JP2022513178A - 受容体アンタゴニストとしての操作された線維芽細胞増殖因子多様体 - Google Patents

受容体アンタゴニストとしての操作された線維芽細胞増殖因子多様体 Download PDF

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Abstract

本発明は、例えば、ヒト線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ１）の多様体を含む、タンパク質分解的に安定な増殖因子多様体についてスクリーニングする方法を提供する。本発明はまた、少なくとも１つのアミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸付加、及びそれらの組み合わせを含むＦＧＦ１多様体を提供し、得られたＦＧＦ１多様体は、野生型ＦＧＦ１と比較して増加したタンパク質分解安定性、ならびに関連する使用を示す。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月０９日に出願された「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｖａｒｉａｎｔｓ Ａｓ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ」と題される米国仮特許出願第６２／７４３，４１４号の優先権を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、ポリペプチド多様体、特に線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の多様体の分野に関する。
ヒト増殖因子は、創傷治癒、組織再生、血管新生、及び腫瘍形成等の多くの複雑なプロセスを編成する上で重要な役割を果たす１～４。したがって、創傷治癒及び再生プロセスを加速させるためのタンパク質治療薬として増殖因子を利用すること、またはがん成長ならびに様々な疾患及び状態における血管新生を阻害することに非常に関心がある５～７。しかしながら、多数の組換え増殖因子が治療薬として開発されてきたにもかかわらず、少数の候補のみが臨床承認を受けるのに十分に有効であった８，９。これは、インビボでの増殖因子の有効半減期が短いことに大きく起因し、これは、それらの一般的に不十分な安定性及び速い血液クリアランスに起因する５，１０。処置増殖因子は、有効であるために、創傷領域内で長期間活性を維持しなければならない。しかしながら、増殖因子は、生理学的温度及びプロテアーゼに曝露されると変性または分解されることができる１１，１２。プロテアーゼ介在性分解に対する耐性は、プラスミン及びメタロプロテイナーゼ等のプロテアーゼが組織リモデリングにおいて特に活性であるため、特に重要であることができる１３。
様々な増殖因子は、それらの熱安定性及びタンパク質分解安定性を改善するために以前に修飾されており、これは、インビトロ機能性アッセイ及びインビボ実験の両方においてそれらの生物活性を増強することが示されている１４～１７。例えば、セリンプロテアーゼ、酸化、及びジペプチジルペプチダーゼＩＶに対してより耐性があるように設計された成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）は、ブタにおける体重増加を誘導する際に野生型ＧＨＲＨよりもより強力であることが見出された１８。しかしながら、これらの構築物の多くは、タンパク質特異的仮説に基づいて合理的に設計され、低スループット態様で試験されている。したがって、改善された安定性を有する新しい増殖因子多様体を生成することは、困難で遅いプロセスであることができる。増加したタンパク質分解安定性を有する操作タンパク質のために、単一変異は、タンパク質分解後の一次配列特異性または質量分析に基づく予測切断部位に直接隣接して作成されることが多い１７，１９。しかしながら、この方法は、特異的プロテアーゼに対するタンパク質分解安定性が多因子であるため、非常に信頼性が低い。第１に、特定のアミノ酸配列の切断におけるプロテアーゼの活性は、切断部位付近の複数のアミノ酸によって大きく影響される。たとえ予測される切断部位（Ｐ１）の直接上流のアミノ酸がプロテアーゼの一次特異性と一致しても、最大で８つのアミノ酸が、切断が特定の部位で発生するかどうか、及びどの速度で切断が発生するかを決定することができる。Ｇｏｓａｌｉａ ｅｔ ａｌ．の刊行物では、正しいＰ１部位の上流の２つのアミノ酸（Ｐ２、Ｐ３）を組み合わせ的に変化させても、ペプチド基質のタンパク質分解切断速度に劇的に影響することがわかる２０。第２に、タンパク質基質のタンパク質分解切断はまた、プロテアーゼの酵素結合ポケットによる切断部位の立体アクセス可能性によって決定される。変異がタンパク質構造にどのように影響を及ぼし得るかを予測するための計算方法が改良されているが、変異がプロテアーゼによる潜在的な切断部位のアクセス可能性をどのように変化させ得るかを予測することは、計算的に高価であり、技術的に困難なままである。したがって、合理的な設計を通じてタンパク質分解安定性を増加させるであろう変異を予測することに厳しい制限がある。タンパク質分解安定性を操作するための容易に適応可能な方法の欠如は、これまでのタンパク質分解安定増殖因子の限られた発達を部分的に説明し得る。
本発明は、タンパク質分解的に安定な増殖因子を操作するための方法を提供することによって、この必要性を満たす。本発明はまた、記載された方法によって生成されたタンパク質分解的に安定なＦＧＦペプチド多様体、ならびにそのようなＦＧＦペプチド多様体の使用を提供する。
本発明は、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸付加、及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのメンバーを含むヒト線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ１）の多様体を提供し、得られたＦＧＦ１多様体は、配列番号１の野生型ＦＧＦ１と比較して増加したタンパク質分解安定性を示す。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体は、βループ内またはＣ末端付近にアミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸付加、及びそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体は、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）アンタゴニストである。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体は、２８位、４０位、４７位、９３位、または１３１位に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体は、Ｄ２８Ｎ、Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、Ｌ１３１Ｒ、及びＬ１３１Ｋからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体はアミノ酸置換Ｌ１３１Ｒを含む。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体はアミノ酸置換Ｌ１３１Ｋを含む。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体はアミノ酸置換Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｒを含む。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体はアミノ酸置換Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｋを含む。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体はアミノ酸置換Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、及びＬ１３１Ｒを含む。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体はアミノ酸置換Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、及びＬ１３１Ｋを含む。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体はアミノ酸置換Ｄ２８Ｎ、Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、及びＬ１３１Ｒを含む。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体はアミノ酸置換Ｄ２８Ｎ、Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、及びＬ１３１Ｋを含む。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体はアミノ酸置換Ｌ１３１Ａを含まない。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体は、検出可能部分、水溶性ポリマー、水不溶性ポリマー、治療部分、標的化部分、及びそれらの組み合わせから選択されるメンバーにコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体は、放射性同位体、パラマグネット、フルオロフォア、及びそれらの組み合わせから選択される検出可能部分にコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体は、診断造影剤である。
本発明はまた、多様体が薬学的に許容される担体と組み合わせてある、請求項１に記載のＦＧＦ１多様体を含む、薬学的製剤を提供する。血管新生を阻害または予防する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１に記載の多様体を投与し、それによって血管新生を予防または阻害することを含む方法。
いくつかの実施形態において、対象は、がんを有する。
いくつかの実施形態において、対象は、眼の新生血管を予防するために処置される。
本発明はまた、処置を必要とする対象においてがんを処置する方法を提供し、本方法は、治療有効量の本明細書に提供されるＦＧＦ１多様体を対象に投与し、それによってがんを処置することを含む。
本発明はまた、対象における腫瘍進行、血管新生、転移、及びそれらの組み合わせから選択されるメンバーであるプロセスを低減させる方法であって、本方法は、プロセスを低下させるのに十分な量の請求項１に記載の多様体を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態において、がんは、大腸、口腔、肝細胞、腎臓、乳房、肺、卵巣、胃、脳、前立腺、及びそれらの組み合わせから選択されるメンバーである。
本発明はまた、本明細書に記載のＦＧＦ１多様体ポリペプチドをコードする核酸を提供する。
本発明はまた、本明細書に記載のＦＧＦ１多様体ポリペプチドをコードする核酸を含み、本明細書に記載のＦＧＦ１多様体ポリペプチドを発現することができる単離細胞を提供する。
本発明はまた、タンパク質分解的に安定な増殖因子多様体をスクリーニングする方法を提供し、本方法は、
ｉ．酵母ディスプレイシステムにおいて増殖因子多様体のライブラリを発現することと、
ｉｉ．関連する増殖因子受容体への酵母ディスプレイ増殖因子多様体の結合活性を測定することによって、ｉ）からの酵母ディスプレイ増殖因子多様体を適切な折り畳みについて試験することと、
ｉｉｉ．ｉｉ）からの酵母ディスプレイ増殖因子多様体を少なくとも１つのプロテアーゼと共にインキュベートすることと、
ｉｖ．野生型増殖因子のプロテアーゼ切断と比較して、ｉｉｉ）からの酵母ディスプレイ増殖因子多様体のプロテアーゼ切断を決定することと、
ｖ．同じプロテアーゼによる野生型増殖因子のプロテアーゼ切断と比較して、少なくとも１つのプロテアーゼに対する減少されたプロテアーゼ切断及び／または増加したタンパク質分解安定性を示すｉｖ）から多様体を選択することであって、選択された増殖因子多様体は、タンパク質分解的に安定な増殖因子多様体である、選択することと、を含む。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのプロテアーゼは、野生型増殖因子を切断することができるプロテアーゼである。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのプロテアーゼは増殖因子を選択的に切断することができ、かつ酵母ディスプレイタンパク質の最小特異的切断を示すか、及び／または非特異的切断を示さない
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのプロテアーゼは、血清、トリプシン、キモトリプシン、及びプラスミンからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのプロテアーゼは血清である。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのプロテアーゼはトリプシンである。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのプロテアーゼはキモトリプシンである。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのプロテアーゼはプラスミンである。
タンパク質分解安定性を操作するための増殖因子の酵母ディスプレイ。目的の増殖因子（ＧＦ）は、２つのジスルフィド結合によって細胞壁タンパク質Ａｇａ１ｐに結合された接着タンパク質Ａｇａ２ｐへの融合体として発現される。プロテアーゼと共にインキュベートすると、切断は、増殖因子内（増殖因子特異的切断）または酵母ディスプレイタンパク質Ａｇａ１ｐまたはＡｇａ２ｐ内（非特異的切断）のいずれかで生じることができる。増殖因子受容体の可溶性Ｆｃ融合体（ＧＦＲ－Ｆｃ）と共にインキュベートした後、蛍光抗体を使用して、ＨＡタグ、ｃ－ｍｙｃタグ、及びＦｃドメインについて染色することができる。ＨＡシグナルは、増殖因子の基礎発現レベル及びプロテアーゼによる非特異的切断を測定するために使用される。Ｃ－ｍｙｃシグナルは、ＧＦ特異的切断を測定するためのＨＡシグナルと併せてある。Ｆｃシグナルは、ＧＦ変性のレベル及びその受容体に対するＧＦの結合親和性を測定するために使用される。 タンパク質分解的に安定な増殖因子変異体のためのＦＡＣＳに基づくスクリーニング方法。増殖因子変異体のライブラリは、ＥＢＹ１００酵母細胞に形質転換され、酵母ディスプレイによって増殖因子をディスプレイするように誘導される。細胞をプロテアーゼと共にインキュベートし、洗浄し、次いで受容体の可溶性Ｆｃ融合体と共にインキュベートする。適切な蛍光抗体で標識した後、フロー活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、低レベルのタンパク質分解切断及び高レベルの可溶性受容体への結合を有する変異体を発現する細胞をゲート化し、収集する。このインキュベーション及び細胞選別プロセスを複数回サイクルして、最大レベルのタンパク質分解安定性を有する変異体を同定する。 ＦＧＦ１の酵母ディスプレイ。（Ａ）ＦＧＦ１は、２つのジスルフィド結合によって細胞壁タンパク質Ａｇａ１ｐに結合される接着タンパク質Ａｇａ２ｐへの融合体として発現される。ＦＧＦＲ１－Ｆｃは、ＦＧＦ１に結合する対応する可溶性受容体である。（Ｂ）ｃ－ｍｙｃタグの蛍光標識は、ＦＧＦ１が酵母の表面上で成功裡に発現されることを示す。（Ｃ）ＦＧＦＲ１のＦｃ融合体は、酵母ディスプレイＦＧＦ１への特異的結合を示す。酵母発現表面ディスプレイＦＧＦ１を、様々な濃度で可溶性ＦＧＦＲ１－Ｆｃと共に３時間インキュベートした。細胞を洗浄し、可溶性ＦＧＦＲ１－Ｆｃについての抗Ｆｃ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８で染色した。酵母細胞への結合に関連する蛍光をフローサイトメトリーによって測定し、プロットした。 胎仔ウシ血清によるタンパク質分解安定性アッセイ。ＦＧＦ１変異体ライブラリをディスプレイする酵母細胞を、異なる濃度の胎仔ウシ血清と共にインキュベートした。細胞を洗浄し、１０ｎＭのＦＧＦＲ１－Ｆｃと共にインキュベートした後、細胞を、ｃ－ｍｙｃについての蛍光抗体及び可溶性受容体のＦｃドメインで染色した。フローサイトメトリーによる分析は、ＦＢＳの濃度を増加させることが、ＦＧＦ１特異的切断シグナル及びＦＧＦＲ１－Ｆｃ結合シグナルに対する影響が比較的少ないことを示す。 トリプシンによるタンパク質分解安定性アッセイ。ＦＧＦ１をディスプレイする酵母細胞を、異なる濃度のトリプシンと共にインキュベートした。細胞を洗浄し、１０ｎＭのＦＧＦＲ１－Ｆｃでインキュベートした後、細胞を、ｃ－ｍｙｃについての蛍光抗体及び可溶性受容体のＦｃドメインで染色した。フローサイトメトリーによる分析は、トリプシンの濃度を増加させることが、酵母ディスプレイタンパク質の切断（減少したｃ－ｍｙｃ）及びＦＧＦＲ１－Ｆｃへの結合の喪失につながることを示す。 キモトリプシンによるタンパク質分解安定性アッセイ。ＦＧＦ１をディスプレイする酵母細胞を、異なる濃度のキモトリプシンと共にインキュベートした。細胞を洗浄し、１０ｎＭのＦＧＦＲ１－Ｆｃと共にインキュベートした後、細胞を、ｃ－ｍｙｃについての蛍光抗体及び可溶性受容体のＦｃドメインで染色した。フローサイトメトリーによる分析は、キモトリプシンの濃度を増加させることが、酵母ディスプレイタンパク質の切断（減少したｃ－ｍｙｃ）及びＦＧＦＲ１－Ｆｃへの結合の喪失につながることを示す。 トリプシンによる酵母ディスプレイタンパク質Ａｇａ１及びＡｇａ２の非特異的切断。ＦＧＦ１をディスプレイする酵母細胞を、異なる濃度のトリプシンと共にインキュベートした。洗浄後、細胞を、ＨＡ及びｃ－ｍｙｃの蛍光抗体で染色した。フローサイトメトリーによる分析は、トリプシンの濃度を増加させることがＨＡシグナルの喪失につながることを示し、これは酵母ディスプレイタンパク質Ａｇａ１及びＡｇａ２の非特異的切断を示す。 トリプシンによる酵母ディスプレイタンパク質Ａｇａ１及びＡｇａ２の非特異的切断。ＦＧＦ１をディスプレイする酵母細胞を、異なる濃度のトリプシンと共にインキュベートした。洗浄後、細胞を、ＨＡ及びｃ－ｍｙｃの蛍光抗体で染色した。フローサイトメトリーによる分析は、トリプシンの濃度を増加させることがＨＡシグナルの喪失につながることを示し、これは酵母ディスプレイタンパク質Ａｇａ１及びＡｇａ２の非特異的切断を示す。 キモトリプシンによるＦＧＦ１特異的切断。ＦＧＦ１をディスプレイする酵母細胞を、異なる濃度のトリプシンと共にインキュベートした。洗浄後、細胞を、ＨＡ及びｃ－ｍｙｃについての蛍光抗体で染色した。フローサイトメトリーによる分析は、キモトリプシンの濃度を増加させることが、ｃ－ｍｙｃシグナルの喪失につながるが、ＨＡシグナルではそうではないことを示し、これはＦＧＦ１特異的切断が生じることを示す。 キモトリプシンによるＦＧＦ１特異的切断。ＦＧＦ１をディスプレイする酵母細胞を、異なる濃度のトリプシンと共にインキュベートした。洗浄後、細胞を、ＨＡ及びｃ－ｍｙｃについての蛍光抗体で染色した。フローサイトメトリーによる分析は、キモトリプシンの濃度を増加させることが、ｃ－ｍｙｃシグナルの喪失につながるが、ＨＡシグナルではそうではないことを示し、これはＦＧＦ１特異的切断が生じることを示す。 プラスミンによるタンパク質分解安定性アッセイ。ＦＧＦ１をディスプレイする酵母細胞を、異なる濃度のプラスミンと共にインキュベートした。洗浄後、細胞を、ＨＡ及びｃ－ｍｙｃについての蛍光抗体で染色した。フローサイトメトリーによる分析は、ＦＧＦ１の濃度依存的切断があることを示す。 プラスミンによるＦＧＦ１特異的切断。ＦＧＦ１をディスプレイする酵母細胞及び酵母ディスプレイタンパク質Ａｇａ１及びＡｇａ２のみを発現する空の対照を、１２５ｎＭのプラスミンと共にインキュベートした。洗浄後、細胞を、ＨＡ及びｃ－ｍｙｃについての蛍光抗体で染色した。フローサイトメトリーによる分析は、プラスミンの濃度を増加させることが、ＦＧＦ１をディスプレイする酵母細胞についてのｃ－ｍｙｃシグナルの喪失につながるが、空の対照を示す酵母細胞についてはそうではないことを示す。これにより、プラスミンによる酵母ディスプレイタンパク質の切断はＦＧＦ１特異的であることが確認される。 野生型ＦＧＦ１及びタンパク質分解的に安定なＰＭ２の分化によるタンパク質分解安定性アッセイの検証。プラスミンは、様々なプラスミン濃度での２日間のインキュベーションの酵母表面ディスプレイによって、野生型ＦＧＦ１とタンパク質分解安定変異体（ＰＭ２）との間の分化を可能にする。これは、プラスミンに基づくスクリーニングが新しいタンパク質分解的に安定な変異体を同定する能力を実証する。 選別１：ＦＧＦＲ１－Ｆｃ結合剤の選択。（Ａ）ＦＧＦＲ１－Ｆｃへの結合剤のスクリーニング方法の概略図。ランダム変異誘発ライブラリを酵母の表面上でのＦＧＦ変異体の発現のために誘導した。細胞を１０ｎＭのＦＧＦＲ１－Ｆｃと共にインキュベートし、洗浄し、次いで発現（α－ｃ－ｍｙｃ）及びＦＧＦＲ１結合（α－ＦＧＦＲ１－Ｆｃ）のための蛍光抗体で染色した。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、高ｃ－ｍｙｃシグナル及び高ＦＧＦＲ１－Ｆｃシグナルを示した細胞について分析及びゲート化した。（Ｂ）ＦＧＦ１についてのＦＡＣＳドットプロットを示す。集団全体から収集した細胞のパーセンテージを、ドットプロット上の描画ゲートの隣に示す。 選別２：ＦＧＦ１特異的切断に対する耐性の選択。（Ａ）選別２のスクリーニング方法の概略図。選別１からの細胞を発現のために誘導し、プラスミンと共にインキュベートした。細胞を洗浄した後、次いで、発現（α－ＨＡ）及びＦＧＦ１特異的切断に対する耐性（α－ｃ－ｍｙｃ）のための蛍光抗体で染色した。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、ＨＡ発現シグナルによって正規化された高ｃ－ｍｙｃシグナルを示した細胞を分析し、ゲート化した。（Ｂ）ＦＡＣＳドットプロットをＦＧＦ１について示す。各ライブラリの選別１からの細胞を、詳細に記載されるように、様々なインキュベーション時間のための様々な濃度のプラスミンでインキュベートした。富化のために細胞のゲーティング及び収集に使用される最終条件を赤色でハイライトする。同じゲートはすべての試験条件に対して描画される。 ペプチドアーティファクトの単離。（Ａ）ＦＧＦ１ 選別２ライブラリの選別のためにＦＡＣＳドットプロットが示される。ＦＧＦ１特異的切断に対する耐性の選択を、選別２と同様の態様で適用した。タンパク質分解切断に対する有意に高い耐性を示した細胞（ｃ－ｍｙｃ）の亜集団の周囲に収集ゲートを描画した。（Ｂ）ゲートから収集した変異体のタンパク質配列を示す。ほとんどは、ランダム変異誘発のアーティファクトであり、ＦＧＦ１に由来しない短いペプチドからなる。 ＦＧＦＲ１－Ｆｃへのペプチドアーティファクトの非結合。細胞表面上でＲＴＴＴＳまたはＨＴＴＳペプチドを発現する酵母細胞を、１０ｎＭのＦＧＦＲ１－Ｆｃと共にインキュベートした。細胞を発現（α－ｃ－ｍｙｃ）及び結合（α－ＦＧＦＲ１－Ｆｃ）のための蛍光抗体で染色した。有意な結合シグナルが検出されなかったことから、ペプチドはＦＧＦＲ１－Ｆｃに結合しないことが示された。 選別３及び４の概略図。前からの細胞を発現のために誘導し、様々な濃度のプラスミンと共にインキュベートし、洗浄し、ＦＧＦＲ１－Ｆｃと共にインキュベートした。最終洗浄後、細胞を次いで、発現（α－ＨＡ）、ＦＧＦ１特異的切断に対する耐性（α－ｃ－ｍｙｃ）、及びＦＧＦＲ１結合（α－ＦＧＦＲ１－Ｆｃ）のための蛍光抗体で染色した。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、ＨＡ発現シグナル及び／または高ＦＧＦＲ１－Ｆｃ結合シグナルによって正規化された高ｃ－ｍｙｃシグナルを示した細胞を分析し、ゲート化した。 選別３：プロテアーゼ耐性についてのＦＧＦＲ１－Ｆｃ結合剤の選択。選別２からの誘導細胞を、示される濃度のプラスミンで１２時間インキュベートした。洗浄後、細胞を１０ｎＭのＦＧＦＲ１－Ｆｃと共にインキュベートした。最終洗浄後、細胞を発現（α－ＨＡ）及びＦＧＦＲ１結合（α－ＦＧＦＲ１－Ｆｃ）のための蛍光抗体で染色した。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、高ＨＡシグナル及び高ＦＧＦＲ１－Ｆｃシグナルを示した細胞について分析及びゲート化した。ＦＧＦ１についてのＦＡＣＳドットプロットを示す。集団全体から収集した細胞のパーセンテージを、ドットプロット上の描画ゲートの隣に示す。下部パネル：１．２５μＭのプラスミンと共に２４時間インキュベートした後、ＦＧＦＲ１－Ｆｃへの結合を保持する。 選別４：プロテアーゼ耐性についてのＦＧＦＲ１－Ｆｃ結合剤の選択。選別３からの誘導細胞を種々の濃度のプラスミンで３６時間インキュベートした。洗浄後、細胞を１０ｎＭのＦＧＦＲ１－Ｆｃと共にインキュベートした。最終洗浄後、細胞を発現（α－ｃ－ｍｙｃ）及びＦＧＦＲ１結合（α－ＦＧＦＲ１－Ｆｃ）のための蛍光抗体で染色した。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、高ｃ－ｍｙｃシグナル及び高ＦＧＦＲ１－Ｆｃシグナルを示した細胞について分析及びゲート化した。ＦＧＦ１についてのＦＡＣＳドットプロットを示す。富化のための細胞のゲート化及び収集に使用される最終条件を赤色でハイライトする。所与のＦＧＦのすべての条件に対して同じゲートが描画される。集団全体から収集した細胞のパーセンテージを、ドットプロット上の描画ゲートの隣に示す。下部パネル：３．７５μＭのプラスミンと共に３６時間インキュベートした後、ＦＧＦＲ１－Ｆｃへの結合を保持する。 ＦＧＦ１構造上のＢＳ４Ｍ１変異（ＰＤＢコード１Ｅ０Ｏ）。タンパク質分解安定性のスクリーニングによって同定される富化変異は、青色でハイライトされる。Ｄ２８Ｎ変異は、６本鎖βバレル構造を安定化させる３つのβヘアピン（赤色でハイライトされる）のうちの１つに位置決定される。Ｌ１３１Ｒ変異は、タンパク質のＣ末端付近に位置決定され、Ｎ末端とＣ末端との間に安定化βヘアピンが欠如している。 可溶性野生型ＦＧＦ１の組換え発現。（Ａ）精製した野生型ＦＧＦ１を、非還元クマシー染色ゲル（左）及びＦＧＦ１に対するウェスタンブロット（右）によって分析した。２つの有意なバンドは、ＦＧＦ１単量体（１９．７ｋＤａ）及び二量体（３９．４ｋＤａ）の存在を示す。（Ｂ）酵母ディスプレイＦＧＦＲ３構築物への特異的結合を観察することによって、ＦＧＦ１の適切な折り畳みを確認する。 ｐＢＡＤベクターにおけるＦＧＦ２の組換え発現。（Ａ）ｐＢＡＤで発現され、精製した野生型ＦＧＦ２－Ｈｉｓを、還元クマシー染色ゲル（左）及びＦＧＦ２に対するウェスタンブロット（右）によって分析した。どちらも、発現したＦＧＦ２による凝集を示す。（Ｂ）ｐＢＡＤで発現されたＦＧＦ２－Ｈｉｓは、酵母ディスプレイＦＧＦＲ３構築物に結合することができない。 ｐＥＴ２８ｂベクターにおけるＦＧＦ２の組換え発現。野生型ＦＧＦ２及びＦＧＦ２変異体（ＢＳ５Ｍ１、ＢＳ５Ｍ３、ＢＳ５Ｍ５）を、ｐＥＴ２８ｂベクター中のスーパーフォルダーＧＦＰとの融合体として発現させた。ｐＢＡＤで発現され、精製された野生型ＦＧＦ２－Ｈｉｓを、ＦＧＦ２に対する還元クマシー染色ゲル（左）及びウェスタンブロット（右）によって分析した。野生型ＦＧＦ２は不十分に発現され、一方、ＦＧＦ２変異体は凝集及び／またはオリゴマー化の徴候を示す。 ｐＥＴ３２ａベクターにおける野生型ＦＧＦ２の組換え発現。（Ａ）ＦＧＦ２は、ｐＥＴ３２ａベクターにおけるチオレドキシンへの融合体として発現された。ＴＥＶで切断し、Ｎｉ－ＮＴＡ及びサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した後、ＦＧＦ２に対してウェスタンブロットによりタンパク質を分析した。ＦＧＦ２（１９．３ｋＤａ）の精製に成功したことを確認した。 プラスミン中のＦＧＦ１ ＷＴ及びＢＳ４Ｍ１のタンパク質分解安定性アッセイ。ＦＧＦ１ ＢＳ４Ｍ１（Ｄ２８Ｎ／Ｌ１３１Ｒ）変異体は、野生型ＦＧＦ１と比較して、プラスミンでより高いタンパク質分解安定性を示す。１００ｎｇのＦＧＦ１を、３７℃で様々なインキュベーション時間のために６００ｎＭのプラスミンと共にインキュベートした。インキュベートした試料を、ＦＧＦ１に対するウェスタンブロットの別個のレーンにかけて、各時点でのタンパク質分解の程度を測定した。赤い矢印によって示されるタンパク質バンドのバンド強度を画像分析によって定量化して、残りのタンパク質の量を測定した。各タンパク質についてｔ＝０の時点でバンド強度を正規化し、プロットした。 プラスミンでのＦＧＦ１ ＷＴ、ＢＳ４Ｍ１、ＰＭ２、及びＰＭ３のタンパク質分解安定性アッセイ。ＢＳ４Ｍ１（Ｄ２８Ｎ、Ｌ１３１Ｒ）からの変異を、ＰＭ２（Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ）からの変異と組み合わせてＰＭ３を作成する。ＰＭ３は、ＢＳ４Ｍ１またはＰＭ２のいずれかと比較して、プラスミンでより高いタンパク質分解安定性を示す。１２５ｎｇのＦＧＦ１を、様々な濃度のプラスミンと共に３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベートした試料を、ＦＧＦ１に対するウェスタンブロットの別個のレーンにかけて、各時点でのタンパク質分解の程度を測定した。赤い矢印によって示されるタンパク質バンドのバンド強度を画像分析によって定量化して、残りのタンパク質の量を測定した。０μＭのプラスミンと共にインキュベートし、プロットした場合、バンド強度を各構築物のタンパク質の量によって正規化した。 トリプシンでのＦＧＦ１ ＷＴ及びＢＳ４Ｍ１のタンパク質分解安定性アッセイ。ＦＧＦ１ ＢＳ４Ｍ１（Ｄ２８Ｎ／Ｌ１３１Ｒ）変異体は、野生型ＦＧＦ１と比較して、トリプシンでより高いタンパク質分解安定性を示す。１００ｎｇのＦＧＦ１を、ＦＧＦ１に対するトリプシンの１：２０モル比で、様々なインキュベーション時間、３７℃でインキュベートした。インキュベートした試料を、ＦＧＦ１に対するウェスタンブロットの別個のレーンにかけてし、各時点でのタンパク質分解の程度を測定した。赤い矢印によって示されるタンパク質バンドのバンド強度を画像分析によって定量化して、残りのタンパク質の量を測定した。バンド強度を、ｔ＝０の時点の各構築物のタンパク質の量によって正規化し、プロットした。 プラスミンでのＦＧＦ１ ＷＴ、ＢＳ４Ｍ１、Ｄ２８Ｎ、及びＬ１３１Ｒのタンパク質分解安定性アッセイ。ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ単一変異体は、ＢＳ４Ｍ１と比較して、そのタンパク質分解安定性の大部分を保持する。ＦＧＦ１ Ｄ２８Ｎ単一変異体は、野生型ＦＧＦ１と比較しても、より低いタンパク質分解安定性を有する。１００ｎｇのＦＧＦ１を、種々の濃度のプラスミンと共に３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベートした試料を、ＦＧＦ１に対するウェスタンブロットの別個のレーンにかけて、各時点でのタンパク質分解の程度を測定した。赤い矢印によって示されるタンパク質バンドのバンド強度を画像分析によって定量化して、残りのタンパク質の量を測定した。０μＭのプラスミンと共にインキュベートし、プロットした場合、バンド強度を各構築物のタンパク質の量によって正規化した。 ＦＧＦ１ ＷＴ、Ｌ１３１Ｒ、Ｌ１３１Ａ、及びＬ１３１Ｋのプラスミンでのタンパク質分解安定性アッセイ。ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｋ単一変異体は、ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒと比較して、そのタンパク質分解安定性の大部分を保持する。ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ａ単一変異体は、野生型ＦＧＦ１と比較しても、より低いタンパク質分解安定性を有する。１００ｎｇのＦＧＦ１を、種々の濃度のプラスミンと共に３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベートした試料を、ＦＧＦ１に対するウェスタンブロットの別個のレーンにかけて、各時点でのタンパク質分解の程度を測定した。赤い矢印によって示されるタンパク質バンドのバンド強度を画像分析によって定量化して、残りのタンパク質の量を測定した。０μＭのプラスミンと共にインキュベートし、プロットした場合、バンド強度を各構築物のタンパク質の量によって正規化した。 ＦＧＦ１野生型及びＬ１３１Ｒ変異体のＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒアッセイ。ＦＧＦ１野生型及びＬ１３１Ｒ変異体の融解温度を３反復で測定し、プロットした。２つのタンパク質の融解温度間に統計的に有意差はなかった。 ＭＤＡ－ＭＢ－２３１培養におけるＦＧＦ１野生型及びＬ１３１Ｒ変異体の安定性。ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体は、野生型ＦＧＦ１と比較して、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１での培養においてより高い安定性を示す。５００ｎｇのＦＧＦ１をＭＤＡ－Ｍｂ－２３１細胞と共に３７℃で様々なインキュベーション時間インキュベートした。インキュベートした試料を濃縮し、ＦＧＦ１に対するウェスタンブロットの別個のレーンにかけて、各時点でのタンパク質分解の程度を測定した。赤い矢印によって示されるタンパク質バンドのバンド強度を画像分析によって定量化して、残りのタンパク質の量を測定した。各タンパク質のｔ＝０の時点のバンド強度を正規化し、プロットした。 ＮＩＨ３Ｔ３ ＥＲＫリン酸化アッセイ。ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体は、野生型ＦＧＦ１によるＮＩＨ３Ｔ３ ＥＲＫリン酸化を阻害する。ＮＩＨ３Ｔ３細胞をＦＧＦ１野生型及び／または様々な濃度のＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体で１５時間刺激した。細胞を溶解し、溶解物をウェスタンブロット上に抗リンＥＲＫで探査した。バンド強度を画像分析によって定量化して、ＦＧＦ経路活性化の程度を測定した。下部パネル：ＮＩＨ３Ｔ３細胞をＦＧＦ１野生型及び／または様々な濃度のＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体で１０時間刺激した。 ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体によるＦＧＦ１刺激ＥＲＫリン酸化の阻害。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、１ｎＭのＦＧＦ１及び様々な濃度のＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒと共にインキュベートした。各条件のＥＲＫリン酸化の程度を、リンＥＲＫに対するウェスタンブロットによって測定する。バンド強度を画像分析により定量化し、ＩＣ５０値を得るようにプロットした。 ＦＧＦ１野生型及びＬ１３１Ｒ変異体のＮＩＨ３Ｔ３細胞への結合。ＨｉｓタグＦＧＦ１ ＷＴ及びＬ１３１Ｒ変異体のＦＧＦＲ発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞への平衡結合滴定。細胞を、様々な濃度の各タンパク質と共に４℃でインキュベートし、Ｈｉｓに対する蛍光抗体で染色して、細胞への結合を定量化した。 ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４配列の例を提供する。 ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４配列の例を提供する。
Ｉ．序論
線維芽細胞増殖因子は、広範なプロセスに関与する細胞シグナル伝達タンパク質のファミリーであり、最も顕著には、正常な発達のための重要な要素である。これらの増殖因子は、一般に、細胞表面受容体を活性化する細胞外起源の全身または局所循環分子として機能する。哺乳類線維芽細胞増殖因子受容体ファミリーは、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、及びＦＧＦＲ４である４つのメンバーを有する。ＦＧＦＲは、３つの細胞外免疫グロブリン型ドメイン（Ｄ１～Ｄ３）、単一スパン膜貫通ドメイン、及び細胞内分割チロシンキナーゼドメインからなる。ＦＧＦは、Ｄ２及びＤ３ドメインと相互作用し、Ｄ３相互作用は主に、リガンド結合特異性の原因となる（以下を参照されたい）。ヘパランスルフェート結合は、Ｄ３ドメインを介して介在される。Ｄ１ドメインとＤ２ドメインとの間に位置決定される酸性アミノ酸の短い伸長は、自己阻害機能を有する。この「酸ボックス」モチーフは、ヘパランスルフェート結合部位と相互作用して、ＦＧＦの非存在下での受容体活性化を防止する。各ＦＧＦＲは、ＦＧＦの特定のサブセットに結合する。同様に、ほとんどのＦＧＦは、いくつかの異なるＦＧＦＲサブタイプに結合することができる。ＦＧＦ１は、７つ全ての異なるＦＧＦＲを活性化することができるため、「ユニバーサルリガンド」と称されることがある。対照的に、ＦＧＦ７（ケラチノサイト増殖因子、ＫＧＦ）は、ＦＧＦＲ２ｂ（ＫＧＦＲ）にのみ結合する。
本発明は、スクリーニングのための酵母ディスプレイプラットフォーム及びフロー活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、タンパク質分解的に安定な増殖因子を操作するための組み合わせ的アプローチのための方法を提供する。ＦＧＦ１をモデル例として使用するスクリーニング方法を設定するプロセスが記載され、例示的なタンパク質分解的に安定な増殖因子を操作するための方法が提供される。本発明はまた、タンパク質分解的に安定なＦＧＦ１変異体の特徴付けを提供する。
ＩＩ．定義
別に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、一般に、本発明が属する分野の当業者によって通常に理解される意味と同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用される命名法、ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学及び核酸化学ならびにハイブリダイゼーションにおける実験手順は、当該技術分野で既知であり、通常に用いられるものである。核酸及びペプチド合成には標準的な技術が使用される。本技術及び手順は、一般に、当該技術分野における従来の方法及び様々な一般的な参考文献（概して、参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａ ｌ ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）に従って行われる。本明細書で使用される命名法、ならびに以下に記載される分析及び合成有機化学の実験手順は、当該技術分野で既知であり、一般に用いられるものである。標準的な技術、またはその修飾は、化学合成及び化学分析に使用される。
用語「ＢＳ４Ｍ１」及び「ＰＭ２」、及び「ＰＭ３」は、（ｉ）ＢＳ４Ｍ１（Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｒ）、（ｉｉ）ＰＭ２（Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ）、及び（ｉｉｉ）ＰＭ３（Ｄ２８Ｎ、Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、Ｌ１３１Ｒ）の置換を有する配列番号１の多様体を指す。ＦＧＦ１：
Figure 2022513178000002
（配列番号１）配列番号１は、プロペプチドを有しないＦＧＦ１配列である（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｂｌａｓｔ／？ａｂｏｕｔ＝Ｐ０５２３０［１６－１５５］＆ｋｅｙ＝Ｃｈａｉｎ＆ｉｄ＝ＰＲＯ＿００００００８９０８）。本明細書に記載される番号付けは、１位である上記の配列の最初のアミノ酸（例えば、Ｆ１、Ｎ２等）に基づく。ＦＧＦ１についての他の番号付けは、番号付け中のプロペプチド配列を含むことができ、これにより、番号付けが１４だけ大きくなるであろう。しかしながら、本明細書における番号付けは配列番号１に基づいており、ＦＧＦ１プロペプチドを含まない。
用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）及びそのポリマーを指す。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の態様で代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別途示されない限り、特定の核酸配列は、その保存的修飾多様体（例えば、縮退コドン置換）、対立遺伝子、オーソログ、ＳＮＰ、及び相補配列、ならびに明示的に示される配列も暗黙的に包含する。具体的には、縮退コドン置換は、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換される配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）、Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）、及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８（１９９４））。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、及び遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと互換的に使用される。さらに、本明細書で使用する場合、本発明のポリペプチド多様体をコードする核酸は、この核酸配列に相補的な核酸配列を含むように定義される。
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味する。それは、コード領域の前後の領域（リーダー及びトレーラー）、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含み得る。
「単離（された）」という用語は、核酸またはタンパク質に適用されるとき、核酸またはタンパク質が、それが天然状態で会合する他の細胞成分を本質的に含まないことを示す。それは、乾燥溶液または水溶液のいずれかにあることができるが、好ましくは均質な状態にある。純度及び均質性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィー等の分析化学技術を使用して決定される。調製物中に存在する卓越する種であるタンパク質は、実質的に精製される。特に、単離遺伝子は、遺伝子に隣接し、目的の遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離される。用語「精製（された）」は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲル中に本質的に１つのバンドを生じることを示す。具体的には、それは、核酸またはタンパク質が少なくとも８５％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、最も好ましくは少なくとも９９％純粋であることを意味する。単離核酸は発現ベクターの成分であることができる。
典型的には、本発明の単離ポリペプチドは、好ましくは範囲として表現される純度レベルを有する。ポリペプチドの純度の範囲の下端は、約６０％、約７０％または約８０％であり、純度範囲の上端は、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約９５％超である。ポリペプチドが約９０％超純粋である場合、その純度もまた、好ましくは範囲として表現される。純度範囲の下端は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％、または約９８％である。純度範囲の上端は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％、または約１００％の純度である。
純度は、任意の技術分野で認識される分析方法（例えば、銀染色ゲル上のバンド強度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、質量分析、または同様の手段）によって決定される。
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の態様で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、ならびに後に修飾されるそれらのアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、及びＯ－ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合したα炭素と同じ基本化学構造を有する化合物を指す。そのような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。「アミノ酸模倣物」は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の態様で機能する化学化合物を指す。
「親水性アミノ酸」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５－１４２の正規化されたコンセンサス疎水性スケールに従って、０未満の疎水性を示すアミノ酸を指す。遺伝子コード親水性アミノ酸としては、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌｙｓ（Ｋ）及びＡｒｇ（Ｒ）が挙げられる。
「酸性アミノ酸」は、７未満の側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を指す。酸性アミノ酸は、典型的には、水素イオンの喪失に起因して、生理学的ｐＨで負荷電側鎖を有する。遺伝子コード酸性アミノ酸には、Ｇｌｕ（Ｅ）及びＡｓｐ（Ｄ）が含まれる。
「塩基性アミノ酸」は、７を超える側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を指す。塩基性アミノ酸は、典型的には、ヒドロニウムイオンとの会合に起因して、生理学的ｐＨで正荷電側鎖を有する。遺伝子コード塩基性アミノ酸としては、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ａｒｇ（Ｒ）及びＬｙｓ（Ｋ）が挙げられる。
「極性アミノ酸」は、生理学的ｐＨで荷電されていないが、２個の原子によって共通に共有される電子の対が１個の原子によってより密接に保持される少なくとも１つの結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸を指す。遺伝子コード極性アミノ酸としては、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｓｅｒ（Ｓ）及びＴｈｒ（Ｔ）が挙げられる。
「疎水性アミノ酸」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，１９８４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５－１４２の正規化されたコンセンサス疎水性スケールに従って、０を超える疎水性を示すアミノ酸を指す。例示的な疎水性アミノ酸としては、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、及びプロリン類似体が挙げられる。
「芳香族アミノ酸」は、少なくとも１つの芳香族または複素芳香族環を有する側鎖を有する疎水性アミノ酸を指す。芳香族または複素芳香族環は、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＣＮ、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－ＮＯ２、－ＮＯ、－ＮＨ２、－ＮＨＲ、－ＮＲＲ、－Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、－Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ等の１つ以上の置換基を含み得、式中、各Ｒは、独立して、（Ｃｌ－Ｃ６）アルキル、置換（Ｃｌ－Ｃ６）アルキル、（Ｃｌ－Ｃ６）アルケニル、置換（Ｃｌ－Ｃ６）アルケニル、（Ｃｌ－Ｃ６）アルキニル、置換（Ｃｌ－Ｃ６）アルキニル、（Ｃ１－Ｃ２１）アリール、置換（Ｃ５－Ｃ２０）アリール、（Ｃ６－Ｃ２６）アルカリル、置換（Ｃ６－Ｃ２６）アルカリル、５～２０員ヘテロアリール、置換５～２０員ヘテロアリール、６～２６員アルクヘテロアリール（ａｌｋｈｅｔｅｒｏａｒｙｌ）、または置換６～２６員アルクヘテロリールである。遺伝子コード芳香族アミノ酸としては、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、及びＴｒｐ（Ｗ）が挙げられる。
「非極性アミノ酸」は、生理学的ｐＨで荷電されておらず、２個の原子によって共通に共有される電子の対が概して２個の原子のそれぞれによって等しく保持される結合を有する側鎖を有する疎水性アミノ酸を指す（すなわち、側鎖は極性ではない）。遺伝子コード非極性アミノ酸としては、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、及びＡｌａ（Ａ）が挙げられる。
「脂肪族アミノ酸」は、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸を指す。遺伝子コード脂肪族アミノ酸としては、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、及びＩｌｅ（Ｉ）が挙げられる。
アミノ酸残基Ｃｙｓ（Ｃ）は、他のＣｙｓ（Ｃ）残基または他のスルホニル含有アミノ酸とジスルフィド架橋を形成することができる点で珍しい。還元遊離ＳＨまたは酸化ジスルフィド架橋形態のいずれかでペプチド中に存在するＣｙｓ（Ｃ）残基（及び－ＳＨ含有側鎖を有する他のアミノ酸）の能力は、Ｃｙｓ（Ｃ）残基がペプチドに正味の疎水性または親水性特性に寄与するかどうかに影響を及ぼす。Ｃｙｓ（Ｃ）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇの正規化されたコンセンサススケール（前掲のＥｉｓｅｎｂｅｒｇ，１９８４）に従って０．２９の疎水性を示すが、本発明の目的のために、Ｃｙｓ（Ｃ）は、上記に定義される一般的な分類にかかわらず、極性親水性アミノ酸として分類されることを理解されたい。
用語「リンカー」は、２つ以上のポリペプチドを共有結合するアミノ酸ポリペプチドスペーサーを指す。リンカーは、１～１５個のアミノ酸残基であることができる。好ましくは、リンカーは、単一のシステイン残基である。リンカーはまた、アミノ酸配列配列番号１ＫＥＳＣＡＫＫＱＲＱＨＭＤＳを有することができる。
当業者には理解されるであろうように、上記定義されたカテゴリは、相互排他的ではない。したがって、２つ以上の物理化学的特性を示す側鎖を有するアミノ酸は、複数のカテゴリに含まれることができる。例えば、Ｔｙｒ（Ｙ）等の極性置換基でさらに置換された芳香族部分を有するアミノ酸側鎖は、芳香族疎水性特性及び極性または親水性特性の両方を示し得、したがって、芳香族カテゴリ及び極性カテゴリの両方に含まれることができる。任意のアミノ酸の適切なカテゴリ化は、特に本明細書に提供される詳細な開示に照らして、当業者には明らかであろう。
「螺旋破壊」アミノ酸と呼ばれるある特定のアミノ酸残基は、螺旋内の内部位置に含有されるとき、α螺旋の構造を破壊する傾向がある。そのようなヘリックス破壊特性を示すアミノ酸残基は、当該技術分野において既知であり（例えば、Ｃｈｏｕ ａｎｄ Ｆａｓｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１－２７６を参照されたい）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、及び潜在的に全てのＤ－アミノ酸（Ｌ－ペプチドに含まれる場合。逆に、Ｄ－ペプチドに含まれる場合、Ｌ－アミノ酸は、螺旋構造を破壊する）、ならびにプロリン類似体を含む。これらのヘリックス破壊アミノ酸残基は、Ｇｌｙ（Ｇ）（以下に考察される）を除いて、上記に定義されるカテゴリに分類されるが、これらの残基は、ヘリックス内の内部位置でアミノ酸残基を置換するために使用されるべきではなく、それらは、ペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端で１～３つのアミノ酸残基を置換するためにのみ使用されるべきである。
上記定義されたカテゴリは、遺伝子コードアミノ酸の観点から例示されているが、アミノ酸置換は、遺伝子コードアミノ酸に限定される必要はなく、ある特定の実施形態において、好ましくは限定されない。実際に、式（Ｉ）の好ましいペプチドの多くは遺伝子非コードアミノ酸を含有する。したがって、天然に存在する遺伝子コードアミノ酸に加えて、式（Ｉ）のコアペプチドにおけるアミノ酸残基は、天然に存在する非コードアミノ酸及び合成アミノ酸で置換され得る。
式（Ｉ）のコアペプチドの有用な置換を提供するある特定の通常に遭遇されるアミノ酸としては、β－アラニン（β－Ａｌａ）及び３－アミノプロピオン酸、２、３－ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、４－アミノ酪酸等の他のオメガ－アミノ酸；α－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε－アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ－アミノバリン酸（Ａｖａ）；Ｎ－メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ－ブチルアラニン（ｔ－ＢｕＡ）；ｔ－ブチルグリシン（ｔ－ＢｕＧ）；Ｎ－メチルリソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ナフチルアラニン（Ｎａｌ）；４－クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４－Ｃｌ）；２－フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（２－Ｆ））；３－フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３－Ｆ））；４－フルオロフェニルグリシン（Ｐｈｅ（４－Ｆ））；ペニシルアミン（Ｐｅｎ）；１／２／３／４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸（Ｔｉｃ）；β－２－チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ－アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）；２，４－ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，３－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；ｐ－アミノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（ｐＮＨ２））；Ｎ－メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）、ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）及びホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、ホモプロリン（ｈＰｒｏ）、Ｎ－メチル化アミノ酸及びペプトイド（Ｎ－置換グリシン）等が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、いくつかの実施形態において、式（Ｉ）のコアペプチド中のアミノ酸プロリンは、アゼチジン－２－カルボキシレート（Ａ２Ｃ）、Ｌ－チアゾリジン－４－カルボン酸、シス－４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン（ＣＨＰ）、３，４－デヒドロプロリン、チオプロリン、及びイソニペコ酸（Ｉｎｐ）を含むがこれらに限定されないプロリン類似体で実証される。
アミノ酸は、本明細書において、通常に知られている３文字記号またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨される１文字記号のいずれかによって参照され得る。同様に、ヌクレオチドは、それらの通常に受け入れられる単一文字コードによって参照され得る。
アミノ酸配列に関して、コード配列中の単一のアミノ酸またはわずかなパーセンテージのアミノ酸を変更、付加もしくは欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失または付加は、「保存的修飾多様体」であり、その変更は、アミノ酸を化学的に同様のアミノ酸で置換するという結果となることを当業者は認識するであろう。機能的に同様のアミノ酸を提供する保存的置換テーブルは、当該技術分野で既知である。そのような保存的修飾多様体は、本発明の多型多様体、種間ホモログ、及び対立遺伝子に加えられ、これらを除外しない。
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）の８つのグループはそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照されたい）。
アミノ酸置換は、概して、アミノ酸側鎖置換基、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズ等の相対的類似性に基づく。前述の特徴のうちの１つ以上を考慮した例示的な置換は、当業者に既知であり、（Ａｌａ：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ）、（Ａｒｇ：Ｌｙｓ）、（Ａｓｎ：Ｇｌｎ、Ｈｉｓ）、（Ａｓｐ：Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ）、（Ｇｌｎ：Ａｓｎ）、（Ｇｌｕ：Ａｓｐ）、（Ｇｌｙ：Ａｌａ）、（Ｈｉｓ：Ａｓｎ、Ｇｌｎ）、（Ｉｌｅ：Ｌｅｕ、Ｖａｌ）、（Ｌｅｕ：Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、（Ｌｙｓ：Ａｒｇ）、（Ｍｅｔ：Ｌｅｕ、Ｔｙｒ）、（Ｓｅｒ：Ｔｈｒ）、（Ｔｈｒ：Ｓｅｒ）、（Ｔｉｐ：Ｔｙｒ）、（Ｔｙｒ：Ｔｒｐ、Ｐｈｅ）、及び（Ｖａｌ：Ｉｌｅ、Ｌｅｕ）を含むがこれらに限定されない（元の残基：例示的な置換）。したがって、本開示の実施形態は、上述のポリペプチドまたはタンパク質の機能的または生物学的等価物を考慮する。特に、本発明の実施形態は、親ポリペプチドと約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び９５％の配列同一性を有する多様体を提供する。様々な実施形態において、本発明は、親ポリペプチド配列の一部、例えば、野生型ＦＧＦ１（配列番号１）を含む野生型増殖因子とこのレベルの同一性を有する多様体を提供する。様々な実施形態において、多様体は、本明細書に定義される親ポリペプチドまたは親ポリペプチド配列の一部、例えば、例えば、野生型ＦＧＦ１（配列番号１）を含む野生型増殖因子と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％配列同一性を有する。
「保存的修飾多様体」は、アミノ酸配列及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的修飾多様体」は、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードするそれらの核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝コードの縮重に起因して、多数の機能的に同一の核酸は、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、及びＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定されるすべての位置において、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載される対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸多様性は、保存的修飾多様性の１つの種である「サイレント多様性」である。ポリペプチドをコードする本明細書の全ての核酸配列は、核酸の全ての可能なサイレント多様性も記載する。当業者は、核酸中の各コドン（通常はメチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常はトリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が修飾されて機能的に同一の分子を得ることができることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント多様性は、各記載の配列において暗黙的である。
「同一性」は、当該技術分野で知られているように、配列を比較することによって決定されるように、２つ以上のポリペプチドまたはタンパク質配列の間の関係である。当該技術分野において、「同一性」はまた、そのような配列の文字列間の一致によって決定される、ポリペプチドまたはタンパク質間の配列相関性の程度を指す。「同一性」は、既知の生物情報的方法によって容易に計算することができる。
「ペプチド」は、単量体がアミノ酸であり、アミド結合を通じて一緒に連結されるポリマーを指す。本発明のペプチドは、サイズ、例えば、２つのアミノ酸から数百または数千のアミノ酸まで変化することができる。より大きなペプチド（例えば、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個または少なくとも５０個のアミノ酸残基）は、代替的に、「ポリペプチド」または「タンパク質」と称される。加えて、非天然アミノ酸、例えば、β－アラニン、フェニルグリシン、ホモアルギニン、及びホモフェニルアラニンも含まれる。遺伝子コードされていないアミノ酸もまた、本発明において使用され得る。さらに、反応性基、グリコシル化配列、ポリマー、治療部分、生体分子等を含むように修飾されたアミノ酸も、本発明で使用され得る。本発明で使用されるアミノ酸の全ては、ｄ異性体またはｌ異性体のいずれかであり得る。Ｌ異性体は、一般に好ましい。加えて、他のペプチド模倣物も本発明において有用である。本明細書で使用される場合、「ペプチド」または「ポリペプチド」は、グリコシル化ペプチド及び非グリコシル化ペプチドまたは「ポリペプチド」の両方を指す。ポリペプチドを発現する系によって不完全にグリコシル化されるポリペプチドも含まれる。一般的なレビューについては、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，ｉｎ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ，ＰＥＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）を参照されたい。
本出願において、アミノ酸残基は、「１」と番号付けされるポリペプチドのＮ末端アミノ酸（例えば、Ｎ末端メチオニン）からのそれらの相対位置に従って番号付けされる（典型的には上付き文字で）。Ｎ末端アミノ酸は、「１」と番号付けされたメチオニン（Ｍ）であり得る。各アミノ酸残基に関連する数は、ポリペプチドのＮ末端がメチオニンなしで開始する場合、Ｎ末端メチオニンの不在を反映するように容易に調整することができる。例示的なポリペプチドのＮ末端は、メチオニンでまたはメチオニンなしで開始することができることが理解される。したがって、アミノ酸リンカーが野生型ポリペプチドのＮ末端に付加される例において、Ｎ末端アミノ酸に隣接する第１のリンカーアミノ酸は、番号－１等である。例えば、リンカーがアミノ酸配列ＫＥＳＣＡＫＫＱＲＱＨＭＤＳ（配列番号２）を有し、Ｓ残基が野生型ポリペプチドのＮ末端アミノ酸に隣接している場合、最もＮ末端のリンカーアミノ酸Ｋは－１４であり、一方、最もＣ末端のリンカーアミノ酸Ｓは－１である。このようにして、野生型ポリペプチド及びリンカー結合野生型ポリペプチド中のアミノ酸の番号付けが保存される。
「親ポリペプチド」という用語は、野生型ポリペプチドを指し、野生型ポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、公的にアクセス可能なタンパク質データベース（例えば、ＥＭＢＬ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ、ＥｘＰａｓｙ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ等）の一部である。
「変異体（ｍｕｔａｎｔ）ポリペプチド」または「ポリペプチド多様体（ｖａｒｉａｎｔ）」または「ミューテイン（ｍｕｔｅｉｎ）」または「多様体（ｖａｒｉａｎｔ）ポリペプチド」という用語は、ポリペプチドの形態を指し、そのアミノ酸配列は、対応する野生型（親）形態、天然に存在する形態、または任意の他の親形態のアミノ酸配列とは異なる。変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドをもたらす１つ以上の変異、例えば、置き換え、挿入、欠失等を含有することができる。
「親ポリペプチドに対応する」という用語（またはこの用語の文法的変形）は、本発明のポリペプチドを説明するために使用され、ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくともアミノ酸多様性の存在によってのみ対応する親ポリペプチドのアミノ酸配列と異なる。典型的には、多様体ポリペプチド及び親ポリペプチドのアミノ酸配列は、高いパーセンテージの同一性を示す。一例において、「親ポリペプチドに対応する」とは、多様体ポリペプチドのアミノ酸配列が、親ポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９８％の同一性を有することを意味する。別の例において、多様体ポリペプチドをコードする核酸配列は、親ポリペプチドをコードする核酸配列に対して少なくとも約５０％の同一性、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、親ポリペプチドは、配列番号１のＦＧＦ１に対応する。
多様性（またはその文法的変形）を含めるための、用語「親ポリペプチドに多様性を導入すること（または付加する等）」（またはその文法的変形）、または「親ポリペプチドを修飾すること」は、親ポリペプチドがそのような変換のための物理的出発物質であることを必ずしも意味するわけではなく、むしろ親ポリペプチドが多様体ポリペプチドを作成するためのガイドアミノ酸配列を提供することを意味する。一例において、「多様体を親ポリペプチドに導入すること」とは、親ポリペプチドの遺伝子を適切な変異を通じて修飾して、多様体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を作成することを意味する。別の例において、「多様体を親ポリペプチドに導入すること」は、得られるポリペプチドが、親ポリペプチド配列をガイドとして使用して理論的に設計されることを意味する。次いで、設計されたポリペプチドは、化学的または他の手段によって生成され得る。
「ライブラリ」という用語は、共通の親ポリペプチドにそれぞれ対応する異なるポリペプチドの集合を指す。ライブラリ内の各ポリペプチド種は、ライブラリの一メンバーと称される。好ましくは、本発明のライブラリは、リードポリペプチドを同定する集団を得るのに十分な数及び多様性を有するポリペプチドの集合を表す。ライブラリは、少なくとも２つの異なるポリペプチドを含む。一実施形態において、ライブラリは、約２～約１００，０００，０００個のメンバーを含む。別の実施形態において、ライブラリは、約１０，０００～約１００，０００，０００個のメンバーを含む。なお別の実施形態において、ライブラリは、約１００，０００～約１００，０００，０００個のメンバーを含む。さらなる実施形態において、ライブラリは、約１，０００，０００～約１００，０００，０００個のメンバーを含む。別の実施形態において、ライブラリは、約１０，０００，０００～約１００，０００，０００個のメンバーを含む。なお別の実施形態において、ライブラリは、１００個を超えるメンバーを含む。
ライブラリのメンバーは、混合物の一部であり得るか、または互いに単離され得る。一例において、ライブラリのメンバーは、任意選択で他の成分を含む混合物の一部である。例えば、少なくとも２つのポリペプチドが細胞培養ブロスのある体積に存在する。別の例において、ライブラリのメンバーはそれぞれ別々に発現され、任意選択で単離される。単離されたポリペプチドは、任意選択で、各ウェルが異なるタイプのポリペプチドを含有するマルチウェルコンテナに含有され得る。別の例において、ライブラリのメンバーはそれぞれ、酵母もしくは細菌細胞、またはファージもしくはウイルス粒子への融合体として発現される。
本明細書で使用される場合、用語「ポリマー修飾基」は、少なくとも１つのポリマー部分（ポリマー）を含む修飾基である。ポリペプチドに添加されるポリマー修飾基は、そのようなポリペプチドの特性、例えば、その生物学的利用能、生物学的活性、または体内でのその半減期を変更することができる。例示的なポリマーとしては、水溶性ポリマー及び水不溶性ポリマーが挙げられる。ポリマー修飾基は、線形または分岐であることができ、ポリ（アルキレングリコール）及びその誘導体等の、１つ以上の独立して選択されるポリマー部分を含むことができる。一例において、ポリマーは天然に存在しない。例示的な実施形態において、ポリマー修飾基は、水溶性ポリマー、例えば、ポリ（エチレングリコール）及びその誘導体（ＰＥＧ、ｍ－ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）及びその誘導体（ＰＰＧ、ｍ－ＰＰＧ）等を含む。好ましい実施形態において、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（プロピレングリコール）は、本質的に均一分散（ｈｏｍｏｄｉｓｐｅｒｓｅ）である分子量を有する。一実施形態において、ポリマー修飾基は、天然に存在する多糖ではない。
本明細書で使用する場合、「標的化部分」という用語は、生体の特定の組織または領域に選択的に局在化する種を指す。局在化は、分子決定基、標的化剤またはコンジュゲートの分子サイズ、イオン相互作用、疎水性相互作用等の特異的認識によって介在される。剤を特定の組織または領域に標的化する他の機構は、当業者に知られている。例示的な標的化部分としては、抗体、抗体断片、トランスフェリン、ＨＳ－グリコタンパク質、凝固因子、血清タンパク質、β－グリコタンパク質、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＥＰＯ等が挙げられる。
本明細書で使用する場合、「Ｆｃ融合体タンパク質」という用語は、本明細書では「Ｆｃ－部分」と呼ばれる免疫グロブリン由来部分と、疾患の処置が意図されるか否かにかかわらず、本明細書では「治療部分」と呼ばれる第２の非免疫グロブリンタンパク質に由来する部分とを含むタンパク質、特に治療タンパク質を包含することを意味する。
本明細書で使用される場合、「治療部分」とは、抗生物質、抗炎症剤、抗腫瘍薬、細胞毒素、及び放射性剤を含むがこれらに限定されない、治療に有用な任意の剤を意味する。「治療部分」は、２つ以上の治療部分が担体、例えば多価剤に結合される構築物である、生体活性剤のプロドラッグを含む。
治療部分はまた、タンパク質及びタンパク質を含む構築物も含む。
本明細書で使用される場合、「抗腫瘍薬」は、を含む、がんと戦うのに有用な任意の剤を意味する。
本明細書で使用される場合、「細胞毒素または細胞毒性剤」は、細胞に有害な任意の剤を意味する。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルキシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、ならびにそれらの類似体または相同体が挙げられる。他の毒素としては、例えば、リシン（ｒｉｃｉｎ）、ＣＣ－１０６５、及び類似体であるデュオカルマイシンが挙げられる。さらに他の毒素としては、ジプテリア毒素、及び蛇毒（例えば、コブラ毒）が挙げられる。
本明細書で使用する場合、「放射性剤」は、腫瘍の診断または破壊に有効な任意の放射性同位体を含む。例としては、インジウム－１１１、コバルト－６０、フッ素－１８、銅－６４、銅－６７、ルテチウム－１７７、またはテクニシウム－９９ｍが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、放射性同位体の混合物を典型的に表すウラン、ラジウム、トリウム等の天然の放射性元素は、放射性剤の好適な例である。金属イオンは典型的には、有機キレート部分でキレートされる。放射性剤または放射性核種は、造影剤の成分であることができる。
近赤外線色素はまた、光学造影用途のための標準的な化学を使用してコンジュゲートすることもできる。「近赤外線」とは、可視光に関連する部分に隣接する電磁スペクトルの部分、例えば約０．７μｍ～約１μｍにおける放射を指す。近赤外線色素としては、例えば、Ｃｙ５．５等のシアニンまたはインドシアニン誘導体が挙げられ得る。赤外線色素はまた、ホスホラミダイト色素、例えば、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００（ＬＩ－ＣＯＲ（登録商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含み得る。
多くの有用なキレート基、クラウンエーテル、クリプタン等が当該技術分野で既知であり、本発明の化合物に組み込まれ得る（例えばＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＮＴＡ、ＨＤＴＡ等、及びそれらのホスホネート類似体、例えばＤＴＰＰ、ＥＤＴＰ、ＨＤＴＰ、ＮＴＰ等）。例えば、Ｐｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｒｏｎ Ｏｖｅｒｌｏａｄ，”Ｉｎ，ＩＮＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＩＮ ＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＥＤＩＣＩＮＥ；Ｍａｒｔｅｌｌ，Ｅｄ．；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８０，ｐｐ．２７９－３１２、Ｌｉｎｄｏｙ，ＴＨＥ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＭＡＣＲＯＣＹＣＬＩＣ ＬＩＧＡＮＤ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９８９、Ｄｕｇａｓ，ＢＩＯＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９、及びそれらに含まれる参照文献を参照されたい。加えて、キレート剤、クラウンエーテル、及びシクロデキストリンの他の分子への結合を可能にする経路のマニホールドは、当業者に利用可能である。例えば、Ｍｅａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｃｈｅｌａｔｅ－Ｔａｇｇｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．”Ｉｎ，ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ：ＦＯＯＤ，ＮＵＴＲＩＴＩＯＮＡＬ，ＡＮＤ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＡＳＰＥＣＴＳ”、Ｆｅｅｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８２，ｐｐ．３７０－３８７、Ｋａｓｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，９：１０８－１１７（１９９８）、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，８：２４９－２５５（１９９７）を参照されたい。これらの金属結合剤を使用して、造影様式で検出可能な金属イオンを結合することができる。
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、コンジュゲートと組み合わせたときに、コンジュゲートの活性を保持し、対象の免疫系と非反応性である任意の物質を含む。「薬学的に許容される担体」には、ビヒクル、希釈剤、及び溶媒等の固体及び液体が含まれる。例としては、リン酸緩衝生理食塩水、水等の標準的な薬学的担体、油／水エマルション等のエマルション、及び様々なタイプの湿潤剤のうちの任意のものが挙げられるが、これらに限定されない。他の担体はまた、滅菌溶液、コーティングされた錠剤を含む錠剤及びカプセルを含み得る。典型的には、そのような担体は、デンプン、ミルク、砂糖、特定の種類の粘土、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、ステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム、タルク、植物性脂肪または油、ガム、グリコール、または他の既知の賦形剤等の賦形剤を含む。そのような担体はまた、着香及び着色添加剤または他の成分を含み得る。そのような担体を含む組成物は、既知の従来の方法によって製剤化される。
本明細書で使用する場合、「投与すること」とは、経口投与、座薬としての投与、局所接触、静脈内、腹腔内、筋肉内、くも膜下腔内、病巣内、もしくは皮下投与、吸入による投与、または対象への徐放性デバイス、例えば、ミニ浸透性ポンプの移植を意味する。投与は、非経口及び経粘膜（例えば、経口、経鼻、膣、直腸、または経皮）を含む任意の経路により、特に吸入による。非経口投与としては、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、皮下、腹腔内、心室内、及び頭蓋内が挙げられる。さらに、注射が腫瘍を処置する、例えば、アポトーシスを誘導すべき場合、投与は、腫瘍に直接及び／または腫瘍を取り囲む組織に行われ得る。他の送達様式としては、リポソーム製剤、静脈内注入、経皮パッチ等の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
「改善すること」または「改善する」という用語は、症状の軽減、寛解もしくは減少、または患者の心身の健康の改善等の任意の客観的または主観的パラメータを含む、病理学または病態の処置における成功の任意の指標を指す。症状の改善は、身体検査及び／または精神科的評価の結果を含む、客観的または主観的パラメータに基づくことができる。
「治療」という用語は、疾患への素因を有し得るが、疾患の症状をまだ経験または示さない対象（例えば、ヒト）において疾患または病態が発生するのを予防すること（予防的処置）、疾患を阻害すること（その発症を遅延または停止させる）、疾患の症状または副作用からの緩和を提供すること（緩和的処置を含む）、及び疾患を緩和すること（疾患の退縮を引き起こす）を含む、疾患または病態の「処置すること」または「処置」を指す。
「有効量」、もしくは「に有効な量」、もしくは「治療有効量」という用語は、または任意の文法上等価な用語は、疾患を処置するために動物またはヒトに投与する場合、その疾患の処置をもたらすのに十分である量を意味する。有効量は、例えば、アポトーシス、細胞周期開始、及び／またはシグナル伝達を含む、細胞応答を引き起こすのに必要な量も指し得る。
「薬学的に許容される塩」という用語は、本明細書に記載の化合物上に見出される特定の置換基に応じて、比較的非毒性の酸または塩基で調製される活性化合物の塩を含む。本発明の化合物が比較的酸性の官能基を含有する場合、塩基付加塩は、そのような化合物の中性形態を、整然とするか、または好適な不活性溶媒中で、十分な量の所望の塩基と、接触させることによって得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩の例としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、もしくはマグネシウム塩、または同様の塩が挙げられる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能基を含有する場合、酸付加塩は、そのような化合物の中性形態を、整然とするか、または好適な不活性溶媒中で、十分な量の所望の酸と、接触させることによって得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、モノヒドロゲンカルボン酸、リン酸、単水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、単水素硫酸、芳香族、またはリン酸等の無機酸、ならびに酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、亜エリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸等の比較的無毒な有機酸に由来する塩が挙げられる。また、アルギン酸等のアミノ酸の塩、及びグルクロン酸またはガラクツン酸等の有機酸の塩も含まれる（例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６：１－１９（１９７７）を参照されたい）。本発明のある特定の化合物は、化合物を塩基または酸付加塩のいずれかに変換することを可能にする塩基性官能基及び酸性官能基の両方を含有する。
化合物の中性形態は、塩を塩基または酸と接触させ、従来の態様で親化合物を単離することによって、好ましくは再生される。化合物の親形態は、極性溶媒中の溶解度等のある特定の物理的特性における様々な塩形態とは異なるが、そうでなければ、塩は、本発明の目的のための化合物の親形態と同等である。
本発明の化合物は、そのような化合物を構成する原子のうちの１個以上において、非天然な割合の原子同位体も含有し得る。例えば、化合物は、トリチウム（３Ｈ）、ヨウ素－１２５（１２５Ｉ）または炭素－１４（１４Ｃ）等の放射性同位体で放射標識され得る。放射性であるか否かに関わらず、本発明の化合物の全ての同位体変形形態は、本発明の範囲内に包含されることが意図される。
本明細書で使用する場合、「反応性官能基」は、オレフィン、アセチレン、アルコール、フェノール、エーテル、酸化物、ハロゲン化物、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、シアネート、イソシアネート、チオシアネート、イソチオシアネート、アミン、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドラジド、ジアゾニウム、ニトロ、ニトリル、メルカプタン、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルホン酸、スルフィン酸、アセタール、ケタール、無水物、スルフェート、スルフェニン酸イソニトリル、アミジン、イミド、イミデート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オルトエステル、スルファイト、エナミン、イナミン、尿素、プソウレア、セミカルバジド、カルバメート、イミジン、アゾ化合物、オキシアゾ化合物、及びニトロ化合物を含むがこれらに限定されない基を指す。反応性官能基には、バイオコンジュゲート、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミド等を調製するために使用されるものも含まれる。これらの官能基のそれぞれを調製するための方法は、当該技術分野で既知であり、特定の目的のためのそれらの適用または修飾は、当業者の能力の範囲内である（例えば、Ｓａｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｏ，ｅｄｓ．ＯＲＧＡＮＩＣ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＧＲＯＵＰ ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９８９を参照されたい）。
ＩＩＩ．多様体
いくつかの実施形態において、多様体は、野生型増殖因子と比較してタンパク質分解的に安定な多様体である。例示的な実施形態において、多様体は、野生型と比較して増加したタンパク質分解安定性を示す。いくつかの実施形態において、多様体は野生型増殖因子の任意の多様体である。いくつかの実施形態において、多様体は、野生型増殖因子が結合する増殖因子受容体のアンタゴニストである。
いくつかの実施形態において、多様体は、ＦＧＦ１の多様体である。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸付加、及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのメンバーを含むヒト線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ１）の多様体が提供される。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸付加、及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのメンバーを含むヒト線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ１）の多様体が提供され、得られるＦＧＦ１多様体は、配列番号１の野生型ＦＧＦ１と比較して増加したタンパク質分解安定性を示す。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体は、βループに、またはＣ末端付近にアミノ酸の置換、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、及びそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体は、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）アンタゴニストである。本発明は、このアミノ酸が親ＦＧＦ１ポリペプチド（野生型、配列番号１）に見出されない少なくとも１つの位置に少なくとも１つのアミノ酸を含むＦＧＦ１ポリペプチドを提供する。
Figure 2022513178000003
（配列番号１）
いくつかの実施形態において、配列番号１のＦＧＦ１多様体は、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体は、２８位、４０位、４７位、９３位、または１３１位に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体は、Ｄ２８Ｎ、Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、Ｌ１３１Ｒ、及びＬ１３１Ｋからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体はアミノ酸置換Ｌ１３１Ｒを含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体はアミノ酸置換Ｌ１３１Ｋを含む。いくつかの実施形態において、多様体はアミノ酸置換Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｒを含む。いくつかの実施形態において、多様体はアミノ酸置換Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｋを含む。いくつかの実施形態において、多様体はアミノ酸置換Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、及びＬ１３１Ｒを含む。いくつかの実施形態において、多様体はアミノ酸置換Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、及びＬ１３１Ｋを含む。いくつかの実施形態において、多様体はアミノ酸置換Ｄ２８Ｎ、Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、及びＬ１３１Ｒを含む。いくつかの実施形態において、多様体はアミノ酸置換Ｄ２８Ｎ、Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、及びＬ１３１Ｋを含む。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体はアミノ酸置換Ｌ１３１Ａを含まない。
いくつかの実施形態において、多様体ＦＧＦ１はＢＳ４Ｍ１（Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｒ）多様体と称される多様体である。いくつかの実施形態において、ＢＳ４Ｍ１は、
Figure 2022513178000004
（配列番号２）の配列を含む。
いくつかの実施形態において、多様体ＦＧＦ１はＰＭ２（Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ）と称される多様体である。いくつかの実施形態において、ＰＭ２は、
Figure 2022513178000005
 （配列番号３）の配列を含む。
いくつかの実施形態において、多様体ＦＧＦ１はＰＭ３（Ｄ２８Ｎ、Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、Ｌ１３１Ｒ）と称される多様体である。いくつかの実施形態において、ＰＭ３は、
Figure 2022513178000006
（配列番号４）の配列を含む。
いくつかの実施形態において、多様体ＦＧＦ１は、
Figure 2022513178000007
（配列番号５）の配列を含む。
いくつかの実施形態において、多様体ＦＧＦ１は、
Figure 2022513178000008
（配列番号６）の配列を含む。
いくつかの実施形態において、多様体は単離多様体である。いくつかの実施形態において、多様体は、本ポリペプチドに存在しない少なくとも１つの望ましい特徴を示す。例示的な特徴としては、タンパク質分解安定性の増加、熱安定性の増加、立体配座柔軟性の増加または減少、及びアンタゴニスト活性の増加が挙げられるが、これらに限定されない。当業者には理解されるように、多様体は、これらの改善された特徴のうちの２つ以上の任意の組み合わせを示し得る。
いくつかの実施形態において、多様体ＦＧＦ１は、ＦＧＦＲ受容体のアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６からなる群から選択される配列を有する。
いくつかの実施形態において、増殖因子多様体は、親ポリペプチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、本発明の増殖因子多様体は、親ポリペプチドと少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．６％、または少なくとも約９９．８％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体は、親ポリペプチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、本発明のＦＧＦ１多様体は、親ポリペプチドと少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．６％、または少なくとも約９９．８％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態において、変異される配列番号１の位置は、２８、４０、４７、９３、または１３１位のうちの１つ以上を含む。当業者が理解するように、これらの位置の任意の組み合わせを変異させることができる。
いくつかの実施形態において、２８位にある親ポリペプチドのアミノ酸は、野生型ＦＧＦ１（例えば、配列番号と比較して、Ｎに変更される。
いくつかの実施形態において、４０位の親ポリペプチドのアミノ酸は、Ｐに変更される。
いくつかの実施形態において、４７位の親ポリペプチドのアミノ酸は、Ｉに変更される。
いくつかの実施形態において、９３位の親ポリペプチドのアミノ酸は、Ｇに改変される。
いくつかの実施形態において、１３１位の親ポリペプチドのアミノ酸は、Ｒに変更される。いくつかの実施形態において、１３１位の親ポリペプチドのアミノ酸は、Ｋに変更される。
ａ．コンジュゲート
本発明は、１つ以上のコンジュゲーションパートナーとの本発明の多様体のコンジュゲートを提供する。例示的なコンジュゲーションパートナーとしては、ポリマー、標的化剤、治療剤、細胞毒性剤、キレート剤、及び検出可能な薬剤が挙げられる。当業者は、これらの非限定的な剤カテゴリの間に重複があることを認識するであろう。
コンジュゲーションパートナーまたは「修飾基」は、任意のコンジュゲート可能な部分であることができる。例示的な修飾基を以下に考察する。修飾基は、所与のポリペプチドの特性（例えば、生物学的または物理化学的特性）を変化させる能力について選択することができる。修飾基の使用によって変更され得る例示的なポリペプチド特性としては、薬物動態学、薬物力学、代謝安定性、生体分布、水溶性、親油性、組織標的化能力、及び治療活性プロファイルが挙げられるが、これらに限定されない。修飾基は、診断用途またはインビトロバイオアッセイ系における使用のポリペプチドの修飾に有用である。
いくつかの実施形態において、例えば、本明細書に記載されるＦＧＦ１多様体を含む増殖因子多様体は、Ｆｃ部分と組み合わされる。Ｆｃ部分は、好ましくはＩｇＧであるヒトまたは動物免疫グロブリン（Ｉｇ）に由来し得る。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４であり得る（例えば図３４を参照されたい）。Ｆｃ部分は、好ましくはＩｇＧである免疫グロブリンの重鎖に由来することも好ましい。より好ましくは、Ｆｃ部分は、免疫グロブリンの重鎖定常領域の、例えばドメイン等の一部分を含む。そのようなＩｇ定常領域は好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインのいずれか、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのＩｇ定常ドメインを含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は少なくともＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。Ｆｃ部分はＩｇＧヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むことがさらに好ましい。
Figure 2022513178000009
Figure 2022513178000010
ＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインは、血清タンパク質のいずれかのうちでＩｇＧ１は最も長い血清半減期を有するため、Ｆｃ部分としてしばしば使用される。長い血清半減期は、動物研究及び潜在的なヒト治療用途に望ましいタンパク質特性であることができる。加えて、ＩｇＧ１サブクラスは、抗体介在エフェクター機能を実行する最も強い能力を保有する。
融合タンパク質において最も有用であり得る一次エフェクター機能は、ＩｇＧ１抗体が抗体依存性細胞毒性を介在する能力である。他方では、これは主にアンタゴニストとして機能する融合タンパク質にとって望ましくない機能であり得る。ＩｇＧ１サブクラスにおける抗体定常領域介在活性に重要であるいくつかの特定のアミノ酸残基が同定されている。したがって、これらの特異的アミノ酸の包含または除外は、特異的免疫グロブリン定常領域介在活性の包含または除外を可能にする。
本発明に従うと、Ｆｃ部分はまた、エフェクター機能を調節するために修飾され得る。例えば、ＥＵインデックス位置（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１）にしたがってＴ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ；Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ＋Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ；Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／ＡΔ２３６＋Ａ３２７Ｇ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ；Ｅ３３３Ａ；Ｋ３２２ＡのＦｃ変異を、Ｆｃ部分がＩｇＧ１に由来する場合に導入することができる。
さらなるＦｃ変異は、例えば、３３０、３３１、２３４、もしくは２３５位、またはこれらの組み合わせから選択されるＥＵインデックス位置での置換であり得る。ＣＨ２ドメインに位置決定される２９７ＥＵインデックス位におけるアミノ酸置換はまた、本発明の文脈におけるＦｃ部分に導入され、Ｎ結合炭水化物結合の潜在的部位を排除し得る。２２０ＥＵインデックス位におけるシステイン残基も置き換えられ得る。
本発明のＦｃ融合タンパク質は、単量体または二量体であり得る。Ｆｃ融合タンパク質はまた、二量体Ｆｃ部分（例えば、２つのジスルフィド架橋ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３構築物の二量体）を含有する「擬似二量体」であり得、そのうちの１つのみが治療部分と融合される。
Ｆｃ融合タンパク質はまた、２つの異なる治療部分を含有するヘテロ二量体、または単一の治療部分の２コピーを含有するホモ二量体であり得る。
いくつかの実施形態において、例えばＦＧＦ１多様体を含む、本明細書に記載される増殖因子多様体のインビボ半減期は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分で増強されることができる。ＰＥＧによるポリペプチドの化学修飾（ＰＥＧ化）は、それらの分子サイズを増加させ、典型的には、表面及び官能基のアクセス可能性を低下させ、それらの各々は、ポリペプチドに結合したＰＥＧ部分の数及びサイズに依存する。しばしば、この修飾は、血漿半減期及びタンパク質分解安定性の改善、ならびに免疫原性及び肝取り込みの減少という結果となる（Ｃｈａｆｆｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１６４３－１６５１（１９９２）、Ｐｙａｔａｋ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｃｈｅｍ．Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：１１３－１２７（１９８０））。例えば、インターロイキン－２のＰＥＧ化は、インビボでその抗腫瘍効力を増加させることが報告されており（Ｋａｔｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：１４８７－１４９１（１９８７））、モノクローナル抗体Ａ７に由来するＦ（ａｂ’）２のＰＥＧ化は、改善されたその腫瘍局在性を有する（Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８：１３８７－１３９４（１９９０））。したがって、別の実施形態において、本発明の方法によってＰＥＧ部分で誘導体化されたポリペプチドのインビボ半減期は、非誘導体化親ポリペプチドのインビボ半減期と比較して増加する。
ポリペプチドインビボ半減期の増加は、親ポリペプチドに対するパーセント増加の範囲として最適に表現される。パーセント増加の範囲の下端は、約４０％、約６０％、約８０％、約１００％、約１５０％または約２００％である。範囲の上端は、約６０％、約８０％、約１００％、約１５０％、または約２５０％超である。
多くの水溶性ポリマーが当業者に既知であり、本発明の実施に有用である。用語「水溶性ポリマー」は、糖（例えば、デキストラン、アミロース、ヒアルロン酸、ポリ（シアル酸）、ヘパラン、ヘパリン等）；ポリ（アミノ酸）、例えば、ポリ（アスパラギン酸）及びポリ（グルタミン酸）；核酸；合成ポリマー（例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エーテル）、例えば、ポリ（エチレングリコール）；ペプチド、タンパク質等の種を包含する。本発明は、ポリマーがコンジュゲートの残りが結合することができる点を含む必要があるという唯一の限定を有する任意の水溶性ポリマーで実施し得る。例えば、Ｈａｒｒｉｓ，Ｍａｃｒｏｎｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃ２５：３２５－３７３（１９８５）、Ｓｃｏｕｔｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １３５：３０－６５（１９８７）、Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８６６－８７４（１９９２）、Ｄｅｌｇａｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ９：２４９－３０４（１９９２）、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６：１５０－１６５（１９９５）、及びＢｈａｄｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，５７：５－２９（２００２）を参照されたい。
別の実施形態において、上記で考察したものと同様に、修飾糖は、水溶性ポリマーではなく水不溶性ポリマーを含む。本発明のコンジュゲートはまた、１つ以上の水不溶性ポリマーを含み得る。本発明のこの実施形態は、制御された態様で治療ポリペプチドを送達するビヒクルとしてのコンジュゲートの使用によって例示される。ポリマー薬物送達系は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｄｕｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ ＤＲＵＧＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｖｏｌ．４６９，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９９１を参照されたい。当業者は、実質的に任意の既知の薬物送達系が本発明のコンジュゲートに適用可能であることを理解するであろう。
代表的な水不溶性ポリマーとしては、ポリホスファジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリハロゲン化物、ポリビニルピロリドン、ポリグリコライド、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ビニルアセテート）、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、プルロニック（登録商標）、及びポリビニルフェノールならびにそれらのコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のコンジュゲートに使用される代表的な生分解性ポリマーとしては、ポリラクチド、ポリグリコリド及びそのコポリマー、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酪酸）、ポリ（バレル酸）、ポリ（ラクチド－コ－カプロラクトン）、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ブレンド及びそのコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。コラーゲン、プルロニクス等を含む組成物等のゲルを形成する組成物は、特に有用である。
例示的な吸収性ポリマーとしては、例えば、ポリ（α－ヒドロキシ－カルボン酸）／ポリ（オキシアルキレン、（Ｃｏｈｎ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，８２６，９４５号を参照されたい）の合成的に製造される吸収性ブロックコポリマーが挙げられる。これらのコポリマーは架橋されておらず、水溶性であり、その結果、本体は分解ブロックコポリマー組成物を排出することができる。Ｙｏｕｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２１：１３０１－１３１６（１９８７）、及びＣｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２２：９９３－１００９（１９８８）を参照されたい。
ハイドロゲルの成分であるポリマーもまた、本発明において有用である。ハイドロゲルは、比較的大量の水を吸収することが可能な高分子材料である。ハイドロゲル形成化合物の例としては、ポリアクリル酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリジン、ゼラチン、カラギーナン、及び他の多糖類、ヒドロキシエチレンメタクリル酸（ＨＥＭＡ）、ならびにそれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。安定、生分解性、及び生体吸収性であるハイドロゲルを製造することができる。さらに、ハイドロゲル組成物は、これらの特性のうちの１つ以上を示すサブユニットを含むことができる。
別の実施形態において、ゲルは熱可逆性ゲルである。プルロニクス、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、多糖類、ポリウレタンハイドロゲル、ポリウレタン－ウレアハイドロゲル等の成分を含む熱可逆性ゲル、及びそれらの組み合わせが現在好ましい。
さらに別の例示的な実施形態において、本発明のコンジュゲートは、リポソームの成分を含む。リポソームは、例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．の、１９８５年６月１１日に発行された米国特許第４，５２２，８１１号に記載された当業者に既知の方法に従って調製されることができる。例えば、リポソーム製剤は、適切な脂質（複数可）（ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリン、及びコレステロール等）を無機溶媒中に溶解させ、その後蒸発させ、容器表面上に乾燥脂質の薄膜を残すことによって調製され得る。次いで、活性化合物またはその薬学的に許容される塩の水溶液が容器中に導入される。次いで、容器を手で旋回させて、容器の側面から脂質材料を遊離させ、脂質凝集体を分散させ、それによってリポソーム懸濁液を形成する。
本発明はまた、ポリペプチドが治療部分、診断部分、標的化部分、毒素部分等にコンジュゲートされる上述のものに類似するコンジュゲートを提供する。上述の部分のそれぞれは、小分子、天然ポリマー（例えば、ポリペプチド）または合成ポリマーであり得る。
様々な実施形態において、多様体は、組織再生のためのマトリックスの成分にコンジュゲートされる。例示的なマトリックスは当該技術分野で既知であり、当業者が、例えばＦＧＦ１多様体を含む、本発明の増殖因子多様体との適切なマトリックスを選択及び修正する能力の範囲内である。例えば、ＦＧＦ１多様体を含む、本発明の増殖因子多様体は、一般に、例えば、眼、肝臓、筋肉、神経及び心臓組織の再生を含む再生医療用途で使用される。
いくつかの実施形態において、本発明は、コンジュゲートの成分としての標的化剤の存在に起因して、特定の組織内で選択的に局在化するコンジュゲートを提供する。例示的な実施形態において、標的化剤は、タンパク質である。例示的なタンパク質としては、トランスフェリン（脳、血液プール）、ＨＳ－グリコタンパク質（骨、脳、血液プール）、抗体（脳、抗体特異的抗原を有する組織、血液プール）、凝固因子Ｖ－ＸＩＩ（損傷組織、凝固、がん、血液プール）、血清タンパク質、例えばα－酸糖タンパク質、フェチュイン、α－胎仔タンパク質（脳、血液プール）、β２－糖タンパク質（肝臓、アテローム性動脈硬化プラーク、脳、血液プール）、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、及びＥＰＯ（免疫刺激、がん、血液プール、赤血球過剰産生、神経保護）、アルブミン（半減期の増加）、ＩＬ－２、及びＩＦＮ－αが挙げられる。
別の実施形態において、本発明は、例えば、ＦＧＦ１多様体を含む、本発明の増殖因子多様体と治療部分との間のコンジュゲートを提供する。本発明の実施において有用である治療部分としては、様々な薬理活性を有する広範な薬物クラスからの薬物が挙げられる。治療及び診断剤を種々の他の種にコンジュゲートする方法は、当業者に既知である。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９６、及びＤｕｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ ＤＲＵＧＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｖｏｌ．４６９，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９９１を参照されたい。
有用な治療部分のクラスとしては、例えば、抗腫瘍薬（例えば、抗アンドロゲン（例えば、ロイプロリドまたはフルタミド）、殺細胞薬（例えば、アドリアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、シクロホスファミド、ブスルファン、シスプラチン、β－２－インターフェロン）、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）、抗代謝薬（例えば、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、チオグアニン）が挙げられる。このクラスには、診断及び治療の両方のための放射性同位体に基づく剤、ならびに例えば、リシン、ゲルダナマイシン、ミタンシン、ＣＣ－１０６５、デュオカルマイシン、クリケアマイシン等のコンジュゲート毒素、ならびにそれらの関連構造と類似体も含まれる。
治療部分はまた、ホルモン（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラジオール、ロイプロリド、メゲストロール、オクトレオチド、またはソマトスタチン）；内分泌調節薬（例えば、避妊薬（例えば、エチノジオール、エチニルエストラジオール、ノルエチンドロン、メストラノール、デソゲストレル、メドロキシプロゲステロン）であることができる。本発明の様々な実施形態で有用であるのは、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベステロール）、グルココルチコイド（例えば、トリアムシノロン、ベタメタゾン等）及びノルエチンドロン、エチノジオール、ノルエチンドロン、レボノルゲストレル等のプロゲストゲン；甲状腺剤（例えば、リオチロニンまたはレボチロキシン）または抗甲状腺剤（例えば、メチマゾール）；抗高プロラクチン薬（例えば、カベルゴリン）；ホルモン抑制剤（例えば、ダナゾールまたはゴセレリン）、オキシトシックス（例えば、メチルエルゴノビンまたはオキシトシン）、ならびに例えば、ミオプロストール、アルプロスタジルまたはジノプロストン等のプロスタグランジンとのコンジュゲートも使用されることができる。
他の有用な修飾基としては、免疫調節薬（例えば、抗ヒスタミン剤、ロドキサミド及び／またはクロモリン等の肥満細胞安定剤、ステロイド（例えば、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、コルチゾン、デキサメタゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベクロメタゾン、またはクロベタゾール）、ヒスタミンＨ２アンタゴニスト（例えば、ファモチジン、シメチジン、ラニチジン）、免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、シクロスポリン）等が挙げられる。スリンダク、エトドラク、ケトプロフェン、及びケトロラック等の抗炎症活性を有する基もまた、有用である。本発明と併せて使用される他の薬物は、当業者には明らかであるであろう。
いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、反応性アミノ酸の反応と反応性コンジュゲーションパートナーとの間の反応によって形成される。反応性アミノ酸及び反応性コンジュゲーションパートナーの両方は、それらのフレームワーク内に１つ以上の反応性官能基を含む。２つの結合種のうちの１つは、「脱離基」（または活性化基）を含み得、これらの部分に言及し、それは、酵素制御求核置換反応において容易に置き換えられるか、または代替的に、求核反応パートナー（例えば、スフヒドリル基を担持するアミノ酸部分）を利用する化学反応において置き換えられる。反応の種類ごとに好適な脱離基を選択することは、当業者の能力の範囲内である。多くの活性化糖が当該技術分野で既知である。例えば、Ｖｏｃａｄｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｅｒｎｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２０００、Ｋｏｄａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３４：６４１９（１９９３）、Ｌｏｕｇｈｅｅｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３７７１７（１９９９）を参照されたい。
様々な実施形態において、天然に存在するＦＧＦ１の多様体（ｔｈｅ ｖａｒｉａｎｔ）（または多様体（ａ ｖａｒｉａｎｔ））であるアミノ酸置換は、コンジュゲーションパートナー、例えば、側鎖アミノ酸、例えば、システイン、リジン、セリン等の結合のための遺伝子座である。
本発明の実施において有用な反応基及び反応のクラスは、一般に、バイオコンジュゲート化学の技術分野において既知のものである。反応性糖部分で利用可能な現在好ましい反応のクラスは、比較的穏やかな条件下で進行するものである。これらには、求核置換（例えば、アミン及びアルコールのアシルハロゲン化物との反応、活性エステル）、求電子置換（例えば、エナミン反応）、ならびに炭素－炭素及び炭素－ヘテロ原子多重結合への付加（例えば、マイケル反応、ディエルス－アルダー添加）が含まれるが、これらに限定されない。これら及び他の有用な反応は、例えば、Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９６、及びＦｅｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ．１９８，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８２において考察される。
ｂ．反応性官能基
反応性アミノ酸または反応性コンジュゲーションパートナー上の有用な反応性官能基としては、
（ａ）カルボキシル基、ならびにＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ－ヒドロキシベンズトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ－ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、及び芳香族エステルを含むがこれらに限定されないその様々な誘導体、
（ｂ）例えばエステル、エーテル、アルデヒド等に変換されることができるヒドロキシル基
（ｃ）ハロアルキル基であって、ハロゲン化物が、後に、例えば、アミン、カルボキシレートアニオン、チオールアニオン、カルバニオン、またはアルコキシドイオン等の求核基で置換され、それによって、ハロゲン原子の官能基における新しい基の共有結合という結果となることができるハロアルキル基、
（ｄ）例えばマレイミド基等のディエルス－アルダー反応に参加することができるジエノフィル基、
（ｅ）アルデヒドまたはケトン基であって、例えばイミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンもしくはオキシム等のカルボニル誘導体の形成を介して、またはグリニャール付加もしくはアルキルリチウム付加等の機構を介して、後続の誘導体化が可能である、アルデヒドまたはケトン基、
（ｆ）例えばスルホンアミドを形成するためのアミンとの後続反応のためのスルホニルハロゲン化物基、
（ｇ）チオール基であって、例えば、ジスルフィドに変換されることができるか、またはアシルハロゲン化物と反応するこができる、チオール基、
（ｈ）例えばアシル化、アルキル化、または酸化されることができるアミンまたはスルフヒドリル基、
（ｉ）アルケンであって、例えば、シクロ付加、アシル化、マイケル付加等を受けることができるアルケン、及び
（ｊ）例えば、アミン及びヒドロキシル化合物と反応することができるエポキシド、を含むがこれらに限定されない。
反応性官能基を選択することができ、その結果、それらは、反応性糖核または修飾基を組み立てるのに必要な反応に参加しない、または干渉しない。代替的には、反応性官能基は、保護基の存在によって反応に参加することから保護されることができる。当業者であれば、特定の官能基を、選択された一連の反応条件に干渉しないように保護する方法を理解する。有用な保護基の例については、例えば、Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ Ｉｎ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１を参照されたい。
ポリペプチド及びコンジュゲーションパートナーを連結する基はまた、架橋基、例えば、ゼロまたは高次架橋基であることができる（架橋試薬及び架橋手順のレビューについては、Ｗｏｌｄ，Ｆ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５：６２３－６５１，１９７２、Ｗｅｅｔａｌｌ，Ｈ．Ｈ．ａｎｄ Ｃｏｏｎｅｙ，Ｄ．Ａ．，Ｉｎ：ＥＮＺＹＭＥＳ ＡＳ ＤＲＵＧＳ．（Ｈｏｌｃｅｎｂｅｒｇ，ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｄｓ．）ｐｐ．３９５－４４２、Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８１、Ｊｉ，Ｔ．Ｈ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９１：５８０－６０９，１９８３、Ｍａｔｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１７：１６７－１８３，１９９３（これらの全ては参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。好ましい架橋試薬は、様々なゼロ長、ホモ二官能性、及びヘテロ二官能性架橋試薬に由来する。ゼロ長架橋試薬としては、外因性材料の導入を有しない２つの内因性化学基の直接コンジュゲーションが挙げられる。ジスルフィド結合の形成を触媒する剤は、このカテゴリに属する。別の例は、カルボキシル及び第１級アミノ基との縮合を誘導して、カルボジイミド、エチルクロロフォルメート、ウッドワード試薬Ｋ（２－エチル－５－フェニルイソオキサゾリウム－３’－スルホネート）、及びカルボニルジイミダゾール等のアミド結合を形成する試薬である。これらの化学試薬に加えて、酵素トランスグルタミナーゼ（グルタミルペプチドγ－グルタミルトランスフェラーゼ、ＥＣ２．３．２．１３）をゼロ長架橋試薬として使用し得る。この酵素は、タンパク質結合グルタミニル残基のカルボキサミド基で、通常は第１級アミノ基を基質とするアシル転移反応を触媒する。好ましいホモ及びヘテロ二官能性試薬は、それぞれ、アミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、または非特異的基に対して反応性であり得る２つの同一または２つの非同様の部位を含有する。
本発明のポリペプチドに結合した例示的なコンジュゲーションパートナーとして、ＰＥＧ誘導体（例えば、アルキル－ＰＥＧ、アシル－ＰＥＧ、アシル－アルキル－ＰＥＧ、アルキル－アシル－ＰＥＧカルバモイル－ＰＥＧ、アリール－ＰＥＧ）、ＰＰＧ誘導体（例えば、アルキル－ＰＰＧ、アシル－ＰＰＧ、アシル－アルキル－ＰＰＧ、アルキル－アシル－ＰＰＧカルバモイル－ＰＰＧ、アリール－ＰＰＧ）、治療部分、診断部分、マンノース－６－フォスフェート、ヘパリン、ヘパラン、ＳｌｅＸ、マンノース、マンノース－６－フォスフェート、Ｓｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓ Ｘ、ＦＧＦ、ＶＦＧＦ、タンパク質、コンドロイチン、ケラタン、デルマタン、アルブミン、インテグリン、アンテナ型オリゴ糖、ペプチド等が挙げられるが、これらに限定されない。
共有結合に加えて、例えば、ＦＧＦ１多様体を含む、本発明の増殖因子多様体は、非共有相互作用を介してバイオ材料の表面に結合されることができる。非共有タンパク質組み込みは、例えば、カプセル化または吸収を通じて行われ得る。本発明のポリペプチドのバイオ材料への結合は、ヘパリンを通じて介在され得る。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｈａｒａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９４）９４：６２３－６３０、Ｌａｈａｍ ｅｔ ａｌ．、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（１９９９）１８６５－１８７１及びその中で引用される参照文献に記載されるヘパリン－アルギネートポリマー及びアルギネートに結合される。他の実施形態において、本発明のポリペプチドは、コラーゲンに基づくバイオ材料に結合される。
ｃ．造影剤
本発明の例示的なコンジュゲートは、本発明の多様体及び検出可能部分を含む造影剤であり、これは造影様式で検出可能である。生体対象におけるＭｅｔ受容体を特異的に標的化し、患者特異的がん処置及び疾患管理のための腫瘍の非侵襲的特徴付けを可能にする分子造影プローブの重要な必要性が存在する。非侵襲的造影を介してＭｅｔ発現腫瘍を検出する能力は、転移リスクの指標としても役立ち得る。
本発明のコンジュゲートが使用される例示的な造影モダリティとしては、本発明の多様体に陽電子放射同位体がタグ付けされる陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）が挙げられるが、これらに限定されない。典型的な同位体としては、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６２Ｃｕ、１２４Ｉ、７６Ｂｒ、８２Ｒｂ、及び６８Ｇａが挙げられ、１８Ｆが最も臨床的に利用される。多様体はまた、超音波剤、磁気共鳴造影剤、Ｘ線剤、ＣＴ剤、ガンマカメラシンチグラフィー剤、及び蛍光造影剤に組み込むこともできる。追加の検出可能部分及び造影方法を、以下の本明細書の方法のセクションに記載する。
例示的な実施形態において、コンジュゲーションパートナーは、選択された条件下で切断される結合を介して本発明のポペプチド多様体に結合される。例示的な条件としては、選択されたｐＨ（例えば、胃、腸、エンドサイトーシスバキュオール）、活性酵素（例えば、エステラーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ）の存在、光、熱等が挙げられるが、これらに限定されない。多くの切断可能な基が当該技術分野で既知である。例えば、Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７６１：１５２－１６２（１９８３）、Ｊｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１４５１８－１４５２５（１９９０）、Ｚａｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２４：９１３－９２０（１９８０）、Ｂｏｕｉｚａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５５：１４１－１４７（１９８６）、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１：２０５－２１０（１９８６）、Ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３：１８５９－１８６７（１９８９）を参照されたい。
ＩＶ．医薬組成物
例えば、ＦＧＦ１多様体を含む増殖因子多様体、及び本発明のそれらのコンジュゲートは、幅広い薬学的用途を有する。
したがって、別の態様において、本発明は、少なくとも１つの本発明のポリペプチドまたはポリペプチドコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、担体、ビヒクル、添加物またはそれらの組み合わせとを含む、医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、様々な薬物送達系での使用に好適である。本発明で使用される好適な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１７ｔｈ ｅｄ．（１９８５）に見出される。薬物送達のための方法の簡単な概説については、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３（１９９０）を参照されたい。
医薬組成物は、例えば、局所投与、経口投与、経鼻投与、静脈内投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮下投与、または筋肉内投与を含む、任意の適切な態様の投与のために製剤化し得る。皮下注射等の非経口投与の場合、担体は、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、または緩衝液を含む。経口投与のために、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、及び炭酸マグネシウム等の上記担体または固体担体のいずれかが用いられ得る。微粒子（例えば、ポリ乳酸ポリグリコレート）等の生分解性マトリックスは、本発明の医薬組成物の担体としても使用され得る。好適な生分解性微粒子は、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号及び同第５，０７５，１０９号に開示されている。
一般に、医薬組成物は、皮下または非経口的に、例えば、静脈内に投与される。したがって、本発明は、許容される担体、好ましくは水性担体、例えば、水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ等に溶解または懸濁された化合物を含む、非経口投与のための組成物を提供する。組成物はまた、Ｔｗｅｅｎ ２０及びＴｗｅｅｎ ８０等の洗剤、マンニトール、ソルビトール、スクロース、及びトレハロース等の安定剤、ならびにＥＤＴＡ及びメタクレゾール等の防腐剤も含有し得る。組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、張度調整剤、湿潤剤、洗剤等の生理学的条件に近似するために必要な薬学的に許容される補助物質を含有し得る。
これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌され得、または滅菌濾過され得る。得られた水溶液は、そのまま使用するためにパッケージ化されまたは凍結乾燥され得、凍結乾燥製剤は投与前に滅菌水性担体と組み合わされ得る。調製物のｐＨは、典型的には、３～１１、より好ましくは５～９、最も好ましくは７～８である。
いくつかの実施形態において、本発明のグリコペプチドは、標準的な小胞形成脂質から形成されるリポソームに組み込むことができる。リポソームを調製するための様々な方法が利用可能であり、例えば、Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、及び同第４，８３７，０２８号を参照されたい。様々な標的化剤（例えば、本発明のシアリルガラクトシド）を使用するリポソームの標的化は、当該技術分野で既知である（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号及び４，６０３，０４４号を参照されたい）。
標的化剤をリポソームに結合するための標準的な方法を使用することができる。これらの方法は、一般に、標的化剤の結合のために活性化されることができるホスファチジルエタノールアミン等の脂質成分、または本発明の脂質誘導体化グリコペプチド等の誘導体化親油性化合物への組み込みを伴う。
標的化機構は、一般に、標的化部分が標的、例えば細胞表面受容体との相互作用のために利用可能である態様で、標的化剤がリポソームの表面上に配置されることを必要とする。本発明の炭水化物を、リポソームが形成される前に、当業者に既知の方法（例えば、炭水化物上に存在するヒドロキシル基の、それぞれ長鎖ハロゲン化アルキルまたは脂肪酸でのアルキル化またはアシル化）を使用して脂質分子に結合させ得る。
代替的には、リポソームは、膜を形成するときに、コネクタ部分が膜に最初に組み込まれるような方法で形成され得る。コネクタ部は、膜にしっかりと埋め込まれ、固定された親油性部を有すること。また、リポソームの水性表面上で化学的に利用可能な反応性部分を有する必要がある。反応性部分は、後に添加される標的化剤または炭水化物と安定した化学結合を形成するのに化学的に好適であるように選択される。いくつかの実施形態において、標的薬剤をコネクタ分子に直接結合させることが可能であるが、ほとんどの例では、第３の分子を使用して、化学架橋として機能させることがより好適であり、したがって、膜内にあるコネクタ分子を、小胞表面から３次元的に伸長される標的薬剤または炭水化物と連結させる。
本発明の方法によって調製される、例えばＦＧＦ１多様体を含む増殖因子多様体は、診断試薬としても使用され得る。例えば、標識化合物を使用して、炎症を有すると疑われる患者の炎症または腫瘍転移の領域を位置決定することができる。この使用のために、化合物は、１２５Ｉ、１４Ｃ、またはトリチウムで標識されることができる。
Ｖ．核酸
いくつかの実施形態において、本発明は、上述の実施形態のうちのいずれかによる、例えば、ＦＧＦ１多様体を含む増殖因子多様体をコードする単離核酸を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、この核酸に相補的な核酸を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された上述の実施形態のいずれかによるポリペプチド多様体をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。
ＶＩ．スクリーニングのライブラリ及び方法
様々な実施形態において、複数の異なるメンバーを含む、例えば、ＦＧＦ１多様体ポリペプチドを含む、増殖因子多様体ポリペプチドのライブラリも提供され、ライブラリの各メンバーは、共通の親増殖因子ポリペプチドまたはＦＧＦ１親ポリペプチドに対応し、ライブラリの各メンバーは、アミノ酸が親ポリペプチドに見出されない位置にアミノ酸を含む。
ａ．ライブラリの作成
ＦＧＦ１または他の増殖因子のランダム化ライブラリを生成するために、様々なＦＧＦ１または他の増殖因子配列についてコードしたオリゴヌクレオチドを調製した。例えば、酵母中のＦＧＦ１多様体ポリペプチドを含む増殖因子多様体ポリペプチドを発現するために使用されるＤＮＡを、合成または標準的な組換え技術によって調製した。アミノ酸が変化されるべき場合、それぞれが異なるアミノ酸をコードする２０個の異なるコドンが所与の位置について合成された。ランダム化オリゴヌクレオチド合成は、約５～約１５個のアミノ酸がランダム化されるコーディングカセットを作成するために使用されている（例えば、Ｂｕｒｒｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３８：１ １３、Ｌｏｗｍａｎ（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：４１０ ２４、Ｗｉｌｓｏｎ（１９９８）Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：３１３ ３２９を参照されたい）。
改良された変異体の進化に典型的に使用される酵母ディスプレイベクターは、「ｐＣＴ」と呼ばれる。ベクターは、Ｗｉｔｔｒｕｐ，ｅｔ ａｌ．，２００４年７月２９日に公開された「Ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ」と題するＵＳ２００４／０１４６９７６にさらに記載される。そこに記載されるように、ベクターは、目的のポリペプチドのＮ末端と酵母Ａｇａ２ｐ細胞壁タンパク質のＣ末端との遺伝的融合体を提供する。各酵母細胞の外壁は、約１０４～１０５個のタンパク質凝集素をディスプレイすることができる。ベクターは、特定の制限部位を含有し、ガラクトース、Ｎ末端ＨＡ及びＣ末端ｃ－ｍｙｃエピトープタグ、ならびに第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位による転写調節を例示する。
本発明の一部の実施形態において、高親和性結合剤を操作するために一般的に使用される酵母ディスプレイプラットフォームは、より大きなタンパク質分解安定性を有するタンパク質を操作するためにも利用される（例えば、図１を参照）。いくつかの実施形態において、単一増殖因子多様体の数千コピーがテザリング融合体として酵母の表面上に表示される。いくつかの実施形態において、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグは、増殖因子の上流で発現され、ｃ－ｍｙｃタグは、増殖因子の下流で発現される。いくつかの実施形態において、細胞は、酵母ディスプレイ増殖因子に結合し得る、対応する受容体の可溶性Ｆｃ融合体と共にインキュベートされ得る。
いくつかの実施形態において、酵母ディスプレイプラットフォームは、より高いタンパク質分解安定性を有する増殖因子を操作するためにフロー活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）と組み合わされる（例えば、図２を参照されたい）。いくつかの実施形態において、増殖因子変異体のライブラリは、ランダム変異誘発、指向性変異誘発、もしくはＤＮＡシャッフル、または上述の、または当該技術分野で既知の他の組換え技法によって生成することができる。いくつかの実施形態において、酵母細胞のライブラリは、目的のプロテアーゼと共にインキュベートされ、その間、酵母表面ディスプレイタンパク質の切断が生じる。いくつかの実施形態において、より大きなタンパク質分解安定性を有する増殖因子変異体は、酵母細胞表面上の切断に対してより耐性がある。いくつかの実施形態において、プロテアーゼインキュベーションの後、細胞は、洗浄され、保持された受容体結合親和性を有する適切に折り畳まれた増殖因子変異体に結合する機能性受容体の可溶性Ｆｃ融合体と共にインキュベートされる。いくつかの実施形態において、ＦＡＣＳは、適切に折り畳まれた未切断増殖因子変異体のために選別されるために使用され、これらは拡張され、次のラウンドの選別のために誘導される。
いくつかの実施形態において、Ｆｃドメイン、ｃ－ｍｙｃドメイン、及びＨＡタグに対する蛍光抗体マーカーを使用して、受容体結合、増殖因子特異的切断、及び非特異的切断を測定する（例えば、以下の表２を参照されたい）。いくつかの実施形態において、結合したＦｃ融合受容体の検出は、増殖因子の変異が受容体に対する結合親和性を著しく低下させないか、または不適切なタンパク質折り畳みにつながらないことを確認することを可能にする。いくつかの実施形態において、増殖因子特異的切断は、増殖因子のタンパク質分解安定性の直接的な尺度である。いくつかの実施形態において、切断された増殖因子がＣ末端ｃ－ｍｙｃタグを除去するため、増殖因子特異的切断はｃ－ｍｙｃシグナルによって検出される。いくつかの実施形態において、プロテアーゼが例えば酵母ディスプレイタンパク質、例えば酵母ディスプレイタンパクＡｇａ１ｐ及びＡｇａ２ｐ内で切断するときに、非特異的切断は生じる。いくつかの実施形態において、非特異的切断中に、３つ全てのマーカーの蛍光シグナルが減少する。一部の実施形態において、増殖因子切断及び結合活性を検出するためのダイナミックレンジが減少するため、これは望ましくない。いくつかの実施形態において、ＨＡシグナルは、目的のプロテアーゼによる非特異的切断が最小限であることを保証するために使用される。
Figure 2022513178000011
いくつかの実施形態において、野生型増殖因子及びその多様体は、ｐＣＴベクター内にクローニングされることができる。いくつかの実施形態において、野生型増殖因子及びその多様体は、Ａｇａ２ｐ交配タンパク質への融合体としてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母細胞の表面上で発現されることができる。いくつかの実施形態において、酵母細胞表面上での野生型増殖因子及びその多様体の発現の成功は、タンパク質のＣ末端上のｃ－ｍｙｃタグの検出によって確認され得る。いくつかの実施形態において、酵母ディスプレイ野生型増殖因子及びその多様体の適切な折り畳みは、野生型増殖因子－Ｆｃに対する特異的結合活性を測定することによって確認することができる。
いくつかの実施形態において、配列番号１のＦＧＦ１ポリペプチドは、タンパク質分解安定性スクリーニングのセットアップを実証するためのモデルとして使用された。いくつかの実施形態において、野生型ＦＧＦ１をｐＣＴベクターにクローニングした。いくつかの実施形態において、このＦＧＦ１ポリペプチド及びそのＦＧＦ１多様体は、Ａｇａ２ｐ交配タンパク質への融合体としてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母細胞の表面上で発現され得る（例えば、図３Ａを参照されたい）。いくつかの実施形態において、酵母細胞表面上のＦＧＦ１の発現の成功は、タンパク質のＣ末端上のｃ－ｍｙｃタグの検出によって確認され得る（例えば、図３Ｂを参照されたい）。いくつかの実施形態において、酵母ディスプレイＦＧＦの適切な折り畳みは、ＦＧＦＲ１－Ｆｃへの特異的結合活性を測定することによって確認され得る（例えば、図３Ｃを参照されたい）。
いくつかの実施形態において、血清、トリプシン、キモトリプシン、及びプラスミンは、例えば、ＦＧＦ１多様体ポリペプチドを含む、増殖因子多様体ポリペプチドのタンパク質分解安定性スクリーニングを開発するために使用され得る。いくつかの実施形態において、これらのプロテアーゼは、例えばＦＧＦ１多様体ポリペプチドを含む増殖因子多様体ポリペプチドに対するそれらの科学的及び生物学的関連性に基づいて選択された。いくつかの実施形態において、スクリーニングに対するプロテアーゼの適合性は、酵母ディスプレイタンパク質の最小限の非特異的切断によって、合理的な速度で増殖因子を切断する能力によって決定された。いくつかの実施形態において、血清は、例えば、ＦＧＦ１多様体ポリペプチドを含む、増殖因子多様体ポリペプチドのタンパク質分解安定性スクリーニングを開発するために使用されることができる。いくつかの実施形態において、トリプシンは、例えば、ＦＧＦ１多様体ポリペプチドを含む、増殖因子多様体ポリペプチドのタンパク質分解安定性スクリーニングを開発するために使用されることができる。いくつかの実施形態において、キモトリプシンは、例えばａｄ ＦＧＦ１多様体ポリペプチドを含む、増殖因子多様体ポリペプチドのタンパク質分解安定性スクリーニングを開発するために使用されることができる。いくつかの実施形態において、プラスミンは、例えば、ＦＧＦ１多様体ポリペプチドを含む、増殖因子多様体ポリペプチドのタンパク質分解安定性スクリーニングを開発するために使用されることができる。
いくつかの実施形態において、安定性は、野生型増殖因子のタンパク質分解切断を、多様体増殖因子のタンパク質分解切断と比較することによって決定される。いくつかの実施形態において、安定性は、野生型ＦＧＦ１のタンパク質分解切断を、ＦＧＦ１多様体のタンパク質分解切断と比較することによって決定される。
いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して少なくとも５％～少なくとも９５％増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して少なくとも１０％～少なくとも９０％増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して少なくとも５％～少なくとも９０％増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して少なくとも５％～少なくとも８５％増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して少なくとも５％～少なくとも８０％増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して少なくとも５％～少なくとも７５％増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して少なくとも５％～少なくとも７０％増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して少なくとも１０％～少なくとも７０％増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも５％増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも１０％増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも１５％増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも２０％増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも２５％増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも３０％増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも３５％増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも４０％増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも４５％増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも５０％増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも５％増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも６０％増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも６５％増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも７０％増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも７５％増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも８０％増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも８５％増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも９０％増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも９５％増加する。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して少なくとも５％～少なくとも９５％増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して少なくとも１０％～少なくとも９０％増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して少なくとも５％～少なくとも９０％増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して少なくとも５％～少なくとも８５％増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して少なくとも５％～少なくとも８０％増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して少なくとも５％～少なくとも７５％増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して少なくとも５％～少なくとも７０％増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して少なくとも１０％～少なくとも７０％増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも５％増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも１０％増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも１５％増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも２０％増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも２５％増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも３０％増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも３５％増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも４０％増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも４５％増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも５０％増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも５％増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも６０％増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも６５％増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも７０％増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも７５％増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも８０％増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも８５％増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも９０％増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも９５％増加する。
いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも１倍～少なくとも１０倍増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも１倍増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも２倍増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも３倍増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも４倍増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも５倍増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも６倍増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも７倍増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも８倍増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも９倍増加する。いくつかの実施形態において、増殖因子多様体の安定性は、野生型増殖因子と比較して、少なくとも１０倍増加する。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも１倍～少なくとも１０倍増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも１倍増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも２倍増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも３倍増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも４倍増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも５倍増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも６倍増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも７倍増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも８倍増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも９倍増加する。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ１多様体の安定性は、野生型ＦＧＦ１と比較して、少なくとも１０倍増加する。
ｂ．蛍光細胞選別
いくつかの実施形態において、スクリーニングは、細胞選別機の使用を含むことができる。市販のフローサイトメータは、単一細胞レベルで４つ以上の波長で、約５０，０００個／秒の速度で蛍光放出を測定することができる（Ａｓｈｃｒｏｆｔ ａｎｄ Ｌｏｐｅｚ，２０００）。典型的なフローサイトメトリデータは、タンパク質発現レベル及び結合された可溶性リガンド（例えば、増殖因子受容体）を測定することを示すことができ、ここで、酵母が２つの異なる色の蛍光プローブで標識されている。細胞ごとに基づく、タンパク質発現レベルの多様性に起因する、細胞の「対角線」集団の結果は、より多くのタンパク質を発現する細胞は、より多くのリガンドに結合するということである。平衡結合定数（ＫＤ）は、可溶性リガンドの滴定によって決定することができ、解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、非標識リガンドの競合結合によって測定することができる。酵母を使用して、テザー化タンパク質の単分散性が細胞表面上に存在し、可溶性リガンドを結合及び試験のために使用して、その結果、固定化リガンドを使用する他のディスプレイ方法とは異なり、アビディティ効果は観察されない。これまでに、酵母細胞表面上で発現されたほとんどのタンパク質の特性は、安定性及び結合親和性の観点から溶液に見出されるものを模倣する（Ｂａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００、Ｆｅｌｄｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．，２００３、Ｈｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００、ＶａｎＡｎｔｗｅｒｐ ａｎｄ Ｗｉｔｔｒｕｐ，２０００）。Ｗｅａｖｅｒ－Ｆｅｌｄｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅａｇｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｙｅａｓｔ ｄｉｓｐｌａｙ，”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｓｅｐ．２６，２００５ １８（１１）：５２７－５３６をまた参照されたい。
細胞選別は、ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）マルチパラメーターレーザーフローサイトメーター及び細胞選別機で行うことができる。選別の前に、蛍光染色を上記のように行い、その結果、上記のように様々なポリペプチドレベルの分析が検出された。
ＶＩＩ．方法
ａ．化学合成
本発明のポリペプチド多様体は、従来の段階的溶液または固相合成を使用して調製し得る（例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，１９９７，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ Ｆｌｏｒｉｄａ、及びその中で引用される参考文献、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ａｔｈｅｒｔｏｎ＆Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｅｄｓ．，１９８９，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ、及びその中で引用される参考文献を参照されたい）。
代替的には、本発明のペプチドを、例えばＬｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３７（７）９３３ ９３６、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：１８８１－１８８７、Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４５：２０９－２１６、Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ ａｎｄ Ｋｅｎｔ，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：２２１－２２５、Ｌｉｕ ａｎｄ Ｔａｍ，１９９４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６（１０）：４１４９－４１５３、Ｌｉｕ ａｎｄ Ｔａｍ，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：６５８４－６５８８、Ｙａｍａｓｈｉｒｏ ａｎｄ Ｌｉ，１９８８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３１：３２２－３３４）に記載されるように、セグメント縮合を使用して調製し得る。セグメント縮合は、内部グリシン残基を含有する実施形態を合成するための特に有用な方法である。本発明のペプチドの合成に有用な他の方法は、Ｎａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０７：７０８７－７０９２に記載されている。
Ｎ末端及び／またはＣ末端遮断基を含有するポリペプチド多様体は、有機化学の標準的な技術を使用して調製することができる。例えば、ペプチドのＮ末端をアシル化する、またはペプチドのＣ末端をアミド化もしくはエステル化するための方法は、当該技術分野で既知である。Ｎ末端及び／またはＣ末端に他の修飾を担持する様式は、当業者には明らかであり、端末ブロック基を結合させるために必要であり得る任意の側鎖官能基を保護する様式も同様である。薬学的に許容される塩（対イオン）を、当該技術分野で既知であるように、イオン交換クロマトグラフィーまたは他の方法によって好都合に調製することができる。
タンデムマルチマーの形態である本発明の化合物を、合成における適切なステップで、リンカー（複数可）をペプチド鎖に付加することによって、好都合に合成することができる。代替的には、螺旋セグメントを合成し、各セグメントをリンカーと反応させることができる。もちろん、実際の合成方法はリンカーの組成に依存することになる。好適な保護スキーム及び化学は既知であり、当業者には明らかであろう。
分岐ネットワークの形態である本発明の化合物は、三量体及び四量体樹脂を使用して好都合に合成することができ、化学は、Ｔａｍ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５４０９－５４１３及びＤｅｍｏｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３９：７４－８４に記載されている。より高いまたはより低いオーダーの分岐ネットワークを合成するために合成樹脂及び戦略を修飾することこと、またはどれが異なるコアペプチドヘリカルセグメントの組み合わせを含有するかは、ペプチド化学及び／または有機化学の分野の当業者の能力の範囲内である。必要に応じて、ジスルフィド結合の形成は、一般に、穏やかな酸化剤の存在下で行われる。
化学酸化剤を使用し得、または化合物を単に大気酸素に曝露してこれらの結合をもたらし得る。例えば、Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ９５５－９５７、Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ、Ａｈｍｅｄ ｅｔ ａｌ．，１９７５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０：８４７７－８４８２、及びＰｅｎｎｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １９９０ １６４－１６６，Ｇｉｒａｌｔ ａｎｄ Ａｎｄｒｅｕ，Ｅｄｓ．，ＥＳＣＯＭ Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓによって記載されるものを含む種々の方法が当業界で既知である。追加の代替法は、Ｋａｍｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ６３：８９９－９１５．Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｏｎ ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｉｓ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｂｙ Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ，１９８５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．２６：９２－９７によって記載される。これらの方法のいずれかを使用して、本発明のペプチド中にジスルフィド結合を形成し得る。
ＶＩＩＩ．ポリペプチドコード配列の取得
ａ．一般的な組み換え技術
本発明のＯ結合グリコシル化配列を組み込む多様体（ｖａｒｉａｎｔ）及び／または変異体（ｍｕｔａｎｔ）ポリペプチドの作成は、対応する親ポリペプチドのアミノ酸配列を変更することによって、ポリペプチドの変異または完全な化学合成のいずれかによって達成することができる。ポリペプチドアミノ酸配列は、好ましくは、ＤＮＡレベルでの変化を通じて、特に、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を予め選択された塩基で変異させて、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成することによって変更される。ＤＮＡ変異（複数可）は、当該技術分野で知られている方法を使用して好ましくは作成される。
本発明は、組換え遺伝学の分野における日常的な技術に依拠する。本発明における一般的な使用方法を開示する基本的なテキストとしては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄ．２００１）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）が挙げられる。
核酸サイズは、キロ塩基（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）のいずれかで与えられる。これらは、アガロースもしくはアクリルアミドゲル電気泳動に由来する推定値、配列決定核酸に由来する推定値、または公開されているＤＮＡ配列に由来する推定値である。タンパク質の場合、サイズはキロダルトン（ｋＤａ）またはアミノ酸残基数で与えられる。タンパク質サイズは、ゲル電気泳動、配列決定タンパク質、由来アミノ酸配列、または公開されているタンパク質配列から推定される。
市販されていないオリゴヌクレオチドを、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ＆Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１８５９－１８６２（１９８１）によって最初に記載された固相ホスホルアミダイトトリエステル法にしたがって、Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：６１５９－６１６８（１９８４）に記載されるような自動化合成器を使用して、化学的に合成することができる。全体の遺伝子は、化学的に合成することもできる。オリゴヌクレオチドの精製は、当技術分野で認識される任意の戦略、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｒｅａｎｉｅｒ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．２５５：１３７－１４９（１９８３）に記載されるように、天然アクリルアミドゲル電気泳動またはアニオン交換ＨＰＬＣを使用して行われる。
クローニングした野生型ポリペプチド遺伝子、変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び合成オリゴヌクレオチドの配列を、例えば、Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ，１６：２１－２６（１９８１）の二本鎖テンプレートを配列決定する鎖終結法を使用するクローニングの後に、検証することができる
例示的な実施形態において、グリコシル化配列を、ポリヌクレオチドをシャッフルすることによって付加する。候補ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡシャッフルプロトコルで調節することができる。ＤＮＡシャッフルは、関連する遺伝子のプールのランダム断片化、続いてポリメラーゼ連鎖反応様プロセスによる断片の再組み立てによって行われる、再帰的組換え及び変異のプロセスである。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１０７４７－１０７５１（１９９４）、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９－３９１（１９９４）、ならびに米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８３７，４５８号、同第５，８３０，７２１号、及び同第５，８１１，２３８号を参照されたい。
ｂ．野生型ペプチドコード配列のクローニング及びサブクローニング
野生型ポリペプチドをコードする多数のポリヌクレオチド配列が決定され、商業サプライヤーから入手可能であり、例えば、ヒト成長ホルモンでは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ０００５１５、ＮＭ００２０５９、ＮＭ０２２５５６、ＮＭ０２２５５７、ＮＭ０２２５５８、ＮＭ０２２５５９、ＮＭ０２２５６０、ＮＭ０２２５６１、及びＮＭ０２２５６２である。
ヒトゲノムの研究の急速な進歩により、ヒトＤＮＡ配列データベースが、例えば、以前に同定されたポリペプチドをコードするもの等の既知のヌクレオチド配列とある特定のパーセンテージの配列相同性を有する任意の遺伝子セグメントを検索することができるクローニングアプローチが可能になった。そのように同定された任意のＤＮＡ配列は、その後、化学合成及び／またはオーバーラップ伸長法等のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によって得ることができる。短い配列については、完全に新規の合成で十分であり得るが、より大きな遺伝子を得るためには、合成プローブを使用するヒトｃＤＮＡまたはゲノムライブラリからの全長コード配列のさらなる単離が必要であり得る。
代替的には、ポリペプチドをコードする核酸配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の標準的なクローニング技術を使用してヒトｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリから単離することができ、相同性に基づくプライマーは、しばしば、ポリペプチドをコードする既知の核酸配列に由来することができる。この目的のために最も一般的に使用される技術は、標準的なテキスト、例えば、前掲のＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌに記載されている。
野生型ポリペプチドのコード配列を得るのに好適なｃＤＮＡライブラリは、市販され得、または構築されることができる。ｍＲＮＡを単離し、逆転写によりｃＤＮＡを作成し、ｃＤＮＡを組換えベクターにライゲーションし、増殖、スクリーニング、及びクローニングのための組換え宿主にトランスフェクトする一般的な方法は既知である（例えば、前掲のＧｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｇｅｎｅ，２５：２６３－２６９（１９８３）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）。ＰＣＲによってヌクレオチド配列の増幅セグメントを得ると、セグメントを、ｃＤＮＡライブラリから野生型ポリペプチドをコードする全長ポリヌクレオチド配列を単離するためのプローブとしてさらに使用することができる。適切な手順の一般的な説明は、前掲のＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌに見出すことができる。
同様の手順に従って、ヒトゲノムライブラリから、野生型ポリペプチドをコードする全長配列、例えば、上述のＧｅｎＢａｎｋ受託番号のうちのいずれか１つを得ることができる。ヒトゲノムライブラリは市販されているか、または様々な技術分野で認識されている方法に従って構築することができる。一般に、ゲノムライブラリを構築するために、ＤＮＡは、まず、ポリペプチドが見出される可能性が高い組織から抽出される。次いで、ＤＮＡを機械的に剪断するか、または酵素的に消化して、約１２～２０ｋｂの長さの断片をもたらす。その後、断片を望ましくないサイズのポリヌクレオチド断片から勾配遠心分離することにより分離し、バクテリオファージλベクターに挿入する。これらのベクター及びファージは、インビトロでパッケージ化される。組換えファージを、Ｂｅｎｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９６：１８０－１８２（１９７７）に記載されるように、プラークハイブリダイゼーションによって分析する。コロニーハイブリダイゼーションは、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２：３９６１－３９６５（１９７５）によって記載されるように行う。
配列相同性に基づいて、縮退オリゴヌクレオチドをプライマーセットとして設計することができ、ＰＣＲを好適な条件下で行って（例えば、Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３；Ｇｒｉｆｆｉｎ ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．１９９４）を使用して、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリからのヌクレオチド配列のセグメントを増幅することができる。増幅セグメントをプローブとして使用して、野生型ポリペプチドをコードする全長核酸を得る。
野生型ポリペプチドをコードする核酸配列を取得すると、コード配列をベクター、例えば発現ベクターにサブクローニングして、組換え野生型ポリペプチドを得られた構築物から産生することができる。野生型ポリペプチドコード配列のさらなる修飾、例えば、ヌクレオチド置換は、その後、分子の特徴を改変するために行われ得る。
ｃ．ポリペプチド配列への変異の導入
コードポリヌクレオチド配列から、野生型ポリペプチドのアミノ酸配列を決定することができる。続いて、このアミノ酸配列を修飾して、アミノ酸配列内の様々な位置に追加のグリコシル化配列（複数可）を導入することによって、タンパク質のグリコシル化パターンを変更することができる。
様々な変異生成プロトコルが、当該技術分野で確立され、記載される。例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：４５０４－４５０９（１９９７）、及びＳｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３７０：３８９－３９１（１９９４）を参照されたい。手順は、一組の核酸の多様体、したがって、コードされたポリペプチドの多様体を産生するために別々にまたは併用することができる。変異誘発、ライブラリ構築、及び他の多様性生成方法のためのキットは、市販されている。
多様性を生成する変異生成方法としては、例えば、部位特異的変異誘発（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｓｈｏｒｔｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１１９３－１２０１（１９８５））、ウラシル含有テンプレートを使用する変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８－４９２（１９８５））、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発（Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１０：６４８７－６５００（１９８２））、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ変異誘発（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：８７４９－８７６４及び８７６５－８７８７（１９８５））、ならびにギャップ二本鎖ＤＮＡを使用した変異誘発（Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：９４４１－９４５６（１９８４））が挙げられる。
変異を生成するための他の方法としては、点ミスマッチ修復（Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３８：８７９－８８７（１９８４））、修復欠損宿主株を使用した変異誘発（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：４４３１－４４４３（１９８５））、欠失変異誘発（Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４：５１１５（１９８６））、制限選択及び制限精製（Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ，３１７：４１５－４２３（１９８６））、全遺伝子合成による変異誘発（Ｎａｍｂｉａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２３：１２９９－１３０１（１９８４））、二本鎖切断修復（Ｍａｎｄｅｃｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：７１７７－７１８１（１９８６））、ポリヌクレオチド鎖終結法による変異誘発（米国特許第５，９６５，４０８号）、及びエラープローンＰＣＲ（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１：１１－１５（１９８９））が挙げられる。
ｄ．宿主生物における好ましいコドン使用のための核酸の修飾
ポリペプチド多様体をコードするポリヌクレオチド配列をさらに変更して、特定の宿主の好ましいコドン使用と一致させることができる。例えば、１つの細菌細胞株の好ましいコドン使用を使用して、本発明のポリペプチド多様体をコードし、この株によって好ましいコドンを含むポリヌクレオチドを導出することができる。宿主細胞によって示される好ましいコドン使用の頻度は、宿主細胞によって発現される多数の遺伝子における好ましいコドン使用の頻度を平均化することによって計算することができる（例えば、計算サービスは、Ｋａｚｕｓａ ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｊａｐａｎのウェブサイトから利用可能である）。この分析は、好ましくは、宿主細胞によって高度に発現される遺伝子に限定される。例えば、米国特許第５，８２４，８６４号は、双子葉植物及び単子葉植物によって示される高度に発現された遺伝子によるコドン使用の頻度を提供する。
修飾の完了時に、ポリペプチド多様体コード配列を配列決定によって検証し、次いで、野生型ポリペプチドと同じ態様で組換え産生のために適切な発現ベクターにサブクローニングする。
ＩＸ．変異体ポリペプチドの発現
配列検証に続いて、本発明のポリペプチド変異体は、本明細書に開示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に依拠して、組換え遺伝学の分野で日常的な技法を使用して産生され得る。
ａ．発現系
本発明の変異体ポリペプチドをコードする核酸の高レベル発現を得るために、典型的には、変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、転写を指示する強力なプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、及び翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含む発現ベクターにサブクローニングする。好適な細菌プロモーターは、当該技術分野で既知であり、例えば、前掲のＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、及び前掲のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．に記載される。野生型または変異体ポリペプチドを発現するための細菌発現系は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、及びＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒで利用可能である。そのような発現系のためのキットは、市販されている。哺乳動物細胞、酵母、及び昆虫細胞の真核生物発現系は、当該技術分野で既知であり、また市販されている。一実施形態において、真核生物発現ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、またはレトロウイルスベクターである。
異種核酸の発現を指示するために使用されるプロモーターは、特定の用途に依存する。プロモーターは、任意選択で、異種転写開始部位から、その天然の設定における転写開始部位からとほぼ同じ距離に配置される。しかしながら、当該技術分野で知られているように、この距離のいくつかの多様性を、プロモーター機能を失うことなく収容することができる。
プロモーターに加えて、発現ベクターは、典型的には、宿主細胞における変異体ポリペプチドの発現に必要な全ての追加のエレメントを含有する転写単位または発現カセットを含む。したがって、典型的な発現カセットは、変異体ポリペプチド、ならびに転写産物、リボソーム結合部位、及び翻訳終了の効率的なポリアデニル化に必要なシグナルをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含有する。ポリペプチドをコードする核酸配列は、典型的には、形質転換細胞によるポリペプチドの分泌を促進するために切断可能なシグナルペプチド配列に連結される。そのようなシグナルペプチドには、とりわけ、組織プラスミノーゲンアクティベーター、インスリン、及びニューロン増殖因子、ならびにヘリオイトウイルスセンスの幼若ホルモンエステラーゼからのシグナルペプチドが含まれる。カセットのさらなるエレメントは、エンハンサー、ならびにゲノムＤＮＡが構造遺伝子として使用される場合、機能的スプライスドナー及びアクセプター部位を有するイントロンを含み得る。
プロモーター配列に加えて、発現カセットは、効率的な終結を提供するために、構造遺伝子の下流に転写終結領域も含有するべきである。終端領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得られ得るか、または異なる遺伝子から得られ得る。
遺伝情報を細胞に輸送するために使用される特定の発現ベクターは、特に重要ではない。真核細胞または原核細胞における発現に使用される従来のベクターのいずれも使用し得る。標準的な細菌発現ベクターとしては、ｐＢＲ３２２に基づくプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ、ならびにＧＳＴ及びＬａｃＺ等の融合発現系等のプラスミドが挙げられる。エピトープタグをまた組み換えタンパク質に付加して、好都合な単離方法、例えば、ｃ－ｍｙｃを提供することができる。
真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含有する発現ベクターは、典型的には、真核生物発現ベクター、例えば、ＳＶ４０ベクター、乳頭腫ウイルスベクター、及びエプスタインバーウイルスに由来するベクターにおいて使用される。他の例示的な真核ベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ－５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、及びＳＶ４０アーリープロモーター、ＳＶ４０レイタープロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞における発現に有効であることが示される他のプロモーターの指示の下でタンパク質の発現を可能とする任意の他のベクターが挙げられる。
いくつかの例示的な実施形態において、発現ベクターは、参照により本明細書に組み込まれる２００４年４月９日に出願された共同所有の米国特許出願に開示されるｐＣＷｉｎ１、ｐＣＷｉｎ２、ｐＣＷｉｎ２／ＭＢＰ、ｐＣＷｉｎ２－ＭＢＰ－ＳＢＤ（ｐＭＳ３９）、及びｐＣＷｉｎ２－ＭＢＰ－ＭＣＳ－ＳＢＤ（ｐＭＸＳ３９）から選択される。
いくつかの発現系は、チミジンキナーゼ、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、及びジヒドロ葉酸還元酵素等の遺伝子増幅を提供するマーカーを有する。代替的には、昆虫細胞中のバキュロウイルスベクター等の遺伝子増幅を伴わない高収率発現系もまた好適であり、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指示下で変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する。
発現ベクターに典型的に含まれるエレメントはまた、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて機能するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、及び真核配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域における独特な制限部位を含む。選択される特定の抗生物質耐性遺伝子は重要ではなく、当該技術分野で知られている多くの耐性遺伝子のいずれも好適である。
原核配列は、必要に応じて、真核細胞におけるＤＮＡの複製を干渉しないように、任意選択で選択される。
組換えタンパク質（例えば、本発明のｈｇｈ変異体）の周辺質発現が所望される場合、発現ベクターは、発現されるべきタンパク質のコード配列の５’に直接接続される、Ｅ．ｃｏｌｉ ＯｐｐＡ（Ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）分泌シグナルまたはその修飾バージョン等の分泌シグナルをコードする配列をさらに含む。このシグナル配列は、細胞質中で産生される組換えタンパク質を、細胞膜を介して細胞質周辺腔内に指示する。発現ベクターは、シグナルペプチダーゼ１のコード配列をさらに含み得、これは、組換えタンパク質が周辺質空間に入っているときにシグナル配列を酵素的に切断することができる。組換えタンパク質の周辺質産生のためのより詳細な記載は、例えば、Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３９：２４７－２５４（１９８５）、米国特許第６，１６０，０８９号及び同第６，４３６，６７４号に見出すことができる。
上述のように、当業者は、ポリペプチドの生物学的活性を依然として保持しながら、任意の野生型または変異体ポリペプチドまたはそのコード配列に対して様々な保存的置換が行われることができることを認識するであろう。さらに、ポリヌクレオチドコード配列の修飾は、得られるアミノ酸配列を変更することなく、特定の発現宿主における好ましいコドン使用を収容するようにも行われ得る。
ｂ．トランスフェクション方法
標準的なトランスフェクション方法を使用して、大量の変異体ポリペプチドを発現する細菌、哺乳類、酵母または昆虫細胞株を産生し、次いで標準的な技術を使用して精製する（例えば、Ｃｏｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７６１９－１７６２２（１９８９）、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８２（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，ｅｄ．，１９９０））を参照されたい。真核細胞及び原核細胞の形質転換は、標準的な技術に従って行われる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１３２：３４９－３５１（１９７７）、Ｃｌａｒｋ－Ｃｕｒｔｉｓｓ＆Ｃｕｒｔｉｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：３４７－３６２（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，１９８３）を参照されたい）。
宿主細胞に外来ヌクレオチド配列を導入するための任意の既知の手順を使用し得る。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマ（ｐｌａｓｍａ）ベクター、ウイルスベクター、及びクローン化ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、または他の外来遺伝子材料を宿主細胞に導入するための他の既知の方法のいずれかの使用が含まれる（例えば、前掲のＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌを参照されたい）。使用される特定の遺伝子操作手順が、変異体ポリペプチドを発現することができる宿主細胞に少なくとも１つの遺伝子を成功裡に導入することができることのみが必要である。
ｃ．宿主細胞における変異体ポリペプチドの発現の検出
発現ベクターを適切な宿主細胞に導入した後、トランスフェクトされた細胞を、変異体ポリペプチドの発現に有利な条件下で培養する。次いで、細胞を、組換えポリペプチドの発現についてスクリーニングし、その後、標準的な技術を使用して培養物から回収する（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（１９８２）、米国特許第４，６７３，６４１号、前掲のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．及び前掲のＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌを参照されたい）。
遺伝子発現をスクリーニングするためのいくつかの一般的な方法は、当業者の間で既知である。第１に、遺伝子発現を、核酸レベルで検出することができる。核酸ハイブリダイゼーション技術を使用した特異的ＤＮＡ及びＲＮＡ測定の様々な方法が一般的に使用される（例えば、前掲のＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ）。いくつかの方法は、電気泳動分離（例えば、ＤＮＡを検出するためのサザンブロット及びＲＮＡを検出するためのノーザンブロット）を伴うが、ＤＮＡまたはＲＮＡの検出は、電気泳動なしで（例えば、ドットブロットによって）実施することもできる。トランスフェクト細胞内の変異体ポリペプチドをコードする核酸の存在を、配列特異的プライマーを使用して、ＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲによって検出することもできる。
第２に、遺伝子発現を、ポリペプチドレベルで検出することができる。様々な免疫学的アッセイは、当業者によって日常的に使用されて、特に、本発明の変異体ポリペプチドと特異的に反応するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用して、遺伝子産物のレベルを測定する（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８８、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５－４９７（１９７５））。そのような技術は、変異体ポリペプチドまたはその抗原部分に対する高い特異性を有する抗体を選択することによる抗体調製を必要とする。ポリクローナル及びモノクローナル抗体の生成方法は十分に確立されており、それらの説明は、文献に見出すことができる。例えば、前掲のＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１－５１９（１９７６）を参照されたい。本発明の変異体ポリペプチドに対する抗体の調製、及び変異体ポリペプチドを検出する免疫学的アッセイの実施のより詳細な記載は、後述のセクションに提供される。
Ｘ．組換え生成された変異体ポリペプチドの精製
トランスフェクトされた宿主細胞における組換え変異体ポリペプチドの発現が確認されると、宿主細胞は、次いで、組換えポリペプチドを精製する目的のために適切なスケールで培養される。
ａ．細菌からの精製
本発明の変異体ポリペプチドが、形質転換細菌によって大量に、典型的にはプロモーター誘導後に組換え的に産生される場合、発現は構成的であることができるが、タンパク質は、不溶性凝集体を形成し得る。タンパク質包含体の精製に好適であるいくつかのプロトコルが存在する。例えば、凝集体タンパク質（以下、包含体と称される）の精製は、典型的には、細菌細胞の破壊による、例えば、約１００～１５０μｇ／ｍｌの溶解酵素及び０．１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、非イオン性洗剤中でのインキュベーションによる、包含体の抽出、分離及び／または精製を伴う。細胞懸濁液を、ポリトロン粉砕機（Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）を使用して粉砕することができる。代替的には、細胞を氷上で超音波処理することができる。細菌の溶解の代替方法は、いずれも前掲であるＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．及びＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌに記載されており、当業者には明らかであろう。
細菌包含体からの組換えポリペプチドの精製のさらなる記載については、例えば、Ｐａｔｒａ ｅｔ ａｌ．、タンパク質発現及び精製１８：１８２－１９０（２０００）を参照されたい。
上清中に存在する組換えタンパク質は、当業者に既知の標準的な分離技術によって宿主タンパク質から分離することができる。
ｂ．変異体ポリペプチド発現の検出のための免疫アッセイ
組換え変異体ポリペプチドの産生を確認するために、免疫学的アッセイは、試料中でポリペプチドの発現を検出するのに有用であり得る。免疫学的アッセイはまた、組換えホルモンの発現レベルを定量化するために有用である。変異体ポリペプチドに対する抗体は、これらの免疫学的アッセイを実施するために必要である。
ｃ．変異体ポリペプチドに対する抗体の産生
目的の免疫原と特異的に反応するポリクローナル及びモノクローナル抗体の産生方法は、当業者に既知である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ，１９９１、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９、Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（４ｔｈ ｅｄ．）Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，ＣＡ，及びそこに引用された参考文献、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｄ ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８６、ならびにＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７，１９７５を参照されたい）．そのような技術には、ファージまたは同様のベクターにおける組換え抗体のライブラリからの抗体の選択による抗体調製が含まれる（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－１２８１，１９８９、及びＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４－５４６，１９８９を参照されたい）。
所望の特異性を有する抗血清含有抗体を産生するために、目的のポリペプチド（例えば、本発明の変異体ポリペプチド）またはその抗原断片を使用して、好適な動物、例えば、マウス、ウサギ、または霊長類を免疫化することができる。フロイントのアジュバント等の標準的なアジュバントは、標準的な免疫プロトコルに従って使用することができる。代替的には、その特定のポリペプチドに由来する合成抗原ペプチドを担体タンパク質に結合させ、その後免疫原として使用することができる。
免疫原調製物に対する動物の免疫応答は、試験出血を採取し、目的の抗原に対する反応性の力価を決定することによって監視される。抗原に対する抗体の適切に高い力価が得られると、動物から血液を採取し、抗血清を調製する。抗原に特異的に反応性である抗体を富化するための抗血清のさらなる分画及び抗体の精製は、後述で行われることができ、前掲のＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、及び上述のタンパク質精製の一般的な説明を参照されたい。
モノクローナル抗体は、当業者によく知られている様々な技術を使用して得られる。典型的には、所望の抗原で免疫化された動物由来の脾臓細胞は、一般に、骨髄腫細胞との融合によって不死化される（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１－５１９，１９７６を参照されたい）。不死化の代替方法としては、例えば、エプスタインバーウイルス、がん遺伝子、もしくはレトロウイルス、または当該技術分野で既知である他の方法での形質転換が挙げられる。単一の不死化細胞から生じるコロニーは、抗原に対する所望の特異性及び親和性の抗体の産生についてスクリーニングされ、そのような細胞によって産生されるモノクローナル抗体の収率は、脊椎動物宿主の腹腔への注射を含む様々な技術によって増強され得る。
加えて、モノクローナル抗体はまた、前掲のＨｕｓｅ ｅｔ ａｌによって概説される一般プロトコルに従ってヒトＢ細胞ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによって、所望の特異性を有する抗体またはそのような抗体の結合断片をコードする核酸配列の同定の際に、組換え的に産生され得る。上述の組換えポリペプチド産生の一般的な原理及び方法は、組換え方法による抗体産生に適用可能である。
所望に応じて、本発明の変異体ポリペプチドを特異的に認識することができる抗体を、野生型ポリペプチドに対するそれらの交差反応性について試験することができ、したがって、野生型タンパク質に対する抗体と区別することができる。例えば、変異体ポリペプチドで免疫化された動物から得られた抗血清は、野生型ポリペプチドが固定化されたカラムを通過させることができる。カラムを通過する抗血清の部分は、野生型ポリペプチドではなく変異体ポリペプチドのみを認識する。同様に、変異体ポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、野生型ポリペプチドではなく、変異体のみを認識する際のそれらの排他性についてスクリーニングすることもできる。
本発明の変異体ポリペプチドのみを特異的に認識するが、野生型ポリペプチドを特異的に認識しないポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、例えば、試料を固体支持体上に固定された変異体ペプチド特異的ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体と共にインキュベートすることによって、変異体タンパク質を野生型タンパク質から単離するのに有用である。
ＸＩ．処置及び診断のための方法
様々な実施形態において、本発明は、疾患状態を予防、改善または処置する方法を提供する。これらの実施形態において、本発明は、疾患状態を予防、改善または処置するのに十分な量の本発明のポリペプチド多様体を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。例示的な疾患状態は、がんである。開示されるアゴニスト多様体は、細胞増殖の促進、特に血管新生、ならびに心血管疾患、肝臓疾患、筋骨格疾患、及び神経細胞疾患の処置に有用であり得る。例えば、本発明の特定のポリペプチド多様体は、過剰増殖性疾患または障害、例えば、様々な形態のがんの予防または処置において有用である。
例示的な実施形態において、本発明は、そのような処置を必要とする対象においてがんを処置する方法を提供する。本方法は、治療有効量の本発明のポリペプチド多様体を対象に投与することを含む。
本発明のポリペプチド多様体を、様々なＦＧＦ応答性障害の処置に使用することができることが企図され、これらの障害には、例えば、様々な眼障害、肺癌におけるＦＧＦ応答性腫瘍細胞、乳癌、結腸癌、前立腺癌、卵巣癌、頭頸部癌、卵巣癌、多発性骨髄腫、肝臓癌、胃癌、食道癌、腎臓癌、鼻咽頭癌、膵臓癌、中皮腫、黒色腫、及び神経膠芽腫が含まれる。
例示的な実施形態において、がんは、がん腫、例えば、大腸、扁平上皮細胞、肝細胞、腎臓、乳房、または肺である。
ポリペプチド多様体を使用して、腫瘍細胞の増殖を阻害または低減することができる。このようなアプローチにおいて、腫瘍細胞は、治療有効量のポリペプチド多様体に曝露され、腫瘍細胞の増殖を阻害または減少させる。ある特定の実施形態において、ポリペプチド多様体は、腫瘍細胞増殖を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％阻害する。
ある特定の実施形態において、ポリペプチド多様体を使用して、腫瘍細胞の増殖を阻害または低減し、多様体は、ＦＧＦ１がＦＧＦＲに結合する能力を低下させる。ある特定の実施形態において、ＦＧＦ１ポリペプチド多様体を使用して、創傷治癒を阻害または促進する。
加えて、ポリペプチド多様体を使用して、哺乳動物における腫瘍増殖または発症を阻害するか、または遅延させることができる。そのような方法では、有効量のポリペプチド多様体を哺乳動物に投与して、哺乳動物における腫瘍増殖を阻害または遅延させる。したがって、ポリペプチド多様体を使用して、例えば、哺乳動物における腫瘍を処置することができる。本方法は、治療有効量のポリペプチド多様体を、哺乳動物に投与することを含む。ポリペプチド多様体を、単独で、または別の薬学的に活性な分子と組み合わせて投与して、腫瘍を処置することができる。
一般に、治療有効量のポリペプチド多様体は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、任意選択で約１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、任意選択で約１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。投与量は、処置されるべき疾患または適応症の種類及び程度、特定の患者の全体的な健康状態、送達されるポリペプチド多様体の相対的な生物学的有効性、ポリペプチド多様体の製剤、製剤中の賦形剤の存在及び種類、ならびに投与経路等の変数に依存する。投与される初期用量は、所望の血液レベルまたは組織レベルを迅速に達成するために、上位レベルを超えて増加され得、または初期用量は最適用量よりも小さくあり得、１日用量は、特定の状況に応じて、処置過程中に漸進的に増加され得る。ヒト用量は、例えば、０．５ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇを実行するように設計された従来の第Ｉ相用量漸増試験で最適化されることができる。投与頻度は、投与経路、投薬量、及び処置される疾患状態等の因子に応じて異なることができる。例示的な投薬頻度は、１日１回、週１回、及び２週間に１回である。好ましい投与経路は、非経口、例えば、静脈内注入である。タンパク質に基づく薬物の製剤は、当該技術分野の通常の技術内である。本発明のいくつかの実施形態において、ポリペプチド多様体、例えば、タンパク質に基づく多様体は凍結乾燥され、投与時に緩衝生理食塩水中で再構成される。
ポリペプチド多様体を、単独で、または他の薬学的に活性な成分と組み合わせて、投与することができる。他の活性成分、例えば、免疫調節剤を、ポリペプチド多様体と共に投与することができ、またはポリペプチド多様体の前または後に投与することができる。
治療使用のためのポリペプチド多様体を含有する製剤は、典型的には、薬学的に許容される担体と組み合わせたポリペプチド多様体を含む。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」とは、合理的な利益／リスク比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしに、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに好適である、緩衝液、担体、及び賦形剤を意味する。担体（複数可）は、製剤の他の成分と適合し、レシピエントに有害ではないという意味で「許容される」べきである。薬学的に許容される担体は、この点において、薬学的投与と適合する任意及び全ての緩衝液、溶媒、分散媒体、コーティング、等張剤及び吸収遅延剤等を含むことが意図される。そのような培地及び薬学的に活性な物質のための薬剤の使用は、当該技術分野で既知である。
製剤を、好都合に、投薬単位形態で提示することができ、薬学分野において既知の方法のうちのいずれかを含む、任意の好適な方法によって調製することができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）。
例示的な実施形態において、ポリペプチド多様体は、インビトロまたはインビボのいずれかで診断目的で使用され、ポリペプチド多様体は、典型的に、検出可能部分で直接または間接のいずれかで標識される。検出可能部分は、直接的または間接的に検出可能なシグナルを産生することができる任意の部分であることができる。例えば、検出可能部分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、もしくは１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、Ｃｙ５．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ（登録商標）色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＩＲＤｙｅ（登録商標）赤外線色素（ＬＩ－ＣＯＲ（登録商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ローダミン、もしくはルシフェリン等の蛍光化合物または化学発光化合物、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、もしくはホラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素、スピンプローブ、例えばスピン標識等のスピンプローブ、または着色粒子、例えばラテックスもしくは金粒子であり得る。ポリペプチド多様体を、例えば、Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９６２）Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５、Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４、Ｐａｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ４０：２１９、及びＮｙｇｒｅｎ（１９８２）Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７に記載されるように、当技術分野で既知のいくつかのアプローチを使用して検出可能部分にコンジュゲートさせることができることが理解される。標識は、例えば、視覚的に、または分光光度計もしくは他の検出器もしくは他の適切な造影システムの補助を使用して検出され得る。
ポリペプチド多様体は、当該技術分野で利用可能な幅広い免疫アッセイ技術に使用することができる。例示的免疫アッセイとしては、例えば、サンドイッチ免疫アッセイ、競合免疫アッセイ、免疫組織化学的手順が挙げられる。
サンドイッチ免疫アッセイでは、目的の分析物または抗原に結合する２つの抗体、例えば、１つは、固体支持体上に固定化され、１つは、溶液中に遊離され、検出可能部分で標識される抗体が使用される。抗原を含有する試料がこの系に導入されると、抗原は固定化された抗体及び標識された抗体の両方に結合し、支持体の表面上に「サンドイッチ」免疫複合体を形成する。複合体化タンパク質は、非結合試料成分及び過剰な標識抗体を洗い流し、支持体の表面上のタンパク質に複合体化された標識抗体の量を測定することによって検出される。代替的には、溶液中に遊離である抗体は、遊離抗体に結合する検出可能部分で標識された第３の抗体によって検出されることができる。免疫学的アッセイ設計、理論及びプロトコルの詳細なレビューは、Ｂｕｔｔ，ｅｄ．，（１９８４）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、及びＤｉａｍａｎｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎを含む多くのテキストに見出すことができる。
標識されたポリペプチド多様体がインビボ造影剤として有用であることが企図され、それによって、ポリペプチド多様体は、造影剤をレシピエントにおける目的の特定の組織に標的化することができる。インビボ造影のための遠隔に検出可能部分は、放射性原子９９ｍＴｃ、約６時間の半減期を有するガンマ放出体を含む。放射性核種診断剤の非限定的な例としては、例えば、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４－１５８Ｇｄ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、８３Ｓｒ、または他のγ、β、もしくは陽電子放射性物質が挙げられる。
インビボ造影にも有用な非放射性部分には、窒素スピン標識、ならびにランタニド及び遷移金属イオンが含まれ、これらは全て、インサイチュで陽子弛緩を誘導する。複合体化放射性部分を造影することに加えて、標的化細胞を破壊するために、標準的な放射線免疫治療プロトコルで使用し得る。
フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリテリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ－フタルアルデヒド、及びフルオレスカミンを含むが、これらに限定されない、様々な蛍光標識が当該技術分野で知られている。使用の化学発光標識としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、またはシュウ酸エステルが挙げられ得る。
開示のポリペプチド多様体をまた、蛍光マーカーで標識して、インビボでの検出を可能にし得る。いくつかの実施形態において、蛍光標識はＣｙ５．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）である。他の実施形態において、蛍光標識は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ（登録商標）色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。いくつかの実施形態において、蛍光標識はＩＲＤｙｅ（登録商標）赤外線色素（ＬＩ－ＣＯＲ（登録商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。
高用量放射線治療のための例示的なヌクレオチドには、放射性原子９０Ｙｔ、１３１Ｉ、及び１１１Ｉｎが含まれる。ポリペプチド多様体は、造影技術分野で既知のカップリング技術を使用して、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、及び９９ｍＴＣで標識することができる。同様に、造影剤を調製及び投与するための手順、ならびに画像を捕捉及び処理するための手順は、造影技術分野で既知であるため、本明細書では詳細に論じない。同様に、抗体に基づく免疫治療を行うための方法は、当該技術分野で既知である。例えば、米国特許第５，５３４，２５４号を参照されたい。
実施例１：タンパク質分解的に安定な増殖因子を操作するためのハイスループットスクリーニング方法
摘要
増殖因子は、再生医療及びがん処置のための治療分子として開発されるべき大きな可能性を有する調節タンパク質の重要なクラスである。しかしながら、治療分子としての増殖因子の活性及び有効性は、それらの不十分な熱及びタンパク質分解安定性によって大きく制限される。多数の方法が増加した熱安定性を有する増殖因子を操作するために開発されているが、増加したタンパク質分解安定性を有する増殖因子を操作するための焦点及び方法開発が欠如している。プラスミン、エラスターゼ、ｕＰＡ、カテプシン、及びＭＭＰ等のプロテアーゼは、細胞外マトリックス分解及びシグナル伝達において、特に創傷治癒及び腫瘍形成において重要な役割を果たしている。これらのプロテアーゼは、通常、増殖因子をも分解することが報告されている。本研究では、増加したタンパク質分解安定性のために増殖因子を操作するための一般化可能な方法を記載する。酵母ディスプレイプラットフォーム及びＦＡＣＳスクリーニングを組み合わせ的アプローチとして利用して、増加したタンパク質分解安定性を有する変異体を選択する。この方法は、スクリーニングが野生型ＦＧＦ１と、文献に報告されているタンパク質分解的に安定なＦＧＦ１変異体とを区別する能力を実証することによって検証された。
序論
この実施例は、スクリーニングのために、酵母ディスプレイプラットフォーム及びフロー活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、タンパク質分解的に安定な増殖因子を操作するための組み合わせ的アプローチを記載する。ＦＧＦ１をモデル例としてスクリーニング方法を設定するプロセスを実証する。ＦＧＦ１は熱及びタンパク質分解安定性が極めて不十分であるために、スクリーニングはＦＧＦ１のために設定した１４，２１。最低の安定性を有する野生型増殖因子は、治療薬での使用のための安定バージョンを操作するための最大の必要性を有する。したがって、不十分に安定であるモデル増殖因子を選択することによって、増殖因子を操作する方法の有用性を実証することが重要であった。この例において、スクリーニングのための選択圧としての血清またはいくつかの異なるプロテアーゼの使用を探索した。最後に、スクリーニングが異なるタンパク質分解安定性のＦＧＦ多様体を区別する能力を検証した。実施例２では、タンパク質分解的に安定なＦＧＦ１変異体の操作及び特徴付けによる組み合わせ的スクリーニングの能力が示される。
結果
タンパク質分解的に安定なタンパク質を操作するための組み合わせ的スクリーニング方法のワークフロー
高親和性結合剤を操作するために通常に使用される酵母ディスプレイプラットフォームもまた、より大きなタンパク質分解安定性を有するタンパク質を操作するために利用される（図１）。単一の増殖因子多様体の数千個のコピーがテザリング融合体として酵母の表面上にディスプレイされる。血球凝集素（ＨＡ）タグは、増殖因子の上流に発現され、一方、ｃ－ｍｙｃタグは、増殖因子の下流に発現される。細胞は、対応する受容体の可溶性Ｆｃ融合体と共にインキュベートされ得、これは酵母がディスプレイする増殖因子に結合することができる。
酵母ディスプレイプラットフォームをフロー活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）と組み合わせて、より高いタンパク質分解安定性を有する増殖因子を操作する（図２）。増殖因子変異体のライブラリは、ランダム変異誘発、指向性変異誘発、またはＤＮＡシャッフリングによって生成される。酵母細胞のライブラリを目的のプロテアーゼと共にインキュベートし、その間に酵母表面にディスプレイされるタンパク質の切断が生じる。より大きなタンパク質分解安定性を有する増殖因子変異体は、酵母細胞表面上の切断に対してより耐性がある。プロテアーゼインキュベーション後、細胞を洗浄し、保持された受容体結合親和性を有する適切に折り畳まれた増殖因子変異体に結合する機能性受容体の可溶性Ｆｃ融合体と共にインキュベートする。ＦＡＣＳを使用して、適切に折り畳まれた未切断増殖因子変異体を選別し、これらを拡張し、次の選別ラウンドのために誘導する。
Ｆｃドメイン、ｃ－ｍｙｃドメイン、及びＨＡタグに対する蛍光抗体マーカーを使用して、受容体結合、増殖因子特異的切断、及び非特異的切断を測定する（表２．１）。結合したＦｃ融合受容体の検出は、増殖因子における変異が受容体に対する結合親和性を著しく低下させないか、または不適切なタンパク質折り畳みをもたらさないことを確保するために重要である。増殖因子特異的切断は、増殖因子のタンパク質分解安定性の直接的な尺度である。切断された増殖因子は除去されたＣ末端ｃ－ｍｙｃタグを有するので、それはｃ－ｍｙｃシグナルによって検出される。プロテアーゼが酵母表面ディスプレイタンパク質Ａｇａ１ｐ及びＡｇａ２ｐを切断するときに、非特異的切断は生じる。非特異的切断中、３つ全てのマーカーについての蛍光シグナルは減少する。これは、増殖因子切断及び結合活性を検出するためのダイナミックレンジが減少するため、望ましくない。したがって、ＨＡシグナルを使用して、目的のプロテアーゼによる非特異的切断が最小であることを確保する。
ＦＧＦ１の酵母ディスプレイ
ＦＧＦ１を、タンパク質分解安定性スクリーニングの設定を実証するためのモデルとして選択した。野生型ＦＧＦ１をｐＣＴベクターにクローニングし、Ａｇａ２ｐ交配タンパク質への融合体としてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母細胞の表面上で発現させた（図３Ａ）。酵母細胞表面上のＦＧＦ１の成功裡の発現は、タンパク質のＣ末端上のｃ－ｍｙｃタグの検出によって確認された（図３Ｂ）。最後に、ＦＧＦＲ１－Ｆｃへの特異的結合活性を測定することによって、酵母ディスプレイＦＧＦの適切な折り畳みを確認した（図３Ｃ）。
タンパク質分解的に安定なＦＧＦ１を操作するためのプロテアーゼの選択
ＦＧＦ１のタンパク質分解安定性スクリーニングを開発するための血清、トリプシン、キモトリプシン、及びプラスミンの使用を試験した。これらのプロテアーゼは、ＦＧＦ１に対するそれらの科学的及び生物学的関連性に基づいて選択された。スクリーニングに対するプロテアーゼの適合性は、酵母ディスプレイタンパク質の最小の非特異的切断を有して、合理的な速度で増殖因子を切断する能力によって決定された。
最初に、体内の増殖因子によって遭遇する可能性がある多数のプロテアーゼからなる天然血液生成物である血清を使用してスクリーニングを開発することを試みた２２～２４。ＦＧＦ１変異体のライブラリを、様々な濃度の胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）と共にインキュベートして、ＦＧＦ１切断及びＦＧＦＲ１－Ｆｃ結合シグナルの減少を観察することができるかどうかを確認した（図４）。ＦＢＳの濃度が１００％に増加した場合でも、ＦＧＦ１切断シグナル（α－ｃ－ｍｙｃ）及びＦＧＦＲ１－Ｆｃ結合シグナルの最小の減少のみが観察されたことを見出した。したがって、血清は、低いタンパク質分解安定性を有する酵母ディスプレイＦＧＦ１変異体を切断するのに十分にストリンジェントな選択圧を提供しなかったと結論づけた。
次に、タンパク質のタンパク質分解安定性を測定及び報告するために通常に使用される２つのプロテアーゼであるトリプシン及びキモトリプシンを使用して、スクリーニングの開発を試験した。酵母ディスプレイ野生型ＦＧＦ１を、様々な濃度のトリプシン（図５）及びキモトリプシン（図６）と共にインキュベートし、次いでタンパク質切断（α－ｃ－ｍｙｃ）及びＦＧＦＲ１－Ｆｃへの結合の程度を測定した。トリプシン及びキモトリプシンの両方が、観察されたタンパク質切断及びＦＧＦＲ１－Ｆｃへの結合の程度に、濃度依存的影響を有したことを見出した。次に、観察されたタンパク質切断が非特異的切断（α－ＨＡ）またはＦＧＦ１特異的切断（α－ｃ－ｍｙｃ）に起因するかどうかを決定した。より高いトリプシン濃度を有するインキュベーション時に、ＨＡシグナルが有意に減少したことを見出し、これは、観察されたトリプシンによるタンパク質切断の多くが非特異的切断に起因することを示した（図７）。したがって、トリプシンをタンパク質分解安定性スクリーニングに使用することはできないと結論付けた。一方ＨＡシグナルはより高いキモトリプシン濃度を有するインキュベーションによって比較的影響を受けなかったが、ｃ－ｍｙｃシグナルのみが減少したことを見出し、これは、キモトリプシンによるタンパク質切断が主にＦＧＦ１内の切断に起因することを示した（図８）。したがって、キモトリプシンは、タンパク質分解安定性スクリーニングで使用される合理的な候補であると結論づけた。
最後に、細胞外マトリックスタンパク質を分解し、ＦＧＦ１を分解することが報告されているプロテアーゼであるプラスミンを使用して、タンパク質分解安定性スクリーニングの開発を評価した２５。酵母ディスプレイ野生型ＦＧＦ１を、様々な濃度のプラスミンと共にインキュベートし、酵母ディスプレイタンパク質が濃度依存性の態様で切断されたことを見出した（図９）。観察された切断が非特異的ではなくＦＧＦ１特異的であることを確認するために、酵母ディスプレイＦＧＦ１の切断を、酵母ディスプレイタンパク質である、Ａｇａ１及びＡｇａ２、ならびにＨＡ及びｃ－ｍｙｃタグのみを発現する空の対照と比較した（図１０）。９６時間にわたるプラスミンとのインキュベーション中、酵母ディスプレイＦＧＦ１が切断され、一方、空の対照が切断されなかったことを見出した。したがって、観察された切断はＦＧＦ１特異的であると結論づけた。
野生型ＦＧＦ１とタンパク質分解安定性ＦＧＦ１変異体との間を区別することによるスクリーニング方法の検証
異なるタンパク質分解安定性のＦＧＦの間を区別するためにプラスミンに基づくスクリーニングの能力を試験するために、野生型（ＷＴ）ＦＧＦ１を、合理的設計によって文献中で開発された熱安定化ＦＧＦ１変異体（ＰＭ２）と比較した１４。ＰＭ２は、トリプシンの存在下でより安定であると、Ｚａｋｒｚｅｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．によって特徴付けられた。プラスミンがトリプシンと一次配列特異性を共有するため、ＰＭ２はプラスミンによる切断に対してより耐性があるであろうという仮説を立てた。したがって、プラスミンを使用する機能的タンパク質分解安定性スクリーニング方法が、ＷＴ ＦＧＦ１と比較して、ＰＭ２のより少ないＦＧＦ１特異的切断を観察することを可能にすることを期待した。
ＰＭ２またはＷＴ ＦＧＦ１をディスプレイする酵母細胞を、様々な濃度のプラスミンと共に４８時間インキュベートし、非特異的切断（抗ＨＡ）及びＦＧＦ１特異的切断（抗ｃ－ｍｙｃ）について染色した（図１１）。集団のクリーンな分離はｃ－ｍｙｃシグナルの差によって得ることができ、ＨＡシグナルに対する影響は比較的少なかったことが見出された。切断シグナルのこの差異は、プラスミンを使用することにより、スクリーニングがより高いタンパク質分解安定性を有する新しいＦＧＦ変異体を適切に同定し、ＦＡＣＳによってこれらの集団について選別することを可能にすることを確認した。
考察
本実施例において、酵母表示プラットフォームを使用してタンパク質分解的に安定な増殖因子を操作するための高スループットの一般化可能なスクリーニング方法の開発と、フロー活性化細胞選別とについて記載する。例として、非常に不安定な増殖因子であるＦＧＦ１のスクリーニングのセットアップが提供される。
目的の増殖因子のスクリーニングを確立する際、第１のステップは、増殖因子が酵母の表面上で発現されることができ、それがその受容体の可溶性バージョンに結合することができることを確保にすることである。ＦＧＦ１は、Ａｇａ２酵母ディスプレイタンパク質へのＣ末端融合体としてｐＣＴベクター内で発現されることができ、ＦＧＦＲ１－Ｆｃに特異的に結合することが確認された。過去に、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、及びＨＧＦは、酵母ディスプレイによって成功裡に発現されている６，２６，２７。これは、酵母ディスプレイに基づくタンパク質分解スクリーニング方法が、他の増殖因子にもより一般的に適用されることができることを示唆する。増殖因子がｐＣＴベクターで発現されることができない場合、ｐＴＭＹベクターを使用して、増殖因子を、代わりにＡｇａ２へのＮ末端融合体として成功裡に発現し得る。ＨＧＦの場合、ｐＣＴベクターで発現させることはできなかったが、ｐＴＭＹで成功裡に発現させた。
第２のステップは、タンパク質分解スクリーニングに使用されるべきプロテアーゼを決定することであった。酵母ディスプレイＦＧＦ１を操作するための血清、トリプシン、キモトリプシン、及びプラスミンの使用を試験した。胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）は、高濃度であっても弱すぎる選択圧を提供したことを見出した。プロテアーゼはＦＢＳに見出されるが、α－１－抗プロテイナーゼ及びα－１－抗キモトリプシン等のＦＢＳに見出されるプロテアーゼ阻害剤は、それらの活性を低下させ得る２８。ＦＧＦ１が特に不安定な増殖因子であることを考慮すると、ＦＢＳが他の増殖因子を操作するための適切な選択タンパク質分解圧ではない可能性もある。しかしながら、新生児ウシ血清、成体ウシ血清、またはヒト血清等の異なる組成物を有する他のタイプの血清が考慮され得る。文献においてタンパク質のタンパク質分解安定性を測定するために通常に使用されるプロテアーゼであるトリプシン及びキモトリプシンの使用を試験した。これは、トリプシン及びキモトリプシンが高い活性及び低い特異性を有し、これにより、それらがある特定の分解速度でほぼ任意のタンパク質を切断することを可能にするためである可能性が高い２９。しかしながら、これらの特性は、タンパク質分解安定性スクリーニングで使用するためにそれらを魅力的にしない場合がある。トリプシンについて、発現（ｃ－ｍｙｃ）シグナルの欠如の多くは酵母ディスプレイタンパク質の非特異的切断に起因し、トリプシンを任意の増殖因子のタンパク質分解安定性スクリーニングの不十分な候補とすることを見出した。キモトリプシンは、有意なレベルの非特異的切断を実証しなかったように思われるが、そのプロテアーゼは主に消化管に見出され、血流中の増殖因子に生物学的に関連する可能性は低いことに留意することが重要である。最後に、実質的に全ての組織に見出され、ＦＧＦ１を分解することが示されている１３，２５プロテアーゼであるプラスミンの使用を試験した。プラスミンはまた、ＶＥＧＦ等の他の増殖因子の分解に関与している３０。プラスミンが酵母ディスプレイＦＧＦ１を特異的に切断することができ、酵母ディスプレイタンパク質の非特異的切断が比較的少なかったことを見出した。試験することができたプロテアーゼに基づいて、プラスミンはスクリーニングの選択圧として使用するのに最も適切なプロテアーゼであると結論づけた。エラスターゼ、ｕＰＡ、カテプシン、及びＭＭＰ等の増殖因子に生物学的に関連する他のプロテアーゼはまた、記載されるように、酵母ディスプレイタンパク質の高増殖因子特異的切断及び低非特異的切断について試験することによって検証し得る。
スクリーニングの設定における最終ステップは、異なるタンパク質分解安定性を有する増殖因子変異体が分化されることができるかどうかを決定することである。この任意選択のステップは、スクリーニングがタンパク質分解的に安定な変異体を選択する能力に信頼性を提供する重要なベンチマークを提供する。ＦＧＦ１について、増加した熱及びタンパク質分解安定性を有するＦＧＦ１変異体であるＰＭ２が、酵母の表面上にディスプレイされるときに野生型ＦＧＦ１から分化され得ることを確認した。利用可能なタンパク質分解安定化増殖因子変異体の非存在下で、プロテアーゼが、酵母ディスプレイタンパク質の高増殖因子特異的切断及び低非特異的切断を実証する限り、スクリーニングを依然として行われ得る。実施例２では、我々が開発した方法を使用するタンパク質分解安定性のためのＦＧＦ１の操作を報告する。
材料及び方法
酵母ディスプレイ構築物のクローニング
ＦＧＦ１を、酵母ディスプレイのために、ヒトＦＧＦ１ ｃＤＮＡ（ＭＧＣクローン：９２１８、画像：３８９６３５９、残基：Ｐｈｅ１６～Ａｓｐ１５５）からｐＣＴベクター（制限部位：ＮｈｅＩ、ＢａｍＨＩ）内にクローニングした。タンパク質分解的に安定なＦＧＦ１変異体であるＰＭ２のために、部位特異的変異誘発を使用して、変異Ｑ４０Ｐ（ＣＡＡ～ＣＣＡ）、Ｓ４７Ｉ（ＴＣＣ～ＡＴＣ）、及びＨ９３Ｇ（ＣＡＴ～ＧＧＴ）をＦＧＦ１に作成した。
酵母ディスプレイＦＧＦ１の結合アッセイ
５０，０００個の誘導酵母細胞を、１ｇ／ＬのＢＳＡ（ＰＢＳＡ）と共に室温で、リン酸緩衝生理食塩水中で、様々な濃度のヒトＦＧＦＲ１ベータ（ＩＩＩｃ）－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共にインキュベートした。細胞を、リガンド枯渇を回避するために十分に多い体積で、平衡に到達するために十分に長い時間（典型的には３～２４時間）、インキュベートした。インキュベーションの最後の３０分間、酵母細胞を、ＰＢＳＡ中のチキン抗ｃ－Ｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１：２５００希釈物と共にインキュベートした。酵母をペレット化し、洗浄し、次いで抗ｃ－ｍｙｃに対する抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）及び抗チキン－ＩｇＹ－ＰＥ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の二次抗体の１：２００の希釈物と共に１０分間氷上でインキュベートした。ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅを使用するフローサイトメトリーによる分析の直前に、酵母を洗浄し、ペレット化し、ＰＢＳＡ中に再懸濁した。フローサイトメトリデータを、ＦｌｏｗＪｏ（ｖ７．６．１）を使用して分析した。結合曲線をプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用してＫｄ値を得た。
スクリーニングのためのタンパク質分解安定性アッセイ
胎仔ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ）、ウシ膵臓由来のトリプシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ウシ膵臓由来のキモトリプシンＶＩＩ型（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、またはヒト血漿由来のプラスミン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、インキュベーションのためのプロテアーゼまたはプロテアーゼ混合物として使用した。胎仔ウシ血清を、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）中で希釈した。トリプシン及びキモトリプシンをトリプシン緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭのＣａＣｌ２、１％のＢＳＡ）中で希釈した。プラスミンをプラスミン緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、０．０１％のＢＳＡ、ｐＨ８．５）中で希釈した。
１００万個の誘導酵母細胞を、適切な緩衝液中の様々な濃度のプロテアーゼと共にインキュベートした。インキュベーションの最後に、細胞をＰＢＳＡ（ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ）で１回洗浄し、緩衝プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中に再懸濁して、残留プロテアーゼ活性をクエンチした。５分後、細胞をＰＢＳＡでもう一度洗浄した。ＦＧＦＲ結合活性を測定した実験のみについて、細胞をｐＢＳＡ中の１０ｎＭのヒトＦＧＦＲ１ベータ（ＩＩＩｃ）－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）中で１時間インキュベートした。最終洗浄後、細胞を適切な蛍光抗体と共にインキュベートした。
ＦＧＦＲ１結合活性及びｃ－ｍｙｃシグナルを測定する実験のために、細胞を、ＰＢＳＡ中のチキン抗ｃ－Ｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１：２０００希釈物と共に３０分間インキュベートした。洗浄後、次いで、細胞を抗ｃ－ｍｙｃに対する抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）及び抗チキン－ＩｇＹ－ＰＥ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）である二次抗体において氷上で１０分間インキュベートした。
ＨＡ及びｃ－ｍｙｃシグナルを測定する実験のために、細胞を、抗ＨＡ－Ｔａｇ（６Ｅ２）マウスｍＡｂ（細胞シグナル伝達）の１：１０００希釈物及びチキン抗ｃ－ｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１：２０００希釈物と共に３０分間インキュベートした。洗浄後、次いで、細胞をヤギ抗マウス－ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びヤギ抗チキン－ＩｇＹ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）である二次抗体において氷上で１０分間インキュベートした。
ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅを使用するフローサイトメトリーによる分析の直前に、酵母を洗浄し、ペレット化し、ＰＢＳＡ中に再懸濁した。フローサイトメトリデータを、ＦｌｏｗＪｏ（ｖ７．６．１）を使用して分析した。結合曲線をプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用してＫｄ値を得た。
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実施例２：タンパク質分解安定化線維芽細胞増殖因子の操作
摘要
ＦＧＦ１は、創傷治癒、組織再生、腫瘍形成、及び他の血管新生依存性疾患中の細胞分化及び血管新生の誘導において有意な役割を果たす。したがって、ＦＧＦ１に基づくアゴニスト及びアンタゴニストは、細胞培養及びタンパク質治療薬の重要な用途を有することができる。しかしながら、ＦＧＦ１は、培養物中のプロテアーゼに曝露されたときに分解に対する感受性を示すことが報告されている。その不十分なタンパク質分解安定性は、細胞培養において、または治療分子として開発される場合、それらの活性及び有効性を妨げることができる。この実施例において、ＦＧＦ１ペプチドを、実施例１に記載の酵母ディスプレイに基づくスクリーニング方法を使用してタンパク質分解安定性のために操作した。タンパク質分解的に安定なＦＧＦの選択のためのゲーティング戦略及びは、特徴付けのための候補を成功裡に同定し、探索された。
序論
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、胚発達、細胞分化、細胞増殖、細胞移動、血管新生、代謝、及び創傷治癒を含む生物学的活性を調節する重要な増殖因子ファミリーの一部である１，３１～３５。したがって、ＦＧＦに基づく治療薬は、がん治療、創傷治癒、組織再生、及び代謝障害の処置における適用について興味がもたれてきた３２，３６，３７。多くのＦＧＦファミリーメンバーのうち、ＦＧＦ１は、ＦＧＦＲ１及びＦＧＦＲ２を介したシグナル伝達によって内皮細胞において血管新生促進表現型を誘導することが知られている最も有意なＦＧＦリガンドの１つとして特に興味深い３８。
ＦＧＦ１は、機能的血管を回帰から保護し、動脈成長を誘導し、毛細血管の増殖を促進することが報告されている３９，４０。ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）における管形成及びマトリゲルプラグアッセイにおける血管の形成を誘導することが見出された４１。
創傷治癒及び組織再生のための血管新生の誘導におけるＦＧＦ１の有効性にもかかわらず、治療剤としてＦＧＦ１を利用するための努力は、ほとんど成功していない。ＦＧＦ１をコードする注射可能な筋肉内プラスミドの形態の遺伝子治療は、第Ｉ相及び第ＩＩ相臨床試験に示され、灌流を改善し、末期下肢虚血を有する患者における切断の必要性を低減する４２，４３。しかしながら、それは、重篤な肢体虚血を有する患者における切断または死亡の低減に関する第ＩＩＩ相臨床試験において臨床的有効性を示すことができなかった４４。ＣａｒｄｉｏＶａｓｃｕｌａｒ ＢｉｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓはまた、潰瘍、冠動脈疾患、及び末梢動脈疾患の処置のための組換え野生型ＦＧＦ１（ＣＶＢＴ－１４１）を開発しているが、臨床試験はほぼ２０年間失敗し続けている４５。
多くの臨床応用において有効である組換えＦＧＦ１の失敗は、その不十分な安定性に部分的に起因する可能性がある。野生型ＦＧＦ１は、条件付けられた培地または培養物中、３７℃でインキュベートすると、約２５分の分解半減期で急速に分解される１４，２１。創傷治癒の領域に見出される主要なプロテアーゼであるプラスミンが、ＦＧＦ１及びＦＧＦ２の両方を分解することができることが具体的に示されている２５，４６，４７。
この実施例は、実施例１に記載され、開発されたスクリーニング方法を使用して、プラスミンに対する改善されたタンパク質分解安定性のためのＦＧＦ１の操作を記載する。ＦＧＦ１を、酵母表面ディスプレイプラットフォームを使用して操作して、遺伝子タンパク質間結合を確立した。各増殖因子のランダム変異誘発ライブラリを、ＦＧＦＲ１結合剤についてスクリーニングし、次いで、プロテアーゼとのインキュベーション後に切断されていないままであった変異体、及び最後に、プロテアーゼとのインキュベーション後に切断されていないままであり、ＦＧＦＲ１結合を保持した変異体についてスクリーニングした。各増殖因子のタンパク質分解安定性を増加させると思われるいくつかの有望な変異を同定し、実施例３に記載されるように特徴付けのための候補を生成した。
結果
野生型ＦＧＦの酵母ディスプレイ及びランダム変異誘発ライブラリの生成
適切に折り畳まれた野生型ＦＧＦ１の成功裡の酵母ディスプレイを以下に記載する。エラープローンＰＣＲをヌクレオチド類似体と共に使用して、野生型ＦＧＦ１内の変異をランダムに生成した。３．３×１０７個の変異体を有するライブラリを生成した。ヌクレオチド類似体の濃度を変化させることにより、変異体当たり平均３．１個の変異を生成することができた（変異率２．１％）。これは、改善されたタンパク質分解性を有する変異体を生成するのに十分に高く、ＦＧＦＲ１受容体に対する適切なタンパク質折り畳みまたは結合親和性を損なうであろう変異の蓄積を回避するのに十分に低い多様性であると仮説をたてた。
選別１：ＦＧＦＲ１－Ｆｃへの結合剤の選択
第１の選別のために、ＦＧＦ１変異体を、ＦＧＦＲ１－Ｆｃに対する結合親和性を保持したものについて選別した（図１２Ａ）。ほとんどのランダム変異は結合親和性の喪失をもたらすという仮説を立てた。ＦＧＦＲ１－Ｆｃとのインキュベーション後、高発現（α－ｃ－ｍｙｃ）及び高結合シグナル（α－ＦＧＦＲ１－Ｆｃ）を示した細胞についてゲーティングし、収集した。ＦＧＦ１ライブラリについて、非結合剤であった変異体と、ＦＧＦＲ結合親和性を保持した多様体との間の明確な分離が観察された（図１２Ｂ）。
選別２：ＦＧＦ１特異的切断に対する耐性の選択
第２の選別のために、選別１由来の細胞を拡張し、プラスミンと共にインキュベートしたときに切断に耐性を維持したＦＧＦ１変異体について選別した（図１３Ａ）。効果的なダイナミックレンジを取得し、異なるタンパク質分解安定性を有する変異体間を区別するために、細胞のインキュベーションを、様々な濃度及びインキュベーションの期間で試験した。ＦＧＦ１ライブラリについては、切断変異体及び未切断変異体の集団間の明確な分離を達成するために４００ｎＭのプラスミンと共に３６時間インキュベーションすることが必要であることが見出された（図１３Ｂ）。最高レベルのプロテアーゼ耐性を示す細胞の上位１～２％を収集し（高α－ｃ－ｍｙｃ）、発現レベルによって正規化した（α－ＨＡ）。
スクリーニング中のペプチドアーティファクトの単離。
第２の選別のＦＧＦ１ライブラリを拡張し、ＨＡ及びｃ－ｍｙｃシグナルを使用して、ＦＧＦ１特異的切断に対する耐性についての別のラウンドの選択に供した。３６時間のインキュベーションのために２００ｎＭのプラスミンと共にインキュベートすると、他の残りのライブラリと比較してはるかにより高いｃ－ｍｙｃシグナルを示した細胞の集団が明確に観察され、これは、プラスミンによる切断に対する酵母ディスプレイタンパク質の有意により大きな耐性を示している（図１４Ａ）。この集団を収集し、分析のために個々のクローンを配列決定した（図１４Ｂ）。細胞の大部分は、それらの細胞表面上にＦＧＦ２変異体を発現せず、代わりにランダム変異誘発中に生成され得る短いペプチドアーティファクトを発現することが見出された。
これらのペプチドがＦＧＦＲ１－Ｆｃに任意の特異的結合を示さなかったことが確認され、これは、ＦＧＦ１特異的切断に対する耐性についての選別が、これらのペプチドアーティファクトを発現する非常に小さな細胞集団の急速な富化につながったことを示している（図１５）。したがって、すべての後続の種類について、我々は、ＦＧＦＲ１結合親和性を保持するための選択圧を含むように進めた。
選別３－４：プロテアーゼ耐性ＦＧＦＲ１－Ｆｃ結合剤の選択
残りの選別３及び４のために、ライブラリをプラスミン、及びその後選択前にＦＧＦＲ１－Ｆｃと共にインキュベートした（図１６）。α－ＨＡ、α－ｃ－ｍｙｃ、及びα－ＦＧＦＲ１－Ｆｃの異なる組み合わせを使用して、未切断のままであり、ＦＧＦＲ１に対する結合親和性を保持したままであったＦＧＦ１変異体を選択した。
第３の選別のＦＧＦ１のために、選別２からの細胞を拡張し、プラスミンとのインキュベーション後にＦＧＦＲ１結合を保持したＦＧＦ変異体について選別した（図１７）。より高い濃度のプラスミンを使用した１２時間のインキュベーションを行った。１．５μＭのプラスミンを、ＦＧＦ１ライブラリの選別に最終的に使用した。高結合シグナル（α－ＦＧＦＲ１－Ｆｃ）及び高発現（α－ＨＡ）を示した細胞についてゲート化し、収集した。
第４のＦＧＦ１の選別のために、選別３から細胞を拡張し、プラスミンインキュベーション時間を１２時間から３６時間に増加させた。選別３由来の細胞を、１．５μＭのプラスミンまたは５００ｎＭのプラスミンのいずれかにおいてインキュベートした。５００ｎＭのプラスミンと共にインキュベートした細胞について最終的に選別した（図１８）。切断に対する高い耐性（α－ｃ－ｍｙｃ）及び高い結合シグナル（α－ＦＧＦＲ１－Ｆｃ）を示した細胞についてゲート化し、収集した。選別４によって、ＦＧＦ１ライブラリについて完了したコンセンサスに達し、選別のさらなるラウンドを行うために捕捉した。
選別ＦＧＦ１変異体の配列分析
最終選別４のために、個々のクローンをランダムに選択し、分析のために配列決定した。４ラウンド以内の選別で完全なコンセンサスに達することができた。変異体（ＢＳ４Ｍ１）は、Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｒの２つの変異を含む（図１９）。アスパラギン酸２８は、ＦＧＦ１の６本鎖βバレル構造を閉じる３つの主要βヘアピンの第１（ＬＰＤＧ）の一部である。ロイシン１３１は、ＦＧＦ１のＮ末端とＣ末端との間のβ鎖対内に見出される。
考察
本実施例において、プラスミンに対するタンパク質分解安定性のためのＦＧＦ１の操作を記載した。第１のステップとして、野生型ＦＧＦ１及び野生型ＦＧＦ２を成功裡に発現することができた。タンパク質は、ＦＧＦＲ１－ＦｃまたはｓＦＧＦＲ３－Ｄ２Ｄ３－Ｆｃに対する特異的結合についてのｃ－ｍｙｃタグ試験の検出によって、成功裡に発現され、適切に折り畳まれることが示された。ＦＧＦ１は比較的高い発現シグナルを示すことが観察され、これは、ＦＧＦ１が短い半減期及び低い融解温度で不安定であると考えられることを考慮すると興味深い２１。酵母ディスプレイの発現及び分泌効率は、不十分に安定なタンパク質のタンパク質安定性と緩やかに相関することが報告されているが、これは必ずしもそうではない４８，４９。したがって、この実施例は、酵母ディスプレイが操作のための不安定な野生型増殖因子の発現を収容することができたことを実証した。
酵母ディスプレイによるＦＧＦ１の高発現は、ＦＧＦ１ランダム変異誘発ライブラリの選別及びその後の選別中に良好なダイナミックレンジのシグナルにつながった。ＦＧＦ１選別は、ストリンジェンシーを増加させるために、高濃度のプラスミン及び長いインキュベーション時間に供され得る。これは、切断ＦＧＦ１変異体と非切断ＦＧＦ１変異体との間の明確な分離が達成された、選別２において特に貴重であった。
選別１におけるＦＧＦＲ結合剤を選択するために最初の選別ラウンドを行ったが、切断を測定するためにＨＡ及びｃ－ｍｙｃシグナルのみを使用することは、選別における非ＦＧＦＲ結合ペプチドの急速な富化につながったことを見出した。わずか２つのそのような選別において、ペプチド発現集団の残りのライブラリからの明確な分離が同定された。ライブラリは、野生型ＦＧＦを足場とするランダム変異誘発によって構築されたが、ランダム変異誘発プロセスにおける稀なエラーは、おそらくペプチドアーティファクトを発現する細胞の極めて小さい集団につながった。これらのアーティファクトは、親和性成熟のためのより伝統的な酵母ディスプレイスクリーニングにとってほとんど結果がないであろうが、それらは、受容体結合についての選択圧なしで急速に有意になった。したがって、結合親和性を測定するための選択圧が不可欠であり、切断活性のみに基づいて変異体を選択することによって、１つ以下の選別を行うべきではないことが結論付けられた。
スクリーニングプロセスを通じて、タンパク質分解安定性の向上に有意であり得るいくつかの富化変異を同定した。興味深いことに、変異は、タンパク質のβループ領域またはＣ末端の近くに見出され、タンパク質安定性を決定するための重要な領域であることが示唆される。ＦＧＦ１ライブラリについては、４ラウンド以内の選別で完全なコンセンサスに達した。ＦＧＦ１ ＢＳ４Ｍ１変異体は、Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｒの２つの変異を含む。アスパラギン酸２８は、ＦＧＦ１の６本鎖βバレル構造を閉じる３つの主要βヘアピンの第１（ＬＰＤＧ）の一部である。ＦＧＦ１の安定性へのその寄与におけるＡｓｘ－Ｐｒｏ－Ａｓｘ－Ｇｌｙモチーフの重要性は以前に研究されており、Ａｓｘ残基をアラニンで置き換えることは、ＦＧＦ１５０を大きく不安定化させることが示されている。しかしながら、Ｄ２８Ｎの置換が実際にそのＧｉｂｂｓ遊離エネルギーを約２．５ｋＪ／ｍｏｌ実際に増加させることが示され、これはタンパク質分解安定性が熱安定性と常に相関するとは限らないことが示唆された。ロイシン１３１は、ＦＧＦ１のＮ末端とＣ末端との間のβ鎖対内に見出される。このβ鎖対に隣接するβバレル構造を安定化するためのβヘアピンが存在しないため、この対のアミノ酸は、２つの鎖間の結合強度、または主鎖がβバレル構造を閉じる態様で配置されるのが立体的に好ましいことのいずれかによってバレルを安定化するために重要であると仮説が立てられている。実際、システイン、トレオニン、またはバリンに対するプロリン１３４の変異は、ＦＧＦ１の安定性を－６～－８ｋＪ／ｍｏｌ増加させることが示されている５１。
結論として、タンパク質分解安定性のスクリーニングは、文献中のＦＧＦ１タンパク質安定性に重要であると報告されている位置における変異を成功裡に富化することができたことが示された。実施例３において、可溶性に発現したＦＧＦ１の安定性及びＦＧＦ経路を調節するリガンドの能力に対するそれらの影響について、最終的なＦＧＦ１ ＢＳ４Ｍ１変異体で同定された変異を特徴付ける。
材料及び方法
タンパク質の酵母表面ディスプレイ
ＹＰＤ培地は、２０ｇ／Ｌのデキストロース、２０ｇ／Ｌのペプトン、及び１０ｇ／Ｌの酵母抽出物からなる。選択的ＳＤ－ＣＡＡ培地は、２０ｇ／Ｌのデキストロース、６．７ｇ／Ｌのアミノ酸を含まない窒素性酵母塩基（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇ／Ｌのカスアミノ酸（Ｂａｃｔｏ）、５．４ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４、及び８．５６ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏからなる。ＳＤ－ＣＡＡプレートは、培地と同じ成分を含有し、１８２ｇ／Ｌのソルビトール及び１５ｇ／Ｌのアガーを添加する。ＳＧ－ＣＡＡ誘導培地はＳＤ－ＣＡＡと同一であるが、デキストロースの代わりに２０ｇ／Ｌのガラクトースを含有する。酵母を成長させ、２３５ｒｐｍで振盪しながら３０℃で誘導した。
ｐＣＴ酵母ディスプレイプラスミドを、電気泳動によってＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＥＢＹ１００株に形質転換し、ＹＰＤ中で３０℃で１時間回収した後、ＳＤ－ＣＡＡプレート上にプレートした。３日後、酵母コロニーをＳＤ－ＣＡＡに一晩接種した。タンパク質の発現及び酵母ディスプレイを、確立されたプロトコル５２に従って３０℃で２４時間ＳＧ－ＣＡＡ中で誘導した。
ライブラリの作成
酵母ディスプレイのために、ＦＧＦ１を、ヒトＦＧＦ１ ｃＤＮＡ（ＭＧＣクローン：９２１８、ＩＭＡＧＥ：３８９６３５９、残基：Ｐｈｅ１６～Ａｓｐ１５５）からｐＣＴベクター（制限部位：ＮｈｅＩ、ＢａｍＨＩ）にクローニングした。ＦＧＦ１ランダム変異誘発ライブラリを、以前に記載されるとおり５２，５３のエラープローンＰＣＲを使用して生成した。ＦＧＦ１をテンプレートとして使用し、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）ならびにヌクレオチド類似体８－オキソ－ｄＧＴＰ及びｄＰＴＰ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して変異を導入した。正及び逆方向のｐＣＴプラスミドと５０ｂｐの重複を含有したプライマーを使用して、変異体遺伝子を、酵母相同組換えを介してｐＣＴベクターに挿入することを可能にした。変異頻度のある範囲を有するクローンを得るために、２０回のＰＣＲサイクルにわたって様々な濃度のヌクレオチド類似体（４０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭ）を使用して６つのＰＣＲを行った。ＰＣＲ生成物をヌクレオチド類似体の非存在下で増幅し、ゲル電気泳動を使用して精製した。ｐＣＴプラスミドをＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩを有するベクターとして消化した。５μｇの精製ＤＮＡインサート及び１μｇの制限酵素消化ｐＣＴの８つの形質転換を、電気能ＥＢＹ１００酵母細胞にエレクトロポレーションした。形質転換酵母細胞を３０℃で１時間ＹＰＤ中で回収し、次いで選択的ＳＤ－ＣＡＡ培地中で増殖させた。各ＰＣＲ由来のクローンをサンプリングして、変異誘発頻度を決定した。５μＭ及び２．５μＭのＰＣＲ由来のクローンを組み合わせて、クローン当たりの平均３個の変異を有する最終ライブラリを作成した。２回の経過後、細胞をＳＧ－ＣＡＡに移し、タンパク質発現を誘導した。希釈プレーティングにより推定されるように、２×１０７形質転換体のライブラリサイズを得た。
ライブラリスクリーニング
ＦＧＦ１変異体をディスプレイする誘導ＥＢＹ１００酵母細胞を、各選別について記載されるように、プラスミン消化緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、０．０１％のＢＳＡ、ｐＨ８．５）中のプラスミン、及び／またはＰＢＳ＋０．１％のＢＳＡ（ＰＢＳＡ）中のＦＧＦＲ１－Ｆｃと共に室温でインキュベートした。プロテアーゼ消化ステップ後、細胞をＰＢＳＡで洗浄し、ＰＢＳＡ中のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）の１：１００希釈物と共に５分間インキュベートし、次いでＰＢＳＡで再度洗浄した。ＦＧＦＲインキュベーションステップ後、細胞をＰＢＳＡで洗浄した。各選別についてインキュベートした酵母細胞の数は、前の選別で収集した細胞の数の約１０倍であった。細胞を、１ｍＬ当たり２００万細胞の密度の体積でインキュベートした。すべてのインキュベーションステップ後、細胞を一次及び二次抗体で染色した。一次染色のために、細胞を、抗ＨＡ－Ｔａｇ（６Ｅ２）マウスｍＡｂ（細胞シグナル伝達）の１：１０００希釈物及び／またはチキン抗ｃ－Ｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１：２０００希釈物と共に３０分間適切にインキュベートした。一次染色後、細胞をＰＢＳＡで洗浄した。２次染色を１０分間氷上で行った。二次染色のために、次の抗体を各選別に使用した。選別１、３、４：－抗ｃ－ｍｙｃに対する抗チキン－ＩｇＹ－ＰＥ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びＦＧＦＲ１－Ｆｃに対する抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）；選別２：－ヤギ抗マウス－ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びヤギ抗チキン－ＩｇＹ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
標識酵母細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｓｈａｒｅｄ ＦＡＣＳ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）を使用して蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって選別した。各選別において、各選別について設定された基準に基づいて、酵母細胞の０．５～１０％を収集した。各選別で収集した細胞を、ＯＤが５～８に達するまで、ＳＤ－ＣＡＡ（ｐＨ５で細菌汚染を制限）中で数日間増殖させた。クローンを、選別の次のラウンドの前に、３０℃で２４時間ＳＧ－ＣＡＡ中の酵母ディスプレイ発現のために誘導した。
配列決定及びクローニングのために、プラスミドＤＮＡを、Ｚｙｍｏｐｒｅｐ Ｙｅａｓｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｉ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して酵母細胞から抽出した。抽出したＤＮＡをＤＨ１０Ｂ電気能細胞に形質転換し、プレートした。単一コロニーを選択し、ＬＢ培地（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で増殖させた。プラスミドＤＮＡを、プラスミドミニプレップキット（ＧｅｎｅＪｅｔ）を使用して単一のコロニー培養物から単離した。ＤＮＡ配列決定をＭＣＬＡＢによって行った。
酵母ディスプレイペプチドＲＴＴＴＳ及びＨＴＴＳの結合親和性アッセイ
５０，０００個の誘導酵母細胞を、様々な濃度のＦＧＦＲ１－Ｆｃと共に、１ｇ／ＬのＢＳＡ（ＰＢＳＡ）を有するリン酸緩衝生理食塩水中、室温でインキュベートした。細胞を、リガンド枯渇を回避するために十分に大きな体積で、平衡に到達するのに十分に長い時間（典型的には３～２４時間）、インキュベートした。インキュベーションの最後の３０分間、酵母細胞を、ＰＢＳＡ中のチキン抗ｃ－Ｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１：２５００希釈物と共にインキュベートした。酵母をペレット化し、洗浄し、次いで、ＦＧＦＲ１－Ｆｃに対する抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）及び抗ｃ－ｍｙｃに対する抗チキン－ＩｇＹ－ＰＥ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の２次抗体の１：２００希釈物と共に１０分間氷上でインキュベートした。酵母を洗浄し、ペレット化し、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅを使用するフローサイトメトリーによる分析の直前に、ＰＢＳＡ中に再懸濁した。フローサイトメトリデータを、ＦｌｏｗＪｏ（ｖ７．６．１）を使用して分析した。結合曲線をプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用してＫｄ値を得た。
実施例３：タンパク質分解安定化線維芽細胞増殖因子の特徴付け
摘要
タンパク質分解安定性は、ＦＧＦ１等の不安定な増殖因子の有効性を改善する際に重要な役割を果たすことができる。研究は、ＦＧＦ１が培養物中で急速に分解されることを示しており、部分的には、血清中に見出されるか、または細胞によって発現されるプロテアーゼに起因する。実施例２において、増加したタンパク質分解安定性のためのＦＧＦ１の操作を記載する。ＦＧＦ１ランダム変異誘発ライブラリを、表面酵母上で増強されたタンパク質分解安定性を示したＦＧＦ１変異体についてスクリーニングした。この実施例において、可溶性ＦＧＦ１の組換え発現及びＦＧＦ１におけるタンパク質分解安定性を改善するためのハイスループットスクリーニングによって同定される変異の特徴付けを記載する。ＦＧＦ１及びＦＧＦ２を、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系において組み換え発現及び精製した。ＦＧＦ１ ＢＳ４Ｍ１（Ｄ２８Ｎ、Ｌ１３１Ｒ）及びＬ１３１Ｒ変異体は、野生型ＦＧＦ１と比較してよりタンパク質分解的に安定しており、ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体は、強力なＦＧＦ経路アンタゴニストとして作用することが確認された。
序論
ＦＧＦ１は、血管新生の誘導のための強力な調節分子であるが、その不十分な安定性は、タンパク質活性を維持し、長期間の有効性を達成する能力を限定する。実施例２において、プラスミンとのインキュベーション時に増加したタンパク質分解安定性を実証するＦＧＦ１変異体を選択するためのハイスループットスクリーニングの使用、ＥＣＭ分解のための疾患の領域で見出される重要なプロテアーゼを記載する。ＦＧＦ１ライブラリの４つの選別後に完全なコンセンサスを達成し、ＦＧＦ１ ＢＳ４Ｍ１（Ｄ２８Ｎ、Ｌ１３１Ｒ）変異体を同定した。変異は、ＦＧＦの安定性に重要であることが報告されているタンパク質の領域で見出された。
本実施例において、ＦＧＦ１ ＢＳ４Ｍ１変異体由来の変異体ＦＧＦの可溶性発現及び特徴付けがスクリーニングで同定されることを記載する。野生型及びＦＧＦ１ ＢＳ４Ｍ１変異体を酵母ディスプレイベクターからクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターに挿入した。精製後、組み換えＦＧＦ１の適切な折り畳みを、酵母ディスプレイＦＧＦＲ３構築物への特異的結合の検出によって試験した。
ＦＧＦ１ ＢＳ４Ｍ１変異体及び野生型ＦＧＦ１について、それらの可溶性安定性及びＦＧＦ経路を調節するそれらの能力をさらに特徴付けた。プラスミンまたはトリプシン中のタンパク質のタンパク質分解安定性を試験し、ウェスタンブロット及びバンド強度定量を使用して異なる時点でのそれらの分解の程度を測定した。変異Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｒの有意性、ならびにタンパク質安定性へのそれらの寄与について探査した。ＦＧＦ１の熱安定性を測定して、タンパク質分解安定性とのそれらの関係を分析した。より生物学的に関連する条件下でＦＧＦ１の安定性を試験するために、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞培養物中のそれらの分解の程度を特徴付けた。加えて、ＥＲＫ等のＦＧＦＲ活性化の下流であるシグナル伝達分子の活性化を調節する能力を特徴付けるためのＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＥＲＫリン酸化アッセイを行った。これらの特徴付け研究の結果は、ＦＧＦ１変異体の改良されたタンパク質分解安定性及びアンタゴニスト活性、ならびに抗血管新生治療に使用されるべき可能性を実証した。
結果
ＦＧＦの組換え発現
操作されたＦＧＦ１変異体をそれらの可溶性中で発現させ、それらを野生型タンパク質と比較するために、タンパク質をＥ．ｃｏｌｉ発現系中で組換え発現させた。組み換えタンパク質の細胞内発現のために、ＦＧＦ１及びＦＧＦ１変異体をｐＢＡＤベクターにクローニングした。ｐＢＡＤ ＦＧＦ１発現ベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてほとんど使用されないコドンを有する真核生物タンパク質の発現を増強するＥ．ｃｏｌｉのＲｏｓｅｔｔａ株に形質転換した。細胞を洗剤に基づく溶液を使用して溶解した。次いで、Ｎｉ－ＮＴＡカラムクロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用してタンパク質を精製した。野生型ＦＧＦ１の同一性及び純度を、クマシー染色タンパク質ゲル及びウェスタンブロットによって確認した（図２０Ａ）。ＦＧＦ１の適切な折り畳みを、酵母ディスプレイＦＧＦＲ３構築物への特異的結合の観察によって確認した（図２０Ｂ）。
プラスミン中のＦＧＦ１変異体ＢＳ４Ｍ１のタンパク質分解安定性
野生型ＦＧＦ１及びＦＧＦ１変異体ＢＳ４Ｍ１（Ｄ２８Ｎ／Ｌ１３１Ｒ）のタンパク質分解安定性を測定するために、１００ｎｇの可溶性ＦＧＦをプラスミン中で様々なインキュベーション時間インキュベートした。次いで、それらの分解速度を、試料のウェスタンブロットを実行し、抗ＦＧＦについて染色することによって評価した。残りのＦＧＦの量を、各条件のバンド強度を測定し、プラスミンインキュベーションなしのタンパク質のバンド強度によって正規化することによって計算した。ＢＳ４Ｍ１（Ｄ２８Ｎ，Ｌ１３１Ｒ）変異体は、野生型ＦＧＦ１と比較して、プラスミン中の全てのインキュベーション時点でより低い分解レベルを示したことが見出された（図２１）。したがって、プラスミンに対するＦＧＦ１のタンパク質分解安定性を増加させるためのスクリーニングが成功したことが確認された。
ＢＳ４Ｍ１（Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｒ）からの変異を安定化ＰＭ２（Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ）変異体に組み込んで、ＰＭ３（Ｄ２８Ｎ、Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、Ｌ１３１Ｒ）を作成した。４８時間のインキュベーション後、各構築物の分解を異なるプラスミン濃度で測定した。ＢＳ４Ｍ１からの変異をＰＭ２からの変異に導入することは、すべての試験濃度でタンパク質分解に対する耐性の顕著な増加につながったことが見出された（図２２）。したがって、ＢＳ４Ｍ１における新たに同定された変異は、ＰＭ２からの変異と組み合わせると、タンパク質分解安定性に相加的効果を有したと結論づけた。
トリプシン中の操作ＦＧＦ変異体のタンパク質分解安定性
野生型ＦＧＦ１及びＦＧＦ１変異体ＢＳ４Ｍ１のタンパク質分解安定性をトリプシンで同様の態様で測定した。プラスミン及びトリプシンは、リジン及びアルギニンと同一の一次特異性を共有するため、プラスミンに対するタンパク質分解安定性のための操作は、トリプシン中のタンパク質分解安定性を増加させることができるという仮説を立てた。加えて、トリプシンによる分解に対してより耐性があるＦＧＦ１変異体ＰＭ２（Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ）もプラスミンによる切断に対してより耐性があることが確認された。ＢＳ４Ｍ１（Ｄ２８Ｎ、Ｌ１３１Ｒ）変異体は、野生型ＦＧＦ１と比較して、トリプシンの全てのインキュベーション時点でより低いレベルの分解を示したことが見出された（図２３）。したがって、プラスミン中のＦＧＦ１のタンパク質分解安定性のための操作は、トリプシン中のタンパク質分解安定性を増加させることにもまた成功したと結論づけた。
ＦＧＦ１変異体ＢＳ４Ｍ１における変異の有意性
Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｒ変異の両方がＢＳ４Ｍ１変異体にタンパク質分解安定性を付与するために重要であるかどうかを決定するために、Ｄ２８ＮまたはＬ１３１Ｒ変異のみを有するＦＧＦ１のバージョンを作成した。これらの変異体のタンパク質分解安定性を、プラスミン中のそれらの分解速度を経時的に評価することによって測定した。Ｌ１３１Ｒ変異体は、ＢＳ４Ｍ１（Ｄ２８Ｎ／Ｌ１３１Ｒ）変異体と比較して匹敵するタンパク質分解安定性を示したが、Ｄ２８Ｎ変異体は、野生型ＦＧＦ１と比較してもはるかにより低いタンパク質分解安定性を示したことが見出された（図２４）。Ｄ２８Ｎ変異は、可溶性発現タンパク質に組み込まれたときに、ＦＧＦ１のタンパク質分解安定性を有意に増加させると解釈されなかったと結論付けた。したがって、Ｌ１３１Ｒ変異体によるさらなる特徴付けを継続した。
また、１３１位のアルギニンへの変異がタンパク質分解安定性を付与するために独特であったか、またはロイシンから離れた変異が有意であったかどうかを決定したかった。したがって、１３１位を代替的にアラニン（Ｌ１３１Ａ）またはリジン（Ｌ１３１Ｋ）のいずれかに変異させて、これらの単一変異体がタンパク質分解安定性においてそれらの増強を維持または失ったかどうかを見た。それらの分解速度をプラスミンで評価した。Ｌ１３１Ｋは、Ｌ１３１Ｒと比較して同様のレベルの分解を維持したが、Ｌ１３１Ａは、野生型ＦＧＦ１と比較してもより高いレベルの分解を示したことが見出された（図２５）。
野生型ＦＧＦ１及びＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体の熱安定性
ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体のタンパク質分解安定性の改善が熱安定性の改善に起因するかどうかを決定するために、野生型ＦＧＦ１及びＦＧＦ Ｌ１３１Ｒ変異体の融解温度を測定した。温度が徐々に増加するにつれて、各タンパク質の展開を測定するために、疎水性色素を使用したＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒアッセイを使用した５４，５５。Ｌ１３１Ｒ変異は、野生型ＦＧＦ１と比較して溶融温度のわずかな増加につながるが、その差は統計的に有意ではないことが見出された（図２６）。したがって、熱安定性は、ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体のタンパク質分解安定性の増加に有意に寄与しないと結論づけた。
細胞培養におけるＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体の安定性
ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体の安定性を、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクティベーター（ｕＰＡ）を発現する乳癌細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１を有する培養物中で試験して、プラスミノーゲンを活性化し、それをプラスミンに変換した。５００ｎｇのタンパク質を、培養物中のＭＤＡ－ＭＢ－２３１と共に様々なインキュベーション時間インキュベートした。各条件について全てのタンパク質を濃縮し、ウェスタンブロットによる分析のために各条件を別個のウェルに充填した。残ったタンパク質の量を、バンド強度を測定し、培養物中でインキュベートされなかった５００ｎｇのタンパク質によって正規化することによって定量化した。ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体は、野生型タンパク質と比較して、培養物中の増加した安定性を示したことが見出された（図２７）。
ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体は、ＦＧＦＲアンタゴニストである
ＦＧＦ１ Ｌ１３１ＲのＦＧＦ経路を調節する能力を特徴付けるために、ＦＧＦＲ活性化の下流であり、細胞増殖の誘導に重要である重要なシグナル伝達分子であるＥＲＫ（ＭＡＰＫ）のリン酸化を調節するその能力を評価した５６，５７。ＦＧＦＲを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を、野生型ＦＧＦ１単独、ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体単独、または様々な濃度のＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体との野生型ＦＧＦ１共にインキュベートした。ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体は、ＥＲＫリン酸化を誘導することができないが、変異体は、野生型ＦＧＦ１によるＥＲＫリン酸化を効果的に阻害することができることが見出された（図２８）。１ｎＭの野生型ＦＧＦ１について、ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体によるＥＲＫリン酸化の阻害のための用量応答曲線を生成し、そのＩＣ５０（１ｎＭ）が野生型ＦＧＦ１の濃度と等モルであることを見出した（図２９）。
ＮＩＨ３Ｔ３細胞へのＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体の結合
ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体の結合親和性を特徴付け、野生型ＦＧＦ１の結合親和性と比較した。ＦＧＦＲを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を様々な濃度のＦＧＦ１と共に４℃でインキュベートしてインキュベーションを防止した。細胞を蛍光タグ付き抗Ｈｉｓ抗体で標識して、結合Ｈｉｓタグ付きＦＧＦ１を検出した。ＦＧＦ１ ＷＴ及びＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体の両方が、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する１０ｎＭの結合親和性を示すことが見出された（図３０）。
考察
本実施例において、実施例２からのプラスミン中のタンパク質分解安定性についてのスクリーニングで同定されたＦＧＦ変異体を可溶性に発現させ、特徴付けた。組換え発現の際に、ＦＧＦ１が発現され、容易に精製されたことが見出された。しかしながら、発現の収率は、１～３ｍｇ／Ｌの発現でかなり低かったことが見出された。この低タンパク質収率は、ＦＧＦ１の不十分な安定性に起因し得る。
可溶性ＦＧＦ１ ＢＳ４Ｍ１（Ｄ２８Ｎ、Ｌ１３１Ｒ）変異体は、野生型ＦＧＦ１と比較して、プラスミン中で増加したタンパク質分解安定性を示すことが成功裡に確認された。変異Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｒを、Ｚａｋｒｚｅｗｓｋａｅｔ ａｌ．１４由来の安定化ＦＧＦ１ ＰＭ２変異体（Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ）からの変異と組み合わせると、新たな変異が、プラスミン中のＦＧＦ１のタンパク質分解安定性をさらに増強させたことが見出された。加えて、ＢＳ４Ｍ１変異体は、プラスミン５８と同様の態様でリジン及びアルギニンの後に切断するプロテアーゼであるトリプシンにおいてより安定していることが見出された。これは、選択に使用されるプロテアーゼと一次特異性を共有する他のプロテアーゼの存在下でのタンパク質のタンパク質分解安定性を増加させるスクリーニングの能力を実証する。例えば、ＢＳ４Ｍ１変異体はまた、リソソーム分解の原因となり、一次特異性をプラスミンと共有するカテプシンの存在下でタンパク質分解的により安定であり得る。
ＦＧＦ１ Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｒ単一変異体の特徴付けを通じて、増加したタンパク質分解安定性のほとんどがＬ１３１Ｒに起因したが、Ｄ２８Ｎ単一変異体は野生型よりもさらにタンパク質分解安定性がより低かったことが見出された。酵母ディスプレイＦＧＦ１と可溶性Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＦＧＦ１との間のＤ２８Ｎ変異の有意性の差は、酵母ディスプレイタンパク質でのみ発生するグリコシル化に起因し得る。アスパラギンへのアスパラギン酸の変異は、真核生物のＮＧｘグリコシル化部位の導入につながる５９。したがって、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現されるＦＧＦ１ ＢＳ４Ｍ１変異体は、さらなるタンパク質分解安定性を有し得る。
Ｌ１３１Ｒ変異は、プラスミンがアルギニンに対する一次特異性を有するため、逆直感的なものである。実際、合理的な設計戦略は、タンパク質に新しい潜在的な切断部位を導入することを伴わないであろう。しかしながら、実施例１で考察されるように、一次特異性は、タンパク質切断が潜在的な切断部位で生じるかどうかの唯一の決定因子ではなく、部位周辺の複数のアミノ酸、及びプロテアーゼへの部位の立体アクセス可能性もまた大きく寄与する。ロイシンから離れた変異または１３１位のアルギニンへの変異がタンパク質分解安定性を増加させるために重要であるかどうかをさらに探査するために、ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ａ及びＬ１３１Ｋ単一変異体を特徴付けた。ロイシン１３１をアラニン（プロテアーゼ切断部位の合理的設計による置換に通常に使用されるアミノ酸）に変化させることは、野生型ＦＧＦ１と比較してもタンパク質分解安定性の減少につながったことが見出された。しかしながら、プラスミンが一次特異性を有する他のアミノ酸であるリジンへのロイシン１３１の変異は、プラスミン中の増加したタンパク質分解安定性の保持につながった。１３１位でのＦＧＦ１タンパク質のプラスミンによる切断が、得られたタンパク質断片の増加したタンパク質分解安定性につながるかどうかを考察したが、スクリーニングはそのような変異について選択できなかったと結論づけた。酵母ディスプレイＦＧＦ１内の任意の切断は、ｃ－ｍｙｃシグナルの喪失及びこの変異体から離れた選択につながったであろう。リジン及びアルギニンは共に正荷電アミノ酸であるため、代わりに、この位置に正荷電を付加することが、ＦＧＦ１のタンパク質分解安定性を増加させるために重要である可能性があり得る。野生型ＦＧＦ１とＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体との間で融解温度に統計的に有意な差がなかったことを見出し、これは熱安定性の増加がタンパク質分解安定性の増加を説明しないことを示唆した。したがって、タンパク質分解安定性を増加させるためのＬ１３１Ｒのメカニズムを確実に見出すためには、さらなる研究が必要であろう。
また、ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞を有する細胞培養において、野生型ＦＧＦ１よりも安定しているようであることも見出された。これらの細胞は、プラスミノーゲンをプラスミンに切断し活性化するウロキナーゼプラスミノーゲンアクティベーター（ｕＰＡ）を発現する。その結果は、ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体が、生物学的により関連する文脈において増加した安定性を示すことを実証するために有意であった。
最後に、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＥＲＫリン酸化アッセイを使用して、Ｌ１３１Ｒ変異がＦＧＦ１をＦＧＦ経路アンタゴニストに変換することが見出された。この結果は、タンパク質分解安定性を増加させるためのスクリーニングがＦＧＦＲに結合する変異体のみを選択するが、タンパク質がアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するかどうかを選択しないことを考慮すると、合理的でありながら興味深い。ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対するＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体の結合親和性は、野生型ＦＧＦ１とほぼ同等であり、これは、ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体のＩＣ５０が阻害アッセイで使用される野生型ＦＧＦ１の濃度とほぼ同等である理由を説明する。ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体によるＥＲＫリン酸化の阻害は、野生型ＦＧＦ１の存在下で最高濃度のＦＧＦ Ｌ１３Ｒ変異体で処理した試料が、未処理細胞のものを上回る低レベルのＥＲＫリン酸化を示すため、完全ではない。しかしながら、この現象は、文献６０においてアンタゴニストとして作用することが報告されている唯一の他のＦＧＦ１変異体であるＦＧＦ１ Ｒ５０Ｅ変異体においても観察される。ＦＧＦ経路関連細胞増殖の誘導及びサイクリンＤ１５７，６１等の下流エフェクタータンパク質の活性化のための持続的かつ高レベルのＥＲＫリン酸化が報告されている。ＦＧＦ１ Ｒ５０Ｅ変異体は、インテグリンαｖβ３への結合に欠陥があり、ＥＲＫリン酸化の不完全な阻害も示す。しかしながら、Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．によるフォローアップ研究では、それらのＦＧＦ１ Ｒ５０Ｅアンタゴニストが、ＦＧＦ１誘導細胞の移動、ＨＵＶＥＣ管形成、Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグアッセイにおける血管新生、及び大動脈環アッセイにおける細胞の結果を阻害することができることを成功裏に示す４１。したがって、この実施例は、ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒが機能的生物学的アッセイにおいてＦＧＦ経路アンタゴニストとして同様に作用することができるという良好な証拠を提供する。
結論として、この実施例２及び３に記載される結果は、プラスミン中のＦＧＦ１のタンパク質分解安定性を増加させることについて我々のハイスループットスクリーニングを成功裡に利用することができ、ＦＧＦ２のための重要なタンパク質分解安定化候補を成功裡に同定することができたことを示す。ＦＧＦ１変異体は、プラスミン及びトリプシン中の増加したタンパク質分解安定性、ならびに培養物中の増加した安定性を示すことが示された。ＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体が、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＦＧＦ１誘導ＥＲＫリン酸化を阻害するために使用することができる強力なＦＧＦ経路アンタゴニストとして作用することが実証された。ＦＧＦ１変異体は、がん及び眼における望ましくない新生血管等の疾患の処置における抗血管新生治療のためのタンパク質分解的に安定化された治療分子の開発のためのそれらの有望性を実証する。
材料及び方法
組換えＦＧＦ１の発現及び精製
ＦＧＦ１は、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）能細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して発現された。遺伝子を、ヒトＦＧＦ１ ｃＤＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）から、Ｎ末端６ｘＨｉｓタグ及びアラビノース誘導性プロモーターを有するｐＢＡＤ／ＨｉｓＢベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。制限部位ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩをクローニングに使用した。ｐＢＡＤ ＦＧＦ１－Ｈｉｓプラスミドを化学的に有能なＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）細胞に形質転換し、２３５ｒｐｍで振盪しながら３７℃で１ｍＬのＬＢ中で回収し、アンピシリン（Ａｍｐ）選択を有するＬＢプレート上にプレートした。コロニーを５ｍＬのＬＢ Ａｍｐに接種し、３７℃で一晩増殖させた。１ｍＬの一晩培養物を使用して、１００ｍＬのＬＢ Ａｍｐ発現培養物を接種した。細胞を２３５ｒｐｍで２～２．５時間振盪させながら３７℃で増殖させた。約０．５のＯＤ６００で、細胞を０．２％のＬ－アラビノース（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で誘導した。タンパク質を発現させ、細胞質中で維持した。発現培養物を３７℃で６時間増殖させた後、細胞をスピンダウンさせて収集した。
細胞をＢ－ＰＥＲ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、溶解酵素、ＤＮａｓｅ Ｉ、及びヘパリンスルフェートで３０分間溶解した。抽出混合物を１５，０００ｇで１０分間スピンダウンし、上清を収集し、０．２２μｍフィルターを通して濾過した。ＦＧＦ１を含有する上清を、セクション２．５．６．１に詳述されるように、Ｎｉ－ＮＴＡ親和性精製のための結合緩衝液で１：１０に希釈した。上清及び結合緩衝液混合物をＮｉ－ＮＴＡカラムに充填した。Ｎｉ－ＮＴＡ親和性精製からの溶出物を濃縮し、１０ｋＤａのカットオフを有するＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔを使用して、緩衝液をＰＢＳに交換した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、セクション２．５．６．１に記載されるように、最終ＦＧＦ１－Ｈｉｓタンパク質を精製した。
ＦＧＦ１単一変異体のクローニング
オーバーラップ伸長ＰＣＲを使用して、野生型ＦＧＦ１を単一アミノ酸変異体に変異させた６２。コドン変異は以下Ｄ２８Ｎ－ＧＡＴ～ＡＡＴ、Ｌ１３１Ｒ－ＣＴＡ～ＣＧＡ、Ｌ１３１Ａ－ＣＴＡ～ＧＣＡ、Ｌ１３１Ｋ－ＣＴＡ～ＡＡＡの通りである。部位特異的変異誘発プライマーは、コドン変異、ならびに野生型ＦＧＦ１配列と重複する各側の２０ｂｐオーバーハングを組み込んだ。
タンパク質分解安定性アッセイ
各条件について、１２５ｎｇのタンパク質を、様々な濃度のプラスミンと共に、または３７℃で様々なインキュベーション時間にわたって、２０μＬのプラスミン消化緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、０．０１％のＢＳＡ、ｐＨ８．５）中でインキュベートした。各試料についての適切なインキュベーション時間の終了時に、プロテアーゼの消化を、試料の－２０℃での保管によって停止させた。すべてのインキュベーションの完了後、分析のために試料を氷上で解凍した。各２０μＬの試料を５μＬのＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液及び２μＬのＮｕＰＡＧＥ試料還元剤と混合した。試料を９５℃に１０分間加熱した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを実行した。ゲルを２０％エタノールと共に１０分間インキュベートした後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｉＢｌｏｔ Ｇｅｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｄｅｖｉｃｅを使用してニトロセルロース膜上にブロットした（プログラム０、７分）。
ウェスタンブロットを、ＴＢＳＴ（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのＴｒｉｓ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０）中の５％の無脂肪乾燥乳（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で１時間ブロックした。一次染色を、ＴＢＳＴ中５％の乳中のマウス抗ＦＧＦ１（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、クローン２Ｅ１２）の１：１０００の希釈物で１時間行った。ＴＢＳＴで１５分間３回洗浄した後、ヤギ抗マウスＨＲＰ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１：２５００希釈物で二次染色を２時間行った。ＴＢＳＴでさらに３回１５分間洗浄した後、ブロットをＢｉｏＲａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ ＳｙｓｔｅｍによってＣｈｅｍｉ Ｈｉ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ様式で造影した。ＩｍａｇｅＪを使用してバンド強度を定量し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して正規化されたバンド強度をプロットした。
溶融温度を測定するためのＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒアッセイ
５０μＬの１．２ｍｇ／ｍＬのタンパク質を９６ウェル薄壁ＰＣＲプレート（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に充填した。０．５μＬのＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を試料に加え、十分に混合した。プレートをプラスチックカバーで密封した後、ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ９６ ＲＴ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈでプレート分析した。プレートを４℃まで５分間冷却し、次いでプレートを１分あたり１℃の速度で１００℃までゆっくりと加熱した。蛍光変化を監視し、各℃で測定した。蛍光オーバー温度をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ上にプロットし、蛍光が最大及び最小蛍光シグナルの平均に等しい温度を見いだすことによって、融解温度を計算した。
細胞培養安定性アッセイ
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、１０％の胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）を有するＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ）中１００，０００細胞／ウェルの密度で６ウェルプレート（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）上に播種し、５％のＣＯ２中３７℃で増殖させた。２４時間後、培地を吸引し、血清飢餓のためにＤＭＥＭに置き換えた。２４時間後、ＤＭＥＭを吸引した。各試料について、１ｍＬのＤＭＥＭ中の５００ｎｇのタンパク質を各ウェルに添加し、様々なインキュベーション時間のために５％のＣＯ２中３７℃でインキュベートした。各インキュベーションの最後に、上清を回収し、０．２２μｍフィルターで濾過し、分析の前に－２０℃で冷凍した。全てのインキュベーションが完了した後、氷上で上清を解凍した。各上清試料を、Ａｍｉｃｏｎ ３Ｋ ＭＷＣＯ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬのＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒを使用して５０μＬの体積まで濃縮した。１５μＬの濃縮試料を５μＬのＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ及び２μＬのＮｕＰＡＧＥ Ｓａｍｐｌｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔと混合した。試料を９５℃に１０分間加熱した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを実行した。ゲルを２０％のエタノールと共に１０分間インキュベートした後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｉＢｌｏｔ Ｇｅｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｄｅｖｉｃｅを使用してニトロセルロース膜上にブロットした（プログラム０、７分）。
ウェスタンブロットを、ＴＢＳＴ（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのＴｒｉｓ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０）中の５％の無脂肪乾燥乳（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で１時間ブロックした。一次染色を、ＴＢＳＴ中５％のミルク中のマウス抗ＦＧＦ１（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、クローン２Ｅ１２）１：１０００の希釈物で１時間行った。ＴＢＳＴで１５分間３回洗浄した後、ヤギ抗マウスＨＲＰ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１：２５００希釈して２時間二次染色を行った。ＴＢＳＴ中でさらに３回１５分間洗浄した後、ブロットをＢｉｏＲａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ ＳｙｓｔｅｍによってＣｈｅｍｉ Ｈｉ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ様式で造影した。ＩｍａｇｅＪを使用してバンド強度を定量し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して正規化されたバンド強度をプロットした。
ＮＩＨ３Ｔ３ ＥＲＫリン酸化アッセイ
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、１０％の新生児ウシ血清（ＮＢＣＳ）（Ｇｉｂｃｏ）を有するＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ）中、１００，０００細胞／ウェルの密度で６つのウェルプレート（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）上に播種し、５％のＣＯ２中で３７℃で増殖させた。２４時間後、培地を吸引し、血清飢餓のためにＤＭＥＭに置き換えた。２４時間後、ＤＭＥＭを吸引した。細胞を、何らのホスファターゼ阻害剤なしで、野生型ＦＧＦ１及び／または様々な濃度のＦＧＦ１ Ｌ１３１Ｒ変異体で１５～１８時間、３７℃で刺激した。刺激後、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、１００μｌの溶解緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０）で、１Ｘホスファターゼ阻害剤カクテル２及び１Ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル２（Ｓｉｇｍａ）で、４℃で１時間処理した。溶解物を－８０℃で冷凍してから分析した。溶解物を氷上で解凍し、遠心分離によって明確化した。タンパク質濃度をＰｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙで定量化した。各試料について２μｇのタンパク質溶解物を、ＭｉｌｌｉＱ Ｈ２Ｏで１４．６μＬに希釈した。各希釈試料を５．６μＬのＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ及び２．２５μＬのＮｕＰＡＧＥ Ｓａｍｐｌｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔと混合した。試料を９５℃に１０分間加熱した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを実行した。ゲルを２０％のエタノールと共に１０分間インキュベートした後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｉＢｌｏｔ Ｇｅｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｄｅｖｉｃｅを使用してニトロセルロース膜上にブロットした（プログラム０、７分）。
ウェスタンブロットを、ＴＢＳＴ（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのＴｒｉｓ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０）中の５％の無脂肪乾燥乳（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で１時間ブロックした。一次染色を、ＴＢＳＴ中５％のミルク中のウサギ抗リンＥＲＫ１／２（Ｙ２０２／Ｙ２０４）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）またはウサギ抗ＥＲＫ１／２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の１：１０００希釈物で１時間行った。ＴＢＳＴ中で１５分間３回洗浄した後、ヤギ抗ウサギＨＲＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の１：２５００希釈物で２時間二次染色を行った。ＴＢＳＴ中でさらに３回１５分間洗浄した後、ブロットをＢｉｏＲａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ ＳｙｓｔｅｍによってＣｈｅｍｉ Ｈｉ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ様式で造影した。ＩｍａｇｅＪを使用してバンド強度を定量化し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用してプロットした。
ＮＩＨ３Ｔ３細胞結合アッセイ
ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、結合緩衝液（１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＭｎＣｌ２、２ｍＭのＣａＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、及び０．１％のＢＳＡとの２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５））中で、様々な濃度の野生型ＦＧＦ１またはＦＧＦ１ ＢＳ４Ｍ１変異体と共に４℃で３時間インキュベートした。細胞を、リガンド枯渇を回避するために十分に大きな体積でインキュベートした。ＦＧＦでインキュベートした後、細胞を洗浄し、抗Ｈｉｌｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ａｎａｓｐｅｃ）の１：１００の希釈物と共に氷上で１５分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ペレット化し、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅを使用するフローサイトメトリーによる分析の直前に結合緩衝液中に再懸濁した。フローサイトメトリデータを、ＦｌｏｗＪｏ（ｖ７．６．１）を使用して分析した。結合曲線をプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用してＫｄ値を得た。
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２９．ＩＮＡＧＡＭＩ，Ｔ．＆ＳＴＵＲＴＥＶＡＮＴ，Ｊ．Ｍ．Ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃａｔａｌｙｓｅｓ ｂｙ ａｌｐｈａ－ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ ａｎｄ ｔｒｙｐｓｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３５，１０１９－２３（１９６０）．
３０．Ｌａｕｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｗｏｕｎｄｓ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１５，１２－１８（２０００）．
３１．Ｋｏｒｃ，Ｍ．＆Ｆｒｉｅｓｅｌ，Ｒ．Ｅ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ．Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ９，６３９－５１（２００９）．
３２．Ｂｅｅｎｋｅｎ，Ａ．＆Ｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｍ．Ｔｈｅ ＦＧＦ ｆａｍｉｌｙ： ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．８，２３５－２５３（２００９）．
３３．Ｍａｓｏｎ，Ｉ．Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｔｏ ｅｎｄ ｐｏｉｎｔ：Ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｎｅｕｒａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８，５８３－５９６（２００７）．
３４．Ｔｅｖｅｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｆａｒｉｎａ，Ｅ．Ｍ．，Ｒｉｖａｓ，Ｊ．＆Ｒｅｉｄ，Ｒ．Ｒ．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ） ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｉｓ．１，１９９－２１３（２０１４）．
３５．Ｅｓｗａｒａｋｕｍａｒ，Ｖ．Ｐ．，Ｌａｘ，Ｉ．＆Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．１６，１３９－１４９（２００５）．
３６．Ｋｎｉｇｈｔｓ，Ｖ．＆Ｃｏｏｋ，Ｓ．Ｊ．Ｄｅ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ＦＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２５，１０５－１１７（２０１０）．
３７．Ｚｈａｎｇ，Ｊ．＆Ｌｉ，Ｙ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｕｓｅｓ ｏｆ ＦＧＦｓ．Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．５３，１４４－１５４（２０１６）．
３８．Ｐｒｅｓｔａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ／ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．１６，１５９－１７８（２００５）．
３９．Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－１ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ａｒｔｅｒｉｅｓ：Ａ ｇｏａｌ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ？Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８７，１７６－１７８（２０００）．
４０．Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｂ．，Ｐｅｃｈｅｒ，Ｐ．，ｖｏｎ Ｓｐｅｃｈｔ，Ｂ．Ｕ．＆Ｓｔｅｇｍａｎｎ，Ｔ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ： ｆｉｒｓｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９７，６４５－６５０（１９９８）．
４１．Ｍｏｒｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａ Ｄｏｍｉｎａｎｔ－Ｎｅｇａｔｉｖｅ ＦＧＦ１ Ｍｕｔａｎｔ（ｔｈｅ Ｒ５０Ｅ Ｍｕｔａｎｔ） Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８，（２０１３）．
４２．Ｃｏｍｅｒｏｔａ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｋｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｔｙｐｅ １ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｅｎｄ－ｓｔａｇｅ ｕｎｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｂｌｅ ｌｏｗｅｒ ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ ｉｓｃｈｅｍｉａ：Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａ ｐｈａｓｅ Ｉ ｔｒｉａｌ．Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．３５，９３０－９３６（２００２）．
４３．Ｎｉｋｏｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ＮＶ１ＦＧＦ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ａｍｐｕｔａｔｉｏｎ－ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｌｉｍｂ ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６，９７２－９７８（２００８）．
４４．Ｂｅｌｃｈ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ＮＶ１ＦＧＦ ｏｎ ａｍｐｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅａｔｈ：Ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｌｉｍｂ ｉｓｃｈａｅｍｉａ．Ｌａｎｃｅｔ ３７７，１９２９－１９３７（２０１１）．
４５．Ｒａｓｋ－Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｆａｂｂｒｏ，Ｄ．＆Ｓｃｈｉｏ，Ｈ．Ｂ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ： ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｓｅ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ ３５，６０４－６２０（２０１４）．
４６．Ｓａｋｓｅｌａ，Ｏ．，Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ，Ｄ．，Ｓｏｍｍｅｒ，Ａ．＆Ｒｉｆｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｂｉｎｄｓ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｉｔ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０７，７４３－５１（１９８８）．
４７．Ｗｈｉｔｅｌｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．，Ｍｕｒｄｏｃｈ，Ａ．Ｄ．，Ｉｏｚｚｏ，Ｒ．Ｖ．＆Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ，Ｐ．Ａ．Ｔｈｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｒｌｅｃａｎ ａｎｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｂｏｕｎｄ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｙ ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ，ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ，ｐｌａｓｍｉｎ，ａｎｄ ｈｅｐａｒａｎａｓｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１００７９－１００８６（１９９６）．
４８．Ｐａｒｋ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１９，２１１－２１７（２００６）．
４９．Ｋｏｗａｌｓｋｉ，Ｊ．Ｍ．，Ｐａｒｅｋｈ，Ｒ．Ｎ．＆Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｋ．Ｄ．Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ Ｖ ｉｓｉａｅ ｏｆ Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｕｔａｎｔｓ Ｌａｃｋｉｎｇ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｂｏｎｄｓ Ｉｓ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７，１２６４－１２７３（１９９８）．
５０．Ｌｅｅ，Ｊ．，Ｄｕｂｅｙ，Ｖ．Ｋ．，Ｌｏｎｇｏ，Ｌ．Ｍ．＆Ｂｌａｂｅｒ，Ｍ．Ａ Ｌｏｇｉｃａｌ ＯＲ Ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ Ａｓｘ－Ｐｒｏ－Ａｓｘ－Ｇｌｙ Ｔｙｐｅ Ｉ ？？－Ｔｕｒｎ Ｍｏｔｉｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７７，１２５１－１２６４（２００８）．
５１．Ｄｕｂｅｙ，Ｖ．Ｋ．，Ｌｅｅ，Ｊ．，Ｓｏｍａｓｕｎｄａｒａｍ，Ｔ．，Ｂｌａｂｅｒ，Ｓ．＆Ｂｌａｂｅｒ，Ｍ．Ｓｐａｃｋｌｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｒａｃｋ：Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－１ ｂｙ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｎ ａｎｄ Ｃ ｔｅｒｍｉｎｕｓ β－Ｓｔｒａｎｄ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７１，２５６－２６８（２００７）．
５２．Ｃｈａｏ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｙｅａｓｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１，７５５－７６８（２００６）．
５３．Ｄｅｖｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｖａｎ＆Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｋ．Ｄ．Ｙｅａｓｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ：Ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｌｉｂｒａｒｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１３１，１５１－１８１（２０１４）．
５４．Ｌａｖｉｎｄｅｒ，Ｊ．Ｊ．，Ｈａｒｉ，Ｓ．Ｂ．，Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｂ．Ｊ．＆Ｍａｇｌｉｅｒｙ，Ｔ．Ｊ．Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ： ａ ｇｅｎｅｒａｌ，ｒａｐｉｄ ｄｙｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．１３１，３７９４－３７９５（２００９）．
５５．Ｅｒｉｃｓｓｏｎ，Ｕ．Ｂ．，Ｈａｌｌｂｅｒｇ，Ｂ．Ｍ．，Ｄｅｔｉｔｔａ，Ｇ．Ｔ．，Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．＆Ｎｏｒｄｌｕｎｄ，Ｐ．Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ－ｂａｓｅｄ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５７，２８９－２９８（２００６）．
５６．Ｙｕｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．（２０１０）．ｄｏｉ：１０．４０６１／２０１０／２１８１４２
５７．Ｓｈａｒｒｏｃｋｓ，Ａ．Ｄ．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ：Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ＥＲＫ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ ｔｈｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．１６，５４０－５４２
５８．Ｈｅｒｖｉｏ，Ｌ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｃａｓｃａｄｅｓ： ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７，４４３－４５３（２０００）．
５９．Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ，Ｊ．＆Ａｅｂｉ，Ｍ．Ｎ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｂｉｏｌ．（２０１３）．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｃｓｈｐｅｒｓｐｅｃｔ．ａ０１３３５９
６０．Ｙａｍａｊｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－１（ ＦＧＦ１ ） Ｍｕｔａｎｔ ｔｈａｔ Ａｃｔｓ ａｓ ａｎ ＦＧＦ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５，（２０１０）．
６１．Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｒａｂｅｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｐ．Ｊ．＆Ｂａｌｄａｓｓａｒｅ，Ｊ．Ｊ．Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ－ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ １（ＥＲＫ１） ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１ ｉｎ Ｇ １ ｐｈａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．６８，６１－６８（１９９７）．
６２．Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．，Ｈｕｎｔ，Ｈ．Ｄ．，Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｐｕｌｌｅｎ，Ｊ．Ｋ．＆Ｐｅａｓｅａ，Ｌ．Ｒ．Ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅ ７７，５１－５９（１９８９）．

Claims (34)

  1. アミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸付加、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む、ヒト線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ１）の多様体であって、得られたＦＧＦ１多様体が、配列番号１の野生型ＦＧＦ１と比較して、増加したタンパク質分解安定性を示す、前記多様体。
  2. 前記ＦＧＦ１多様体が、βループ内またはＣ末端付近にアミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸付加、及びそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の多様体。
  3. 前記ＦＧＦ１多様体が、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）アンタゴニストである、請求項１～２に記載の多様体。
  4. 前記ＦＧＦ１多様体が、２８位、４０位、４７位、９３位、または１３１位に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１～３に記載の多様体。
  5. 前記ＦＧＦ１多様体が、Ｄ２８Ｎ、Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、Ｌ１３１Ｒ、及びＬ１３１Ｋからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項３に記載の多様体。
  6. 前記ＦＧＦ１多様体が、アミノ酸置換Ｌ１３１Ｒを含む、請求項３に記載の多様体。
  7. 前記ＦＧＦ１多様体が、アミノ酸置換Ｌ１３１Ｋを含む、請求項３に記載の多様体。
  8. 前記多様体が、アミノ酸置換Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｒを含む、請求項３に記載の多様体。
  9. 前記ＦＧＦ１多様体が、アミノ酸置換Ｄ２８Ｎ及びＬ１３１Ｋを含む、請求項３に記載の多様体。
  10. 前記ＦＧＦ１多様体が、アミノ酸置換Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、及びＬ１３１Ｒを含む、請求項３に記載の多様体。
  11. 前記ＦＧＦ１多様体が、アミノ酸置換Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、及びＬ１３１Ｋを含む、請求項３に記載の多様体。
  12. 前記ＦＧＦ１多様体が、アミノ酸置換Ｄ２８Ｎ、Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、及びＬ１３１Ｒを含む、請求項３に記載の多様体。
  13. 前記ＦＧＦ１多様体が、アミノ酸置換Ｄ２８Ｎ、Ｑ４０Ｐ、Ｓ４７Ｉ、Ｈ９３Ｇ、及びＬ１３１Ｋを含む、請求項３に記載の多様体。
  14. 前記ＦＧＦ１多様体が、アミノ酸置換Ｌ１３１Ａを含まない、請求項３に記載の多様体。
  15. 前記ＦＧＦ１多様体が、検出可能部分、水溶性ポリマー、水不溶性ポリマー、治療部分、標的化部分、及びそれらの組み合わせから選択されるメンバーにコンジュゲートされている、請求項１に記載の多様体。
  16. 前記ＦＧＦ１多様体が、放射性同位体、パラマグネット、フルオロフォア、及びそれらの組み合わせから選択される検出可能部分にコンジュゲートされている、請求項１４に記載の多様体。
  17. 前記ＦＧＦ１多様体が、診断造影剤である、請求項１５に記載の多様体。
  18. 前記多様体が、薬学的に許容される担体と組み合わせてある、請求項１に記載のＦＧＦ１多様体を含む薬学的製剤。
  19. 血管新生の阻害または予防を必要とする対象における前記血管新生を阻害または予防する方法であって、請求項１～１７に記載の多様体を、それを必要とする前記対象に投与し、それによって血管新生を予防または阻害することを含む、前記方法。
  20. 前記対象が、がんを有する、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記対象が、眼の新生血管を予防するために処置される、請求項１９に記載の方法。
  22. 処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、前記方法が、治療有効量の請求項１に記載の多様体を前記対象に投与し、それによって前記がんを処置することを含む、前記方法。
  23. 対象における腫瘍進行、血管新生、転移、及びそれらの組み合わせから選択されるメンバーであるプロセスを低下させる方法であって、前記方法が、前記プロセスを低下させるのに十分な量の請求項１に記載のＦＧＦ１多様体を前記対象に投与することを含む、前記方法。
  24. 前記がんが、大腸、口腔、肝細胞、腎臓、乳房、肺、卵巣、胃、脳、前立腺、及びそれらの組み合わせから選択されるメンバーである、請求項２３に記載の方法。
  25. 請求項１～１７に記載のＦＧＦ１多様体ポリペプチドをコードする、核酸。
  26. 請求項２５に記載の前記核酸が、発現される、単離細胞。
  27. タンパク質分解的に安定な増殖因子多様体をスクリーニングする方法であって、
    ｉ．酵母ディスプレイシステムにおいて増殖因子多様体のライブラリを発現させることと、
    ｉｉ．関連する増殖因子受容体への酵母ディスプレイ増殖因子多様体の結合活性を測定することによって、ｉ）からの前記酵母ディスプレイ増殖因子多様体を、適切な折り畳みについて試験することと、
    ｉｉｉ．ｉｉ）からの前記酵母ディスプレイ増殖因子多様体を、少なくとも１つのプロテアーゼと共にインキュベートすることと、
    ｉｖ．野生型増殖因子のプロテアーゼ切断と比較して、ｉｉｉ）からの前記酵母ディスプレイ増殖因子多様体のプロテアーゼ切断を決定することと、
    ｖ．少なくとも１つのプロテアーゼによる前記野生型増殖因子のプロテアーゼ切断と比較して、同じプロテアーゼによる減少したプロテアーゼ切断及び／またはそれに対する増加したタンパク質分解安定性を示すｉｖ）からの前記多様体を選択することであって、前記選択された増殖因子多様体が、タンパク質分解的に安定な増殖因子多様体である、前記選択することと、を含む、前記方法。
  28. 前記少なくとも１つのプロテアーゼが、前記野生型増殖因子を切断することができるプロテアーゼである、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記少なくとも１つのプロテアーゼが、前記増殖因子を選択的に切断することができ、酵母ディスプレイタンパク質の最小の非特異的切断を示し、及び／または非特異的切断を示さない、請求項２７に記載の方法。
  30. 前記少なくとも１つのプロテアーゼが、血清、トリプシン、キモトリプシン、及びプラスミンからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
  31. 前記少なくとも１つのプロテアーゼが、血清である、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記少なくとも１つのプロテアーゼが、トリプシンである、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記少なくとも１つのプロテアーゼが、キモトリプシンである、請求項３０に記載の方法。
  34. 前記少なくとも１つのプロテアーゼが、プラスミンである、請求項３０に記載の方法。
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