PT94732B - Processo para a preparacao de composicoes contendo um polipeptido da proteina morfogenetica do tecido osseo - Google Patents

Description

A invenção refere-se à proteína morfogenética do tecido ósseo (BMP) que inicia o crescimento de cartilagens e do tecido ósseo. E revelada a sequência de comprimento total que codifica a BMP, um polipeptideo. A BMP é obtida por isolamento a partir de fontes de tecido ósseo e por meio de síntese, usando para tal técnicas de MÍN recombinante.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO z

E sabido que a matriz de tecido ósseo desmineralizado induz a nova formação de novo tecido ósseo quando implantada em tecidos moles, através de um processo normalmente designado como formação de tecido ósseo induzida pela matriz (ver Urist, M.R., Science, 150: 893-899 (1965)). Têm-se feito numerosos esforços para extrair e identificar a substância activa (ou substâncias) que induzem este processo, e tem sido normalmente referida na literatura como proteína(s) morfogenética do tecido ósseo (BMP). Não se sabe ao certo se a BMP é uma substância única ou se é uma mistura de substâncias, e não parece haver acordo entre os investigadores quanto à substância, ρ /ίν, se existir, que constitui a proteína morfogenética do tecido ósseo. Tal como aqui é discutido, o termo BMP é usado para descrever a proteína que possui a sequência de aminoácidos apresentada na figura 3 (BMP bovina) ou na figura 5 (BMP humana), isenta de peptídeo sinal.

uso terapêutico da BMP oferece vantagens consideráveis sobre o uso tradicional de materiais de enxerto ósseo. Embora não se pretenda limitar-se a qualquer teoria, uma hipótese parte do princípio que a BMP inicia a diferenciação de células de tecido em osteoblastos (células que produzem tecido ósseo). Durante um processo que replica o desenvolvimento fetal humano normal, os osteoblastos induzidos pela BMP formam cartilagens que, durante um período de várias semanas, originam tecido ósseo sólido. Logo, a BMP pode ser útil para substituição de tecido ósseo que tenha sido destruído por doença ou acidente, para uso no tratamento de vitimas de escoliose, para tratamento de malformações ou deformações ósseas, para uso na soldagem de uma fractura, reconstrução dental, substituição da bacia, remodelação de tecido ósseo, e controlo da osteoporose.

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E portanto um objectivo da presente invenção produzir uma cartilagem funcional e um factor de crescimento ósseo, ou um seu componente, que seja uma proteína identificada pela sua sequência completa de aminoácidos, que possui a actividade da BMP.

Um outro objectivo da presente invenção é produzir esta proteína BMP biologicamente activa por meio de tecnologia de ADN recombinante.

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SUMARIO DA INVENÇÃO

A presente invenção revela uma classe de proteínas maturas naturais de mamíferos, aqui denom.ina.das como proteína morfogenética de tecidos ósseos ou BMP, exemplificadas pelas sequências de BMP bovinas e humanas naturais aqui descritas. Geralmente, esta classe de proteínas induz o crescimento do tecido ósseo in vivo ou in vitro. As sequências de BMP humanas e/ou bovinas são representativas da classe, e podem ser usadas para identificar e isolar outras proteínas BMP de mamíferos, que serão, pelo menos, parcial ou substancialmente homólogas nas sequências de aminoácidos e de nucleotídeos. Os peritos na técnica serão capazes de identificar prontamente outras BMPs de mamíferos, baseadas na homologia de sequências com as proteínas humanas e bovinas aqui reveladas, bem como na actividade biológica. Reconhece-se que podem existir variantes alélicas da BMP dentro de uma espécie, e estas variantes alélicas estão também dentro do âmbito da classe de proteínas desenvolvidas pela presente invenção.

A presente invenção revela ainda polipeptideos que são análogos à BMP, tais como as muteínas de BMP, proteínas de fusão que compreendem BMP ou domínios da BMP, e fragmentos de BMP. Os análogos preferidos possuem actividade de BMP. A muteína de BMP é uma proteína substancialmente homóloga a uma sequência natural de BMP (por exemplo, uma homologia mínima de cerca de 75%, 85%, 90% ou 95%) em que pelo menos um dos aminoácidos é diferente. 0 termo proteína de fusão inclui uma proteína que compreende uma sequência de BMP completa, ou um domínio de BMP, e uma sequência heteróloga como grupo N- ou C-terminal (tal como uma sequência sinal ou uma sequência que protege a proteína de degradação). Um fragmento ou domínio de BMP é uma sequência de aminoácidos de comprimento suficiente, obtida a partir da proteína BMP, que é identificável como tendo sido derivada a partir dessa proteína BMP. A origem de um peptídeo específico pode ser determinada, por exemplo, comparando a sua sequência com as de bases de dados públicas.

A presente invenção revela ainda, numa outra forma de realização, a BMP que possui a sequência de aminoácidos apresentada nas figuras 3 e 5 (que também mostram o peptídeo sinal). A presente invenção também revela processos para a preparação da BMP por meio de técnicas de ADN recombinante.

Numa outra variante de realização, a presente invenção revela a sequência de ADN que codifica a BMP ou os seus análogos, que pode ser usada na construção de vectores para expressão em sistemas hospedeiros por meio de técnicas de ADN recombinante.

A presente invenção revela ainda, numa outra forma de realização, composições terapêuticas que compreendem BMP e opcionalmente factoosteoindutivos associados, tais como a proteína Gla de matriz (MGP) e o factor de calcificação do tecido ósseo (BCF), e processos para a formação de tecidos cartilagíneo e ósseo em vertebrados pela introdução in vivo, no sítio desejado, de uma quantidade de BMP efectiva na iniciação do crescimento de tecido ósseo. A identidade de MGP foi primeiramente registada por Price, (Jrist e Otawara em Biochem. Biophys Res. Cofflm. 117: 765-771 (1983). A identidade do BCF é revelada na Memória Descritiva da Patente Americana copendente No. 360.826, depositada a 2 Junho de 1989.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A fig. 1 mostra as sequências de aminoácidos de oito

peptídeos provenientes da digestão tríptica da BMP de bovinos;

A Figura 2 mostra ADN e sequências de aminoácidos de duas regiões que compreendem exões do gene de BMP de bovino;

A Figura 3 mostra a sequência de nucleotídos de cADN da BMP de bovino e a sequência de aminoácidos deduzida do polipeptideo precursor;

As Figuras 4a a 4c mostram as sequências das regiões que compreendem exões do gene de BMP humano;

A Figura 5 mostra a sequência de nucleotídos do BMP humano e da sequência de aminoácidos deduzida do polipeptideo percursor.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

A BMP de acordo com a presente invenção pode ser obtida, isenta de outros factores osteoindutivos associados, directamente a partir de fontes ósseas, por síntese preparativa de peptídeos usando processos químicos (tal como o método de síntese de Merrifield) ou por meio de tecnologia de ADN recombinante.

Tal como mais minuciosamente é descrito no Exempio 1, a BMP pode ser obtida a partir de extractos de tecido ósseo, parcialmente purificados, humanos, bovinos ou de outros vertebrados, por meio de electroporese por gel preparativa e electroeluição da proteína.

As sequências dos ácidos nucleicos da BMP podem ser obtidas por meio de métodos de ADN recombinante, tal como selecção das transcrições inversas de mARN, ou por selecção das bibliotecas genómicas de qualquer célula. 0 ADN pode também ser obtido sintetizando o ADN usando as técnicas disponíveis comuns e os dispositivos de síntese de ADN comuns. A síntese pode ser vantajosa porque podem ser introduzidos os sítios de restrição únicos na altura de preparação do ADN, facilitando assim o uso do gene em vectores que contêm sítios de restrição que doutra forma não estão presentes em fontes naturais. Além disso, qualquer modificação do sítio desejada no ADN pode ser introduzida por síntese, sem a necessidade de modificar posteriormente o ADN por mutagénese.

Em geral, o ADN que codifica a BMP pode ser obtido a partir de fontes humanas, bovinas ou de outras fontes construindo uma biblioteca de cADN a partir de mARN isolado de tecidos de vertebrados; e seleccionando com amostras de ADN marcado que codificam porções de cadeias humanas ou bovinas no sentido de detectar clones na biblioteca de cADN que possuem sequências homólogas; ou por amplificação do ADNc através de reacções em cadeia de polimerase (PCR) (a partir de mARN) e subclonado e seleccionado com amostras de ADN marcado; e analizando então os clones por análises com enzimas de restrição e sequenciando os ácidos nucleicos no sentido de identificar os clones de comprimento total e, se não estiverem presentes os clones de comprimento total na biblioteca, recuperando os fragmentos apropriados dos vários clones e ligando-os nos sítios de restrição comuns aos clones para ligar os clones que codificam a molécula de comprimento total. As amostras de ADN particularmente preferidas são apresentadas nos exemplos anexos. Qualquer sequência ausente na extremidade 5' do cADN da BMP pode ser obtida pela extensão de 3' dos oligonucleótidos sintéticos complementares às sequências de BMP usando mARN como um padrão (a denominada extensão primária), ou sequências homólogas podem ser fornecidas a partir de cADN conhecidas derivados de sequências humanas ou bovinas, como se mostra nas Figuras 3 ou 5.

Α prática da presente invenção usará, a não ser que de outra forma se indique, biologia molecular convencional, microbiologia, e técnicas de ADN recombinante conhecidas pelos peritos na técnica. Tais técnicas estão plenamente documentadas na literatura. Ver, por exemplo, Maniatis, Fritsch & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982);

DNA Cloning: A Praticai Approach Vol. I e II (D.N. Glover ed. 1985); 01 igonucleoti.de Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1985); Transcription And Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984).

Na descrição da presente invenção será usada a terminologia que se seguir, de acordo com as definições abaixo apresentadas .

termo factores osteoindutivos associados inclui factores conhecidos na técnica que estão presentes no tecido ósseo de mamíferos ou em outros tecidos de mamíferos e têm como objectivo co-purificar com BMP ou a actividade da BMP. Tais factores incluem, mas não se limitam a, proteínas que tenham sido isoladas a partir de tecido ósseo e que possuem os pesos moleculares relativos indicados, por migração em SDS-PAGE de 34KD, 24KD, 18,5KD, 17,5KD, 16,5KD, 14KD (tal como é citado na Memória Descritiva da Patente Americana No. 4.761.471), e 6KD (relatado por Price, P.A., et al., do Prot. Natl, Acad. Sei., 73, págs 1447-1451, 1976). Todos os pesos moleculares observados são aqui registados como pesos moleculares relativos por migração em gel SDS-PAGE.

Um replicão é qualquer elemento genético (por exemplo plasmideo, cromossoma, vírus) que funciona como uma unidade autónoma de replicação de ADN in vivo; isto é, capaz de replicação sob o seu controlo próprio.

Um vector é um replicão, tal como um plasmideo, fago ou cosmídeo, ao qual pode ser ligado um outro segmento de ADN para conduzir à replicação do segmento ligado.

Uma molécula de ADN refere-se à forma polimérica de desoxiribonucleótidos (adenina, guanina, timina, ou citosina) tanto na sua forma de cadeia única ou em forma de dupla cadeia em hélice. Este termo refere-se apenas à estrutura primária e secundária da molécula e não a limita a qualquer forma terceária particular. Deste modo, este termo inclui ADN de dupla cadeia encontrado, inter alia, em moléculas de ADN linear (por exemplo fragmentos de restrição), vírus, plasmídeos e cromossomas. Ao discutir a estrutura das moléculas específicas de ADN de dupla cadeia, as sequências podem ser aqui descritas de acordo com a convenção geral de dar apenas a sequência na direcção de 5' para 3' ao longo da cadeia não transcrita de ADN (isto é, a cadeia que possui uma sequência homóloga ao mARN).

Uma sequência que codifica ADN é uma sequência de ADN de dupla cadeia que é transcrita e traduzida num polipeptideo in vivo quando é colocada sob o controlo de sequências regulatórias apropriadas. As fronteiras da sequência que codifica são determinadas por um codão de iniciação na extremidade 5' (amino) e um codão de terminação de tradução no extremo 3^r(carboxi). Uma sequência que codifica pode incluir, mas não se limitam a, sequências procarióticas, cADN do mARN eucariótico, sequências de ADN genómico de ADN eucariótico (por exemplo, de mamíferos), e eventualmente sequências de ADN sintéticos. Um

sinal de poliadenilação e uma sequência de terminação de transcrição estarão normalmente localizados no extremo 3' da sequência que codifica.

As sequências de controlo de transcrição e tradução são sequências de ADN regulatórias, tais como promotores, intensificadores, sinais de poliadeni1 ação, terminadores, e semelhantes, que proporcionam a expressão de uma sequência que codifica numa célula hospedeira.

Uma sequência promotora é uma região regulatória de ADN capaz de ligar a polimerase de ARN numa célula e de iniciar a transcrição de uma sequência que codifica em sentido descendente (na direcção de 3'). Para fins de defenição da presente invenção, a sequência promotora é ligada à sua extremidade 3' pelo sítio de iniciação de transcrição e extende-se em sentido ascendente (na direcção de 5') de modo a incluir o número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar a transcrição a níveis detectados acima do nível básico. Dentro da sequência promotora encontrar-se-á um sítio de iniciação de transcrição (convenientemente definida por planeamento com nuclease S1), bem como com domínios que ligam proteínas (sequências de consenso) responsáveis pela ligação da polimerase de ARN. Os promotores eucarióticos compreenderão ferquentemente, mas nem sempre, caixas TATA e caixas CAT. Os promotores procarióticos contêm sequências Shine-Dalgarno em adição às sequências de consenso -10 e -35.

Uma sequência que codifica está sob controlo das sequências de controlo de transcrição e tradução numa célula quando a polimerase de ARN transcreve a sequência que codifica para o mARN, que é então transcrito para a proteína codificada pela sequência que codifica.

Uma sequência sinal pode ser incluída antes da sequência que codifica. Esta sequência codifica um peptideo sinal, N-terminal em relação ao polipeptídeo, que ordena à célula hospedeira que dirija o polipeptídeo para a superfície da célula, ou que segregue o polipeptídeo para o meio, e este peptideo sinal é expulso pela célula hospedeira antes que a proteína deixe a célula. As sequências sinal podem ser encontradas associadas a uma variedade de proteínas naturais dos procariotes e eucariotes. Por exemplo, o factor alfa, a proteína natural de leveduras, é segregada pela levedura, e a sua sequência sinal pode ser ligada a proteínas heterólogas para serem segregadas no meio (ver a Patente Americana 4.546.082. EPO 0 116 201, cuja data de publicação é 12 de Janeiro de 1983; pedido de Patente Americana No. 522.909, depositada em 12 de Agosto de 1983). Além disso, descobriu-se que o factor-alfa e os seus análogos segregam proteínas heterólogas de uma diversidade de leveduras, tais como Saccharomyces e Kluyveromices, (EPO 88312306.9 depositada a 23 de Dezembro de 1988; Memória Descritiva da Patente Americana No. 139.682 depositada a 30 de Dezembro de 1987, e a Publicação EPO No. 0 301 669 publicação datada de 1 de Fevereiro de 1989).

Uma célula foi transformada por ADN heterólogo ou exógeno quando esse ADN tiver sido introduzido dentro da célula.

ADN transformador pode ser ou não integrado (ligado por covalência) no ADN cromossómico formando o génome da célula. Em células procariotes, leveduras e células de mamíferos, por exemplo, o ADN transformante pode ser mantido num elemento episómico, tal como um plasmideo. No que diz respeito a células eucarióticas, uma célula estávelmente transformada é aquela em que o ADN transformante foi integrado num cromossoma de forma que seja herdado pelas células filhas através da replicação cromossómica. Esta estabilidade é demonstrada pela capacidade da

célula eucariótica estabelecer linhas dee células ou clones constituídos por uma população de células filhas que contêm o ADN transformante. Um clone é uma população de células derivadas de uma célula única ou de um antepassado comum por mitose. Uma linha de células é um clone de uma célula primária que é capaz de experimentar um crescimento estável in vitro du rante várias gerações.

Duas sequências de ADN são substancialmente homólogas quando pelo menos cerca de 85% (de preferência pelo menos cer ca de 90%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%) dos nucleótidos coincidem ao longo do comprimento definido das sequências de ADN. As sequências que são substancialmente homólogas podem ser identificadas por meio de uma experiência de hibridização Southern, por exemplo, sob condições restritas, como são definidas para esse sistema específico. A definição das condições de hibridização apropriadas está dentro do âmbito dos peritos na técnica. Ver, por exemplo, Maniatis et al., supra; DNA Cloning, Vols. I & II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

Uma região heteróloga da construção ADN é um segmento identificável do ADN dentro de uma molécula de ADN maior que não se encontre em associação com as moléculas maiores na Natureza. Assim, quando a região heteróloga codifica um gene de mamífero, o gene será normalmente flanqueado por ADN que não flanqueia o ADN genómico de mamífero no génome do organismo fonte. Um outro exemplo de uma sequência heteróloga que codifica é uma construção em que a própria sequência que a codifica não é encontrada na natureza (por exemplo, um cADN onde a sequência genómica que codifica compreende intrões, ou sequências sintéticas que possuem codões diferentes dos do gene natural). Variações alélicas ou acontecimentos mutacionais que

ocorrem naturalmente não originam uma região heteróloga de ADN, como aqui se definiu.

Uma composição que compreende A (em que A é uma pro teína simples, uma molécula de ADN, um vector, etc.) está substancialmente isenta de B (em que B compreende uma ou mais proteínas contaminantes, moléculas de ADN, vectores, etc.) quando pelo menos cerca de 75% em peso de proteínas, ADN, vecto res (dependendo da categoria das espécies às quais A e B pertencem) da composição são A. De preferência A constitui pelo menos cerca de 90% em peso das espécies A+B na composição, sendo preferível que compreenda pelo menos cerca de 99% em peso. E também preferível que uma composição, que está essencialmente isenta de contaminação, compreenda apenas uma espécie de peso molecular simples que possua a actividade ou características da espécie de interesse.

Um anticorpo é qualquer imunoglobina, incluindo anticorpos e seus fragmentos, que liga um epítopo específico. 0 termo abrange, entre outros, anticorpos policlonais, anticordos monoclonais e anticorpos quiméricos.

Para se obterem mais informações sobre anticorpos quiméricos ver as Memórias Descritas das Patentes Americanas 4.816.397 e 4.816.567.

o ADN isento de intrão revelado pela presente invenção é novo, pois crê-se que os genes humanos e bovinos, ocorrem naturalmente, compreendem intrões. Assim, o termo isento de intrão exclui as sequências de ADN que ocorrem naturalmente nos cromossomas de células humanas ou bovinas. A presente invenção abrange também as sequências de cADN isentas de intrão, * 14 // obtidas a partir de sequências de ADN aqui reveladas.

Tal como se descreve mais minuciosamente no exemplos que se seguem, as bibliotecas de cADN humano e bovino foram inicialmente amostradas para sequências que codificam sequências de BMP, usando para tal oligodesoxinucleótidos marcados cujas sequências sejam baseadas numa sequência de aminoácidos parcial, determinada a partir de análises de amostras de proteínas purificadas obtidas a partir de tecido ósseo como aqui se descreveu. No entanto, crê-se que uma vez que se disponha de ADN isento de intrões, que codifica a BMP humana ou bovina e suas sequências principais, como aqui se descreveu, um perito na técnica reconhecerá que poderão ser preparadas outras amostras que hibridizam rigorosamente a partir das referidas sequências, no sentido de obter prontamente o restante dos genes humanos ou bovinos desejados.

Os vectores são usados para simplificar a manipulação do ADN que codifica o polipeptídeo BMP, tanto para a preparação de quantidades maiores de ADN como para processamento posterior (vectores declonação) ou para expressão de polipeptídeos BMP (vectores expressão). Os vectores compreendem plasmídeos, vírus (incluindo fagos), e fragmentos de ADN integráveis, isto é, fragmentos que são integráveis dentro do genoma hospedeiro por recombinação. Os vectores de clonação’ não necessitam de compreender as sequências de controlo de expressão No entanto, as sequências de controlo num vector de expressão incluem as sequências de controlo de transcrição e tradução, tais como um promotor de transcrição, uma sequência operadora opcional para controlar a transcrição, uma sequência que codifica sítios de ligação ribossómicos adequados (para expressão procariótica), e sequêcias que controlam a terminação da transcrição e tradução. 0 vector expressão deverá incluir, de

preferência, um gene de selecção para facilitar a expressão estável de BMP e/ou para identificar transformantes. No entanto, o gene de selecção para manter a expressão pode ser fornecido por um vector separado nos sistemas de cotransformação usando células hospedeiras eucarióticas.

Os vectores adequados geralmente compreenderão um replicão (origem de replicação, para uso em vectores não-integrativos) e sequências de controlo que são obtidas a partir de espécies compatíveis com o hospedeiro de expressão pretendido. Com termo vector ·¹¹ repl i cável, tal como aqui é usado, pretende-se abranger vectores que compreendem os referidos replicões, bem como os vectores que são replicados por integração em génomas hospedeiros. As células hospedeiras transformadas são células que foram transformadas ou transferidas com vectores que compreendem ADN que codifica BMP. A BMP expressa será depositada intracelularmente ou segregada tanto dentro do espaço periplásmico como no sobrenadante da cultura, dependendo da célula hospedeira seleccionada e de presença de sinais de processamento no peptídeo expresso, por exemplo sequências de sinal homólogo ou heterólogo.

As células hospedeiras adequadas são procariotes ou células eucarióticas. As células procariotes incluem células de organismos Gram negativos ou Gram positivos, por exemplo _E. col i ou bacilos. As eucarióticas incluem leveduras ou células eucaróticas superiores, tais como as linhas de células estabelecidas de origem em mamíferos.

Os vectores de expressão para células hospedeiras normalmente incluem uma origem de replicação, um promotor localizado acima da cadeia em relação à sequência que codifica a BMP, em conjunto com um sítio de ligação do ribossoma, um sítio de pol iadenilação, e uma sequência de terminação de transcrição. Os peritos na técnica compreenderão que algumas destas sequências não sejam necessárias para expressão em certos hospedeiros. Um vector de expressão para uso com micróbios apenas necessita de compreender uma origem de replicação reconhecida pelo hospedeiro, um promotor que funcione no hospedeiro e um gene de selecção.

Um vector de expressão é construído de acordo com a presente invenção de forma que a sequência que codifica a BMP está localizada no vector com as sequências que codifica, no que diz respeito às sequências de controlo, tal que a sequência que codifica é transcrita e traduzida sob o controlo das sequências de controlo (isto é, a polimerase ARN que se liga à molécula de ADN nas sequências de controlo transcreve as sequências que codificam). As sequências de controlo podem ser ligadas à sequência que codifica antes da inserção num vector, tal como os vectores de.clonação acima descritos. Em alternativa, a sequência que codifica pode ser directamente clonada dentro de um vector de expressão que já compreendem as sequências de controlo e um sítio de restrição apropriado. Para a expressão da BMP em procariotas e leveduras, as sequências de controlo serão necessariamente heterólogas em relação à sequência que codifica. Se a célula hospedeira é um procariote, é também necessário que a sequência que codifica esteja isenta de intrões (por exemplo, cADN). Se a célula hospedeira seleccionada fôr uma célula de um mamífero, as sequências de controlo podem ser heterólogas ou homólogas à sequência que codifica a BMP, e a sequência que codifica tanto pode ser ADN genómico que compreende intrões ou cADN. Tanto as sequências que codificam cADN como as sequências genómicas podem ser expressas em leveduras.

Os vectores de expressão devem compreender um promotor que seja reconhecido pelo organismo hospedeiro. Os promotores comummente conhecidos e disponíveis que são usados em construções de ADN recombinante incluem a $-lactamase (penici1inase) e sistemas promotores de lactose, um sistema promotor de triptofano (trp) e o promotor tac. Embora estes sejam comummente usados, são adequados outros promotores microbianos conhecidos.

Em adição aos procarites, as células eucarióticas, tais como leveduras, são transformadas com vectores que codificam a BMP. A Saccharomyces cerevisiae, ou a levedura de fermento comum de padaria, é o mais comummente usado de entre os microorganismos hospedeiros eucarióticos inferiores. No entanto, numerosas outras espécies estão comummente disponíveis e são aqui úteis. Os vectores de leveduras compreenderão normalmente uma origem de replicação do plasmídeo de levedura de 2 micron ou uma sequência de replicação autónoma (ARS), um promotor, um ADN que codifica a BMP, sequências para poliadenilação, terminação da transcrição, e um gene de selacção.

As sequências promotoras adequadas em vectores de leveduras incluem os promotores para as enzimas glicoliticas, tais como enolase, 3-fosfog1iceratocinase, gliceraIdeído-3fosfato-desidrogenase, hexocinase, piruvato-descarboxi1 ase, fosfofructocinase, glucose-6-fosfato-isomerase, 3-fosfoglicerato-mutase, piruvatocinase, triosefosfato-isomerase, fosfog1ucose-isomerase e glucocinase.

Outros promotores de leveduras,que possuem a vantagem adicional de transcrição controlada por condições de crescimento são as regiões de promotores para desidrogenase de álcool 1 ou 2, isocitocroma C, fosfatase ácida, bem como enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose.

Podem ser usadas culturas de células eucarióticas superiores, quer células de vertebrados ou de invertebrados, incluindo insectos, e as suas técnicas de propagação são conhecidas. Ver, por exemplo, Tissue Culture, Academic Press, Kruse e Patterson, editors (1973).

As células hospedeiras adequadas para expressão de BMP em eucariotas superiores incluem: linha CVI do rim do macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); células de rim de bebés hamster (BHK, ATCC CRL 10); células de ovário de hamster chinês-DHFR (descritas por Urlaub e Chasin, PNAS (USA) 77: 4216 (1980)); células de Sertòli de ratos (TM4, Mather, J.P. Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de rim de macaco (CVI ATCC CCL 70); células de rim do macaco verde Africano (VER0-76, ATCC CRL-1587); células do carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim de caninos (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células do pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células do fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário do rato (MMT 060652, ATCC CCL 51); células de hepatoma de rato (HTC, M1, 54, Baumann, Μ., et al., J. Cel 1 Biol. 85: 1-8 (1980)) e células TRI (Mather, J.P., et al., Annals N.Y. Acad. Sei. 383: 44-68 (1982)). Os promotores comummente usados são obtidos a partir de polioma, adenovírus 2 e virus de símio 40 (SV40). Note-se que quando é expressa em tecidos de mamíferos, a BMP recombinante pode possuir um peso molecular mais elevado devido à g1icosi1 ação. Pretende-se portanto que as formas parcialmente ou completamente glicosiladas da BMP que possuem pesos moleculares superiores a 19KD estejam dentro do âmbito da invenção, bem como as suas formas não glicosiladas.

São conhecidos na técnica numerosos vectores de expressão procarióticos. Ver por exemplo, A Memória Descritiva das Patentes Americanas Nos. 4.440.859; 4.436.815; 4.431.740; 4.431.739; 4.428.941; 4.425.437; 4.418.149; 4.411.994; 4.366.246; 4.342.832; ver também as Memórias Descritivas das Patentes Britânicas Nos. GB 2.121.054; GB 2.008.123; GB 2.007.675; e a Memória Descritiva da Patente Europeia N- 103.395. Os sistemas procarióticos preferidos são os da E. coli.

Outros vectores de expressão preferidos são aqueles usados em sistemas eucarióticos. Um exemplo de sistema de expressão eucariótico é aquele que usa virus de vacinas, que é bem conhecido na técnica. Ver por exemplo Macket et al. (1984) J. Virol. 49: 857; DNA Cloning, Vol. II, págs. 191-211, supra; PCT Pub N⁹ W0 86/07593. Vectores de expressão em leveduras são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, As Memórias Descritivas das Patentes Americanas Nos. 4.446.235; 4.443.539; 4.430.428; ver também as Memórias Descritivas das Patentes Europeias Nos. 103.409; 100.561; 96.491. Um outro sistema de expressão preferido é o vector pHS1, que transforma as células ováricas do hamster Chinês. Ver PCT Pub. W0 87/02062. Os tecidos mamíferos podem ser cotransformados com ADN que codifica um marcador seleccionável, como o dihidrofo1ato-reductase (DHFR) ou timidinacinase e ADN que codifica BMP.

Se fór usado o gene DHFR de tipo selvagem, é preferível seleccionar uma célula hospedeira que seja deficiente em DHFR, permitindo assim o uso da sequência que codifica da DHFR como ^marcadora para uma transferência bem sucedida no meio hgt^-, com carência de hipoxantina, glicina e timidina. Uma célula hospedeira apropriada neste caso é a linha de células (CHO) do ovário de hamster Chinês deficiente em actividade de

DHFR, preparada e propagada como é descrito por Urlaub e Chasin, 1980, Proc. Nat. Acad. Sei. (USA) 77: 4216. Os vectores de expressão obtidos a partir de baculovirus para uso em células de insectos são conhecidos e estão disponíveis na prática. Ver Lucklow and Summers, Biotechnology, 6^, p. 47-55.

Em função do sistema de expressão e do hospedeiro seleccionado, a BMP é produzida cultivando células hospedeiras transformadas por uma construção de ADN heterólogo ou exógeno, tal como um vector de expressão acima descrito sob condições em que a proteína BMP é expressa. A BMP é então isolada a partir das células hospedeiras e purificada. Se o sistema de expressão segregar BMP para o meio de crescimento, a proteína pode ser purificada directamente a partir do meio isento de células. Se a proteína BMP não fôr segregada, é então isolada a partir de células lisadas. A selecção das condições de cultura apropriadas e dos meios de recuperação são do domínio dos peritos na técnica.

A BMP produzida por meio de técnicas recombinantes é recuperada a partir de células transformadas de acordo com técnicas conhecidas. De preferência será usado um vector de expressão que promova a secreção de BMP a partir das células transformadas; deste modo podem então as células ser separadas por centrifugação. A BMP tipicamente é purificada por téc nicas gerais de purificação de proteínas, incluindo, mas não se limitando a, exclusão dimensional, cromatografia de permuta iónica, HPLC, e semelhantes.

Uma vez preparada ou isolada a sequência que codifica a BMP, pode ser clonada num vector adequado e deste modo é mantida numa composição de células que está substancialmente

isenta de células que não compreendem uma sequência que codifica a BMP (por exemplo, isenta de outros clones da biblioteca). Numerosos vectores de clonação são conhecidos pelos peritos na técnica. Os exemplos de vectores de ADN recombinante para clonação e as células hospedeiras que eles podem transformar incluem os vários vectores Lambda bacteriófagos (E. coli), pBR 322 (E, coli), pACYC 177 (E. coli) , pKT 230 (bactérias gram negativas), pLAFR 1 (bactérias gram negativas), pME 290 (bactérias gram negativas não - E. coli) PGV 1106 (bactéria gram negativa), pHV 14 (E. coli e Bacillus subtilis), pBD 9 (Bacillus), pIJ 61 (Streptomyces), pUC 6 (Streptomyces), actinofago, 0C 31 (Streptomyces), YIp 5 (Saccharomyces), YCp 19 (Sacharomyces), e virus papilloma de bovino (células mamíferas). Ver genericamente, DNA cloning: Vols. I e II, supra;T. Maniatis et al., supra; B.Perbal, supra.

Em alternativa a BMP pode ser preparada por meio de síntese peptídica convencional, por exemplo, usando os princípios da síntese de Merrifield e usando os dispositivos automáticos comercias previstos para empregar os métodos da síntese de Merrifield. Os peptídeos preparados usando a síntese peptídica convencional podem ser purificados usando para tal a cromatografia de afinidade, filtração por gel e/ou RP-HPLC.

A Figura 3 mostra a sequência nucleotídica do cADN da BMP de bovinos e a sequência de aminoácidos deduzida ou o polipeptídeo percursor. 0 sítio provável de clivagem de peptidase de sinal está assinalado por (|). A sequência de cADN foi obtida a partir de um inserto de 830 bp Bgl II do clone n^s 1 do cADN de BMP de bovino, que foi isolado a partir de uma biblioteca de cADN de fígado de vitelo, como abaixo se descreve.

A Figura 5 mostra a sequência de nucleôtidos de cADN de BMP humana e a sequência de aminoácidos deduzida do polipeptídeo precursor. 0 sítio provável de clivagem da peptidase sinal está assinalado com (J,). A sequência de cADN foi obtida a partir de um inserto BamHI/HindIII de 600 bp do clone A6 de cADN de BMP humana, foi isolado de uma biblioteca de cADN de BMP/rim humano de PCR, como se descreve adiante.

Considera-se ainda, através das sequências de nucleótidos das Figuras 3 e 5, que os análogos de BMP estão dentro do âmbito da invenção. Os análogos, tais como os fragmentos podem ser produzidos, por exemplo, por digestão por pepsina da BMP. Outros análogos, tais como mutaínas, podem ser produzidos por mutagénese, localizada no sítio, convencional, de sequências que codificam BMP. Os análogos que exibem actividade de BMP podem ser identificados por ensaios in vivo e/ou in vitro, de preferência o ensaio de indução de cartilagem in vitro,

Methods of Enzymology, 146, págs 294-312, (1987).

Um exemplo de um análogo dê BMP são os produtos de clivagem de leveduras produzidos in vivo a partir de produtos de expressão de BMP humana ou de bovino de comprimento completo. 0 processamento de produtos de expressão de bovino resulta em 2 polipeptideos aproximadamente de 16KD, descritos abaixo no Exemplo 9, e um ou ambos destes análogos são aqui referidos como análogos de clivagem de leveduras de 16KD.

Tal como acima se mencionou, uma sequência de ADN que codifica a BMP pode ser preparada sintéticamente, em vez de clonada. A sequência ADN pode ser prevista com os codoês apropriados para a sequência de aminoácidos da BMP. Em geral, selecionar-se-ão os codoês preferidos para o hospedeiro pretendido se a sequência for usada para expressão. A sequência completa

é ligada a partir de oligonucleótidos sobrepostos, preparados por meios padrão, e ligados formando uma sequência completa que codifica. Ver por exemplo, Edge (1981) Nature 292:756; Nambair, et al.

( 1984) Science 223:1299; Jay et al. ( 1984) J. Biol. Chen.. 259:6311.

As sequências de ADN sintéticas permitem a construção conveniente de genes que expressarão os Análogos de BMP ou muteínas. Em alternativa, o ADN que codifica muteínas pode ser preparado por mutagénese, localizada no sítio, de genes de BMP naturais ou cADN, e as mutaínas podem ser directamente produzidas usando sínteses de polipeptídeos convencionais.

A mutagénese localizada é conduzida usando um oligonucleótido sintético principal, complementar de um ADN de fago de cadeia simples a submeter a mutagénese, excepto em não concordâncias limitadas, representando a mutação desejada. Em resumo, o oligonucleótido sintético é usado como um oligonucleótido primário para dirigir a síntese de uma cadeia complementar ao fago, e a ADN de cadeia dupla resultante é transformada numa bactéria hospedeira suporte do fago. As culturas das bactérias transformadas são colocadas em placas de agar, permitindo a formação de placas a partir de células singulares que abrigam o fago.

Teoricamente, 50% das novas placas compreenderão o fago que possui, como uma cadeia simples, a forma mutada; 50% possuirá a sequência original. As placas resultantes são hibridizadas com o primário sintético transformado com cinase, a uma temperatura que permita a hibridização com concordância exacta, mas ao qual as não concordâncias com a cadeia original são suficientes para impedir a hibridização.As placas que hibridizam com a amostra são então removidas, cultivadas, e o ADN é recuperado.

Um método geral para a incorporação, específica de sítio, de aminoácdos não naturais em proteinas é descrito em Christopher J. Norn, Spencer J. Anthony-Cahi11, Michael C. Griffitti, Peter g. Schultz, (Abril 1989), Science, Vol. 244, págs 182-188. Este método pode ser usado para criar análogos com aminoácidos não naturais.

Podem ser testadas preparações de BMP e de seus análogos in vivo de acordo com o método descrito por Urist, et al., Methods in Enzymology (D. Barnes e D. A. Sirbaska, eds.),

Vol. 146, págs 294-312, Academic Press, N.Y. (1987), e in vitro pelo método de Sato e Urist, Clin. Orthop. , 183:180-187 (1984) como modificado por Kawamura e Urist, Dev. Biol., 130:435-442 (1988), aqui incorporadas como referência.

A BMP substancialmente pura, as suas formas glicolisadas de pesos moleculares superiores, ou os seus fragmentos activos, ou os seus sais não tóxicos, combinados com uma substância veicular farmacêuticamente aceitável formando uma composição farmacêtica, podem ser administrados a mamíferos, incluindo a seres humanos, tanto por via intravenosa, via subcutânea, percutânea, intramuscular ou por via oral.

Tais proteínas são frequentemente administradas sob a forma de sais não tóxicos farmacêuticamente aceitáveis, tais como sais de adição de ácidos ou complexos de metais, por exemplo, com zinco, ferro ou semelhante (que são considerados como sais para os propósitos deste pedido de patente). São exemplos destes sais de adição de ácido o cloridrato,bromidra-

to, sulfato, fosfato, maleato, acetato, citrato, benzoato, succinato, malato, ascorbato, tartarato e semelhantes. Se se pretende administrar o ingrediente activo sob a forma de comprimido, este pode compreender um agente ligante, tal como tragacanto, amido de milho ou gelatina; um agente de desintegração tal como ácido alginico; e um agente lubrificante, tal como o estearato de magnésio. Se se desejar a administração de uma forma liquida, podem usar-se agentes eduleorantes e/ou aromatizantes e pode efectuar-se a administração intravenosa em soro fisiológico isotónico, em soluções de tampão fosfato ou semelhante.

As composições farmacêuticas compreenderão normalmente uma quantidade efectiva de BMP em conjunto com uma substância veicular corrente farmacêuticamente aceitável. A dosagem variará em função do propósito especifico para o qual a proteína é administrada, e podem ser usados os níveis de dosagem compreendidos no intervalo entre 0,1/ig a cerca de 100 miligramas por Kg de peso corporal.

A presente invenção contempla ainda a combinação de BCF, particularmente humana ou bovina, com BMP como uma composição terapêutica para iniciação de formação do tecido ósseo, tanto in vitro como in vivo.

Implantes de BMP recombinante, isoladamente ou quando misturado com um ou mais factores osteoindutivos associados, podem ser usados para iniciar a formação de cartilagem e crescimento do tecido ósseo. Os implantes podem ser composições de libertação retardada, encapsuladas, por exemplo, em lipossomas ou em outras membranas de libertação retardada, naturais ou sintéticas, que são absorvíveis pelo indivíduo

hospedeiro. A BMP pode ser de origem humana, bovina, ou de qualquer outro mamífero, ou uma sua mistura. Para iniciar o crescimento do tecido ósseo, a BMP pode ser misturada com qualquer combinação de uma ou mais proteínas, particularmente, com uma ou mais proteínas derivadas do tecido ósseo. Tais misturas podem iniciar a formação de cartilagem, seguida por crescimento ósseo. Implantes de BMP podem ser usados para induzirem a formação de cartilagem e o crescimento ósseo na zona dos quadricepes.

Os protocolos de purificação, descritos mais abaixo em pormenor, permitem pela primeira vez a purificação de BMP natural em quantidade suficiente e com uma pureza suficientemente alta para permitir a sequênciação rigorosa dos aminoácidos. As sequências de aminoácidos obtidos a partir de BMP purificada permitem a concepção de amostras para auxiliar o isolamento da sequência do ácido nucleico de BMP natural, ou a concepção das sequências de ácidos nucleicos sintéticos que codificam a sequência de aminoácidos da BMP, bem como permitem a produção pela primeira vez de anticorpos, tanto de diagnóstico como terapêuticos, para BMP e seus análogos. Os genes de ADN de BMP ou seus fragmentos podem também ser utilizados num teste de diagnóstico para identificar pacientes que possuem genes de BMP deficientes.

Podem ser preparados antissoros ou anticorpos monoclonais específicos (abaixo descritos) a um peptideo de BMP sintético que possui a sequência ou fragmentos da sequência dos resíduos de aminoácidos, tais como os representados nas Figuras 3 ou 5. Exemplos destes são os fragmentos tripticos apresentados na Figura 1, e anticorpos contra aqueles podem ser usados para imunoprecipitarem qualquer BMP presente num

tecido escolhido, extrato celular seleccionado ou fluído corporal escolhido. A BMP purificada proveniente desta fonte pode ser sequenciada e usada como uma base para a construção de amostras específicas, como acima se descreveu. Podem também ser usados anticorpos para outras regiões que divergem da BMP conhecida. Também são úteis como antigenes BMP nativa ou recombinante purificados.

Peptídeos de BMP sintéticos, recombinantes ou naturais (de comprimento completo ou subunidades) podem ser usados para produzir tanto anticorpos monoclonais como anticorpos policlonais. Se se desejarem anticorpos policlonais é usado o peptídeo de BMP purificado para imunizar um mamífero seleccionado (por exemplo, rato, coelho, cabra, cavalo, etc.) e o soro do animal imunizado é posteriormente recolhido e tratado de acordo com as técnicas conhecidas. As composições que compreendem anticorpos policlonais para uma variedade de antigenes, em adição á BMP, podem ser preparadas substancialmente isentas de anticorpos que não são anti-BMP,por cromatografia de imunoafinidade.

Os anticorpos anti-BMP monoclonais podem também ser prontamente produzidos pelos peritos na técnica a partir desta memória descritiva. A metodologia geral para a preparação de anticorpos monoclonais pelos hibridomas é bem conhecida. Podem também ser criadas linhas de células produtoras de anticorpos, imortais, por meio de técnicas que não a de fusão, tal como a transformação directa de linfócitos B com ADN oncogénico, ou transferência com vírus Epstein-Barr. Ver, por exemplo, M. Schreier et al., Hibridoma Techniques (1980); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies And T-cell Hybridomas (1981); Kennett et al., Monoclonal Antibodies (1980) ver também as Memórias Descritivas das Patentes Americanas

Nos. 4.341.761; 4.399.121; 4.427.783; 4.444.887; 4.451.570; 4.466.917; 4.472.500; 4.491.632; 4.493.890.

Painéis de anticorpos monoclonais produzidos contra os peptídeos de BMP podem ser seleccionados quanto a várias propriedades; isto é, Isotipo, epítopo, afinidade, etc. Os anticorpos monoclonais que neutralizam a actividade de BMP apresentam interesse particular. Tais anticorpos monoclonais podem ser prontamente identificados em ensaios de actividade de BMP. Anticorpos de elevada afinidade são também úteis na purificação por imunoafinidade da BMP recombinante ou natural .

Os anticorpos para a BMP (tanto policlonais como monoclonais) aqui descritos podem ser usados para inibir ou para inverter várias indicações clínicas de doenças ósseas, tais como: osteoporose, osteoartrite, etc. Uma experiência terapêutica será a de tratar o paciente com uma dose efectiva de anticorpos anti-BMP através de uma via intravenosa convencional. Os antagonistas de BMP ou agonistas de BMP, tais como as muteínas de BMP, podem também ser usadas em vez de anticorpos. Estas composições anti-BMP podem também ser úteis na detecção ou inibição de várias formas de tumores, pois sabe-se que alguns tumores são induzidos por factores de crescimento.

A determinação do regime de tratamento adequado (isto é dosagem, frequência de administração, acções sistémicas versus local, etc.) estão no âmbito dos peritos na técnica. Para administração, os anticorpos serão formulados numa unidade de dosagem sob a forma injectável (solução, suspensão, emulsão, etc.) em associação com uma substância veicular parentérica farmaceuticamente aceitável. Tais substâncias veiculares são normalmente não tóxicas e não terapêuticas. Exemplos de tais substâncias veiculares são água, soro fisiológico, solução de Ringer, solução de dextrose, e solução de Hank. Podem também usar-se substâncias veiculares não aquosas, tais como óleos fixos e oleato de etilo. Uma substância veicular preferida é a albumina humana a 5% P/P em soro fisiológico.

A substância veicular pode compreender quantidades reduzidas de aditivos, tais como substâncias que promovem a isotonicidade e estabilidade química, por exemplo, tampões e conservantes. 0 anticorpo é formulado tipicamente em tais substâncias veiculares a concentrações compreendidas no intervalo entre cerca de 1>tg/ml a 10 mg/ml.

Os anticorpos anti-BMP são também úteis em aplicações de diagnóstico. A presente invenção contempla um processo, particularmente um método de diagnóstico, em que é recolhida uma amostra humana (ou de outro mamífero), e a quantidade de BMP é medida quantitativamente num ensaio. Por exemplo, o uso de anticorpos anti-BMP num imunoensaio quantitativo pode ser levado a cabo para detectar deficiências genéticas na BMP. 0 anticorpo específico para BMP pode ser formulado num qualquer formato de ensaio de imunidade convencional; por exemplo um radioimunoensaio'homogéneo ou heterogéneo ou ELISA. Os vários formatos são bem conhecidos pelos peritos na técnica. Ver, por exemplo, Immunoassay A Praticai Guide (D. W. Chan and Μ. T. Perlstein eds. 1987) cuja descrição é aqui incorporada como referência.

Em geral, a produção de BMP recombinante pode proporcionar composições do polipeptideo substancialmente isento de proteínas contaminantes. A capacidade de obter níveis elevados de pureza é um resultado dos sistemas de expressão recombinantes que podem produzir BMP em quantidades substanciais relativamente às fontes in vivo. Assim, através de apli,0 )730 ! // ί/ .7 cação de técnicas convencionais para culturas recombinantes, podem ser produzidas composições de BMP substancialmente mais puras que as composições disponíveis obtidas a partir de fontes ósseas.

A BMP purificada será particularmente útil como uma ponte de partida na formação e selecçâo dos inibidores do crescimento de cartilagem e tecido ósseo. Primeiro, quantidades ao nível de miligramas de material são obtidas de acordo com a presente invenção. Quantidades ao nível de miligramas são capazes de cristalizarem para permitirem o estudo tridimensional, usando difracção por raios X e análise computorizada. Isto pode permitir a dedução no que refere à forma de molécula, definindo assim formas próprias para substâncias úteis como inibidores da actividade normalmente exibida pela BMP. Geralmente, os antagonistas têm sido peptideos cujas interacções com um polipeptideo, cuja actividade é inibida, são estabilizados por modificação dos resíduos que participam na ligação do peptideo, no sentido de aumentar a capacidade do peptideo para interactuar especificamente com o enzima, com o receptor ou co-factor, tais como os factores osteoindutivos associados no caso da BMP. Assim, a ligação peptidica une especificamente os ácidos carboxilicos e aminas escolhidos (não necessáriamente aminoácidos). Estes peptideos são configurados num arranjo tridimensional, no sentido de complementarem o contorno do alvo pretendido. Um arranjo especial complementar (tipo chave e fechadura) pode resultar de moléculas concebidas complementarmente aos contornos de superfície de BMP da invenção. Entende-se que superfície inclui convoluções que podem ser reentrantes, e especialmente inclui zonas activas. Além disso complementarmente é entendido como significando que, em adição às conformações especiais que se ajustam, as interacções

entre a proteína e a molécula concordante com os seus contornos superficiais, são atractivas e positivas. Estas interacções podem ser ligações por pontes de hidrogénio, iónicas, ou de afinidade hidrofóbica.

De acordo, a presente invenção contempla antagonistas e agonistas peptídicos (2 a 15 aminoácidos) à BMP que são caracterizados por carbonos tridimencionais complementares aos contornos tridimencionais na superfície da BMP recombinante. Por peptídeo neste contexto entende-se que o antagonista ou agonista compreende ligações de amida de ácido carboxílico.

Os participantes ácido carboxilo e amina não necessitam de ser «-aminoácidos.

Em segundo lugar, mesmo sem o auxílio da determinação da estrutura tridimencional, a BMP purificada de acordo com a invenção é útil como um reagente de selecção de inibidores de BMP in vitro e como um meio ad hoc para avaliação. As preparações de BMP impuras correntemente disponíveis originam dados confusos devido às impurezas. Por exemplo, os contaminantes que se tornam por si mesmos inibidores, activadores ou substractos para a BMP podem interferir na avaliação. Assim, uma melhoria substancial nas técnicas de selecção correntes para agonistas e antagonistas de BMP seria efectivada pela disponibilidade de proteína de BMP purificada.

Entender-se-á que esta memória descritiva e descrição da invenção pretende abarcar todas as alterações e modificações da invenção que se encontram dentro do espírito e âmbito da invenção. Encontra-se dentro do conhecimento da técnica inserir, eliminar ou substituir aminoácidos dentro das sequências de aminoácidos de uma BMP sem afectar substancialmente a actividade de calcificação e de indução do crescimento ósseo da molécula.

Assim, a invenção inclui tais eliminações, adições ou substituições. Além disso, considera-se que um perito na técnica pode produzir por técnicas recombinantes tais proteínas modificadas .

Os exemplos que se seguem são apresentados como ilustração, mas não pretendem limitar a invenção de forma alguma.

Exemplo 1

Purificação da BMP do tecido ósseo

As proteínas de BMP de interesse, parcialmente purificadas obtidas a partir de fontes humanas (17KD) e bovinas (19KD) como são descritas por Urist, et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 81, 371-375 (1984), foram pósteriormente purificadas até à homogeneidade por meio de electroforese por gel preparativa e electroeluição (M.W. Hunkapiller, E. Lugan, F. Ostrander e L.E. Hood, Methods in Enzymology, 9_1: 227-236 ( 1983)). Esta purificação mostrou que as amostras inicialmente purificadas parcialmente continham, além da BMP de 19KD, outras proteínas de mamíferos a 34KD, 22KD, 14KD e 6KD. Depois da precipitação com acetona (W.H. Konigsberg e L. Henderson, Methods in Enzymology, 91: 254-259 (1983)) e quantificação por análise de aminoácidos (B.A. Bidlingmeyer, S.A. Cohen e T.L. Tarvin, Journal of Chromatography, 336: 93-104 (1984)), o material foi reduzindo sob condições de desnaturação com 2-mercaptoetano1 e resíduos de cisteína foram derivatizados com 4-vinil-piridina (M. Friedman, L.G. Krull e J.F. Gavins, Journal of Biological Chemistry, 245: 3868-3871 (1970)). Após diálise exaustiva para remoção do desnaturante, a recuperação da proteína foi avaliada por meio de repetição de análise de aminoácidos. As proteínas foram digeridas com TPCK-tripsina em presença de ureia 2M para

originar fragmentos de peptideos não bloqueados, apropriados para a análise de sequência (G. Allen, Sequencing of Proteins and Peptides, págs 51-62 (1981), Elsevier/North Holland Publishing Company, Amesterdão Holanda). Os produtos de digestão forem separados por cromatografia liquida de alta resolução em fase inversa usando gradientes de acetonitrilo ou acetonitrilo/isopropanol em ácido trifluoracético aquoso (J.E. Shively, Methods of Protein Microcharacterization, págs 41-87 (1986), Humane Press, Clifton, New Jersey). As fracções peptídicas foram submetidas a degradação de Edman automática usando para tal um sequenciador de proteínas Applied Biosystems 470A (M.W. Hunkapiller, R.M. Hewick, W.J. Dreyer e L.E. Hood, Methods in Enzymology, 91: 399-413 (1983)). Os derivados de aminoácidos de feniltiohidantoína foram identificados por cromatografia num analizador Applied Biosystems 120A PTH (M.W. Hunkapiller, Applied Biosystems, User Bulletin Number 14 (1985), Applied Biosystems, Foster City, Califórnia).

Exemplo 2

Isolamento de ARN e Síntese de Amostras

Cultura Celular.; 293, uma linha de células de rim humano embrionário, obtido a partir da American Type Collection (ATCC No. CRL 1573) foi cultivada num meio de Eagle modificado por Dulbecco's, compreendendo soro de feto de vitelo a 10%,

100 U/ml de penicilina e 100 -yg/ml de estreptomicina a 37°C em C0₂ a 5%.

Isolamento de ARN. 0 ARN foi isolado a partir de figado de vitelo (obtido a partir de JR Scientific, Woodland, CA) pelo método de tiocianato de guanidinio/CsCl (Maniatis, T. Fritsch, E.F e Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: A

Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY) e Freeman, G.J., Clayberger, C., Dekruyff, R., Rosenblum,

D. S. e Cantor H. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci.:USA 80: 40944098). 0 poly (A)⁺ ARN foi purificado por meio de fraccionamento simples sobre oligo(dT)-celulose (Maniatis, T. Fritsch,

E. F. e Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY)).

Síntese do 01igonucleótido: Foram sintetizados adaptadores de oligonucleótidos, oligonucleótidos primários e amostras pelo método de fosforemidite com um sintetizador modelo 38A Applied Biosystems (Foster City, CA), foram purificados por electroforese por gel de poliacrilamida e desalinizados numa embalagem Waters SEP-PAK (C^g).

(a) Adaptadores. Um ol igonucleótideo 14-mero (5'¹ CCTGTAGATCTCCG 3¹) e um ol igonuc leotídeo 18-mero (5' AATTCGGA GATCTACAGG 3') foram sintetizados e usados como adaptadores EcoRI para a biblioteca de cADN construída em ZAPII lambda. 0 14-mero foi fosforilado (Maniatis T. Fritsch, E. F. e Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual: (Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY)) e subsequentemente aquecido a 95°C durante 15 minutos para inactivar a polinucleotídocinase, antes do recozimento com o oligonucleotído 18-mero. Estes adaptadores fosforilados assimetricamente compreendem também um sítio de enzima de restrição BglII interno.

(b) Primários PCR. Dois oligonucleotídos 47-meros foram sintetizados por amplificação PCR da região completa que codifica do cADN da BMP humana a partir de mARN da linha de células 293 do rim e subsequentemente clonados em ZAPII lambda.

primário no sentido 5' (5' TCCGGACTCGAGGAATTCAAACAATCATGATT TCCAGAATGGAGAAG 3') e o primário no sentido oposto 3' (5'

GACTCGAGGAATTGGTCGACACCTCAAGGCCGTTACTCAAAGTCAGT 3') são baseados na sequência dos exãos 1 e 7 do gene humano, respectivamente. Ambos os primários possuem extensões 5' (adaptadores) que compreendem vários sítios de enzimas de restrição.

Dois grupos adicionais de primários/adaptadores de PCR foram sintetizados para amplificação de clones de cADN de BMP humana e bovina (que apenas codifica a proteína matura) e subsequentemente clonação em pAB125, um plasmídeo compreendendo a sequência líder de x- factor de leveduras. 0 primário no sentido 5' (42-mero) para o cADN da BMP humana (5' ACTACTGGTC TAGATAAAAGATTCCCAGTGTACGACTACGAT 3') e o primário no sentido 5' (41-mero) para o cADN da BMP de bovino (5' GGAACCCTCTCTAGA TAAAAGATTCCCGGTGTATGACTATG 3') compreendem um sítio Xbal para facilitar a ligação do cADN de PCR amplificado à sequência líder de cX-factor. 0 primário no sentido oposto 3' (37-mero) para o cADN da BMP humana (5' TCTTACCTGTCGACTATTACTCAAAGTCAGT ATTTAT 3') e o primário de sentido oposto 3' (41-mero) para o cADN de BMP de bovino (5' AATGGCCGTCGACTATCACTCAAAGCCAGGGTTTA CTCTTG 3') compreendem um sítio Sall directamente após o codão de terminação.

(c) Amostras. As amostras de oligonucleotídos, baseadas nas sequências dos peptideos tripticas da BMP de bovino, foram sintetizadas para selecção da biblioteca genómica do bovino (Provas A a D) e são representadas na Figura 1. As amostras reais são complementares às sequências apresentadas. As sequências dos quatro peptideos tripticos de BMP adicionais foram determinadas (E a H) e são também apresentadas na Figura 1. Com alguns codões, dois nucleotídeos foram incluídos em posições degeneradas para aumentar a probabilidade de uma hipótese correcta. Nos resíduos serina, têm que se sintetizar dois oligonucleotídeos separados para cada amostra (diferindo apenas no codão serina) devido à natureza única da degenerância do codão serina.

Dois oligonucleotídeos 50-meros sobrepostos parcialmente, baseados na sequência do exão 3 de BMP do bovino, foram sintetizadas para selecção da biblioteca de cADN de fígado de vitelo (Amostra I) e são apresentadas na Figura 2a (sublinhada). Quatro amostras de oligonucleotídos foram sintetizadas para identificar os exões 1, 5, 6 e 7 do gene de BMP humano (ver Tabela 1). A amostra BMP103 (5' CCAGTGGTTCATTCCAAGGACAAA TATCACCAACATCTTCATCGCCATCTTCTCCAT 3') é um 57-mero complementar às sequências que codificam o exão 1 de BMP de bovino. A amostra BMP104 (5' TCACTCAAAGCCAGGGTTTACTCTTGCTCTGGGCCACGGGTT CGAGTACCTTCTATT 3') é também um 57-mero comp1ementarmente às sequências que codificam o exão 7 da BMP do bovino. A BMP 116 (5' GAGACCAAATAGATAATTGTTTCTCCATTTATGAGAGATCC 3') é um 39-mero complementar às sequências que codificam o exão 5 da BMP humana. A BMP 117 (5' CAAGTGACCATCATAAAATTGTTCACTTATGGACTCGTCTG AAATGAGA 3¹) é um 51-mero complementar às sequências que codificam o exão 6 de BMP humana. Um oligonucleotídeo 26-mero (5' TAGTCCCTCTGGAAGGCACATGTAGC 3') complementar às sequências que codificam o exão 3 de BMP humana (Amostra J) foi sintetizado para selecção de biblioteca de cADN de BMP humana/PCR.

Exemplo 3

Construção e selecção das bibliotecas de cADN

Construção das bibliotecas do cADN (a) Biblioteca de cADN do fígado de vitelo. 0 cADN da primeira cadeia foi sintetizado a partir de ARN poli (A)⁺ de fígado de vitelo usando para tal condições similares às descritas por Okayama e Berg COkayama, H. e Berg, P. Molec. and Cell Biol. 3: 4094-4098 ( 1983)3· Cerca de 5/t9 de ARN Poli(A)⁺ em

20/tl de Tris-cloridrato 5mM (pH 7,5) foram aquecidas a 65°C durante 3 minutos, depois foram rapidamente arrefecidas em gelo húmido e imediatamente ajustados (à temperatura ambiente) para compreender Tris-cloridrato 50mM (pH 8,3 a 42°C), MgC^ 8mM, KC1 30mM, ditiotreitol 10mM, e ATPd, GTPd, TTPd a uma concentração de 2mM cada e Cpi“^^2pJ dCTP(~300cpm/pmol),

RNasin 60 U, e 2,5/tg de oligo (dT)^ -|g (volume total 40 ml). A reacção foi iniciada pela adição de 50 a 60 U da transcriptase invertida do virús da leucemia de murina moloney cionado e continuada durante 60 minutos a 42°C. A segunda cadeia de cADN foi sintetizada pelo processo de Gubler e Hoffman tGubler, U. e Hoffman, B. J. Gene 25: 263-269 (1983)3 modificado por Aruffo e Seed tAruffo, A. e Seed, B. Proc. Natl.

Acad. Sei.: USA 74: 8573-8577 (1987)3- Os cADN ds foi então ligado a adaptadores EcoRI (hemi) fosforilados assimetricamente (ver síntese de oligonucleotídeos) como descrito por Aruffo e Seed, supra, fosforilado com polinucleotído-cinase T^ (Maniatis, et al, supra), ajustado para NaCl 0,5M, EDTA 25mM e aquecidos a 75°C durante 15 minutos, para inactivar a pol inucleótido-cinase. Os cADN ds foram separados dos adaptadores não ligados por cromatografia em Biogel A-15 m e recuperados por meio de precipitação com etanol. 0 cADN foi ligado ao corte EcoRI ZAPII lambda (Stratagene) com ADN-ligase T^ (New England Biolabs) como descrito pelo fornecedor, mas incluía polietilenoglicol a 15% (PEG) 8000 (Sigma), uma modificação descrita por Pheiffer e Zimmerman CPheiffer, B.H. e Zimmerman, S.B. Nucl. Acids Res. 11: 7853-7871 (1983)3 · °

ADN ligado foi recuperado por centrifugação (12 OOOxg), lavado com clorofórmio, seco, posto de novo em suspensão em 4/x-l de água e incubado com um extracto de embalagem in vitro (Stratagene) de acordo com 0 fornecedor. 0 fago recombinante foi propagado em E. coli XLi-Blue (Stratagene).

(b) Biblioteca de cADN de rim humano com primário de BMPamplificado em PCR (BMP/PCR).

As reacções em PCR foram realizadas como descrito pelos fornecedores do kit PCR (Perkin/Elmer/Cetus). Dois primários de oligonucleotídeos 47-meros sintéticos, cujas sequências foram obtidas a partir do exão 1 (sentido primário) e 7 (sentido inverso primário) do gene de BMP humana e que compreendiam adaptadores de sítios de restrição adequados para clonação, foram usados a uma concentração final de 1/w-M cada. Os primários de PCR flanqueiam a região completa que codifica do mARN de hBMP. 0 cADN padrão foi sintetizado a partir de 2,5/ig de poli(A)⁺ ARN da linha da célula 293 do rim humano embrionário. As condições de síntese de cADN foram idênticas às acima mencionadas (Pasta A) à excepção de que o volume reactivo foi de 20/H . 0 cADN foi fraccionado em Biogel A-15 m, tal como acima, foi recuperado por precipitação com etanol e posto de novo em suspensão em 100 /t-1 de água esterilizada. Para cada reacção de PCR foram usadas amostras de 1 a 10 /íl de cADN. Foram realizados 40 ciclos de PCR num dispositivo térmico de ciclos de ADN Perkin/Elmer/Cetus. Cada ciclo compreendeu um passo de desnaturação de 1 minuto à temperatura de 94°C, um passo de recozimento de 2 minutos a 55°C, e um passo de extensão de 3 minutos a 72°C. 0 passo de extensão no ciclo 40 foi de 15 minutos em vez de 3 minutos.

Foram extraídas amostras uma vez com fenol/clorofórmio/IAA (1:1:0,04) uma vez com clorofórmio/IAA (24:1), recuperadas por precipitação com etanol, digeridas com EcoRI e fraccionadas por electroforese num gel do acrilamida a 7%, x TBE.

A fracção de ADN que migrou entre 400 a 800 b.p. foi removida do gel, purificada por passagem sobre uma coluna Elutip-d, ligada ao corte EcoRI ZAPII lambda, embalada e proCP*·***

pagada como acima se descreveu (Parte A).

Selecção das bibliotecas, (a) Biblioteca/genómica do bovino.

β

Aproximadamente 10 fagos recombinantes obtidos de uma biblio teca genómica de bovinos (Clontech) foram colocados (20 000 fagos/placa de 137 mm de diâmetro) em E.coli LE 392, e foram cultivados durante 5 a 6 horas a 37°C. Os fagos foram transferidos para filtros de nitrocelulose (Millipore, HATF 137) e processados de acordo com Benton e Davis (8) e seleccionados com a amostra A (Figura 1). As amostras foram marcadas nos extremos com o polinucleotído-cinase T. (^^^-p)ATP (1) para uma actividade específica de 1 a 2 χ 10 cmp/ytg. Os filtros foram pré-hibridizados durante 1 a 2 horas a 37°C em 5 χ SSC (1 χ SSC = cloreto de sódio 0,15 M/citrato de sódio 0,015 M, pH 7), 5 χ solução de Denhardfs (1 χ solução de Denhardfs = = polivinilpirrolidona 0,02%/Ficoll 0,02%/albumina de soro de bovino 0,02%), sulfato de dextrano a 10%, fosfato de sódio 50 mM pH 6,8, pirofosfato de sódio 1 mM, NaDodSO^ 0,1% e 50yLvg/ml de ADN de esperma de salmão desnaturado. A amostra marcada foi adicionada para uma concentração de 10θ cpm/ml e foi continuada a hibridização durante a noite a 37°C com agitação suave. Os filtros foram lavados em 2 χ SSC, NaDodSO^ 0,1% a 55°C, e expostos a uma película Kodak XAR-2 com um filtro intensificador DuPont Lightning Plus durante uma noite a 80°C. Após revelação, a amostra foi removida dos filtros lavando-os com 0,1 χ SSC, NaDodSO^ 0,1% a 65°C. Um grupo de filtros foi então hibridizado com a amostra B (Fig. 1), lavado e exposto como acima se descreveu. As áreas das placas que originaram sinais com as amostras A e B foram recolhidas, recolocadas em placas e transferidas para nitrocelulose em quadruplicado, amplificadas de acordo com Woo (21) e seleccionadas com as amostras A a D (Figura 1) (uma amostra por filtro). Os filtros foram lavados e expostos ao filme como acima se descreveu. Uma placa originando sinais com três (A a C) das quatro amostras foi purificada por uma repetição adicional das operações de colocação em placa e selecção.

(b) Biblioteca de cADN de fígado de vitelo. Aproximadamente 192 000 fagos recombinantes foram cultivados em placas ( 16 000 fagos/placa de 137 mm de diâmetro) em _E. col i XL1 - Blue, processadas como acima se descreveu e seleccionadas com E.coli amostra I (Fig. 2a). A amostra foi marcada com ADN polimerase I (fragmento de Klenow) e (<χ?²-Ρ) - d CTP (9)

Q para uma actividade específica de 2 χ 10 cpm/yxg. Os filtros foram seleccionados como se descreveu em (a) mas com as seguintes alterações: (1) A solução de hibridização compreendia formamida a 40% e (2) os filtros foram lavados em 2 χ SSC e NaDodS0₄ 0,1% a' 65%.

(c) Biblioteca genómica humana. Aproximadamente 10 fagos recombinantes de uma biblioteca genómica humana (Stratagene) foram cultivados em placa (50 000 fagos/placa) em E.coli LE 392, processados e seleccionados com o inserte de/780 bp BglII do cADNc n^Q 1 de bBMP (fig. 3). A amostra foi marcada (9) e os filtros hibridizados como acima se descreveu (ver biblioteca de cADN de fígado de vitelo). Os filtros foram lavados em 2 χ SSC, NaDodSO^ a 60° C. As placas positivas foram purificadas por recolocação em placas e resselecção.

(d) Biblioteca de cADN de rim humano (BMP/PCR).

Aproximadamente 1000 fagos recombinantes foram cultivados em placas (placa de 500 mm de diâmetro) em E.coli XL1 Blue, processadas, hibridizadas com a amostra J (Figura 4b, sublinhada) e lavados como em (a). As placas positivas foram purificadas por recolocação em placa e resselecção.

Exemplo 4 Isolamento

Subclonação, Sequenciação e Análises de ADN de fagos e plasmídeos

ADN de plasmídeo foi isolado pelo método de lise alcalina (Maniatis, et al, supra) e foi isolado o ADN lambda por meio de um processo miniprep de fago, descrito por Jones e Rawls, [Jones, K.W. e Rawls, J.M. Genetics 120: 733-742 (1988)] ·

Os plasmídeos Bluescript SK(-), que compreendem cADN da BMP, foram libertados do ZAP lambda pelo protocolo de libertação/excisão 1113 descrito pelo fornecedor (Stratagene). Os fragmentos de gene de BMP foram libertados a partir do vector lambda EMBL3 por Sall ou outras digestões com enzimas de restrição apropriadas (ver Figura 2 e Tabela 1). Os insertos de cADN de BMP foram excisados a partir do vector Bluescript SK(-) por uma digestão por BglII (cADN de bBMP) ou por Bam HI/HindIII (cADN de hBMP). Os fragmentos de ADN foram purificados por electroforese por gel de poliacri1amida ou gel de agarose (Maniatis, et al., supra) e passagem por uma coluna Elutip-d (Schleicher e Schuell) e foram então clonados em vectores de sequenciação pUC 19 ou M13ÍYamisch-Perron, C., Vieira, J. e Messing, J., Gene 33: 103-119 (1985)3 . A sequenciação do ADN foi realizada pelo método de terminação de cadeia de didesoxi (Sanger, F. Nicklen, S. e Coulson, A.R., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 5463-67 (1977)3 usando os primários de M 13 bem como os primários internos específicos. As regiões ambíguas foram resolvidas usando 7-desaza-2-desoxiguanidina-trifosfato [Barr, P.J., Thayer, R.M., Laybourn, P., Najarian, R.C., Seela, F. e Tolan, D., Biotechniques 4:428-32 (1986)3 ^e sequenase (U.S.Biochemicals).

Análises de mancha nothern. 0 ARN Poli (A)⁺ foi fraccionado em gel agarose a 1,4% em presença de formaldeído (Lehrech,H., Diamond, D., Wozney, J.M. e Boedtker, H., Biochemistry 16: 4743-51 (1977)] e directamente transferido para nitrocelulose, de acordo com Thomas (Thomas, P., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 5201-5 (1980)] .

Os filtros foram hibridizados com a amostra I ou cADN n^s 1 da bBMP e lavados como se descreveu previamente na selecção das bibliotecas, na Secção B.

Análises de mancha Southern. Manchas genómicas: 10/ig de ADN genómico de rato, bovino ou humano (Clontech) foram digeridos com EcoRI, foram fraccionados em gel de agarose a 0,7% e trans feridos para nitrocelulose (Maniatis, et al., supra). A hibridização e a lavagem foram realizadas de forma idêntica â descrita em Análises de mancha Nothern. Manchas de clone e PCR: ADN de clones genómicos, clones de cADN ou reacções de PCR foram digeridos com várias enzimas de restrição, fraccionados em gel de agarose a 1% e transferidos para nitrocelulose (Maniatis, et al., supra).

Exemplo 5

Expressão de BMPs humanas e bovina em leveduras

Os primários de PCR acima descritos em pormenor foram usados para gerar sequências de ADN com sítios de restrição Xba-1 e sal-1 para clonação directa na estrutura num vector pAB 125, um vector compreendendo a sequência lider doo<-factor (descrito na EPO Pub. No. 0116201, publicada a 22 de Agosto de 1984) fundida com o promotor ADH 2/GAPDH (descrito na Memória Descritiva do Pedido de Patente Norte Americana copendente No. 760.197, depositada a 29 de Julho de 1985).

Os blocos promotor/1íder/gene resultantes foram exisadas com BamH 1 e Sal-1 e cionadas no vector de expressão da levedura, pBS 24.1. 0 plasmideo pBS 24.1 é um derivado do pBS 24 que é descrito na Memória Descritiva da Patente Americana copendente No. 138.894 depositada a 24 Dezembro de 1987.

fragmento do vector BamHI - Sall do pBS 24 foi ligado a um fragmento BamHI - Sall FGF básico humano de 65 pares-base será substituído pelos blocos BamHI - Sall promotor/ /líder/BMP que estão ligadas no pBS 24,1. Os plasmideos resultantes pBS 24bBMP e pBS 24hBMP foram usados para transformar as espécies de leveduras AB110 com genotipos Mata, Ura3-52, leu 2-04 ou leu 2-3 e leu 2-112, pep 4-3, his 4-580, cir°, sob meios de selecção de leucina, tal como o meio completo sintético isento de leucina em Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratories, 1986, F. Sherman, G.R. Fink e J.B. Hicks. Para indução da expressão, as células foram cultivadas durante 48 horas com os seguintes meios deficientes em uracilo:

0	g Ácidos Casamínicos
5	g Sulfato de amónia
1	g Fosfato de potássio
0,5	g Sulfato de magnésio
0,1	g Cloreto de sódio
0,1	g Cloreto de cálcio
0,04	ml Mistura de elementos vestigiais
1	1 Molibdato de sódio a 2%
0,015	g Mistura de vitaminas
0,03	g Pantotenato
0,03	g Inositol
70	ml Glucose a 50%

q.b. para 900 ml a pH 6.0

q.b. para 1000 ml

Mistura de elementos vestigiais g Acido Bórico

0,4 g Sulfato cúprico g íodeto de potássio g Cloreto férrico g Sulfato de manganésio g Molibdato de sódio g Sulfato de zinco

q.b. para 1000 ml e esterilizar por filtração

Mistura de vitaminas g Mio-Inositol g Tiamina g Piridoxina g Pantotenato de cálcio

0,2 g Biotina g p-Acido aminobenzóico g Riboflavina

0,2 g Acido fólico g Niacina

As células de leveduras foram removidas do meio de cultura por centrifugação e as proteínas nos sobrenadantes foram analisadas após precipitação com ácido tricloroacético a 10%/desoxicolato (0,4 mg/ml). As peletes foram lavadas com acetona e carregadas sobre geles SDS-poliacri1amida a 15%, em conjunto com controlos apropriados. As proteínas foram seleccionadas por manchamento com Coomassie blue. Umas amostras da espécie S.cerevisae AB 110 compreendendo pBS 24.1 bBMP ou pBS 24,1 hBMP foram depositadas no ATCC em 1 de Junho ο

de 1989 sob os Nos. de Acesso 20 949 e 20 950.

Exemplo 6

Purificação de BMP de bovino, recombinante meio foi removido de células de leveduras por centrifugação, e concentrado aproximadamente 10 vezes. 0 pH foi ajustado para 4,5 e o concentrado foi diluído para uma condutividade inferior a 5 mS/cm. Esta solução foi aplicada a resina de permuta iónica Fast-Flow S (Pharmacia) pré-equi1ibrada com acetato de sódio 50 mM, EDTA 1 mM, PMSF (pH 4,5). A coluna foi lavada com um volume do tampão anterior e eluída usando para tal um gradiente de cloreto de sódio 0 M a 1 M no tampão anterior. As proteínas de 19 KD e 15 KD foram eluídas a uma condutividade compreendida no intervalo entre 5 mS/cm a 25 mS/cm, como foi confirmado por SDS-PAGE. As fracções que compreendiam predominantemente a proteína de 19KD foram reunidas, ajustadas para pH 7,5 e 4,5 M relativamente a ureia, concentrada, e aplicada a uma coluna de repartição dimensional S-100 em ureia 4 M, Tris/HCl 100 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM (pH 7,5). As fracções que compreendiam proteínas de 19 KD e 16 KD foram identificadas por SDS-PAGE, reunidas separadamente, concentradas e dialisadas em água antes de se proceder à liofilização.

Exemplo 7

Ensaio para actividade de BMP

Amostras de BMP recombinante purificada foram adicionadas ao meio de cultura CMRL-1066 (GIBCO) compreendendo fragmentos do músculo maior do tríceps abdominal de feto de rato.

Tecidos conectivos desenvolvidos foram cultivados num

substrato de matriz isenta de BMP a partir de diáfises de ossos longos de ratos Sprague-Dawley adultos machos, tste ensaio é descrito com maior pormenor por Kawakura e IJrist, Developmental Biology, 130, 435-442 (1982). A actividade indutiva é medida por incorporação de£³H]timidina em ADN, incorporação r 35 η deL SJsulfato em g1icosaminoglicanos e confirmação de condrogénese (formação de cartilagem) por histologia.

A BMP recombinante foi testada a concentrações compreendidas no intervalo entre 200 ng/ml a 5 g/ml em sistemas de cultura de 2 ml. Foram observados os mesmos níveis de resultados positivos com BMP recombinante, como foi previamente registado com BMP natural a concentrações equivalentes. Foram observadas incorporações mais elevadas de C³Hj timidina e [?⁵s] sulfato, novas cartilagens e condrócitos nas culturas induzidas por BMP recombinante. Nas culturas de controlo isentas de BMP recombinante não se observaram cartilagens ou condrócitos.

Exemplo 8

Isolamento e Análises do gene de BMP e cADN

I. 0 gene BMP bovino

As amostras A e B (Figura 1) foram usadas para isolar 1 clone de hibridização forte e 7 fracamente hibridizantes a partir de 10 recombinantes de uma biblioteca genómica de bovinos. 0 clone fortemente hibridizante (29-bg-3) foi submetido a uma segunda fase de selecção com amostras A a D (Fig. 1). Três das amostras (A a C) hibridizaram a 29-bp-3.

As análises de mancha Southern do ADN de 29-bg-3 purificado localizaram as amostras A e B num fragmento de 1,9 Kb EcoRI e a amostra C num fragmento de 1,2 Kb EcoRI-SalI. Ambos os fragmentos foram seguenciados e mostraram compreender regiões, na rede superior de leitura, que codifica os seus respectivos peptídeos trípticos (Fig. 2; aminoácidos envolvidos em caixa). Interessante, o peptídeo tríptico D estava também presente mas encontrava-se fraccionado entre dois exãos, explicando assim a lacuna de hibridização com a amostra D. As fronteiras Intrão-exão são conformes com a regra GT-AG e são realçadas por linhas verticais. Exãos adicionais da BMP de bovino não foram isolados. Foram dirigidas tentativas para o isolamento de um clone cADN da BMP de bovino usando como amostra sequências de exão obtidas a partir do gene da BMP de bovinos.

II. 0 cADN da BMP de bovinos

Análises de mancha Northern de ARN poli (A) ⁺ de vários tecidos de bovinos usando a amostra I revelaram que o fígado de vitelo é uma boa fonte de mARN de BMP de bovino (dados não apresentados). A amostra I foi então usada para isolar presumíveis clones de cADN de BMP de bovino a partir de uma biblioteca de cADN de fígado de vitelo.

Dois clones (n⁹ 1 e n⁹ 7) foram sequenciados, e mostraram compreender sequências sobrepostas idênticas, bem como peptídeos trípticos codificados pretendidos (A a D) (Figura 3) Os peptídeos trípticos de BMP adicionais (E a H, Figura 1) foram também detectados codificados no cADN de BMP de bovinos.

III. 0 gene BMP humano

As análises de mancha Northern do ARN poli (A)⁺ de vários tecidos e linhas de células humanas, incluindo fígado, rim e osteosazcoma, (usando o cADN do BMP de bovino n⁹ 1 como amostra) foram infrutíferas na detecção do BMP humano. No entanto, análises de mancha Southern, realizadas sob condições de hibridização e lavagem idênticas, detectaram fragmentos do

Α Á'/oyyyyy ú

gene humano (dado não apresentado).

Baseados nos resultados Northern e Southern, foi adoptada a seguinte estratégia para (1) clonar e sequênciar o gene BMP humana, depois (2) identificar uma fonte de tecido do mARN de BMP humano por amplificação em PCR (usando primários baseados em BMP humano; BMP/ PCR, cADN) e análises de mancha Southern dos produtos; (3) clonação e isolamento da cADN de BMP humana gerado pelo PCR.

cADN da BMP n^e1 foi usado como uma amostra para isolar 7 clones fortemente hibridizantes e 5 fracamente hibridizantes a partir de 10 recombinantes de uma biblioteca genómica humana. Análises de mancha Southern de ADN purificado a partir de 11 dos 12 clones identificaram dois fragmentos hibridizantes Hind III (1,7Kb e 2,0Kb) comuns aos três clones HG4, 5 e 9. Os fragmentos HindIII de 1,7Kb e 2,0Kb do HG9 foram sequenciados e revelaram possuir uma homologia de aminoácidos de 63,4% e 62,2% para os exãos de BMP de bovino apresentados nas Figuras 2A e 2B, respectivamente. A tabela 1 sumariza estes resultados, bem como os resultados de análises de mancha Southern para os restantes exãos de BMP humanos. A sequência da região que compreende o exão de cada sub-clone é apresentada nas Figuras 4a-c. A extremidade 5' do exão 1 (sítio Cap) e a extremidade 3' de exão 7 (sítio de adição poli (A)⁺) são desconhecidos.

As fronteiras intrão/exão seguem a regra GT-AG e são assinaladas por linhas verticais. 0 ADN foi traduzido em todas as redes de leitura. As redes superior e média compreendem os aminoácidos correctos para os exãos 1-6 e exão 7, respectivamente (assinalados em caixas).

IV. 0 cADN da BMP humana rim (linha de células 293) foi identificado como uma

β

- 49 fonte de mARN de hBMP por amplificaçao de PCR e analises de .

mancha Southern. 10 recombinantes de uma biblioteca de cADN, produzidas a partir de cADN de hBMP/PCR, foram seleccionados com a amostra J (amostra de exão 3 humano) e foram isolados 12 supostos clones de cADN de hBMP. A electroforese por gel de agarose após a digestão de Bam HI/Hind III dos clones revelaram que cada clone compreendia ou um inserto de cADN de 700bp ou um de 600 bp. A sequenciação de ADN revelou que a espécie com 700 bp era cADN da BMP humana de comprimento completo pretendido (Figura 5), enquanto que a espécie com 600 bp era uma cadeia de cADN de BMP humana truncada, a que falta o exão 2 (não representado). Esta espécie de cADN mais curta representa muito provavelmente uma cadeia de mARN não funcional cortada de forma aberrante, pois ocorre um desvio estrutural por translacção da rede na junção recentemente formada exão 1/ Γ exão 3, resultando num codão de terminação prematuro.

Exemplo 9

Análises de BMPs humanas e bovinas expressas em leveduras

A hBMP é expressa em leveduras como uma mistura de três proteínas de aproximadamente 17 KD, enquanto que a bBMP é expressa como uma mistura de 3 espécies com pesos moleculares de 19 KD e um dupleto de 16 KD. A heterogeneidade dimensional é muito provavelmente um resultado do processamento de cada BMP por enzimas codificadas na levedura durante a secreção. A sequenciação dos aminoácidos da parte amino terminal da mistura de bBMP originou um terminus amino simples (Phe), indicando que o processamento ocorre na região carboxilo da proteína, originando análogos de clivagem da levedura de 16 KD. Vários resíduos de aminoácidos básicos emparelhados nesta região são praticamente candidatos como sítios de proteólise durante a secreção. Esta observação, em conjunto com o facto de que cada cADN da BMP codifica um provável produto de proteína de peso molecular superior a 20 KD, também diminui a possibilidade que a BMP, in vivo, seja o produto de processamento proteolítico de um precurssor superior.

Tabela 1

Resumo dos resultados das análises de mancha Southern identificando ADN que compreende exões da BMP humana, a partir de clones genómicos.

Exão 1 2	Fragmento de Restrição	Clone
Dimensão 0.6 0.6	(kb)	Enzima Pst I Pst I	Genómico2 HG 43 HG 43	4 Amostra BMP 103 hBMP cADN
3	1.7		Hind III	HG 9	bBMP cADN
4	2.0		Hind III	HG 9	bBMP cADN
5	0.4		Bgl II	HG 5	BMP 116
6	3.0		Bgl II	HG 53	BMP 117
7	1.1		Bgl II	HG 5	BMP 104

- Fragmento de restrição de ADN contendo exões

- Clone genómico a partir do qual foi obtido o fragmento de restrição.

3-0 ADN dos exões 1 e 2 foram obtidos a partir de um fragmeii to de Sal I de 7 Kb do HG 4 subclonado em pUC 19. Ambos os exões foram detectados no mesmo fragmento Pst I, mas identificados com amostras diferentes. 0 exão 6 foi obtido a partir de um inserto de Sal I de 15 Kb do HG 5 subclonado

em pUC 19.

- Amostra usada para identificar o fragmento de restrição de ADN contendo o exão. As amostras foram descritas em 01igonucleotides Synthesis secção de Materials and Methods. As condições de hibridização e lavagem são descritas no Exemplo 3 na Secção Screening of the llbraries (c) human genomic library dos exemplos.

Claims (24)

1. REIVINDICAÇÕES:

   1^â - Processo para a preparação de composições contendo um polipéptido escolhido do grupo que consiste em proteína morfogenética do tecido ósseo de mamíferos (BMP) e seus análogos substancialmente isento de outros factores ostereoindutivos associados, caracterizado pelo facto de compreender as operações que consiste¹''¹ em (a) se proporcionar uma população de células contendo uma sequência de ADN heteróloga, em que a citada sequência de ADN compreende (i) sequências de controlo da transcrição e da translação funcionais nas referidas células, e (ii) uma sequência de codificação sob o controlo das citadas sequências de transcrição e translação que codifica um polipéptido que compreende BMP de mamíferos e seus análogos; e (b) se desenvolver a mencionada população de células em condições sob as quais se expressa o referido polipéptido.
2. 2^â - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a citada proteina morfogenética do tecido ósseo de mamíferos ser BMP humana.
3. 3^â - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a mencionada proteina morfogenética do tecido ósseo de mam'feros ser BMP bovina.
4. 4² - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido Olipéptido compreender a sequência de aminoácidos aa^ - aa₁₈₂ seguinte

   53 -2Í

   Me t II eSer ArgMetG luLy sMet ThrMetMetMetLy s I leLeul 1 eMetPhe 1 ACAATCATGATTTCCAGAATGGAGAAGATGACGATGATGATGAAGATATTGATTATGTTT TGTTAGTACTAAAGGTCTTACCTCTTCTACTGCTACTACTACTTCTATAACTAATACAAA

   -I Hl

   AlaLeuGlyMetAsnTyrTrpSerCysSerGlyPheProValTyrAspTyrAspProSer 61 GCTCTTGGAATGAACTACTGGTCTTGCTCAGGTTTCCCAGTGTACGACTACGATCCATCC

   CGAGAACCTTACTTGATGACCAGAACGAGTCCAAAGGGTCACATGCTGATGCTAGGTAGG

   SerLeuArgAspAlaLeuSerAlaSerValValLysValAsnSerGlnSerLeuSerPro 121 TCCTTAAGGGATGCCCTCAGTGCCTCTGTGGTAAAAGTGAATTCCCAGTCACTGAGTCCG

   AGGAATTCCCTACGGGAGTCACGGAGACACCATTTTCACTTAAGGGTCAGTGACTGAGGC

   TyrLeuPheArgAlaPheArgSerSerLeuLysArgValGluValLeuAspGluAsnAsn 181 TATCTGTTTCGGGCATTCAGAAGCTCATTAAAAAGAGTTGAGGTCCTAGATGAG AACAAC

   ATAGAGAAAGCCCGTAAGTCTTCGAGTAATTTTTCTCAACTCCAGGATCTACTCTTGTTG

   LeuValMetAsnLeuGluPheSerlleArgGluThrThrCysArgLysAspSerGlyGlu 241 TTGGTCATGAATTTAGAGTTCAGCATCCGGGAGACAACATGCAGGAAGGATTCTGGAGAA

   AACCAGTACTTAAATCTCAAGTCGTAGGCCCTCTGTTGTACGTCCTTCCTAAGACCTCTT

   AspProAlaThrCysAlaPheGlnArgAspTyrTyrValSerThrAlaValCysArgSer 301 GATCCCGCTACATGTGCCTTCCAGAGGGACTACTATGTGTCCACAGCTGTTTGCAGAAGC

   CTAGGGCGATGTACACGGAAGGTCTCCCTGATGATACACAGGTGTCGACAAACGTCTTCG

   ThrValLysValSerAlaGlnGlnValGlnGlyValHisAlaArgCysSerTrpSerSer 361 ACCGTGAAGGTATCTGCCCAGCAGGTGCAGGGCGTGCATGCTCGCTGCAGCTGGTCCTCC

   TGGCACTTCCATAGACGGGTCGTCCACGTCCCGCACGTACGAGCGACGTCGACCAGGAGG

   SerThrSerGluSerTyrSerSerGluGluMetllePheGlyAspMetLeuGlySerHis 4 21 TCCACGTCTGAGTCTTACAGCAGCGAAGAGATGATTTTTGGGGACATGTTGGGATCTCAT

   AGGTGCAGACTCAGAATGTCGTCGCTTCTCTACTAAAAACCCCTGTACAACCCTAGAGTA

   LysTrpArgAsnAsnTyrLeuPheGlyLeuIleSerAspGluSerlleSerGluGlnPhe 481 AAATGG AGAAACAATTATCTATTTGGTCTCATTTCAGACG AGTCCATAAGTGAACAATTT

   TTTACCTCTTTGTTAATAGATAAACCAGAGTAAAGTCTGCTCAGGTATTCACTTGTTAAA

   TyrAspArgSerLeuGlylleMetArgArgValLeuProProGlyAsnArgArgTyrPro 541 TATGATCGGTCACTTGGGATCATGAGAAGGGTATTGCCTCCTGGAAACAGAAGGTACCCA

   ATACTAGCCAGTGAACCCTAGTACTCTTCCCAIAACGGAGGACCTTTGTCTTCCATGGGT

   ISL

   AsnHisArgHisArgAlaArglleAsaThrAspPheGluOC 601 AACCACCGGCACAGAGCAAGAATAAATACTGACTTTGAGTAACGGCCTTGAGGT

   TTGGTGGCCGTGTCTCGTTCTTATTTATGACTGAAACTCATTGCCGGAACTCCA ou um seu fragmento.
5. 5^â - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o mencionado polipéptido compreender a sequência de aminoácidos aa₁ - aa₁₈₀ seguinte

   1 TGATAAACAGCTGCTTTCAGGACAACIGGTCAGCCCCAAAGGCACACAGACAATCTCCCT actatttgtcgacgaaXgtcctgttgaccagtcggggtttccgtgtgtctgttagaggga

   MetGluLysMetAlaMetLysMetLeuVal 61 ATCTCTGGCACGGAAATTGTTCTTCCCATAATGGAGAAGATGGCGATGAAGATGTTGGTG TAGAGACCGTGCCTTTAACAAGAAGGGTATTACCTCTTCTACCGCTACTTCTACAACCAC

   -I|»l

   IlePheValLeuGlyMetAsnHísTrpThrCysThrGlyPheProValTyrAspTyrAsp 121 ATATTTGTCCTTGGAATGAACCACTGGACTTGTACAGGTTTCCCGGTGTATGACTATGAC

   TATAAACAGGAACCTTACTTGGTGACCTGAACATGTCCAAAGGGCCACATACTGATACTG

   ProAlaSerLeuLysGluAlaLeuSerAlaSerValAlaLysValAsnSerGlnSerLeu 181 CCGGCTTCCCTGAAGGAGGCTCTCAGCGCCTCTGTGGCAAAAGTGAATTCCCAGTCACTG

   GGCCGAAGGGACTTCCTCCGAGAGTCGCGGAGACACCGTTTTCACTTAAGGGTCAGTGAC

   SerProTyrLeuPheArgAlaPheArgSerSerValLysArgValAsnAlaLeuAspGlu 241 AGCCCSTATCTGTTTCGGGCGTTTAGAAGCTCAGTTAAAAGAGTCAACGCCCTGGACGAG

   TCGGGGATAGACAAAGCCCGCAAATCTTCGAGTCAATTTTCTCAGTTGCGGGACCTGCTC

   AspSerLeuThrMetAspLeuGluPheArglleGlnGluThrThrCysArgArgGluSer 301 GACAGCTTGACCATGGACTTAGAGTTCAGGATTCAAGAGACGACGTGCAGGAGGGAATCT

   CTGTCGAACTGGTACCTGAATCTCAAGTCCTAAGTTCTCTGCTGCACGTCCTCCCTTAGA

   GluAlaAspProAlaThrCysAspPheGlnArgGlyTyrHisvalProValAlaValCys 361 GAGGCAGACCCCGCCACCTGTGACTTCCAGAGGGGCTACCACGTGCCCGTGGCCGTTTGC

   CTCCGTCTGGGGCGGTGGACACTGAAGGTCTCCCCGATGGTGCACGGGCACCGGCAAACG

   ArgSerThrValArgMetSerAlaGluGlnValGlnAsnValTrpValArgCysHisTrp 4 21 AGAAGCACCGTGCGGATGTCTGCTGAACAGGTGCAGAACGTGTGGGTTCGCTGCCACTGG

   TCTTCGTGGCACGGCTACAGACGACTTGTCCACGTCTTGCACACCCAAGCGACGGTGACC

   SerSerSerSerGlySerSerSerSerGluGluMetPhePheGlyAspIleLeuGlySer 4 81 TCCTCCAGCTCTGGGTCCAGCAGCAGTGAAGAGATGTTTTTTGGGG ATATCTTGGGATCC

   AGGAGGTCGAGACCCAGGTCGTCGTCACTTCTCTACAAAAAACCCCTATAGAACCCTAGG

   SerThrSerArgAsnSerTyrLeuLeuGlyLeuThrProAspArgSerArgGlyGluPro 541 TCTACATCAAGAAACAGTTACCTGCTTGGCCTCACTCCTGACAGATCCAGAGGTGAACCA

   AGATGTAGTTCTTTGTCAATGGACGAACCGGAGTGAGGACTGTCTAGGTCTCCACTTGGT .-55 -

   LeuTyrGluProSerArgGluMetArgArgAsnPheProLeuGlyAsnArgArgTyrSer 601 CTTTATGAACCATCACGTGAGATGAGAAGAAACTTTCCTCTTGGAAATAGAAGGTACTCG

   GAAATACTTGGTAGTGCACTCTACTCTTCTTTGAAAGGAGAACCTTTATCTTCCATGAGC ir®

   Asn ProTrp ProArg Al aArgValAsnProG ly PheGluOP 661 AACCCGTGGCCCAGAGCAAGAGTAAACCCTGGCTTTGAGTGACAGCCTTAAGCAAAATGC

   TTGGGCACCGGGTCTCGTTCTCATTTGGGACCGAAACTCACTGTCGGAATTCGTTTTACG

   721 ACTGGAAGGAATAGAAGTTCCAATGAAGAAAGATACCTTATGAATTGTGTAATTTTCTTT

   TGACCTTCCTTATCTTCAAGGTTACTTCTTTCTATGGAATACTTAACACATTAAAAGAAA

   781 TGATCAATTGCAGTCCCTAATAAATGGCTTACTTTTCC ACTAGTTAACGTCAGGGATTATTTACCGAATGAAAAGG ou um seu fragmento.
6. 6³ - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de o referido polipéptido compreender um análogo de clivagem de fermento de 16 KD.
7. 7^â - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se empregar uma sequência de ADN isenta de intrão ou o seu complemento que codifica um polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos da proteína BMP de mamíferos e seus análogos.
8. 8^â - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de o referido ADN codificar a proteína BMP humana.

   - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de o mencionado ADN codificar BMP bovina.
9. 10- - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de o mencionado polipéptido compreender a sequência do sinal da BMP de mamíferos.
10. 11^â - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de o referido polipéptido não compreender a sequência de sinal da BMP de mamíferos.
11. 12^â - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de o citado polipéptido compreender ainda uma sequência de sinal do factor alfa de levedura N-terminal, que provoca a secreção num hospedeiro da levedura.
12. 13¹ - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se obter um replicão que compreende uma sequência de ADN de acordo com a reivindicação 8.
13. 14^ã - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se obter um vector contendo uma sequência de ADN.
14. 15⁵ - Processo de acordo com a reivindicação 13, carac terizado pelo facto de se obter uma célula contendo um replicão.
15. 16^ã - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de se obter uma célula contendo um vector.
16. 17^â - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido polipéptido ser a BMP humana.
17. 18^§ - Processo de acordo ^rom a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de o mencionado polipéptido ser a BMP bovina.
18. 19^§ - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida população de células ser constituída por microrganismos.
19. 20⁵ - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a citada população de células ser formada por levedura.
20. 21^â - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a mencionada população de células ser constituída por E. coli.
21. 22⁵ - Processo de acordo com a reivindicação 17, carac terizado pelo facto de o referido polipéptido compreender ainda uma sequência de sinal no terminal N do citado polipéptido, e o referido polipéptido ser segregado pelas mencionadas células.
22. 23^â - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo facto de as citadas células de levedura e a referida sequência de sinal ser uma sequência de sinal do factor alfa da levedura.
23. 24^â - Processo para provocar o crescimento de ossos, em contacto com uma composição contendo uma proteína BMP de mamífero ou um seu análogo.
24. 25^ã - Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se produzir um anticorpo monoclonal para uma proteina morfogenética do tecido ósseo de mamíferos.