環アッセイにおける細胞の成長を阻害することができることを良好に示す41。したがって、この実施例は、ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒが機能的生物学的アッセイにおいてＦＧＦ経路アンタゴニストとして同様に作用することができるという良好な証拠を提供する。
結論として、この実施例２及び３に記載される結果は、プラスミンにおけるＦＧＦ１のタンパク質分解安定性を増加させ、ＦＧＦ２の主要なタンパク質分解的安定化候補を特定するためにハイスループットスクリーニングをうまく利用することができたことを示す。ＦＧＦ１変異体は、プラスミン及びトリプシンにおける増加したタンパク質分解安定性、ならびに培養下の増加した安定性を示すことが示された。ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体が、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＦＧＦ１誘導ＥＲＫリン酸化を阻害するために使用することができる強力なＦＧＦ経路アンタゴニストとして作用することが示された。ＦＧＦ１変異体は、眼におけるがん及び望ましくない血管新生などの疾患の治療における抗血管新生療法のためのタンパク質分解的安定化治療用分子の開発のためのそれらの有望性を示す。
材料及び方法
組換えＦＧＦ１の発現及び精製
ＦＧＦ１は、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して発現された。遺伝子を、ヒトＦＧＦ１ ｃＤＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）から、Ｎ末端６ｘ Ｈｉｓタグ及びアラビノース誘導性プロモーターを有するｐＢＡＤ／Ｈｉｓ Ｂベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。制限部位ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩをクローニングに使用した。ｐＢＡＤ ＦＧＦ１－Ｈｉｓプラスミドを化学的にコンピテントなＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）細胞に形質転換し、２３５ｒｐｍで振盪しながら３７℃で１ｍＬのＬＢ中で回収し、アンピシリン（Ａｍｐ）選択のＬＢプレート上にプレーティングした。コロニーを５ｍＬのＬＢ Ａｍｐに播種し、３７℃で一晩増殖させた。１ｍＬの一晩培養物を使用して、１００ｍＬのＬＢ Ａｍｐ発現培養物を播種した。細胞を２３５ｒｐｍで２～２．５時間振盪させながら３７℃で増殖させた。約０．５のＯＤ６００で、細胞を０．２％Ｌ－アラビノース（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で誘導した。タンパク質を発現させ、細胞質中で維持した。発現培養物を３７℃で６時間増殖させた後、細胞を沈降させて収集した。
細胞を、リゾチーム、ＤＮａｓｅ Ｉ、及びヘパリン硫酸塩を含むＢ－ＰＥＲ細菌タンパク質抽出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に３０分間溶解した。抽出混合物を１５，０００ｇで１０分間沈降させ、上清を収集し、０．２２μｍフィルタを通して濾過した。ＦＧＦ１を含有する上清を、セクション２．５．６．１に詳述されるように、Ｎｉ－ＮＴＡ親和性精製のための結合緩衝液で１：１０希釈で希釈した。上清と結合緩衝液との混合物をＮｉ－ＮＴＡカラム上に充填した。Ｎｉ－ＮＴＡ親和性精製からの溶出物を濃縮し、１０ｋＤａカットオフを有するＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４遠心フィルタユニットを使用して、緩衝液をＰＢＳに交換した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、セクション２．５．６．１に記載されるように、最終ＦＧＦ１－Ｈｉｓタンパク質を精製した。
ＦＧＦ１単一変異体のクローニング
オーバーラップ伸長ＰＣＲを使用して、野生型ＦＧＦ１を単一アミノ酸変異体に変異させた62。コドン変異は以下の通りである：Ｄ２８Ｎ－ＧＡＴからＡＡＴ、Ｌ１３１Ｒ－ＣＴＡからＣＧＡ、Ｌ１３１Ａ－ＣＴＡからＧＣＡ、Ｌ１３１Ｋ－ＣＴＡからＡＡＡ。部位特異的変異誘発プライマーは、コドン変異、ならびに野生型ＦＧＦ１配列と重複する各側上の２０ｂｐのオーバーハングを組み込んだ。
タンパク質分解安定性アッセイ
各条件について、１２５ｎｇのタンパク質を、様々な濃度のプラスミンと共に、または３７℃で様々なインキュベーション時間にわたって、２０μＬのプラスミン消化緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、０．０１％のＢＳＡ、ｐＨ８．５）中でインキュベートした。各試料の適切なインキュベーション時間の終了時に、プロテアーゼ消化を、試料を－２０℃で貯蔵することによって停止した。すべてのインキュベーションが完了した後、分析のために試料を氷上で解凍した。各２０μＬの試料を５μＬのＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液及び２μＬのＮｕＰＡＧＥ試料還元剤と混合した。試料を１０分間９５℃に加熱した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを実行した。ゲルを２０％エタノールと共に１０分間インキュベートした後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｉＢｌｏｔ Ｇｅｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｄｅｖｉｃｅを使用してニトロセルロース膜上にブロットした（プログラム０、７分）。
ウエスタンブロットを、ＴＢＳＴ（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのＴｒｉｓ、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）中５％の脱脂粉乳（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で１時間遮断した。５％乳含有ＴＢＳＴ中１：１０００希釈のマウス抗ＦＧＦ１（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、クローン２Ｅ１２）で、一次染色を１時間行った。１５分間ＴＢＳＴ中で３回洗浄した後、１：２５００希釈のヤギ抗マウスＨＲＰ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、二次染色を２時間行った。１５分間ＴＢＳＴ中でさらに３回洗浄した後、ブロットをＢｉｏＲａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ Ｓｙｓｔｅｍによって Ｃｈｅｍｉ Ｈｉ感度モードで撮像した。ＩｍａｇｅＪを使用してバンド強度を定量化し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して、正規化されたバンド強度をプロットした。
融解温度を測定するためのＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒアッセイ
５０μＬの１．２ｍｇ／ｍＬのタンパク質を９６ウェル薄壁ＰＣＲプレート（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に充填した。０．５μＬのＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を試料に加え、十分に混合した。プレートをプラスチックカバーで密封した後、ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ９６ ＲＴ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈでプレート分析した。プレートを５分間４℃まで冷まし、次いでプレートを毎分１℃の速度で１００℃までゆっくりと加熱した。蛍光変化を監視し、各℃で測定した。温度に対する蛍光をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌでプロットし、蛍光が最大及び最小蛍光シグナルの平均に等しい温度を見つけることによって、融解温度を計算した。
細胞培養安定性アッセイ
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ）中１００，０００個の細胞／ウェルの密度で６ウェルプレート（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）上に播種し、５％ＣＯ2で、３７℃で増殖させた。２４時間後、培地を吸引し、血清飢餓のためにＤＭＥＭに置き換えた。２４時間後、ＤＭＥＭを吸引した。各試料について、１ｍＬのＤＭＥＭ中５００ｎｇのタンパク質を各ウェルに加え、様々なインキュベーション時間にわたって、５％ＣＯ2で、３７℃でインキュベートした。各インキュベーションの最後に、上清を収集し、０．２２μｍのフィルタで濾過し、－２０℃で凍結した後分析した。すべてのインキュベーションが完了した後、氷上で上清を解凍した。各上清試料を、Ａｍｉｃｏｎ ３Ｋ ＭＷＣＯ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ遠心フィルタを使用して、５０μＬの体積まで濃縮した。１５μＬの濃縮した試料を５μＬのＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液及び２μＬのＮｕＰＡＧＥ試料還元剤と混合した。試料を１０分間９５℃に加熱した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを実行した。ゲルを２０％エタノールと共に１０分間インキュベートした後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｉＢｌｏｔ Ｇｅｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｄｅｖｉｃｅを使用してニトロセルロース膜上にブロットした（プログラム０、７分）。
ウエスタンブロットを、ＴＢＳＴ（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのＴｒｉｓ、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）中５％の脱脂粉乳（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で１時間遮断した。５％乳含有ＴＢＳＴ中１：１０００希釈のマウス抗ＦＧＦ１（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、クローン２Ｅ１２）で、一次染色を１時間行った。１５分間ＴＢＳＴ中で３回洗浄した後、１：２５００希釈のヤギ抗マウスＨＲＰ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、二次染色を２時間行った。１５分間ＴＢＳＴ中でさらに３回洗浄した後、ブロットをＢｉｏＲａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ Ｓｙｓｔｅｍによって Ｃｈｅｍｉ Ｈｉ感度モードで撮像した。ＩｍａｇｅＪを使用してバンド強度を定量化し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して、正規化されたバンド強度をプロットした。
ＮＩＨ３Ｔ３ ＥＲＫリン酸化アッセイ
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、１０％新生胎仔血清（ＮＢＣＳ）（Ｇｉｂｃｏ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ）中１００，０００個の細胞／ウェルの密度で６ウェルプレート（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）上に播種し、５％ＣＯ2で、３７℃で増殖させた。２４時間後、培地を吸引し、血清飢餓のためにＤＭＥＭに置き換えた。２４時間後、ＤＭＥＭを吸引した。細胞を、任意のホスファターゼ阻害剤なしで、野生型ＦＧＦ１及び／または様々な濃度のＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体で１５～１８時間、３７℃で刺激した。刺激後、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、１Ｘホスファターゼ阻害剤カクテル２及び１Ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル２（Ｓｉｇｍａ）を含む、１００μｌの溶解緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０）で、４℃で１時間処理した。溶解物を－８０℃で凍結した後分析した。溶解物を氷上で解凍し、遠心分離によって清澄化した。タンパク質濃度をＰｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイで定量化した。各試料の２μｇのタンパク質溶解物を、ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏで１４．６μＬに希釈した。各希釈試料を５．６μＬのＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液及び２．２５μＬのＮｕＰＡＧＥ試料還元剤と混合した。試料を１０分間９５℃に加熱した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを実行した。ゲルを２０％エタノールと共に１０分間インキュベートした後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｉＢｌｏｔ Ｇｅｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｄｅｖｉｃｅを使用してニトロセルロース膜上にブロットした（プログラム０、７分）。
ウエスタンブロットを、ＴＢＳＴ（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのＴｒｉｓ、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）中５％の脱脂粉乳（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で１時間遮断した。５％乳含有ＴＢＳＴ中１：１０００希釈のウサギ抗リンＥＲＫ１／２（Ｙ２０２／Ｙ２０４）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）またはウサギ抗ＥＲＫ１／２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）で、一次染色を１時間行った。１５分間ＴＢＳＴ中で３回洗浄した後、１： ２５００希釈のヤギ抗ウサギＨＲＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で、二次染色を２時間行った。１５分間ＴＢＳＴ中でさらに３回洗浄した後、ブロットをＢｉｏＲａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ Ｓｙｓｔｅｍによって Ｃｈｅｍｉ Ｈｉ感度モードで撮像した。ＩｍａｇｅＪを使用してバンド強度を定量化し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用してプロットした。
ＮＩＨ３Ｔ３細胞結合アッセイ
ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、結合緩衝液（１ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＭｎＣｌ2、２ｍＭのＣａＣｌ2、１００ｍＭのＮａＣｌ、及び０．１％ＢＳＡを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５））中で、様々な濃度の野生型ＦＧＦ１またはＦＧＦ１ ＢＳ４Ｍ１変異体と共に４℃で３時間インキュベートした。細胞を、リガンド枯渇を回避するために十分に大きな体積でインキュベートした。ＦＧＦでインキュベーションした後、細胞を洗浄し、１：１００希釈の抗Ｈｉｓ Ｈｉｌｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ａｎａｓｐｅｃ）と共に、氷上で１５分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ペレット化し、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅを使用したフローサイトメトリーによる分析の直前に結合緩衝液に再懸濁した。フローサイトメトリーデータを、ＦｌｏｗＪｏ（ｖ７．６．１）を使用して分析した。結合曲線をプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用してＫd値を得た。
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１９．Ｃｏｏｋ，ａ Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ＢＢ ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８１，５７－６５ （１９９２）．
２０．Ｇｏｓａｌｉａ，Ｄ．Ｎ．，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｃ．Ｍ．，Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．＆Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｓ．Ｌ．Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ Ｓｅｒｉｎｅ ａｎｄ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ－ｐｈａｓｅ Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ４，６２６－６３６ （２００５）．
２１．Ｂｕｃｈｔｏｖａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｓ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．７２，２４４５－２４５９ （２０１５）．
２２．Ｂｏｏｔｔｇｅｒ，Ｒ．，Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｒ．＆Ｋｎａｐｐｅ，Ｄ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｂｌｏｏｄ，ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｓｅｒｕｍ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １２，１－１５ （２０１７）．
２３．Ｒｏｍｅｒｏ，Ｎ．，Ｔｉｎｋｅｒ，Ｄ．，Ｈｙｄｅ，Ｄ．＆Ｒｕｃｋｅｒ，Ｒ．Ｂ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｓｅｒｕｍ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｌａｓｔｉｎ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４４，１６１－１６８ （１９８６）．
２４．Ｗａｇｎｅｒ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｓｅｒｕｍ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅ ＢＭＰ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｒｅ－ｅｎｔｒｙ ｏｆ Ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ Ｍｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌｓ ｄｕｒｉｎｇ Ｎｅｗｔ Ｌｉｍｂ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ ４０，６０８－６１７ （２０１７）．
２５．Ｒｏｓｅｎｇａｒｔ，Ｔ．Ｋ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｗ．Ｖ．，Ｆｒｉｅｓｅｌ，Ｒ．，Ｃｌａｒｋ，Ｒ．＆Ｍａｃｉａｇ，Ｔ．Ｈｅｐａｒｉｎ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｈｅｐａｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－Ｉ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５２，４３２－４４０ （１９８８）．
２６．Ｃｏｃｈｒａｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｋｉｍ，Ｙ．Ｓ．，Ｌｉｐｐｏｗ，Ｓ．Ｍ．，Ｒａｏ，Ｂ．＆Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｋ．Ｄ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｕｔａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｒｅ ｂｉａｓｅｄ ｔｏ ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１９，２４５－２５３ （２００６）．
２７．Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｓ．，Ｔｓａｉ，Ｐ．－Ｃ．＆Ｃｏｃｈｒａｎ，Ｊ．Ｒ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓ Ｍｅｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔｓ ａｎｄ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０８，１３０３５－１３０４０ （２０１１）．
２８．Ｚｈｅｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｏｔｓ ｏｆ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｓ ａ ｒａｗ ｍａｔｅｒｉａｌ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｐａｒｔ ＩＶ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｔｏ ｔｈｅ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｒｕｇｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２２，１２９４－１３００ （２００６）．
２９．ＩＮＡＧＡＭＩ，Ｔ．＆ＳＴＵＲＴＥＶＡＮＴ，Ｊ．Ｍ．Ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃａｔａｌｙｓｅｓ ｂｙ ａｌｐｈａ－ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ ａｎｄ ｔｒｙｐｓｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３５，１０１９－２３ （１９６０）．
３０．Ｌａｕｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｗｏｕｎｄｓ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１５，１２－１８ （２０００）．
３１．Ｋｏｒｃ，Ｍ．＆Ｆｒｉｅｓｅｌ，Ｒ．Ｅ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ．Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ９，６３９－５１ （２００９）．
３２．Ｂｅｅｎｋｅｎ，Ａ．＆Ｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｍ．Ｔｈｅ ＦＧＦ ｆａｍｉｌｙ： ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．８，２３５－２５３ （２００９）．
３３．Ｍａｓｏｎ，Ｉ．Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｔｏ ｅｎｄ ｐｏｉｎｔ： Ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｎｅｕｒａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８，５８３－５９６ （２００７）．
３４．Ｔｅｖｅｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｆａｒｉｎａ，Ｅ．Ｍ．，Ｒｉｖａｓ，Ｊ．＆Ｒｅｉｄ，Ｒ．Ｒ．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ （ＦＧＦ） ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｉｓ．１，１９９－２１３ （２０１４）．
３５．Ｅｓｗａｒａｋｕｍａｒ，Ｖ．Ｐ．，Ｌａｘ，Ｉ．＆Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．１６，１３９－１４９ （２００５）．
３６．Ｋｎｉｇｈｔｓ，Ｖ．＆Ｃｏｏｋ，Ｓ．Ｊ．Ｄｅ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ＦＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２５，１０５－１１７ （２０１０）．
３７．Ｚｈａｎｇ，Ｊ．＆Ｌｉ，Ｙ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｕｓｅｓ ｏｆ ＦＧＦｓ．Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．５３，１４４－１５４ （２０１６）．
３８．Ｐｒｅｓｔａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ／ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．１６，１５９－１７８ （２００５）．
３９．Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－１ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ａｒｔｅｒｉｅｓ： Ａ ｇｏａｌ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ？ Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８７，１７６－１７８ （２０００）．
４０．Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｂ．，Ｐｅｃｈｅｒ，Ｐ．，ｖｏｎ Ｓｐｅｃｈｔ，Ｂ．Ｕ．＆Ｓｔｅｇｍａｎｎ，Ｔ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ： ｆｉｒｓｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９７，６４５－６５０ （１９９８）．
４１．Ｍｏｒｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａ Ｄｏｍｉｎａｎｔ－Ｎｅｇａｔｉｖｅ ＦＧＦ１ Ｍｕｔａｎｔ （ｔｈｅ Ｒ５０Ｅ Ｍｕｔａｎｔ） Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８，（２０１３）．
４２．Ｃｏｍｅｒｏｔａ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｋｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｔｙｐｅ １ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｅｎｄ－ｓｔａｇｅ ｕｎｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｂｌｅ ｌｏｗｅｒ ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ ｉｓｃｈｅｍｉａ： Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａ ｐｈａｓｅ Ｉ ｔｒｉａｌ．Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．３５，９３０－９３６ （２００２）．
４３．Ｎｉｋｏｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ＮＶ１ＦＧＦ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ａｍｐｕｔａｔｉｏｎ－ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｌｉｍｂ ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６，９７２－９７８ （２００８）．
４４．Ｂｅｌｃｈ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ＮＶ１ＦＧＦ ｏｎ ａｍｐｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅａｔｈ： Ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｌｉｍｂ ｉｓｃｈａｅｍｉａ．Ｌａｎｃｅｔ ３７７，１９２９－１９３７ （２０１１）．
４５．Ｒａｓｋ－Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｆａｂｂｒｏ，Ｄ．＆Ｓｃｈｉｏ，Ｈ．Ｂ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ： ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｓｅ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ ３５，６０４－６２０ （２０１４）．
４６．Ｓａｋｓｅｌａ，Ｏ．，Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ，Ｄ．，Ｓｏｍｍｅｒ，Ａ．＆Ｒｉｆｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｂｉｎｄｓ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｉｔ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０７，７４３－５１ （１９８８）．
４７．Ｗｈｉｔｅｌｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．，Ｍｕｒｄｏｃｈ，Ａ．Ｄ．，Ｉｏｚｚｏ，Ｒ．Ｖ．＆Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ，Ｐ．Ａ．Ｔｈｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｒｌｅｃａｎ ａｎｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｂｏｕｎｄ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｙ ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ，ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ，ｐｌａｓｍｉｎ，ａｎｄ ｈｅｐａｒａｎａｓｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１００７９－１００８６ （１９９６）．
４８．Ｐａｒｋ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１９，２１１－２１７ （２００６）．
４９．Ｋｏｗａｌｓｋｉ，Ｊ．Ｍ．，Ｐａｒｅｋｈ，Ｒ．Ｎ．＆Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｋ．Ｄ．Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ Ｖ ｉｓｉａｅ ｏｆ Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｕｔａｎｔｓ Ｌａｃｋｉｎｇ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｂｏｎｄｓ Ｉｓ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７，１２６４－１２７３ （１９９８）．
５０．Ｌｅｅ，Ｊ．，Ｄｕｂｅｙ，Ｖ．Ｋ．，Ｌｏｎｇｏ，Ｌ．Ｍ．＆Ｂｌａｂｅｒ，Ｍ．Ａ Ｌｏｇｉｃａｌ ＯＲ Ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ Ａｓｘ－Ｐｒｏ－Ａｓｘ－Ｇｌｙ Ｔｙｐｅ Ｉ ？？－Ｔｕｒｎ Ｍｏｔｉｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７７，１２５１－１２６４ （２００８）．
５１．Ｄｕｂｅｙ，Ｖ．Ｋ．，Ｌｅｅ，Ｊ．，Ｓｏｍａｓｕｎｄａｒａｍ，Ｔ．，Ｂｌａｂｅｒ，Ｓ．＆Ｂｌａｂｅｒ，Ｍ．Ｓｐａｃｋｌｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｒａｃｋ： Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－１ ｂｙ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｎ ａｎｄ Ｃ ｔｅｒｍｉｎｕｓ β－Ｓｔｒａｎｄ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７１，２５６－２６８ （２００７）．
５２．Ｃｈａｏ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｙｅａｓｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１，７５５－７６８ （２００６）．
５３．Ｄｅｖｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｖａｎ ＆Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｋ．Ｄ．Ｙｅａｓｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ： Ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｌｉｂｒａｒｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１３１，１５１－１８１ （２０１４）．
５４．Ｌａｖｉｎｄｅｒ，Ｊ．Ｊ．，Ｈａｒｉ，Ｓ．Ｂ．，Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｂ．Ｊ．＆Ｍａｇｌｉｅｒｙ，Ｔ．Ｊ．Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ： ａ ｇｅｎｅｒａｌ，ｒａｐｉｄ ｄｙｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．１３１，３７９４－３７９５ （２００９）．
５５．Ｅｒｉｃｓｓｏｎ，Ｕ．Ｂ．，Ｈａｌｌｂｅｒｇ，Ｂ．Ｍ．，Ｄｅｔｉｔｔａ，Ｇ．Ｔ．，Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．＆Ｎｏｒｄｌｕｎｄ，Ｐ．Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ－ｂａｓｅｄ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５７，２８９－２９８ （２００６）．
５６．Ｙｕｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ： Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．（２０１０）．ｄｏｉ：１０．４０６１／２０１０／２１８１４２
５７．Ｓｈａｒｒｏｃｋｓ，Ａ．Ｄ．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ： Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ＥＲＫ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ ｔｈｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．１６，５４０－５４２
５８．Ｈｅｒｖｉｏ，Ｌ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｃａｓｃａｄｅｓ： ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７，４４３－４５３ （２０００）．
５９．Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ，Ｊ．＆Ａｅｂｉ，Ｍ．Ｎ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｂｉｏｌ．（２０１３）．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｃｓｈｐｅｒｓｐｅｃｔ．ａ０１３３５９
６０．Ｙａｍａｊｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－１ （ ＦＧＦ１ ） Ｍｕｔａｎｔ ｔｈａｔ Ａｃｔｓ ａｓ ａｎ ＦＧＦ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５，（２０１０）．
６１．Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｒａｂｅｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｐ．Ｊ．＆Ｂａｌｄａｓｓａｒｅ，Ｊ．Ｊ．Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ－ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ １ （ＥＲＫ１） ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１ ｉｎ Ｇ １ ｐｈａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．６８，６１－６８ （１９９７）．
６２．Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．，Ｈｕｎｔ，Ｈ．Ｄ．，Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｐｕｌｌｅｎ，Ｊ．Ｋ．＆Ｐｅａｓｅａ，Ｌ．Ｒ．Ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅ ７７，５１－５９ （１９８９）．
実施例４．ＮＫ１のタンパク質操作
１．１ 酵母表面提示を介したＮＫ１のタンパク質操作。酵母表面提示は、増強された標的結合親和性、適切な折り畳み、及び改善された安定性のためのタンパク質を設計するために使用されてきた強力な指向性進化技術である。ＮＫ１タンパク質のコンビナトリアルライブラリを、酵母交配凝集素タンパク質Ａｇａ２ｐへの遺伝的融合を介して酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅの表面上に提示した。Ａｇａ２ｐは、酵母細胞壁に共有結合するＡｇａ１ｐにジスルフィド結合される。ほとんどの酵母提示研究とは対照的に、本明細書で使用した構築物は、提示されたＮＫ１タンパク質をＡｇａ２ｐのＮ末端に係留した（米国特許第９，５５６，２４８号からの図２）。このリガンド－受容体系について、この配向が、以下に記載の受容体及び抗体標識の立体障害を低減したことが分かった。ＮＫ１タンパク質は、Ｎ末端血球凝集素（ＨＡ）及びＣ末端ｃ－ｍｙｃエピトープタグと隣接し、これらは酵母細胞表面上の構築物の発現を確認し、表面発現レベルを定量化するために使用された。提示されたＮＫ１タンパク質のＣ末端の柔軟な（Ｇｌｙ4 Ｓｅｒ）3リンカーを使用して、タンパク質を酵母細胞表面から離れて突出させ、立体障害をさらに最小限に抑えた。
タンパク質操作研究のために、１０7～１０8の形質転換体のライブラリを日常的に作製し、各酵母細胞は、その表面に何千もの特定のＮＫ１変異体の同一のコピーを提示する。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用した数千万個の酵母提示ＮＫ１変異体のハイスループットスクリーニングは、所望の特性、この場合、増強されたＭｅｔ受容体結合親和性及び／または増強された発現を有するタンパク質バリアントの単離を可能にした。この目的のために、酵母提示ＮＫ１ライブラリを、蛍光標識されたＭｅｔ－Ｆｃ融合タンパク質、ならびにＨＡエピトープタグに対する一次及び二次抗体の両方で染色した（米国特許第９，５５６，２４８号からの図２Ｂ）。マルチカラーフローサイトメトリーの使用により、フィコエリトリン及びＡｌｅｘａ－４８８蛍光をそれぞれ検出することによって、相対表面発現レベル及びＭｅｔ結合の両方の同時及び独立した監視を可能にした。最も高いレベルのＭｅｔに結合し、最も高いＮＫ１発現レベルを有する酵母細胞を単離した。以前、酵母細胞表面上の発現レベルと熱的安定性及び可溶性発現収率との間に強い相関が示された。選別した酵母を培養下で増殖させ、スクリーニングプロセスを数回繰り返して、少数の独特のクローンからなる濃縮酵母集団を得た。
１．２ 概要：酵母表面提示を使用した高親和性及び安定性のためのＮＫ１の指向性進化。ＮＫ１断片を、１）増強された熱安定性、及び２）Ｍｅｔに対する高結合親和性のために操作した。１回目の指向性進化は主に、酵母細胞表面上の機能発現及びＭｅｔ結合親和性の適度の改善のためのＮＫ１を進化させることからなった。プールした生成物をさらに変異させ、それらを改善されたＭｅｔ結合親和性または増強された安定性のいずれかについて独立してスクリーニングした２回目の指向性進化に供した。次いで、２回目からのプールされた生成物に対してＤＮＡシャッフルを行い、続いて改善されたＭｅｔ結合親和性及び増強された安定性について同時にスクリーニングすることによって、３回目の指向性進化を行った（図３）。
１．３ 野生型ＮＫ１は酵母細胞表面上に機能的に発現しない。ＨＧＦは、２つの主要なアイソフォーム、アイソフォーム１（Ｉ１：Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５９２）及びアイソフォーム３（Ｉ３： Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０１０９３２、配列番号１０）に存在する。
配列番号４（ＮＰ＿００１０１９３２）
ＭＷＶＴＫＬＬＰＡＬＬＬＱＨＶＬＬＨＬＬＬＬＰＩＡＩＰＹＡＥＧＱＲＫＲＲＮＴＩＨＥＦＫＫＳＡＫＴＴＬＩＫＩＤＰＡＬＫＩＫＴＫＫＶＮＴＡＤＱＣＡＮＲＣＴＲＮＫＧＬＰＦＴＣＫＡＦＶＦＤＫＡＲＫＱＣＬＷＦＰＦＮＳＭＳＳＧＶＫＫＥＦＧＨＥＦＤＬＹＥＮＫＤＹＩＲＮＣＩＩＧＫＧＲＳＹＫＧＴＶＳＩＴＫＳＧＩＫＣＱＰＷＳＳＭＩＰＨＥＨＳＹＲＧＫＤＬＱＥＮＹＣＲＮＰＲＧＥＥＧＧＰＷＣＦＴＳＮＰＥＶＲＹＥＶＣＤＩＰＱＣＳＥＶＥＣＭＴＣＮＧＥＳＹＲＧＬＭＤＨＴＥＳＧＫＩＣＱＲＷＤＨＱＴＰＨＲＨＫＦＬＰＥＲＹＰＤＫＧＦＤＤＮＹＣＲＮＰＤＧＱＰＲＰＷＣＹＴＬＤＰＨＴＲＷＥＹＣＡＩＫＴＣＡＤＮＴＭＮＤＴＤＶＰＬＥＴＴＥＣＩＱＧＱＧＥＧＹＲＧＴＶＮＴＩＷＮＧＩＰＣＱＲＷＤＳＱＹＰＨＥＨＤＭＴＰＥＮＦＫＣＫＤＬＲＥＮＹＣＲＮＰＤＧＳＥＳＰＷＣＦＴＴＤＰＮＩＲＶＧＹＣＳＱＩＰＮＣＤＭＳＨＧＱＤＣＹＲＧＮＧＫＮＹＭＧＮＬＳＱＴＲＳＧＬＴＣＳＭＷＤＫＮＭＥＤＬＨＲＨＩＦＷＥＰＤＡＳＫＬＮＥＮＹＣＲＮＰＤＤＤＡＨＧＰＷＣＹＴＧＮＰＬＩＰＷＤＹＣＰＩＳＲＣＥＧＤＴＴＰＴＩＶＮＬＤＨＰＶＩＳＣＡＫＴＫＱＬＲＶＶＮＧＩＰＴＲＴＮＩＧＷＭＶＳＬＲＹＲＮＫＨＩＣＧＧＳＬＩＫＥＳＷＶＬＴＡＲＱＣＦＰＳＲＤＬＫＤＹＥＡＷＬＧＩＨＤＶＨＧＲＧＤＥＫＣＫＱＶＬＮＶＳＱＬＶＹＧＰＥＧＳＤＬＶＬＭＫＬＡＲＰＡＶＬＤＤＦＶＳＴＩＤＬＰＮＹＧＣＴＩＰＥＫＴＳＣＳＶＹＧＷＧＹＴＧＬＩＮＹＤＧＬＬＲＶＡＨＬＹＩＭＧＮＥＫＣＳＱＨＨＲＧＫＶＴＬＮＥＳＥＩＣＡＧＡＥＫＩＧＳＧＰＣＥＧＤＹＧＧＰＬＶＣＥＱＨＫＭＲＭＶＬＧＶＩＶＰＧＲＧＣＡＩＰＮＲＰＧＩＦＶＲＶＡＹＹＡＫＷＩＨＫＩＩＬＴＹＫＶＰＱＳ
ＨＧＦ Ｉ１及びＩ３は、Ｉ３の第１のクリングルドメイン（Ｋ１）の５つのアミノ酸欠失を除いて、配列は同一である。酵母提示プラスミドｐＴＭＹ－ＨＡを使用して、酵母細胞壁タンパク質Ａｇａ２ｐへの遺伝的融合物として酵母細胞表面上にＮＫ１ Ｉ１またはＮＫ１ Ｉ３を発現させた（図２）。ＮＫ１ Ｉ１及びＮＫ１ Ｉ３の両方で同様の結果が見出された。酵母提示ＮＫ１ Ｉ１を、相対発現（ＨＡタグの抗体検出を介して）、及びＡｌｅｘａ ４８８で標識された２０または２００ｎＭのＭｅｔ－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）への結合について染色した。野生型ＮＫ１－Ｍｅｔ相互作用にはヘパリンが必要であるため、この実験は、２μＭのヘパリン（Ｌｏｖｅｎｏｘ、Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）の存在下（米国特許第９，５５６，２４８号からの図４Ａ、上部）及び不在下（図４Ａ、下部）の両方で行った。フローサイトメトリーを使用して、酵母細胞表面上でＮＫ １ Ｉ１を発現する酵母を検出した。可溶性Ｍｅｔ－Ｆｃへの低レベルの結合のみが観察された（図４、ｘ軸対ｙ軸）。結合レベルは、酵母提示ＮＫ１を７０℃に加熱した後に示される（米国特許第９，５５６，２４８号からの図４Ｂ）。以下に示すように、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓから産生される可溶性ＮＫ１ Ｉ１は、６０℃で完全にアンフォールドされる（米国特許第９，５５６，２４８号からの図４）。まとめると、このデータは、酵母提示野生型ＮＫ１が酵母細胞表面上で機能的に発現されないことを示す。
１．４ 酵母表面提示を使用した改善された親和性及び安定性のためのＮＫ１の操作。野生型ＮＫ１と比較して、安定性及びＭｅｔ結合親和性の改善のために、３回の別個の指向性進化を使用してＮＫ１を進化させた。ＮＫ１は、酵母細胞表面上で機能的に発現されなかったため、１回目の指向性進化は主に、酵母提示ＮＫ１変異体をスクリーニングして、Ｍｅｔ受容体に結合するクローンを単離することからなった。この目標に向けて、ヌクレオチド類似体８－オキソ－ｄＧＴＰ及びｄＰＴＰ（ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、エラープローンＰＣＲによって約３×１０7のＮＫ１変異体のライブラリを生成した。ＮＫ１ Ｉ１またはＮＫ１ Ｉ３のいずれも酵母細胞表面上で機能的に発現されないため、どのアイソフォームが指向性進化を介した親和性成熟に最も適しているか明らかではなかった。したがって、開始テンプレートとして等量のＮＫ１ Ｉ１及びＮＫ１ Ｉ３を使用して、Ｉ１及びＩ３の両方に基づく組み合わせたＮＫ１変異体ライブラリを生成した。酵母提示ライブラリからのランダムクローンの配列決定は、ＮＫ１ Ｉ１及びＮＫ１ Ｉ３の等しい表示を確認した。
酵母は３０℃で増殖することを好むが、それらは多くの場合、２０℃でより複雑なタンパク質の改善された発現を示す。したがって、２０℃で酵母細胞表面上のタンパク質発現を誘導して、ＮＫ１変異体の改善された折り畳みを可能にした後、２回目のライブラリ選別を行い、ＦＡＣＳを使用して、２００ｎＭのＡｌｅｘａ－４８８標識されたＭｅｔ－Ｆｃ（Ｍｅｔ－Ｆｃ Ａ４８８）への検出可能な結合を示した酵母細胞を単離した（米国特許第９，５５６，２４８号からの図５Ａ）。その後のライブラリ選別は、３０℃の発現温度を使用して改善された安定性を有する変異体についてスクリーニングすることを目的に、２０℃または３０℃のいずれかの誘導温度を使用して並行して行われた。各戦略で５回の選別後（２０℃の発現温度を使用して５回、または２０℃で２回、続いて３０℃の発現温度で３回）、ライブラリは、２００ｎＭのＭｅｔ－Ｆｃに結合したメンバーを明らかに含有した。
２回目の指向性進化について、１回目の指向性進化の最終選別からプールされた変異体を、エラープローンＰＣＲによってランダムに変異させて、約８×１０7の独特の変異体のライブラリを生成した。このライブラリの最初の２回の選別を、可溶性Ｍｅｔ－Ｆｃ Ａ４８８に結合した変異体を最初に回収するために２０℃の発現温度を使用して行った。その後の回について、改善された熱的安定性と相関することが示されている発現の改善（すなわち、折り畳み安定性）、またはＭｅｔ結合親和性の改善のいずれかについて並行して選別した（米国特許第９，５５６，２４８号からの図５Ｂ）。高温（３７℃）での発現を使用して、改善された安定性のために選別ストリンジェンシーを付与した一方で、低濃度の可溶性Ｍｅｔ－Ｆｃ Ａ４８８への改善された結合を親和性選別ストリンジェンシーに使用した。
最後に、３回目の指向性進化は、２回目の指向性進化からの安定性及び親和性増強された変異体の最終プールをＤＮＡシャッフルして、約２×１０7の独特な形質転換体の第３世代ライブラリを生成することからなった。このライブラリを、増強された安定性（３７℃の誘導時の高い細胞表面発現レベルを介して）及び増強された親和性（実質的に低濃度のＭｅｔ－Ｆｃ Ａ４８８への改善された結合を介して）の両方について同時にスクリーニングした。１回目、２回目、及び３回目の選別は、それぞれ４０、２０、及び２ｎＭのＭｅｔ－Ｆｃ Ａ４８８を使用した。３回目の選別の後、得られた変異体のプールは、３７℃で良好に発現し、２ｎＭのＭｅｔ－Ｆｃ Ａ４８８に強く結合した（米国特許第９，５５６，２４８号からの図６、中央）。２ｎＭのＭｅｔ－Ｆｃ Ａ４８８で標識し、続いて過剰な非標識競合体、この場合、組換えＨＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の存在下で非結合ステップを行うことによって、後続の選別を行った。過剰なＨＧＦ競合体の存在下で２４時間後にＭｅｔ結合を保持したクローンをＦＡＣＳによって単離した。このプロセスを、ＮＫ１変異体のプールがＭｅｔ－Ｆｃ競合体として過剰なＨＧＦの存在下での２日間の非結合ステップ後にＭｅｔ－Ｆｃ Ａ４８８への結合を保持するまで繰り返した（図６、右）。
過剰なＨＧＦ競合体の存在下での２日間の非結合ステップ後でも、バリアントが高温で酵母細胞表面上で効率的に発現され、２ｎＭの可溶性Ｍｅｔへの持続的結合を維持するＮＫ１バリアントのプールを特定した（米国特許第９，５５６，２４８号からの図６）。
１．５ 親和性及び安定性増強ＮＫ１変異体の配列分析。３回目の指向性進化の実施と並行して、２回目からの有望な変異体の特徴付けを開始した。各選別戦略（２０℃親和性選別戦略及び３７℃安定性選別戦略）の最終的な２つ選別回の各々から８つのランダム変異体を配列決定した。興味深いことに、配列決定された３２すべてのクローンは、初期ライブラリの配列決定が比較的等しい割合のＮＫ１アイソフォーム１及びアイソフォーム３を示したにもかかわらず、ＮＫ１ Ｉ１に基づいた。加えて、いくつかの好ましいまたはコンセンサス変異が明らかであった。１０の変異は、ライブラリ選別生成物からランダムに配列決定されたクローンに繰り返し出現し、これらの変異のうちの８つは、ランダムに選択されたクローンの半分を超えて存在した。これらの優性変異を、表１に太字で強調した。多種多様な変異に起因して、個々のクローンのいずれもこれらの変異の８つすべてを含有しなかった。しかしながら、１つのクローンは、８つの最も頻繁な変異のうちの５つを含有した（Ｋ６２Ｅ、Ｎ１２７Ｄ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、Ｎ１９３Ｄ、このクローンはＭ２．１と称される）。残りの３つの変異（Ｑ９５Ｒ、Ｋ１３２Ｎ、Ｑ１７３Ｒ）をこのクローンの背景に加えて、Ｍ２．２と称するＮＫ１変異体を生成した。これらの変異のさらなる配列分析は、以下でさらに論じられるいくつかの興味深い観察を強調した。
２つの戦略からの選別生成物は、完全に同じクローンの多くを産生しなかったが、コンセンサス配列において顕著なオーバーラップを示した。Ｍ２（２回目の指向性進化）生成物において観察されたＩ１２５ＴとＮ１２７Ｄとの間の負の相関は、Ｍ３（３回目の指向性進化）生成物に残存した。配列決定した３０のクローンのうち、２５は、Ｎ１２７Ｄ変異を含有し、そのいずれもＩ１２５Ｔ変異も含有しなかった。しかしながら、Ｎ１２７Ｄを含有しない５つのクローンの各々は、Ｉ１２５Ｔ変異を含有しなかった。Ｋ６２Ｅ／Ｖ６４Ａ及びＩ１３０Ｖ／Ｋ１３２Ｎコンセンサス変異は、２つのアミノ酸間隔のみで生じた。
Ｍ２生成物からの８つのコンセンサス変異のすべてがＭ３生成物に存在した（Ｍ２．２＝Ｋ６２Ｅ、Ｑ９５Ｒ、Ｎ１２７Ｄ、Ｋ１３２Ｎ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、Ｑ１７３Ｒ、Ｎ１９３Ｄを想起されたい）。Ｍ３生成物の５０％超で生じた５つの追加のコンセンサス変異があった：Ｖ６４Ａ、Ｎ７７Ｓ、Ｉ１３０Ｖ、Ｓ１５４Ａ、及びＦ１９０Ｙ。
表７： ある特定のバリアントに存在する配列置換
Figure 2022513196000016
実施例５．ＮＫ１の産生
２．１ 酵母株Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける野生型ＮＫ１及びＮＫ１変異体の可溶性産生。簡潔には、Ｎ末端ＦＬＡＧエピトープタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）及びＣ末端ヘキサヒスチジンタグを含有する野生型ＮＫ１、Ｍ２．１、またはＭ２．２をコードするＤＮＡを、分泌プラスミドｐＰＩＣ９Ｋにクローニングした。構築物をＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓに形質転換し、４ｍｇ／ｍＬのジェネティシンを含有するＹＰＤ－寒天プレート上での増殖のために選択し、培養上清のウエスタンブロットによってＮＫ１発現についてスクリーニングした。図７Ａ（米国特許第９，５５６，２４８号から）は、Ｍ２．１及びＭ２．２が３０℃で良好に発現する一方で、野生型ＮＫ１がはるかに低いレベルで発現することを示す。このデータは、酵母表面提示を使用した増加したタンパク質安定性のための操作も改善された組換え発現レベルをもたらすことを報告する以前の研究と一致する。しかしながら、発現温度を２０℃に低下させることは、野生型ＮＫ１の効率的な発現を可能にした（データ図示せず）。ＮＫ１及び変異体発現を振盪フラスコ培養下で０．５Ｌまでスケールアップし、固定化ニッケル親和性クロマトグラフィーを使用して精製し、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でゲル濾過した。数ミリグラムの変異体Ｍ２．１及びＭ２．２が、任意の最適化なしに１つの０．５Ｌ振盪フラスコから得られ、誘導条件を修正することによって、または発酵を介してさらに高い収率を得ることができることを示唆する。
２．２ 変異体Ｍ２．１及びＭ２．２は野生型ＮＫ１よりも高い熱的安定性を示す。熱的安定性を試験するために、Ｍ２．１及びＭ２．２を酵母細胞表面上に発現させ、様々な温度に加熱し、蛍光標識されたＭｅｔ－Ｆｃへの結合の保持をフローサイトメトリーにより測定した（米国特許第９，５５６，２４８号からの図８Ａ）。ＮＫ１変異体Ｍ２．１及びＭ２．２は、酵母の表面でそれぞれ６１．０±１．４℃及び６１．４±０．７℃のＴm値を有する。酵母提示野生型ＮＫ１は、酵母細胞表面上に機能的に発現されなかったため、安定性を監視することができなかった。
可溶性タンパク質の安定性を試験するために、精製された可溶性変異体の二次構造アンフォールディングを、Ｊａｓｃｏ Ｊ－８１５ＣＤ分光計で円二色性（ＣＤ）を使用して監視した。変異タンパク質のＣＤスキャンは、主にβシート構造要素に起因して、２０８ｎｍでピークを特定した。Ｍ２．１及びＭ２．２のＣＤスキャンは、野生型ＮＫ１のＣＤスキャンと類似しており、変異タンパク質が野生型ＮＫ１と同じ全体的な二次構造要素を含有することを図示する（米国特許第９，５５６，２４８号からの図８Ｂ）。８０℃での野生型ＮＫ１のＣＤスペクトルはランダムコイルのＣＤスペクトルに似ており、円二色性を使用した二次構造要素のアンフォールディングを監視する能力を示す（図８Ｂ）。この情報を使用して、この二次構造のアンフォールディングを可変温度ＣＤスキャンによって監視した（図８Ｃ）。これらのアッセイのそれぞれにおいて、Ｍ２．１及びＭ２．２は、野生型ＮＫ１（Ｔm＝５０．９±０．２℃）と比較して、より高い熱的安定性（それぞれ、６３．６±０．３℃及び６７．８±０．２℃）を示した。これらの結果をさらに確認するために、Ｍ２．１のランダムコイルの融解に対する２３６ｎｍでの局所最大の融解を監視した。同じＴmが２０８ｎｍでの融解について観察された。ＣＤ温度融解によって決定された野生型及び変異ＮＫ１タンパク質の熱的安定性（Ｔm）の要約を表８に示す。
Figure 2022513196000017
２．３ 塩濃度がタンパク質の安定性に与える影響。その構造完全性を維持するために、野生型ＮＫ１は、高い塩濃度（＞２００～３００ｍＭのＮａＣｌ）を含有する緩衝液中で維持されなければならないことが観察された。この要件のさらなる証拠として、野生型ＮＫ１は、中程度の塩濃度（１３７ｍＭ）を含有する緩衝液を用いたサイズ排除クロマトグラフィーで広範な遅延溶出プロファイルを示し（米国特許第９，５５６，２４８号からの図９及び挿入図）、これらの条件下でのアンフォールディング及び／またはカラムへの非特異的結合を示唆した。対照的に、Ｍ２．１及びＭ２．２は、同様の中等度の塩条件下でのサイズ排除クロマトグラフィーで、単一の鋭いピークとして溶出した（米国特許第９，５５６，２４８号からの図９）。
実施例６．ＮＫ１の特徴付け
３．１ ＮＫ１ホモ二量体化界面残基Ｎ１２７における点変異は、Ｎ及びＫ１ドメインを接続するリンカー領域内にある（図１）。このアスパラギン残基の側鎖は、２つの水素結合を形成する。Ｎ１２７Ｄバリアントは、ライブラリ単離されたバリアントの間で頻繁に観察された。（表２及び３）。Ｍ２．２内のＮ１２７Ｄ変異が生物学的活性に与える影響を調べるために、この位置で一連の点変異体を生成した。アラニン残基は、ＮＫ１ホモ二量体の安定化相互作用を妨害することによって、野生型ＮＫ１をアゴニストからアンタゴニストに変換する。この位置でのリジンまたはアルギニンへの変異の影響を試験した。これらの置換は、かさ高い荷電側鎖を介して立体及び静電妨害物を導入する。
加えて、点変異体Ｄ１２７Ｎを分析した。これにより、この位置を野生型アスパラギン残基に戻す。Ｎ１２７Ｄ変異を含有するＭ２．２の文脈内では、これらの変異は、Ｄ１２７Ａ、Ｄ１２７Ｋ、Ｄ１２７Ｒ、及びＤ１２７Ｎと称される。重要なことに、これらの変異体の各々は、Ｍ２．２に関連する高い熱的安定性を保持した（表５）。
３．２ Ｍｅｔ受容体アゴニストまたはアンタゴニストとしてのＮＫ１変異体の特徴付け。ＮＫ １変異体は、ＭＤＣＫ細胞散乱及びｕＰＡアッセイにおいて評価され、２つのアッセイは、哺乳類細胞におけるＭｅｔ受容体の活性化を研究するために広く使用されている。ＭＤＣＫ細胞散乱アッセイについて、１５００個の細胞／ウェルを１００μＬの完全成長培地の９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ ＣＯ2でインキュベートした。２４時間後、培地を吸引によって除去し、それぞれ０．１または１００ｎＭの濃度のＨＧＦまたはＮＫ１タンパク質を含有する培地に置き換えた。いくつかの実験では、ｌｏｖｅｎｏｘ（登録商標）ヘパリン（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）を２μＭの濃度で、または２：１のヘパリン：ＮＫ１のモル比で使用した。２４時間後、細胞を固定し、室温で１０分間、５０％エタノール中０．５％クリスタルバイオレットで染色し、水で洗浄し、風乾させた後、写真を撮った。細胞を２５０ｎＭのＮＫ１変異体と共に３０分間インキュベートした後、ＨＧＦを０．１ｎＭの最終濃度で加えたことを除いて、ＭＤＣＫ散乱阻害アッセイを同様の方法で行った。
ＭＤＣＫ ｕＰＡアッセイについて、４０００個の細胞／ウェルを１００μＬの完全成長培地の９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ ＣＯ2でインキュベートした。２４時間後、培地を吸引によって除去し、それぞれ１または１００ｎＭの濃度のＨＧＦまたはＮＫ１を含有する培地に置き換えた。２４時間後、細胞を２００μＬのフェノールレッド不含ＤＭＥＭで２回洗浄し、１００ｍＭのグリシン（ｐＨ３．５）
溶液中に５０ ％（体積／体積）の０．０５単位／ｍＬのプラスミノーゲン（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、４０％（体積／体積）の５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１０％（体積／体積）及び３ｍＭのｃｈｒｏｍｏｚｙｍ ＰＬ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を含有する２００μＬの反応緩衝液と共にインキュベートした。プレートを３７℃、５％ＣＯ2で４時間インキュベートした後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．）を使用して４０５ｎｍで吸光度を測定した。
変異体Ｍ２．２ Ｄ１２７Ａ、Ｄ１２７Ｋ、及びＤ１２７Ｒは、ＭＤＣＫ細胞における散乱（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１０及び図１１Ａ）またはｕＰＡ活性化（図１１Ｂ）によって測定されるように、Ｍｅｔ活性化を誘導しなかった。Ｎ１２７Ｄ変異を含有する未修飾Ｍ２．２バリアントは、弱い（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１１Ａ）またはまったく（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１０及び図１１Ｂ）アゴニスト活性を示さなかった。
対照的に、１２７位を野生型アスパラギン残基に戻す（Ｍ２．２ Ｄ１２７Ｎ）ことは、ＭＤＣＫ散乱（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１０及び図１１Ａ）及びｕＰＡアッセイ（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１１Ｂ）の両方においてアゴニスト活性をもたらした。Ｍ２．２ Ｄ１２７Ｎの活性は、野生型ＮＫ１の活性と同様であり、両方とも可溶性ヘパリンの存在下での活性の増強を示した（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１１Ｃの上部対下部）。比較して、Ｍ２．２Ｄ１２７Ａ、Ｄ１２７Ｋ、及びＤ１２７Ｒは、ヘパリンの存在下または不在下のいずれにおいてもこれらのアッセイにおいてアゴニスト活性を示さなかった（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１０及び図１１Ａ～Ｃ）。
これらの変異体がＨＧＦ誘導Ｍｅｔ活性化を阻害する能力を試験した。対照として、Ｍ２．２ Ｄ１２７Ｎは、ＨＧＦ誘導活性を阻害せず、Ｍｅｔ受容体アゴニストとしてのその機能のさらなる証拠を提供した（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１２）。Ｍ２．２変異体Ｄ１２７Ａ、Ｄ１２７Ｋ、及びＤ１２７Ｒは、可溶性ヘパリンの不在下でＨＧＦ誘導ＭＤＣＫ散乱の弱いまたは最小限の阻害を示した（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１２、上部）。
対照的に、２μＭのヘパリンを加えたことにより強いアンタゴニスト活性を観察した（図１２、下部）。２：１のヘパリン：ＮＫ１のモル比でのＮＫ１変異体の予備製剤化は、このアンタゴニスト活性を付与するのに十分であり、アンタゴニスト活性の改善のために過剰なヘパリンを加える必要性を取り除いた（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１３）。未修飾Ｍ２．２（Ｍ２．２ Ｎ１２７Ｄ）は、ヘパリンの２：１のモル比で弱いアンタゴニスト活性のみを示し（米国特許第９，５５６，２４８号の図１３）、合理的に操作された点変異の有用性を支持する。Ｍ２．２ Ｄ１２７Ｋのアンタゴニスト活性は、以前に報告されたアンタゴニストＮＫ１ Ｎ１２７Ａのものと同様である（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１３）。しかしながら、Ｍ２．２ Ｄ１２７Ａ／Ｋ／及びＲ変異体は、ＮＫ１ Ｎ１２７Ａと比較して顕著に改善された安定性及び発現、つまり、より低い塩依存的安定性、約１５℃の増加したＴm、及び約４０倍の改善された組換え発現収率を有し、これらはすべて魅力的な特性である。
４．１ 組換えＡｒａｓ－４の生化学的及び生物学的特徴付け。配列分布、酵母表面発現レベル、及びＭｅｔ－Ｆｃ結合に基づいて、３回目の指向性進化からのクローンのうちの５つをさらなる調査のために選択した。これらのクローンは、Ａｒａｓ－１、－２、－３、－４、及び－５と称された（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１４）。これらのクローンのそれぞれは、Ａｒａｓ－１を除いて、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて十分に発現されることが分かった。
Ａｒａｓ－４をさらなる特徴付けのために選択した。ＣＤ温度融解によって決定されるように、それは高い熱的安定性を示した（Ｔm＝６４．９±１．２℃）。Ａｒａｓ－４は、ＭＤＣＫ細胞の培養物に加えられた場合、細胞Ｍｅｔを活性化せず、Ｍ２．２ Ｄ１２７Ａまたは野生型ＮＫ１に基づくアンタゴニストＮＫ１ Ｎ１２７Ａより約５倍低い濃度で、ＭｅｔのＨＧＦ誘導活性化を効果的に阻害した（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１５）。
４．２ 共有結合二量体を形成するためのジスルフィド結合の導入。遊離システイン残基をＭ２．２ Ｄ１２７ＮのＮ末端に導入し、これは組換え発現時に単量体及び二量体種の形成をもたらした。シスチン結合二量体タンパク質（ｃｄＤ１２７Ｎと称される）を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して単量体から精製した。還元及び非還元条件下でのｃｄＤ１２７ＮのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、二量体が共有結合のジスルフィド結合を介して形成されることを確認した。（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１６）。シスチン結合二量体Ｍ２．２ Ｄ１２７Ｋ（ｃｄＤ１２７Ｋと称される）及びＡｒａｓ－４（ｃｄＡｒａｓ－４と称される）ポリペプチドも生成した。
４．３ ｃｄＤ１２７Ｎ、ｃｄＤ１２７Ｋ、及びｃｄＡｒａｓ－４の生物学的活性。ｃｄＤ１２７Ｎ及びｃｄＤ１２７Ｋは、野生型ＮＫ１と同様のアゴニスト活性を有するＭ２．２ Ｄ１２７Ｎ単量体よりも１桁低い濃度でアゴニスト活性を示した（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１７）。親単量体Ｍ２．２ Ｄ１２７Ｋがアンタゴニストであるため、ｃｄＤ１２７Ｋのアゴニスト活性は驚くべきことである。同様に、共有結合がアンタゴニストＡｒａｓ－４をアゴニストに変換したｃｄＡｒａｓ－４の結果も驚くべきことである。観察されるアゴニスト活性のレベルは、全長ＨＧＦのものに近づくが、ｃｄＤ１２７Ｎ、ｃｄＤ１２７Ｋ、及びｃｄＡｒａｓ－４は、全長ＨＧＦに対して実質的に改善された安定性を有し、酵母において組換え発現され得る。
４．４ Ｎ末端システインのみがホモ二量体化を直接媒介する。ＮＫ１ホモ二量体の結晶構造に基づいて、１２７位が隣接するプロトマー上で近接していることが認識された。これは、この位置にシステイン残基を配置することによって共有結合ホモ二量体を形成する可能性を示唆した。この可能性を試験するために、残基Ｄ１２７をＣｙｓで置換したバリアントＡｒａｓ－４ポリペプチドを生成した。結果として生じるポリペプチドは、大部分は、図１８（米国特許第９，５５６，２４８号から）に示すように、自発的またはフェナトロリン硫酸銅処理後のいずれかで二量体を産生することができなかった。
ＮＫ１及びバリアントのＮ末端に遊離システインを付加することによる共有結合に加えて、他の位置及びリンカーを試験した。（米国特許第９，５５６，２４８号からの図１９）。遊離システイン、または遊離システインとシステインタグとの組み合わせ（Ｂａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１３（４）：５０４－５０９）を、Ａｒａｓ－４バリアントのＮ末端またはＣ末端に結合させた。Ｎ末端の遊離システインのみが酵母における組換え発現時に二量体タンパク質をもたらした。
５．０ ヘパリンアルギン酸ペレットを含有するＨＧＦバリアントポリペプチドの調製。アルギン酸カルシウムペレットは、活性及び貯蔵時間の保持が増強したため、ＨＧＦに安定したプラットフォームを提供し得、したがって、ＨＧＦバリアント放出を制御するためのデバイスとして使用することができる。ヘパリン－セファロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ）は、紫外線下で３０分間滅菌され、次いで濾過滅菌アルギン酸ナトリウムと混合され得る。次いで、混合スラリーを、ＣａＣｌ2（１．５％重量／体積）の硬化溶液を含有するビーカー内に針を通して滴下することができる。ビーズがすぐに形成し得る。架橋カプセルエンベロープは、ＣａＣｌ2溶液中のカプセルを穏やかな混合下で５分間、次いで混合せずに１０分間インキュベートすることによって得ることができる。形成されたビーズを、滅菌水で洗浄し、０．９％ＮａＣｌ－１ｍｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ2中に４℃で貯蔵することができる。ＨＧＦ充填は、０．９％ＮａＣｌ－１ｍｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ2－０．０５％ゼラチン中の１０個のカプセルを、１２．５μｇ（１０μｇ用量の場合）もしくは１２５μｇ（１００μｇ用量の場合）、またはＨＧＦバリアントと共に、４℃で穏やかな撹拌下で１６時間インキュベートすることによって行うことができる。最終生成物は、紫外線下で３０分間滅菌され得る。
実施例７．ＨＧＦ／ＦＧＦの組み合わせを使用した角膜治療
ドーム状の眼の最も外側の組織として保護的な役割を果たしているにもかかわらず、通常透明な角膜は、損傷または疾患の結果として潰瘍化、瘢痕、及び混濁化を非常に起こしやすい。角膜の重度の損傷及び疾患では、主に対症手段であるが現在利用可能な多数の手段にもかかわらず、永久的な瘢痕及び視力低下が結果として生じることが多い。1末期角膜失明は、角膜の通常透明な層のうちの１つ以上の血管新生及び混濁化、その後の浮腫及び線維性瘢痕を特徴とする（図３８）。眼表面のほぼすべての盲障害は、それが感染性（例えば、重度の角膜潰瘍またはヘルペス性角膜炎）、免疫媒介性（例えば、スティーブンス－ジョンソン症候群）、及びまたは外傷性（例えば、アルカリ熱傷）であるかにかかわらず、上皮欠損の治癒障害から始まり、不透明な角膜血管新生で終わる。血清点眼薬1及び羊膜2などの組織由来療法は、臨床的に広く使用されているが、両治療の分子組成及び根底にある機序は未だ明確に定義されていない。2逆に、上皮増殖因子（ＥＧＦ）などの単一の組換え増殖因子は、臨床試験で失敗しており、3角膜創傷治癒を完全に支援するために多因子介入が必要であることを示唆している。この仮説と一致して、我々の予備データ4及び他のグループのデータは、傷ついた眼に適用されるヒト間葉幹細胞（ＭＳＣ）の分泌因子（セクレトーム）が上皮化を加速し、動物モデルにおける血管新生及び瘢痕を抑制することを示している。5しかし、これらの効果の原因となる正確な因子は不明のままである。それらの治療可能性は否定できないが、眼表面へのＭＳＣの直接投与は、実現が困難で予測不可能なことが多い。予備データに動機づけられて、ＭＳＣセクレトームの再生効果は、（ｉ）上皮細胞増殖及び遊走を誘導する、ならびに（ｉｉ）角膜の血管新生及び瘢痕を抑制する経路に要約され得ると推論した。我々は、ＭＳＣセクレトームの創傷治癒効果から情報を得て始まった操作された治療用生体分子で構成される合理的に設計され定義されたコンビナトリアル局所療法を開発している。この定義された療法は、新規の操作されたＨＧＦ（ｅＨＧＦ）断片8～11を用いて組換え肝細胞増殖因子（ｒＨＧＦ）6、7の既知の栄養効果を改善し、それを線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の新生血管及び線維化効果の操作されたアンタゴニストと組み合わせる。
図３９に要約されるように、ヒアルロン酸（ＨＡ）及び硫酸コンドロイチン（ＣＳ）の粘弾性ゲル担体内に送達される骨髄由来のＭＳＣのセクレトームの１日１回の適用だけで、ラットにおいて上皮創傷治癒が加速し、角膜アルカリ熱傷後の血管新生及び瘢痕を防止することが示されている。4組換えＨＧＦ（ｒＨＧＦ）は、角膜上皮創傷治癒を促進し、7動物において静脈内注射されたＭＳＣの効果を再現することが示されている。6しかしながら、ｒＨＧＦは製造が困難であり、水溶液中では比較的不安定であり、眼科使用に典型的に必要な高用量では極めて高価である。タンパク質操作方法は、野生型成長因子と比較して、安定性、アゴニスト活性、及び組換え発現収率が実質的に改善された、新規のＨＧＦ断片を作製するために使用されている。8～11
この実施例は、この操作されたＨＧＦ（ｅＨＧＦ）断片のみが、アルカリ熱傷後の角膜における上皮治癒を加速させる可能性があることを示す（図３９）。加えて、細胞培養アッセイにおいて、ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）アンタゴニストとして有望な属性を有するＦＧＦのバリアントを開発するために、ハイスループットスクリーニングアプローチが行われた。ＦＧＦＲアンタゴニストは、ＦＧＦが上流を調節することが知られている血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）媒介性血管新生及び形質転換増殖因子（ＴＧＦ）ベータ媒介性線維化効果を阻害することができる。12、13このＨＧＦ受容体アゴニスト及びＦＧＦＲアンタゴニストの組み合わせは、ラットにおける角膜アルカリ熱傷モデル及び予備研究において一緒に試験されており、ＭＳＣセクレトーム全体の創傷治癒、抗線維化、及び抗血管新生効果を顕著に再現するように思える（図４０）。
この併用療法は、（１）遷延性角膜上皮欠損（ＰＣＥＤ）、及び（２）角膜血管新生において使用できる可能性がある。ＰＣＥＤは、眼の非治癒性潰瘍で、足の非治癒性（例えば、糖尿病性）潰瘍に等しい。ＰＣＥＤは、上皮治癒及び欠損閉鎖のプロセスが遅延し、潰瘍、感染、瘢痕、穿孔、及び視力低下をもたらし得る角膜上皮欠損をもたらす場合に生じる。ｅＨＧＦ分子のみがＰＣＥＤに対処する可能性を有し、唯一の目標は、上皮びらん、摩耗、または潰瘍の閉鎖である。ＰＣＥＤは、損傷、以前の眼の手術、感染（例えば、以前のヘルペス感染または重度の細菌性潰瘍）、または眼の疾患（重度のドライアイ疾患、糖尿病、眼瞼病理に起因する慢性露出、及び造血幹細胞移植後の眼移植片対宿主病などの基礎状態を含む）から生じ得る。ＰＣＥＤ症例の５０％超はドライアイ疾患及び糖尿病が原因であると推定される。1糖尿病は、全身組織修復障害に寄与し、角膜表面は温存されない。医療従事者にとって、糖尿病性角膜疾患及びドライアイ疾患に起因する上皮欠損を有する患者の管理は困難で、時間がかかり、費用及び資源集約的である。患者は、しばしば長引く疾患の治療のために繰り返し来院する必要がある。同様に、中等度から重度のドライアイ疾患の影響は、透析及び重度の狭心症などの状態と同等の範囲であり、著しい不快感、役割制限、低活力、及び全体的な健康不良に関連する。1、2全体的に、米国における年間の推定ＰＣＥＤ数は、約７３，４３４～９９，４６５例である。２０万未満であるので、ＰＣＥＤ自体は、難病と見なされる。4現在の治療は、様々な結果をもたらし、侵襲的で高価であり、患者にとって不便であり得る。既存の承認された薬理療法がなく、ＰＣＥＤは、大きな満たされていない医学的ニーズを表す。14
ＰＣＥＤを治癒するための現在の治療は最適ではなく、潤滑剤、包帯（コンタクトレンズ、パッチ、及び侵襲的な外科グラフ）、ならびに自家血清、羊膜、及び臍帯液（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｆｌｕｉｄ）を通して提供される内因性増殖因子からなる姑息な手段である。しかしながら、これらの治療は、角膜欠損を適時に完全に治癒させることができない場合がある。糖尿病性角膜上皮症では、糖尿病神経障害に起因する角膜感覚の低下が見られる。5治療用の液体充填アーチ形コンタクトレンズ及び瞼板縫合などの外科的介入も使用されている。新鮮凍結または凍結乾燥調製物の羊膜は、ＰＣＥＤ上の所定の位置に縫合することができる。自家血清涙（患者自身の沈降血液から）は、眼表面に必須因子を提供することによって治癒を促進することが示されている。ＰＣＥＤまたはひどく乾燥した眼表面の正確な原因にかかわらず、最終目標は、眼の損なわれた外上皮層を閉鎖し、治癒することである。このようにして、局所ｅＨＧＦ化合物単独は、より保存的な手段に不応で、根底にある原因が分からないＰＣＥＤを有する患者にとって魅力的な選択肢となるであろう。
ｅＨＧＦと抗ＦＧＦＲとの組み合わせに関して、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｅｙｅ ａｎｄ Ｅａｒ／Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌの研究で公表された４．１４％の有病率の外挿に基づき、年間推定１４０万人の患者に影響を及ぼす角膜血管新生は、目標の必要性を満たしていない。ＦＤＡ承認の治療がない異常な角膜血管新生は、典型的には、ＰＣＥＤの後期もしくは重度の兆候、及び／または外傷もしくは疾患を介して角膜の周辺にある上皮幹細胞の喪失もしくは破壊として生じる。この典型例は、化学角膜熱傷であり、これは１０万人当たり１０．７人（すべての眼の外傷の１１．５％～２２．１％を表す）に影響を及ぼし、末梢幹細胞が重度に枯渇し、治癒の遅延及び角膜上への血管増殖につながる。化学熱傷、特にアルカリ熱傷は、ほぼ間違いなく眼が受け得る最も破壊的な損傷であり、ほぼ例外なく、現在利用可能なすべての（主に対症）手段にもかかわらず、角膜及び結膜の瘢痕化、角質化、混濁化 、及び血管新生により失明につながる。したがって、それは、提案されるｅＨＧＦ／抗ＦＧＦＲ併用療法によって標的とされる複数の経路、ならびにそれらの組み合わせが血管新生及び線維症を阻害しながら上皮化を促進することが示されている確立された動物モデルの理想的な標的である（図４０）。角膜化学熱傷の他にも、現在治療法はないが、スティーブンス－ジョンソン症候群、輪部幹細胞欠損、さらにはコンタクトレンズ過剰装用を含む、ｅＨＧＦ／抗ＦＧＦＲ併用技術によって潜在的に対処可能である他の多くの角膜血管新生の原因があり、これらのすべてが、根本的には、透明な無血管角膜とそれに隣接する高血管結膜組織との間の障壁の不全を表している。
方法：
動物
これらの実験において、雌の７～８週齢の野生型ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。ラットに麻酔をかけ、処置の前に、０．５ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンＳＲを皮下に、そして０．５％のプロパラカイン塩酸塩を左眼に１滴投与した。
角膜損傷
直径４ｍｍの１ＮのＮａＯＨ飽和濾紙を角膜の中央部に１分間適用し、続いて１００ｍＬの滅菌生理食塩水ですすぐことによって、アルカリ熱傷を行った。
増殖因子投与及び角膜創傷修復の評価
アルカリ熱傷の直後、白色及びコバルトブルー光条件下で角膜の写真画像を撮影した。蛍光色素を角膜表面に適用して、コバルトブルー光下の上皮欠損領域を評価した。
３１匹のラットを、治療群当たり４～５匹のラットの７つの治療群に分けた。治療群には、陰性対照として滅菌生理食塩水、ヒアルロン酸ゲル（ＤｉｓＣｏＶｉｓｃ）生理食塩水（ＨＡ／ＣＳ）混合物、生理食塩水懸濁液中０．０１％ｅＨＧＦ、生理食塩水懸濁液中０．０１％ＦＧＦ－１アンタゴニスト、生理食塩水懸濁液中０．０２％ｅＨＧＦ－ＦＧＦ－１アンタゴニスト、ＨＡ／ＣＳゲル中０．０２％ｅＨＧＦ－ＦＧＦ－１アンタゴニスト、及び生理食塩水懸濁液中０．０１％ｅＨＧＦ、続いて１％酢酸プレドニゾロンが含まれた。損傷当日に写真を撮影した後、各ラットに、適切な物質の１０μＬの結膜下注射１回及び２０μＬの局所治療を１回施した。各ラットの結膜下治療及び局所治療は、結膜下注射が１０μＬのｅＨＧＦであり、局所治療が２０μＬのｅＨＧＦ、続いて２０μＬの酢酸プレドニゾロンであったステロイド群の場合を除き、同じ物質及び濃度からなった。
写真を毎日撮影し、局所治療を１日１回、合計１４日間施した。損傷後１４日目に、最終的な写真を撮影し、ラットを安楽死させ、眼球除去を行った。上皮欠損の面積は、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いた毎日の写真の検査によって計算した。写真を使用して、角膜の混濁化及び血管新生を評価した。
免疫組織化学
眼球全体の凍結切片を固定した。切片を免疫染色し、共焦点顕微鏡で検査した。
ＲＮＡ単離及びリアルタイムｑＰＣＲ
全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔを使用して単離した。単離したＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。リアルタイムｑＰＣＲを行い、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、アルファ平滑筋アクチンのプライマー。結果を分析し、ＧＡＰＤＨに正規化した。
今後の研究：
機械的角膜損傷モデルにおける操作されたＨＧＦの創傷治癒効果を特徴付け、制御する。リン酸化アッセイを使用して、血管内皮細胞で以前に行ったように、初代培養角膜上皮細胞のＨＧＦ受容体に対するｅＨＧＦの活性を確認及び解明する。8角膜上皮化に対するｅＨＧＦ対ｒＨＧＦ及び全ＭＳＣセクレトームの濃度及び担体依存効果は、インビトロ及び臓器培養に基づく創傷治癒アッセイの両方を通して試験される。重度のドライアイ状態の誘導（別の箇所に記載される確立されたモデルを介して）または機械的デブリードマンモデルの両方の後にインビボで機械的損傷ラット角膜に送達されるヒアルロン酸ベースのゲル担体の有無にかかわらず、ｅＨＧＦを評価し、ｒＨＧＦ及び全ＭＳＣセクレトームの創傷治癒効果に対してその濃度及び担体依存的影響を滴定することが計画される。
アルカリ角膜熱傷モデルにおける瘢痕及び血管新生を予防するために定義されたコンビナトリアル療法を最適化する。抗線維化剤をＨＧＦの栄養効果と組み合わせることにより、ＭＳＣセクレトームの再生効果が再現されると予測される。ＨＧＦ受容体のＨＧＦ媒介性活性化を介して上皮創傷治癒も促進しながら、角膜のアルカリ熱傷後に続く間質線維症及び血管新生を抑制する目的で、ｅＨＧＦは、（ａ）操作されたＦＧＦＲアンタゴニスト、（ｂ）抗ＶＥＧＦ剤ベバシズマブ、または（ｃ）局所ステロイドと組み合わされる。これらの組み合わせを、インビボでアルカリ熱傷ラット角膜に送達されるヒアルロン酸ベースのゲル担体の有無にかかわらず試験し、それらを全ＭＳＣセクレトームの創傷治癒効果と比較することによって、それらの相対比を滴定する。上皮及び間質の完全性ならびに表現型、角膜の透明度、血管新生、及び炎症の臨床的及び組織学的証拠を、治療後の結果尺度として使用する。
実施例７で引用された参考文献：
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１１．Ｓｔｅｅｌｅ ＡＮ，Ｃａｉ Ｌ，Ｔｒｕｏｎｇ ＶＮ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｎａｌｏｇ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｖｉａ ａ ｓｈｅａｒ－ｔｈｉｎｎｉｎｇ ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｐｏｓｔ－ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２０１７；１１４（１０）：２３７９－２３８９．
１２．Ｔｒｉｐａｔｈｉ ＲＣ，Ｋｏｌｌｉ ＳＰ，Ｔｒｉｐａｔｈｉ ＢＪ．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｅｙｅ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ ｉｔｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｕｓｅ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ Ｒｅｓ．１９９０；１９（３）：２２５－２３７．
１３．Ｋａｙ ＥＰ，Ｌｅｅ ＭＳ，Ｓｅｏｎｇ ＧＪ，Ｌｅｅ ＹＧ．ＴＧＦ－βｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｖｉａ ａｎ ａｕｔｏｃｒｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＦＧＦ－２ ｉｎ ｃｏｒｎｅａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｃｕｒｒ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．１９９８；１７（３）：２８６－２９３．
１４．Ｒａｆｉｉ Ｍ，Ｃｈａｐｉｎ Ｍ．Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ａｎｄ ｆｉｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｕｎｍｅｔ ｎｅｅｄ．Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．２０１５；Ｍａｙ．

Claims (33)

  1. 遷延性角膜上皮欠損（ＰＣＥＤ）の治療及び／または予防を必要とする対象においてそれを治療及び／または予防する方法であって、ヒト肝細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）バリアント及びヒト線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ１）バリアントを前記対象に投与し、それによって前記ＰＣＥＤを治療及び／または予防することを含む、前記方法。
  2. 角膜血管新生の治療、低減、及び／または予防を必要とする対象においてそれを治療、低減、及び／または予防する方法であって、ｈＨＧＦバリアント及びＦＧＦバリアントを前記対象に投与し、それによって前記角膜血管新生を治療、低減、及び／または予防することを含む、前記方法。
  3. 前記ＦＧＦ１バリアントが、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸付加、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含み、結果として生じるＦＧＦ１バリアントが、配列番号１の野生型ＦＧＦ１と比較して、増加したタンパク質分解安定性を示す、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記ＦＧＦ１バリアントが、βループまたはＣ末端付近においてアミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸付加、及びそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記ＦＧＦ１バリアントが、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）アンタゴニストである、請求項１～４に記載の方法。
  6. 前記ＦＧＦ１バリアントが、２８位、４０位、４７位、９３位、または１３１位に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１～５に記載の方法。
  7. 前記ＦＧＦ１バリアントが、Ｄ２８Ｎ、Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、Ｌ１３１Ｒ、及びＬ１３１Ｋからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記ＦＧＦ１バリアントが、アミノ酸置換Ｌ１３１Ｒを含む、請求項６に記載の方法。
  9. 前記ＦＧＦ１バリアントが、アミノ酸置換Ｌ１３１Ｋを含む、請求項６に記載の方法。
  10. 前記ＦＧＦ１バリアントが、アミノ酸置換Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｒを含む、請求項６に記載の方法。
  11. 前記ＦＧＦ１バリアントが、アミノ酸置換Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｋを含む、請求項６に記載の方法。
  12. 前記ＦＧＦ１バリアントが、アミノ酸置換Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、及びＬ１３１Ｒを含む、請求項６に記載の方法。
  13. 前記ＦＧＦ１バリアントが、アミノ酸置換Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、及びＬ１３１Ｋを含む、請求項６に記載の方法。
  14. 前記ＦＧＦ１バリアントが、アミノ酸置換Ｄ２８Ｎ、Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、及びＬ１３１Ｒを含む、請求項６に記載の方法。
  15. 前記ＦＧＦ１バリアントが、アミノ酸置換Ｄ２８Ｎ、Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、及びＬ１３１Ｋを含む、請求項６に記載の方法。
  16. 前記ＦＧＦ１バリアントが、アミノ酸置換Ｌ１３１Ａを含まない、請求項６に記載の方法。
  17. 前記ｈＨＧＦが、配列番号８の野生型ｈＨＧＦと比較して、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸付加、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む、請求項１～１６に記載の方法。
  18. 前記ｈＨＧＦバリアントが、６２位、１２７位、１３７位、１７０位、または１９３位に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１～１７に記載の方法。
  19. 前記ｈＨＧＦバリアントが、Ｋ６２Ｅ、Ｎ１２７Ｄ／Ａ／Ｋ／Ｒ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、及びＮ１９３Ｄからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１～１８に記載の方法。
  20. 前記ｈＨＧＦバリアントが、アミノ酸置換Ｋ６２Ｅ、Ｎ１２７Ｄ／Ａ／Ｋ／Ｒ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、及びＮ１９３Ｄを含む、請求項１～１９に記載の方法。
  21. 前記ｈＨＧＦバリアントが、Ｍｅｔのアンタゴニストである、請求項１～２０に記載の方法。
  22. 前記ｈＨＧＦバリアントが、Ｍｅｔのアゴニストである、請求項１～２０に記載の方法。
  23. 前記ｈＨＧＦバリアントが、検出可能な部分、水溶性ポリマー、水不溶性ポリマー、治療部分、標的化部分、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーにコンジュゲートされる、請求項１～２２に記載の方法。
  24. 前記ｈＨＧＦバリアントが、６４位、７７位、９５位、１２５位、１３０位、１３２位、１４２位、１４８位、１５４位、及び１７３位のうちの１つ以上にアミノ酸置換をさらに含む、請求項１～２２に記載の方法。
  25. 前記ｈＨＧＦバリアントが、図４１）に提供される米国特許第９，５５６，２４８号からの配列番号２～２２からなる群から選択される配列を含む、請求項１～２２に記載の方法。
  26. 前記ｈＨＧＦバリアントが、アミノ酸置換Ｋ６２Ｅ、Ｑ９５Ｒ、Ｉ１２５Ｔ、Ｎ１２７Ｄ／Ａ／Ｋ／Ｒ、Ｉ１３０Ｖ、Ｋ１３２Ｎ／Ｒ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、Ｑ１７３Ｒ、及びＮ１９３Ｄを含む、請求項１～２２に記載の方法。
  27. 前記ｈＨＧＦバリアントが、６４位、７７位、１４２位、１４８位、及び１５４位のうちの１つ以上にアミノ酸置換をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記ｈＨＧＦバリアントが、アミノ酸置換Ｋ６２Ｅ、Ｑ９５Ｒ、Ｋ１３２Ｎ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、Ｑ１７３Ｒ、及びＮ１９３Ｄを含む、請求項１～２２に記載の方法。
  29. 前記ｈＨＧＦバリアントが、６４位、７７位、１２５位、１２７位、１３０位、１４２位、１４８位、及び１５４位のうちの１つ以上にアミノ酸置換をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記ｈＨＧＦバリアントが、アミノ酸置換Ｋ６２Ｅ、Ｑ９５Ｒ、Ｎ１２７Ｄ／Ａ／Ｋ／Ｒ、Ｋ１３２Ｎ／Ｒ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１７０Ｅ、Ｑ１７３Ｒ、及びＮ１９３Ｄを含む、請求項１～２２に記載の方法。
  31. 前記ｈＨＧＦバリアントが、６４位、７７位、１２５位、１３０位、１４２位、１４８位、及び１５４位のうちの１つ以上にアミノ酸置換をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記ｈＨＧＦバリアントが、配列番号２～２２からなる群から選択される配列を含む、請求項１～３１に記載の方法。
  33. 前記ＨＧＦバリアントが、アゴニストであり、前記ＦＧＦ１バリアントが、アンタゴニストである、請求項１～３１に記載の方法。
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