CN101611053B

CN101611053B - 抗血管生成化合物

Info

Publication number: CN101611053B
Application number: CN200780049649.0A
Authority: CN
Inventors: 柯特·布拉德肖; 阿比吉特·巴特; 赖敬宇; 文卡塔·多帕拉普迪; 刘定国
Original assignee: Covx Technologies Ireland Ltd
Current assignee: Covx Technologies Ireland Ltd
Priority date: 2006-11-10
Filing date: 2007-11-12
Publication date: 2015-06-03
Anticipated expiration: 2027-11-12
Also published as: US8912148B2; NO20092203L; ATE520712T1; EP2089425A2; US20080166364A1; AU2007318912B2; US20150057431A1; MX2009005045A; BRPI0718591A2; DK2089425T3; IL198581A0; CN101611053A; KR101309948B1; JP2012121886A; KR20090090331A; KR20120043028A; WO2008056346A2; EP2368908A3; PL2089425T3; MY146985A

Abstract

本发明提供了AA靶向化合物，其包括连接到抗体结合部位的AA靶向剂-连接子共轭物。本发明还提供了该化合物的各种用途，包括治疗与异常血管生成有关的病症的方法。

Description

抗血管生成化合物

技术领域

本发明涉及具有抗血管生成活性的新型化合物及制备和使用这些化合物的方法。

背景技术

血管生成是形成新血管的基本过程，其对诸如再生、发育和伤口恢复等多种正常身体活动是必要的。尽管血管生成在正常条件下是高度可调(highly regulated)的过程，但是很多疾病(表征为“血管生成疾病”)因未调节的血管生成而引发或加重。例如，眼睛的新血管形成已被暗示为最常见的失明原因。在一些诸如关节炎等的现有病症中，新形成的毛细血管侵入关节并破坏软骨。在糖尿病中，在视网膜中形成的新毛细血管侵入玻璃体、出血并引起失明。实体瘤的生长和转移也是血管生成依赖型的(J.Folkman，Cancer Res.，46：467-473(1986)，J.Folkman，J.Natl.Cancer Inst.，82：4-6(1989))。例如，已经显示，扩大至2mm以上的肿瘤通过诱导新毛细血管生长而获取它们自身的血液供应。一旦这些新血管植入肿瘤中，它们向肿瘤细胞提供进入循环并转移至远距离部位如肝、肺和骨的手段(N.Weidner，等，N.Engl.J.Med.，324：1-8(1991))。

已鉴定出多种与血管生成相关因子血管生成素-2(“Ang-2”)结合的肽(Oliner，J.等，Cancer Cell，204(6)，507-516(2004))。Ang-2结合肽已显示具有抗血管生成活性。

对本说明书中任何现有技术的参考并非且不应当被认为是任何形式的承认或暗示所参考的现有技术形成公知常识的一部分。

发明内容

本发明提供了基于Ang-2结合肽的抗血管生成靶向化合物(targeting compound)(AA靶向化合物)，其具有可用于很多应用的独特的特异性和生物学特性。本发明的抗血管生成靶向化合物通过共价连接抗血管生成靶向剂与抗体结合部位而形成。本发明还提供了包括本发明的靶向化合物和可药用载体的药物组合物。在一些实施方式中，本发明提供包含肽的靶向剂，所述肽包括与下述序列基本同源的序列：

x¹ x² x³ x⁴ x⁵ x⁶ D x⁸ x⁹ x¹⁰ x¹¹ x¹² x¹³ x¹⁴ x¹⁵ x¹⁶ x¹⁷ x¹⁸ x¹⁹ x²⁰ x²¹ x²²(SEQ IDNO：161)

其中

x¹可以是任何残基，x²可以是任何残基，x³可以是任何芳香性氨基酸残基，x⁴可以是任何残基，x⁵可以是P、hP、dhP或BnHP，x⁶可以是任何残基，x⁸可以是D或E，x⁹可以是包含亲核性或亲电性侧链的任何残基，x¹⁰可以是D或E，x¹¹可以是包含亲核性或亲电性侧链的任何残基，x¹²可以是任何残基，x₁₃可以选自L、HL、Nva、I、HchA、HF和ThA。x¹⁴可以是任何芳香性氨基酸残基，x¹⁵可以是D或E，x¹⁶可以是任何残基，x¹⁷可以是任何芳香性氨基酸残基，x¹⁸可以是任何残基，x¹⁹可以是任何残基，x²⁰可以是任何残基或者当x²²和x²¹不存在时可以不存在，x²¹可以是任何残基或者当x²²不存在时可以不存在，x²²可以是任何残基或者不存在。

x¹可以是Q。x¹可以是T。x¹可以是S。x¹可以是R。x¹可以是H。x²可以是K。x²可以是N。x²可以是R。x²可以是H。x²可以是AcK。x²可以是Nick。x²可以是CbcK。在一些实施方式中，x²可以选自K、N、R、H、AcK、Nick或CbcK。X²可以选自N、R、H、AcK、Nick或CbcK。X²可以选自R、H、AcK、Nick或CbcK。X²可以选自R、H、AcK或CbcK。x²可以选自R、H或AcK。x³可以是F。x³可以是Y。x³可以是W。x³可以是BPA。x³可以是CF。或者x³可以是NF。x⁴可以是Q。x⁴可以是M。x⁴可以是E。x⁴可以是K。x⁵可以是P。x⁵可以是HP。x⁵可以是DHP。x⁵可以是BnHP。x⁶可以是M。x⁶可以是L。x⁶可以是I。x⁸可以是E。x⁸可以是D。x⁹可以是L。x⁹可以是I。x⁹可以是TA。x⁹可以是ThA。x⁹可以是K。x⁹可以是AcK。x¹⁰可以是E。x¹⁰可以是D。x¹¹可以是Q。x¹¹可以是N。x¹¹可以是C。x¹¹可以是K。x¹¹可以是AcK。x¹¹可以是Dab。X¹¹可以是Dap。x¹²可以是T。x¹²可以是R。x¹²可以是K。x¹³可以是L。x¹³可以是HL。x¹³可以是Nva。x¹³可以是I。x¹³可以是HchA。x¹³可以是HF。x¹³可以是ThA。x¹³可以是K。在一些实施方式中，x¹³可以选自L、HL、Nva、I、HchA、HF和ThA。在一些实施方式中，x¹³可以选自L、HL和Nva。x¹⁴可以是F。x¹⁴可以是Y。x¹⁴可以是W。x¹⁴可以是BPA。x¹⁴可以是CF。x¹⁴可以是或NF。x¹⁵可以是D。x¹⁵可以是E。x¹⁶可以是Q。x¹⁶可以是N。x¹⁷可以是F。x¹⁷可以是Y。x¹⁷可以是W。x¹⁷可以是BPA。X¹⁷可以是CF。x¹⁷可以是NF。x¹⁸可以是M。x¹⁹可以是L。x¹⁹可以是I。x²⁰可以是Q。x²⁰可以是N。x²¹可以是Q。x²¹可以是N。x²²可以是G。

在一些实施方式中，本发明提供包含肽的靶向剂，所述肽包括与下述序列基本同源的序列：

x¹ x² x³ x⁴ x⁵ x⁶ D E x⁹ D x¹¹ x¹² x¹³ x¹⁴ D x¹⁶ x¹⁷ x¹⁸ x¹⁹ x²⁰ x²¹ x²²(SEQ IDNO：162)

其中

x¹、x²、x⁴、x⁶、x¹²、x¹⁶、x¹⁸、x¹⁹中每个可独立地为任何残基，

x³、x¹⁴和x¹⁷每个可独立地为任何芳香性氨基酸残基，

x⁵可以是P、hP、dhP或BnHP之一，

x⁹和x¹¹每个可独立地为包含亲核性或亲电性侧链的任何残基，

x¹³可以选自L、HL、Nva、I、HchA、HF和ThA。

x²⁰可以是任何残基，或者当x²²和x²¹不存在时可以不存在，

x²¹可以是任何残基，或者当x²²不存在时可以不存在，

x²²可以是任何残基或者不存在。

x¹可以是Q。x¹可以是T。x¹可以是S。x¹可以是R。x¹可以是H。x²可以是K。x²可以是N。x²可以是R。x²可以是H。x²可以是AcK。x²可以是Nick。x²可以是CbcK。在一些实施方式中，x²可以选自K、N、R、H、AcK、Nick或CbcK。x²可以选自N、R、H、AcK、Nick或CbcK。X²可以选自R、H、AcK、Nick或CbcK。x²可以选自R、H、AcK或CbcK。x²可以选自R、H或AcK。x³可以是F。x³可以是Y。x³可以是W。x³可以是BPA。x³可以是CF。x³可以是NF。x⁴可以是Q。x⁴可以是M。x⁴可以是E。x⁴可以是K。x⁵可以是P。x⁵可以是HP。x⁵可以是DHP。x⁵可以是BnHP。x⁶可以是M。x⁶可以是L。x⁶可以是I。x⁹可以是L。x⁹可以是I。x⁹可以是TA。x⁹可以是ThA。x⁹可以是K。x⁹可以是AcK。x¹¹可以是Q。x¹¹可以是N。x¹¹可以是C。X¹¹可以是K。x¹¹可以是AcK。x¹¹可以是Dab。X¹¹可以是Dap。x¹²可以是T。x¹²可以是R。x¹²可以是K。x¹³可以是L。x¹³可以是HL。x¹³可以是Nva。x¹³可以是I。x¹³可以是HchA。x¹³可以是HF。x¹³可以是ThA。在一些实施方式中，x¹³可以选自L、HL、Nva、I、HchA、HF和ThA。在一些实施方式中，x¹³可以选自L、HL和Nva。x¹⁴可以是F。x¹⁴可以是Y。x¹⁴可以是W。x¹⁴可以是BPA。x¹⁴可以是CF。x¹⁴可以是NF。x¹⁶可以是Q。x¹⁶可以是N。x¹⁷可以是F。x¹⁷可以是Y。x¹⁷可以是W。x¹⁷可以是BPA。x¹⁷可以是CF。x¹⁷可以是NF。x¹⁸可以是M。x¹⁹可以是L。x¹⁹可以是I。x²⁰可以是Q。x²⁰可以是N。x²¹可以是Q。x²¹可以是N。x²²可以是G。

x¹ AcK x³ x⁴ x⁵ x⁶ D E x⁹ D x¹¹ x¹² x¹³ x¹⁴ D x¹⁶ x¹⁷ x¹⁸ x¹⁹ x²⁰ x²¹ x²²(SEQID NO：163)

其中x¹、x⁴、x⁶、x¹²、x¹⁶、x¹⁸、x¹⁹中每个可独立地为任何残基，x³、x¹⁴和x¹⁷每个可独立地为任何芳香性氨基酸残基，x⁵可以是P、hP、dhP或BnHP。

x⁹和X¹¹每个可独立地为包含亲核性或亲电性侧链的任何残基，x¹³可以选自L、HL、Nva、I、HchA、HF和ThA，x²⁰可以是任何残基或者当x²²和x²¹不存在时不存在，x²¹可以是任何残基或者当x²²不存在时不存在，x²²可以是任何残基或者不存在。表7中的化合物22、24、29、30、31、32、33、44、45、56、57、58、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35和42例证了由本式覆盖的本发明方面。

x¹可以是Q。x¹可以是T。x¹可以是S。x¹可以是R。x¹可以是H。x³可以是F。x³可以是Y。x³可以是W。x³可以是BPA。x³可以是CF。或x³可以是NF。x⁴可以是Q。x⁴可以是M。x⁴可以是E。x⁴可以是K。x⁵可以是P。x⁵可以是HP。x⁵可以是DHP。x⁵可以是BnHP。x⁶可以是M。x⁶可以是L。x⁶可以是I。x⁹可以是L。x⁹可以是I。x⁹可以是TA。x⁹可以是ThA。x⁹可以是K。x⁹可以是AcK。x¹¹可以是Q。x¹¹可以是N。x¹¹可以是C。x¹¹可以是K。x¹¹可以是AcK。x¹¹可以是Dab。x¹¹可以是Dap。x¹²可以是T。x¹²可以是R。x¹²可以是K。x¹³可以是L。x¹³可以是HL。x¹³可以是Nva。x¹³可以是I。x¹³可以是HchA。x¹³可以是HF。x¹³可以是ThA。在一些实施方式中，x¹³可以选自L、HL、Nva、I、HchA、HF和ThA。在一些实施方式中，x¹³可以选自L、HF和Nva。x¹⁴可以是F。x¹⁴可以是Y。x¹⁴可以是W。x¹⁴可以是BPA。x¹⁴可以是CF。或x¹⁴可以是NF。x¹⁶可以是Q。x¹⁶可以是N。x¹⁷可以是F。x¹⁷可以是Y。x¹⁷可以是W。x¹⁷可以是BPA。X¹⁷可以是CF。或x¹⁷可以是NF。x¹⁸可以是M。x¹⁹可以是L。x¹⁹可以是I。x²⁰可以是Q。x²⁰可以是N。x²¹可以是Q。x²¹可以是N。x²²可以是G。

x¹ N x³ x⁴ x⁵ x⁶ D E x⁹ D x¹¹ x¹² x¹³ x¹⁴ D x¹⁶ x¹⁷ x¹⁸ x¹⁹ x²⁰ x²¹ x²²(SEQ IDNO：164)，

其中

x¹、x⁴、x⁶、x¹²、x¹⁶、x¹⁸、x¹⁹中每个可独立地为任何残基，x³、x¹⁴和x¹⁷每个可独立地为任何芳香性氨基酸残基，x⁵可以是P、hP、dhP或BnHP，x⁹和x¹¹每个可独立地为包含亲核性或亲电性侧链的任何残基，x¹³可以选自L、HL、Nva、I、HchA、HF和ThA，x²⁰可以是任何残基或者当x²²和x²¹不存在时不存在，x²¹可以是任何残基或者当x²²不存在时可以不存在，x²²可以是任何残基或者不存在。表7中的化合物23、25、28、56、57和58例证了本发明的这些方面。

x¹可以是Q。x¹可以是T。x¹可以是S。x¹可以是R。x¹可以是H。x³可以是F。x³可以是Y。x³可以是W。x³可以是BPA。x³可以是CF。或x³可以是NF。x⁴可以是Q。x⁴可以是M。x⁴可以是E。x⁴可以是K。x⁵可以是P。x⁵可以是HP。x⁵可以是DHP。x⁵可以是BnHP。x⁶可以是M。x⁶可以是L。x⁶可以是I。x⁹可以是L。x⁹可以是I。x⁹可以是TA。x⁹可以是ThA。x⁹可以是K。x⁹可以是AcK。x¹¹可以是Q。x¹¹可以是N。x¹¹可以是C。x¹¹可以是K。x¹¹可以是AcK。x¹¹可以是Dab。X¹¹可以是Dap。x¹²可以是T。x¹²可以是R。x¹²可以是K。x¹³可以是L。x¹³可以是HL。x¹³可以是Nva。x¹³可以是I。x¹³可以是HchA。x¹³可以是HF。x¹³可以是ThA。在一些实施方式中，x¹³可以选自L、HL、Nva、I、HchA、HF和ThA。在一些实施方式中，x¹³可以选自L、HL和Nva。x¹⁴可以是F。x¹⁴可以是Y。x¹⁴可以是W。x¹⁴可以是BPA。X¹⁴可以是CF。或x¹⁴可以是NF。x¹⁶可以是Q。x¹⁶可以是N。x¹⁷可以是F。x¹⁷可以是Y。x¹⁷可以是W。x¹⁷可以是BPA。X¹⁷可以是CF。或x¹⁷可以是NF。x¹⁸可以是M。x¹⁹可以是L。x¹⁹可以是I。x²⁰可以是Q。x²⁰可以是N。x²¹可以是Q。x²¹可以是N。x²²可以是G。

x¹ x² x³ x⁴ x⁵ x⁶ D E x⁹ D K x¹² x¹³ x¹⁴ D x¹⁶ x¹⁷ x¹⁸ x¹⁹ x²⁰ x²¹ x²²(SEQ IDNO：165)，

其中x¹、x²、x⁴、x⁶、x¹²、x¹⁶、x¹⁸、x¹⁹中每个可独立地为任何残基，x³、x¹⁴和x¹⁷每个可独立地为任何芳香性氨基酸残基，x⁵可以是P、hP、dhP或BnHP。

x⁹可以是任何残基，并且可选自L、I、K、ThA和AcK，x¹³可以选自L、HL、Nva、I、HchA、HF和ThA，x²⁰可以是任何残基或者当x²²和x²¹不存在时不存在，x²¹可以是任何残基或者当x²²不存在时可以不存在，x²²可以是任何残基或者不存在。

x¹可以是Q。x¹可以是T。x¹可以是S。x¹可以是R。x¹可以是H。x²可以是K。x²可以是N。x²可以是R。x²可以是H。x²可以是AcK。x²可以是Nick。x²可以是CbcK。在一些实施方式中，x²可以选自K、N、R、H、AcK、Nick或CbcK。X²可以选自N、R、H、AcK、Nick或CbcK。X²可以选自R、H、AcK、Nick或CbcK。X²可以选自R、H、AcK或CbcK。X²可以选自R、H或AcK。x³可以是F。x³可以是Y。x³可以是W。x³可以是BPA。x³可以是CF。或x³可以是NF。x⁴可以是Q。x⁴可以是M。x⁴可以是E。x⁴可以是K。x⁵可以是P。x⁵可以是HP。x⁵可以是DHP。x⁵可以是BnHP。x⁶可以是M。x⁶可以是L。x⁶可以是I。x⁹可以是L。x⁹可以是I。x⁹可以是TA。x⁹可以是ThA。x⁹可以是K。x⁹可以是AcK。x¹²可以是T。x¹²可以是R。x¹²可以是K。x¹³可以是L。x¹³可以是HL。x¹³可以是Nva。x¹³可以是I。x¹³可以是HchA。x¹³可以是HF。x¹³可以是ThA。在一些实施方式中，x¹³可以选自L、HL、Nva、I、HchA、HF和ThA。在一些实施方式中，x¹³可以选自L、HL和Nva。x¹⁴可以是F。x¹⁴可以是Y。x¹⁴可以是W。x¹⁴可以是BPA。X¹⁴可以是CF。或x¹⁴可以是NF。x¹⁶可以是Q。x¹⁶可以是N。x¹⁷可以是F。x¹⁷可以是Y。x¹⁷可以是W。x¹⁷可以是BPA。X¹⁷可以是CF。或x¹⁷可以是NF。x¹⁸可以是M。x¹⁹可以是L。x¹⁹可以是I。x²⁰可以是Q。x²⁰可以是N。x²¹可以是Q。x²¹可以是N。x²²可以是G。

Q x² x³ Q x⁵ L D E x⁹ D x¹¹ T x¹³ x¹⁴ D Q x¹⁷ M L Q Q G(SEQ ID NO：166)

其中

x²可以是AcK、N、R、H、Nick、CbcK，x³、x¹⁴和x¹⁷每个可独立地为任何芳香性氨基酸残基，x⁵可以是P、hP、dhP或BnHP，x⁹可以是K、AcK、Ile、L或ThA任一种，x¹¹可以是K、Dab、Dap、AcK、C或R中任一种，x¹³可以选自L、HL、Nva、I、HchA、HF和ThA。

x²可以是K。x²可以是N。x²可以是R。x²可以是H。x²可以是AcK。x²可以是Nick。x²可以是CbcK。在一些实施方式中，x²可以选自K、N、R、H、AcK、Nick或CbcK。X²可以选自N、R、H、AcK、Nick或CbcK。X²可以选自R、H、AcK、Nick或CbcK。X²可以选自R、H、AcK或CbcK。X²可以选自R、H或AcK。x³可以是F。x³可以是Y。x³可以是W。x³可以是BPA。x³可以是CF。x³可以是NF。x⁵可以是P。x⁵可以是HP。x⁵可以是DHP。x⁵可以是BnHP。x⁹可以是L。x⁹可以是I。x⁹可以是TA。x⁹可以是ThA。x⁹可以是K。x⁹可以是AcK。x¹¹可以是Q。x¹¹可以是N。x¹¹可以是C。x¹¹可以是K。x¹¹可以是AcK。x¹¹可以是Dab。x¹³可以是L。x¹³可以是HL。x¹³可以是Nva。x¹³可以是I。x¹³可以是HchA。x¹³可以是HF。x¹³可以是ThA。在一些实施方式中，x¹³可以选自L、HL、Nva、I、HchA、HF和ThA。在一些实施方式中，x¹³可以选自L、HL和Nva。x¹⁴可以是F。x¹⁴可以是Y。x¹⁴可以是W。x¹⁴可以是BPA。X¹⁴可以是CF。或x¹⁴可以是NF。x¹⁷可以是F。x¹⁷可以是Y。x¹⁷可以是W。x¹⁷可以是BPA。X¹⁷可以是CF。或x¹⁷可以是NF。

Q x² x³ Q x⁵ L D E x⁹ D K T x¹³ x¹⁴ D Q x¹⁷ M L Q Q G(SEQ ID NO：167)

其中

x²可以是K、N、R、H、AcK、Nick或CbcK中任一种。x³、x¹⁴和x¹⁷每个可独立地为任何芳香性氨基酸残基，x⁵可以是P、hP、dhP或BnHP，x⁹可以是K、AcK、Ile、L或ThA中任一种，x¹³可以选自L、HL、Nva、I、HchA、HF和ThA。x²可以是K。x²可以是N。x²可以是R。x²可以是H。x²可以是AcK。x²可以是Nick。x²可以是CbcK。在一些实施方式中，x²可以选自K、N、R、H、AcK、Nick或CbcK。X²可以选自N、R、H、AcK、Nick或CbcK。X²可以选自R、H、AcK、Nick或CbcK。X²可以选自R、H、AcK或CbcK。X²可以选自R、H或AcK。

x³可以是F。x³可以是Y。x³可以是W。x³可以是BPA。x³可以是CF。或x³可以是NF。x⁵可以是P。x⁵可以是HP。x⁵可以是DHP。x⁵可以是BnHP。x⁹可以是L。x⁹可以是I。x⁹可以是TA。x⁹可以是ThA。x⁹可以是K。x⁹可以是AcK。x¹³可以是L。x¹³可以是HL。x¹³可以是Nva。x¹³可以是I。x¹³可以是HchA。x¹³可以是HF。x¹³可以是ThA。在一些实施方式中，x¹³可以选自L、HL、Nva、I、HchA、HF和ThA。在一些实施方式中，x¹³可以选自L、HL和Nva。x¹⁴可以是F。x¹⁴可以是Y。x¹⁴可以是W。x¹⁴可以是BPA。X¹⁴可以是CF。或x¹⁴可以是NF。x¹⁷可以是F。x¹⁷可以是Y。x¹⁷可以是W。x¹⁷可以是BPA。X¹⁷可以是CF。或x¹⁷可以是NF。

Q AcK x³ Q x⁵ L D E x⁹ D K T x¹³ x¹⁴ D Q x¹⁷ M L Q Q G(SEQ IDNO：168)

其中

x³、x¹⁴和x¹⁷每个可独立地为任何芳香性氨基酸残基，x⁵可以是P、hP、dhP或BnHP，x⁹可以是K、AcK、Ile、L或ThA中任一种，x¹³可以选自L、HL、Nva、I、HchA、HF和ThA。x³可以是F。x³可以是Y。x³可以是W。x³可以是BPA。x³可以是CF。或x³可以是NF。x⁵可以是P。x⁵可以是HP。x⁵可以是DHP。x⁵可以是BnHP。x⁹可以是L。x⁹可以是I。x⁹可以是TA。x⁹可以是ThA。x⁹可以是K。x⁹可以是AcK。x¹³可以是L。x¹³可以是HL。x¹³可以是Nva。x¹³可以是I。x¹³可以是HchA。x¹³可以是HF。x¹³可以是ThA。在一些实施方式中，x¹³可以选自L、HL、Nva、I、HchA、HF和ThA。在一些实施方式中，x¹³可以选自L、HL和Nva。x¹⁴可以是F。x¹⁴可以是Y。x¹⁴可以是W。x¹⁴可以是BPA。X¹⁴可以是CF。或x¹⁴可以是NF。x¹⁷可以是F。x¹⁷可以是Y。x¹⁷可以是W。x¹⁷可以是BPA。X¹⁷可以是CF。或x¹⁷可以是NF。

Q N x³ Q x⁵ L D E x⁹ D K T x¹³ x¹⁴ D Q x¹⁷ M L Q Q G(SEQ ID NO：169)

其中，x³、x¹⁴和x¹⁷每个可独立地为任何芳香性氨基酸残基，

x⁵可以是P、hP、dhP或BnHP，x⁹可以是K、AcK、Ile、L或ThA中任一种，x¹³可以选自L、HL、Nva、I、HchA、HF和ThA。

x¹ x² x³ x⁴ x⁵ x⁶ D E x⁹ D x¹¹ x¹² L x¹⁴ D x¹⁶ x¹⁷ x¹⁸ x¹⁹ x²⁰ x²¹ x²²(SEQ IDNO：170)

其中

x¹、x⁴、x⁶、x¹²、x¹⁶、x¹⁸、x¹⁹中每个可独立地为任何残基，x²可以是AcK、N、R、H、Nick、CbcK，x³、x¹⁴和x¹⁷每个可独立地为任何芳香性氨基酸残基，x⁵可以是P、hP、dhP或BnHP之一，x⁹和x¹¹每个可独立地为包含亲核性或亲电性侧链的任何残基，x²⁰可以是任何残基或者当x²²和x²¹不存在时不存在，x²¹可以是任何残基或者当x²²不存在时可以不存在，x²²可以是任何残基或者不存在。

x¹ AcK x³ x⁴ x⁵ x⁶ D E x⁹ D x¹¹ x¹² L x¹⁴ D x¹⁶ x¹⁷ x¹⁸ x¹⁹ x²⁰ x²¹ x²²(SEQ IDNO：171)

其中x¹、x⁴、x⁶、x¹²、x¹⁶、x¹⁸、x¹⁹中每个可独立地为任何残基，x³、x¹⁴和x¹⁷每个可独立地为任何芳香性氨基酸残基，x⁵可以是P、hP、dhP或BnHP，x⁹和x¹¹每个可独立地为包含亲核性或亲电性侧链的任何残基，x²⁰可以是任何残基或者当x²²和x²¹不存在时不存在，x²¹可以是任何残基或者当x²²不存在时可以不存在，x²²可以是任何残基或者不存在。

表7中的化合物22、24、29、30、33、34、35、36、37、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、54、55和62例证了被本式覆盖的本发明方面。

x¹ N x³ x⁴ x⁵ x⁶ D E x⁹ D x¹¹ x¹² L x¹⁴ D x¹⁶ x¹⁷ x¹⁸ x¹⁹ x²⁰ x²¹ x²²(SEQ IDNO：172)，

其中，x¹、x⁴、x⁶、x¹²、x¹⁶、x¹⁸、x¹⁹中每个可独立地为任何残基，x³、x¹⁴和x¹⁷每个可独立地为任何芳香性氨基酸残基，x⁵可以是P、hP、dhP或BnHP，x⁹和x¹¹每个可独立地为包含亲核性或亲电性侧链的任何残基，x²⁰可以是任何残基或者当x²²和x²¹不存在时不存在，x²¹可以是任何残基或者当x²²不存在时可以不存在，x²²可以是任何残基或者不存在。

表7中的化合物23、25、28、56、57和58例证了被本式覆盖的本发明方面。

x¹ x² x³ x⁴ x⁵ x⁶ D E x⁹ D K x¹² L x¹⁴ D x¹⁶ x¹⁷ x¹⁸ x¹⁹ x²⁰ x²¹ x²²(SEQ IDNO：173)

其中x¹、x⁴、x⁶、x¹²、x¹⁶、x¹⁸、x¹⁹中每个可独立地为任何残基，x²可以是AcK、N、R、H、Nick、CbcK，x³、x¹⁴和x¹⁷每个可独立地为任何芳香性氨基酸残基，x⁵可以是P、hP、dhP或BnHP，且x⁹可以是任何残基并且可以选自L、I、K、ThA和AcK，x²⁰可以是任何残基或者当x²²和x²¹不存在时不存在，x²¹可以是任何残基或者当x²²不存在时可以不存在，x²²可以是任何残基或者不存在。

Q x² x³ Q x⁵ L D E x⁹ D x11 T L x¹⁴ D Q x¹⁷ M L Q Q G(SEQ ID NO：174)

其中x²可以是AcK、N、R、H、Nick、CbcK，x³、x¹⁴和x¹⁷每个可独立地为任何芳香性氨基酸残基，x⁵可以是P、hP、dhP或BnHP，x⁹可以是K、AcK、Ile、L或ThA中任一种，x¹¹可以是K、Dab、AcK、C或R中任一种。

Q x² x³ Q x⁵ L D E x⁹ D K T L x¹⁴ D Q x¹⁷ M L Q Q G(SEQ ID NO：175)

其中x²可以是K、N、R、H、AcK、Nick或CbcK中任一种，x³、x¹⁴和x¹⁷每个可独立地为任何芳香性氨基酸残基，x⁵可以是P、hP、dhP或BnHP，x⁹可以是K、AcK、Ile、L或ThA中任一种。

Q AcK x³ Q x⁵ L D E x⁹ D K T L x¹⁴ D Q x¹⁷ M L Q Q G(SEQ IDNO：176)

其中，x³、x¹⁴和x¹⁷每个可独立地为任何芳香性氨基酸残基，x⁵可以是P、hP、dhP或BnHP，x⁹可以是K、AcK、Ile、L或ThA中任一种。

Q N x³ Q x⁵ L D E x⁹ D K T L x¹⁴ D Q x¹⁷ M L Q Q G(SEQ ID NO：177)

其中x³、x¹⁴和x¹⁷每个可独立地为任何芳香性氨基酸残基，x⁵可以是P、hP、dhP或BnHP，x⁹可以是K、AcK、Ile、L或ThA中任一种。

本发明的化合物可以包括氨基-端(N-端)封端基团或羧基-端(C-端)封端基团。N-端封端基团可以是“ac”：C(O)CH₃)(例如，表7中的化合物21、22、23、24、25、27、28、29、30、31、32、33、34、3 5、36、37、38、39、40，41、42、43、44、45、46、47、48、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63)。本发明的化合物可以包含DCB基团作为N-端封端基团(例如，表7中的化合物49)。本发明的化合物可以包含DFB基团作为N-端封端基团(例如，表7中的化合物50)。本发明的化合物可以包含PyC基团作为N-端封端基团(例如，表7中的化合物51)。本发明的化合物可以包含2-PEG基团作为N-端封端基团(例如，表7中的化合物52)。C-端封端基团可以是“am”：NH₂。

在一些实施方式中，本发明提供血管生成素受体-拮抗剂(AA)靶向剂，其包含肽，所述肽包括与下述序列基本同源的序列：

Q¹ x² Y³ Q⁴ x⁵ L⁶ D⁷ E⁸ x⁹ D¹⁰ x¹¹ T¹² x¹³ x¹⁴ x¹⁵ x¹⁶ F¹⁷ x¹⁸ x¹⁹ Q²⁰ Q²¹ G²²(SEQ ID NO：178)

其中

x²选自K、N、R、H、AcK、Nick、CbcK和连接残基(linking residue)，x⁵选自P、hP、dhP或BnHP，x⁹选自L、I、ThA、AcK和连接残基，x¹¹选自Q、N、C、K、AcK、Dab、Dap和连接残基，x¹³选自L、HL、Nva、I、HchA、HF、ThA和连接残基，x¹⁴选自芳族残基和连接残基，x¹⁵选自D和连接残基，x¹⁶选自Q、N和连接残基，x¹⁸选自M和连接残基，x¹⁹选自L、I和连接残基，并且其中Q¹、x⁹、x¹¹、x¹³、x¹⁵、x¹⁶、x¹⁸、x¹⁹和G²²之一是包含亲核性侧链的连接残基，所述亲核性侧链可直接或经由中间连接子而共价键合至抗体的结合部位，所述连接残基选自K、R、Y、C、T和S、或者N-端或C-端。

Q¹ x² Y³ Q⁴ x⁵ L⁶ D⁷ x⁸ x⁹ D¹⁰ x¹¹ x¹² x¹³ x¹⁴ x¹⁵ x¹⁶ F¹⁷ x¹⁸ x¹⁹ Q²⁰ Q²¹ G²²(SEQ ID NO：193)

其中

x²选自K、N、R、H、AcK、Nick、CbcK和连接残基，x⁵选自P、hP、dhP或BnHP，x⁸是E或连接残基，x⁹选自L、I、ThA、AcK和连接残基，x¹¹选自Q、N、C、K、AcK、Dab、Dap和连接残基，x¹²是T或连接残基，x¹³选自L、HL、Nva、I、HchA、HF、ThA，x¹⁴选自芳族残基和连接残基，x¹⁵选自D和连接残基，x¹⁶选自Q、N和连接残基，x¹⁸选自M和连接残基，x¹⁹选自L、I和连接残基，并且其中Q¹、x⁹、x⁸、x¹¹、x¹²、x¹⁵、x¹⁶、x¹⁸、x¹⁹和G²²之一是包含亲核性侧链的连接残基，所述亲核性侧链直接或经由中间连接子可共价键合至抗体的结合部位，所述连接残基选自K、R、Y、C、T、S、Dap、Dab、S的同系物、C的同系物、K的同系物、或者N-端或C-端。

连接残基可以选自K、Y、T、Dap和Dab。连接残基可位于X⁹、X¹¹、X¹²、X¹⁵、X¹⁶、X¹⁸和X¹⁹之一上。在一些实施方式中，X¹¹是连接残基。表7和8提供在不同连接残基上共价键合于h38C2的结合部位的本发明化合物的例子。

x²可以选自K、N、AcK。其中x²是N的本发明的示例性化合物是23、25、28、56、57和58。其中x²是AcK的本发明示例性化合物是22、24、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、43(a)、44、45、46、47、48、49、50、51、52、54、55、62、63、64、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87和91。

x⁵可以选自P、hP和dhP。其中x⁵是P的本发明示例性化合物是21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、35、36、37、38、39、40、41、42、43、43(a)、44、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90和91。其中x⁵是HP的本发明示例性化合物是35、45、46和47。其中x⁵是DHP的本发明示例性化合物是34。

x⁸可以是E。

x¹¹可以选自K、AcK、Dab和Dap。其中x¹¹是AcK的本发明示例性化合物是30和32。其中x¹¹是Dab的本发明示例性化合物是54。其中x¹¹是Dap的本发明示例性化合物是55。

x¹²可以是T。

x¹³可以选自K、L、HL、Nva和I。其中x¹³是K的本发明示例性化合物是31和32。其中x¹³是HL的本发明示例性化合物是42。其中x¹³是Nva的本发明示例性化合物是41。其中x¹³是I的本发明示例性化合物是36。

x¹⁴可以选自F、Y、W、BPA、CF和NF。其中x¹⁴是F的本发明示例性化合物是44。其中x¹⁴是BPA的本发明示例性化合物是46和56。其中x¹⁴是CF的本发明示例性化合物是47、57和62。其中x¹⁴是NF的本发明示例性化合物是45、48和58。

本发明的AA靶向剂可以包含肽，所述肽包括与一种或多种选自下组的化合物基本同源的序列：21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、43(a)44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90和91。

本发明的AA靶向剂可以包含肽，所述肽包括与一种或多种选自下组的化合物基本同源的序列：24、25、26、27、28、29、30、34、35、37、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、54、55、56、57、58、59、60、61、62、75、76、77、78和79。

本发明的AA靶向剂可以包含肽，所述肽包括与选自下组的一种或多种化合物基本同源的序列：24、25、27、28、29、30、34、35、37、41、42、43、44、45、46、47、48、56、57、58、60、62、75、76、77、78和79。

本发明的AA靶向剂可以包含肽，所述肽包括与一种或多种选自下组的化合物基本同源的序列：22、34、41、43、44、48和91。

本发明的AA靶向剂可以包含肽，所述肽包括与一种或多种选自下组的化合物基本同源的序列：27、28、29、43、45和48。

本发明的化合物用于靶向Ang2，并且显示出优于现有Ang2靶向剂的有利性能。在本发明的一些方面，有利的本发明的药剂和化合物在半衰期与IC₅₀值之间提供了有吸引力的平衡。

在本发明的一些实施方式中，x⁹和x¹¹中的至少一个残基是包含氨基酸的连接残基，其侧链能够分别与包含亲电体或亲核体的化学基团共价结合。

连接残基的存在为本发明的靶向剂提供了与支架(scaffold)、大分子及其它部分(moiety)键合的极大灵活性。特别地，本发明的化合物可以可靠、牢固且有效地共价连接至支架诸如抗体。惊人地，已经发现，使连接残基位于肽的某些关键位置导致增加的稳定性和/或肽的结合。

连接残基是可用于通过连接残基的氨基端、羧基端或侧链进行共价结合的氨基酸残基。连接残基可以是K。在其它实施方式中，连接残基可以是Y。在其它实施方式中，连接残基可以是T。连接残基可以是Dab。连接残基可以是Dap。在一些实施方式中，连接残基选自K、Dab、Dap、Y和T。

在其它实施方式中，连接残基可以是C。连接残基可以是R。连接残基可以是S。连接残基可以是N。连接残基可以是Q。连接残基可以是D。连接残基可以是E。

连接残基可以是任何一个残基。在一些实施方式中，连接残基可以是x⁹。连接残基可以是x¹¹。在一些实施方式中，已经发现，使用赖氨酸和修饰赖氨酸残基的侧链作为连接残基可提供一些优势，包括在该部位允许特异性的、可靠的、直接的且有效的化学共价键。

参考上式(SEQ ID NOs：161-178和SEQ ID NO：193)，以及更通常地：

x¹可以是Q。x¹可以是T。x¹可以是S。x¹可以是R。x¹可以是H。x²可以是N。x²可以是R。x²可以是H。x²可以是AcK。x²可以是Nick。x²可以是CbcK。在一些实施方式中，x²可以选自K、N、R、H、AcK、Nick或CbcK。X²可以选自N、R、H、AcK、Nick或CbcK。X²可以选自R、H、AcK、Nick或CbcK。X²可以选自R、H、AcK或CbcK。X²可以选自R、H或AcK。在一些包含连接子和抗体的本发明实施方式中，x²可以是K。x³可以是F。x³可以是Y。x³可以是W。x³可以是BPA。x³可以是CF。或x³可以是NF。x⁴可以是Q。x⁴可以是M。x⁴可以是E。x⁴可以是K。x⁶可以是M。x⁶可以是L。x⁶可以是I。x⁸可以是E。x⁸可以是D。X⁹可以是L。x⁹可以是I。X⁹可以是TA。X⁹可以是ThA。X⁹可以是K。X⁹可以是AcK。X⁹可以是连接残基。x¹⁰可以是E。x¹⁰可以是D。x¹¹可以是Q。X¹¹可以是N。X¹¹可以是C。X¹¹可以是K。X¹¹可以是AcK。X¹¹可以是Dab。X¹¹可以是Dap。X¹¹可以是连接残基。x¹²可以是T。x¹²可以是R。x¹²可以是K。x¹³可以是L。x¹³可以是HL。x¹³可以是Nva。x¹³可以是I。x¹³可以是HchA。x¹³可以是HF。x¹³可以是ThA。在一些实施方式中，x¹³可以选自L、HL、Nva、I、HchA、HF和ThA。在一些实施方式中，x¹³可以选自L、HL和Nva。x¹⁴可以是F。x¹⁴可以是Y。x¹⁴可以是W。x¹⁴可以是BPA。X¹⁴可以是CF。或x¹⁴可以是NF。x¹⁵可以是D。x¹⁵可以是E。x¹⁶可以是Q。x¹⁶可以是N。x¹⁷可以是F。x¹⁷可以是Y。x¹⁷可以是W。x¹⁷可以是BPA。X¹⁷可以是CF。或x¹⁷可以是NF。x¹⁸可以是M。x¹⁹可以是L。x¹⁹可以是I。x²⁰可以是Q。x²⁰可以是N。x²¹可以是Q。x²¹可以是N。x²²可以是G。

在本发明的一些方面，本发明的AA靶向剂可以包括任何血管生成素2拮抗剂。

在本发明的一些方面，本发明的AA靶向剂可以包含肽，所述肽包括与一种或多种选自下组的序列基本同源的序列：SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ IDNO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ IDNO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ IDNO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ IDNO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ IDNO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：192和SEQ ID NO：193。

在一些方面，本发明提供选自下组的AA靶向剂：

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：29)

R¹-QNY QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：28)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEK D(AcK)T LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：30)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEK DET LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：33)

R¹-Q(AcK)Y Q(DHP)L DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：34)

R¹-Q(AcK)Y Q(HP)L DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：35)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT IYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：36)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEI DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：37)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT(HChA)YD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：38)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT(HF)YD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：39)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT(ThA)YD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：40)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT(Nva)YD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：41)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT(HL)YD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：42)

R¹-Q(AcK)Y QPL DE(AcK)DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：43)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT LFD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：44)

R¹-Q(AcK)Y Q(HP)L DE(ThA)DKT L(NO2F)D QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：45)

R¹-Q(AcK)Y Q(HP)L DE(ThA)DKT L(BPA)D QFM LQQ G-R²；(SEQID NO：46)

R¹-Q(AcK)Y Q(HP)L DE(ThA)DKT L(CO2H)FD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：47)

R¹-Q(AcK)Y QPL DE(AcK)DKT L(NO2F)D QFM LQQ G-R²；(SEQID NO：48)

R¹-Q(AcK)Y QPL DE(AcK)DKT LFD QFM LQQ G-R²(SEQ ID NO：63)

DCB-Q(AcK)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：49)

DFB-Q(AcK)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：50)

PyC-Q(AcK)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：51)

酰胺2-PEG-Q(AcK)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：52)

R¹-Q(ClBn氨基甲酸酯K)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：53)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL D(Dab)T LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：54)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL D(Dap)T LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：55)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT L(NO2F)D QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：91)

R¹-QNY QPL DEL DKT L(BPA)D QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：56)

R¹-QNY QPL DEL DKT L(CF)D QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：57)

R¹-Q(Nick)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：61)

R¹-Q(AcK)Y QPL DE(AcK)DKT L(CF)D QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：62)和

R¹-Q(AcK)Y QPL DE(AcK)DKT LFD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：63)

其中

R¹是CH₃、C(O)CH₃、C(O)CH₃、C(O)CH₂CH₃、C(O)CH₂CH₂CH₃、C(O)CH(CH₃)CH₃、C(O)CH₂CH₂CH₂CH₃、C(O)CH(CH₃)CH₂CH₃、C(O)C₆H₅、C(O)CH₂CH₂(CH₂CH₂O)_1-5Me、二氯苯甲酰(DCB)、二氟苯甲酰(DFB)、吡啶甲酸酯(PyC)或酰胺基-2-PEG、氨基保护基、类脂脂肪酸基团或糖类；和

R²是OH、NH₂、NH(CH₃)、NHCH₂CH₃、NHCH₂CH₂CH₃、NHCH(CH₃)CH₃、NHCH₂CH₂CH₂CH₃、NHCH(CH₃)CH₂CH₃、NHC₆H₅、NHCH₂CH₂OCH₃、NHOCH₃、NHOCH₂CH₃、羧基保护基、类脂脂肪酸基团或糖类。

在一些方面，本发明提供具有式I的AA靶向剂-连接子共轭物及其可药用盐、立体异构体、互变异构体、溶剂化物和前体药物：

L-[AA靶向剂](I)

其中：

[AA靶向剂]是选自下组的肽：

R¹-QKY QPL DEL DKTLYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：21)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：22)

R¹-QNY QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：23)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEK D(AcK)T LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：30)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEK DET LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：33)

R¹-Q(AcK)Y Q(DHP)L DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：34)

R¹-Q(AcK)Y Q(HP)L DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：35)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT IYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：36)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEI DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：37)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT(HChA)YD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：38)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT(HF)YD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：39)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT(ThA)YD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：40)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT(Nva)YD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：41)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT(HL)YD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：42)

R¹-Q(AcK)Y QPL DE(AcK)DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：43)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT LFD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：44)

R¹-Q(AcK)Y Q(HP)L DE(ThA)DKT L(NO2F)D QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：45)

R¹-Q(AcK)Y Q(HP)L DE(ThA)DKT L(BPA)D QFM LQQ G-R²；(SEQID NO：46)

R¹-Q(AcK)Y Q(HP)L DE(ThA)DKT L(CO2H)FD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：47)

R¹-Q(AcK)Y QPL DE(AcK)DKT L(NO2F)D QFM LQQ G-R²；(SEQID NO：48)

R¹-Q(AcK)Y QPL DE(AcK)DKT LFD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：68)

DCB-Q(AcK)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：49)

DFB-Q(AcK)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：50)

PyC-Q(AcK)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：51)

酰胺2-PEG-Q(AcK)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：52)

R¹-Q(ClBn氨基甲酸酯K)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：53)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL D(Dab)T LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：54)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL D(Dap)T LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：55)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT L(NO2F)D QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：91)

R¹-QNY QPL DEL DKT L(BPA)D QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：56)

R¹-QNY QPL DEL DKT L(CF)D QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：57)

R¹-QNY QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：58)

R¹-Q(Nick)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：61)

R¹-Q(AcK)Y QPL DE(AcK)DKT L(CF)D QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：62)和

R¹-Q(AcK)Y QPL DE(AcK)DKT LFD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：63)

其中

R¹是指靶向剂的氨基端残基的氨基部分，并且是NH₂、NHC(O)CH₃、NHC(O)CH₂CH₃、NHC(O)CH₂CH₂CH₃、NHC(O)CH(CH₃)CH₃、NHC(O)CH₂CH₂CH₂CH₃、NHC(O)CH(CH₃)CH₂CH₃、NHC(O)C₆H₅、NH(CH₃)C(O)CH₂CH₂(CH₂CH₂O)_1-5Me、氨基保护基、类脂脂肪酸基团或糖类；

R²是指靶向剂的羧基端残基的羧基端部分，并且是COOH、C(O)NH₂、C(O)NH(CH₃)、C(O)NHCH₂CH₃、C(O)NHCH₂CH₂CH₃、C(O)NHCH(CH₃)CH₃、C(O)NHCH₂CH₂CH₂CH₃、C(O)NHCH(CH₃)CH₂CH₃、C(O)NHC₆H₅、C(O)NHCH₂CH₂OCH₃，C(O)NHOCH₃、C(O)NHOCH₂CH₃、羧基保护基、类脂脂肪酸基团或糖类；且

L是具有式-X-Y-Z的连接子部分，其中：

X是任选存在的，并且为生物相容性聚合物、嵌段共聚物、C、H、N、O、P、S、卤素(F、Cl、Br、I)或其盐、烷基、烯基、炔基、氧代烷基、氧代烯基、氧代炔基、氨基烷基、氨基烯基、氨基炔基、磺基烷基、磺基烯基、磺基炔基、磷酸烷基(phosphoalkyl)、磷酸烯基或磷酸炔基，其附着至构成AA靶向剂的残基之一上；

Y是任选存在的识别基团，其至少包含环结构；和

Z是反应基团，其能够与抗体结合部位中的侧链共价键合。

在描述本发明的上述方面时，R¹的起始NH基团由所述肽的N-端氨基-酸残基提供；因此NHC(O)CH₃表示与肽的N-端共价结合的C(O)CH₃基团，并且在整个说明书和权利要求书的其它地方可被写作C(O)CH₃等。因此，R¹可以写为：

R¹是CH₃、C(O)CH₃、C(O)CH₃、C(O)CH₂CH₃、C(O)CH₂CH₂CH₃、C(O)CH(CH₃)CH₃、C(O)CH₂CH₂CH₂CH₃、C(O)CH(CH₃)CH₂CH₃、C(O)C₆H₅、C(O)CH₂CH₂(CH₂CH₂O)_1-5Me、二氯苯甲酰(DCB)、二氟苯甲酰(DFB)、吡啶甲酸酯(PyC)或酰胺-2-PEG、氨基保护基、类脂脂肪酸基团或糖类；且

类似地，在描述本发明的上述方面时，R²的起始C(O)基团由所述肽的C-端氨基-酸残基提供；因此C(O)NH₂表示与肽的C-端共价结合的NH₂基团，并且在其它地方可被写作NH₂等。因此，R²可以写为：R²是OH、NH₂、NH(CH₃)、NHCH₂CH₃、NHCH₂CH₂CH₃、NHCH(CH₃)CH₃、NHCH₂CH₂CH₂CH₃、NHCH(CH₃)CH₂CH₃、NHC₆H₅、NHCH₂CH₂OCH₃、NHOCH₃、NHOCH₂CH₃、羧基保护基、类脂脂肪酸基团或糖类。

在所列举的肽序列中，不标准的氨基酸残基被附在括号内。在一些情况中，肽的氨基末端被附着至下述封端基团之一：二氯苯甲酰(DCB)、二氟苯甲酰(DFB)、吡啶甲酸酯(PyC)或酰胺-2-PEG。

在其它方面，本发明提供根据下述的化合物：

具有选自下组的分子式的化合物：

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DK(L)T LYD QFM LQQ G-R²(SEQ IDNO：132)；

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DK(L)T L(NO2F)D QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：133)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEK(L)DK(Ac)T LYD QFM LQQ G-R²(SEQ IDNO：134)；和

R¹-Q(AcK)Y QPL DEK(Ac)DK(L)T LYD QFM LQQ G-R²(SEQ IDNO：135)；

其中

R²是OH、NH₂、NH(CH₃)、NHCH₂CH₃、NHCH₂CH₂CH₃、NHCH(CH₃)CH₃、NHCH₂CH₂CH₂CH₃、NHCH(CH₃)CH₂CH₃、NHC₆H₅、NHCH₂CH₂OCH₃、NHOCH₃、NHOCH₂CH₃、羧基保护基、类脂脂肪酸基团或糖类，且

K(L)是附着至连接子L的赖氨酸残基，其中L能够与抗体结合部位中的氨基酸侧链形成共价键。

在一些实施方式中，K(L)是

其中L是具有式-X-Y-Z-的连接子部分，其中：

X是：

其中选择v和w，以使X的主链长度是6-12个原子：

Y是包含至少一个环结构的识别基团；和

Z是能够与醛缩酶抗体结合部位中的氨基酸侧链形成共价键的反应基团。

在一些实施方式中Y具有任选取代的结构：

其中a、b、c、d和e独立地为碳或氮；f是碳、氮、氧或硫；Y在具有足够化合价的任何两个环位置独立地附着至X和Z；并且a、b、c、d、e或f中的不超过四个同时为氮。

在一些实施方式中，Z选自取代的1，3-二酮或酰基β-内酰胺。

在一些实施方式中Z具有下面的结构：

其中q＝0、1、2、3、4或5。在其它实施方式中，q＝1、2或3。

在式I的一些实施方式中，X是：

-R²²-P-R²³-或-R²²-P-R²¹-P’-R²³-

其中：

P和P’独立地选自：聚氧化烯氧化物(polyoxyalkylene oxide)，诸如，聚环氧乙烷、聚乙基噁唑啉、聚-N-乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯和聚丙烯酰胺；在聚合物骨架或者聚合物侧链上具有胺基团的聚胺，诸如，多赖氨酸、多鸟氨酸、多精氨酸和多组氨酸；非肽聚胺，诸如，聚氨基苯乙烯、聚氨基丙烯酸酯、聚(N-甲氨基丙烯酸酯)、聚(N-乙氨基丙烯酸酯)、聚(N，N-二甲氨基丙烯酸酯)、聚(N，N-二乙氨基丙烯酸酯)、聚(氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N-甲氨基-甲基丙烯酸酯)、聚(N-乙氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N，N-二甲氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N，N-二乙氨基甲基丙烯酸酯)、聚(乙烯亚胺)；季铵的聚合物，诸如，聚(N，N，N-三甲基氨基丙烯酸酯氯化物(poly(N，N，N-trimethylaminoacrylatechloride))、聚(甲基丙烯酰胺基丙基三甲基氯化铵)；蛋白聚糖，诸如，硫酸软骨素-A(4-硫酸酯)、硫酸软骨素-C(6-硫酸酯)和硫酸软骨素-B；多肽，诸如聚丝氨酸、聚苏氨酸、多谷氨酰胺；天然或合成多糖，诸如，壳聚糖、羟乙基纤维素和类脂；

R²¹、R²²和R²³每个独立地为共价键、-O-、-S-、-NR^b-、酰胺、取代或未取代的直链或支链C_1-50亚烷基、或者取代或未取代的直链或支链C_1-50杂亚烷基；

R^b是氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基；和

R²¹、R²²和R²³被选择，以便X的主链长度保持约200个原子或较少。

在式I的一些实施方式中，X附着至[AA靶向剂]中的氨基酸残基，并且是任选取代的-R²²-[CH₂-CH₂-O]_t-R²³-、-R²²-环烷基-R²³-、-R²²-芳基-R²³-或-R²²-杂环基-R²³-，其中t是0至50。

在式I的一些实施方式中，R²²是-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-C(O)-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-C(O)-O-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-C(S)-NR^b-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-C(O)-NR^b-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-NR^b-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-O-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-S(O)_0-2-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-S(O)_0-2-NR^b-(CH₂)_v-或-(CH₂)_u-P(O)(OR^b)-O-(CH₂)_v-。其中u和v独立地是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。

在式I的一些实施方式中，R²¹和R²³独立地是-(CH₂)_s-、-(CH₂)_r-C(O)-(CH₂)_s-、-(CH₂)_r-C(O)-O-(CH₂)_v-、-(CH₂)_r-C(S)-NR^b-(CH₂)_s-、-(CH₂)_r-C(O)-NR^b-(CH₂)_s-、-(CH₂)_r-NR^b-(CH₂)_s-、-(CH₂)_r-O-(CH₂)_s-、-(CH₂)_r-S(O)_0-2-(CH₂)_s-、-(CH₂)_r-S(O)_0-2-NR^b-(CH₂)_s-或-(CH₂)_r-P(O)(OR^b)-O-(CH₂)_s-，其中r、s和v独立地是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。

在式I的一些实施方式中，如果t＞1或如果X是-R²²-[CH₂-CH₂-O]_t-R²³-、-R²²-环烷基-R²³、-R²²-芳基-R²³-或-R²²-杂环基-R²³-，则Y是存在的。

根据式I的示例性化合物(其中R¹是NHC(O)CH₃或DFB，R²是C(O)NH₂，且连接子部分的X部分是“O”PEG)，包括：

如式II说明的本发明另一方面是AA靶向化合物，其包含经由中间连接子L′与抗体的结合部位共价键合的AA靶向剂。AA靶向化合物的抗体部分可以包括完整(全长)抗体、独特的抗体片段、或任何其它抗体形式，如该术语在本文使用的情况。在一个实施方式中，抗体是人化(humanized)形式的鼠醛缩酶抗体，其包含来自人IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体的恒定区。在另一实施方式中，抗体是嵌合抗体，其包含来自鼠醛缩酶抗体的可变区和来自人IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体的恒定区。在进一步实施方式中，抗体是完全人化形式(fullyhuman version)的鼠醛缩酶抗体，其包含来自天然或自然人IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体的多肽序列。

抗体-L′-[AA靶向剂] (II)；

及其可药用的盐、立体异构体、互变异构体、溶剂合物和前体药物；

其中：

[AA靶向剂]是选自下组的肽：

R¹-QKY QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：21)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：22)

R¹-QNY QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：23)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEK D(AcK)T LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：30)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEK DET LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：33)

R¹-Q(AcK)Y Q(DHP)L DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：34)

R¹-Q(AcK)Y Q(HP)L DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：35)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT IYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：36)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEI DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：37)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT(HChA)YD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：38)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT(HF)YD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：39)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT(ThA)YD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：40)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT(Nva)YD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：41)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT(HL)YD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：42)

R¹-Q(AcK)Y QPL DE(AcK)DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：43)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT LFD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：44)

R¹-Q(AcK)Y Q(HP)L DE(ThA)DKT L(NO2F)D QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：45)

R¹-Q(AcK)Y Q(HP)L DE(ThA)DKT L(BPA)D QFM LQQ G-R²；(SEQID NO：46)

R¹-Q(AcK)Y Q(HP)L DE(ThA)DKT L(CO2H)FD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：47)

R¹-Q(AcK)Y QPL DE(AcK)DKT L(NO2F)D QFM LQQ G-R²；(SEQID NO：48)

R¹-Q(AcK)Y QPL DE(AcK)DKT LFD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：68)

DCB-Q(AcK)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：49)

DFB-Q(AcK)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：50)

PyC-Q(AcK)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：51)

酰胺2-PEG-Q(AcK)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：52)

R¹-Q(ClBn氨基甲酸酯K)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：53)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL D(Dab)T LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：54)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL D(Dap)T LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：55)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT L(NO2F)D QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：91)

R¹-QNY QPL DEL DKT L(BPA)D QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：56)

R¹-QNY QPL DEL DKT L(CF)D QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：57)

R¹-QNY QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：58)

R¹-Q(Nick)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：61)

R¹-Q(AcK)Y QPL DE(AcK)DKT L(CF)D QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：62)和

R¹-Q(AcK)Y QPL DE(AcK)DKT LFD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：63)，其中

R₁是CH₃、C(O)CH₃、C(O)CH₃、C(O)CH₂CH₃、C(O)CH₂CH₂CH₃、C(O)CH(CH₃)CH₃、C(O)CH₂CH₂CH₂CH₃、C(O)CH(CH₃)CH₂CH₃、C(O)C₆H₅、C(O)CH₂CH₂(CH₂CH₂O)_1-5Me、二氯苯甲酰(DCB)、二氟苯甲酰(DFB)、吡啶甲酸酯(PyC)或酰胺-2-PEG、氨基保护基、类脂脂肪酸基团或糖类；且

L’是具有式X-Y-Z’的连接子部分，其中：

X是附着至构成AA靶向剂的残基之一的生物相容性聚合物或嵌段共聚物；

Y是任选存在的识别基团，其至少包含环结构；和

Z是与抗体结合部位中的侧链共价键合的基团。

在式II化合物的一些实施方式中，X是：

-R²²-P-R²³-或-R²²-P-R²¹-P’-R²³-

其中：

P和P’独立地选自：聚氧化烯氧化物(polyoxyalkylene oxide)，诸如，聚环氧乙烷、聚乙基噁唑啉、聚-N-乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯和聚丙烯酰胺；在聚合物骨架或者聚合物侧链上具有胺基团的聚胺，诸如，多赖氨酸、多鸟氨酸、多精氨酸和多组氨酸；非肽聚胺，诸如，聚氨基苯乙烯、聚氨基丙烯酸酯、聚(N-甲氨基丙烯酸酯)、聚(N-乙氨基丙烯酸酯)、聚(N，N-二甲氨基丙烯酸酯)、聚(N，N-二乙氨基丙烯酸酯)、聚(氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N-甲氨基-甲基丙烯酸酯)、聚(N-乙氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N，N-二甲氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N，N-二乙氨基甲基丙烯酸酯)、聚(乙烯亚胺)；季铵的聚合物，诸如，聚(N，N，N-三甲基氨基丙烯酸酯氯化物(poly(N，N，N-trimethylaminoacrylatechloride))、聚(甲基丙烯酰胺基丙基三甲基氯化铵)；蛋白聚糖，诸如，硫酸软骨素-A(4-硫酸酯)、硫酸软骨素-C(6-硫酸酯)和硫酸软骨素-B；多肽，诸如多丝氨酸、多苏氨酸、多谷氨酰胺；天然或合成多糖，诸如，壳聚糖、羟乙基纤维素和类脂；

R²¹、R²²和R²³每个独立地为共价键、-O-、-S-、-NR^b-、取代或未取代的直链或支链C_1-50亚烷基、或者取代或未取代的直链或支链C_1-50杂亚烷基；

R²¹、R²²和R²³被选择，以便X的主链长度保持约200个原子或以下。

在式II化合物的一些实施方式中，X附着至[AA靶向剂]中的氨基酸残基，并且是任选取代的-R²²-[CH₂-CH₂-O]_t-R²³-、-R²²-环烷基-R²³-、-R²²-芳基-R²³-或-R²²-杂环基-R²³-，其中t是0至50。

在式II化合物的一些实施方式中，R²²是-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-C(O)-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-C(O)-O-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-C(S)-NR^b-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-C(O)-NR^b-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-NR^b-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-O-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-S(O)_0-2-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-S(O)_0-2-NR^b-(CH₂)_v-或-(CH₂)_u-P(O)(OR^b)-O-(CH₂)_v-，其中u和v独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。

在式II化合物的一些实施方式中，R²¹和R²³独立地是-(CH₂)_s-、-(CH₂)_r-C(O)-(CH₂)_s-、-(CH₂)_r-C(O)-O-(CH₂)_v-、-(CH₂)_r-C(S)-NR^b-(CH₂)_s-、-(CH₂)_r-C(O)-NR^b-(CH₂)_s-、-(CH₂)_r-NR^b-(CH₂)_s-、-(CH₂)_r-O-(CH₂)_s-、-(CH₂)_r-S(O)_0-2-(CH₂)_s-、-(CH₂)_r-S(O)_0-2-NR^b-(CH₂)_s-或-(CH₂)_r-P(O)(OR^b)-O-(CH₂)_s-，其中r、s和v独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。

本发明的一些方面提供选自下组的化合物：

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DK(L’)T LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：136)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DK(L’)T L(NO2F)D QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：137)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEK(L’)DK(Ac)T LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：138)和

R¹-Q(AcK)Y QPL DE(AcK)DK(L’)T LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：139)

其中

K(L’)是附着至连接子L’的赖氨酸残基，其中L与抗体结合部位中的氨基酸侧链共价结合。

在一些实施方式中，K(L’)是

L’是具有式X-Y-Z’的连接子部分，其中：

X是：

其中v和w被选择，以便X的主链长度是6-12个原子；

Y是至少包含环结构的识别基团；和

Z’是连接部分，其包含与抗体结合部位中氨基酸侧链的共价连接。

在一些实施方式中，Y具有下述任选取代的结构：

其中a、b、c、d和e独立地为碳或氮；f是碳、氮、氧或硫；Y在足够化合价的任何两个环位置独立地附着至X和Z’；并且a、b、c、d、e或f中不超过四个同时为氮。

在一些实施方式中，Z’具有下述结构：

其中q＝0、1、2、3、4或5，-N-抗体是指与具有氨基的抗体结合部位中的氨基酸侧链的共价键。在其它方面，q＝1、2或3。

以式III说明的本发明的另一方面是这样的靶向化合物，其中两个可以相同或不同的AA靶向化合物每一个都与抗体的结合部位共价键合。AA靶向化合物的抗体部分可以包括完整(全长)抗体、独特的抗体片段或任何其它的抗体形式，如该术语在本文所使用的情况。在一个实施方式中，抗体是人化形式的鼠醛缩酶抗体，其包含来自人IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体的恒定区。在另一实施方式中，抗体是嵌合抗体，其包含来自鼠醛缩酶抗体的可变区和来自人IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体的恒定区。在进一步的实施方式中，抗体是完全人化形式(fully human version)的鼠醛缩酶抗体，其包含来自天然或自然人IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体的多肽序列。

抗体[-L’-[AA靶向剂]]₂ (III)

其中：

[AA靶向剂]、抗体和L’如根据式II所定义。

本发明还提供了递送或施用本发明的AA靶向化合物的方法及利用本发明的AA靶向化合物进行治疗的方法。例如，治疗(包括预防)对象中与异常血管生成有关的疾病或病症的方法，包括向对象施用治疗有效量的本发明AA靶向化合物。可以被治疗的疾病和病症包括癌症、关节炎、高血压、肾脏疾病、银屑病、与眼病有关的眼部血管生成、感染或外科手术、黄斑变性、糖尿病性视网膜病等。

本发明的另一方面包括利用本发明的AA靶向化合物用于诊断目的的方法。例如，AA靶向化合物可以被用于与异常血管生成有关的疾病或病症的诊断，所述异常血管形成包括癌症、关节炎、银屑病、与眼病有关的眼部血管生成、感染或外科手术、黄斑变性、糖尿病性视网膜病等。

附图说明

图1图解了根据式II或式III的一个实施方式。

图2图解了根据式II或式III的一个实施方式。

图3图解了根据式II或式III的一个实施方式。

图4A和4b各自图解了根据式II或式III的一个实施方式。

图5A和5b各自图解了根据式II或式III的一个实施方式。

图6A和图6B图解了本发明的靶向剂-连接子共轭物的固相合成。

图7A图解了m38c2、h38c2和人种系的可变域的氨基酸序列比对。构架区(FR)和互补决定区(CDR)根据Kabat等定义。星号标记出m38c2与h38c2或h38c2与人种系之间的差异。图7B图解了人化38c2 IgG1的一个实施方式的轻链和重链氨基酸序列(分别为SEQ ID NOs：189和190)。

图8显示了可用作连接子反应基团的各种结构。结构A-C与抗体结合部位的表面可及的活性亲核基团(例如，赖氨酸或半胱氨酸侧链)形成可逆共价键。结构A-C中的R’₁、R’₂、R′₃和R₄表示取代基，其包括例如C、H、N、O、P、S、卤素(F、Cl、Br、I)或其盐。X是N、C或任何其它杂原子。这些取代基也可以包括基团，诸如烷基、烯基、炔基、氧代烷基、氧代烯基、氧代炔基、氨基烷基、氨基烯基、氨基炔基、磺基烷基、磺基烯基、或磺基炔基、磷酸烷基、磷酸烯基、或磷酸炔基。R’₂和R′₃可以是环状的，如在结构B和C中所示例，而X可以是杂原子。例如，如果X是N并且如果R’₁和R₃形成环状结构的一部分，结构A可以与活性亲核体形成不可逆共价键。结构D-G可以与抗体结合部位中的活性亲核基团形成不可逆共价键。在这些结构中，R”₁和R”₂表示C、O、N、卤化物或离去基团诸如甲磺酰基或甲苯磺酰基。

图9显示了适合用抗体结合部位中的活性氨基酸侧链进行活性修饰的各种亲核体并且其因此可用作连接子反应基团。注解：(A)酰基β-内酰胺；(B)简单的二酮；(C)琥珀酰亚胺活性酯；(D)马来酰亚胺；(E)具有连接子的卤代乙酰胺；(F)卤代酮；(G)环己基二酮；和(H)醛。波形线表示与连接子或靶向剂其余部分的附着点。X指卤素。

图10显示了抗体结合部位中的亲核(“nu”)侧链与图8中的化合物A-G的加成。抗体-Nu-是指与抗体结合部位中具有亲核体的氨基酸侧链的共价键。

图11显示了抗体结合部位中的亲核性侧链与图9中的化合物A-H的加成。抗体-Nu-是指与抗体结合部位中具有亲核体的氨基酸侧链的共价键。

图12显示下述物质的合成：

图13显示下述物质的合成：

图14显示下述物质的合成：

图15显示下述物质的合成：

图16显示下述物质的合成：

图17显示下述物质的合成：

图18显示下述物质的合成：

图19显示下述物质的合成：

图20显示下述物质的合成：

图21显示下述物质的合成：

图22显示下述物质的合成：

图23显示下述物质的合成：

图24显示下述物质的合成：

图25显示下述物质的合成：

图26显示下述物质的合成：

图27显示下述物质的合成：

图28显示下述物质的合成：

图29图解了本发明的一个实施方式。

图30图解了本发明的一个实施方式。

图31图解了本发明的一个实施方式。

图32图解了本发明的一个实施方式。

图33图解了本发明的一个实施方式。

图34图解了本发明的一个实施方式。

图35图解了本发明的一个实施方式。

图36图解了本发明的一个实施方式。

图37图解了本发明的一个实施方式。

图38图解了本发明的一个实施方式。

图39图解了本发明的一个实施方式。

图40图解了本发明的一个实施方式。

图41图解了本发明的一个实施方式。

具体实施方式

定义

下述缩写、术语和短语如下文所定义被用于本文。

表1：氨基酸缩写

靶向剂的每一个具有氨基的侧链都可以用如本文所述的R¹终止。靶向剂的每一个具有COOH/COO^-的侧链可以用如本文所述的R²终止。

脱氢脯氨酸或DHP是指：

羟基脯氨酸或HP是指：

高环己基丙氨酸(Homocyclohexyl alanine)或HChA是指：

高苯丙氨酸(Homophenyl alanine)或HF是指：

噻唑基丙氨酸或ThA是指：

正缬氨酸或Nva是指：

高亮氨酸或HL是指：

ε-酰基赖氨酸或AcK是指：

4-苯甲酰苯丙氨酸或BPA是指：

4-羧基苯丙氨酸或(CO2H)F或CF是指：

ε-氯苄基氨基甲酸酯赖氨酸或(ClBn氨基甲酸酯)K或CbcK是指：

二氨基丁酸或Dab是指：

二氨基丙酸或Dap是指：

4-硝基苯丙氨酸或NO2F或NF是指：

噻吩基丙氨酸或TA是指：

烟酰基赖氨酸(Nicotinyl Lysine)(NicK)是指：

酰胺2-PEG是指：

二氯苯甲酰或DCB是指：

二氟苯甲酰或DFB是指：

吡啶基甲酸酯或PyC是指：

“O”PEG或OP是指：

“4”PEG或4P是指：

显示为附着至赖氨酸残基。

除非另外指出，通过“D”前缀，例如D-Ala或N-Me-D-Ile，本说明书和所附权利要求书中所述的肽中的氨基酸和氨酰基残基的α-碳的立体化学是天然的或“L”构型。Cahn-Ingold-Prelog“R”和“S”命名被用于详细说明在肽的N-端处的一些酰基取代基中的手性中心的立体化学。命名“R，S”的意思是表示两种对映体形式的外消旋混合物。该术语遵循在R.S.Cahn等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，5：385-415(1966)中所述的命名法。

″多肽″、″肽″和″蛋白质″互换地用于指氨基酸残基的聚合物。如本文所用的，这些术语适用其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然出现的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物。这些术语也适用天然出现的氨基酸聚合物。氨基酸可以处于L或D形式，只要肽的结合功能被保持。肽可以是环状的，在该肽内的两个不相邻的氨基酸之间具有分子内键，例如主链与主链环化、侧链与主链环化以及侧链与侧链环化。环状肽可以通过本领域熟知的方法制备。例如参见美国专利6,013,625。

所有肽序列按照普遍接受的惯例进行书写，由此α-N-端氨基酸残基位于左侧，而α-C-端氨基酸残基位于右侧。如本文所用的，术语“N-端”是指肽中氨基酸的游离α-氨基，而术语“C-端”是指肽中氨基酸的游离α-羧酸末端。利用基团进行N-封端的肽是指在N-端氨基酸残基的α-氨基氮上具有基团的肽。利用基团进行N-封端的氨基酸是指在α-氨基氮上具有基团的氨基酸。

“基本同源的″意指在所定义的肽序列长度上至少约75％(优选至少约80％，更优选至少约90％，或最优选至少约95％的氨基酸残基匹配。基本同源的序列包括在其长度上共享至少65％氨基酸残基的序列，并且至少10％的非共享序列是保守置换。基本同源的序列可以通过使用序列数据银行中可用的标准软件进行序列比较而鉴定，诸如可于ncbi.nlm.nih.gov得自National Cancer Center for BiotechologyInformation的BLAST程序。

一般而言，“取代的”是指如下所定义的这样的基团：其中一个或多个连接其中所包含的氢原子的键被连接非氢或非碳原子的键代替，所述非氢或非碳原子诸如但不限于，卤素原子如F、Cl、Br和I；基团中的氧原子，诸如羟基、烷氧基、芳氧基和酯基团；基团中的硫原子，诸如硫醇基团、烷硫基和芳硫基基团、磺基(sulfone groups)、磺酰基和亚砜基团(sulfoxide groups)；基团中的氮原子，诸如胺、酰胺、烷基胺、二烷基胺、芳基胺、烷基芳基胺、二芳基胺、N-氧化物、酰亚胺和烯胺；基团中的硅原子，诸如三烷基甲硅烷基、二烷基芳基甲硅烷基、烷基二芳基甲硅烷基和三芳基甲硅烷基；以及在各种其它基团中的杂原子。取代的烷基以及还有取代的环烷基以及其它基团也包括其中一个或多个连接碳(一个或多个)或氢(一个或多个)原子的键被连接杂原子的键取代的基团，诸如羰基、羧基和酯基中的氧；基团诸如亚胺、肟、腙和腈中的氮。如本文所用的，“任选取代的”基团也可以是取代的或未取代的。因此，例如，“任选取代的烷基”是指取代的烷基和未取代的烷基两者。

短语“未取代的烷基”是指不包含杂原子的烷基。因此，该短语包括直链烷基，诸如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、辛基、庚基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基等等。该短语也包括直链烷基的支链异构体，其包括但不限于通过例子提供的下列基团：-CH(CH₃)₂、-CH(CH₃)(CH₂CH₃)、-CH(CH₂CH₃)₂、-C(CH₃)₃、-C(CH₂CH₃)₃、-CH₂CH(CH₃)₂、-CH₂CH(CH₃)(CH₂CH₃)、-CH₂CH(CH₂CH₃)₂、-CH₂C(CH₃)₃、-CH₂C(CH₂CH₃)₃、-CH(CH₃)CH(CH₃)(CH₂CH₃)、-CH₂CH₂CH(CH₃)₂、-CH₂CH₂CH(CH₃)(CH₂CH₃)、-CH₂CH₂CH(CH₂CH₃)₂、-CH₂CH₂C(CH₃)₃、-CH₂CH₂C(CH₂CH₃)₃、-CH(CH₃)CH₂CH(CH₃)₂、-CH(CH₃)CH(CH₃)CH(CH₃)₂、-CH(CH₂CH₃)CH(CH₃)CH(CH₃)(CH₂CH₃)以及其它。该短语不包括环烷基。因此，短语未取代的烷基包括伯烷基、仲烷基和叔烷基。未取代的烷基可以与母体化合物中的一个或多个碳原子、氧原子(一个或多个)、氮原子(一个或多个)和/或硫原子(一个或多个)结合。可能的未取代的烷基包括具有1到20个碳原子的直链与支链烷基。可选地，这样的未取代的烷基具有1到10个碳原子或者是具有1到约6个碳原子的低碳烷基。其它未取代的烷基包括具有1到3个碳原子的直链与支链烷基并且包括甲基、乙基、丙基和-CH(CH₃)₂。

短语“取代的烷基”指这样的烷基基团：其中一个或多个连接碳(一个或多个)或氢(一个或多个)的键被连接非氢或非碳原子的键代替，所述非氢或非碳原子诸如但不限于，卤素原子如F、Cl、Br和I；基团中的氧原子，诸如羟基、烷氧基、芳氧基和酯基团；基团中的硫原子，诸如硫醇基团、烷硫基和芳硫基基团、磺基、磺酰基和亚砜基团；基团中的氮原子，诸如胺、酰胺、烷基胺、二烷基胺、芳基胺、烷基芳基胺、二芳基胺、N-氧化物、酰亚胺和烯胺；基团中的硅原子，诸如三烷基甲硅烷基、二烷基芳基甲硅烷基、烷基二芳基甲硅烷基和三芳基甲硅烷基；以及在各种其它基团中的杂原子。取代的烷基也包括其中一个或多个连接碳(一个或多个)或氢(一个或多个)原子的键被连接杂原子的键取代的基团，所述杂原子诸如羰基、羧基和酯基中的氧；诸如亚胺、肟、腙和腈的基团中的氮。取代的烷基包括其中一个或多个连接碳或氢原子的键被一个或多个连接氟原子的键取代的烷基基团以及其它。取代烷基的一个例子是三氟甲基和含有三氟甲基的其它烷基。其它烷基包括这样的基团：其中一个或多个连接碳或氢原子的键被连接氧原子的键取代，以使取代的烷基基团含有羟基、烷氧基、芳氧基或杂环氧基基团。还有其它的烷基基团包括具有胺、烷基胺、二烷基胺、芳基胺、(烷基)(芳基)胺、二芳基胺、杂环基胺(heterocyclylamine)、(烷基)(杂环基)胺、(芳基)(杂环基)胺或二杂环基胺基团的烷基基团。

短语“未取代的亚烷基”是指如上所定义的二价的未取代烷基。因此，亚甲基、亚乙基和亚丙基每一个都是未取代亚烷基的例子。短语“取代的亚烷基”是指如上所定义的二价的取代烷基。取代或未取代的低碳亚烷基基团具有1至约6个碳。

短语“未取代的环烷基”是指环状烷基，诸如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基，以及用如上所定义的直链和支链烷基取代的这类环。该短语也包括多环烷基，诸如但不限于金刚烷基、降冰片基(norbornyl)和二环[2.2.2]辛基等，以及用如上所定义的直链和支链烷基取代的这类环。因此，该短语包括甲基环己基等。该短语不包括含有杂原子的环烷基基团。未取代的环烷基可以结合至母体化合物中的一个或多个碳原子、氧原子、氮原子和/或硫原子。在一些实施方式中，未取代的环烷基具有3到20个碳原子。在其它实施方式中，这样的未取代烷基具有3到8个碳原子，而在其它实施方式中，这样的基团具有3到7个碳原子。

短语“取代的环烷基”相对于未取代的环烷基与取代的烷基相对于未取代的烷基具有相同的含义。因此，该短语包括但不限于氧代环己基、氯代环己基、羟基环戊基和氯甲基环己基。

短语“未取代的芳基”是指不含杂原子的芳基基团。因此，该短语包括但不限于作为例子的苯基、联苯基、蒽基和萘次甲基。尽管短语“未取代的芳基”包括含有稠环诸如萘的基团，但是其不包括具有与环成员结合的其它基团诸如烷基或卤基团的芳基，因此芳基诸如甲苯基在本文被认为是如在下文所述的取代的芳基基团。通常，未取代的芳基可以是具有6至约10个碳原子的低碳芳基。一个未取代的芳基是苯基。然而，未取代芳基可以与母体化合物中的一个或多个碳原子、碳原子、氧原子(一个或多个)、氮原子(一个或多个)和/或硫原子(一个或多个)结合。

短语“取代的芳基”相对于未取代的芳基与取代的烷基相对于未取代的烷基具有相同的含义。然而，取代的芳基也包括其中芳香碳之一与上述非碳或非氢原子结合的芳基基团，以及也包括其中芳基的一个或多个芳香碳与本文所述的取代和/或未取代烷基、烯基或炔基结合的芳基基团。这包括这样的结合排列：其中芳基的两个碳原子与烷基、烯基或炔基的两个原子结合以定义稠环体系(例如，二氢萘基或四氢萘基)。因此，短语“取代的芳基”包括但不限于甲苯基和羟基苯基以及其它基团。

短语“未取代的烯基”是指直链和支链以及环状基团，诸如关于如上所定义的未取代烷基所述的那些基团，只是在两个碳原子之间存在至少一个双键。例子包括但不限于乙烯基、-CH＝C(H)(CH₃)、-CH＝C(CH₃)₂、-C(CH₃)＝C(H)₂、-C(CH₃)＝C(H)(CH₃)、-C(CH₂CH₃)＝CH₂、环己烯基、环戊烯基、环己二烯基、丁二烯基和己二烯基以及其它基团。未取代的低碳烯基具有1至约6个碳。

短语“取代的烯基”相对于未取代的烯基与取代的烷基相对于未取代的烷基具有相同的含义。取代的烯基包括其中非碳或非氢原子结合于与另一碳双键结合的碳的烯基，并且包括这样的烯基：其中非碳或非氢原子之一与不参与连接另一碳的双键的碳结合。例如，-CH＝CH-OCH₃和-CH＝CH-CH₂-OH都是取代的烯基。其中CH₂基团被羰基取代的氧代烯基诸如-CH＝CH-C(O)-CH₃也是取代烯基。

短语“未取代的亚烯基”是指二价的如上所定义的未取代烯基。例如，-CH＝CH-是示例性的未取代亚烯基。短语“取代的亚烯基”是指二价的如上所定义的取代烯基。

短语“未取代的炔基”是指直链和支链基团，诸如关于如上所定义的未取代烷基所述的那些基团，只是至少一个三键存在于两个碳原子之间。例子包括但不限于-C≡C(H)、-C≡C(CH₃)、-C≡C(CH₂CH₃)、-C(H₂)C≡C(H)、-C(H)₂C≡C(CH₃)和-C(H)₂C≡C(CH₂CH₃)及其它基团。未取代的低碳炔基具有1至约6个碳。

短语“取代的炔基”相对于未取代的炔基与取代的烷基相对于未取代的烷基具有相同的含义。取代的炔基包括这样的炔基：其中非碳或非氢原子结合于与另一碳三键结合的碳，并且包括其中非碳或非氢原子结合于不参与连接另一碳的三键的碳那些炔基。例子包括但不限于氧代炔基，其中CH₂基团由羰基取代，诸如-C(O)-CH≡CH-CH₃和-C(O)-CH₂-CH≡CH。

短语“未取代的亚炔基”是指如上所定义的二价未取代炔基。-C≡C-是未取代亚炔基的例子。短语“取代的亚炔基”是指如上所定义的二价取代炔基。

短语“未取代的芳烷基”是指其中未取代烷基的氢或碳键被如上所定义的连接芳基的键取代的如上所定义的未取代烷基。例如，甲基(-CH₃)是未取代的烷基。如果甲基的氢原子被连接苯基键取代，例如如果甲基的碳与苯的碳结合，则该化合物是未取代的芳烷基(即苄基)。因此，该短语包括但不限于基团诸如苄基、联苯甲基和1-苯乙基(-CH(C₆H₅)(CH₃))。

短语“取代的芳烷基”相对于未取代的芳烷基与取代的芳基相对于未取代的芳基具有相同的含义。然而，取代的芳烷基也包括其中该基团的烷基部分的碳或氢键被连接非碳或非氢原子的键取代的基团。取代的芳烷基的例子包括但不限于-CH₂C(＝O)(C₆H₅)和-CH₂(2-甲基苯基)。

短语“未取代的芳烯基”是指如上所定义的未取代烯基，其中该未取代烯基的氢或碳键用如上定义的连接芳基的键取代。例如，乙烯基是未取代的烯基基团。如果该烯基基团的氢原子被连接苯基的键取代，诸如如果烯基的碳与苯的碳结合，则该化合物是未取代的芳烯基基团(即苯乙烯基团)。因此，该短语包括但不限于基团诸如苯乙烯、联苯乙烯基和1-苯基乙烯基(-C(C₆H₅)(CH₂))。

短语“取代的芳烯基”相对于未取代的芳烯基与取代的芳基相对于未取代的芳基具有相同的含义。取代的芳烯基也包括其中该基团的烯基部分的碳或氢键被连接非碳或非氢原子的键取代的基团。取代的芳烯基的例子包括但不限于-CH＝C(Cl)(C₆H₅)和-CH＝CH(2-甲基苯基)。

短语“未取代的芳炔基”是指如上所定义的未取代炔基，其中该未取代炔基的氢或碳键用如上所定义的连接芳基的键取代。例如，乙炔是未取代的炔基。如果该乙炔基团的氢原子被连接苯基的键取代，诸如如果该乙炔的碳与苯的碳结合，则该化合物是未取代的芳炔基基团。因此，该短语包括但不限于基团诸如-C≡C-苯基和-CH₂-C≡C-苯基。

短语“取代的芳炔基”相对于未取代的芳炔基与取代的芳基相对于未取代的芳基具有相同的含义。然而，取代的芳炔基也包括其中该基团的炔基部分的碳或氢键被连接非碳或非氢原子的键取代的基团。取代的芳炔基的例子包括但不限于-C≡C-C(Br)(C₆H₅)和-C≡C(2-甲基苯基)。

短语“未取代的杂烷基”是指如上所定义的未取代的烷基，在该烷基中碳链被一个或多个选自N、O和S的杂原子中断。含有N的未取代的杂烷基在碳链中可以具有NH或N(未取代烷基)。例如，未取代的杂烷基包括烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、硫醚、烷基氨基烷基、氨基烷氧基和其它此类基团。通常，未取代的杂烷基含有1-5杂原子，以及特别含有1-3个杂原子。在一些实施方式中，未取代的杂烷基包括例如烷氧基烷氧基烷氧基基团诸如乙氧基乙氧基乙氧基。

短语“取代的杂烷基”相对于未取代的杂烷基与取代的烷基相对于未取代的烷基具有相同的含义。

短语“未取代的杂亚烷基”是指如上所定义的二价的未取代杂烷基。例如，-CH₂-O-CH₂-和-CH₂-NH-CH₂CH₂-都是示例性未取代杂亚烷基。短语“取代的杂亚烷基”是指如上所定义的二价的取代杂烷基基团。

短语“未取代的杂烯基”是指如上所定义的未取代烯烃基团，在该基团中碳链被一个或多个选自N、O和S的杂原子中断。含有N的未取代的杂烯基在碳链中可以具有NH或N(未取代的烷基或烯烃)。短语“取代的杂烯基”相对于未取代的杂烯基与取代的杂烷基相对于未取代的杂烷基具有相同的含义。

短语“未取代的杂亚烯基”是指如上所定义的二价的未取代杂烯基。因此，-CH₂-O-CH＝CH-是未取代杂亚烯基的例子。短语“取代的杂亚烯基”是指如上所定义的二价的取代杂烯基。

短语“未取代的杂炔基”是指如上所定义的未取代炔基基团，在该基团中碳链被一个或多个选自N、O和S的杂原子中断。含有N的未取代的杂炔基在碳链中可以具有NH或N(未取代的烷基、烯烃或炔烃)。短语“取代的杂炔基”相对于未取代的杂炔基与取代的杂烷基相对于未取代的杂烷基具有相同的含义。

短语“未取代的杂亚炔基”是指如上所定义的二价的未取代杂炔基基团。因此，-CH₂-O-CH₂-C≡C-是未取代的杂亚炔基的例子。短语“取代的杂亚炔基”是指如上所定义的二价的取代杂炔基基团。

短语“未取代的杂环基”是指芳环和非芳环化合物，其包括单环、双环和多环化合物，诸如但不限于奎宁环基(quinuclidyl)，其含有3个或多个环成员，其中的一个或多个是诸如但不限于N、O和S的杂原子。尽管短语“未取代的杂环基”包括稠环，诸如苯并咪唑基，但是其不包括具有与环成员之一结合的其它基团如烷基或卤素基团的杂环基基团，因为诸如2-甲基苯并咪唑基的化合物是取代的杂环基基团。杂环基的例子包括但不限于：含有1至4个氮原子的不饱和3至8元环，诸如但不限于吡咯基、吡咯啉基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、二氢吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三唑基(例如4H-1，2，4-三唑基、1H-1，2，3三唑基、2H-1，2，3三唑基等)、四唑基(例如，1H-四唑基、2H四唑基等)；含有1至4个氮原子的饱和3至8元环，诸如但不限于吡咯烷基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基；含有1至4个氮原子的稠合不饱和杂环基团，诸如但不限于吲哚基、异氮茚基、二氢吲哚基、中氮茚基、苯并咪唑基、喹啉基、异喹啉基、吲唑基、苯并三唑基；含有1至2个氧原子和1至3个氮原子的不饱和3至8元环，诸如但不限于噁唑基、异噁唑基、噁二唑基(例如，1，2，4-噁二唑基、1，3，4-噁二唑基、1，2，5-噁二唑基等)；含有1至2个氧原子和1至3个氮原子的饱和3至8元环，诸如但不限于吗啉基；含有1至2个氧原子和1至3个氮原子的不饱和稠合杂环基团，例如苯并噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噁嗪基(例如，2H-1，4-苯并噁嗪基)；含有1至3个硫原子和1至3个氮原子的不饱和3至8元环，诸如但不限于噻唑基、异噻唑基、噻二唑基(例如，1，2，3-噻二唑基、1，2，4-噻二唑基、1，3，4-噻二唑基、1，2，5-噻二唑基等)；含有1至2个硫原子和1至3个氮原子的饱和3至8元环，诸如但不限于噻唑烷基(thiazolodinyl)；含有1至2个硫原子的饱和3至8元环，诸如但不限于噻吩基、二氢二噻烯基(dihydrodithiinyl)、二氢二硫酮基(dihydrodithionyl)、四氢噻吩基、四氢噻喃基；含有1至2个硫原子和1至3个氮原子的不饱和稠合杂环，诸如但不限于苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并噻嗪基(例如，2H-1，4-苯并噻嗪基等)、二氢苯并噻嗪基(例如，2H-3，4-二氢苯并噻嗪基等)；含有氧原子的不饱和3至8元环诸如但不限于呋喃基；含有1至2个氧原子的不饱和稠合杂环，诸如苯并间二氧杂环戊烯基(例如，1，3-苯并间二氧杂环戊烯基等)；含有氧原子和1至2个硫原子的不饱和3至8元杂环，诸如但不限于二氢氧杂噻烯基(dihydrooxathiinyl)；含有1至3个氧原子和1至2个硫原子的饱和3至8元杂环，诸如1，4-氧硫杂环己烷；含有1至2个硫原子的不饱和稠环，诸如苯并噻吩基、苯并间二氧杂环戊烯基；以及含有氧原子和1至3个氧原子的不饱和稠合杂环，诸如苯并氧杂噻烯基(benzoxathiinyl)。杂环基团也包括上述环中的一个或多个S原子与一个或两个氧原子双键结合(亚砜和砜)的那些基团。例如，杂环基团包括四氢噻吩基、氧化四氢噻吩基和1，1-二氧化-四氢噻吩基。在一些实施方式中，杂环基团含有5或6个环成员。在其它实施方式中，杂环基团包括吗啉基、哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基、咪唑基、吡唑基、1，2，3-三唑基、1，2，4-三唑基、四唑基、硫代吗啉基、其中硫代吗啉的S原子与一个或多个O原子结合的硫代吗啉基、吡咯基、高哌嗪基、噁唑烷-2-酮基、吡咯烷-2-酮基、噁唑基、奎宁环基、噻唑基、异噁唑基、呋喃和四氢呋喃基。

短语“取代的杂环基”是指如上所定义的未取代的杂环基团，其中环成员之一与非氢原子结合，诸如如上关于取代烷基和取代芳基所述般。例子包括但不限于2-甲基苯并咪唑基、5-甲基苯并咪唑基、5-氯苯并咪唑基、1-甲基哌嗪基和2-氯吡啶基。

短语“未取代的杂芳基”是指如上所定义的未取代的芳香杂环基团。因此，未取代的杂芳基包括但不限于呋喃基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、吡啶基、苯并咪唑基和苯并噻唑基。短语“取代的杂芳基”是指如上所定义的取代的芳香杂环基团。

短语“未取代的杂环烷基”是指如上所定义的未取代的烷基基团，其中所述未取代的烷基基团的氢或碳键用连接如上所定义的杂环基团的键来取代。例如，甲基(-CH₃)是未取代的烷基。如果该烷基的氢原子被连接杂环基团的键取代，诸如如果甲基的碳与吡啶的2位碳(与吡啶的N相键合的碳之一)或吡啶的3位碳或4位碳结合，则该化合物是未取代的杂环烷基基团。

短语“取代的杂环烷基”相对于未取代的杂环烷基与取代的芳烷基相对于未取代的芳烷基具有相同的含义。取代的杂环烷基也包括其中非氢原子与该杂环烷基的杂环基团中的杂原子结合的那些基团，所述杂原子诸如但不限于哌啶基烷基的哌啶环中的氮原子。

短语“未取代的杂环烯基”是指如上所定义的未取代的烯基基团，其中该未取代的烯基基团的氢或碳键用连接如上所定义的杂环基团的键来取代。例如，乙烯基是未取代的烯基。如果该乙烯基的氢原子被连接杂环基团的键取代，诸如如果该乙烯基的碳与吡啶的2位碳或吡啶的3位碳或4位碳结合，则该化合物是未取代的杂环烯基基团。

短语“取代的杂环烯基”相对于未取代的杂环烯基与取代的芳烯基相对于未取代的芳烯基具有相同的含义。然而，取代的杂环烯基也包括其中非氢原子与该杂环烯基的杂环基团中的杂原子结合的那些基团，所述杂原子诸如但不限于哌啶基烯基的哌啶环中的氮原子。

短语“未取代的杂环炔基”是指如上所定义的未取代的炔基基团，其中该未取代的炔基基团的氢或碳键用连接如上所定义的杂环基团的键取代。例如，乙炔是未取代的炔基。如果乙炔的氢原子被连接杂环基团的键取代，诸如如果该乙炔的碳与吡啶的2位碳或吡啶的3位碳或4位碳结合，则该化合物是未取代的杂环炔基基团。

短语“取代的杂环炔基”相对于未取代的杂环炔基与取代的芳炔基相对于未取代的芳炔基具有相同的含义。取代的杂环炔基也包括这样的基团，其中非氢原子与该杂环炔基的杂环基团中的杂原子结合，所述杂原子诸如但不限于哌啶基炔基的哌啶环中的氮原子。

短语“未取代的烷氧基”是指这样的羟基：在该羟基中连接氢原子的键被连接如上所定义的其它未取代的烷基的碳原子的键取代。

短语“取代的烷氧基”是指这样的羟基(-OH)，其中连接氢原子的键被连接如上所定义的其它取代烷基的碳原子的键取代。

可药用的盐包括与无机碱、有机碱、无机酸、有机酸或者与碱性或酸性氨基酸的盐。无机碱的盐包括例如下述物质的盐：即，碱金属如钠或钾；碱土金属如钙和镁；或者铝；以及氨。有机碱的盐包括例如下述物质的盐：即，三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺。无机酸的盐包括例如下述物质的盐：即，盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸和磷酸。有机酸的盐包括例如下述物质的盐：即，甲酸、乙酸、三氟乙酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸。碱性氨基酸的盐包括例如精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸。酸性氨基酸包括例如天冬氨酸和谷氨酸。

″互变异构体″是指彼此相平衡的化合物的异构形式。异构形式的浓度取决于该化合物被发现的环境并且可能是不同的，这取决于例如该化合物是否是固体还是在有机或者水溶液中。例如在水溶液中，酮一般地与它们的烯醇形式相平衡。因此，酮与它们的烯醇被称为彼此的互变异构体。如本领域技术人员容易理解的，各种官能团及其它结构可以显示出互变异构现象，并且式I、II和III化合物的所有互变异构体都在本发明的范围之内。

按照本发明的化合物可以是溶剂化的，尤其是水合的。水合可以化合物或者包括该化合物的组合物的制造期间发生，或者水合可由于化合物的吸水性以而随时间发生。

一些实施方式是被称为前体药物的衍生物。表达“前体药物”表示药学上或治疗上活性的药物的衍生物，例如酯和酰胺，其中该衍生物与所述药物相比具有增强的特性，例如，诸如增强的递送和治疗价值，并且所述衍生物通过酶或化学过程可以被转化为所述药物。参见例如R.E.Notari，Methods Enzymol.112：309-323(1985)；N.Bodor，Drugs of the Future 6：165-182(1981)；H.Bundgaard，Chapter 1 in Designof Prodrugs(H.Bundgaard，ed.)，Elsevier，New York(1985)；和A.G.Gilman et al.，Goodman And Gilman′s The Pharmacological Basis ofTherapeutics，8^th ed.，McGraw-Hill(1990)。因此，前体药物可以被设计为改变药物的代谢稳定性或者传递特性、掩盖药物的副作用或毒性、改善药物的味道或者改变药物的其它特征或性质。

本发明的化合物包括在任何或所有不对称原子上的富集或拆分的旋光异构体，这根据描述是显而易见的。外消旋和非对映混合物以及单独的旋光异构体可以被分离或合成，以便基本上没有它们的对映或非对映成分。所有这样的立体异构体在本发明的范围内。

术语″羧基保护基″如本文所用是指保护羧酸的酯基团，其用于防护或保护羧酸官能团，同时允许涉及化合物其它官能部位的反应可以进行。羧基保护基被公开在例如Greene，Protective Groups in OrganicSynthesis，pp.152-186，John Wiley & Sons，New York(1981)中，该文献因此通过参考并入本文。另外，羧基保护基可以被用作前体药物，藉此羧基保护基可以被容易地通过例如酶解作用进行体内断裂，以释放生物活性母体。T.Higuchi和V.Stella在″Pro-drugs as Novel DeliverySystems”，Vol.14，the A.C.S.Symposium Series，American ChemicalSociety(1975)中提供了关于前体药物概念的讨论，该文献因此通过参考并入本文。这类羧基保护基是本领域技术人员所熟知的，其已经广泛用在盘尼西林和头孢菌素领域的羧基保护中，如在美国专利3,840,556和3,719,667；S.Kukolja，J.Am.Chem.Soc.93：6267-6269(1971)；和G.E.Gutowski，Tetrahedron Lett.21：1779-1782(1970)中所述，所述文献的公开内容因此通常参考并入本文。可用作含羧基化合物的前体药物的酯的例子可见于例如Bioreversible Carriers in Drug Design：Theory and Application(E.B.Roche，ed.)，Pergamon Press，New York(1987)，pp.14-21，其因此通过参考并入本文。代表性的羧基保护基是C₁至C₈烷基(例如甲基、乙基或叔丁基等)；卤代烷基；烯基；环烷基及其取代衍生物，诸如环己基、环戊基等；环烷基烷基及其取代衍生物，诸如环己基甲基、环戊基甲基等；芳基烷基，例如苯乙基，或苄基及其取代衍生物，诸如烷氧基苄基或硝基苄基等；芳基烯基，例如苯基乙烯基等；芳基及其取代衍生物，例如5-2，3-二氢化茚基等；二烷基氨基烷基(例如，二甲氨基乙基等)；烷酰氧基烷基，诸如乙酰氧基甲基、丁酰氧基甲基、戊酰氧基甲基(valerytoxymethyl)、异丁酰氧基甲基、异戊酰氧基、1-(丙酰氧基)-1-乙基、(1-新戊酰氧基)-1-乙基、1-甲基-1-(丙酰氧基)-1-乙基、新戊酰氧基甲基、丙酰氧基甲基等；环烷酰氧基烷基，诸如环丙基羰氧基甲基、环丁基羰氧基甲基、环戊基羰氧基甲基、环己基羰氧基甲基等；芳酰氧基烷基，诸如苯甲酰氧基甲基、苯甲酰氧基乙基等；芳基烷基羰氧基烷基，诸如苄基羰氧基甲基、2-苄基羰氧基乙基等；烷氧羰基烷基，诸如甲氧羰基甲基、环己氧羰基甲基、1-甲氧羰基-1-乙基等；烷氧羰基氧基烷基，诸如甲氧羰基氧基甲基、叔丁氧羰基氧基甲基、1-乙氧羰基氧基-1-乙基、1-环己氧羰基氧基-1-乙基等；烷氧羰基氨基烷基，诸如叔丁氧羰基氨基甲基等；烷基氨基羰基氨基烷基，诸如甲氨基羰基氨基甲基等；烷酰基氨基烷基，诸如乙酰基氨基甲基等；杂环基羰氧基烷基，诸如4-甲基哌嗪基羰氧基甲基等；二烷基氨基羰基烷基，诸如二甲氨基羰基甲基、二乙氨基羰基甲基等；(5-(烷基)-2-氧代-1，3-二氧杂环戊烯-4-基)烷基，诸如(5-叔丁基-2-氧代-1，3-二氧杂环戊烯-4-基)甲基等；和(5-苯基-2-氧代-1，3-二氧杂环戊烯-4-基)烷基，诸如(5-苯基-2-氧代-1，3-二氧杂环戊烯-4-基)甲基等。

术语″N-保护基″或″N-保护的″如本文所用是指那些意图保护氨基酸或肽的N-端或者意图在合成步骤期间保护氨基酸不进行不需要的反应的基团。常用的N-保护基公开在例如Greene，Protective Groupsin Organic Synthesis，John Wiley & Sons，New York(1981)中，该文献因此通过参考并入。例如N-保护基可以包括：酰基，诸如甲酰基、乙酰基、丙酰基、新戊酰、叔丁基乙酰、2-氯乙酰、2-溴乙酰、三氟乙酰、三氯乙酰、邻苯二酰、邻硝基苯氧基乙酰、a-氯丁酰苯甲酰、4-氯苯甲酰、4-溴苯甲酰、4-苯甲酰等；磺酰基，诸如苯磺酰基、对甲苯磺酰基等；形成氨基甲酸酯的基团，诸如苄氧羰基、对氯苄氧羰基、对甲氧基苄氧羰基、对氯苄氧羰基、对甲氧基苄氧羰基、对硝基苄氧羰基、2-硝基苄氧羰基、对溴苄氧羰基、3，4-二甲氧基苄氧羰基、3，5-二甲氧基苄氧羰基，2，4-二甲氧基苄氧羰基、4-甲氧基苄氧羰基、2-硝基-4，5-二甲氧基苄氧羰基、3，4，5-三甲氧基苄氧羰基、1-(对联苯基)-1-甲基乙氧羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧基苄氧羰基、二苯甲氧羰基、叔丁氧羰基、二异丙氧基甲氧羰基、异丙氧羰基、乙氧羰基、甲氧羰基、烯丙氧羰基、2，2，2，-三氯乙氧羰基、苯氧羰基、4-硝基苯氧羰基、芴基-9-甲氧羰基、环戊氧羰基、金刚烷氧羰基、环己氧羰基、苯硫羰基等；烷基，诸如苄基、三苯甲基、苄氧甲基等；甲硅烷基，诸如三甲基甲硅烷基等。在一些实施方式中，N-保护基是甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、新戊酰、叔丁基乙酰、苯基磺酰、苄基、9-芴基甲氧羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)和苄氧羰基(Cbz)。

如本文所用，“卤”、″卤素″或″卤化物″是指F、Cl、Br或I。

如本文所用，任何保护基、氨基酸或其它化合物的缩写，除非另外指明，按照其常见用法、公认的缩写或者IUPAC-IUB Commission onBiochemical Nomenclature，Biochem.11：942-944(1972)。

如本文所用，″基本纯的″意指足够均质而显示不存在根据标准分析方法测定而容易检测的杂质，所述标准分析方法诸如本领域技术人员评估该类纯度的薄层层析(TLC)、凝胶电泳和高效液相色谱法(HPLC)，或者足够纯，以致进一步的纯化将不会可检测地改变物质的物理及化学性质，诸如酶及生物活性。基本纯包括这样的组合物，其中AA靶向剂或AA靶向化合物形成该组合物的主要组分，诸如构成组合物中物质的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或者约95％或以上。纯化化合物以产生基本化学纯的化合物的方法是本领域技术人员已知的。基本化学纯的化合物然而可以是立体异构体的混合物。在这些情况中，进一步的纯化可以增加化合物的比活性。然而，AA靶向剂无需总是以特定的纯化状态提供。部分纯化的成分在一些实施方式中具有实用性并且这取决于期望的用途。例如，可以产生较大的AA-靶向剂总收率的纯化方法可能产生较低的相对纯化程度。

如本文所用，″生物活性″是指化合物、组合物或其它混合物的体内活性，或者是指体内施用化合物、组合物或其它混合物之后产生的生理反应。生物活性因此包括此类化合物、组合物及混合物的治疗效果、诊断效果和药物活性。术语″生物活性的″或″功能的″当用作含有多肽的本发明AA靶向剂或其组合物的修饰剂时是指表现出至少一种为AA靶向剂的特征或类似于AA靶向剂的活性的多肽。

如本文所用，″药物动力学″是指随时间的过去所施用的化合物在血清中的浓度。药效学是指随时间的过去所施用的化合物在靶及非靶组织中的浓度以及在靶组织(例如，功效)和非靶组织(例如，毒性)上的效果。药物动力学或药效学上的改进例如可以针对特定的靶向剂或生物制剂进行设计，诸如通过使用不稳定的键或通过改变任何连接子的化学性质(例如，改变溶解度、电荷等)。

如本文所用，短语“有效量”和“治疗有效的量”是指AA靶向剂或包含AA靶向剂的化合物的量，该量用于或能够支持AA靶向剂的一种或多种生物活性特征水平上可观察的变化，或者是指足以赋予有益效果的剂量，所述有益效果例如在其接受者上的症状改善。对于任何特定对象而言，具体的治疗有效的剂量水平将取决于多种因素，包括被治疗的症状或疾病、所述症状或疾病的严重度、具体化合物的活性、给药途径、化合物的清除速率、治疗的持续期间、与该化合物联合应用或同时应用的药物、对象的年龄、体重、性别、饮食和一般健康状态等，以及医学领域及科学熟知的其它因素。治疗有效的剂量可以是足以在被治疗的组织中产生可测量的血管生成抑制的AA靶向化合物的量，即血管生成抑制量。血管生成的抑制可以通过免疫组织化学，或者通过本领域技术人员抑制的其它方法原位测量。在测定“治疗有效量”时考虑的各种通常的考虑因素是本领域技术人员已知的，并且在例如Gilman，A.G.，et al.，Goodman And Gilman′s The PharmacologicalBasis of Therapeutics，8^th ed.，McGraw-Hill(1990)；and Remington′sPharmaceutical Sciences，17^th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1990)中予以描述。

一方面，本发明提供各种靶向化合物，其中AA靶向剂与抗体的结合部位共价结合。

另一方面，本发明包括改变AA靶向剂的至少一种物理或生物特征的方法。该方法包括直接地或者通过连接子共价连接AA靶向剂与抗体的结合部位。可以被改变的AA靶向剂的特征包括但不限于结合亲和性、对降解的易感性(例如，通过蛋白酶)、药物动力学、药效学、免疫原性、溶解性、亲油性、亲水性、疏水性、稳定性(或者更稳定或者较不稳定，以及计划的降解)、硬度、柔性、抗体结合的调节等。同样，特定AA靶向剂的生物学效力可以通过加入由抗体提供的效应子功能(一种或多种)来增加。例如，抗体提供效应子功能诸如互补调节的效应子功能。不希望束缚于任何理论，AA靶向化合物的抗体部分通常可以延长较小大小的AA靶向剂在体内的半衰期。因此，在一方面，本发明提供用于增加AA靶向剂的有效循环半衰期的方法。

在另一方面，本发明提供通过共价连接AA靶向剂与抗体结合部位来调节抗体结合活性的方法。尽管不希望束缚于任何理论，大量减少的抗体与抗原结合可能是由于键合的AA靶向剂立体阻碍了抗原接触抗体结合部位。可选地，如果由共价键修饰的抗体结合部位的氨基酸侧链对于与抗原的结合是重要的，则大量减少的抗原结合可能发生。通过比较，当键合的AA靶向剂没有立体阻碍抗原与抗体结合部位时和/或当由共价键修饰的抗体结合部位的氨基酸侧链对于与抗原的结合不重要时，可产生大量增加的抗体与抗原的结合。

在另一发明，本发明包括修饰抗体结合部位以产生针对Ang-2的结合特异性的的方法。此类方法包括共价连接抗体结合部位中的活性氨基酸侧链与如本文所述的AA靶向剂-连接子化合物的连接子上的化学部分，其中AA靶向剂基于Ang-2结合肽。连接子的化学部分距离AA靶向剂足够远以便当AA靶向剂-连接子化合物与抗体结合部分共价键合时AA靶向剂可以与其同源物(cognate)结合。通常，抗体不被认为是针对靶分子特异的。在一些实施方式中，在共价连接之前抗体对Ang-2的亲和性在约1×10^-5摩尔/升以下。然而，在抗体共价键合至AA靶向剂-连接子化合物之后，该修饰的抗体优选对靶分子具有至少约1×10^-6摩尔/升的亲和性，可选地，至少约1×10^-7摩尔/升，可选地，至少1×10^-8摩尔/升，可选地，至少1×10^-9摩尔/升，或者可选地，至少约1×10^-10摩尔/升。

AA靶向剂

AA靶向剂是选自下组的肽：

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：29)

R¹-QNY QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：28)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEK D(AcK)T LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：30)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEK DET LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：33)

R¹-Q(AcK)Y Q(DHP)L DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：34)

R¹-Q(AcK)Y Q(HP)L DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：35)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT IYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：36)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEI DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：37)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT(HChA)YD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：38)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT(HF)YD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：39)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT(ThA)YD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：40)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT(Nva)YD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：41)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT(HL)YD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：42)

R¹-Q(AcK)Y QPL DE(AcK)DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：43)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT LFD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：44)

R¹-Q(AcK)Y Q(HP)L DE(ThA)DKT L(NO2F)D QFM LQQ G-R²；(SEQID NO：45)

R¹-Q(AcK)Y Q(HP)L DE(ThA)DKT L(BPA)D QFM LQQ G-R²；(SEQID NO：46)

R¹-Q(AcK)Y Q(HP)L DE(ThA)DKT L(CO2H)FD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：47)

R¹-Q(AcK)Y QPL DE(AcK)DKT L(NO2F)D QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：48)

R¹-Q(AcK)Y QPL DE(AcK)DKT LFD QFM LQQ G-R²(SEQ ID NO：63)

DCB-Q(AcK)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：49)

DFB-Q(AcK)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：50)

PyC-Q(AcK)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：51)

酰胺2-PEG-Q(AcK)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：52)

R¹-Q(ClBn氨基甲酸酯K)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQID NO：53)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL D(Dab)T LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：54)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL D(Dap)T LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：55)

R¹-Q(AcK)Y QPL DEL DKT L(NO2F)D QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：91)

R¹-QNY QPL DEL DKT L(BPA)D QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：56)

R¹-QNY QPL DEL DKT L(CF)D QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：57)

R¹-Q(Nick)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：61)

R¹-Q(AcK)Y QPL DE(AcK)DKT L(CF)D QFM LQQ G-R²；(SEQ IDNO：62)和

R¹-Q(AcK)Y QPL DE(AcK)DKT LFD QFM LQQ G-R²；(SEQ ID NO：63)

其中

AA靶向化合物可以利用本领域熟知的技术制备。通常，肽基AA靶向剂的合成是第一步并且如本文所述进行。靶向剂然后被衍生以便与连接成分(连接子)键合，其然后与抗体结合。本领域技术人员容易理解，所使用的具体合成步骤取决于三种成分的确切性质。因此，本文所述的AA靶向剂-连接子共轭物和AA靶向化合物可以被容易地合成。

AA靶向剂肽可以通过本领域技术人员已知的多种技术来合成。对于固相肽合成，示例性技术的概述可见于Chemical Approaches to theSynthesis of Peptides and Proteins(Williams et al.，eds.)，CRC Press，Boca Raton，FL(1997)。

通常，期望的肽AA靶向剂按照本领域熟知的步骤在固相上连续合成。参见例如美国专利申请号2003/0045477)。连接子可以部分或完全的在固相上附着至所述肽，或者可以在肽从树脂上移走之后利用溶液相技术来添加(参见图6A和6B)。例如，含有N-保护的氨基和羧酸的连接部分可以被附着至树脂诸如4-羟甲基-苯氧甲基-聚(苯乙烯-1％二乙烯基苯)。N-保护基可以通过合适的酸(例如，对于Boc用TFA)或碱(例如，对于Fmoc用哌啶)来去除，并且肽序列以正常的C-端至N-端方式发展(参见图6A)。可选地，肽序列可以首先合成，并且连接子被最后添加至N-末端氨基酸残基(参见图6B)。又一方法必须在合成期间脱保护合适的侧链并用适当的反应性连接子衍生。例如，赖氨酸侧链可以被脱保护并与具有活性酯的连接子反应。可选地，带有已经附着至侧链(参见图6B)或者在一些情况下附着至α-氨基氮的适当保护的连接子部分的氨基酸衍生物可以作为增长的肽序列而被添加。

在固相合成结束时，靶向剂-连接子共轭物从树脂移走并脱保护，或者连续操作或者在一个操作中进行。靶向剂-连接子共轭物的移走和脱保护可以通过用断裂试剂处理树脂结合的肽-连接子共轭物在一个操作中完成，所述断裂试剂例如含三氟乙酸的清除剂，诸如苯甲硫醚(thianisole)、水或乙二硫醇。在靶向剂脱保护和释放之后，可以进行靶向剂肽的进一步衍生。

完全脱保护的靶向剂-连接子共轭物通过一系列色谱步骤进行纯化，所述色谱步骤采用下述类型任一种或全部：以乙酸酯形式在弱碱性树脂上的离子交换；在未衍生的聚苯乙烯-二乙烯基苯上的疏水吸附色谱法(例如AMBERLITE XAD)；硅胶吸附色谱法；在羧甲基纤维素上的离子交换色谱法；分配色谱法，例如在SEPHADEX G-25、LH-20上，或者反流分布法；高效液相色谱(HPLC)，特别是在辛基-或十八基甲硅烷基-二氧化硅结合相柱填料上的反相HPLC。

完全脱保护的靶向剂-连接子偶联物通过一系列色谱步骤进行纯化，所述色谱步骤采用下述类型任一种或全部：以乙酸酯形式在弱碱性树脂上的离子交换；在未衍生的聚苯乙烯-二乙烯基苯上的疏水吸附色谱法(例如AMBERLITE XAD)；硅胶吸附色谱法；在羧甲基纤维素上的离子交换色谱法；分配色谱法，例如在SEPHADEX G-25、LH-20上，或者反流分布法；高效液相色谱(HPLC)，特别是在辛基-或十八基甲硅烷基-二氧化硅结合相柱填料上的反相HPLC。

抗体

“抗体”如本文所用包括含有重链和/或轻链的多肽分子，其具有免疫反应活性。抗体包括为B细胞及其变体产物的免疫球蛋白以及为T细胞及其变体产物的T细胞受体(TcR)。免疫球蛋白是包含一种或多种多肽的蛋白质，所述多肽基本由免疫球蛋白κ和λ、α、γ、δ、ε和mu恒定区基因以及无数免疫球蛋白可变区基因编码。轻链被分为κ或λ。重链被分为γ、mu、α、δ或ε，其进而分别定义免疫球蛋白类型，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。重链的亚类也是已知的。例如，人中的IgG重链可以是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类中任一种。

典型的免疫球蛋白结构单元已知包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每一对具有一个″轻″链(大约25kD)和一个″重″链(大约50-70kD)。每个链的N-端定义了主要负责抗原识别的大约100至110或更多氨基酸的可变区。术语可变轻链(V_L)和可变重链(V_H)分别是指这些轻链和重链。抗体的氨基酸可以是天然或非天然出现的。

含有两个结合部位的抗体是二价的，原因在于它们具有两个互补或抗原识别部位。通常的天然二价抗体是IgG。尽管脊椎动物抗体通常包含两个重链和两个轻链，仅重链抗体是已知的。参见Muyldermans等，TRENDS in Biochem.Sci.26(4)：230-235(1991)。此类抗体是二价的并且通过重链成对而形成。抗体也可以是多价的，如IgA二聚形式以及五聚IgM分子的情况。抗体也包括杂交抗体，其中抗体链与参考的哺乳动物抗体链分别一致。一对重链和轻链具有特定于一个抗原的结合部位，而另一对重链和轻链具有特定于不同抗原的结合部位。此类抗体被称为双特异性的，因为它们能同时结合两个不同的抗原。抗体也可以是单价的，例如诸如Fab或Fab’片段的情况。

抗体以全长完整抗体存在，或者以很多通过用不同的肽酶或化学品消化而产生的充分表征的片段存在。因此，例如，胃液素消化在铰链区中二硫键下面的抗体，以产生F(ab’)₂，Fab的二聚体，其自身是通过二硫键连接至V_H-CH₁的轻链。F(ab’)₂可以在温和条件下被还原，以断裂铰链区中的二硫键，从而将F(ab’)₂二聚体转化成Fab′单体。Fab′单体主要是具有部分铰链区的Fab片段(关于其它抗体片段的更详细的描述，参见例如Fundamental Immunology(W.E.Paul，ed.)，RavenPress，N.Y.(1993))。作为另一例子，用木瓜蛋白酶部分消化可以产生单价Fab/c片段。参见M.J.Glennie等，Nature 295：712-714(1982)。尽管各种抗体片段按照完整抗体的消化进行定义，本领域技术人员将理解，多种抗体片段中的任一种可以重新化学合成或者通过重组DNA技术来合成。因此，术语抗体如本文所用也包括通过全抗体修饰产生的抗体片段、重新合成的抗体片段、或者从重组DNA技术获得的抗体片段。本领域技术人员理解，存在着这样的情况：其中使用抗体片段而不是全抗体是有利的。例如，较小的抗体片段的尺寸允许快速的清除并且可以导致到达实体瘤的机会改进。

重组抗体可以是常规的全长抗体、杂交抗体、重链抗体、已知来自蛋白水解的抗体片段、抗体片段诸如Fv或单链Fv(scFv)、单域片段诸如V_H或V_L、双抗体、结构域缺失的抗体、微型抗体(minibodies)等。Fv抗体大小为大约50kD并且包含轻链和重链的可变区。轻链和重链可以在细菌中表达，其中它们被装配到Fv片段中。可选地，两个链可以被工程而形成链间二硫键以产生dsFv。单链Fv(″scFv″)是单个多肽，其包含通过插入的接头序列而连接的V_H和V_L序列结构域，使得当多肽折叠时所产生的三级结构模拟抗原结合部位的结构。参见J.S.Huston等，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.85：5879-5883(1988)。本领域技术人员将理解，取决于具体的表达方法和/或所期望的抗体分子，可以进行适当的重组抗体处理，以获得期望的重构或重装配抗体。例如参见Vallejo and Rinas，Biomed Central.，在万维网URLmicrobialcellfactories.com/content/3/1/11可得。

单域抗体是最小的抗体功能结合部位(大小大约13kD)，对应于重V_H或轻V_L链的可变区。参见美国专利6,696,245、WO04/058821、WO04/003019和WO03/002609。单域抗体被充分表达在细菌、酵母和其它低级真核生物表达系统中。相对于全长抗体，结构域缺失抗体使结构域诸如CH2被删除。在很多情况中，此类结构域缺失抗体，特别是CH2缺失抗体，相对于它们的全长抗体提供了改进的清除。双抗体通过缔合含有两个V_H结构域的第一融合蛋白与含有两个V_L结构域的第二融合蛋白而形成。双抗体，像全长抗体，是二价的并且可以是双特异性的(bi-specific)。微型抗体是包含连接至CH3的V_H、V_L或scFv的融合蛋白，该连接直接进行或者通过插入的IgG铰链进行。参见T.Olafsen等，Protein Eng.Des.Sel.17：315-323(2004)。微型抗体，像结构域缺失抗体，被工程以保留全长抗体的结合特异性，但是具有改进的清除，原因在于它们的分子量较小。

T细胞受体(TcR)由两个链构成的二硫键合的异源二聚体。所述两个链通常是二硫键合的，刚好在装配抗体铰链区的短伸展氨基酸段中的T细胞胞膜的外面。每个TcR链由一个抗体状可变域和一个恒定域组成。全TcR具有大约95kD的分子量，其中单个链的大小在35至47kD之间变化。也包括在TcR含义内的是受体的部分，例如诸如可变区，其可以利用本领域熟知的方法作为可溶蛋白而产生。例如美国专利6,080,840及A.E.Slanetz和A.L.Bothwell，Eur.J.Immunol.21：179-183(1991)描述了通过将TcR的胞外域粘接至Thy-1的糖基磷脂酰肌醇(GPI)膜锚着点序列而制备的可溶性T细胞受体。分子在缺乏CD3的情况下被表达在细胞表面上，并且通过用磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)处理可以从膜切割。可溶性TcR也可以通过偶联TcR可变域与抗体重链CH₂或CH₃结构域来制备，基本如在美国专利5,216,132和G.S.Basi等，J.Immunol.Methods 155：175-191(1992)中所述，或者作为可溶性TcR单链来制备，如通过E.V.Shusta等，Nat.Biotechnol.18：754-759(2000)或P.D.Houer等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97：5387-5392(2000)所述。本发明的一些实施方式使用TcR“抗体”作为可溶性抗体。TcR的结合部位可以通过参考CDR区和其它框架残基群利用上面针对抗体所述相同的方法来鉴定。

结合部位是指参与抗原结合的抗体分子的部分。抗原结合部位通过重(″H″)链和轻(″L″)链的N-端可变(″V″)区的氨基酸残基而形成。抗体可变区包含三个高度分歧的伸展(three highly divergent stretches)，其被称为″高可变区″或″互补决定区″(CDR)，其插入被称为″框架区″(FR)的更保守的侧面伸展(flanking stretches)之间。轻链的这三个高可变区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)和重链的三个高可变区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)相对于彼此被排列在三维空间中，以形成抗原结合表面或口袋(pocket)。在重链抗体或V_H结构域中，抗原结合部位通过重链的三个高可变区形成。在V_L结构域中，抗原结合部位通过轻链的三个高可变区形成。

在特定抗体中构成结合部位的氨基酸残基的身份可以利用本领域熟知的方法测定。例如，抗体CDRs可以被鉴定为最初由Kabat等定义的高可变区。参见E.A.Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，5^th ed.，Public Health Service，NIH，WashingtonD.C.(1992)。CDRs的位置也可以被鉴定为最初由Chothia及其他人描述的结构环结构。例如参见C.Chothia and A.M.Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；C.Chothia等，Nature 342：877-883(1989)；和A.Tramontano等，J.Mol.Biol.215：175-182(1990)。其它方法包括“AbM定义”，其是Kabat与Chothia之间的折衷，并且使用OxfordMolecular′s AbM抗体模拟软件(现在为Accelrys)获得，或者包括CDRs的“接触定义(contact definition)”，其在R.M.MacCallum等，J.Mol.Biol.262：732-745(1996)中阐述。表2基于各种已知的定义鉴定了CDRs：

表2：CDR定义

可以从单独的序列中鉴定抗体中的CDR的综合指南如下：

LCDR1：

起始-大约残基24。

之前的残基总是Cys。

之后的残基总是Trp，Tyr-Gln通常在其后，但也可以是Leu-Gln、Phe-Gln或Tyr-Leu。

长度是10至17个残基。

LCDR2：

起始-在L1结束之后16个残基。

之前的序列一般是Ile-Tyr，但也可以是Val-Tyr、Ile-Lys或Ile-Phe。

长度通常为7个残基。

LCDR3：

起始-L2结束之后33个残基。

之前的残基是Cys。

之后的序列是Phe-Gly-X-Gly。

长度是7至11个残基。

HCDR1：

起始-大约残基26，在Chothia/AbM定义下在Cys之后四个残基；在Kabat定义下，起始是后面的5个残基。

之前的序列是Cys-X-X-X。

之后的残基是Trp，其后通常是Val，但其后也可以是Ile或Ala。

在AbM定义下，长度是10至12个残基；Chothia定义不包括最后4个残基。

HCDR2：

起始-在CDR-H1的Kabat/AbM定义结束之后15个残基。

之前的序列通常是Leu-Glu-Trp-Ile-Gly，但很多变异是可能的。

之后的序列是Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala。

在Kabat定义下，长度是16至19个残基；AbM定义不包括最后7个残基。

HCDR3：

起始-在CDR-H2结束之后33个残基(在Cys之后两个残基)。

之前的序列是Cys-X-X(通常为Cys-Ala-Arg)。

之后的序列是Trp-Gly-X-Gly。

长度是3至25个残基。

特定抗体中位于CDR之外、但是通过具有作为结合部位的衬(lining)的一部分(即，其可用于通过结合部位的键)的侧链而构成结合部位一部分的氨基酸残基的身份，可以利用本领域熟知的方法来鉴定，诸如分子建模和X射线衍射晶体分析法。参见例如L.Riechmann等，Nature 332：323-327(1988)。

如所讨论的，可用于制备抗体基A靶向化合物的抗体需要在抗体结合部位中的活性侧链。活性侧链可以天然存在或者可以通过突变而被置于抗体中。抗体结合部位的活性残基可以与抗体缔合，诸如当该残基通过存在于首先被鉴定为制备抗体的淋巴样细胞中的核酸编码时。可选地，氨基酸残基可以通过有目的地突变DNA以便编码特定残基而产生(参见例如Meares等的WO 01/22922)。活性残基可以是非天然的残基，其通过例如利用单一密码子、tRNA以及氨酰-tRNA进行生物合成引入而产生，如本文所讨论的。在另一种方法中，氨基酸残基或其活性官能团(例如，亲核氨基基团或巯基基团)可以被附着至抗体结合部位中的氨基酸残基。因此，如本文所用，“经过抗体结合部位中的氨基酸残基”而发生的与抗体的共价键意指，键可以直接至抗体结合部位的氨基酸残基，或者通过被连接至抗体结合部位的氨基酸残基侧链的化学部分。

催化抗体是一种具有结合部位的抗体来源，所述结合部位包含一个或多个活性氨基酸侧链。此类抗体包括醛缩酶抗体、β-内酰胺酶抗体、酯酶抗体、酰胺酶抗体等。

一种实施方式包括醛缩酶抗体诸如小鼠单克隆抗体mAb 38C2或mAb 33F12，以及适当人化形式或嵌合形式的此类抗体。小鼠mAb38C2在HCDR3附近但在其外具有活性赖氨酸，并且是一类新型催化抗体的原型，所述催化抗体通过活性免疫以及机械模仿的天然醛缩酶产生。参见C.F.Barbas 3^rd等，Science 278：2085-2092(1997))。可以使用的其它醛缩酶催化抗体包括通过下述而产生的抗体：杂交瘤85A2，ATCC登记号为PTA-1015；杂交瘤85C7，ATCC登记号为PTA-1014；hybridoma 92F9，ATCC登记号为PTA-1017；杂交瘤93F3，ATCC登记号为PTA-823；杂交瘤84G3，ATCC登记号为PTA-824；杂交瘤84G11，ATCC登记号为PTA-1018；杂交瘤84H9，ATCC登记号为PTA-1019；杂交瘤85H6，ATCC登记号为PTA-825；杂交瘤90G8，ATCC登记号为PTA-1016。通过活性赖氨酸，这些抗体利用天然醛缩酶的烯胺机理来催化aldol和retro-aldol反应。参见例如J.Wagner等，Science 270：1797-1800(1995)；C.F.Barbas 3^rd等，Science 278：2085-2092(1997)；G.Zhong等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.38：3738-3741(1999)；A.Karlstrom等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，97：3878-3883(2000)。醛缩酶抗体以及产生醛缩酶抗体的方法公开在美国专利6,210,938、6,368,839、6,326,176、6,589,766、5,985,626和5,733,757中。

AA靶向化合物也可以通过连接AA靶向剂与活性半胱氨酸来形成，诸如在硫酯酶和酯酶催化抗体的结合部位中发现的那些半胱氨酸。合适的硫酯酶催化抗体由K.D.Janda等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：2532-2536(1994)描述。合适的酯酶抗体由P.Wirsching等，Science270：1775-1782(1995)描述。含有活性氨基酸的抗体可以通过本领域熟知的方法制备，包括突变抗体结合部位残基以编码活性氨基酸，或在抗体结合部位中衍生氨基酸侧链，所述抗体结合部位具有含有反应基团的连接子。

适于用于本文的抗体可以通过常规免疫法、体内活性免疫法(immunization)或者通过体外活性选择诸如利用噬菌体展示来获得。抗体也可以通过杂交瘤或细胞融合系统或者体外宿主细胞表达系统来获得。抗体可以在人或其它动物种类中产生。来自一个动物种类的可以被修饰以便反映另一种类的动物。例如，人嵌合抗体是那些其中抗体的至少一个区来自人免疫球蛋白的抗体。人嵌合抗体通常被理解为具有与非人动物例如啮齿类动物同源的可变区氨基酸序列，所述啮齿类动物带有具有与人免疫球蛋白同源的氨基酸序列的恒定区。相反，人化抗体使用来自非人抗体的CDR序列，其中大部分或全部可变框架区序列和所有的恒定区序列来自人免疫球蛋白。嵌合和人化抗体可以通过本领域熟知到达方法制备，包括CDR接枝法(参见例如N.Hardman等，Int.J.Cancer 44：424-433(1989)；C.Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：10029-10033(1989))、链改组策略(参见例如Rader等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：8910-8915(1998)、基因工程分子建模方法(参见例如M.A.Roguska等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：969-973(1994))等。

人化非人抗体的方法在本领域已经被描述。优选地，人化抗体具有一个或多个从非人的来源引入其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基经常被称为″输入″残基，其通常取自″输入″可变域。人化基本上可以按照Winter及其同事的方法通过用高可变区取代响应的人抗体序列进行(参见例如P.T.Jones等，Nature 321：522-525(1986)；L.Riechmann等，Nature 332：323-327(1988)；M.Verhoeyen等，Science239：1534-1536(1988))。因此，此类″人化″抗体是嵌合抗体，其中基本上不到一个完整的人可变域已被来自非人种的相应序列所置换。实际上，人化抗体通常是其中一些高可变区残基及可能的一些框架(FR)残基已经被来自啮齿类动物抗体中的类似部位的残基置换的人抗体。

在制备人化抗体中所使用的人可变域——包括轻的和重的——的选择是非常重要的，以便当该抗体意图用于人治疗用途时降低抗原性和人抗鼠抗体(HAMA)反应。按照所谓的″最佳拟合″方法，用于人化的人可变域基于与感兴趣的啮齿类动物可变区的较高程度的同源性而选自已知结构域的文库(M.J.Sims等，J.Immunol.，151：2296-2308(1993)；M.Chothia and A.M.Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。另一种方法使用得自轻链或重链的特定亚组的所有人抗体的共有序列的框架区。相同的框架可以用于几种不同的人化抗体(参见例如P.Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：4285-4289(1992)；L.G.Presta等，J.Immunol.，151：2623-2632(1993))。

进一步重要的是，抗体被人化，而保留对Z基团的高结合亲和性。为实现该目标，根据一种方法，人化抗体通过使用亲本和人化序列的三维模型来分析亲本序列和各种概念上人化产物进行制备。三维免疫球蛋白模型通常是可得的，并且是本领域技术人员所熟悉的。计算机程序是可得的，其说明并展示了已选的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。对这些展示的检查允许分析残基就与Z基团键合而言在候选免疫球蛋白序列的功能作用中的可能作用。以此方式，FR残基可以被选择，从受体结合并输入序列，以便获得期望的抗体特征，诸如对靶向抗原的亲和性增加。

各种形式的人化鼠醛缩酶抗体被考虑。一种实施方式使用人化醛缩酶催化抗体h38c2 IgG1或h38c2 Fab，其具有人恒定域C和C₁1。C.Rader等，J.Mol.Bio.332：889-899(2003)公开了可以用于产生h38c2Fab和h38c2 IgG1的基因序列和载体。人种系V_k基因DPK-9和人J_k基因JK4被用作m38c2的κ轻链可变域人化的框架，以及人种系基因DP-47和人J_H基因JH4被用作m38c2的重链可变域的人化的框架。图7A图解了m38c2、h38c2和人种系中的可变轻链与重链之间的序列对比。h38c2可以利用IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定域，包括其任一种异型。图7B图解了利用G1m(f)异型的h38c2 IgG1的一种实施方式，其中该h38c2 IgG1的轻链和重链氨基酸序列被列举在该图中。在式II或III的AA靶向化合物的一些实施方式——其中抗体是具有G1m(f)异型的h38c2 IgG1——中，Z与重链位置99处的赖氨酸残基的侧链结合。该残基在图7B中以粗体印刷表示。另一实施方式使用包含h38c2的可变域(V_L和V_H)和来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定域的嵌合抗体。

各种形式的人化醛缩酶抗体片段也被考虑。一种实施方式使用h38c2 F(ab’)₂。h38c2 F(ab’)₂可以通过蛋白水解消化h38c2 IgG1而产生。另一实施方式使用包含来自h38c2的V_L和V_H结构域的h38c2 scFv，所述结构域任选通过插入的接头(Gly₄Ser)₃来连接。

作为人化的可选方法，可以产生人抗体。例如，现在产生转基因动物(例如，小鼠)是可能的，所述转基因动物在免疫接种(或者在催化抗体的情况下活性免疫接种)后在缺乏内源免疫球蛋白生产的情况下能够产生人抗体的全组成成分。例如，已经描述了，嵌合和种系免疫球蛋白基因阵列中的抗体重链连接区(J_H)基因纯合子缺失到此类种系突变小鼠中将导致人抗体在抗原激发后产生。参见例如B.D.Cohen etal，Clin.Cancer Res.11：2063-2073(2005)；J.L.Teeling等，Blood104：1793-1800(2004)；N.Lonberg等，Nature 368：856-859(1994)；A.Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：2551-2555(1993)；A.Jakobovits等，Nature 362：255-258(1993)；M.Bruggemann等，YearImmunol.7：33-40(1993)；L.D.Taylor，等Nucleic Acids Res.20：6287-6295(1992)；M.Bruggemann等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：6709-6713(1989))；和WO 97/17852。

可选地，噬菌体展示技术(参见例如J.McCafferty等，Nature348：552-553(1990)；H.J.de Haard等，J Biol Chem 274，18218-18230(1999)；和A.Kanppik等，J Mol Biol，296，57-86(2000))可以被用于体外产生人抗体和抗体片段，使用的是来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)域基因的所有组成成分。按照该技术，抗体V结构域基因被符合读框地克隆到丝状噬菌体的主要或次要外被蛋白中，诸如M13或fd，并且作为功能性抗体片段在噬菌体颗粒的表面上展示。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，因此基于抗体的功能特性进行的选择也导致选择编码展示那些特性的抗体的基因。因此，噬菌体模拟B-细胞的一些特性。噬菌体展示可以以很多方式进行，并且在例如K.S.Johnson and D.J.Chiswell，Curr.Opin.Struct.Biol.3：564-571(1993)进行了综述。几种V-基因节段来源也可以用于噬菌体展示。T.Clackson等，Nature，352：624-628(1991)从得自免疫小鼠脾脏V基因的小型随机组合文库中分离出抗噁唑酮抗体的各种阵列。来自未免疫人类供体V基因的所有组成成分可以被构建，并且抗体与各种抗原阵列(包括自身抗原)基本上可以按照由J.D.Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)或A.D.Griffiths等，EMBO J.12：725-734(1993)所述的技术进行分离。也可参见美国专利5,565,332和5,573,905；以及L.S.Jespers等，Biotechnology 12：899-903(1994)。

如上所述，人抗体也可以通过体外激活的B细胞产生。参见例如美国专利5,567,610和5,229,275；以及C.A.K.Borrebaeck等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：3995-3999(1988)。

本文所述的抗体的氨基酸序列修饰被考虑。例如，改进抗体的结合亲和性和/或其它生物特性可能是期望的。抗体的氨基酸序列变体通过将合适的核苷酸变化引入该抗体核酸中或者通过肽合成来制备。此类修饰包括例如从抗体的氨基酸序列中删除、插入抗体的氨基酸序列中和/或置换抗体的氨基酸序列中的残基。进行删除、插入和置换的任何组合以达到最终的结构，条件是最终结构具有期望的特征。氨基酸变化也可以改变抗体的翻译后过程，诸如改变糖基话位点的编号或位置。

鉴定为诱变优选位置的抗体的一些残基或区域的有用方法被称为″丙氨酸扫描诱变″，如在B.C.Cunningham and J.A.Wells，Science244：1081-1085(1989)中usosh。此处，残基或靶向残基组被鉴定(例如，带电残基诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并且被中性或带负电的氨基酸(最优选Ala或多丙氨酸)置换，以影响氨基酸与连接子的Z基团的相互作用。对取代展示官能敏感性的那些氨基酸位置然后通过在取代部位或者针对取代部位引入此外的或其它的变体而被精修。因此，尽管引入氨基酸序列的部位是预定的，但是本身突变的性质不需要是预定的。例如，为分析在特定部位的突变性能，在目标密码子或区域处进行丙氨酸扫描或随机诱变，并且筛选所表达的抗体变体与Z形成共价键的能力。

氨基酸序列插入包括氨基-端和/或羧基-端融合，其长度范围从一个残基到含一百或更多个残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N-端甲硫氨酰残基的抗体或者与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗-抗体的N-端或C-端与增加抗体的血清半衰期的酶或多肽的融合。

另一类型的变体是氨基酸置换变体。这些变体在抗体分子中具有至少一个被不同残基置换的氨基酸残基。对于置换诱变来说最大感兴趣的部位包括高可变区，但是FR改变也被考虑。保守置换在″优选置换″的标题下示于下面的表3中。如果此类置换导致生物活性变化，则更多的实质性变化——被命名为″示例性置换″，如下面参考氨基酸种类进一步描述的——可以被引入并对产物进行筛选。

抗体生物特性的实质性改变伴随选择置换，所述置换在其保持下述特性的作用上显著不同：(a)在置换区域中的多肽骨架的结构，例如，作为折叠构象或螺旋构象，(b)靶向部位的分子电荷或疏水性，或者(c)侧链的体积。天然出现的残基基于共同的侧链特性被分成组：

(1)疏水性的：Nle、Met、Ala、Val、Leu、Ile。

(2)中性疏水性的：Cys、Ser、Thr。

(3)酸性：Asp、Glu。

(4)碱性：Asn、Gln、His、Lys、Arg。

(5)影响链定向的残基：Gly、Pro；和

(6)芳香性的：Trp、Tyr、Phe。

非保守置换将产生这些种类之一的成员与另一种类的成员的交换。

任何不参与维持适当的抗体构象的半胱氨酸残基可以被置换，通常利用丝氨酸，以改进分子的氧化稳定性以及防止异常交联。相反地，半胱氨酸键(一个或多个)可以加至抗体中以改进其稳定性(特别是在抗体是诸如Fv片段的抗体片段情况下)。

一种类型的置换变体涉及置换亲本抗体(例如人化或人抗体)的一个或多个高可变区残基。一般而言，所产生的被选择用于进一步开发的变体(一种或多种)相对于亲本抗体——所述变体从中产生——将具有改进的生物特性。用于产生此类置换变体的方便的方式涉及利用噬菌体展示的亲和力成熟。简言之，几个高可变区位点(例如，6-7位点)被突变以在每个位点产生所有可能的氨基置换。由此产生的抗体变体以单价方式从丝状噬菌体颗粒展示为与在每个颗粒内包装的M13的基因III产物融合。然后，如本文所公开，筛选噬菌体展示的变体的生物活性(例如，结合亲和性)。微粒鉴定用于修饰的候选高可变区部位，可以进行丙氨酸扫描诱变以鉴定显著有助于抗原结合的高可变区残基。可选地或另外地，分析抗体偶联物配合物的结构以鉴定抗体与Z基团之间的接触点可以是有益的。按照本文详解的技术，此类接触残基以及相邻残基是置换的候选物。一旦此类变体被产生，使变体组经历如本文所述的筛选，并且可以选择在一个或多个相关试验中具有优良特性的抗体进行进一步开发。

另一类型的抗体氨基酸变体通过在抗体中删除一个或多个碳水化合物部分和/或通过在抗体中添加不存在的一个或多个糖基化位点改变抗体的原始糖基化模式。

抗体的糖基化通常是N-联或O-联的。N-联是指碳水化合物部分附着至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列Asn-X”-Ser和Asn-X”-Thr——其中X”是除脯氨酸之外的任何氨基酸，通常是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链的酶附着的识别序列。因此，这些三肽序列的任一种在多肽中的存在产生潜在的糖基化位点。O-联糖基化是指糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着至羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。

糖基化位点与抗体的加成通过更改氨基酸序列以便其含有一个或多个上述三肽序列(对于N-联糖基化位点而言)而方便地完成。该更改也可以通过一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基加成至原始抗体的序列或通过一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基的置换进行(对于O-联糖基化位点而言)。

关于效应子作用来修饰抗体可能是期望的，例如，以增强抗体的抗原依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖细胞毒性(CDC)。这可以通过在抗体的Fc区引入一个或多个氨基酸置换来实现。可选地，抗体可以被工程化，其具有双Fc区并且因此可以具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见G.T.Stevenson等，Anticancer Drug Des.3：219-230(1989)。

为增加抗体的血清半衰期，技术人员可以将补救受体结合表位掺入抗体(特别是抗体片段)中，例如如在美国专利5,739,277中所述。如本文所用，术语″补救受体结合表位(salvage receptor binding epitope)″是指IgG分子(例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄)的Fc区表位，其负责增加IgG分子的体内血清半衰期。

表3：氨基酸置换

各种技术已经被开发用于产生全抗体和抗体片段。传统上，抗体片段经过完整抗体的蛋白水解消化得到(参见例如K.Morimoto and K.Inouye，J.Biochem.Biophys.Methods 24：107-117(1992)；M.Brennan等，Science 229：81-83(1985))。然而，这些片段现在可以通过重组宿主细胞直接产生。Fab、Fv、VH、VL和scFv抗体片段全部可以在大肠杆菌中表达并且可以从中分泌——这在下面详细描述，因此允许容易产生大量的这些片段。抗体片段可以从上面讨论的抗体噬菌体文库中分离。可选地，Fab′-SH片段可以从大肠杆菌中直接回收，并进行化学偶联而形成F(ab′)2片段(P.Carter等，Biotechnology 10：163-167(1992))。按照另一种方法，F(ab′)2片段可以从重组宿主细胞培养物直接分离。

多种表达载体/宿主系统可以被用于表达抗体。这些系统包括但不限于微生物诸如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞；用病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)转染的或者用细菌表达载体(例如，Ti或pBR322质粒)转染的植物细胞系统；或动物细胞系统。

用于重组抗体表达中的哺乳动物细胞包括但不限于VERO细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、COS细胞(诸如COS-7)、W138、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562和293细胞以及如本文所述的杂交瘤细胞系。哺乳动物细胞对于那些通常被糖基化并且需要适当的活性重折叠的抗体制备来说是优选的。优选的哺乳动物细胞包括CHO细胞、杂交瘤细胞和髓样细胞。

抗体重组表达的一些示例性方案在本文下面描述。

术语″表达载体″或“载体”是指用于从DNA(RNA)序列表达多肽的质粒、噬菌体、病毒或载体。表达载体可以包含转录单位，其包含(1)一个或多个控制基因表达的调节序列，例如启动子或增强子，(2)一个或多个编码一个或多个多肽的序列，和(3)合适的转录起始和终止序列。意图用于酵母或真核生物表达系统中的表达载体优选包括能够通过宿主细胞胞外分泌翻译蛋白的引导序列。可选地，在抗体多肽无需引导序列或转运序列而被表达的情况下，其可以包括氨基末端的甲硫氨酸残基。该残基随后可以从或可以不从表达的重组蛋白质切割，以提供最终的抗体产物。

抗体特别是抗体片段可以在原核系统诸如大肠杆菌中表达。在另一例子中，编码特异性结合剂肽的DNA序列可以通过PCR扩增并被克隆到合适的载体诸如例如pGEX-3x(Pharmacia)中。pGEX载体被设计，以产生被载体编码的包含谷胱苷肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白，以及被插入载体克隆位点中的DNA片段编码的肽。PCR的引物可以被产生，以包括例如合适的切割位点。pGEX-3x抗体肽构建物被转化到大肠杆菌XL-1 Blue细胞中(Stratagene，La Jolla Calif.)，并且单独的转化体被分离并生长。表达的肽融合蛋白然后可以从融合蛋白的GST部分切割。

利用上述重组系统表达编码抗体的多肽可导致抗体或其片段产生，所述抗体或其片段必须被“重折叠”(以适当地建立各种二硫桥)以便具有生物活性。

在细菌细胞中产生的抗体特别是抗体片段可以作为在细菌中的不溶性包涵体(inclusion body)而产生。这类抗体可以如下纯化。宿主细胞可以通过离心分离而被处死；在0.15 M NaCl、10mM Tris，pH 8、1mM EDTA中洗涤；并用0.1mg/ml溶菌酶(Sigma，St.Louis，Mo.)在室温处理15分钟。溶胞产物可以通过声裂法产生，并且细胞碎片可以通过在下离心分离10分钟而成粒。含有抗体的小球可以再悬浮于50mM Tris，pH 8和10mM EDTA中，在50％甘油上分层，并在6000xg下离心分离30分钟。小球可以再悬浮于无Mg和Ca离子的标准磷酸缓冲盐水溶液(PBS)中。抗体可以通过将再悬浮的小球在变性SDS聚丙烯酰胺凝胶中分馏而被进一步纯化(前述Sambrook等)。凝胶可以被浸泡在0.4M KCl中，以使蛋白质显形，其可以缺乏SDS的跑胶缓冲液中被切断(excise)并电洗脱。

用于表达抗体的哺乳动物宿主系统是本领域技术人员熟知的。宿主细胞株可以基于加工表达蛋白质或产生某些翻译后修饰——其在提供蛋白质活性方面有用——的特定能力而被选择。此类多肽的修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂质化(lipidation)和酰化作用。不同的宿主细胞诸如CHO、HeLa、MDCK、293、W138以及杂交瘤细胞系等针对此类翻译后活性具有特异性细胞结构(cellularmachinery)和特征机制，并且可以进行选择以确保所引入的异体蛋白的正确修饰和加工。

很多选择系统可以用于恢复已经被转化用于重组抗体生产的细胞。此类系统包括但不限于分别在tk-细胞、hgprt-细胞或aprt-细胞中的HSV胸苷激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶以及腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因。此外，抗代谢物抗性可以被用作选择下述的基础：DHFR，其赋予甲氨喋呤抗性；gpt，其赋予霉酚酸抗性；neo，其赋予氨基葡糖苷G418抗性以及赋予嗪磺隆抗性；和hygro，其赋予均霉素抗性。可以使用的另外的可选择基因包括trpB——其允许细胞利用吲哚来代替色氨酸，或hisD——其允许细部利用组醇(histinol)来代替组氨酸。给出转化体鉴定的可见信号的标记包括花青苷、β-葡糖苷酸酶及其底物GUS、以及荧光酶(luciferase)及其底物荧光素。

在一些情况下，利用上述方法产生的抗体可能需要被“重折叠”并氧化成合适的三级结构，并使其产生二硫键，以便具有生物活性。重折叠可以利用本领域熟知的很多方法来完成。此类方法包括例如在促溶剂存在下将溶解的多肽试剂暴露于通常在7以上的pH。对促溶剂的选择类似于对包涵体溶解的选择。然而，促溶剂通常在较低的浓度下使用。示例性的促溶剂是胍。在大多数情况下，重折叠/氧化溶解也将含有特定比例的还原剂加其氧化形式以产生特定的氧化还原电势，其允许发生二硫化物的移动发生以形成半胱氨酸桥。一些常用的氧化还原对包括半胱氨酸/六亚甲基四胺、谷胱苷肽/二硫双GSH(dithiobisGSH)、氧化铜、二硫苏糖醇DTT/二噻烷DTT及2-巯基乙醇(bME)/二硫代-bME。在很多情况下，共溶剂可用于增加重折叠的效率。常用的共溶剂包括甘油、各种分子量的聚乙二醇以及精氨酸。

连接子和连接的化合物

AA靶向剂可直接或经由连接子而与抗体中的结合部位共价连接。合适的连接子可以被选择为在靶向剂与抗体之间提供足够的距离。用于制备AA靶向化合物的连接子实施方式一般设计由式-X-Y-Z表示，其中X是连接链，Y是识别基团，以及Z是反应基团。连接子可以是线型的或支化的，并且任选包括一个或多个碳环或杂环基团。连接子长度可以按照线型原子数来考虑，其中环部分诸如芳环等通过取环周围的最短路径来计数。在一些实施方式中，连接子具有5-15个原子之间的线型伸长，在其它实施方式中为15-30个原子，仍在其它实施方式中为30-50个原子，仍在其它实施方式中为50-100个原子，仍在其它实施方式中为100-200个原子。其它的连接子考虑因素包括对所得到的AA靶向化合物或AA靶向剂-连接子的物理性质或药物动力学性质的影响，诸如溶解性、亲油性、亲水性、疏水性、稳定性(或者更稳定或者较不稳定，以及计划的降解)、硬度、柔性、免疫原性、抗体结合的调节、被引入胶束或脂质体中的能力等。

连接子的连接链X包括来自基团C、H、N、O、P、S、卤素(F、Cl、Br、I)或其盐的任何原子。X也可以包括基团诸如烷基、烯基、炔基、氧代烷基、氧代烯基、氧代炔基、氨基烷基、氨基烯基、氨基炔基、磺基烷基、磺基烯基、磺基炔基、磷酸烷基、磷酸烯基、或磷酸炔基。在一些实施方式中，X可以包括一个或多个环结构。在一些实施方式中，连接子是重复聚合物，诸如含有2-100个单元聚乙二醇。

连接子的识别集团Y是任选的，并且如果存在的话则位于反应基团与连接链之间。在一些实施方式中，Y位于距离Z1-20个原子处。尽管不希望束缚于任何理论，但是认为识别基团起着将反应基团适当定位到抗体结合部位中以便其可与反应性氨基酸侧链反应的作用。示例性识别基团包括碳环和杂环，所述环优选具有5或6个原子。然而，也可以使用较大的环。在一些实施方式中，AA靶向剂与Y直接连接而不使用居间的连接子。

Z能够与抗体结合部位中的反应性侧链形成共价键。在一些实施方式中，Z包括一个或多个C＝O基团，其被排列而形成二酮、酰基β-内酰胺、活性酯、卤代酮、环己基二酮基、醛、马来酰亚胺、活性烯烃、活性炔烃，或者一般地，含有易于受亲核或亲电子置换影响的离去基团的分子。其它基团可以包括内酯、酐、α-卤代乙酰胺、亚胺、酰肼或环氧化物。可以与抗体结合部位中的反应性亲核基团(例如，赖氨酸或半胱氨酸侧链)共价结合的示例性连接子亲电子反应基团包括酰基β-内酰胺、简单二酮、琥珀酰亚胺活性酯、马来酰亚胺、具有接头的卤代乙酰胺、卤代酮、环己基二酮、醛、脒、胍、亚胺、烯胺、磷酸酯、膦酸酯、环氧化物、氮丙啶、硫代环氧化物、掩蔽或被护二酮(a例如缩酮)、内酰胺、磺酸酯等、掩蔽C＝O基团诸如亚胺、缩酮、缩醛以及任何其它已知的亲电子基团。在一些实施方式中，反应基团包括一个或多个C＝O基团，其被排列以形成酰基β-内酰胺、简单二酮、琥珀酰亚胺活性酯、马来酰亚胺、具有接头的卤代乙酰胺、卤代酮、环己基二酮、或醛。

选择连接子反应基团或类似的这类基团，用于特定结合部位中的反应性残基。例如，用以修饰醛缩酶抗体的化学部分可以是酮、二酮、β-内酰胺、活性酯卤代酮、内酯、酐、马来酰亚胺、α-卤代乙酰胺、环己基二酮、环氧化物、醛、脒、胍、亚胺、烯胺、磷酸酯、膦酸酯、环氧化物、氮丙啶、硫代环氧化物、掩蔽或被护二酮(例如缩酮)、内酰胺、卤代酮、醛等。

适于通过抗体中的反应性巯基共价修饰的连接子反应基团化学部分可以是二硫化物、芳基卤、马来酰亚胺、α-卤代乙酰胺、异氰酸酯、环氧化物、硫代酸酯、活性酯、脒、胍、亚胺、烯胺、磷酸酯、膦酸酯、环氧化物、氮丙啶、硫代环氧化物、掩蔽或被护二酮(例如缩酮)、内酰胺、卤代酮、醛等。

本领域技术人员容易理解，在抗体结合部位中的活性氨基酸侧链可以具有与AA靶向剂或其连接子上的亲核基团反应的亲电子基团，而在其它实施方式中，氨基酸侧链中的活性亲核基团与AA靶向剂或连接子中的亲电子基团反应。

AA靶向化合物可以通过几种方法制备。在一种方法中，AA靶向剂-连接子化合物是利用连接子合成的，所述连接子包括一个或多个专门用于与抗体结合部位中的氨基酸的侧链进行共价反应的反应基团。靶向剂-连接子化合物和抗体在连接子反应基团与氨基酸侧链形成共价键的条件下结合。

在另一方法中，通过合成包含抗体和连接子的抗体-连接子化合物可以实现连接，其中所述连接子包括一个或多个专门用于与AA靶向剂的适当化学部分进行共价反应的反应基团。AA靶向剂可能需要进行修饰，以提高用于与连接子反应基团进行的反应的适宜部分。抗体-连接子和AA靶向剂在连接子反应基团与靶向剂和/或生物制剂共价键合的条件下结合。

抗体-AA靶向化合物的另外的方法使用双连接子设计。在一些实施方式中，AA靶向剂-连接子化合物被合成，其包含AA靶向剂和具有反应基团的连接子。抗体-连接子化合物被合成，其包含抗体和具有易于与第一步的AA靶向剂-连接子的反应基团进行反应的化学基团的连接子。这两种含连接子的化合物然后在连接子借此共价键合的条件下结合，形成抗体-AA-靶向化合物。

可参与键合的示例性官能团包括例如酯、酰胺、醚、磷酸酯、氨基、酮、脒、胍、亚胺、烯胺、磷酸酯、膦酸酯、环氧化物、氮丙啶、硫代环氧化物、掩蔽或被护二酮(例如缩酮)、内酰胺、卤代酮、醛、硫代氨基甲酸酯、硫代酰胺、硫代酸酯、硫化物、二硫化物、磷酰胺、磺酰胺、脲、硫脲、氨基甲酸酯、碳酸酯、羟基酰胺(hydroxamide)等。

连接子包括来自基团C、H、N、O、P、S、卤素(F、Cl、Br、I)或其盐的任何原子。连接子也可以包括基团诸如烷基、烯基、炔基、氧代烷基、氧代烯基、氧代炔基、氨基烷基、氨基烯基、氨基炔基、磺基烷基、磺基烯基、磺基炔基、磷酸烷基、磷酸烯基、或磷酸炔基。连接子也可以包括一个或多个环结构。如本文所用，“环结构”包括饱和、不饱和和芳香碳环以及饱和、不饱和和发芳香杂环。环结构可以是单环的、二环或多环的，并且包括稠环或非稠环。此外，环结构任选用本领域熟知的官能团取代，其包括但不限于卤素、氧代、-OH、-CHO、-COOH、-NO₂、-CN、-NH₂、-C(O)NH₂、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_1-6氧代烷基、氧代烯基、氧代炔基、氨基烷基、氨基烯基、氨基炔基、磺基烷基、磺基烯基、磺基炔基、磷酸烷基、磷酸烯基、或磷酸炔基。上述基团和环的组合也可以存在于AA靶向化合物的连接子中。

本发明的一方面是具有式I的AA靶向剂-连接子偶联物：

L-[AA靶向剂] (I)

其中[AA靶向剂]是AA靶向剂肽。

式I化合物中的连接子部分L可以附着至AA靶向剂的氨基末端、羧基末端或任何氨基酸侧链。在一些实施方式中，L连接至AA靶向剂的羧基末端。在一些其它实施方式中，L连接至AA靶向剂的氨基末端。仍在其它实施方式中，L连接至亲核性或亲电性侧链。对于连接至亲电子侧链的情况，L应当具有易于与亲电子侧链进行共价反应的亲核基团。示例性亲电子侧链是Asp和Glu。示例性亲核侧链是Cys、Lys、Ser、Thr和Tyr。对于共价连接至亲核侧链的情况，L应当包含易于与亲核侧链进行共价反应的亲电子基团。在另一实施方式中，亲核氨基酸被添加至AA靶向剂的羧基末端或氨基末端，并且连接子L共价附着至该添加氨基酸的侧链。在一些实施方式中，Lys被添加至AA靶向剂的氨基末端。在一些其它实施方式中，Lys被添加至AA靶向剂的羧基末端。

因此，在那些包含R¹-QKY QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²基AA靶向剂的实施方式中，通过连接至i)D、E、K、T和Y的侧链或ii)氨基或羧基末端而形成的式I的示例性化合物包括下列化合物，其中在氨基酸残基之后的(Li)表示与该残基连接：

Q(Li)KY QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²(SEQ ID NO：140)

R¹-QK(Li)Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²(SEQ ID NO：141)

R¹-QKY(Li) QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²(SEQ ID NO：142)

R¹-QKY QPL D(Li)EL DKT LYD QFM LQQ G-R²(SEQ ID NO：13)

R¹-QKY QPL DE(Li)L DKT LYD QFM LQQ G-R²(SEQ ID NO：144)

R¹-QKY QPL DEL D(Li)KT LYD QFM LQQ G-R²(SEQ ID NO：145)

R¹-QKY QPL DEL DK(Li)T LYD QFM LQQ G-R²(SEQ ID NO：146)

R¹-QKY QPL DEL DKT(Li)LYD QFM LQQ G-R²(SEQ ID NO：147)

R¹-QKY QPL DEL DKT LY(Li)D QFM LQQ G-R²(SEQ ID NO：148)

R¹-QKY QPL DEL DKT LYD(Li)QFM LQQ G-R²(SEQ ID NO：149)

R¹-QKY QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G(Li) (SEQ ID NO：150)

类似地，在那些包括R¹-Q-[ACK]-Y QPL DEL DKT LYD QFMLQQ G-R²基AA靶向剂的实施方式中，通过连接至i)D、E、K、T和Y的侧链或ii)氨基或羧基末端而形成的式I的示例性化合物包括：

Q(Li)-[AcK]Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²(SEQ ID NO：151)

R¹-Q-[AcK]-Y(Li)QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G-R²(SEQ IDNO：152)

R¹-Q-[AcK]-Y QPL D(Li)EL DKT LYD QFM LQQ G-R²(SEQ IDNO：153)

R¹-Q-[AcK]-Y QPL DE(Li)L DKT LYD QFM LQQ G-R²(SEQ IDNO：154)

R¹-Q-[AcK]-Y QPL DEL D(Li)KT LYD QFM LQQ G-R²(SEQ IDNO：155)

R¹-Q-[AcK]-Y QPL DEL DK(Li)T LYD QFM LQQ G-R²(SEQ IDNO：156)

R¹-Q-[AcK]-Y QPL DEL DKT(Li)LYD QFM LQQ G-R²(SEQ IDNO：157)

R¹-Q-[AcK]-Y QPL DEL DKT LY(Li)D QFM LQQ G-R²(SEQ IDNO：158)

R¹-Q-[AcK]-Y QPL DEL DKT LYD(Li)QFM LQQ G-R²(SEQ IDNO：159)

R¹-Q-[AcK]-Y QPL DEL DKT LYD QFM LQQ G(Li)(SEQ ID NO：160)

在式I的化合物中，L是具有式X-Y-Z的连接子部分，其中：

X是任选存在的生物相容性聚合物或嵌段共聚物，其附着至构成AA靶向剂的残基之一；

Y是至少包含环结构的任选存在的识别基团；和

Z是反应基团，其能够与抗体结合部位中的侧链共价键合。

在式I化合物的一些实施方式中，X是：

-R²²-P-R²--或-R²²-P-R²¹-P’-R²³-

其中：

P和P’独立地选自：聚氧化烯氧化物(polyoxyalkylene oxide)，诸如，聚环氧乙烷、聚乙基噁唑啉、聚-N-乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯和聚丙烯酰胺；在聚合物骨架或者聚合物侧链上具有胺基团的聚胺，诸如，多赖氨酸、多鸟氨酸、多精氨酸和多组氨酸；非肽聚胺，诸如，聚氨基苯乙烯、聚氨基丙烯酸酯、聚(N-甲氨基丙烯酸酯)、聚(N-乙氨基丙烯酸酯)、聚(N，N-二甲氨基丙烯酸酯)、聚(N，N-二乙氨基丙烯酸酯)、聚(氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N-甲氨基-甲基丙烯酸酯)、聚(N-乙氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N，N-二甲氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N，N-二乙氨基甲基丙烯酸酯)、聚(乙烯亚胺)；季铵的聚合物，诸如，聚(N，N，N-三甲基氨基丙烯酸酯氯化物、聚(甲基丙烯酰胺基丙基三甲基氯化铵)；蛋白聚糖，诸如，硫酸软骨素-A(4-硫酸酯)、硫酸软骨素-C(6-硫酸酯)和硫酸软骨素-B；多肽，诸如聚丝氨酸、聚苏氨酸、多谷氨酰胺；天然或合成多糖，诸如，壳聚糖、羟乙基纤维素和类脂；

R²¹、R²²和R²³被选择，以便X的主链长度保持大约200个原子或以下。

在式I的一些实施方式中，R²²是-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-C(O)-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-C(O)-O-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-C(S)-NR^b-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-C(O)-NR^b-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-NR^b-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-O-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-S(O)_0-2-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-S(O)_0-2-NR^b-(CH₂)_v-或-(CH₂)_u-P(O)(OR^b)-O-(CH₂)_v-，其中u和v每个独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。

在式I化合物的又一实施方式中，R²²是-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-C(O)-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-C(O)-O-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-C(O)-NR^b-(CH₂)_v-或-(CH₂)_u-NR^b-(CH₂)_v。仍在其它实施方式中，R^-2是-(CH₂)_u-C(O)-NR^b-(CH₂)_v-。

在式I的一些实施方式中，R²¹和R²³每个独立为-(CH₂)_s-、-(CH₂)_r-C(O)-(CH₂)_s-、-(CH₂)_r-C(O)-O-(CH₂)_v-、-(CH₂)_r-C(S)-NR^b-(CH₂)_s-、-(CH₂)_r-C(O)-NR^b-(CH₂)_s-、-(CH₂)_r-NR^b-(CH₂)_s-、-(CH₂)_r-O-(CH₂)_s-、-(CH₂)_r-S(O)_0-2-(CH₂)_s-、-(CH₂)_r-S(O)_0-2-NR^b-(CH₂)_s-或-(CH₂)_r-P(O)(OR^b)-O-(CH₂)_s-，其中r、s和v每个独立为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。

还在其它实施方式中，R²¹和R²³每个独立为-(CH₂)_s-、-(CH₂)_r-C(O)-(CH₂)_s-、-(CH₂)_r-C(O)-O-(CH₂)_s-、-(CH₂)_r-C(O)-NR^b-(CH₂)_s-或-(CH₂)_r-NR^b-(CH₂)_s和-(CH₂)_r-C(O)-NR^b-(CH₂)_s-。

仍在其它实施方式中，R²¹和R²³每一个独立地具有下述结构：

其中p是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、32、43、44或45；w、r和s每个独立为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。

在式I化合物的一些实施方式中，X具有下述结构：

其中H¹和H^1’在每次出现时独立地为N、O、S或CH₂；r和s每个独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；t和t’每个独立为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、32、43、44、45、46、47、48、49或50；并且R^b是氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。

在式I化合物的一些实施方式中，X具有下述结构：

其中H¹和H^1’在每次出现时独立地为N、O、S或CH₂；r和s每个独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；t和t’每个独立为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、32、43、44、45、46、47、48、49或50；和R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。

在式I化合物的一些实施方式中，X具有下述结构：

其中H¹和H^1’在每次出现时独立地为N、O、S或CH₂；r和s每个独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；t和t’每个独立为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、32、43、44、45、46、47、48、49或50；并且R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。

在式I化合物的一些实施方式中，X具有下述结构：

其中v和w每个独立为1、2、3、4或5，以及R^b是氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在这些实施方式的一些中，v is 1、2或3，w是1、2或3，以及R^b是氢。

在式I的一些实施方式中，L是具有式X-Y-Z的连接子部分，其中：

X附着至构成AA靶向剂的残基之一，并且是任选取代的-R²²-[CH₂-CH₂-O]_t-R²³-、-R²²-环烷基-R²³-、-R²²-芳基-R²³-或-R²²-杂环基-R²³-，其中：

R²²和R²³每个独立为共价键、-O-、-S-、-NR^b-、取代或未取代的直链或支链C_1-50亚烷基、取代或未取代的直链或支链C_1-50杂亚烷基、取代或未取代的直链或支链C_2-50亚烯基、或者取代或未取代的C_2-50杂亚烯基；

R^b是氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基；

t是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、32、43、44、45、46、47、48、49或50；

并且R²²和R²³大小使得X的主链长度保持大约200个原子或以下；

Y是任选存在识别基团，其至少包含环结构；和

Z是反应基团，其能够与抗体结合部位中的侧链共价键合。

在式I的一些实施方式中，如果t＞1或者如果-X是-R²²-环烷基-R²³-、-R²²-芳基-R²³-或-R²²-杂环基-R²³-，则Y存在。

在式I的一些实施方式中，X是：

-R²²-[CH₂-CH₂-O]_t-R²³-，

其中：

R²²是-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-C(O)-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-C(O)-O-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-C(O)-NR^b-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-C(S)-NR^b-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-NR^b-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-O-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-S(O)_0-2-(CH₂)_v-、-(CH₂)_u-S(O)_0-2-NR^b-(CH₂)_v-或-(CH₂)_u-P(O)(OR^b)-O-(CH₂)_v-；

u和v每个独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，并且t是0至50。

R²³具有下述结构：

其中：

p是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、32、43、44或45；

w和r每个独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；

s是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；和

R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基；并且t、u、w、p、v、r和s的值使得X的主链长度保持大约200个原子或以下。

在式I化合物的一些实施方式中，X具有下述结构：

其中v、t、w和p的值被选择，以使X的主链长度在200个原子以下，可选地在100个原子以下，可选地在75个原子以下，可选地在50个原子以下，可选地在25个原子以下，或者可选地在15个原子以下。

在式I化合物的一些实施方式中，X具有下述结构：

其中v、t、r和s的值被选择，以使X的主链长度在200个原子以下，可选地在100个原子以下，可选地在75个原子以下，可选地在50个原子以下，可选地在25个原子以下，或者可选地在15个原子以下。

在式I化合物的一些实施方式中，X具有下述结构：

其中u、v、w和p的值被选择，以使X的主链长度在200个原子以下，可选地在100个原子以下，可选地在75个原子以下，可选地在50个原子以下，可选地在25个原子以下，或者可选地在15个原子以下。

在式I化合物的一些实施方式中，X具有下述结构：

其中u、v、t、r和s的值被选择，以使X的主链长度在200个原子以下，可选地在100个原子以下，可选地在75个原子以下，可选地在50个原子以下，可选地在25个原子以下，或者可选地在15个原子以下。

在式I化合物的一些实施方式中，X具有下述结构：

其中u、v、t、w和p的值被选择，以使X的主链长度在200个原子以下，可选地在100个原子以下，可选地在75个原子以下，可选地在50个原子以下，可选地在25个原子以下，或者可选地在15个原子以下。

在式I化合物的一些实施方式中，X具有下述结构：

在具有式I的化合物(其中L具有式-X-Y-Z)中，Y的环结构包括饱和、不饱和及芳香性的碳环以及饱和、不饱和及芳香性的杂环。环结构可以是单环、双环或多环，并且包括稠环或非稠环。此外，环结构任选用本领域熟知的官能团取代，所述官能团包括但不限于卤素、氧代、-OH、-CHO、-COOH、-NO₂、-CN、-NH₂、脒、胍、羟胺、-C(O)NH₂、仲酰胺和叔酰胺、磺酰胺、取代或未取代烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、氧代烷基、氧代烯基、氧代炔基、氨基烷基、氨基烯基、氨基炔基、磺基烷基、磺基烯基、磺基炔基、磷酸烷基、磷酸烯基和或磷酸炔基。

在具有式I的化合物的一些实施方式中，Y的环结构具有任选取代的结构：

其中a、b、c、d和e每个独立地为碳或氮；f是碳、氮、氧或硫；Y在足够化合价的任何两个环位置独立地附着至X和Z；并且a、b、c、d、e或f中不超过四个同时为氮。

在构成环结构的原子上任何开放化合价可以通过氢或其它取代基填充，或者可以通过共价附着至X和Z来填充。例如，如果b是碳，则其化合价可以通过氢、诸如卤素的取代基、共价附着至X或共价附着Z来填充。在一些实施方式中，a、b、c、d和e每个是碳，而在其它实施方式中，a、c、d和f每个是碳。在其它实施方式中，a、b、c、d或e中至少一个是氮，以及仍在其它实施方式中，f是氧或硫。在又一实施方式中，Y的环结构是未取代的。在一些实施方式中，Y是苯基。

在式I化合物的一些实施方式中，X-Y具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，v是1、2、3、4或5；w是1、2、3、4或5；且R^b是氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些其它实施方式中，v是1、2或3，以及w是1、2或3。仍在其它实施方式中，v是1或2以及w是1或2。

在式I化合物的一些实施方式中，X具有下述结构：

其中H¹和H^1’每个独立为N、O、S或CH₂；r和s每个独立为1、2、3、4或5；以及t和t’每个独立为0、1、2、3、4或5。在这些实施方式的一些中，H¹和H^1’每个独立为O或CH₂；r和s每个独立为1或2；以及t和t’每个独立为0或1。

在式I化合物的一些实施方式中，X具有下述结构：

其中H¹和H^1’每个独立为N、O、S或CH₂；r和s每个独立为1、2、3、4或5；t和t’每个独立为0、1、2、3、4或5，以及R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在这些实施方式的一些中，H¹和H^1’每个独立为O或CH₂；r和s每个独立为1或2；以及t和t’每个独立为0或1。

在式I化合物的一些实施方式中，X具有下述结构：

其中H¹和H^1’每个独立为N、O、S或CH₂；r和s每个独立为1、2、3、4或5；t和t’每个独立为0、1、2、3、4或5，以及R^b是氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在这些实施方式的一些中，H¹和H^1’每个独立为O或CH₂；r和s每个独立为1或2；以及t和t’每个独立为0或1。

在式I化合物的一些实施方式中，X具有下述结构：

在式I化合物的这些实施方式中的一些中，X-Y具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；w是1、2、3、4或5；p是1、2、3、4或5，以及R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，v是0；t是1、2、3、4、5或6；w是1；以及p是3。在一些实施方式中，v是0；t是1、2或3。W是1；以及p是1或2。

在式I化合物的一些实施方式中，X-Y具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；r是1、2、3、4或5；s是0、1、2、3、4或5；并且R^b是氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，v是0；t是1、2、3、4、5或6；r是1或2；以及s是3。在一些实施方式中，v是0；t是1、2或3，r是1；以及s是1或2。

在式I化合物的一些实施方式中，X-Y具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，u是0、1、2、3、4或5；v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；w是1、2、3、4或5；p是1、2、3、4或5；并且R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，u是0；v是0；t是1、2、3、4、5或6；w是1；以及p是3。在一些实施方式中，u是0或1；v是0；t是1或2；w是1；以及p是1或2。

在式I化合物的一些实施方式中，X-Y具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，u是0、1、2、3、4或5；v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；r是1、2、3、4或5；s是0、1、2、3、4或5；并且R^b是氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，u是0；v是0；t是1、2、3、4、5或6；r是1或2；以及s是3。在一些实施方式中，u是0或1；v是0；t是1、2或3；r是1；以及s是1或2。

在式I化合物的一些实施方式中，X-Y具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，u是0、1、2、3、4或5；v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；r是1、2、3、4或5；s是0、1、2、3、4或5；并且R^b是氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，u是0；v是0；t是1、2、3、4、5或6；r是1或2；以及s是3。在一些实施方式中，u是0或1；v是0；t是1、2或3，r是1；以及s是1或2。

在式I化合物的一些实施方式中，X-Y具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，u是0、1、2、3、4或5；v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；r是1、2、3、4或5；s是0、1、2、3、4或5；并且R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，u是0；v是0；t是1、2、3、4、5或6；r是1或2；以及s是3。在一些实施方式中，u是0或1；v是0；t是1、2或3，r是1；以及s是1或2。

在式I化合物的一些实施方式中，X-Y具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，u是0、1、2、3、4或5；v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；r是1、2、3、4或5；s是0、1、2、3、4或5；并且R^b是氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在某一实施方式中，u是0；v是0；t是1、2、3、4、5或6；r是1或2；以及s是3。在一些实施方式中，u是0或1；v是0；t是1、2或3，r是1；以及s是1或2。

在具有式I的化合物——其中L具有式-X-Y-Z——中，反应基团Z含有能够与抗体结合部位中的氨基酸形成共价键的部分。例如Z可以是取代的烷基、取代的环烷基、取代的芳基、取代的芳基烷基、取代的杂环基或取代的杂环烷基，其中至少一个取代基是1，3-二酮部分、酰基β-内酰胺、活性酯、α-卤代酮、醛、马来酰亚胺、内酯、酐、α-卤代乙酰胺、胺、酰肼或环氧化物。在一些此类实施方式这，Z是取代的烷基。

Z可以是形成可逆或不可逆共价键的基团。在一些实施方式中，可逆共价键可以利用二酮Z基团诸如在图8中显示的那些来形成。因此，结构A-C可以与抗体结合部位中的活性亲核基团(例如赖氨酸或半胱氨酸侧链)形成可逆共价键。图8结构A-C中的R’₁、R’₂、R’₃和R₄代表可以是C、H、N、O、P、S、卤素(F、Cl、Br、I)或其盐的取代基。这些取代基也可以包括基团，诸如烷基、烯基、炔基、氧代烷基、氧代烯基、氧代炔基、氨基烷基、氨基烯基、氨基炔基、磺基烷基、磺基烯基或磺基炔基、磷酸烷基、磷酸烯基、或磷酸炔基。R’₂和R’₃也可以来自如在结构B和C中所示例的环结构。图8中的X可以是杂原子。形成可逆共价键的其它Z基团包括脒、亚胺和其它被图8中的结构G所包括的反应基团。图9包括形成可逆共价键的其它连接子反应基团的结构，例如B、G、H，并且其中X不是离去基团E和F。

与抗体结合部位形成不可逆共价键的Z反应基团包括图8中的结构D-G(例如，当G是酰亚胺化物(imidate)时)和图9中的结构A、C和D。当X是离去基团时，图9中的结构E和F也可以形成不可逆共价键。此类结构用于不可逆地将靶向剂-连接子附着至抗体结合部位的活性亲核基团。

在其它此类实施方式中，Z是1，3-二酮部分。仍在其它此类实施方式中，Z是被1，3-二酮部分取代的烷基。在一些实施方式中，Z具有下述结构：

其中q＝0-5。在一些其它实施方式中，Z具有下述结构：

用在AA靶向化合物中以及用于制备AA靶向剂-连接子化合物的一种连接子包括作为Z的1，3-二酮反应基团。在式I的某些实施方式中，L具有下面的结构：

在这些实施方式的一些中，v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；w是1、2、3、4或5；p是1、2、3、4或5；q是0、1、2、3、4或5；并且R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在某些实施方式中，v是0；t是1、2、3、4、5或6；w是1；p是3；并且q是0、1、2或3。在一些实施方式中，v是0；t是1或2；w是1；p是1或2；并且q是1或2。

在式I的某些实施方式中，L具有下面的结构：

在这些实施方式的一些中，v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；w是1、2、3、4或5；p是1、2、3、4或5；q是0、1、2或3；并且R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，v是0；t是1、2、3、4、5或6；w是1；p是3；并且q是0、1、2或3。在一些实施方式中，v是0；t是1或2；w是1；p是1或2；并且q是2或3。

在式I的某些实施方式中，L具有下面的结构：

在这些实施方式的一些中，v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；w是1、2、3、4或5；p是1、2、3、4或5；q是0、1、2、3、4或5；并且R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，v是0；t是1、2、3、4、5或6；w是1；p是3；并且q是0、1、2或3。在一些实施方式中，v是0；t是1或2；w是1；p是1或2；并且q是1或2。

在式I的某些实施方式中，L具有下面的结构：

在这些实施方式的一些中，v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；r是1、2、3、4或5；s是0、1、2、3、4或5；q是0、1、2、3、4或5；并且R^b是氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，v是0；t是1、2、3、4、5或6；r是1或2；s是3；并且q是0、1、2或3。在一些实施方式中，v是0；t是1、2或3，r是1；s是1或2；并且q是1或2。

在式I的某些实施方式中，L具有下面的结构：

在这些实施方式的一些中，v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；r是1、2、3、4或5；s是0、1、2、3、4或5；q是0、1、2或3；并且R^b是氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，v是0；t是1、2、3、4、5或6；r是1或2；s是3；并且q是0、1、2或3。在一些实施方式中，v是0；t是1、2或3，r是1；s是1或2；并且q是2或3。

在式I的某些实施方式中，L具有下面的结构：

在这些实施方式的一些中，u是0、1、2、3、4或5；v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；w是1、2、3、4或5；p是1、2、3、4或5；q是0、1、2、3、4或5；并且R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，u是0；v是0；t是1、2、3、4、5或6；w是1；p是3；并且q是0、1、2或3。在一些实施方式中，u是0或1；v是0；t是1或2；w是1；p是1或2；并且q是1或2。

在式I的某些实施方式中，L具有下面的结构：

在这些实施方式的一些中，u是0、1、2、3、4或5；v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；w是1、2、3、4或5；p是1、2、3、4或5；q是0、1、2、3、4或5；并且R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，u是0；v是0；t是1、2、3、4、5或6；w是1；p是3；并且q是0、1、2或3。在一些实施方式中，v是0；t是1或2；w是1；p是1或2；并且q是1或2。

在式I的某些实施方式中，L具有下面的结构：

在这些实施方式的一些中，u是0、1、2、3、4或5；v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；w是1、2、3、4或5；p是1、2、3、4或5；q是0、1、2或3；并且R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，u是0；v是0；t是1、2、3、4、5或6；w是1；p是3；并且q是0、1、2或3。在一些实施方式中，v是0；t是1或2；w是1；p是1或2；并且q是2或3。

在式I的某些实施方式中，L具有下面的结构：

在这些实施方式的一些中，u是0、1、2、3、4或5；v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；r是1、2、3、4或5；s是0、1、2、3、4或5；q是0、1、2、3、4或5；并且R^b是氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，u是0；v是0；t是1、2、3、4、5或6；r是1或2；s是3；并且q是0、1、2或3。在一些实施方式中，u是0或1；v是0；t是1或2；w是1；p是1或2；并且q是1或2。

在式I的某些实施方式中，L具有下面的结构：

在这些实施方式的一些中，u是0、1、2、3、4或5；v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；r是1、2、3、4或5；s是0、1、2、3、4或5；q是0、1、2、3、4或5；并且R^b是氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，u是0；v是0；t是1、2、3、4、5或6；r是1或2；s是3；并且q是0、1、2或3。在一些实施方式中，u是0或1；v是0；t是1、2或3，r是1；s是1或2；并且q是1或2。

在式I的某些实施方式中，L具有下面的结构：

在这些实施方式的一些中，u是0、1、2、3、4或5；v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；r是1、2、3、4或5；s是0、1、2、3、4或5；q是0、1、2或3；并且R^b是氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，u是0；v是0；t是1、2、3、4、5或6；r是1或2；s是3；并且q是0、1、2或3。在一些实施方式中，u是0或1；v是0；t是1、2或3，r是1；s是1或2；并且q是2或3。

在式I的某些实施方式中，L具有下面的结构：

在这些实施方式的一些中，u是0、1、2、3、4或5；v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；w是1、2、3、4或5；p是1、2、3、4或5；q是0、1、2或3；并且R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，u是0；v是0；t是1、2、3、4、5或6；w是1；p是3；并且q是0、1、2或3。在一些实施方式中，u是0或1；v是0；t是1或2；w是1；p是1或2；并且q是2或3。

在式I的某些实施方式中，L具有下面的结构：

在这些实施方式的一些中，u是0、1、2、3、4或5；v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；r是1、2、3、4或5；s是0、1、2、3、4或5；q是0、1、2、3、4或5；并且R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，u是0；v是0；t是1、2、3、4、5或6；r是1或2；s是3；并且q是0、1、2或3。在一些实施方式中，u是0或1；v是0；t是1、2或3，r是1；s是1或2；并且q是1或2。

在式I的某些实施方式中，L具有下面的结构：

在这些实施方式的一些中，u是0、1、2、3、4或5；v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；r是1、2、3、4或5；s是0、1、2、3、4或5；q是0、1、2或3；并且R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，u是0；v是0；t是1、2、3、4、5或6；r是1或2；s是3；并且q是0、1、2或3。在一些实施方式中，u是0或1；v是0；t是1、2或3，r是1；s是1或2；并且q是2或3。

在式I的某些实施方式中，L具有下面的结构：

在这些实施方式的一些中，u是0、1、2、3、4或5；v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；w是1、2、3、4或5；p是1、2、3、4或5；q是0、1、2、3、4或5；并且R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，u是0；v是0；t是1、2、3、4、5或6；w是1；p是3；并且q是0、1、2或3。仍在一些实施方式中，u是0或1；v是0；t是1或2；w是1；p是1或2；并且q是1或2。

在式I的某些实施方式中，L具有下面的结构：

在这些实施方式的一些中，u是0、1、2、3、4或5；v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；w是1、2、3、4或5；p是1、2、3、4或5；q是0、1、2、3、4或5；并且R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，u是0；v是0；t是1、2、3、4、5或6；w是1；p是3；并且q是0、1、2或3。仍在其它实施方式中，u是0或1；v是0；t是1或2；w是1；p是1或2；并且q是1或2。

在式I的某些实施方式中，L具有下面的结构：

如本文所用，″AA₁-AA₂-AA_n″是指AA靶向剂，其中″AA₁″是AA靶向剂序列中的第一氨基酸，如从N-端所测量，″AA₂″是AA靶向剂序列中的第二氨基酸，如从N-端所测量，以及″AA_n″是AA靶向剂序列中的n^th氨基酸，如从N-端所测量。

按照式I的一些实施方式具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，v是1、2、3、4或5；w是1、2、3、4或5；q是0、1、2、3、4或5；并且R^b是氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，v是1、2或3；w是1、2或3；并且q是0、1、2或3。在一些实施方式中，v是1或2；w是1或2；并且q是1或2。

按照式I的一些实施方式具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，v是1、2、3、4或5；w是1、2、3、4或5；q是0、1、2或3；并且R^b是氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，v是1、2或3；w是1、2或3；并且q是0、1、2、3。在一些实施方式中，v是1或2；w是1或2；并且q是2或3。

按照式I的一些实施方式具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，v是1、2、3、4或5；w是1、2、3、4或5；q是0、1、2、3、4或5；并且R^b是氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，v是1、2或3；w是1、2或3；并且q是0、1、2、3。在一些实施方式中，v是1或2；w是1或2；并且q是2或3。

按照式I的一些实施方式具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；w是1、2、3、4或5；p是1、2、3、4或5；q是0、1、2或3；并且R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；w是1、2、3、4或5；p是1、2、3、4或5；并且q是0、1、2或3。在一些实施方式中，v是0；t是1、2、3、4、5或6；w是1；以及p是3，并且在一些实施方式中，v是0；t是1或2；w是1；p是1或2；并且q是2或3。

按照式I的一些实施方式具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；r是1、2、3、4或5；s是0、1、2、3、4或5；q是0、1、2、3、4或5；并且R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，v是0；t是1、2、3、4、5或6；r是1或2；s是3；并且q是0、1、2或3。在一些实施方式中，v是0；t是1、2或3，r是1；s是1或2；并且q是1或2。

按照式I的一些实施方式具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；r是1、2、3、4或5；s是0、1、2、3、4或5；q是0、1、2或3；并且R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，v是0；t是1、2、3、4、5或6；r是1或2；s是3；并且q是0、1、2或3。在一些实施方式中，v是0；t是1、2或3，r是1；s是1或2；并且q是2或3。

按照式I的一些实施方式具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；r是1、2、3、4或5；s是0、1、2、3、4或5；q是0、1、2或3；并且R^b是氢、取代或未取代的G_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，v是0；t是1、2、3、4、5或6；r是1或2；s是3；并且q是0、1、2或3。在一些实施方式中，v是0；t是1、2或3，r是1；s是1或2；并且q是2或3。

如本文所用是指AA靶向剂，其中″AA₁″是AA靶向剂序列中的第一氨基酸，如从N-端所测量，″AA₂″是AA靶向剂序列中的第二氨基酸，如从N-端所测量，以及″AA_n″是AA靶向剂序列中的n^th氨基酸，如从N-端所测量。所述靶向剂进一步包含在任何位置m+1处的Lys残基，如从N-端所测量。应当意识到，除了在AA靶向剂的主体上连接Lys侧链之外，也能够在AA靶向剂的N-端或C-端上连接Lys侧链。

按照式I的一些实施方式具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，v是1、2、3、4或5；w是1、2、3、4、5或6；q是1、2、3、4或5；并且R_b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，v是1、2或3；w是1、2或3；并且q是1、2或3。在一些实施方式中，v是1或2；w是1或2；并且q是2或3。

按照式I的一些实施方式具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；w是1、2、3、4或5；p是1、2、3、4或5；q是0、1、2或3；并且R^b在每次出现时独立X地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，v是0；t是1、2、3、4、5或6；w是1；p是3；并且q是0、1、2或3。在一些实施方式中，v是0；t是1或2；w是1；p是1或2；并且q是2或3。

按照式I的一些实施方式具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；w是1、2、3、4或5；p是1、2、3、4或5；q是0、1、2、3、4或5；并且R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在某一实施方式中，v是0；t是1、2、3、4、5或6；w是1；p是3；并且q是0、1、2或3。在一些实施方式中，v是0；t是1或2；w是1；p是1或2；并且q是1或2。

按照式I的一些实施方式具有下述结构：

向免疫活性的个体施用AA靶向化合物可导致对抗偶联物的抗体产生。此类抗体可以涉及可变区，其包括抗体个体基因型(idiotype)以及靶向剂或者用于偶联该靶向剂与抗体的任何连接子。减小AA靶向化合物的免疫原性可以通过本领域熟知的方法来完成，诸如将长链聚乙二醇(PEG)-基间隔物等附着至AA靶向化合物。长链PEG和其它聚合物已知具有能够掩盖外来表位(epitope)的能力，这导致展示外来表位的治疗蛋白质的免疫原性降低(N.V.Katre，J.Immunol.144：209-213(1990)；G.E.Francis等，Int.J.Hematol.68：1-18(1998)。可选地，或另外，被施用抗体-AA靶向剂偶联物的个体可以被施用免疫抑制剂诸如cyclosporin A、抗-CD3抗体等。

在一个实施方式中，AA靶向化合物如式II所示，并且包括其立体异构体、互变异构体、溶剂合物、前体药物和药学上可接受的盐。

抗体-L’-[AA靶向剂] (II)

在式II的化合物中，[AA靶向剂]如在式I中所定义。L’是连接抗体与靶向剂并且具有式-X-Y-Z’-的连接子部分。在式II的化合物中，X和Y如在式I中所定义，并且抗体是如在本文所定义的抗体。图10和11分别图解了在抗体结合部位中的活性亲核侧链与图8和9中Z部分的加成机制。

在一些实施方式中，其中抗体是醛缩酶催化抗体，Z’-抗体具有下述结构：

其中HN-抗体是指在具有氨基的抗体结合部位中的任何侧链。

在具有式II的化合物中，Z’是包含共价键以及连接抗体的0-20个碳原子的连接部分。这在下面显示，其情况是连接子具有作为反应基团的二酮部分，并且键合发生于抗体结合部位中的赖氨酸残基的侧链氨基基团。抗体示意性地显示为二价的，具有所示的每个结合部位的反应性氨基酸侧链。

下面显示的另一抗体是这样的情况：其中连接子具有β内酰胺部分作为反应基团，并且键合发生于抗体结合部位中的赖氨酸残基的侧链氨基基团。抗体示意性地显示为二价的，具有所示的每个结合部位的反应性氨基酸侧链。

按照式II的一些实施方式具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；w是1、2、3、4或5；p是1、2、3、4或5；q是0、1、2、3、4或5；并且R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，v是0；t是1、2、3、4、5或6；w是1；p是3；并且q是0、1、2或3。在一些实施方式中，v是0；t是1或2；w是1；p是1或2；并且q是2或3。

按照式II的一些实施方式具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；w是1、2、3、4或5；以及p是1、2、3、4或5；并且R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，v是0；t是1、2、3、4、5或6；w是1；以及p是3。在一些实施方式中，v是0；t是1或2；w是1；以及p是1或2。

按照式II的一些实施方式具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，v是1、2、3、4或5；w是1、2、3、4或5；q是0、1、2、3、4或5；并且R^b是氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，v是1、2或3；w是1、2或3；并且q是0、1、2、3。在一些实施方式中，v是1或2；w是1或2；并且q是1或2。

按照式II的一些实施方式具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，v是1、2、3、4或5；w是1、2、3、4或5；并且R^b是氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，v是1、2或3；以及w是1、2或3。在一些实施方式中，v是1或2以及w是1或2。

按照式II的一些实施方式具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；r是1、2、3、4或5；s是0、1、2、3、4或5；q是0、1、2、3、4或5；并且R^b是氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，v是0；t是1、2、3、4、5或6；r是1或2；s是3以及q是0、1、2或3。在一些实施方式中，v是0；t是1、2或3，r是1；s是1或2；并且q是1或2。

按照式II的一些实施方式具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；r是1、2、3、4或5；s是0、1、2、3、4或5；q是0、1、2或3；并且R^b是氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，v是0；t是1、2、3、4、5或6；r是1或2；s是3以及q是0、1、2或3。在一些实施方式中，v是0；t是1、2或3，r是1；s是1或2；并且q是2或3。

按照式II的一些实施方式具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；w是1、2、3、4或5；p是1、2、3、4或5；并且R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，v是0；t是1、2、3、4、5或6；w是1；以及p是3。在一些实施方式中，v是0；t是1或2；w是1；以及p是1或2。

按照式II的一些实施方式具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；r是1、2、3、4或5；s是0、1、2、3、4或5；q是0、1、2、3、4或5；并且R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，v是0；t是1、2、3、4、5或6；r是1或2；s是3以及q是0、1、2或3。在一些实施方式中，v是0；t是1、2或3，r是1；s是1或2；并且q是1或2。

按照式II的一些实施方式具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；r是1、2、3、4或5；s是0、1、2、3、4或5；q是0、1、2或3；并且R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，v是0；t是1、2、3、4、5或6；r是1或2；s是3以及q是0、1、2或3。在一些实施方式中，v是0；t是1、2或3，r是1；s是1或2；并且q是2或3。

按照式II的一些实施方式具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，v是0、1、2、3、4或5；t是1、2、3、4、5或6；r是1、2、3、4或5；s是0、1、2、3、4或5；并且R^b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，v是0；t是1、2、3、4、5或6；r是1或2；以及s是3。在一些实施方式中，v是0；t是1、2或3，r是1；以及s是1或2。

按照式II的一些实施方式具有下述结构：

在这些实施方式的一些中，v是1、2、3、4或5；以及w是1、2、3、4、5；并且R_b在每次出现时独立地为氢、取代或未取代的C_1-10烷基、取代或未取代的C_3-7环烷基-C_0-6烷基、取代或未取代的芳基-C_0-6烷基。在一些实施方式中，v是1、2或3；以及w是1、2或3。在一些实施方式中，v是1或2；以及w是1或2。

按照式II的一些实施方式具有下述结构：

可选地，连接子可以具有胺或酰肼作为反应基团，并且抗体可以被工程为具有二酮部分。非天然的含二酮氨基酸可以利用本领域熟知的技术而被容易地引入抗体结合部位中；含有非天然氨基酸的蛋白质已经在酵母和细菌中被产生。例如参见J.W.Chin等，Science301：964-966(2003)；L.Wang等，Science 292：498-500(2001)；J.W.Chin等，J.Am.Chem.Soc.124：9026-9027(2002)；L.Wang，等，J.Am.Chem.Soc.124：1836-1837(2002)；J.W.Chin and P.G.Schultz，Chembiochem.3：1135-1137(2002)；J.W.Chin等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99：11020-11024(2002)；L.Wang and P.G.Schultz，Chem.Commun.(1)：1-11(2002)；Z.Zhang等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.41：2840-2842(2002)；L.Wang，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100：56-61(2003)。因此，例如，为将非天然的含有二酮部分的氨基酸插入酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中需要将新成分添加至包括单一密码子、tRNA和氨酰-tRNA合成酶(aa RS)的蛋白质生物合成装置中(protein biosynthetic machinery)。例如，来自大肠杆菌(E.coli)的琥珀抑制基因酪氨酰-tRNA合成酶(TyrRS)-tRNA_CUA对可以被使用，如在J.W.Chin等，Science 301：964-966(2003)中关于真核生物所报告。琥珀密码子被用于编码感兴趣的非天然氨基酸。然后可以产生突变体TyrRS和tRNA_CUA的文库，并选择那些aaRS-tRNA_CUA对其中TyrRS利用感兴趣的非天然氨基酸例如含二酮的氨基酸装载tRNA_CUA。随后，通过克隆和表达在一个或多个抗体结合部位含有琥珀密码子的基因，可以产生结合了含二酮氨基酸的抗体。

在式II的化合物的一些实施方式中，抗体是全长抗体。在其它实施方式中，抗体是Fab、Fab’F(ab’)₂、Fv、V_H、V_L或scFv。在一些实施方式中，抗体是人抗体、人化抗体或嵌合人抗体。在一些实施方式中，抗体是催化抗体。在一种实施方式中，抗体是人化形式的鼠38c2，其包含来自人IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体的恒定区。在另一实施方式中，抗体是嵌合抗体，其包含来自鼠38c2的可变区和来自人IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体的恒定区。

在这些情况中，两个或多个AA靶向剂可以连接至单个全长二价抗体。这在下面以式III显示：

抗体[-L’-[AA靶向剂]]₂ (III)

也提供了其立体异构体、互变异构体、溶剂合物、前体药物及药学上可接受的盐。

在式III的化合物中，[AA靶向剂]、L′和抗体每个如在式II中所定义。

靶向化合物诸如式II的那些也可以通过将如本文所述的靶向剂-连接子化合物共价键合至多价抗体的结合部位而被容易地合成。例如，AA靶向剂-连接子偶联物——其中连接子包括二酮反应部分，可以用0.5当量的醛缩酶诸如h38C2 IgG1温育，以产生AA靶向化合物。可选地，AA靶向化合物诸如式III的那些可以通过将如本文所述的AA靶向剂-连接子化合物共价键合至二价抗体的每个结合部位而产生。AA靶向化合物的使用方法

本发明的一方面提供用于体内调节Ang-2活性的方法，其包括向对象施用有效量的如上所述的AA靶向化合物。进一步提供治疗对象中异常血管生成或血管生成介导的病症的方法。此类方法包括向对象施用治疗有效量的如本文所述的AA靶向化合物。如本文所用，血管生成介导的病症是由异常血管生成活动引起的病症，或者其中调节血管生成活性的化合物具有治疗用途的病症。可以治疗的疾病和病症包括癌症、关节炎、银屑病、与感染或外科手术有关的眼血管生成、黄斑变性或糖尿病性视网膜病。特别地，治疗癌症的方法包括乳癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、口咽癌、舌癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、胆囊癌和胆管癌、小肠癌、泌尿道癌、女性生殖道癌、男性生殖道癌、内分泌腺癌以及皮肤癌；血管瘤；黑素瘤；肉瘤；脑部肿瘤、神经肿瘤、眼部肿瘤和脑膜肿瘤；非白血性白血病；或淋巴瘤。

药物组合物及施用方法

本发明的另一方面提供AA靶向化合物的药物组合物。所述AA靶向化合物可以与药学上可接受的载体混合而形成药物组合物，用以单独或与一种或多种其它治疗方式结合施用于细胞或对象。

药物组合物通常被配制为与其预期的给药途径相容。本领域技术人员将了解，药物介质的选择以及适当的组合物制备将取决于预期用途和给药方式。给药途径的实例包括肠胃外(例如，静脉内、肌内、髓内、皮内、皮下)、口服(例如，吸入、摄食)、鼻内、经皮(例如，局部)、经粘膜以及直肠给药。AA靶向化合物的给药途径可以可以包括鞘内、直接心室内以及腹膜内递送。AA靶向化合物可以经由任何肠胃外途径来施用，或者通过直接注射制剂，或者通过输注靶向AA化合物制剂与输注基质诸如生理盐水、D5W、乳酸盐林格溶液或者通常使用的输注基质的混合物。

AA靶向化合物可以使用本领域技术人员熟知的技术来施用。优选地，制剂被配制并被全身施用。配制和使用技术可见于″Remington′sPharmaceutical Sciences，″18^th Ed.，1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA。对于注射而言，AA靶向化合物可以被配制在水溶液、乳剂或悬浮液中。AA靶向化合物优选在含有生理相容性缓冲剂诸如柠檬酸盐、乙酸盐、组氨酸或磷酸盐的水溶液中配制。在必要时，此类制剂也可以含有各种张度调节剂、增溶剂和/或稳定剂(例如，盐诸如氯化钠，或者糖诸如蔗糖、甘露醇和海藻糖，或者蛋白质诸如白蛋白，或氨基酸诸如甘氨酸和组氨酸，或者表面活性剂诸如聚氧乙烯油酸山梨醇酯(Tweens)，或者共溶剂诸如乙醇、聚乙二醇和丙二醇。

药物组合物可以含有用于改变、保持或预防例如pH、克分子渗透压浓度、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、溶解或释放率、组合物的吸附或渗透的配制材料。合适的配制材料包括但不限于氨基酸(诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(诸如抗坏血酸、亚硫酸钠、或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(诸如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐、其它有机酸、螯合剂[诸如乙二胺四乙酸(EDTA)]；溶剂(诸如甘油、丙二醇、或聚乙二醇)；糖醇(诸如甘露糖醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(诸如普流罗尼类，PEG，山梨聚糖酯，聚山梨酸酯诸如吐温20、吐温85，氚核，缓血酸胺，卵磷脂，胆固醇，tyloxapal)；稳定性增强剂(蔗糖或山梨糖醇)；张度增强剂(例如诸如碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾、甘露糖醇、山梨糖醇)；递送介质；稀释剂；赋形剂和/或药物助剂。(Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Edition，A.R.Gennaro，ed.，Mack Publishing Company，1990)。

当肠胃外给药被考虑时，治疗组合物可以处于无热原的、肠胃外可接受的水溶液形式，所述水溶液包含在在药学上可接受的载体中的AA靶向化合物。一种用于肠胃外注射的载体是无菌蒸馏水，其中AA靶向化合物被配制为无菌的等渗溶。又一种制剂可以涉及AA靶向化合物与一物质的制剂，所述物质诸如可注射微球、生物可降解的颗粒、聚合化合物(聚乳酸、聚乙醇酸)、珠或脂质体，所述制剂提供产品的控制释放或持续释放，该产品然后可以经由via a depot injection递送。也可以使用透明质酸酶，并且这可以具有在循环中促进持续期间的作用。用于引入期望分子的其它合适的工具包括可植入的药物递送装置。

在另一个方面，适于肠胃外给药的药物制剂可以在水溶液中配制，优选地，在生理相容的缓冲剂诸如汉克氏溶液、林格溶液或生理缓冲盐水中配制。水注射悬浮液可以含有增加该悬浮液粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋糖酐。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油诸如芝麻油，或合成的脂肪酸酯诸如油酸乙酯、三酸甘油酯或脂质体。非脂质聚阳离子氨基聚合物也可以用于递送。任选地，悬浮液也可以含有适当的稳定剂或增加该化合物的溶解性并且允许预备高度浓缩溶液的物质。

被用于体内施用的药物组合物一般必须是无菌的。这可以通过经过无菌过滤膜过滤来完成。在组合物是冻干的情况下，可以在冻干和重构之前或者之后实施使用该方法进行的灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以以冻干形式或在溶液中贮存。另外，肠胃外组合物通常被放入具有无菌入口的容器中，例如具有由皮下注射针可刺穿的塞子的静脉溶液袋或小瓶。

一旦药物组合物已经被配制，其可以以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或者脱水或冻干粉末被贮存在无菌瓶中。此类制剂可以以即用形式贮存或者以需要在给药之前进行重构的形式(例如，冻干)贮存。

一个实施方式涉及用于生产单剂量给药单元的试剂盒。所述试剂盒每个可以含有具有AA靶向化合物的第一容器和具有水性制剂的第二容器。还包括在本发明范围内的是含有单腔和多腔预填充注射器的试剂盒。

在治疗患有伴随异常血管生成的疾病的哺乳动物——包括人在内时，治疗有效量的AA靶向化合物或药学上可接受的衍生物被施用。给药频率将取决于所使用的制剂中的AA靶向化合物的药物动力学参数。典型地，组合物被施用，直到达到获得期望效果的剂量。组合物因此可以以单剂量施用，或以多剂量在一段时间内施用(在相同或不同的浓度/剂量下)，或者以连续输注使用。组合物的给药途径和频率以及剂量在个体与个体之间可以不同并且利用标准技术可以容易地建立。适宜剂量的进一步精化可以常规进行。适宜剂量可以由本领域技术人员通过利用适当的剂量-反应数据来开发。

适宜的剂量和治疗方案提供了足以提供治疗和/或预防益处的量的活性化合物(一种或多种)。这类反应可以通过在治疗患者中建立与未治疗患者相比的改善的临床结果(例如，在靶向区域的血管数量减少，肿瘤大小或体积减小)来监控。典型地，合适的剂量是这样的化合物量：其当如本文所述被施用时，能够促进抗血管生成反应，和/或至少高于基础或未治疗水平10-50％。

在一些实施方式中，本发明组合物的最有效的给药方式和剂量方案取决于疾病的严重度和病程、患者的健康情况和对治疗的反应、以及治疗医师的判断。因此，本发明组合物的剂量应当针对个体患者进行调节。化合物的有效剂量在约0.1ug/kg/天至约40mg/kg/天的范围内。AA靶向化合物可以以约0.1mg/kg体重至约15mg/kg体重的日静脉关注施用。因此，一个实施方式提供了约0.5mg/kg体重的剂量。另一实施方式提供了约0.75mg/kg体重的剂量。另一实施方式提供了约1.0mg/kg体重的剂量。另一实施方式提供了约2.5mg/kg体重的剂量。另一实施方式提供了约5mg/kg体重的剂量。另一实施方式提供了约10.0mg/kg体重的剂量。另一实施方式提供了约15.0mg/kg体重的剂量。AA靶向化合物或药学上可接受的衍生物的剂量应当以大约每天一次至每周2次的间隔使用，或者可选地，以大约每周一次至每月一次的间隔使用。在一个实施方式中，剂量被施用，以获得约0.002mg/ml至30mg/ml的AA靶向化合物或其药学上可接受的衍生物的血浆浓度峰值。这可以通过无菌注射所施用的成分在合适的制剂中的溶液来实现(可以使用化学领域的技术人员已知的任何合适的制剂溶液)。通过连续输注AA靶向化合物可以维持期望的血液水平，这通过由验证的分析方法所测量的血浆水平来确定。

一种向个体施用AA靶向化合物的方法包括向个体施用AA靶向剂-连接子偶联物并使其在体内与适当抗体的结合部位形成共价化合物。体内形成的AA靶向化合物的抗体部分可以在使用靶向剂-连接子偶联物之前、同时或之后被施用给个体。如已经讨论的，AA靶向剂可以包括连接子/反应部分，或者抗体结合部位可以被适当地改性以与该靶向剂共价结合。可选地，或者另外，抗体在利用适当的免疫原免疫接种后可以存在于个体的循环中。例如，催化抗体可以通过用与载体蛋白偶联的底物的活性中间体免疫接种后而产生。参见R.A.Lerner和C.F.Barbas 3^rd，Acta Chem.Scand.50：672-678(1996)。特别地，醛缩酶催化抗体可以通过用连接至二酮部分的匙孔血蓝蛋白控制而产生，如由P.Wirsching等，Science 270：1775-1782(1995)(commenting onJ.Wagner等，Science 270：1797-1800(1995))所述。

本发明也提供在组织和细胞中显现或定位Ang-2或抗血管生成剂(即AA-靶向剂受体)的方法。在一个实施方式中，可以检查活体解剖组织中AA靶向剂受体的存在。在另一实施方式中，通过向对象施用包含可检测标记的AA靶向剂或化合物可以使该对象中的新血管形成成像。如本文所用，术语″可检测标记″是指可以被体内施用并随后被检测的任何分子。示例性的可检测标记包括放射性标记和荧光分子。示例性放射性核素包括铟-111、锝-99、碳-11和碳-13。荧光分子包括而不限于荧光素、异藻蓝蛋白、藻红蛋白、若丹明和德克萨斯红。

联合治疗

肿瘤内的脉管系统通常经历活跃的血管生成，这导致新血管不断的形成而支持生长的肿瘤。此类血管原性血管区别于成熟的脉管系统，原因在于血管原性脉管系统表达单内皮细胞表面标志，包括整联蛋白(Brooks，Cell 79：1157-1164(1994)；WO 95/14714，Int.Filing DateNov.22，1994)以及生血管生长因子的受体(Mustonen和Alitalo，J.CellBiol.129：895-898(1995)；Lappi，Semin.Cancer Biol.6：279-288(1995))。

本发明也包括与一种或多种肿瘤疗法联合施用一种或多种AA靶向剂，每一种按照适合该治疗的方案来使用。联合治疗的组分可以同时或不同时施用。如本文所用，术语″同时施用″和″共同施用″包括基本上同时的施用一种或多种AA靶向化合物和一种其它的肿瘤疗法。

如本文所用，术语″不同时″施用包括在不同的时间、以任何顺序施用一种或多种AA靶向化合物，无论与否重叠。这包括但不限于利用联合的组分进行连续治疗(诸如预治疗、后治疗或交错治疗)，以及药物被交替的方案，或者一种组分被长期施用而其它(一种或多种)被间歇施用的方案。组分也可以以同一组合物或分开的组合物施用，以及可以通过相同或不同的给药途径施用。

可以与AA靶向化合物联合使用的合适的肿瘤疗法和并用药物列举在表4-6中。

表4：批准的肿瘤药物和适应症

表5：临床上的高级抗血管生成化合物

表6：用在肿瘤中的联合治疗

本发明的多功能性通过下面的实施例阐述，所述实施例阐述的本发明的典型实施方式并且不以任何方式限定权利要求书或说明书。

实施例

实施例1：示例性化合物的合成：

方案1.利用Fmoc化学的肽链的固相合成

实施例2：如在实施例1制备的肽从树脂的断裂。

肽从树脂的断裂

实施例3：如在实施例2制备的化合物与连接子的偶联。

连接子的偶联

实施例4：下式所示结构的合成提供在图12中。

实施例5：下式所示结构的合成提供在图13中。

实施例6：下式所示结构的合成提供在图14中。

实施例7：下式所示结构的合成提供在图15中。

实施例8：下式所示结构的合成提供在图16中。

实施例9：下式所示结构的合成提供在图17中。

实施例10：下式所示结构的合成提供在图18中。

实施例11：下式所示结构的合成提供在图19中。

实施例12：下式所示结构的合成提供在图20中。

实施例13：下式所示结构的合成提供在图21中。

实施例14：下式所示结构的合成提供在图22中。

实施例15：下式所示结构的合成提供在图23中。

实施例16：下式所示结构的合成提供在图24中。

实施例17：下式所示结构的合成提供在图25中。

尽管该实施例使用实施例12的化合物，但是其也能充分使用实施例13的化合物。此外，尽管该实施例显示与N-端的键合，但是在实施例12和13的化合物的左侧上的游离酸也可以被连接至肽上的任何亲核侧链，诸如C、K、S、T或Y侧链。同样如在本实施例中所示，在实施例12和13的化合物的右侧上的Fmoc保护的氨基被用于通过酰胺键连接于识别基团Y。

实施例18：下式所示结构的合成提供在图26中。

尽管该实施例使用实施例15的化合物，但是其也能充分使用实施例14和16的化合物。此外，尽管该实施例显示与N-端的键合，但是在实施例14-16的化合物的左侧上的游离酸也可以被连接至肽上的任何亲核侧链，诸如C、K、S、T或Y侧链。同样如在本实施例中所示，在实施例14-16的化合物的右侧上的游离酸被用于通过酰胺键连接于抗体识别基团Y。

实施例19：下述物质的合成

3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-叔丁氧羰基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]乙氧基}-丙酸叔丁酯

标题化合物利用经报道的方法来制备(O.Seitz和H.Kunz，J.Org.Chem.62：813-826(1997))。将小片金属钠加至四(乙二醇)(47.5g，244mmol)的THF(200ml)溶液中并搅拌直到钠完全溶解。然后加入丙烯酸叔丁酯(94g，730mmol)并在室温持续搅拌2天。加入另一批丙烯酸叔丁酯(94g，730mmol)并持续再搅拌2天。反应混合物用几滴1 N HCl中和并在减压下浓缩。残余物被悬浮在水中并用乙酸乙酯(3×150ml)萃取。合并的有机层用盐水洗涤并经硫酸钠干燥。挥发物经减压蒸发产生为无色液体的粗产物，其利用硅胶柱纯化(42g，51％)。

实施例20：下述物质的合成

3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-羧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸

在冰浴中冷却3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-叔丁氧羰基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸叔丁酯(6g，18.6mmol)的苯甲醚(20ml)溶液，并加入三氟乙酸(65g)。在室温3hrs之后，挥发物在减压下被移除，并将残余物在乙酸乙酯(50ml)与5％碳酸氢钠溶液之间分配。水层用1 N HCl酸化，用NaCl饱和，然后用乙酸乙酯(3×50ml)萃取。合并的有机层用盐水洗涤并经硫酸钠干燥。减压下去除挥发物得到为无色液体的产物，其在冷藏之后固化(3.8g，82％)。

实施例21：下述物质的合成

3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{2-[2-(2-甲基-[1，3]二氧戊环-2-基甲基)-[1，3]二氧戊环-2-基]-乙基}-苯基氨基甲酰)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸

将来自实施例20的化合物(0.6g，1.8mmol)溶解在二氯甲烷10ml)和4-{2-[2-(2-甲基-[1，3]二氧戊环-2-基甲基)-[1，3]二氧戊环-2-基]-乙基}-苯胺(0.3g，1.4mmol)中之后在室温加入EDCI(0.28g，1.8mmol)。室温1小时之后，用水洗涤RM并经硫酸钠干燥。挥发物蒸发并在利用二氯甲烷中的1至15％甲醇的硅胶柱上纯化产生胶状的标题化合物(0.47g，32％)。

实施例22：下述物质的合成

4-{2-[2-(2-甲基-[1，3]二氧戊环-2-基甲基)-[1，3]二氧戊环-2-基]-乙基}-苯胺

向经烘箱干燥的干净烧瓶中装入6-(4-硝基-苯基)-己烷--2，4-二酮(3.7g，15.72mmol)、干CH₂Cl₂(20ml)，之后向该烧瓶中加入二TMS乙二醇(38.5ml，157.3ml)，并将得到的溶液在氮气下伴随搅拌冷却至-5℃。向反应混合物中加入TMSOTf(300μl)并将溶液在-5℃搅拌6h。反应用吡啶(10ml)猝灭并倒入饱和NaHCO₃中。混合物用EtOAc萃取，有机层用水、盐水洗涤，干燥(Na₂SO₄)并浓缩，产生黄色固体。用己烷研磨该固体，产生自由流动的浅黄色固体(3.5g，72％)，其被溶解在EtOAc(50ml)中并在帕尔振荡器中以50psi氢气压开始氢化。两小时之后，将反应经过C盐垫过滤，C盐垫用CH₂Cl₂/MeOH充分洗涤，合并的有机物浓缩，产生油状的标题化合物(1.46g，100％)，其在静置后凝固。

实施例23：下述物质的合成

4-[4-(3，5-二氧代-己基)-苯基氨基甲酰基]-丁酸2，5-二氧代吡咯烷-1-酯(10)的合成

步骤1：6-(4-硝基-苯基)-己烷--2，4-二酮(11)

向反应容器(加热并真空干燥，装备有磁旋棒)中加入四氢呋喃和二异丙氨基锂(2M庚烷/乙基苯/四氢呋喃；69.4mL，138.9mmol)。将溶液冷却至-78℃。滴加戊烷-2，4-二酮(7.13mL，69.4mmol)并将溶液在-78℃搅拌30分钟。加入一份4-硝基苄基溴(15.0g，69.4mmol)。将溶液中干冰/丙酮浴中移走，使其升至室温并搅拌16小时。将溶液冷却至大约0℃，并用1M HCl猝灭该反应。减压下去除四氢呋喃。将粗物质溶解到二氯甲烷中并用1M HCl和盐水洗涤。水层用二氯甲烷再次洗涤。合并的二氯甲烷被干燥(Na₂SO₄)并在减压下去除利用5％至15％乙酸乙酯/己烷进行梯度急骤柱层析(FCC)，得到标题化合物(8.5g，52％；黄色固体)。¹H NMR(CDCl₃)：δ8.14(d，J＝9.0Hz，2H)，δ7.43(d，J＝8.4Hz，2H)，δ5.45(s，1H)，δ3.06(t，J＝7.5Hz，2H)，δ2.64(t，J＝7.8Hz，2H)，δ2.04(s，3H)。

步骤2：4-[4-(3，5-二氧代-己基)-苯基氨基甲酰]-丁酸(12)

200mL四氢呋喃、6-(4-硝基-苯基)-己烷--2，4-二酮(8.0g，34.0mmol)和二氢-吡喃-2，6-二酮(3.88g，34.0mmol)被加至反应容器中。该反应容器用氩吹扫三次。加入大约200mg钯(10wt％，在活性碳上)。反应容器再用氩吹扫三次并将过量的氢引入气球中。溶液在室温搅拌16小时。减压下去除氢并通过经C盐过滤去除催化剂。减压下去除四氢呋喃得到标题化合物(10.5g，97％，黄色固体)。

步骤3：4-[4-(3，5-二氧代-己基)-苯基氨基甲酰]-丁酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯(10)

向反应容器(加热并真空干燥，装备有磁旋棒)中加入4-[4-(3，5-二氧代-己基)-苯基氨基甲酰]-丁酸(10.53g，33.0mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(3.8g，33.0mmol)和1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(6.3g，33.0mmol)和二氯甲烷(250mL)。溶液在氮气下于室温搅拌16小时，然后用10％柠檬酸、盐水洗涤并干燥(Na₂SO₄)。减压下去除二氯甲烷。70％乙酸乙酯/己烷的FCC产生标题化合物(7.4g，黄色固体，54％)。¹H NMR(CDCl₃)：δ7.87(s，1H)，δ7.43(d，J＝8.4Hz，2H)，δ7.12(d，J＝8.4Hz，2H)，δ5.46(s，1H)，δ2.89(t(& m)，J＝8.1Hz(for the t)，7H)，δ2.73(t，J＝6.0Hz，2H)，δ2.56(t，J＝7.2Hz，2H)，δ2.47(t，J＝6.9Hz，2H)，δ2.21(p，J＝6.6Hz，2H)，δ2.04(s，3H)。

实施例24：下述物质的合成：

3-{2-[2-(2-{4-[4-(3，5-二氧代-己基)-苯基氨基甲酰]-丁酰氨基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-酯，(20)的合成

步骤1：3-{2-[2-(2-羟基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸叔丁酯

在0℃将Na金属(催化的)加入丙烯酸叔丁酯(6.7mL，46mmol)和2-[2-(2-羟基-乙氧基)-乙氧基]-乙醇(20.7g，138mmol)在THF(100mL)中的搅拌溶液中并将混合物在室温搅拌过夜。去除溶剂并将剩余的油溶解在EtOAc(100mL)中。有机层用水(3×50mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥，真空去除溶剂，产生对应于标题化合物的油状物，其被直接用于下一步。(M+1)＝279。

步骤2：3-{2-[2-(2-甲苯磺酰基磺酰氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸叔丁酯

将对甲苯磺酰氯(22.3g，117mmol)按份加入3-{2-[2-(2-羟基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸叔丁酯(16.3g，58.6mmol)和吡啶60mL的搅拌溶液中(240mL)，并将混合物搅拌过夜。反应用水(300mL)猝灭并分离有机层。水层用CH₂Cl₂(2×100mL)萃取。合并的有机层用HCl(1N，100mL)、水(100mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥，真空去除溶剂，产生对应于标题化合物的油状物，其被直接用于下一步。(M+1)＝433。

步骤3：3-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸叔丁酯

将NaN₃(35g，538mmol)加至3-{2-[2-(2-甲苯磺酰基磺酰氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸叔丁酯(20g，46mmol)在DMF(150mL)中的搅拌溶液中，并将反应搅拌过夜。反应用水(200mL)稀释并用EtOAc(4×100mL)萃取。有机层用水(100mL)和盐水(100mL)洗涤并经Na₂SO₄干燥。真空去除溶剂，产生油状物。柱色谱法EtOAc/Hex(1∶4)产生对应于3-{2-[2-(2-叠氮基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸叔丁酯的油状物，(M+1)＝304。该油状物利用在EtOAc中的Pd(5％，在碳上)在氢下(1atm.)氢化3天。通过过滤去除催化剂，并真空去除溶剂，产生对应于标题化合物的油状物，(M+1)＝278。

步骤4：3-{2-[2-(2-{4-[4-(3，5-二氧代-己基)-苯基氨基甲酰]-丁酰氨基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸叔丁酯

将4-[4-(3，5-二氧代-己基)-苯基氨基甲酰]-丁酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-酯(1.5g，3.6mmol)、3-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸叔丁酯(1.0g，3.6mmol)和DIEA(1.3μL，7.2mmol)的CH₂Cl₂(10mL)溶液在室温搅拌过夜。真空去除溶剂并利用柱色谱法EtOAc/MeOH(95∶5)纯化残余油，产生为透明油状物的标题化合物，(M+1)＝579。

步骤5：3-{2-[2-(2-{4-[4-(3，5-二氧代-己基)-苯基氨基甲酰]-丁酰氨基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-酯

将3-{2-[2-(2-{4-[4-(3，5-二氧代-己基)-苯基氨基甲酰]-丁酰氨基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸叔丁酯(400mg，0.692mmol)溶解在TFA/CH₂Cl₂(1∶1，3mL)中，并将混合物搅拌过夜。去除溶剂，产生为酸性中间体的油状物。将该油状物溶解在含DIEA(569μL，3.09mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(119mg，1.03mmol)和EDC(197mg，1.0mmol)的CH₂Cl₂(4mL)中，并将混合物搅拌过夜。去除溶剂，利用柱色谱法EtOAc/MeOH(95∶5)纯化残余油状物，产生油状物，为标题化合物，(M+1)＝620。

实施例25：AA靶向化合物的合成

实施例17或18的化合物可以通过下述方法与抗体38C2键合：将在磷酸缓冲盐水(10mg/mL)中的1mL抗体38C2加至12μL的10mg/mLAA靶向剂的贮存液中，在使用前将所得到的混合物在室温保持2小时。

实施例26：下述物质的合成提供在图27中。

尽管该实施例使用实施例12的化合物，其也能充分使用实施例13的化合物。

实施例27：

C.Rader，等，J.Mol.Biol.332：889-899(2003)详解了制备h38c2的方法。下述详述了在该参考文献中的结果、材料和方法。

人化Vκ基因DPK-9和人Jκ基因JK4被用作κ轻链可变域的人化的框架，而人VH基因DP-47和人J_H基因J_H4被用作m38C2的重链可变域人化的框架。如由Kabat等定义的所有互补决定区(CDR)残基以及在轻链和重链可变域中的确定框架残基，从m38C2被移植到人框架上。移植框架残基的选择可以基于小鼠mAb 33F12 Fab(PDB 1AXT)的晶体结构。mAb 33F12 Fab在可变域和相同的CDR长度上与m38c2共享92％的序列同源性。此外，33F12和m38C2具有相似的催化活性。框架残基由轻链的五个残基和重链的七个残基组成(图7A)并且包括可能直接或间接m38C2的催化活性的残基。这些包括m38C2的活性赖氨酸Lys^H93，其位于重链的框架区3(FR3)中。六个残基Ser^H35、Val^H37、Trp^H47、Trp^H103和Phe^L98——它们在小鼠mAbs 33F12与38C2之间是保守的，位于Lys^H93ε氨基的5-半径内。这些残基在人化中也是保守的。Lys^H93位于小鼠mAbs 33F12和38C2的高疏水性底物结合部位的底部。除CDR残基之外，很多框架残基位于该袋中。在这些残基中，Leu^L37、Gln^L42、Ser^L43、Val^L85、Phe^L87、Val^H5、Ser^H40、Glu^H42、Gly^H88、Ile^H89和Thr^H94被移植到人框架上。

表达

通过融合人化可变域与人恒定域C_κ和C_γ11，h38C2最初作为在大肠杆菌中表达的Fab而产生。接下来，利用被工程用于在哺乳动物细胞中的人IgG1表达的PIGG载体，h38c2 IgG从h38c2 Fab形成。使来自瞬时转染的人293T细胞的上清液在重组蛋白质A上经历亲合色谱法，产生大约1mg/L h38C2 IgG1。通过SDS-PAGE之后考马斯蓝染色确立纯度。

β-二酮化合物

通过β-二酮与m38c2共价加成形成的烯胺酮具有在λ_max＝318nm处的特征UV吸光度。如同m38C2 IgG，h38C2 IgG在用β-二酮温育后显示特征烯胺酮吸光度。作为阴性对照，具有相同的IgG1同种型作为h38C2但是无活性赖氨酸的重组人抗-HIV-1 gp120 mAb b12在用β-二酮温育后不显示烯胺酮吸光度。对于β-二酮与m38C2和h38C2结合的定量比较，作者使用了竞争性ELISA。抗体用浓度增加的β-二酮2和3温育，并针对固定的BSA-偶联的β-二酮1进行测试。表观平衡解离常数对于β-二酮2是38μM(m38C2)和7.6μM(h38C2)，对于β-二酮3是0.43μM(m38C2)和1.0μM(h38C2)，这表明对于小鼠和人化抗体而言相似的β-二酮结合特性(图6)。

分子模拟(Molecular modeling)-h38C2 Fab的分子模型通过同源性模拟利用相关酶缩醛抗体小鼠33F12 Fab(Protein Data Bank ID：1AXT)的晶体结构作为模版来构建。小鼠33F12 Fab的晶体结构先前在2.15的分辨率下被测定。⁴利用INSIGHT II软件(Accelrys)内的HOMOLOGY模块比对小鼠33F12和38C2氨基酸序列证实，两个序列是高度同源的。在两个可变域中它们在在226个氨基酸中有19个彼此不同，并且它们的CDR共享相同的长度。除了高的序列同源性，两种结构展示出相当的结构相似性，如通过38C2的低分辨率晶体结构所观察到的。模型中的残基被突变以符合h38C2氨基酸序列，并且侧链基于标准旋转异构体被放置。该模型然后用INSIGHT II中的DISCOVER模块被最小化，采用100分步，每一最速下降最小化(steepest descent minimization)之后是共轭梯度最小化(conjugategradient minimization)。

h38C2 Fab的构建-m38C2的可变轻链域和重链域的序列(分别是SEQ ID NOs：15和16)以及人种系序列DPK-9(SEQ ID NO：17)、JK4(SEQ ID NO：18)、DP-47(SEQ ID NO：19)和JH4(SEQ ID NOs：20、187和188)(V BASE；http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)的序列被用于分别设计人化V_κ和V_H的合成装配的重叠寡核苷酸。避免具有序列NXS/T的N-糖基化位点以及内部限制位点HindIII、Xbal、SacI、ApaI和SfiI。PCR通过利用Expand High Fidelity PCR System(Roche MolecularSystems)来实施。人化V_κ寡核苷酸是：L侧翼有义(flank sense)(Rader，C.，Ritter，G.，Nathan，S.，Elia，M.，Gout，I.，Junbluth，A.A.，J.Biol.Chem.275：13668-13676(2000))(有义

5’-GAGGAGGAGGAGGAGGGCCCAGGCGGCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCTCCA-3’SEQ ID NO：179)；h38C2L1(有义；

5′-GAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGTGACCGCGTCACCATCACTTG-3′)(SEQ ID NO：1)；h38C2L2(反义；

5′-ATTCAGATATGGGCTGCCATAAGTGTGCAGGAGGCTCTGACTGGAGCGGCAAGTGATGGTGACGCGGTC-3′)(SEQ ID NO：2)；h38C2L3(有义；

5′-TATGGCAGCCCATATCTGAATTGGTATCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCTAAGCTCCTGATCTAT-3′)(SEQ ID NO：3)；h38C2L4(反义；

5′-CTGAAACGTGATGGGACACCACTGAAACGATTGGACACTTTATAGATCAGGAGCTTAGGAGACTG-3′)(SEQ ID NO：4)；h38C2L5(有义；

5′-AGTGGTGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGTTCTGGCACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAGTG-3′)(SEQ ID NO：5)；h38C2L6(反义；

5′-GATCTCCACCTTGGTCCCTCCGCCGAAAGTATAAGGGAGGTGGGTGCCCTGACTACAGAAGTACACTGCAAAATCTTCAGGTTGCAG-3′)(SEQ ID NO：6)；L反义侧翼(antisense flank)(C.Rader等，J.Biol.Chem.275：13668-13676(2000)) (反义

5’-GACAGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTGATCTCCACCTTGGTCCCTCC-3’SEQ ID NO：180)。人化V_H寡核苷酸是：H侧翼有义(C.Rader 等，J. Biol. Chem. 275：13668-13676(2000))(有义

5’-GCTGCCCAACCAGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGA-3’SEQ ID NO：181)；h38C2H1(有义；

5′-GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCTTGGTACAGCCTGGCGGTTCCCTGCGCCTCTCCTGTGCAGCCTCTGGCT-3′)(SEQ IDNO：7)；h38C2H2(反义；

5′-CTCCAGGCCCTTCTCTGGAGACTGGCGGACCCAGCTCATCCAATAGTTGCTAAAGGTGAAGCCAGAGGCTGCACAGGAGAG-3′)(SEQID NO：8)；h38C2H3(有义；

5′-TCTCCAGAGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGAGATTCGTCTGCGCAGTGACAACTACGCCACGCACTATGCAGAGTCTGTC-3′)(SEQID NO：9)；h38C2H4(反义；

5′-CAGATACAGCGTGTTCTTGGAATTGTCACGGGAGATGGTGAAGCGGCCCTTGACAGACTCTGCATAGTGCGTG-3′)(SEQ ID NO：10)；h38C2H5(有义；

5′-CAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACGGGCATTTATTACTGTAAAACG-3′)(SEQ IDNO：11)；h38C2H6(反义；

5′-TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCCCTGGCCCCAGTAGCTGAAACTGTAGAAGTACGTTTTACAGTAATAAATGCCCGTG-3′)(SEQ IDNO：12)；H侧翼反义(flank antisense)(C.Rader等，J.Biol.Chem.275：13668-13676(2000))(反义

5’-GACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC-3’SEQ ID NO：182)。在装配之后，人化V_κ和V_H分别与人C_κ和C_γ11融合，并且所得到的轻链和重链片段被融合并SfiI-克隆到嗜菌粒载体pComb3X中，如(C.Rader et al，J.Biol.Chem.275：13668-13676(2000)；C.F.Barbas 3^rd等，Phage Display：A laboratorymanual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor N.Y.(2001))所述。为富集具有正确h38C2序列的克隆，Fab被展示在噬菌体上并通过对与BSA偶联的固定β-二酮1(JW)进行一轮淘洗而进行选择。从单克隆生产可溶性Fab，并通过ELISA利用偶联于辣根过氧化物酶(Jackson ImmunoResearch Laboratories)的驴抗-人F(ab′)₂多克隆抗体作为二抗测试与固定JW-BSA的结合。通过DNA测序利用引物OMPSEQ(5’-AAGACAGCTATCGCGATTGCAG-3’SEQ ID NO：183)和PELSEQ(5’-CTATTGCCTACGGCAGCCGCTG-3’SEQ ID NO：184)(C.F.Barbas 3^rd等，Phage Display：A laboratory manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor N.Y.，(2001))分析阳性克隆的轻链和重链编码序列，以分别证实h38C2的装配V_κ和V_H序列。

h38C2 IgG1的构建、生产和纯化-最近描述的载体PIGG(C.Rader et al，FASEB J.，16：2000-2002(2002))被用于h38C2 IgG1的哺乳动物表达。哺乳动物表达载体PIGG-h38c2被图解在图23中。9kb载体包含由双向CM启动子构建物驱动的重链γ1和轻链κ表达盒。利用引物PIGG-h38C2H(有义；

5′-GAGGAGGAGGAGGAGGAGCTCACTCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTG-3′)(SEQ ID NO：13)和GBACK

(5’-GCCCCCTTATTAGCGTTTGCCATC-3’SEQ ID NO：185)(C.F.Barbas 3^rd et al，Phage Display：A laboratory manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor N.Y.(2001))，在嗜菌粒载体pComb3X中扩增来自h38C2 Fab的VH编码序列，用SacI和ApaI消化，并克隆到适当消化的载体PIGG中。利用引物PIGG-h38C2L(有义：

5′-GAGGAGGAGGAGGAGAAGCTTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGGGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCC-3′)(SEQ ID NO：14)和LEADB(5’-GCCATGGCTGGTTGGGCAGC-3’SEQ ID NO：186)((C.F.Barbas 3^rd et al，Phage Display：A laboratory manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor N.Y.(2001))，在嗜菌粒载体pComb3X中扩增来自h38C2 Fab的轻链编码序列，用HindIII和XbaI消化，并克隆到已经含有h38C2重链的适当消化的载体PIGG中。中间的和最后的PIGG载体构建物在大肠杆菌菌株SURE(Stratagene)中扩增并用QIAGEN Plasmid Maxi Kit制备。通过利用Lipofectamine 2000(Invitrogen)瞬时转染人293T细胞，从所制备的最终PIGG载体构建物生产h38C2 IgG1。转染细胞被保持在RPMI 1640(Hyclone)中的GIBCO 10％超低IgG(＜0.1％)FCS(Invitrogen)中2周。在此期间，收集培养基并置换三次。使所收集的培养基在重组蛋白质A HiTrap柱(Amersham Biosciences)上经历亲合色谱法。该纯化步骤从2,300mL已收集培养基中产生2.45mg h38C2 IgG1，如通过利用EppendorfBioPhotometer在280nm下测量光密度所测定。在Slide-A-Lyzer 10K透析盒(Pierce)中对PBS透析之后，利用Ultrafree-15 Centrifugal FilterDevice(UFV2BTK40；Millipore)将抗体浓缩至760μg/mL，并经过0.2-μm Acrodisc 13MM S-200 Syringe Filter(Pall)无菌过滤。最终产量是2.13mg(87％)。纯化的h38C2 IgG1通过非还原SDS-PAGE之后通过考马斯蓝染色证实。

烯胺酮形成-抗体(h38C2 IgG1或b12 IgG1)被加至β-二酮2至25μM抗体结合部位的终浓度和125μMβ-二酮。该混合物在室温温育10分钟，之后在SpectraMax Plus 384 UV板读数器(Molecular Devices)上利用SOFTmax Pro软件(版本3.1.2)获取UV光谱。

结合测定-除非另外指出，所有溶液是磷酸缓冲盐溶液(pH 7.4)。将β-二酮2或3的2倍溶液(50μL)加至50μL抗体(h38C2或m38C2)中，并使其在37℃温育1hr。通过移液混合溶液。抗体的终浓度是0.4至8nM抗体结合部位，并且β-二酮2和3的终浓度分别是10^-9至10^-2M和10^-10至10^-4M。Costar 3690 96-孔板(Corning)的每个孔被涂覆在TBS中的100ng β-二酮的BSA偶联物。孔然后用TBS中的3％(w/v)BSA封闭。然后，加入50μL抗体/β-二酮混合物，之后加入50μL与辣根过氧化物酶偶联的羊抗-人Fc IgG多克隆抗体(Pierce)或兔抗-鼠Fc IgG多克隆抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories)的1∶1,000稀释。这之后加入50μL ABTS底物溶液。在每次加入之间，板被覆盖，在37℃温育1h，然后用去离子水洗涤五次。如上所述监控405nm处的吸光度，直到无β-二酮的反应达到合适的值(0.5＜A₄₀₅＜1.0)。对于每一孔，ELISA信号(v_i)的相对抑制利用等式i计算：

v_i＝(A_o-A_i)/(A_o) (i)

其中A_o是在不存在β-二酮的情况下获得的ELISA吸光度，以及A_i是在存在β-二酮的情况下获得的吸光度。对于单价结合蛋白质，与可溶性β-二酮(f)结合的抗体部分等于v_i。然而，IgG抗体是二价的，并且ELISA信号仅由双配体抗体的存在而不是由于单价抗体的存在而被抑制。因此，使用二价抗体的Stevens校正：

f_i＝(v_i)^1/2 (ii)

下述关系式被用于测定表观平衡解离常数(从[ref.37]修改)：

f_i＝f_min+(f_max-f_min)(1+K_D/a₀)^-1 (iii)

其中a₀对应于总β-二酮浓度，K_D是平衡解离常数，以及f_min和f_max表示当抗体结合部位分别是未占据或不饱和时的试验测定值。因为该等式仅在K_D值比抗体浓度高至少10倍时有效，因此已经证实，从等式iii测定的K_D值满足该校正。利用KaleidaGraph(版本.0.5，Abelbeck软件)的非线性最小二乘法拟合程序拟合数据，其中K_D、f_max和f_min作为可调参数，并利用等式iv标准化：

f_norm＝(f_i-f_min)/(f_max-f_min) (iv)

实施例28：

Ang-2结合化合物与Ang-2相互作用的能力通过与Tie-2竞争进行测量。

对于竞争性ELISA，人血管生成素-2蛋白质和Tie-2-Fc(R&DSystems)无须载体蛋白而被重构。鼠抗-人Tie-2(Pharmingen)被用作一抗(primary antibody)，而羊抗-鼠-IgG1-HRP(Pierce)被用作二抗。使用来自Pierce的TMB底物。

高结合性半孔板用在50μl PBS中的Ang-2(100ng/孔)温育并在4℃温育过夜。板用洗涤缓冲液(0.1％Tween 20，PBS，pH 7.4)洗涤三次，并用Superblock(Scytek)以100μl/孔在室温(“RT”)封闭1小时。在去除封闭溶液之后，在0.25nM hTie-2-Fc存在下利用Superblock作为稀释剂加入50μl Ang-2结合肽化合物(1uM和5x连续稀释)，并在室温温育2小时。板用洗涤缓冲液洗涤三次。然后，加入50ul在Superblock中稀释的0.1ug/ml鼠抗-人Tie-2。在温育之后，然后加入50ul在Superblock中的羊抗-鼠IgG-HRP的1∶5,000稀释，并在室温温育1小时。在洗涤三次之后，加入50μl(25μl TMB+25μl H₂O₂)，并温育3-5分钟。监控显色并用25μl 2M H₂SO₄终止。测量具有540nm纠正波长的OD450nm。在Prism 4软件(GraphPad)中利用非线性Sigmoidal剂量反应曲线拟合函数计算IC50值(50％的Ang-2-Tie-2结合抑制)。

对于反相竞争性ELISA，使用人Tie-2-Fc、血管生成素-2蛋白质、生物素化抗-人Ang-2抗体和链霉抗生物素HRP(R&D Systems)以及来自Pierce的TMB底物。

高结合性半孔板用在50μl PBS中的Tie-2-Fc(50ng/well)温育并在4℃温育过夜。板用洗涤缓冲液(0.1％Tween 20，PBS，pH 7.4)洗涤三次，并用Superblock以150μl/孔在室温(“RT”)封闭1小时。将板洗涤三次。洗涤后，在50ng/ml(0.83nM)Superblock中的Ang-2存在下加入50μl Ang-2结合肽化合物(1uM，5x连续稀释)，并在室温温育1小时。将板洗涤三次，加入50μl在Superblock中的1μg/ml生物素化抗-Ang-2检测抗体并在室温温育2小时。将板洗涤三次，加入50μl链霉抗生物素HRP(在Superblock中的1∶200稀释)，在室温保持20分钟。将板洗涤三次，加入50μl(25μl TMB+25μl H₂O₂)底物溶液并温育20-30分钟。用25μl 2M H₂SO₄终止显色。测量具有540nm纠正波长的OD450nm。在Prism 4软件中利用非线性Sigmoidal剂量反应曲线拟合函数计算IC₅₀值(50％的Ang-2-Tie-2结合抑制)。

如通过竞争性ELISA测定的示例性Ang-2结合肽化合物的IC50值呈现在表7中。靶向肽加连接子(如在图3或图2和中关于化合物24和25所示)(T)以及经由图3的连接子与抗体(P)连接的靶向肽的IC50值被提供，除非另外说明。在表7中，SEQ ID NOs：21-23的化合物是单独的Ang-2结合肽，其未与连接子或连接子-抗体偶联；SEQID NOs：65和66的化合物是与连接子-抗体偶联的Ang-2结合肽，其中所述连接子是4P(“4”PEG)并且具有图2所示的连接子结构；以及化合物26-63是与连接子-抗体偶联的Ang-2结合肽，其中所述连接子是OP(“O”PEG)并且具有图3所示的连接子结构。化合物24-63与人化醛缩酶抗体h38c2偶联，并且当获得下面所示的数据时，连接子结构示于图2(4P)和图3(OP)中，除另外指出之处。所有示于表中的本发明化合物在N-端用酰基封端，以及在C-端用氨基封端，除另外指出之处(例如化合物26、49、50、51和52)。

在表7中，肽化合物的氨基酸序列被显示，其中连接子OP或4P的位置在连接子所附着的内部氨基酸残基之后的括号内标明。对于SEQ ID NO：67的化合物，N-端“OP”连接子在肽序列的开始处被标出。

例如，表7中的化合物具有下列序列：QAcKY QPL DEL DK(4P)TLYD QFM LQQ G(SEQ ID NO：65)。在该实施例中，第二氨基酸残基是ε酰基赖氨酸，之后是酪氨酸，连接位置(在这种情况下是4P连接子)是赖氨酸残基11，之后是苏氨酸。此外，化合物52具有下述序列：(酰胺2-PEG)QAcKY QPL DEL DK(0P)T LYD QFMLQQ G(SEQ ID NO：93)。在这种情况下，N-端谷酰胺残基由酰胺基-2-PEG基团封端，第二氨基酸残基是ε酰基赖氨酸，并且OP连接子附着至赖氨酸残基11。

表7和8也显示了半衰期(T¹/₂)和“筛选”半衰期(括号中的结果)：这实际上是基于较短的测试周期测定T¹/₂的可选方法。对于“筛选”T¹/₂，测试化合物被静脉内施用于雄性Swiss Webster小鼠中。在下述时间点，每时间点从4只小鼠中经由眶后窦血(retroorbital sinus bleed)采血样：0.08、5和32小时。通过ELISA测定测试化合物的血液水平。数据被报告为32小时比5分钟下的测试化合物百分比。在利用WinNonlin版本.1(Pharsight Corporation)进行另外的数据分析之后，以相似的方式计算正常T¹/₂。使数据与基于曲线形状的模型拟合(即，二指数递减(bi-exponential decline)将与二室模型拟合等)。最佳拟合(即最低的％CV)的标准基于迭代的重加权最小二乘法。

表7

如通过反相竞争性ELISA测定的示例性Ang-2结合肽化合物的IC50值呈现在表8中。提供了靶向肽加连接子(如在图3中所示)以及通过图3的连接子与抗体(P)连接的靶向肽的IC50值，除非另外说明。在表8中，化合物与人化醛缩酶抗体h38c2偶联，并且连接子结构示于图3中(OP)。

表8

平截研究(TRUNCATION STUDY)

重组人Ang-2在0.5μg/mL以100μL涂敷在微量滴定板上，在2-8℃过夜。在所有步骤之间洗涤板并且所有随后的温育发生在室温。板用250Ml/孔的SuperBlock封闭1-3小时。测试化合物以10ng/mL与连接于连接子(如图3所示)和h38c2的化合物43预混合。然后将100μL的肽混合物在所列举的终浓度下加入，密封板，并温育1-2小时。结合的化合物43利用100μL HRP-标记的抗-人IgG试剂的1∶20,000稀释检测1-2小时。最后，加入100μL TMB底物10分钟，反应用100μL 2N H₂SO₄终止溶液(stop solution)终止。然后在450nm对板进行读数，在650nm下校正(IC50值示于表9中)。

表9

异种移植研究

Colo205细胞用10％ FBS RPMI培养基培养，并且在0.1ml汉克(氏)平衡盐溶液(HBSS)中的3×10⁶个细胞被皮下注射到裸鼠的上右侧肋(upper right flank)中。7-9天之后，动物随机分成适当数目的组，其中平均肿瘤大小为200-300mm³。然后用规定量的本发明化合物处理小鼠，并且一周测量肿瘤体积两次。一旦其平均肿瘤体积达到2000mm³，则动物被处死。处死后，称重肿瘤并保存，用于进一步的组织学研究。通过测量处理组与对照组在肿瘤体积上的差异评价处理功效。结果报告为％T/C，其中％T/C被计算为：％T/C＝(Vt-V0)/(Ct-C0)×100，其中V0和Vt是处理组在该组开始和结束时的平均肿瘤体积。C0和Ct是对照组在该组开始和结束时的平均肿瘤体积(表10)。

表10：

实施例29：下述结构的合成提供在图28中。

本发明因此已经参考上述代表性实施方式被广泛地公开和阐述。本领域技术人员理解，可以对本发明进行各种修改而不背离其精神和范围。所有的出版物、专利申请以及授权的专利在此通过引用而并入，其程度如同每一单独的出版物、专利申请或授权专利被特定且单独地表明通过引用而以其全部并入。通过引用并入的文本中所包含的定义在其与本公开的定义抵触程度上被排除。

应当理解，本发明的一些特征——其为清楚起见在分开的实施方式的情况下予以描述，也可以组合起来在单个实施方式中提供。相反，本发明的各种特征——其为简短起见在单个实施方式的环境下予以描述，也可以单独提供或以任何合适的亚组合来提供。

特别考虑的是，关于本发明的一个实施方式所讨论的任何限定可适用本发明的任何其它实施方式。此外，本发明的任何组合物可以被用在本发明的任何方法中，并且本发明的任何方法可以被用于产生或利用本发明的任何组合物。特别地，在权利要求中所述的本发明的任何方面，单独的或与一种或多种另外的权利要求和/或本说明书的方面结合，应当被理解为与在权利要求书和/或说明书中其它地方阐述的本发明的其它方面可以组合。

在权利要求中术语″或(or)″应用被用于指″和/或″，除非明确表明仅仅指可选物或者可选物相互排斥，尽管本公开支持仅指可选物以及″和/或″的定义。

如本文说明书中所用，″一(a)″或″一个(an)″可以意指一个或多个，除非另外明确指出。如在本文权利要求(一个或多个)中所用，当与词语″包括″一起使用时，词语″一个″或″一个″可以意指一个或多于一个。如本文所用，″另一个″可以指至少第二个或多个。

词语“包括/包含”和词语“具有/含有”当关于本申请在此使用时被用于说明所述特征、整数、步骤或组分的存在，但是不排除一种或多种其它特征、整数、步骤、组分或其组别的存在或添加。

Claims

1.一种抗血管生成(AA)靶向剂，其包含肽，所述肽由以下序列构成：

R¹-Q¹(A_cK)²Y³Q⁴P⁵L⁶D⁷E⁸(A_cK)⁹D¹⁰K¹¹T¹²L¹³Y¹⁴D¹⁵Q¹⁶F¹⁷M¹⁸L¹⁹Q²⁰Q²¹G²²-R²

其中

R¹是C(O)CH₃；和

R²是NH₂，且其中

K¹¹能直接或经由中间连接子而共价键合至抗体的结合部位。

2.一种化合物，其具有下式：

L-[AA靶向剂]或

L’-[AA靶向剂]

其中：

[AA靶向剂]是如权利要求1所述的AA靶向剂，且

L是具有式-X-Y-Z-的连接子部分，且L’是具有式-X-Y-Z’的连接子部分，并且其中：

X经由K¹¹的侧链而附着至所述AA靶向剂，并且是生物相容的连接链，其包括选自C、H、N、O、P、S、F、Cl、Br和I的任何原子并且能够包含聚合物或嵌段共聚物，

Y是任选存在的识别基团，其至少包含环结构；和

Z是能够与抗体结合部位中的氨基酸侧链形成共价键的反应基团，且

3.根据权利要求2所述的化合物，其中所述环结构Y具有下述任选取代的结构：

其中a、b、c、d和e独立地为碳或氮；f是碳、氮、氧或硫；Y在具有足够化合价的任何两个环位置独立地附着至X和Z；并且a、b、c、d、e或f中不超过四个同时为氮。

4.如权利要求3所述的化合物，其中所述环结构中的a、b、c、d和e均是碳。

5.如权利要求4所述的化合物，其中Y是苯基。

6.如权利要求2所述的化合物，其中Z当存在时具有下述结构：

并且其中Z′当存在时具有下述结构：

其中q＝0-5，并且抗体-N-当存在时是与抗体结合部位中侧链的共价键。

7.如权利要求2所述的化合物，其中：

X是：

其中v和w选择为使得X的主链长度是6-12个原子。

8.如权利要求7所述的化合物，其中X-Y是：

v＝1或2；w＝1或2；R^b是氢。

9.如权利要求2所述的化合物，其中所述化合物具有下式：

10.如权利要求2所述的化合物，其中所述Z基团与抗体结合部位共价连接。

11.如权利要求10所述的化合物包括下述结构：

12.如权利要求10所述的化合物，其中所述抗体是催化抗体。

13.如权利要求12所述的化合物，其中所述催化抗体是醛缩酶催化抗体。

14.如权利要求10所述的化合物，其中所述抗体包含来自h38c2的V_H和V_L结构域，并且

(i)是Fab、Fab’、F(ab’)₂、F_v、dsF_v、scF_v、双特异性抗体或微抗体；

(ii)或者是全长抗体；

(iii)或者包含选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恒定域的抗体。

15.如权利要求14所述的化合物，其中所述抗体是h38C2 IgG1。

16.如权利要求15所述的化合物，其中所述抗体包括SEQ ID NO：189和SEQ ID NO：190。

17.一种药物组合物，其包括治疗有效量的如权利要求1所述的AA靶向剂。

18.如权利要求17所述的药物组合物还包括治疗有效量的一种或多种化学治疗剂。

19.如权利要求18所述的药物组合物，其中所述化学治疗剂选自5-氟脲嘧啶、依立替康、奥沙利铂、贝伐单抗和西妥昔单抗的化合物。

20.一种药物组合物，其包括治疗有效量的如权利要求2所述的化合物。

21.如权利要求20所述的药物组合物，还包括治疗有效量的一种或多种化学治疗剂。

22.如权利要求21所述的药物组合物，其中所述化学治疗剂选自5-氟脲嘧啶、依立替康、奥沙利铂、贝伐单抗和西妥昔单抗的化合物。

23.一种药物组合物，其包括治疗有效量的如权利要求16所述的化合物。

24.如权利要求23所述的药物组合物，还包括治疗有效量的一种或多种化学治疗剂。

25.如权利要求24所述的药物组合物，其中所述化学治疗剂选自5-氟脲嘧啶、依立替康、奥沙利铂、贝伐单抗和西妥昔单抗的化合物。