JP2000502241A

JP2000502241A - 松果腺特異的遺伝子−１

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Publication number: JP2000502241A
Application number: JP09500354A
Authority: JP
Inventors: ヘ，ウェイ・ウー; ローゼン，クレイグ・エイ
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1995-06-05
Filing date: 1995-06-05
Publication date: 2000-02-29
Also published as: EP0831866A4; KR19990008010A; EP0831866A1; AU2766095A; WO1996039158A1; AU716415B2

Abstract

(57)【要約】ヒト松果腺特異的遺伝子−１ポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ(ＲＮＡ)、および方法を開示する。また、下垂体腺の制御および生物学的リズムを調節するためそのようなポリペプチドを利用する方法をも開示する。そのようなポリペプチドに対するアゴニストおよびアンタゴニストおよびそのようなポリペプチドの作用を制御するための治療剤としての使用をもまた開示する。該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中の変異を検出するおよび宿主中のポリペプチドのレベルの変化を検出するための診断アッセイもまた開示する。

Description

【発明の詳細な説明】松果腺特異的遺伝子−１本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に関する。とりわけ、本発明のポリペプチドは、時として以下で「ＰＧＳＧ −１」と呼ぶ、松果腺特異的遺伝子−１として推定的に同定されているものである。ヒトおよび他の哺乳動物の松果腺（松果腺または上生体）はその機能的な作用において内分泌腺であると考えられている。しかしながら、その由来および脊椎動物内の進化において他の機能的な関係を有する。下等動物において、松果体の光受容能力は微小構造および神経生理学の両者に基づいて示唆される主要な作用である。哺乳動物の松果腺は神経内分泌系の特有な要素である。松果腺内において、神経およびホルモン入力は松果腺独特の実質細胞および松果腺細胞の合成および分泌作用を制御するよう相互作用する。これらの細胞は２つの化学的ファミリーのホルモンを合成および分泌すると信じられている：メラトニンなどのインドールアミンおよび視床下部下垂体系のペプチドに類似しているペプチド。松果腺の主要な内分泌機能はサーカディアンリズムとして知られる生物学的リズムのいくつかのタイミングを媒介または調節するものである。この調節は２４時間（サーカディアン）の相のタイミングにおける変化および日照の開始および終了などの環境の手掛かりに応じた季節性または年間（サーカニュアル）リズムの相における変化に関する。ストレスおよび刺激により交感神経支配および生理学的相互作用が豊富である松果腺はその内分泌作用の確率がこれらの因子同様に結び付いていることを示唆している。松果腺はさらにある条件下で脳化学および興奮しやすい性質の側面に作用すると考えられている。松果腺機能の最も明瞭な証明はいくつかの光周性（photoperiodic）の種において生殖器官の季節性の退化を起こす。これらの種の中で最も研究されているゴールデンハムスターにおいては、暗さまたは短い日照時間によって促進される生殖退行は松果腺の存在に依存する。他の種でアるヒトにおいて、顕著な２４時間および季節性のリズムが松果腺ホルモンであるメラトニンの血中レベルにおいて起こる。ヒト松果腺は胎児生命の初期に発達する。成人においては単なる正中構造であるが、胎児においては、２つの部位を有し、前の固体部は手綱交連（habenularc ommissure）領域に由来し、後ろの空洞部は手綱交連および後部の視交叉の間の間脳頂部の永年膨出（secular evagination）に由来する。哺乳動物の松果腺は主として松果腺細胞の大きさにおける増加、二次的および一層変化に富んではグリアおよびストローマ細胞および産物における増加によって小児から成体まで増殖する。成人松果腺は長さ５〜８mm、幅３〜５mmである。その薄い結合組織カプセル髄膜組織に外的に続くものであり、基本的に、松果茎によって邪魔されるものである。松果体の神経支配は排他的に自動的であり、松果腺細胞の内分泌機能はその交感神経支配に依存することが優勢な見解である。松果腺の解剖学的な位置は頭蓋内の静脈溝に重要である。正中および深い静脈の中の深い大脳皮質静脈からの出力の統合に密接に存在する。松果体の腫瘍はしばしば脳梁膨大に対して圧縮することによってこの出力を妨げるかまたは変える。該松果体細胞は活性である酸化代謝およびタンパク質合成のオルガネラを有し、少なくとも構造の一部は通常中枢神経系または網膜組織におけるシナプス結合に関連する。松果体細胞は分泌前物質を含むと信じている者もいる小胞または密度の高い松果体（dense bodies）を含む。しかしながら、限極した濃度およびこれらの小胞および体の数は一般的にそう多くない。松果体細胞のミトコンドリアはその数の相対的に多いことまたは細胞質中の濃度、多型性および大きさが大きいことがよくあることに顕著である。多くのオルガネラおよび松果体細胞の包含は２４時間の変化周期に従う。この主題に対する関心は松果体のセロトニン（５−ＨＴ、５−ヒドロキシトリプトアミン）中の高く増幅された２４時間リズムの発見および続くメラトニンの合成に貢献する酵素活性にて起こった。メラトニン合成および分泌に貢献する化学的および超構造（ultrastructual）要素はその松果体細胞内に存在する。松果体細胞、細胞質小胞体、微小管、グリコーゲン顆粒、シナプスリボンおよびシナプスリボン領域は顕著な２４時間周期を同様に示す。これらの要素の多くは、日周の間の夜または暗い相の間に１日のうちのピークおよび頂点位相を有す。このことは哺乳動物において松果体細胞は化学的媒体の輸送および放出において一層様々に関連する。松果体産物は機能においてホルモンであり、脳内の他の器官および体に作用すると考えられている。松果体産物は２つの生化学的なタイプがあり、インドールアミンおよびペプチド、またはタンパク質である。松果腺は、これらのレベルが松果腺摘出手術を施した動物において消滅するので、血中のメラトニンの通常レベルに必要である。ヒトおよび研究された他の動物の血漿メラトニン濃度は、１日のうちの時間、季節または年においておよび松果腺生合成において生来の２４時間リズムにおいて変化し、初期新生動物においての代謝活性は交感神経制御下にあり、その器官は交感神経系を必要とする。この交感制御はノルエピネフリンおよびサイクリックａｍｐの媒体により制御される。松果腺で産生されるペプチドの多くは、視床下部下垂体系において見いだされる。松果腺で産生される他のペプチドはアルギニン、バソプレッシン、アルギニンバソトシン、ＬＨ−ＲＨ、ＴＲＨ、ソマトスタチン、α−ＭＳＨ、アンジオテンシン２およびＰ物質が含まれる（クァイ（Ｑuay，Ｗ．Ｂ．）、Histology Cell and Tissue Biology）第５版、１０７９〜１０８９頁（１９７７）、（ヴァイス（Weiss，Ｌ.）編）。松果腺腫瘍はgerminomasとしても知られるが、下垂体腺に及ぼす阻害効果を破壊すると考えられ、その結果、子どもの貴重な思春期を引き起こす。松果腺腫瘍は子どもに最もよく見られると知られている。本発明の１つの態様により、新規の成熟ポリペプチドならびに生物学的に活性であり、診断上または治療上有用なその断片、アナログおよび誘導体を提供する。本発明のポリペプチドはヒト起源のものである。本発明の他の１つの態様により、ｍＲＮＡ，ＤＮＡ，ｃＤＮＡ，ゲノムＤＮＡを含め、単離された核酸分子、さらにはまた、そのアナログ、ならびに生物学的に活性であって、診断上または治療上有用なそのフラグメントを提供する。本発明のさらに別の態様により、組換え原核および／または真核宿主細胞を培養すること、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を該タンパク質の発現を促進し、さらに該タンパク質の回収をする条件下で含む組換え技術によるそのようなポリペプチドの産生方法を提供する。本発明のさらに別の態様により、そのようなポリペプチドならびに例えば下垂体腺の分泌制御および生物学的リズムのための治療上の目的のため、コードするようなポリヌクレオチドを利用する方法を提供する。本発明のさらに別の態様により、本発明の核酸配列に特異的にハイブリダイズすることができるのに十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブも提供する。本発明のさらに別の態様により、そのようなポリペプチドに対する抗体を提供する。本発明の別の態様により、本発明のポリペプチド受容体に結合し活性化する化合物および本発明のポリペプチドの受容体に結合して阻害する化合物を決定するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。本発明の別の態様により、治療上の目的のために本発明のポリペプチドに結合し、活性化させる化合物を利用する方法を提供する。本発明のさらに別の態様により、治療上の目的のために本発明のポリペプチドの受容体に結合し、不活性化させる化合物を利用する方法を提供する。本発明の別の態様により、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列における変異に関連する疾患および本発明のポリペプチドのレベルの変化を検出するための診断アッセイを提供する。本発明のさらに別の態様により、科学的研究、ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの製造に関連したイン・ビトロでの目的のためにそのようなポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用する方法を提供する。本発明のこれらの態様および他の態様は、本明細書中の教示から当業者に明らかであろう。以下の図面は、本発明の態様を説明するものであって、請求の範囲により包含される本発明の範囲を限定しようとするものではない。図１は、ＰＧＳＧ−１のｃＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を説明する。下線領域は推定シグナル配列を表わし、アミノ酸に関する標準的な１文字略号を使用する。本発明の一つの態様により、図１（配列番号：２）の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド、または１９９５年５月２４日にＡＴＣＣ受託番号第号として寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする、単離された核酸（ポリヌクレオチド）を提供する。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト松果腺組織由来のｃＤＮＡライブラリー中で発見された。本発明のポリヌクレオチドは、ヒト松果腺由来のｃＤＮＡライブラリー中で発見された。該ポリヌクレチドは最初の約２１アミノ酸が推定リーダー配列である３２３アミノ酸を含む成熟タンパク質であるような３４４アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。本発明のタンパク質の推定可溶性成熟部分は配列番号：１のアミノ酸１から２６２を含む。該タンパク質は、配列番号：２のアミノ酸２６２から３２３を含むとして推定的に同定されている膜貫通部位を含む。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形で、またはＤＮＡの形であり得、このＤＮＡには、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ，および合成ＤＮＡが含まれる。該ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖であるなら、コーディング鎖または非コーディング（アンチーセンス）鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコーディング配列は、図１（配列番号：２）に示すコーディング配列または寄託されたクローンのコーディング配列と同じであってよく、あるいは遺伝コードの重複または縮重の結果として、図１（配列番号：１）のＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なったコード配列であってもよい。図１（配列番号：２）の成熟ポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、以下のものが含まれ得る：成熟ポリペプチドのコーディング配列のみ；成熟ポリペプチドのコーディング配列、およびリーダーもしくは分泌配列またはプロタンパク質配列といったような付加的コーディング配列；成熟ポリペプチドのコーディング配列( また場合により、付加的コーディング配列)、および成熟ポリペプチドのコーディング配列のイントロンまたは非コーディング配列５'および／または３'といったような非コーディング配列。従って、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコーディング配列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはまた、付加的コーディングおよび／または非コーディング配列が含まれるポリヌクレオチドを包含する。本発明はさらに、図１（配列番号：２）の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする、上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在するアレル変異体またはポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体であり得る。従って、本発明には、図１（配列番号：２）に示すのと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドの変異体が含まれ、これらの変異体は、図１（配列番号：２）のポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコードする。そのようなヌクレオチド変異体には、欠失変異体、置換変異体並びに付加および挿入変異体が含まれる。先に示したように、該ポリヌクレオチドは、図１（配列番号：１）に示すコーディング配列の天然に存在するアレル変異体または寄託されたクローンのコーディング配列の天然に存在するアレル変異体であるコーディング配列を有し得る。当業界で知られているように、アレル変異体は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得る別の形のポリヌクレオチド配列であり、これは、コードされるポリペプチドの機能を実質的には変えない。本発明にはまた、成熟ポリペプチドのコーディング配列が、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列に、同じ読み枠内で融合し得るポリヌクレオチドも含まれる。リーダー配列を有するポリペプチドがプレタンパク質であり、また宿主細胞により切断されて、成熟型のポリペプチドを形成したリーダー配列を有することがある。該ポリヌクレオチドはまた、付加的５'アミノ酸残基を加えた成熟タンパク質であるプロタンパク質もコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質がプロタンパク質であり、また不活性型のタンパク質である。プロ配列が一度切断されると、活性成熟タンパク質が残る。従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、またはプロ配列を有するタンパク質、またはプロ配列およびプレ配列（リーダー配列）の両方を有するタンパク質をコードし得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能とするマーカー配列に枠内で融合したコード配列も有し得る。細菌宿主の場合には、そのマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を提供するための、pＱＥ−９ベクターにより与えられるヘキサーヒスチジンタグ(tag)であってよく、または、例えば、哺乳動物宿主、例えば、ＣＯＳ−７細胞を使用する場合には、そのマーカー配列は、赤血球凝集素（ＨＡ）タグであってよい。ＨＡタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対応する（ウィルソン（Wilson，Ｉ.）ら、Cell、３７：７６７（１９８４））。本発明はさらに、配列間に少なくとも７０％、また好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性がある場合に、上記の配列にハィブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、ストリンジェント条件下、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェント条件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、また好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを意味する。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１（配列番号：１）のcＤＮＡもしくは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能もしくは活性を保持する、すなわち、可溶性神経ペプチド受容体として、例えば第二次メッセンジャー応答を引き出すことによって膜結合神経ペプチド受容体としては機能しないポリペプチドでさえ該受容体のリガンドに結合することができる能力を保持することによって機能するポリペプチドをコードする。また、該ポリヌクレオチドは本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、上記のように同定されている、活性を有さない少なくとも２０塩基、好ましくは３０塩基、よりこのますくは少なくとも５０塩基を含む。そのようなポリヌクレオチドは、配列番号：１のポリヌクレオチドのプローブとして、例えば該ポリヌクレオチドの回収または診断プローブとしてまたはＰＣＲプライマーとして使用されてよい。本明細書中でいう寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件の下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者への便宜として与えられるものであって、寄託が３５Ｕ.Ｓ.Ｃ．§１１２下に要求されることを承認するものではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオチドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成して、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾する際はいつでも照合している。寄託された物質を製造し、使用し、または販売するには、実施許諾が要求され得、またそのような実施許諾は、ここでは付与されない。本発明はさらに、図１（配列番号：２）の推定アミノ酸配列を有する、または寄託されたcＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、さらにはまた、そのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関する。図１（配列番号：２）のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドを示す場合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」という用語は、そのようなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能もしくは活性を保持するポリペプチドを意味する。従って、アナログには、プロプロテイン部分を切断することにより活性化して、活性な成熟ポリペプチドを製造することができるプロプロテインが含まれる。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、好ましくは組換ポリペプチドであってよい。図１（配列番号：２）のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が同型または非同型アミノ酸残基(好ましくは、同型アミノ酸残基)で置換されており、またそのような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコードされるものであってもよく、またはコードされたものでなくてもよいもの、（ii）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、または（iii）成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増加させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のような、他の化合物と融合しているもの、または（iv）リーダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に使用される配列、またはプロプロテイン配列といったような、付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているものであり得る。そのようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ましくは、均一となるまで精製される。「単離された」という用語は、物質がその元の環境(例えば、それが天然に存在するなら、天然の環境)から除去されていることを意味する。例えば、生きている動物にある天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然の系における共存物質のいくつかまたは全てから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの部分となり得、および／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の部分となり得、またそのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の部分ではないという点で、なお単離されている。本発明のポリペプチドは配列番号：２のポリペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに配列番号：２のポリペプチドに少なくとも７０％の類似性（好ましくは少なくとも７０％の同一性）、およびより好ましくは少なくとも９０％の類似性（より好ましくは少なくとも９０％の同一性）およびさらにより好ましくは少なくとも９５％のを有する類似性（より好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有すポリペプチドおよび少なくとも３０アミノ酸およびより好ましくは少くとも５０アミノ酸を一般的に含むポリペプチドの部位を有するポリペプチドの一部を含む。当該技術分野において公知のように、２つのポリペプチドの間の『類似性』とは、アミノ酸配列に比較して決定され、ついで第二のポリペプチドの配列のポリペプチドの保存された置換されたアミノ酸が決定される。本発明のポリペプチドの断片または一部はペプチド合成によって対応する完全長のポリペプチドのを産生するのに使用されてよい；それゆえ、断片は完全長ポリペプチド産生する中間体として使用されてよい。本発明のポリヌクレオチドの断片または一部は本発明の完全長ポリヌクレオチドを合成するのに使用されてよい。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドが含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え技術による製造にも関する。宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで遺伝的に操作される(トランスデュースされ、またはトランスフォームされ、またはトランスフェクトされる)。該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、またはＫＧＦ−２遺伝子を増幅するのに適するよう修飾された従来の栄養培地で培養することができる。温度、ｐＨ等といったような培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で先に使用した培養条件であって、当業者に明らかであろう。本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドを組換え技術により製造するのに使用することができる。従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプチドを発現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに含ませることができる。そのようなベクターには、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡとの組合せから得られるベクター；ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったようなウイルスＤＮＡが含まれる。しかし、他のいずれのベクターも、それが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することができる。適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベクターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、当業者の範囲内であると思われる。発現ベクターのＤＮＡ配列を、適当な発現制御配列(プロモーター)に作動可能に結合し、mＲＮＡ合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例として、以下のものが挙げられる：ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ.coli. lacまたはtrp、ファージラムダＰ_Lプロモーター、および原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスでの遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終結区も含む。該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配列も含み得る。さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の場合にはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性といったような、またはＥ.coliではテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性といったような、トランスフォームされた宿主細胞の選択のための表現型特性を与えるために、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含むのが好ましい。上記のような適当なＤＮＡ配列、さらにはまた、適当なプロモーターまたは制御配列を含むベクターを、適当な宿主をトランスフォームするために使用して、その宿主がタンパク質を発現するのを可能にすることができる。適当な宿主の代表例として、以下のものが挙げられる：Ｅ.coli、Streptomyce s 、Salmonella typhimuriumといったような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；Drosophila Ｓ２およびSpodoptera Sf ９といったような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯｓまたはBowesメラノーマといったような動物細胞；アデノウイルス；植物細胞等。適当な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載した配列を１つまたはそれ以上含む組換え構築物も含まれる。その構築物は、本発明の配列が順または逆方向で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベクターといったようなベクターを含む。この実施態様の好ましい態様では、該構築物はさらに、例えば、該配列に作動可能に結合したプロモーターを含め、制御配列を含んでなる。適当なベクターおよびプロモーターが多数、当業者に知られていて、市販されている。以下のベクターを例として挙げる。細菌用:pＱＥ７０、pＱＥ６０、pＱＥ−９（キアゲン(Q iagen)）、pbs、pＤ１０、ファージスクリプト(phagescript)、psiＸ１７４、pb luescript ＳＫ、pbsks、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６a、pＮＨ１８Ａ、pＮＨ４６Ａ（ストラタジーン(Stratagene)）；ptrc９９a、pＫＫ２２３−３、pＫＫ２３３− ３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ５（ファルマシア(Pharmacia)）。真核生物用: pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡＴ、pＯＧ４4、pＸＴ１、pＳＧ(Stratagene)、pＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ（ファルマシア）。しかし、他のいずれのプラスミドまたはベクターも、それらが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することができる。プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベクターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。個々に名付けられた細菌プロモーターには、lacI、lacＺ、Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰ_R、Ｐ_Lおよびtrpが含まれる。真核プロモーターには、ＣＭＶ即時初期(immediate early)、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスのメタロチオネイン− Ｉが含まれる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、十分、当業者のレベルの範囲内である。さらなる態様では、本発明は、上記の構築物を含む宿主細胞に関する。その宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような低等真核細胞であり得て、または該宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ− デキストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより行うことができる。（デイビス（Davis,Ｌ.）、ディブナー（Dibner,Ｍ.）、バッティー（Battey,Ｌ.）、ベーシック・メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Basic Methods in Molecular Biology）（１９８６）)。宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用して、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造することができる。あるいはまた、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成装置により合成的に製造することができる。本発明のポリペプチドの断片はペプチド合成によって対応する完全長のポリペプチドを産生するのに使用してよく、それゆえ、該断片は完全長ポリペプチドを産生する中間体として使用してよい。本発明のポリヌクレオチドの断片は同様の方法で本発明の完全長ポリヌクレオチドを合成するのに使用してよい。成熟タンパク質は、適当なプロモーターの制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で発現させることができる。そのようなタンパク質を、本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造するために、無細胞翻訳系もまた使用することができる。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニングおよび発現ベクターは、サンブルック（Sambrook）ら、モレキユラー・クローニング（Molecular Ｃloning）：ア・ラボラトリー・マニュアル（A Laboratory Manual）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク、(１９８９)により記載されており、この開示は、本明細書の一部を構成する。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。例には、bp １００〜２７０の、複製開始点の後期側にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。通例、組換え発現ベクターには、複製開始点、および宿主細胞のトランスフォーメーションを可能にする選択可能なマーカー、例えば、Ｅ.coliのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ.cerevisiae ＴＲＰ１遺伝子、並びに下流の構造配列の転写を行わせるために高度に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含まれるであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)のような解糖系酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンから得ることができる。ヘテロロガス構造配列は、翻訳開始および終結配列、また好ましくは、翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔または細胞外媒体への分泌を行わせることができるリーダー配列と共に、適当な相(phase)で構築される。場合により、そのヘテロロガス配列は、所望の特性、例えば、発現された組換え生成物の安定化または精製の簡易化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融合タンパク質をコードすることができる。細菌で使用するのに有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適当な翻訳開始および終結信号と共に、機能的なプロモーターを有する作動可能なリーディング相に挿入することにより構築される。そのベクターは、ベクターの維持を確実なものとするために、また所望により、宿主内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現型の選択可能なマーカーおよび複製開始点を含んでなるであろう。トランスフォーメーションに適当な原核宿主には、大腸菌（Ｅ.coli）、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、ならびにシュードモナス（Pseudomonas）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、およびスタフィロコッカス（Staphylococcus）属の範囲内の様々な種が含まれるが、他のものもまた、選択物質として使用することができる。代表的であるが、非限定的な例として、細菌で使用するのに有用なベクターは、周知のクローニングベクターpＢＲ３２２(ＡＴＣＣ３７０１７)の遺伝要素を含んでなる市販のプラスミドから得られる、選択可能なマーカーおよび細菌の複製開始点を含んでなり得る。そのような市販のベクターには、例えば、pＫＫ２２３−３（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Pharmacia Fine Chemicals）、ウプサラ（Uppsala）、スウェーデン)およびＧＥＭ１(プロメガ・バイオテク（Promega Biotec）、マディソン、ウィスコンシン、米国)が含まれる。これらのpＢＲ３２２「骨核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせる。適当な宿主株をトランスフォーメーションして、その宿主株を適当な細胞密度まで増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な方法(例えば、温度シフトまたは化学誘導)により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。細胞を、一般的には、遠心分離により収集し、物理的または化学的方法により破壊して、その結果得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保持する。タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含め、いずれの従来法によっても破壊でき、そのような方法は、当業者に周知である。組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。哺乳動物発現系の例には、ガルツマン（Gluzman）、Cell、２３：１７５（１９８１）により記載されている、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および５'に隣接する非転写配列もまた含んでなるであろう。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配列、およびポリアデニル化部位を使用して、必要とされる非転写遺伝要素を与えることができる。該ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが含まれる方法により、組換え細胞培養物から回収して、精製することができる。必要に応じて、タンパク質の再生工程を、成熟タンパク質の立体配置を完成するのに使用することができる。最後に、高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を最終精製工程に使用することができる。本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、または原核もしくは真核宿主から(例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によって)組換え技術により製造することができる。組換え製造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、またはグルコシル化され得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基が含まれ得る。いかなる年齢においても松果腺腫瘍は発生するが、最もよくみられるのは子供においてである。性的早熟は、特に男児における松果腺腫瘍の結果である。該腫瘍はシルビウス溝を圧縮し、それによって水頭症、乳頭水腫および他の頭蓋内圧の上昇の結果のサインを起こす。上丘の領域もまた圧縮され、その結果、上方凝視、下垂および瞳孔の光および反射の馴化の消失の麻痺となる。従って、治療上有効な量のＰＧＳＧ−１ポリペプチドの投与は、松果腺腫瘍から引き起こされる上記に概説した状態を処置するために使用して良い。ＰＧＳＧ−１遺伝子および遺伝子産物は、特に該遺伝子産物の可溶性形態はまた、生物学的リズム、特にサーカディアンリズムの制御に使用されて良い。というのは、松果腺はサーカディアンリズムを制御すると知られているメラトニンを産生すると知られているからである。ＰＧＳＧ−１遺伝子および遺伝子産物は、また、性的早熟の開始を制御する、すなわち、下垂体から放出される黄体化ホルモン（ＬＨ）、卵胞剌激ホルモン（ＦＳＨ）および成長ホルモンの下垂体ホルモン分泌を制御するのに使用してよい。全長のＰＧＳＧ−１遺伝子のフラグメントをｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションプローブとして使用して全長ＰＧＳＧ−１遺伝子を単離し、これらの遺伝子と高い配列類似性または同様の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離する。このタイプのプローブは少なくとも２０塩基、好ましくは少なくとも３０塩基、さらに好ましくは少なくとも５０塩基を有する。該プローブはまた、全長の転写物に対応するクローン、および制御領域およびプロモーター領域、エキソンおよびイントロンを含む完全な遺伝子を含む単一または複数のゲノムクローンを同定するのに使用してよい。スクリーニングの例にはオリゴヌクレオチドプローブを合成するため公知のＤＮＡ配列を使用することによる該遺伝子のコーディング領域の単離を含む。本発明の遺伝子の配列と相補的な配列を有している標識したオリゴヌクレオチドは、ライブラリーのどのメンバーに該プローブがハイブリダイズするかを決定するため、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングするのに使用する。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドはヒトの疾患の治療および診断の発見のための実験試薬および物質として使用されてよい。本発明はＰＧＳＧ−１ポリペプチドの受容体の同定方法を提供する。該受容体をコードする遺伝子は当業者に公知の多数の方法、例えば、リガンドパンニングおよびＦＡＣＳソーティング（コリガン（Coligan）ら、カレント・プロトコールズ・イン・イムン（Current Protocols in Immun．）、１（２）、第５章、（１９９１））などにより同定することができる。好ましくは、発現クローニングを用い、その際、ポリアデニル化したＲＮＡをＰＧＳＧ−１ポリペプチドに応答性の細胞から調製し、ついでこのＲＮＡから作成されたｃＤＮＡライブラリーをプールに分け、ＣＯＳ細胞または該ポリペプチドに応答性でない他の細胞にトランスフェクションするために使用する。ガラススライド上で増殖させたトランスフェクションした細胞を標識したポリペプチドにさらす。該ポリペプチドはヨウ素化または部位特異的なプロテインキナーゼの認識部位を含めることを含む多様な手段によって標識することができる。固定およびインキュベーションの後でスライドをオートラジオグラフィー分析にかける。正のプールを同定し、っいでサブプールを調製し、ついで相互作用性のサブ−プールおよび再スクリーニング方法を用いて再度トランスフェクションし、最終的に推定受容体をコードする単一クローンを産生する。受容体の同定のための別法として、標識したポリペプチドを細胞膜または受容体分子を発現する抽出調製物と光親和性結合させることができる。架橋した物質をＰＡＧＥ分析によって分離し、ついでＸ−線フィルムにさらす。ポリペプチドの受容体を含む標識した複合体を切り出して、ペプチドフラグメントに分離し、タンパク質マイクロシークエンシングにかける。マイクロシークエンシングから得たアミノ酸配列を推定受容体をコードする遺伝子を同定するためｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための縮重したオリゴヌクレオチドプローブのセットを設計するのに使用する。本発明はまた、ＰＧＳＧ−１とその受容体との相互作用を増強（アゴニスト）するまたは阻害（アンタゴニスト）するものを同定するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。例としては、ＰＧＳＧ−１受容体に結合して活性化させる化合物をスクリーニングする場合、単離されて固定化されるかまたは細胞に結合した形態におけるＰＧＳＧ−１受容体は多数の化合物および受容体に結合して相互作用する化合物が選択される。結合または相互作用は、関心のある放射性標識した化合物または該受容体との相互作用または該受容体の候補化合物の結合から引き起こされる第二メッセンジャーによって直接測定することができる。ＰＧＳＧ−１とその受容体との相互作用を結合して阻害する化合物のスクリーニングの場合は、候補化合物は競合スクリーニングアッセイにかけられ、ＰＧＳＧ−１好ましくは分析的に感知できる試薬で標識され、最も好ましくは放射能により標識されたものは、標識されたＰＧＳＧ−１の結合を阻害または増強するための能力が測定される化合物とともに導入される。ＰＧＳＧ−１受容体の活性を阻害する化合物のスクリーニングの他の例は、スクリーニングされるべき化合物と単離されたまたは膜結合形態でのＰＧＳＧ−１受容体を有するＰＧＳＧ−１ポリペプチドと接触させることを含む。ＰＧＳＧ− １の受容体の相互作用に影響を及ぼすＰＧＳＧ−１によって産生されたシグナルの抑制は該化合物が該受容体を阻害するかまたはＰＧＳＧ−１とその受容体の相互作用を妨害することによって受容体の活性を阻害することを示している。第二メッセンジャーシグナルは以下に限られるものではないが、ｃＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネルまたはホスホイノシチド加水分解を含む。ＰＧＳＧ−１受容体の活性化を阻害する化合物の具体例は、抗体、またある場合には該ポリペプチドに結合するオリゴペプチド、または該受容体部位に結合する密接関連タンパク質、しかし、該ポリペプチドの不活性形態であり、それによって該受容体部位を阻害するものを含む。他の例は、アンチセンス技術の利用によって調製されたアンチセンス構築物である。アンチセンス技術を利用して、三重らせん形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御することができ、この方法は両方とも、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列の５'コーディング部分を使用して、長さ約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、転写に関与する遺伝子領域に対して相補的であるよう設計し(三重らせん−リー（Lee）ら、Nucl.Acids Res.、６：３０７３（１９７９）；クーニー（Cooney）ら、Science、２４１：４５６（１９８８）；およびダーバン（Dervan）ら、Science、２５１：１３６０（１９９１）を参照)、そのことによって、転写およびＰＧＳＧ−１の産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、イン・ビボにおいてmＲＮＡにハィブリダイズして、mＲＮＡ分子のＰＧＳＧ−１ポリペプチドへの翻訳をブロックする(アンチセンス−オカノ（Okano）、J.Neurochem.、５６：５６０（１９９１）；オリゴデオキシヌクレオチドズ・アズ・アンチセンス・オブ・ジーン・エクスプレッシヨン（Oigodeoxynucleotides asAntisense Inhibitorsof Gene Expression）、ＣＲＣプレス（ＣＲＣ Press）、ボカ・レイトン（Boca R aton）、フロリダ（１９８８）)。上記のオリゴヌクレオチドをまた、細胞に送り込むことから、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡをインビボにおいて発現させて、ＰＧＳＧ−１の産生を阻害することができる。さらなる例には、該ポリペプチドの触媒部位に結合する、および該ポリペプチドの触媒部位を占め、それによって該触媒部位に近づき難くして正常な生物学的活性を妨げる小分子が含まれる。小分子の例には、これらに限定されるものではないが、小ペプチドまたはペプチド様分子が含まれる。これらの化合物は例えば、ＬＨ、ＦＳＨおよびＧＨなどの増殖および分化を調節する下垂体からのホルモン分泌を調節するために使用してよい。それらは製薬学的担体、例えば、以下に記載するようなものとともに使用されてよい。本発明のポリペプチド、アゴニストおよびアンタゴニストは、適当な製薬学的担体と組み合わせて医薬組成物を含むよう使用することができる。そのような組成物は、治療上有効な量の該ポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストおよび薬学上許容され得る担体または賦形剤を含んでなる。そのような担体には、これに限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。その製剤は、投与方法に適合すべきである。本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分を１つまたはそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供する。そのような容器に関連して、薬学的または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府当局により規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売の、該当局による承認を表わす。さらに、本発明のポリペプチド、アゴニストおよびアンタゴニストは、他の治療化合物と共に使用することができる。該医薬組成物は、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路といったような、便利な方法で投与することができる。該医薬組成物は、具体的な徴候を治療および／または予防するのに有効な量で投与される。一般に、それらは、少なくとも約１０μg／kg(体重)の量で投与され、最も多くの場合、それらは、１日当り約８mg／kg(体重)を超えない量で投与されるであろう。最も多くの場合、投与経路および症状等を考慮に入れて、投薬量は、毎日約１０μg／k g〜約１mg／kg(体重)である。該ＰＧＳＧ−１ポリペプチド、ポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニストまたはアゴニストはまた、「遺伝子治療」と呼ばれることが多い、そのようなポリペプチドのインビボにおける発現により、本発明に従って使用することができる。従って、例えば、患者由来の細胞を、エクス・ビボにおいてポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操作した細胞を該ペプチドで処置すべき患者に与える。そのような方法は、当業界で周知である。例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子の使用によって、当業界で既知の方法により、細胞を操作することができる。同様に、例えば、当業界で既知の方法により、ポリペプチドのイン・ビボにおける発現のために、細胞をイン・ビボにおいて操作することができる。当業界で知られているように、細胞をイン・ビボにおいて操作して、ポリペプチドをイン・ビボにおいて発現させるために、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を製造するための産生細胞を患者に投与することができる。そのような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。前記レトロウイルスプラスミドベクターが由来するものには、以下に限られるものではないが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、アビエンリューコシスウイルス、テナガザル類人猿白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、脊髄増殖肉腫ウイルスおよび乳癌ウイルスなどが含まれる。１つの態様において、該レトロウイルスプラスミドベクターはモロニーマウス白血病ウイルス由来である。１つの態様におてい、レトロウイルスプラスミドベクターはモロニーマウス白血病ウイルス由来である。該ベクターは１つまたはそれ以上のプロモーターを含む。使用してよい適切なプロモーターは、以下に限られるものではないが、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（ミラー（Miller）ら、Biotechniques、Vol.７、No.９、９８０−９９０（１９８９）または他のプロモーター（例えば、以下に限られるものではないが、ヒストン、po l III２およびβ−アクチンプロモーターを含む真核生物細胞プロモーターなどの細胞プロモーターである）が含まれる。使用してよい他のウイルスプロモーターには、以下に限るものではないが、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、Ｂ１９パルボウイルスプロモーターが含まれる。適切なプロモーターの選択は本明細書に含まれる教示から当業者には明らかである。本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は適切なプロモーターの制御下にある。使用してよい適切なプロモーターには以下に限るものではないが、アデノウイルス主要後期プロモーターなどのアデノウイルスプロモーターまたはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどのヘテロロガスプロモーター；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーターなどの誘導可能なプロモーター；熱ショックプロモーター、アルブミンプロモーター；ApoAIプロモーター；ヒトグロブリンプロモーター；単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターなどのウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲｓ（上記の修飾したレトロウイルスＬＴＲｓを含む）；β−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターを含む。該プロモーターはまた、該ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天然に存在するプロモーターであってよい。レトロウイルスプラスミドベクターはプロデューサー細胞株を形成するパッキング細胞をトランスデュースするのに使用される。トランスフェクションされるパッキング細胞の例には、以下に限るものではないが、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、φ−２、φ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、φ ＣＲＥ、 φＣＲＩＰ、ＧＰ＋envAm１２、およびミラー、Human Gene Therapy、 Vol.１、５−１４頁（１９９０）（参照のためその全文を本明細書に包含する）に記載されているＤＮＡ細胞株が含まれる。該ベクターは当該技術分野において公知の任意の方法によりパッキング細胞をトランスデュースしてよい。そのような手段には、以下に限るものではないがエレクトロポレーション、リポソームの使用、ＣａＰＯ₄沈降が含まれる。それとは別に、レトロウイルスプラスミドベクターはリポソームにカプセル化されてよく、その後、宿主に投与される。該プロデューサー細胞株は該ポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性のレトロウイルスベクター粒子を産生する。ついでそのようなレトロウイルスベクター粒子はイン・ビトロまたはイン・ビボのいずれかで真核生物をトランスデュースするために使用される。トランスデュースされてよい真核生物細胞は以下に限られるものではないが、胎性幹細胞、胎性癌細胞ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋肉芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞および気管上皮細胞が含まれる。本発明はまた、本発明の遺伝子を治療的に使用することにも関する。本発明のポリヌクレオチド配列中の変異の検出はんたとえば性的早熟などのＰＧＳＧ−１の過少発現から引き起こされる疾患の診断または疾患の罹患しやすさの診断を可能にする。ヒトＰＧＳＧ−１遺伝子中の変異を担う個体は、ＤＮＡレベルＤＮＡ多様な技術により検出してよい。診断のための核酸は例えば、血液、尿、唾液、組織生検および剖検物質などの患者の細胞から得てよい。ゲノムＤＮＡは検出に直接的に使用してよく、またはＰＣＲを使用して酵素的に増幅してから分析してよい（サイキ（Saiki）ら、Nature、３２４：１６３−１６６（１９８６））。ＲＮＡまたはcＤＮＡはまた、同様の目的のために使用してよい。例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列に相補的であるＰＣＲプライマーは変異を同定および分析するために使用できる。点突然変異は増幅したＤＮＡを放射能標識したＰＧＳＧ−１ＲＮＡまたは別に、放射能標識したＰＧＳＧ−１アンチセンスＤＮＡ配列にハイブリダイズさせることによって同定することができる。例えば、欠失および挿入は、正常の遺伝子型に比較して、増幅された産物の大きさの変化により検出される。点突然変異は増幅したＤＮＡを放射能標識したＰＧＳＧ−１ＲＮＡまたは別に、放射能標識したＰＧＳＧ−１アンチセンスＤＮＡ配列にハイブリダイズさせることによって同定することができる。完全にマッチした配列はＲＮアーゼＡ消化または融点の違いによってマッチしていない２本鎖から区別することができる。参考遺伝子と変異を有する遺伝子との間の差異は、直接ＤＮＡシークエンシング法によって明らかにされてよい。加えて、クローニングしたＤＮＡセグメントは特定のＤＮＡセグメントとしてプローブとして使用してよい。本方法の感度はＰＣＲと組み合わせると非常に増強される。例えば、シークエンシングプライマーは二本鎖ＰＣＲ産物または修飾されたＰＣＲによって産生された一本鎖鋳型分子とともに使用する。その配列決定は放射能標識したヌクレオチドで従来技術により行われるか、または蛍光タグでの自動化シークエンシング手法により行われる。ＤＮＡ配列の相違に基づいた遺伝試験は、変性剤を含む、または含まないゲルでのＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出により成し遂げることができる。小さな配列の欠失および挿入は、高分解能ゲル電気泳動により視覚化することができる。ＤＮＡフラグメントの様々な配列は、変性ホルムアミド勾配ゲル上で区別することができ、ここでは、様々なＤＮＡフラグメントの移動度が、それらの特異的な融解または部分的な融解温度により、ゲルにおける様々な位置で遅延される(例えば、ミエーズ（Myers）ら、Science、２３０：１２４２（１９８５）を参照)。特定の位置での配列変化はまた、ＲＮアーゼおよびＳ１保護といったようなヌクレアーゼ保護アッセイ、または化学切断法により示すことができる(例えば、コットン（Cotton）ら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−４４０１（１９８５）)。従って、特異的なＤＮＡ配列の検出は、ゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保護、化学切断、直接ＤＮＡ配列決定、または制限酵素の使用( 例えば、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）)、およびサザンブロッティングといったような方法により成し遂げることができる。さらに従来的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加えて、変異はまた、in situ 分析により検出することもできる。本発明はまた、さまざまな組織中の本発明のポリペプチドのレベルの変化を検出するための診断アッセイにも関し、該レベルは、正常なコントロール組織サンプルに比較した場合に低く、松果体腫瘍の存在を検出するのに使用してよい。宿主由来のサンプル中の本発明のポリペプチドのレベルを検出するために使用するアッセイは当業者によく知られており、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。ＥＬＩＳＡアッセイにはまずＰＧＳＧ−１抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製することを含む。さらにリポーター抗体を該モノクローナル抗体に対して調製する。リポーター抗体に放射能、蛍光または本例においては西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素などの検出可能な試薬を結合させる。サンプルを宿主から採り、ついで固相支持体（例えばポリスチレン皿、該サンプル中のタンパク質を結合させる）上でインキュベーションする。ついで皿上の遊離タンパク質結合部位をウシ血清アルブミンのような非特異的なタンパク質とインキュベーションすることによりカバーする。ついで、モノクローナル抗体をインキュベーションすると、その間にモノクローナル抗体がポリスチレン皿に付着した任意の本発明のポリペプチドに結合する。未結合のモノクローナル抗体をすべてバッファーで洗い流す。ついで西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したリポーター抗体を皿に入れると、本発明のポリペプチドに結合したモノクローナル抗体に対してリポーター抗体が結合する。ついで未結合のリポーター抗体を洗い流す。ペルオキシダーゼ基質をついで該皿に加え、所定の時間において発色する量が、標準曲線に比較した際の患者のサンプルの所定量に存在する本発明のポリペプチドの量の測定値である。競合アッセイを使用してよく、その際、ＰＧＡＧ−１タンパク質に特異的な抗体を固相支持体に結合させ、標識しＰＧＳＧ−１タンパク質および宿主由来のサンプルを該固相支持体を通過させ、例えば液体シンチレーションクロマトグラフィーなどによって検出されたレベルの量を該サンプル中のＰＧＳＧ−１の量に相関させることができる。本発明の配列はまた、染色体同定にも有益である。その配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に対して具体的に標的化して、ハイブリダイズさせることができる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要性がある。実際の配列データ(反復多型性)に基づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤＮＡの染色体へのマッピングは、それらの配列を病気と関連する遺伝子と関係づける重要な第一段階である。簡単に言えば、cＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー(好ましくは、１５−２５bp) を調製することにより、配列を染色体にマップすることができる。３'の翻訳されていない領域のコンピューター分析を利用して、ゲノムＤＮＡ中の１つ以上のエキソンをスパン(span)しないプライマーを迅速に選択することから、増幅過程を複雑なものとする。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含む、それらのハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを与えるであろう。体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いての本発明を利用して、サブローカリゼーションは、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプール由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達成することができる。その染色体へマップするのに同様に利用することができる他のマッピング方法には、in situ ハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソーティッド(flow-sorted)染色体を用いてのプレスクリーニング、および染色体特異的cＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレセレクションが含まれる。 cＤＮＡクローンの、中期染色体スプレッドへの蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)を利用して、正確な染色体位置を一工程で与えることができる。この技術は、５０または６０塩基という短いcＤＮＡで利用することができるこの技術の概説には、ベルマ（Verma）ら、ヒューマン・クロモソームズ（Hum an Chromosomes）：ア・マニュアル・オブ・ベーシック・テクニックス（a Manu al of Basic Techniques）、パーガモン・プレス（PergamonPress）、ニューヨーク（１９８８）を参照。ある配列が正確な染色体位置に一度マッピングされると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデータと関連付けることができる。そのようなデータは、例えば、マクジック（V.McKusick）、メンデリアン・インヘリタンス・イン・マン（Mendelian Inheritance in Man）ジョーンズ・ホプキンス・ユニバーシティー・ウェルチ・メディカル・ライブラリー(Johns Hopkins UniversityWelch Med ical Library)を介してオンラインで利用できる)に見い出される。次いで、同じ染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との間の関係を結合分析(物理的に隣接した遺伝子の共遺伝(coinheritance))によって確認する。次に、病気に罹患した個体と罹患していない個体との間のcＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定する必要がある。変異が、冒された個体のいくつかまたは全てにおいて認められるが、いずれの正常な個体においても認められないなら、その変異は疾患の原因となるものであるらしい。現在、物理的マッピングおよび遺伝的マッピングの分析から、疾患と関連する染色体領域に正確に局在化したcＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因となる遺伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガベースのマッピング分析および２０kb当り１つの遺伝子を仮定する)。ポリペプチド、それらのフラグメントもしくは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそれらを発現する細胞を免疫原として使用して、それらに対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体、さらにはまた、Fabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの生成物も含まれる。当業界で既知の様々な方法を、そのような抗体およびフラグメントの製造に使用することができる。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入することにより、またはポリペプチドを動物、好ましくはヒトでない動物に投与することにより得ることができる。次いで、そのようにして得られた抗体は、そのポリペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、完全な天然のポリペプチドを結合する抗体を製造するのに使用することができる。次いで、そのような抗体を使用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離することができる。モノクローナル抗体を調製するには、連続的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全て使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術(コーラー（Kohler）およびミルスタイン（Milstein）、１９７５、Nature、２５６ :４９５−４９７)、トリオーマ(trioma)技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術( コズボール（Kozbor）ら、１９８３、Immunology Today ４：７２)、およびヒトモノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（コール（Co le）ら、１９８５、モノクローナル・アンチボディーズ・アンド・キャンサー・セラピー（Monoclona1 Antibodies and Cancer Therapy）、アラン・アール・リス・インク（Alan R.Liss,Inc.）、７７−９６頁において)が含まれる。単鎖抗体の産生に関して記載されている技術(米国特許第４，９４６，７７８号)は、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を製造するのに適合し得る。また、トランスジェニックマウスを使用して、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体を発現させることもできる。本発明をさらに、以下の実施例に関して記載する；しかし、本発明は、そのような実施例に限定されないことを理解すべきである。部または量は全て、特にことわらない限り、重量単位である。以下の実施例の理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出てくる方法および／または用語を記載する。「プラスミド」は、前置きする小文字のpおよび／または続けて大文字および／または数字により示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されていて、限定されない基盤の下に公に入手可能であるか、または公開された方法により入手可能なプラスミドから構築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラスミドは、当業界で既知であって、当業者に明らかであろう。ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列にのみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒切断することを示す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されており、それらの反応条件、補因子および他の必要条件は、当業者に知られているように使用した。分析目的には、一般的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と共に使用する。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的には、一般的に、より多量の体積中、ＤＮＡ５〜５０μgを２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に適当な緩衝液および基質量は、製造者により指定されている。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が通常利用されるが、供給者の指示に従って変えることができる。消化後、その反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して、所望のフラグメントを単離する。切断したフラグメントのサイズ分離は、ゲッデル（Goeddel,D）ら、 Nucleic Acids Res.、８：４０５７（１９８０）により記載されている８％ポリアクリルアミドゲルを用いて行う。「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成することができる、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド、または２つの相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖を示す。そのような合成オリゴヌクレオチドは５'ホスフェートを有さないことから、キナーゼの存在下、ＡＴＰでホスフェートを加えることなしには、別のオリゴヌクレオチドにライゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントにライゲートするであろう。「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する過程をいう（マニアチスら、同上、１４６頁）。特にことわらない限り、ライゲーションは、ライゲートさせるべきＤＮＡフラグメントのほぼ等モル量の０.５μg当たり１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に、既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができる。実施例１ＰＧＳＧ−１タンパク質の可溶性形態の細菌発現および精製最初に、ＰＧＳＧ−１をコードするＤＮＡ配列(ＡＴＣＣ第号)を、プロセシングしたタンパク質の推定末端アミノ酸から始まるＰＧＳＧ−１コーディング配列の２４ヌクレオチドが続くBglII制限部位を含む配列：を有す５'オリゴヌクレオチドプライマーとして用いて増幅し、ＰＧＳＧ−１コーディング配列の２８ヌクレオチドが続くBglIIの制限部位に相補的な配列を含む３'配列：として用いて増幅する。その制限酵素部位は、細菌発現ベクターpＱＥ−９の制限酵素部位に一致する。pＱＥ−９は、抗生物質耐性(Amp^r)、細菌の複製開始点( ori)、ＩＰＴＧ−調節可能なプロモーター／オペレーター(Ｐ／Ｏ)、リボソーム結合部位(ＲＢＳ)、６−Hisタグおよび制限酵素部位部位をコードする。ついでp ＱＥ−９ベクターをBamＨＩで消化する。増幅した配列をpＱＥ−９にライゲーションし、ついでヒスチジンタグおよびリボソーム結合部位（ＲＢＳ）をコードする配列と共にインフレームで挿入した。適切な方向のインサートを含むベクターをシークエンシングで確認した。次いで、そのライゲーション混合物を使用して、Ｍ１５／rep４（キアゲン（Qiagen）、インク（Inc.））である大腸菌株をサンブルック（Sambrook，Ｊ.）ら、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）：ア・ラボラトリー・マニュアル（A Laboratory Manual）、コールド・スプリング・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Laboratory Press)、（１９８９）に記載された方法によってトランスフォームした。Ｍ１５／rep４はプラスミドpＲＥＰ４の多重コピーを含み、これは、lacI リプレッサーを発現して、またカナマイシン耐性(Kan^r)も与える。トランスフォーマントを、それらが、ＬＢプレートで増殖する能力により同定しついでアンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。所望の構築物を含むクローンを、Amp(１００μg／ml)およびKan(２５μg／ml)の両方を補った、ＬＢ培地中での液体培養で一晩増殖させた(Ｏ／Ｎ)。そのＯ／Ｎ培養物を使用して、大きな培養物に１：１００〜１：２５０の割合で播種する。細胞が、０.４〜０.６の間の光学密度６００(Ｏ.Ｄ.⁶⁰⁰)まで増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ(「イソプロピル− Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド」)を、最終濃度が１mMとなるまで加えた。ＩＰＴＧは、1acIリプレッサーを不活性化し、Ｐ／Ｏをクリアリングし、遺伝子発現を増加させることにより誘導する。細胞をさらに３−４時間増殖させた。次いで、細胞を遠心分離により収集した。細胞ペレットをカオトロピック剤である６モルのグアニジンＨＣ1中で可溶化した。清澄後、この溶液から、６−Hisタグを含むタンパク質による強固な結合を可能にする条件下、ニッケルキレートカラムでのクロマトグラフィーにより、可溶化したＰＧＳＧ−１を精製する（ホチュリ（Hochuli,Ｅ.）ら、Ｊ．Chromatography ４１１：１７７−１８４（１９８４））。９０％の純度のタンパク質をｐＨ５.０の６モルのグアニジンＨＣ１中のカラムから溶出し、３モルのグアニジンＨＣ１、１００mMのリン酸ナトリウム、１０モルのグルタチオン（還元された）および２モルのグルタチオン（酸化された）に合わせてリネーチャーする。この溶液中で１２時間インキュベートした後、該タンパク質を１０ミリモルのリン酸ナトリウムで透析する。実施例２バキュロウイルス発現システムを用いてのＰＧＳＧ−１の可溶性形態のクローニングおよび発現完全な長さのＰＧＳＧ−１タンパク質をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ第号を、遺伝子の５'および３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを利用して増幅する。その５'プライマーは、配列：を有し、またBglII制限酵素部位(肉太の活字)を有す。その３'プライマーは、配列：を有し、また制限エンドヌクレアーゼBgl IIの切断部位、およびＰＧＳＧ−１遺伝子の３'配列に対して相補的な２４ヌクレオチドを含む。増幅された配列を、市販のキット(『ジーンクリーン』（Geneclean）、ＢＩＯ１０１インク、ラ・ホラ、カリフォルニア)を使用して、１％アガロースゲルから単離した。次いで、そのフラグメントをエンドヌクレアーゼBgl IIで消化し、再度１％アガロースゲル上で精製した。このフラグメントをＦ２と名付ける。ベクターpA２（pＶＬ９４１ベクターの修飾、以下に論ずる)を、バキュロウイルス発現システムを用いてのＰＧＳＧ−１タンパク質の発現に使用する(概説には、サマーズ（Summers,Ｍ.Ｄ.）およびスミス（Smith,Ｇ.Ｅ.）１９８７、ア・マニュアル・オブ・メソッズ・フォー・バキュロウイルス・べクターズ・アンド・インセクト・セル・カルチャー・プロシーデュアーズ(A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures）、 Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No.１５５５を参照)。この発現ベクターは、オートグラファ(Autographa)カリフォルニアヌクレアポリヘドロシスウイルス(ＡｃＭＮＰＶ)の強力なポリヘドリンプロモーター、続いて、制限エンドヌクレアーゼ Bam ＨＩの認識部位を含む。シミアンウイルス(ＳＶ ) ４０のポリアデニル化部位を、有効なポリアデニル化に使用する。組換えウイルスを容易に選択するため、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化信号が続くポリヘドリンプロモーターと同じ向きに挿入する。同時トランスフェクトした(cotransfected)野生型ウイルスＤＮＡの、細胞により媒介される相同組換えのためのウイルス配列をポリヘドリン配列の両側に隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベクターを、例えば、ｐＲＧ１、pAc３７３、pＶＬ９４１、およびpＡcIＭ１などを、pＡ２の代わりに使用することができるであろう(ラッコゥ（Luckow,Ｖ.Ａ.)およびサマーズ、Vir o1ogy)１７０：３１−３９)。プラスミドを制限酵素Bam ＨＩで消化し、次いで、当該技術分野において公知の手法によりウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化する。ついでそのＤＮＡを１％アガロースゲルから市販のキット(『ジーンクリーン』、ＢＩＯ１０１インク、ラ・ホラ、カリフォルニア)を使用して、単離する。このベクターＤＮＡをＶ２と名付ける。フラグメントＦ２および脱リン酸化したプラスミドＶ２をＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲーションする。次いで、大腸菌ＸＬ−１Blue細胞をトランスフォームして、該タンパク質の可溶性形態をコードするＰＧＳＧ−１遺伝子を有するプラスミド(pBac ＰＧＳＧ−１)を含む細菌を同定する。XhoII配列および向きを用いて、色付けされた断片をＤＮＡシークエンシングによって確認する。リポフェクション法(フェルグナー（Felgner）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ、８４：７４１３−７４１７（１９８７）)を利用して、プラスミドpBacＰＧＳＧ−１５μgを市販の線形化バキュロウイルス(「BaculoGold^TMバキュロウイルスＤＮＡ」、ファーミンゲン（Pharmingen）、サン・ディエゴ（SanDiego）、カリフォルニア)１.０μgと共に同時トランスフェクションする。 BaculoGold^TMウイルスＤＮＡ 1μgおよびプラスミド pBacＫＧＦ−２５μg を、無血清グレイス(Grace's)培地(ライフ・テクノロジーズ・インク（LifeTech nologies Inc.）、ゲイザーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド）５０μl を含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合する。その後、リポフェクチン(Lipofectin)１０μlとグレイス培地９０μlを加え、混合して、室温で１５分間インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合物を、無血清グレイス培地１mlを含む、３５mmの組織培養プレートに播種したSf９昆虫細胞(ＡＴＣＣＣＲＬ１７１１)に滴加する。そのプレートを前後に揺り動かして、新たに加えた溶液を混合する。次いで、そのプレートを２７℃で５時間インキュベートする。５時間後、そのトランスフェクション溶液をプレートから除去して、１０％ウシ胎児血清を補ったグレイス昆虫培地１mlを加える。そのプレートをインキュベーターに戻して、２７℃で４日間培養し続ける。４日後、上清を集めて、サマーズおよびスミス（上記）により記載されたようにして、プラークアッセイを行う。変法として、「Blue Gal」(ライフ・テクオロジーズ・インク、ゲイザーズバーグ)を含むアガロースゲルを使用したが、このことにより、青色に染色されたプラークを容易に単離することが可能となる。( 「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞培養に関する利用者のガイド、およびライフ／テクノロジーズ・インク、ゲイザーズバーグにより配布されたバキュロウイルス学、９−１０頁にも見出すことができる)。４日後、ウイルスの連続希釈物を細胞に加えて、青色に染色されたプラークをエッペンドルフピペットの先端で採取する。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、グレイス培地２００μlを含むエッペンドルフ管内で再び懸濁させる。その寒天を短時間の遠心分離により除去して、組換えバキュロウイルスを含む上清を、３５mmの皿に播種したSf９細胞を感染させるのに使用する。４日後、これらの培養皿の上清を収集した後、４℃で保存する。 Sf９細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳを補ったグレイス培地で増殖させる。その細胞に、感染多重度(ＭＯＩ)２で組換えバキュロウイルスＶ−ＰＧＳＧ−１を感染させる。６時間後、その培地を除去して、メチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００ II培地(ライフ・テクノロジーズ・インク、ゲイザーズバーグ)に替える。４２時間後、５μＣｉの³⁵Ｓ−メチオニンおよび５μCiの³⁵Ｓシステイン５μCi(アマシャム(Amersham))を加える。その細胞をさらに１６時間インキュベートした後、それらを遠心分離により収集して、標識化タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより視覚化する。実施例３遺伝子治療を介しての発現皮膚生検により被験体から線維芽細胞を得る。得られた組織を組織培養培地に静置し、ついで小片に分ける。組織の小塊を組織培養フラスコの湿潤面に静置し、各フラスコには約１０片を置く。そのフラスコを上下逆さにし、しっかりと蓋を閉めて室温で一晩放置する。室温で２４時間後、そのフラスコを逆にし、組織の塊をフラスコおよび新鮮な培地の底に固定したままにする（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを加えたハムＦ１２（Ham's Ｆ１２）培地）。ついでこれを３７℃で約１週間インキュベーションする。このとき、新鮮培地を加え、続いて数日毎に変える。培養物中でさらなる２週間後、線維芽細胞の単層が現れる。その単層をトリプシン化し、一層大きなフラスコに測る。ｐＭＶ−７（キルシュメイアー（Kirschmeier，Ｐ．Ｔ.）ら、ＤＮＡ、７：２１９−２５（１９８８））はモロニーマウス肉腫ウイルスの長い待末端反復配列によってフランキングされ、EcoRIおよびHindIIIで消化され、続いてウシ腸ホスファターゼで処理される。その線形ベクターをアガロスゲル上で画分し、ついでガラスビーズを用いて精製する。本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、それぞれ５'および３'端配列に対応するＰＣＲプライマーを用いて増幅する。そのEcoRI部位を含む５'プライマーおよび３'プライマーはさらにHindIII部位を含む。モロニーマウス肉腫ウイルス線形骨格の等量および増幅したEcoRIおよびHindIII断片をＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で共に加える。得られた混合物を２つの断片の適切なライゲーション条件下で維持する。そのライゲーション混合物を細菌ＨＢ１０１をトランスフォームするために使用し、ついでそのベクターが適切に挿入されたインサートの遺伝子を有することを確認するためカナマイシンを含むアガーの上に播く。両栄養性ｐＡ３１７またはＧＰ＋am１２パッキング細胞を組織培養中で増殖させ、１０％ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを有するダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco'sModified Eagles Medium）中で一定の密度にする。ついでその遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に加えてパッキング細胞をベクターでトランスデュースする。今度はそのパッキング細胞をその遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（パッキング細胞は今度はプロデューサー細胞と呼ばれる）。新鮮な培地をトランスデュースしたプロデューサー細胞に加え、続いて、その倍とを一定の産生細胞の１０cmプレートから回収する。使用した培地は感染性のウイルス粒子を含み、ミリポアフィルターを通して濾過して分離したプロデューサー細胞を除去し、ついでこの培地を線維芽細胞を感染させるのに使用する。培地を線維芽細胞のサブコンフルエントプレートから除去し、すぐにプロデューサー細胞からの培地で置き換える。この培地を除去し、ついで新鮮な培地に変える。ウイルスの力価が高い場合は、実質的に全ての線維芽細胞を感染させており、選択の必要はない。力価が非常に低い場合、ｎｅｏまたはｈｉｓなどの選択可能なマーカーを有するレトロウイルスベクターを使用する必要がある。ついで、技術操作された線維芽細胞を単独でかまたは、サイトデックス３マィクロキャリアビーズ（cytodex ３ microcarrier beads）上で一定の密度に増殖させた後に宿主に注入する。今度は線維芽細胞がタンパク質調製物を産生する。先の教示から見て、本発明の多数の変更および変化が可能であることから、後記する請求の範囲内で、特に記載した以外の方法で、本発明を行うことができる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９７年５月２１日（１９９７．５．２１）【補正内容】請求の範囲１．（ａ）配列番号：２に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号：２に示されるアミノ酸１から２６２を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）または（ｂ）にハイブリダイズすることができ、少なくとも７０％同一であり；および（ｄ）ポリヌクレオチド（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド断片よりなる群から選択されるメンバーを含む、単離されたポリヌクレオチド。２．ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。４．ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。５．該ポリヌクレオチドが、配列番号：２に示すポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。６．（ａ）ＡＴＣＣ受託番号第９７１６２号に含まれるＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号第９７１６２号に含まれるＤＮＡにより発現されるポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；（ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）または（ｂ）にハイブリダイズすることができ、少なくとも７０％同一であり；および（ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド断片よりなる群から選択されるメンバーを含む、単離されたポリヌクレオチド。７．請求項２に記載のＤＮＡを含むベクター。８．請求項７に記載のベクターで遺伝的操作された宿主細胞。９．請求項８に記載の宿主細胞から該ＤＮＡによりコードされるポリペプチドを発現することを含むポリペプチドを産生する方法。１０．請求項７に記載のベクターで細胞を形質転換またはトランスフェクションすることを含むポリペプチドを発現することができる細胞を産生する方法。１１．（ｉ）配列番号：２の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、およびそのフラグメント、アナログおよび誘導体；（ii）配列番号：２のアミノ酸１から２６２までのアミノ酸を含むポリペプチド；および（iii）ＡＴＣＣ受託番号第９７１６２号のcＤＮＡによりコードされるポリペプチド、および該ポリペプチドの断片、アナログおよび誘導体；よりなる群から選択されるポリペプチド。１２．請求項１１に記載のポリペプチドに対して有効なアゴニストである化合物。１３．請求項１１に記載のポリペプチドに対して有効なアンタゴニストである化合物。１４．ＰＧＳＧ−１を必要とする患者の治療方法であって、請求項１１に記載のポリペプチドの治療上有効な量を該患者に投与することを含む方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＺＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/24 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ローゼン，クレイグ・エイアメリカ合衆国20882メリーランド州レイトンズビル、ローリング・ヒル・ロード 22400番

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）配列番号：２に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号：２に示されるアミノ酸１から２６２を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）または（ｂ）にハイブリダイズすることができ、少なくとも７０％同一であり；および（ｄ）ポリヌクレオチド（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド断片よりなる群から選択されるメンバーを含む、単離されたポリヌクレオチド。２．ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。４．ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。５．該ポリヌクレオチドが、配列番号：２に示すポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。６．（ａ）ＡＴＣＣ受託番号第号に含まれるＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号第号に含まれるＤＮＡにより発現されるポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；（ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）または（ｂ）にハイブリダイズすることができ、少なくとも７０％同一であり；および（ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド断片よりなる群から選択されるメンバーを含む、単離されたポリヌクレオチド。７．請求項２に記載のＤＮＡを含むベクター。８．請求項７に記載のベクターで遺伝的操作された宿主細胞。９．請求項８に記載の宿主細胞から該ＤＮＡによりコードされるポリペプチドを発現することを含むポリペプチドを産生する方法。１０．請求項７に記載のベクターで細胞を形質転換またはトランスフェクションすることを含むポリペプチドを発現することができる細胞を産生する方法。１１．（ｉ）配列番号：２の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、およびそのフラグメント、アナログおよび誘導体；（ii）配列番号：２のアミノ酸１から２６２までのアミノ酸を含むポリペプチド；および（iii）ＡＴＣＣ受託番号第号のcＤＮＡによりコードされるポリペプチド、および該ポリペプチドの断片、アナログおよび誘導体；よりなる群から選択されるポリペプチド。１２．請求項１１に記載のポリペプチドに対して有効なアゴニストである化合物。１３．請求項１１に記載のポリペプチドに対して有効なアンタゴニストである化合物。１４．ＰＧＳＧ−１を必要とする患者の治療方法であって、請求項１１に記載のポリペプチドの治療上有効な量を該患者に投与することを含む方法。１５．ポリペプチドの治療上有効な量を該ポリペプチドをコードするＤＮＡを該患者に与えて、該ポリペプチドをイン・ビボで発現させることによって投与する、請求項１４に記載の方法。１６．ＰＧＳＧ−１を必要とする患者の治療方法であって、請求項１２に記載の化合物の治療上有効な量を該患者に投与することを含む方法。１７．ＰＧＳＧ−１の阻害を必要とする患者の治療方法であって、請求項１３に記載のアンタゴニストの治療上有効な量を該患者に投与することを含む方法。１８．請求項１１に記載のポリペプチドの発現に関連のある疾患または該疾患の罹患し易さを診断する方法であって、該ポリペプチドをコードする核酸配列中の変異を決定することを含む方法。１９．宿主由来のサンプル中の請求項１１に記載のポリペプチドの存在を分析することを含む診断方法。２０．請求項１１に記載のポリペプチドの受容体に結合し、活性化または阻害する化合物を同定する方法であって、細胞の表面に発現する該ポリペプチドの受容体と接触させ、該受容体は該受容体に対する結合に応じて検出可能なシグナルを提供することができる第２成分と関連があり、化合物は該受容体に結合するうこと可能である条件下でスクリーニングされるべきものであり、該化合物と受容体の相互作用から産生されたシグナルの存在または不在を検出することにより該受容体に結合するかまた、活性化または阻害するかどうかを決定することを含む方法。