KR100243989B1 - 사람 쿠니즈형 프로테아제 저해인자 - Google Patents

사람 쿠니즈형 프로테아제 저해인자 Download PDF

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아나벨 퀸타나
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Abstract

본 발명은 신규한 사람 쿠니즈형 저해인자를 암호화하는 DNA절편으로 이루어지는 분리된 DNA 분자를 제공한다. 또한, 신규한 사람 쿠니즈형 저해인자를 암호화하는 제1 DNA절편으로 이루어지고, 상기 제1 DNA절편은 제1 DNA절편에 대한 발현에 요구되는 추가적 DNA절편들에 작동가능하게 연결되는 DNA구조체를 제공하며, 또한 이러한 DNA구조체를 함유하는 숙주세포와 숙주세포로 부터의 단백질의 제조방법을 제공한다.

Description

[발명의 명칭]
사람 쿠니즈형 프로테아제 저해인자
[발명의 상세한 설명]
[발명의 배경]
혈액 응고는 여러가지 혈액 성분 또는 인자의 복잡한 상호작용으로 구성되어 있는 과정으로서, 그 상호작용은 결국은 섬유소 응괴를 일으킨다. 일반적으로 소위 응고 "캐스케이드(cascade)"에 관하여는 혈액 성분은 활성화 응고인자 그 자체인 활성인자의 작용에 의해 단백질 분해효소로 전환되는 효소 불활성 단백질인 프로효소 또는 자이모겐이다. 그러한 전환을 겪은 응고인자를 일반적으로 "활성 인자"라 하며 소문자 추기 "a"를 부가하여 나타낸다 (예를 들면 인자VIIa).
두가지 시스템이 혈액 응고를 촉진시킴으로써 정상적 지혈에 관여한다. 이들 시스템은 "내(內)" 및 "외(外)" 응고 경로로 불리어 왔다. 현재 내경로는 섬유소 형성의 증가 및 유지 역할을 하며 "외" 경로는 섬유소 형성의 개시에 결정적인 중복 메카니즘이라고 여겨지고 있다. 이 경로들은 인자 X의 Xa로의 활성화에 집중되며 섬유소 형성에 대한 "공통" 경로를 거쳐 진행한다. 혈관 손상후 조직인자는 칼슘의존 방식으로 인자 VII와 복합되어 인자 VII의 VIIa로의 전환을 용이하게 함으로써 "외" 응고경로를 개시한다. 인자 VIIa-조직인자 복합체는 인자 X를 Xa로 직접 활성화시킬 수 있다.
내경로는 인자 XI를 절단하여 "내"응고 케스케이드의 개시에 필요한 효소인 인자 XIa를 생성하는 트롬빈 또는 인자 VIIa의 생성에 의해 활성화될 수 있다.
"외"경로를 통한 섬유소 생성은 인자 Xa 의존 방식으로 경로를 조절하는 조직인자 경로 저해 단백질(TFPI)의 존재에 의해 제어된다. 다가 쿠니즈형 저해인자인 TFPI는 인자 Xa, 조직인자 및 인자 VIIa와의 4차 복합체를 생성하여 유리인자 Xa 및 인자 VIIa의 형성을 저해함으로써 외경로를 조절하는 것으로 여겨지고 있다. (Broze et al., Bio-chemistry 29: 7539-7546, 1990; 이것은 전부 여기에 참고로 포함된다).
어떤 경우, 예를 들면 신장 투석, 심부 정맥 혈전증 및 파종성 혈관내 응고(DIC)에서는, 헤파린, 쿠마린, 쿠마린의 유도체, 인단디온 유도체 또는 기타의 약제를 사용하여 응고 캐스케이드를 차단하는 것이 필요하다. 시트르산 이온에 의한 헤파린 요법 또는 체외 요법(미국특허 제 4,500,309호)은 예를 들면 투석에서 치료중에 응고를 방지하는데 사용할 수 있다. 헤파린은 또한 수술을 받은 환자에서 심부 정맥 혈전증을 방지할 때도 사용한다. 그러나 낮은 투여량의 헤파린에 의한 요법은 심한 출혈을 초래한다. 게다가 헤파린은 반감기가 약 80분이기 때문에 혈액에서 급속히 제거된다. 헤파린은 안티트롬빈 III (AT III)에 대한 코팩터로서 작용하고 안티트롬빈 III은 DIC 요법시 급속히 소모되기 때문에 종종 적당한 헤파린 투여량을 유지하기가 어려워 AT III 및 헤파린 레벨의 연속적 모니터를 필요로 한다. 또한 만일 AT III 소모가 극단적이라면 헤파린은 무효하다. 더욱이 헤파린의 장기 사용은 혈소판 응집을 증가시켜 혈소판수를 감소시킬 수 있으며 골다공증의 악화에 관련되어 있다.
인단디온 유도체는 또한 독성 부작용이 있을 수 있다.
위에서 간단히 설명한 항응고제 외에도 항응고 활성을 갖는다고 주장되는 조성물은 당업계에 여러가지가 있다. 한가지 그러한 조성물이 사람 탯줄 동맥으로부터 32,000 달톤 폴리펩티드를 분리한 Reutelingsperger et al. (Eur. J. Biochem. 151: 625-629, 1985)에 의해 개시되어 있다. 또 다른 조성물이 Warn-Cramer et al. (Circulation Suppl, part 2, 74: 2-408ii, Abstract #1630, 1986)에 의해 개시되어 있다. 그들은 혈장에서 겉보기 분자량 34,500의 인자 VIIa 저해인자를 검출하였다.
단백질 저해인자는 패밀리 구성원중의 광범위한 서열 상동성 및 사슬내 이황화물 브리지의 보존에 의거하여 일련의 패밀리로 분류된다 (검토를 위해서는 Laskowski and Kato, Ann. Rev. Biochem. 49: 593-626, 1980 참조). 쿠니즈 패밀리의 세린 프로테아제 저해인자는 아프로티닌(소 췌장 트립신 저해인자)과의 상동성을 특징으로 한다. 아프로티닌은 트립신, 키모트립신, 플라스민 및 칼리크레인을 포함하여 여러가지 세린프로테아제를 저해하는 것으로 알려져 있다. 쿠니즈형 저해인자 도메인은 인터-α-트립신 저해인자 (Hochstrasser et al., Hoppe-Seylers z. Physiol. Chem,. 357: 1659-1661, 1969 및 Tschesche et al., Eur. J. Biochem. 16: 187-198, 1970), β-아밀로이드 단백질 전구체 및 α3-콜라겐 VI형(Chu et al., EMBO J. 9: 385-393, 1990)과 같은 큰 단백질에서 보고되어 왔다. TFPI (외경로 저해인자(EPI) 또는 리포단백질연관 응고인자(LACI)로도 알려짐)는 음전하를 띤 아미노 말단 및 양전하를 띤 카르복실 말단에 의해 측접되는 세가지의 탠덤 쿠니즈형 저해인자로 구성되어 있는 혈장 프로테아제 저해인자이다. 제1 및 제2 쿠니즈형 도메인은 인자 VIIa 및 인자 Xa 활성을 각각 저해하는 것으로 밝혀졌다.
당업계에서는 종래의 항응고제 조성물과 연관된 바람직하지 않은 부작용을 낳지 않는 항응고 활성을 갖는 개선된 조성물이 여전히 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시키고 그와 관련된 다른 이점을 더 제공한다.
따라서 본 발명의 목적은 항응고제로서 사용하고 심부 정맥 혈전증 및 DIC의 치료에 사용하기 위한 유사한 저해인자 프로파일을 갖는 저해인자의 쿠니즈 패밀리의 신규한 프로테아제 저해인자를 제공하는 것이다.
[발명의 개요]
요약하면, 본 발명은 쿠니즈형 저해인자를 암호화하는 DNA 절편으로 이루어지는 DNA 분자를 제공하는데, DNA 절편은 1 내지 165의 SEQ ID NO : 14의 뉴클레오티드 서열로 이루어지며, 각 뉴클레오티드 트리플렛 1 내지 3, 4 내지 6, 160 내지 162 및 163 내지 165는 가각 시스테인 이외의 어떤 아미노산이든지 암호화한다. 본 발명의한 양태에서 쿠니즈형 저해인자는 뉴클레오티드 138 내지 뉴클레오티드 305의 SEQ ID NO : 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 본 발명의 다른 양태에서 쿠니즈형 저해인자는 뉴클레오티드 39 내지 뉴클레오티드 743의 SEQ ID NO : 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 또 다른 양태에서 쿠니즈형 저해인자는 뉴클레오티드 138 내지 뉴클레오티드 493의 SEQ ID NO : 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 본 발명의 또 다른 양태에서 쿠니즈형 저해인자는 뉴클레오티드 138 내지 뉴클레오티드 671의 SEQ ID NO : 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
본 발명의 한 양태에서 DNA 절편은 SEQ ID NO : 15의 아미노산 서열로 이루어진 쿠니즈형 저해인자를 암호화하는데, 이 서열에서 각 Xaa는 각각 시스테인 이외의 어떤 아미노산이다. 본 발명의 한 양태에서 DNA 절편은 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호 89의 이소루신까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 이루어진 쿠니즈형 저해인자를 암호화한다. 본 발명의 또 다른 양태에서 DNA 절편은 아미노산 번호 1의 Met로부터 아미노산 번호 235의 Phe 까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 이루어지는 쿠니즈형 저해인자를 암호화한다. 본 발명의 또 다른 양태에서는 DNA 절편은 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호 152의 리신까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 이루어지는 쿠니즈형 저해인자를 암호화한다. 본 발명의 또 다른 양태에서는 DNA 절편은 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호 211의 알라닌까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 이루어지는 쿠니즈형 저해인자를 암호화한다.
본 발명은 또한 제1DNA 절편의 발현에 필요한 추가의 DNA 절편에 작동가능하게 연결된 사람 쿠니즈형 저해인자를 암호화하는 제1DNA 절편으로 이루어지는 DNA 구조체, 그러한 DNA 구조체를 함유하는 숙주 세포뿐만 아니라, 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 쿠니즈형 저해인자를 분리하는 단계로 이루어지는 사람 쿠니즈형 저해인자의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에서는 분리된 쿠니즈형 저해인자가 제공된다. 또 다른 구체예에서 분리된 사람 쿠니즈형 저해인자는 SEQ ID NO : 15의 아미노산 서열로 이루어지는데, 이 서열에서 각 Xaa는 각각 시스테인 이외의 어떤 아미노산이다.
본 발명의 한 양태에서 쿠니즈형 저해인자는 아미노산 번호 1의 Met로부터 아미노산 번호 235의 Phe 까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열, 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호 89의 이소루신까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열, 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호 152의 리신까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 또는 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호 211의 알라닌까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 이루어진다. 본 발명의 또 다른 양태에서는 쿠니즈형 저해인자는 아미노말단에서 SEQ ID NO : 12 또는 SEQ ID NO : 13의 아미노산 서열을 더 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서는 사람 쿠니즈형 저해인자에 특이적으로 결합하는 분리된 항체가 제공된다. 한 구체에에서 항체는 단클론성 항체이다.
본 발명의 또 다른 양태에서 SEQ ID NO : 15의 아미노산 서열로 이루어지는 약학 조성물이 제공되는데, 이 서열에서 각 Xaa는 각각 시스테인 이외의 어떤 아미노산이다. 본 발명의 한 양태에서 약학 조성물은 아미노산 번호 1의 Met로부터 아미노산 번호 235의 Phe 까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열, 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호 89의 이소루신까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열, 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호 152의 리신까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 또는 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호 211의 알라닌까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 이루어지는 사람 쿠니즈형 저해인자를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서 각 Xaa는 각각 시스테인 이외의 어떤 아미노산인 SEQ ID NO : 15의 아미노산 서열로 이루어지는 사람 쿠니즈형 저해인자를 혈액응고를 저해하는데 충분한 양으로 투여하는 것으로 이루어지는 포유동물에서의 혈액응고 저해 방법이 개시된다. 본 발명의 또 다른 양태에서 아미노산 번호 1의 메티오닌으로부터 아미노산 번호 235의 페닐알라닌까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열, 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호 89의 이소루신까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열, 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호 152의 리신까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 또는 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호 211의 알라닌까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 이루어지는 쿠니즈형 저해인자를 혈액 응고를 저해하는데 충분한 양으로 투여하는 포유동물에서의 혈액응고 저해방법이 개시된다. 본 발명의 또 다른 양태에서 아미노 말단에서 SEQ ID NO : 12 또는 SEQ ID NO : 13의 아미노산 서열을 더 포함하는 쿠니즈형 저해인자를 혈액응고를 저해하는데 충분한 양으로 투여하는 포유동물에서의 혈액응고 저해방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서 적어도 12 뉴클레오티드의 프로브가 제공되는데, 이 프로브는 SEQ ID NO : 1의 뉴클레오티드 서열, SEQ ID NO : 1의 뉴클레오티드 변이체, 또는 SEQ ID NO : 1 또는 그 변이체에 상보적인 DNA 서열을 암호화하는 DNA 절편으로 이루어지는 쿠니즈형 저해인자 도메인을 암호화하는 헥산과 혼성화할 수 있다.
이러한 양태 및 기타 양태는 다음 상세한 설명을 참조할 때 명백해질 것이다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 신규한 사람 쿠니즈형 저해인자를 제공한다. 본 발명 저해인자의 한가지 이점은 인자 Xa의 부재하에 인자 VIIa를 저해함으로써 내 또는 외경로를 통한 인자 Xa의 생성을 요구하지 않는는 것이다. 보다 상세히 말하면 본 발명은 아미노산 서열 상동성 및 종합 도메인 편성을 조직인자 경로 저해인자(TFPI)와 공유하는 신규한 이전에 공지되지 않은 쿠니즈형 저해인자를 제공한다. 이 신규한 쿠니즈형 저해인자를 TFPI-2로 나타내었다.
본 발명의 특징중의 하나는 신규한 사람 쿠니즈형 저해인자를 암호화하는 분리된 DNA 분자이다. 그러한 분리된 분자는 그것의 자연 환경으로부터 분리된 분자이며 cDNA 및 게놈 클론을 포함한다. 본 발명의 분리된 DNA 분자는 자연적으로 연관된 다른 유전자없이 제공되며 프로모터 및 터미네이터와 같은 조절영역을 나타내는 자연발생 5' 및 3' 미번역 서열을 포함할 수 있다. 자연발생 5' 및 3' 미번역 영역내의 조절 영역의 동정은 당업자에게 자명할 것이다 (검토를 위해서는 Dynan and Tijan, Nature 316: 774-778, 1985; Birnstiel et al., Cell 41: 349-359, 1985; Proudfoot, Trends in Biochem. Sci. 14: 105-110, 1989; 및 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; 이것은 참고로 여기에 포함된다).
본 발명의 분리된 DNA 분자는 재조합 사람 쿠니즈형 저해인자를 제조하는데 유용하다. 따라서 본 발명은 당업계에 공지된 방법 (일반적으로 Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY, 1982)을 사용하여 용이하게 정제될 수 있는 사람 쿠니즈형 저해인자를 고 품질로 제조한다는 이점을 제공한다. 이 대신에 본 발명의 단백질은 Barany and Merrifield의 방법 (The Peptides. Analysis, Synthesis, Biology vol. 2, Gross and Meien-hofer, eds, Academic Press, NY, pp. 1-284, 1980)과 같은 고상 합성, 부분 고상법, 단편 축합 또는 고전적 용액첨가에 의한 것과 같은 종래의 합성법을 사용하여 합성할 수도 있다.
따라서 본 발명의 추가의 특징은 분리된 사람 쿠니즈형 저해인자이다. 본 발명의 분리된 단백질 및 펩티드는 균질성이 적어도 약 50%, 보다 바람직하게는 균질성이 70% 내지 80%인 단백질인데, 단백질 제제는 특히 약학적 용도에 가장 바람직한 95% 내지 99% 이상의 균질성을 갖는다.
쿠니즈형 저해인자 활성은 본질적으로 Norris et al. (Biol. Chem. Hoppe-Seyler 371: 37-42, 1990)이 기술한 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 간단히 말하면, 여러가지 고정된 농도의 쿠니즈형 저해인자를 0.24㎍/㎖ 돼지 트립신(Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark), 12.8 CU/1 사람 플라스민(Kabi, Stockholm, Sweden) 또는 0.16nkat/ml 사람 혈장 칼리크레인의 존재하에 100mM NaCl, 50mM Tris HCl, 0.01% TWEEN 80 (폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트) (pH 7.4)로 25℃에서 배양한다. 30분 배양후, 잔류 효소활성을 측정완충액에서 0.6mM의 색원성 펩티딜니트로아닐리드 트립신/플라스민 기질 S2251 (D-Val-Leu-Lys-Nan; Kabi) 또는 S 2302 (D-Pro-Phe-Arg-Nan; Kabi)를 함유하는 용액의 분열에 의하여 측정한다. 샘플을 30분동안 배양한후 각 샘플의 흡광도를 405nm에서 측정한다. 효소활성의 저해는 405nm에서의 흡광도 또는 460nm에서의 형광도의 감소로 측정한다. 결과로부터 겉보기 저해상수 Ki를 계산한다.
본 발명의 쿠니즈형 저해인자는 그중에서도 특히 심부정맥혈전증, 파종성 혈관내 응고, 폐색전의 치료 및 수출후 혈전예방을 위해 개시된 방법으로 사용될 수 있다.
본 발명은 SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO: 2 또는 그것의 부분에 나타내고, 및/또는 SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 1 또는 그것의 부분의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 DNA 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열로 이루어지는 신규한 사람 쿠니즈형 저해인자에 관한 것이다. TFPI-2의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2와 다른 쿠니즈형 저해인자, 특히 TFPI의 비교는 단백질이 세개의 추정상 쿠니즈형 저해인자 도메인을 함유하는 것을 나타냈다.
이 분야의 전문가에게는 명백한 바와 같이, 각가의 개체 도메인 또는 도메인의 조합은 본 발명에서의 사용을 위해 합성적으로 또는 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 추정상 쿠니즈형 저해인자 도메인은 아미노산 번호 36의 시스테인으로부터 아미노산 번호 86의 시스테인까지; 아미노산 번호 96의 시스테인으로부터 아미노산 번호 149의 시스테인까지; 및 아미노산 158의 시스테인으로부터 아미노산 208의 시스테인까지의 SEQ ID NO: 2에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진다. 보다 상세하게는 본 발명의 쿠니즈형 저해인자는 아미노산 번호 36의 시스테인으로부터 아미노산 번호 86의 시스테인까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 이루어진다. 쿠니즈 도메인은 이황화 결합을 형성한다고 여겨지는 6개의 특정위치 시스테인 잔기의 우치에 의해 한정된다 (Laskowski and Kato., ibid. and Broze et al., Biochemistry 29: 7539-7546, 1990 참조). 제1 및 제6 시스테인 잔기는 각각의 쿠니즈 도메인의 경계를 한정한다. 따라서, TFPI-2의 경우, 쿠니즈 도메인은 잔기 36과 89, 96과 149, 158과 208 (SEQ ID NO: 2에 따라 번호매김)에 의해 경계를 이룬다. 적당한 이황화 결합 형성 및 단백질 구조를 제공하기 위하여, 쿠니즈 도메인을 한정하는 각각의 시스테인 잔기를 측접하는 적어도 두개의 아미노산 잔기를 포함하는 것이 바람직하다. 그러나, 이들 측접 잔기의 종류는 중요하지 않다. 따라서 상기 "코어" 쿠니즈 서열로 이루어진 개체 쿠니즈 도메인의 변이체를 제공하는 것이 가능하며, 폴리펩티드 코어는 시스테인 잔기 이외의 2 내지 4 이상의 아미노산 잔기에 의하여 그 아미노 말단 및 카르복실 말단에 측접된다. 더우기, 이 분야의 전문가에게는 명백한 바와 같이, 쿠니즈형 저해인자의 아미노 말단 및/ 또는 카르복실 말단의 연장은 합성적으로 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조하고, 저해인자 활성에 대해 테스트할 수 있다.
본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 저해인자 암호화 서열의 부분에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 관련되지만 별개인 쿠니즈형 저해인자의 게놈클론에 해당하는 cDNA에 대해 스크리닝하는 동안 예견치 못하게 확인되었다.
cDNA클론의 분석으로 TFPI-2로 표시되는, 독특하고 전에는 알려지지 않았던 쿠니즈형 저해인자를 암호화하는 클론이 밝혀졌다. 본 발명의 단백질은 여기에 개시된 DNA서열과 실질적으로 유사한 DNA서열에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명의 문맥내에서 사용되는 "실질적으로 유사한" DNA 서열은 보전적 아미노산 치환 및/ 또는 아미노산의 사소한 첨가, 치환 또는 결실을 함유하는 TFPI-2 유전자의 대립 유전자 및 유전공학적 또는 합성 변이체를 포함한다.
또한 DNA서열 변이체는 숙주-선호 코돈이 사람서열내의 유사코돈과 치환된 DNA 코드의 축퇴를 포함한다. 더우기, 실질적으로 유사한 DNA 서열은 고저 긴축조건하에 본 발명의 DNA 서열과 혼성화 할 수 있는 서열 (Sambrook et al., 상기 참조)과 유전적 암호의 결과로서 예를 들면 본 발명의 아미노산 서열로 축퇴된 서열이다. 유전공학적 변이체는 올리고뉴클레오티드 지정된 부위 특이적 돌연변이 유발을 사용함으로써, 제한효소 분해 및 어댑터 라이게이션, 또는 문헌으로 잘 확립된 다른 방법 (예를들면, Sambrook et al. 상기 참조, 및 Smith et al., Genetic Engneering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981 여기서 참고로 포함됨)을 사용하여 얻어질 수 있다.
본 발명의 DNA 분자는 Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1982; 여기서 참고로 포함됨), Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; 여기서 참고로 포함됨) 또는 Mullis et al. (미국특허 제4,683,195호; 여기서 참고로 포함됨)이 기술한 것과 같은 표준 클로닝 방법을 사용하여 분리할 수있다. 이와 선택적으로 본 발명의 암호화 서열은 자동 DNA 합성기와 같은 이 분야에 널리 공지된 표준기술을 사용하여 합성할 수 있다.
이하에 보다 상세하게 설명하겠지만 이제까지 알려지지 않은 사람 쿠니즈형 저해인자는 1.0kb cDNA삽입체로 동정되었으며, SEQ ID NO : 1의 DNA서열로 이루어진다. 본 발명의 한가지 구체예에서, 본 발명의 쿠니즈형 저해인자를 암호화하는 DNA 서열은 SEQ ID NO : 1 또는 그것의 상보체로부터 설계되는 프라이머를 사용하여 PCR증폭에 의해 얻어진다.
TFPI-2를 암호화하는 DNA 분자도 또한 여기에 개시된 DNA서열 및 방법을 사용하여 태반, 간 또는 제정맥 세포 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 개, 토끼, 닭, 돼지, 마우스, 래트 및 소와 같은 사람이 아닌 동물로부터 얻어질 수 있다.
본 발명의 DNA 분자 또는 그것의 부분은 예를들면 세포내에서 TFPI-2 서열을 직접 검출하기 위해서 프로브로서 사용될 수 있다. 그러한 DNA 분자는 일반적으로 합성 올리고뉴클레오티드이지만 클론된 cDNA 또는 게놈 서열로부터도 발생될 수 있으며, 보통 적어도 12뉴클레오티드, 보다 빈번하게는 약 14뉴클레오티드 내지 약 25이상의 뉴클레오티드, 간혹 40 내지 60 뉴클레오티드, 및 약간의 경우에서는 실질적인 부분 또는 심지어 전체 TFPI-2 유전자 또는 cDNA로 이루어진다. 본 발명의 합성 올리고뉴클레오티드는 해당 TFPI-2 DNA서열 (SEQ ID NO : 1) 또는 그것의 상보체와 적어도 85% 동일성을 갖는다. 프로브로 사용하기 위하여, 분자는 이 분야에 공지된 방법에 따라 예를들면 효소, 비오틴, 방사성핵종, 형광단, 화학발광체, 상자성입자로 표지되어 검출가능한 신호를 제공한다. 본 발명의 프로브는 혈전증과 같은 세포대사장애를 검출하기 위한 진단법에 사용될 수 있다.
본 발명내에서 사용되는 DNA 분자는 표지되어 서던 또는 점 블로트와 유사한 혼성화 방법에 사용될 수 있다. 이 분야의 전문가라면 이해할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 DNA 분자를 TFPI-2 서열과 혼성화시키는 조건은 이 분야에 널리 공지된 방법에 의해 결정될 수 있으며 예를 들면, Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; 여기서 참고로 포함됨)이 논의하였다. 이 분야의 전문가는 문헌 (예를 들면 Sambrook et al., 상동, p11.45-11.53 참조)에 널리 알려진 방법에 의해 여러가지 과정에서 사용하기에 적당하게 DNA 분자의 혼성화 조건(즉, 혼성화의 긴축성)을 변화시킬 수 있다. 혼성화의 긴축성이 클수록 검출되는 부정합 서열의 수는 더 낮다. 이와 반대로, 더 낮은 긴축성은 관련 서열을 동정할 수 있게 한다.
대안으로, TFPI-2 단백질 서열 변이체는 본 발명의 DNA와 예를 들면, DNA 서열을 증폭하기 위한 폴리머라제 연쇄반응 (PCR) (Saiki et al., Science 239: 487, 1987; Mullis et al., 미국특허 제4,686,195호; 및 Mullis et al., 미국특허 제 4,683,202호에 개시됨)을 사용하여 동정될 수 있으며, 이어서 아가로스 겔에서 그 특징적인 크기에 의해 검출되거나 서열 비정상을 검출하기 위해 서열화될 수 있다.
본 발명의 쿠니즈형 저해인자를 암호화하는 DNA 분자는 DNA구조체로 삽입될 수 있다. 본 발명의 문맥내에서 사용되는 바와 같은, 발현 벡터로도 알려진 DNA구조체는 단일 가닥 또는 이중가닥된 DNA 분자 또는 그러한 분자의 클론을 말하며, 사실상 달리 존재하지 않는 방식으로 조합되고 병렬된 DNA의 절편을 포함하도록 사람의 조정에 의하여 변형된다. 본 발명의 DNA구조체는 제1DNA절편의 발현에 필요한 추가의 DNA절편에 작동가능하게 연결된 쿠니즈형 저해인자를 암호화하는 제1DNA절편으로 이루어진다. 본 발명의 문맥내에서, 추가의 DNA절편은 보통 프로모터와 전사 터미에이터를 포함하며, 엔핸서 및 다른 요소를 더 포함할 수 있다. 하나 이상의 선택성 마커도 포함될 수 있다. 여러가지 원핵 및 진핵 숙주 세포내에서 클론된 DNA 절편을 발현하기에 유용한 DNA구조체는 쉽게 입수가능한 성분으로부터 제조되거나 시중 구입처에서 구입할 수 있다.
한가지 구체예에서, DNA서열은 각각의 Xaa가 개별적으로 시스테인을 제외한 어떤 아미노산인 SEQ ID NO : 15의 아미노산 서열로 이루어진 쿠니즈형 저해인자를 암호화한다. 다른 구체예에서, DNA 서열은 아미노산 번호 1의 메티오닌으로부터 아미노산 번호 235의 페닐알라닌까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 이루어진 쿠니즈형 저해인자를 암호화한다. 다른 구체예에서, 제1DNA서열은 아미노산 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호 89의 이소루신까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 이루어진 쿠니즈형 저해인자를 암호화한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 쿠니즈형 저해인자는 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호 152의 리신까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 이루어진다. 본 발명의 더 다른 구체예에서 쿠니즈형 저해인자는 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호 211의 알라닌까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 이루어진다.
또한 DNA구조체는 관심상의 폴리펩티드 또는 단백질을 분비시키는데 필요한 DNA 절편을 포함할 수 있다. 그러한 DNA절편은 적어도 하나의 분비신호서열을 포함할 수 있다. 또한 리더 서열, 프리프로서열 및/ 또는 프리서열이라고도 하는 분비신호서열은 세포로부터 성숙 폴리펩티드 또는 단백질을 분비시키도록 지시하는 작용을 하는 아미노산 서열이다. 그러한 서열은 소수성 아미노산의 코어를 특징으로 하며,(절대적인 것은 아니지만) 새로 합성된 단백질의 아미노 말단에서 통상 발견된다. 매우 흔하게 분비펩티드는 분비동안 성숙 단백질로부터 절단된다. 그러한 분비 펩티드는 분비통로를 통과함에 따라서 성숙 단백질로부터 분비 펩티드를 절단시키는 프로세싱 부위를 함유한다. 바람직한 프로세싱부위는 Saccharomyces cerevisiae KEX2 유전자에 의해 인식되는 바와 같은 이염기성 절단부위이다. 특히 바람직한 프로세싱 부위는 Lys-Arg 프로세싱 부위이다. 프로세싱 부위는 분비펩티드내에서 암호화되거나 예를들면 시험관내 돌연변이 유발에 의해 펩티드에 첨가될 수 있다.
바람직한 분비신호는 α인자 신호서열 (프리프로 서열: Kurjan 및 Herskowitz, Cell 30: 933-943, 1982; Kurjan et al., 미국특허 제4,546,082 호; Brake, EP 116,201), PH05 신호 서열 (Beck et al., WO 86/00637), BAR1 분비신호 서열 (Mackay et al., 미국특허 제4,613,572; Mackay WO 87/002670), SUC2 신호서열 (Carlsen et al., Molecular and Cellular Biology 3: 439-447, 1983), α-1-안티트립신 신호서열 (Kurachi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6826-6830, 1981), α-2 플라스민 저해인자 신호서열 (Tone et al., J. Biochem. (Tokyo) 102, 1033-1042, 1987) 및 조직 플라스미노겐 활성인자 신호서열 (Pennical et al., Nature 301: 214/221, 1983)을 포함한다. 대신에 분비신호 서열은 예를 들어 Von Heinje가 설정한 규칙 (European Journal of Biochemistry 133: 17-21, 1983, Journal of Molecular Biology 184: 99-105, 1985; Nucleic Acids Research 14: 4683-4690, 1986)에 따라서 합성될 수 있다. 특히 바람직한 신호 서열은 전부 여기서 참고로 포함되는 WO 90/10075에 기술된 합성 신호 LaC 212 spx (1-47)-ERLE이다.
분비 신호 서열은 단독으로 사용되거나 조합될 수 있다. 예를들면, 제1분비신호 서열은 배리어의 제3도메인을 암호화하는 서열과 조합하여 사용될 수 있다 (미국특허 제5,037,243호에 기술됨, 여기서 그 전부가 참고로 포함됨). 배리어의 제3도메인은 적당한 해독 프레임으로 관심대상의 DNA절편의 3' 또는 DNA절편에의 5'에 그리고 적당한 해독 프레임으로 분비 신호 서열 및 관심대상의 DNA 절편과 함께 위치될 수 있다.
적당한 프로모터, 터미네이터 및 분비 신호의 선택은 이 분야의 통상의 기술을 가진자의 수준내에서 이루어진다.
Saccharomyces cerevisiae에서 클론된 유전자를 발현하는 방법은 이 분야에 일반적으로 공지되어 있다 ("Gene Expression Technology, "Methods in Enzymology, Vol. 185, Goeddel (ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990 및 "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology," Methods is Enzymology, Guthrie and Fink (eds.), Academic Press, San Diego, CA, 1991 참조; 여기서 참고로 포함됨). 또한 본 발명의 단백질은 사상균 예를들면, 균류 Aspergillus의 균주에서 발현될 수 있다. 또한 본 발명의 단백질은 사상균 예를 들면, 균류 Aspergillus의 균주에서 발현될 수 있다(Mcknight et al., 미국특허 4,935,349호, 여기서 참고로 포함됨). 배양된 포유동물 세포 및 E. Coli에서 클론된 유전자의 발현은 예를 들면 Sambrook et al.이 상세하게 논의하였다(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Ekition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; 여기서 참고로 포함됨). 이 분야의 전문가에게 명백한 바와 같이, 조절서열, 벡터 및 문헌상으로 잘 확립된 방법을 사용하여 조류, 곤충 및 식물세포와 같은 다른 숙주세포에서 본 발명의 단백질을 발현할 수 있다.
효모에서, 본 발명에 사용하기에 적당한 효모벡터는 YRp7 (Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76: 1035-1039, 1978), YEp13 (Broach et al., Gene 8: 121-133, 1979), POT 벡터 (Kawasaki et al, 미국특허 제4,931,373호, 여기서 참고로 포함됨), pJDB 249 및 pJDB 219 (Beggs, Nature 275: 104-108, 1978) 및 그것의 유도체를 포함한다. 효모에 사용하기에 바람직한 프로모터는 효모 해당 유전자 (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 12073-12080, 1980; Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1: 419-434, 1982; Kawasaki, U.S. 미국특허 제4,599,311호) 또는 알코올 탈수소효소 유전자 (Young et al., Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender et al., (eds.), p. 355, Plenum, New York, 1982; Ammerer, Meth, Enzymol, 101: 192-201, 1983)로부터의 프로모터를 포함한다. 이에 관하여 특히 바람직한 프로모터는 TPI1 프로모터 (Kawasaki, 미국 특허 제4,599,311, 1986) 및 ADH2-4C- 프로모터 (Russell et al., Nature 304: 652-654, 1983; Irani and Kilgore, 미국특허출원 제07/784,653호, CA 1,304,020 및 EP 284 044, 여기서 참고로 포함됨)이다. 또한 발현 단위체는, 전사 터미네이터를 포함할 수 있다. 바람직한 전사 터미네이터는 TPI1 터미네이터 (Alber and Kawasaki, 상동)이다.
그 다음, 본 발명의 DNA 구조체를 함유하는 숙주 세포를 배앙하여 쿠니즈형 저해인자를 생성한다. 세포는 표준방법에 따라서 특정 숙주세포의 성장에 필요한 영양분을 함유하는 배양배지에서 배양된다. 다양한 적합한 배지가 당업계에 알려져 있고, 일반적으로 탄소원, 질소원, 필수 아미노산, 비타민, 미네랄 및 성장인자를 포함한다. 일반적으로, 성장 배지는 예를 들어 약제 선택 또는 DNA 구조체 상이나 DNA 구조체와 공- 트랜스펙션된 선택성 마커에 의해 상보되는 필수영양소의 결핍에 의해 DNA 구조체를 함유하는 세포를 선택할 것이다.
예를 들어 효모세포는 비- 아미노산 질소원, 무기염, 비타민 및 필수 아미노산 보충물로 이루어진 화학적 한정 배지에서 배양하는 것이 바람직하다. 배지의 pH는 바라직하게는 2 내지 8의 pH에서, 더 바람직하게는 pH6.5에서 유지시킨다. 안정한 pH를 유지하는 방법은 바람직하게는 수산화나트륨의 첨가를 통한 완충작용 및 일정한 pH 조절을 포함한다. 바람직한 완충제는 숙신산 및 Bis-Tris (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)를 포함한다. 아스파라긴-연결된 글리코실화에 필요한 유전자의 결함을 갖는 효모세포는 삼투 안정화제를 함유하는 배지에서 성장시키는 것이 바람직하다. 바람직한 삼투 안정화제는 0.1M 내지 1.5M 사이의 농도로, 바람직하게는 0.5M 또는 1.0M의 농도로 배지내로 보충된 소르비톨이다. 배양된 포유동물 세포는 일반적으로 시중에서 구입가능한 혈청-함유 또는 혈청-없는 배지에서 배양시킨다. 사용된 특정 숙주세포에 적당한 배지의 선택은 당업계의 통상 기술의 범위내에 있다.
본 발명의 한가지 구체예에서, 본 발명의 단백질을 포유동물 세포에서 발현시킨다. 포유동물 숙주세포내로 외생적 DNA를 도입하기 위한 방법은 칼슘포스페이트- 매개된 트랜스펙션 (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981: Graham and Van Der Eb, Virology 52: 456, 1973), 일렉트로포레이션 (Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845, 1982) 및 DEAE- 텍스트란 매개된 트랜스펙션 (Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987)을 포함하며, 이들은 참고로 포함된다.
제조자의 지시서에 따라 Boehringer Mannheim 트랜스펙션- 시약 (N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄메틸술페이트; Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) 또는 LIPOFECTIN 시약 (N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드 및 디오엘레오일포스파티딜에탄올아민; GIBCO-BRL, Gaihtersburg, MD)을 포함하는 시중에서 구입가능한 시약을 사용한 양이온 지질 트랜스펙션도 또한 사용할 수 있다.
배양된 포유동물 세포에서 제조합 단백질의 생산은 예를 들어 Levinson et al., 미국특허 제 4,713,339호; Hagen et al., 미국특허 제 4,784,950호; Palmiter et al., 미국특허 제 4,579,821호에 기술되어 있으며, 이들은 참고로 포함된다. 바람직한 배양된 포유동물 세포는 COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), BHK (ATCC No. CRL 1632), BHK 570 (ATCC No. CRL 10314) 및 293 (ATCC No. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977) 세포주를 포함한다. 추가의 적합한 세포주는 당업계에 공지되어 있고, American Type Culture Collection, Rockville, Maryland와 같은 공공 기탁소로부터 구입할 수 있다.
여기서 기술된 방법을 사용하여 발현된 재조합 쿠니즈형 저해인자는 원심분리 또는 여과에 의해 배지로부터 세포를 분리하고, 예를 들어 황산암모늄과 같은 염에 의해 상청액 또는 여액의 단백질 성분을 침전시키고, 예를 들어 이온교환 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피 등과 같은 다양한 크로마토그래피 방법에 의해 정제하는 것을 포함하는 종래의 방법의해 분리하고 정제한다. 단백질 정제의 방법은 당업계에 공지되어 있으며 (Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, NY (1982) 참조, 참고로 포함됨), 이것을 본 발명의 재조합 단백질의 정제에 활용할 수 있다.
본 발명의 쿠니즈형 저해인자는 트립신에 결합하는 저해인자의 능력을 사용하여 평가할 수 있다. 요약하면, 총 약 1리터의 발효 상청액을 최종 농도 50mM가 될때까지 고체 Tris-HCℓ을 첨가하고, 4M NaOH로 적정함으로써 pH8.0으로 조정한다. 여과하여 어떤 세포 조각을 제거한 후, 상청액을 CNBr- 활성된 세파로스에 흡착된 소 트립신의 컬럼 (35㎖ 겔당 350㎎소 트립신)에 적용한다. 컬럼을 순차적으로 150㎖ 0.1M Tris-HCℓ(pH8.0), 0.5M NaCℓ다음, 150㎖ 0.11M Tris-HCℓ(pH8.0)로 세척한 후, 결합물질을 200㎖ 0.2M 글리신-HCℓ(pH3.0)로 용출한다. 10㎖의 분획은 수집하고, 역상 HPLC에 의해 분석한다. 단백질- 함유 분획을 모은다.
풀(pool) 상태의 물질을 5% B (아세토니트릴중 0.7% TFA) 및 95% A (H2O중 0.1% TFA)제조용 역상 HPLC 컬럼 (Vydac, 분리군, Hesperia, CA 등)에 적용한다. 유속을 4㎖/ 분으로 유지한다. 샘플의 적용후에, 컬럼을 214nm에서의 베이스라인이 성취될 때까지 5% B로 세척한다. 분획수집과 함께 구배용출은 80분에 걸쳐서 5 내지 85% B로 실행한다. UV-흡광 물질을 함유하는 분획을 역상 HPLC (Vydac)에 의해 분석하고, 합쳐서 풀상태의 크로마토그래프적 순수물질을 얻는다. 용매를 진공 원심분리에 의해 풀상태의 분획으로부터 제거한다. 주요 풀중 저해인자의 농도 및 총 수율은 역상 HPLC 분석과 아프로티닌 표준과의 비교에 의해 측정한다. 최종 제제는 전자 스프레이 질량 분광법 (SCIEX API III) 등에 의해 특성화한다.
쿠니즈 저해인자의 단백질분해적 절단이 잠재적 문제점인 경우에, 본 발명의 쿠니즈 저해인자는 또한 Norris et al. (Biol. Chem, Hoppe-Seyler 371: 37-42, 1990, 전체가 참고로 포함됨)에 의해 필수적으로 기술된 방법을 사용하여 정제화할 수 있다. 요약하면, 선택된 형질전환체를 약 25의 OD600에 도달할 때까지 30℃에서 약 40시간 동안 10리터의 YEPD에서 성장시킨다. 배양물을 원심분리하고, 상청액을 기울여 따른다. 상청액의 300㎖-1000㎖ 앨리컷을 pH2.3으로 조정하고, 이미 20mM Bicine, pH 8.7 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)로 평형화된 S-세파로스 (Pharmacia-LKB Biotechnology AS, Alleroed, Denmark) 등과 같은 8㎖의 구슬형 아가로스 매트릭스를 함유하는 컬럼에 적용한다. 컬럼을 20mM Bicine, pH 8.7로 광범위하게 세척한 후, 쿠니즈형 저해인자를 1M NaCℓ을 함유하는 30㎖의 20mM Bicine, pH 8.7로 용출한다. 용출 물질을 20mM NH4HCO3, pH 7.8로 평형화된 Sephadex G-25 컬럼 (구슬형 덱스트란 매트릭스, Pharmacia-LKB Biotechnology AS, Alleroed, Denmark; 2.5×30㎝) 등에 적용시킴으로써 탈염시킨다.
쿠니즈형 저해인자를 20mM NH4HCO3, pH 7.8로 용출한다.
쿠니즈형 저해인자를 20mM Bicine pH 7.8로 평형화된, MONO S 컬럼 (Pharmacia-LKB, Bio-technology AS, Allerode, Denmark;0.5×5㎝) 등과 같이 구슬형 친수성 수지에 커플링된 전하를 띤 술폰기를 갖는 양이온 교환기를 함유하는 컬럼상에서 크로마토그래피함으로써 더욱 정재화하고 농축시킨다. 10분간 2㎖/ 분으로 평형 완충액으로 세척한 후, 쿠니즈형 저해인자의 구배용출을 평형 환충액중 0-0.6M NaCℓ로 부터 1㎖/ 분으로 12분동안 수행한다. 피크 샘플을 풀상태로 만들고, 쿠니즈형 저해인자를 20분 이내에 5% A (수중 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA))로부터 45% B (아세토니트릴중 0.7% TFA)까지 4㎖/ 분의 구배용출을 갖는 Vydac 214TP510 컬럼 (Mikro-lab, Aarhus, Denmark; 10×25㎝)등 상에서 역상 HPLC를 사용하여 정제화한다. 정제 생성물을 수중 동결건조하고, 저해인자 활성을 측정한다.
이와 선택적으로, TFPI-2를 헤파린 아가로스, MONO Q (Pharmacia) 등과 같은 구슬형 친수성 수지에 가교결합된 4차 아민기를 갖는 음이온 교환기, MONO S (Pharmacia) 등과 같은 구슬형 친수성 수지에 커플링된 전하를 띤 술폰기를 갖는 양이온 교환기와 SUPEROSE 12 (Pharmacia) 등과 같은 1×103내지 3×105MW의 단백질의 구분을 위한 서로 다른 공극률을 갖는 교차결합된 아가로스겔 여과 매트릭스를 사용하는 순차적 크로마토그래피에 의해 조건 배지로부터 정제화할 수 있다. 요약하면, 1N NaOH로 pH7.5로 조정되고 0.22-㎛ 필터를 통해 여과된 조건 혈청- 없는 배지를 버퍼 A (50mM Tris-HCℓ(pH 7.5), 10% 글리세롤)로 4℃에서 평형화된 헤파린 세파로스 컬럼 (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ)등에 적용한다. 여과된 배지를 3㎖/ 분의 유속으로 적용한다. 컬럼을 0.2M NaCℓ을 함유하는 완충액 A로 세척한다. 트립신을 저해하는 그것의 능력 (실시예 4A)에 의해 판단된 TFPI-2활성을 1M NaCℓ을 함유하는 버퍼 A로 컬럼으로부터 용출한다. 헤파린 세파로스 컬럼으로부터의 용출물을 25mM Tris-HCℓ(pH 7.5), 10% 글리세롤에 대해 4℃에서 투석시킨다. 잔류물을 실온에서 25mM Tris-HCℓ(pH 7.5), 10% 글리세롤로 평형화된 MONO Q (MONO Q HR 5/5; Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ)등과 같은 구슬형 친수성 수지에 교차결합된 4차 아민기를 갖는 음이온 교환기를 함유하는 5×50mm 컬럼상에서 FPLC (Pharmacia Biotech Inc.) 시킨다. TFPI-2를 1㎖/ 분의 유속으로 선형 NaCℓ구배 (0-0.5M NaCℓ)의 컬럼으로부터 용출한다. TFPI-2 분획을 풀상태로 만들고, 25mM 시트르산나트륨 (pH 5.0), 10% 글리세롤에 대해 투석시킨다. 그 다음 잔류물을 0.5ℓ/분의 유속으로 MONO S (MONO S HR 5/5; Pharmacia Biotech Inc.)등과 같은 구슬형 친수성 수지에 커플링된 전하를 띤 술폰기를 갖는 양이온 교환기상에서 실온에서 FPLC시킨다. TFPI-2활성을 25mM 시트르산나트륨 ( pH 5.0), 10% 글리세롤로부터 25mM Tris-HCℓ(pH 7.5), 10% 글리세롤, 1M NaCℓ까지의 구배용출로 MONO S 컬럼으로부터 용출한다. TFPI-2활성을 함유하는 분획을 풀상태로 만들고, 한외여과에 의해 약 1㎖로 농축한다. 농축 샘플을 50mM Tris-HCℓ(pH 7.5), 100mM NaCℓ에서 실온에서 SUPEROSE 12 (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ) 등과 같은 1×103내지 3×105MW의 단백질의 구분을 위해 적합한 공극률을 갖는 교차결합된 아가로스겔 여과 매트릭스를 따라 EPLC시킨다. TFPI-2활성을 갖는 EPLC로부터 용출된 분획을 SDS-PAGE시키고, 순수 분획을 풀상태로 만들고 -80℃에 저장했다.
본 발명은 또한 본 발명의 쿠니즈형 저해인자와 함께 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제로 이루어진 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물에서, 쿠니즈형 저해인자는 예를 들면 Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985에 기술된 바와 같은 약학 조성물의 어떤 확립된 조제방법에 의해서도 조제할 수 있다. 조성물은 전형적으로 전신성 주사 또는 주입을 위한 적합한 형태일 수 있고, 그와 같이 멸균수 또는 등장염수 또는 글루코스 용액과 함께 조제될 수 있다.
그러므로 본 발명의 쿠니즈형 저해인자는 조직인자경로 저해인자가 유용한 치료적 용도에서의 사용에 유리하다고 생각된다. 그러한 용도는 파종성 혈관내 응고, 심부 정맥 혈전증, 폐색증 및 수술후 혈전 예방을 포함한다. 당업계의 숙련자에게 명백한 바와 같이, 본 발명의 쿠니즈형 저해인자는 그러한 약제의 항트롬빈 또는 항응고 활성을 증대시키는 다른 치료적 약제와 함께 조합할 수 있다. TFPI-2는 예를 들어 혈전용해 치료에서 조직 플라스미노겐 활성인자와 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 쿠니즈형 저해인자의 사용은 인자 VIIa/조직인자 복합체를 저해하는 그것들의 능력의 결과로서 가리켜진다.
그래서 본 발명의 쿠니즈형 저해인자는 포유동물에서 혈액응고를 저해하기 위한 방법내에서 사용될 수 있다. 그러한 방법은 일반적으로 혈액응고를 저해하기에 충분한 양으로 쿠니즈형 저해인자를 투여하는 것을 포함할 것이다. 그러한 양은 치료될 질병의 정도에 따라 변할 수 있고, 약 10㎍/㎏ 내지 10㎎/㎏ 체중의 범위내일 것이다. 바람직하게는 투여된 쿠니즈형 저해인자의 양은 100㎍/㎏ 내지 5㎎/㎏의 범위내, 가장 바람직하게는 100㎍/㎏ 내지 1㎎/㎏의 범위내일 것이다. 상기 약학적 용도와는 별도로, 위에서 특정된 쿠니즈형 저해인자는 예를 들어 스크리닝 측정법 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 쿠니즈형 저해인자에 직접적 또는 간접적으로 결합하는 천연물질, 예를 들어 프로테아제 또는 리셉터를 사람물질로부터 분리하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 그것의 유도체를 포함하는 쿠니즈형 저해인자 뿐만 아니라 이들 단백질의 부분 또는 단편도 쿠니즈형 저해인자와 특이적으로 결합하는 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 여기서 사용된 "항체"라는 용어는 다클론성 항체, 단클론성 항체, F(ab')2및 Fab 단편과 같은 그것의 항원-결합 단편 뿐만 아니라 재조합적으로 생산된 결합 파트너도 포함한다. 이들 결합 파트너는 특이적 결합 단클론성 항체를 암호화하는 유전자로부터의 다양한 영역에 통합한다. 항체는 만약 그것들이 107/M 이상의 Ka로 쿠니즈형 저해인자와 결합한다면 특이적으로 결합한다고 정의된다. 단클론성 항체 또는 결합 파트너의 친화성은 당업계의 통상기술중 한가지 (Scatchard, Ann. NY Acad, Sci. 51: 660-672, 1949 참조)에 의해 쉽게 결정할 수 있다. 분리된 항체는 다른 혈액으로부터 실질적으로 분리된 항체이다.
다클론성 및 단클론성 항체의 제조방법은 논문 (예를 들어 Sambrook et al., 상동; Hurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies : Technigues and Applications, CRE Press, Inc., Boca Raton. FL, 1982참조)에 잘 기술되어 있다. 당업계의 통상 기술자에 명백한 바와 같이, 다클론성 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 토끼, 마우스 또는 래트와 같은 다양한 온혈동물로부터 발생될 수 있다. 쿠니즈형 저해인자의 면역원성은 Freund의 완전 또는 불완전 보조제와 같은 보조제의 사용을 통해 증가할 수 있다. 당업계의 숙련자에 공지된 다양한 측정법을 쿠니즈형 저해인자에 특이적으로 결합하는 항체를 검출하기 위해 사용할 수 있다. 측정법의 예들은 Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow 및 Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. 에 상세히 기술되어 있다. 그러한 측정법의 대표적 예들은 병발 면역전기영동, 방사면역측정법, 방사면역침전법, 효소-연결 면역흡착측정법, 점 블로트측정법, 저해 또는 경쟁측정법 및 샌드위치 측정법을 포함한다.
단클론성 항체의 제조를 위한 추가의 기술을 재조합 단클론성 항체를 구성하고 발현시키기 위해 사용할 수 있다. 간단히 말하면, mRNA를 B세포 집단으로부터 분리시켜, 스트라토사이트(La Jolla, CA)로부터 얻을 수 있는IMMUNOZAP(H)와IMMUNOZAP(L) 벡터와 같은 적합한 벡터로 중쇄 및 경쇄 면역 글로불린 cDNA 발현 라이브러리를 생성하는데 사용한다. 그 다음에, 이들 벡터를 개별적으로 스크리닝하거나 공발현시켜 Fab 단편이나 항체를 생성한다 (Huse et al., Science 246: 1275-1281, 1989; Sasrty et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5728-5732, 1989). 이어서 양성 플라크를 E. coli에서 단클론성 항체 단편을 높은 레벨로 발현시키는 비용균 플라스미드로 전환시킨다.
또한 상기한 바와 같은 결합 파트너는 특이적 결합 항체를 암호화는 여러 영역의 유전자를 통합하는 재조합 DNA 기술을 사용하여 구성할 수도 있다. 이들 단백질의 구성은 당업자에 의해 용이하게 달성될 수 있다 (예를 들면, Larrick et al., Biotechnology 7: 934-938, 1989; Reichmann et al., Nature 322: 323-327, 1988 및 Roberts et al., Nature 328: 731-734, 1987 참조). 일단 적합한 항체나 결합 파트너가 얻어지게 되면, 그것을 문헌에 잘 기재된 많은 방법에 의해 분리하거나 정제할 수 있다(예를 들면, Antibodies: A Laboratory Manual. 상기 참조). 적합한 방법으로는 단백질 또는 펩티드 친화성 컬럼, HPLC 또는 RP-HPLC, 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼상의 정제 또는 이들 방법의 어떤 조합을 들 수 있다. 본 발명의 명세서에서, 항체 또는 결합 파트너를 정의하는데 사용되는 "분리된"이라는 용어는 "실질적으로 다른 혈액 성분이 없는" 것을 의미한다.
본 발명의 항체 및 결합파트너는 여러 방법으로 사용할 수 있다. 쿠니즈형 저해인자의 조직분포는 예컨대 쿠니즈형 저해인자에 특이적으로 결합하는 표지된 단클론성 항체와 함께 조직 슬라이스를 배양하고, 이어서 결합된 항체의 존재를 검출함으로써 측정할 수 있다. 본 발명에서 사용하는데 적합한 표지는 당업계에 잘 공지되어 있고, 많은 가운데 플루오레신, 이소티오시아네이트, 피코에리트린, 양고추냉이 퍼옥시다제 및 콜로이드상 금을 예로 들수 있다. 또한 본 발명의 항체는 본 발명의 쿠니즈형 저해인자의 정제를 위해 사용할 수도 있다. 고체 지지체에 대한 항체의 커플링 및 단백질 정제에서의 그들의 사용은 문헌에 잘 공지되어 있다 (예를 들면, Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker (Ed.), Humana Press, New Jersey, 1984, 이것은 전부 여기에 참고로 포함된다).
다음 실시예는 예시의 방법으로 제공된 것이고, 제한의 방법으로 제공된 것이 아니다.
[실시예]
제한 효소 및 다른 DNA 변형 효소 (예컨대, T4 폴리뉴클레오티드 키나제, 송아지 알칼리성 포스파타제, DNA 중합효소 I (Klenow 단편), T4폴리뉴클레오티드 리가제)는 GIBCO BRL Life Tenhnology 사 (GIBCO BRL) 및 New England Biolabs에서 얻었고, 다른 표시가 없으면 제조업자가 지시하는 바와 같이 사용하였다.
올리고 뉴클레오티드는 Applied Biosystems 모델 380A DNA 합성기에서 합성하고 변성 겔상에서 폴리아크릴아미드겔 전기영동으로 정제하였다. E. Coli 세포는 Maniatis et al., (Molecualr Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) 또는 Sambrook et al., (Molecualr Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed., Cold Spring Harbor New York, 1989)에 의해 기재된 바와 같이 형질전환시켰다. 방사성 표지된 프로브 및 혼성화 용액은 본질적으로 Sambrook et al., (Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2 ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989; 이것은 전부 여기에 참고로 포함된다)에 의해 기재된 바와 같이 제조하였다.
[실시예 1]
신규의 사람 쿠니즈형 저해인자 cDNA의 클로닝
안티센스 30량체 올리고뉴클레오티드(ZC4792; SEQ ID NO:3)를 사용하여 여러가지 사람 조직 공급원으로부터의 폴리 (A)+RNA 를 스크리닝하였다. 심장, 뇌, 태반, 간, 폐, 골격근, 신장 및 췌장 (HUMAN MTN BLOT) 로부터의 사람 폴리 (A)+RNA의 블로트를 Clontech Laboratories사 (Palo Alto, CA)로부터 얻었다. 블로트를 55℃에서 4시간동안 예비 혼성화용액(5×SSPE (표 1), 2×Denhardt's (표 1), 0.5% 도데실황산나트륨(SDS), 초음파 분해된 연어 정액 DNA 100㎍/㎖) 중에서 예비혼성화시켰다. 예비혼성화후, 예비혼성화 용액을 제거하고32P-표지된 ZC4792 (SEQ ID NO:3) 4.7×106cpm/㎖를 함유하는 예비혼성화 용액으로 대체하였다. 55℃에서 하룻밤 배양후, 혼성화용액을 제거하고, 블로트를 실온에서 20분동안 2×SSC (표 1), 0.05% SDS로 1회 세척하고 뒤이어 55℃에서 20분동안 2×SSC (표 1), 0.1% SDS로 세척하였다. 블로트를 2시간 30분동안 필름에 노출시켰다. 얻어진 자동 방사선 사진으로 대부분의 레인에서 다수의 밴드가 있음을 알았고, 이것은 블로트에 나타난 대부분의 조직에 관련 서열이 존재함을 제시한다. 블로트를 60℃ 내지 65℃의 온도에서 30분동안 2×SSPE (표 1)에서 고 긴축성으로 세척하고, 그 후 블로트를 하룻밤 필름에 노출하였다. 이차 자동 방사선 사진으로 태반 및 간에 대한 1.6Kb밴드 및 췌장에서의 약 1.2Kb의 명백히 더 작은 밴드의 존재를 알 수 있었다.
[표 1]
증류수에 고체를 용해한다. 부피를 1리터가 되게 한다. 오토클레이브로 멸균한다.
쿠니즈 패밀리로부터 사람 태반 프로테아제 저해인자를 암호화하는 cDNA를 얻기 위해gtll중의 사람 태반 cDNA 라이브러리(Clontech Laboratories 사, Palo Alto, CA)를 본질적으로 상기한 바와 같이 방사선 표지된 ZC4792 (SEQ ID NO:3)를 이용하여 스크리닝하였다. 라이브러리를 적정하고 총 12개의 플레이트에 플레이트당 2×105pfu를 플레이팅하여 2백 4십만개의 독립 플라크를 얻었다. ICN BIOTRANS 나일론 막(INC, Irvine, CA)를 사용하여 복제 플라크리프트를 제조하였다. 50℃에서 1시간동안, 5×SSC (표 1), 0.5% SDS로 막을 예비세척한 후, 55℃에서 하룻밤 예비혼성화용액#1(표 1)으로 예비혼성화시켰다. 예비혼성화용액을 제거하고 ZC4792 프로브 7.2×107cpm/(SEQ ID NO:3)을 함유하는 새로운 예비혼성화용액#1(표 1)로 대체하였다. 예비혼성화와 동일한 조건하에서 혼성화를 실시하였다. 혼성화 용액을 제거하고 블로트를 60℃에서 2x SSC (표 1), 0.1% SDS로 세척하였다. 14개의 양성 플라크를 동정하고 방사성 표지된 ZC4792 (SEQ ID NO:3)를 사용하여 플라크를 정제하였다.
14개 클론의 플라크 정제로부터의 삼차필터를 아밀로이드 전구체 단백질 상동체 암호화 서열인 ZGKI13 (수탁번호 ATCC 69090로 E. Coli 형질전환체로서 1992년 10월 2일에 American Type Culture Collection, 12301 ParkLawn Dr., Rockville, MD에 기탁됨)으로부터 특정 단편으로 프로브하여 아밀로이드 전구체 단백질 상동체와 상동성을 갖는 클론을 동정하고 제거하였다. ZGKI13의 임의적 프라임의 880bp Pst I-Xho I 단편을 프로브로서 사용하였다. 필터를 표지된 프로브 2×106cpm/㎖ 를 함유하는 예비혼성화용액 #2에서 65℃에서 하룻밤 혼성화하였다. 혼성화 후, 용액을 제거하고 필터를 65℃ 0.2×SSC (표 1), 0.1% SDS로 세척하였다. 14개의 플라크중 4개는 ZGKI13 아밀로이드 단백질 전구체를 암호화하는 것으로 밝혀졌다. 이들 4개의 클론을 폐기하였다.
남은 정제된 파지클론 10개중 1개로부터 이중가닥 DNA를 제조하여 J-2-11로 표기하였다. 플라스미드 DNA를 Eco RI로 분해하여 약 1Kb cDNA 삽입체를 분리하였다. Eco RI 단편을 Eco RI-선형화된 pUC19로 서브클로닝하였다. 클론화된 단편의 서열 분석으로 쿠니즈 패밀리의 프로테아제 저해인자에 강한 상동성을 나타내는 클론의 세개 영역을 증명하였다. 남은 파지클론 9개 (상기함)의 삼차필터를 스크리닝하고, J-2-11 클론에 특이적인 표지된 프로브로 결정하였다. 삼차필터를 키나제 올리고뉴클레오티드 ZC6281 프로브 (SEQ ID NO:4) 2×106cpm/㎖ 를 함유하는 예비혼성화용액 #2(표 1)에서 55℃에서 하룻밤 혼성화하였다. 혼성화 후, 프로브를 제거하고, 60℃에서 2×SSC (표 1), 0.1% SDS로 필터를 세척하였다. 필터의 자동 방사선 사진으로 9개의 후보클론 모두가 J-2-11 에 상동인 서열을 함유하였음을 알았다. 클론 한개를 선택하여 J-2-11/pUC19로 표기하였다.
플라스미드 S-2-11/pUC19는 수탁번호 69425로 American Type Culture Collection (12301 ParkLawn Dr., Rockville, MD)에 1993년 9월 17일에 E. Coli 형질전환체로서 기탁하였다. 플라스미드 J-2-11/pUC19는 SEQ ID NO:1에 나타낸 서열을 포함함을 알 수 있다. 서열의 분석으로 36 뉴클레오티드의 5'비암호화 영역, 235 아미노산을 암호화하는 705 뉴클레오티드의 오픈 리딩 프레임 및 235 뉴클레오티드의 31 비암호화 영역을 알 수 있었다. 다른 쿠니즈형 저해인자와 추론된 아미노산서열( SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2)의 비교로 TFPI와의 아미노산 상동성 및 도메인구조 유사성을 알 수 있었다.
사람조직으로부터의 폴리(A)+mRNA 블로트(Clontech Multiple Tissue Northern Blot)를 TFPI-2 서열 (ZC6281; SEQ ID NO:4)에 해당하는32P-말단표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 스크리닝하여 전사체의 조직분포를 측정하였다. 블로트를 55℃에서 수시간 동안 5x SSPE(표 1), 2x Denhardt (표 1), 0.5% SDS, 연어 정액 DNA 100㎍/㎖를 함유하는 예비혼성화용액에서 예비혼성화시켰다. 예비혼성화후, 용액을 제거하고 블로트를 55℃에서 하룻밤 키나제 ZC6281 (SEQ ID NO:4)을 함유하는 새로운 예비혼성화용액에서 혼성화시켰다. 블로트를 0.2x SSC (표 1), 0.1% SDS로 65℃에서 세척하고 필름에 노출시켰다. 자동 방사선 사진의 분석으로 TFPI-2가 태반 및 간에서 전사되는 것을 알았다. 후속하는 노던분석으로 사람제정맥내피세포중의 TFPI-2 전사체의 존재를 증명하였다. 하나의 대 전사체가 1.4Kb로 나타나고 가능한 소 전사체는 ～2Kb로 나타난다. 가징 긴 TFPI-2 클론의 크기를 기초로 하여, 폴리아데닐화 서열이 보이지 않기 때문에 클론이 3'비암호화서열중의 일부가 결여되어 있는 불완전 전사체를 나타내는 것이 가능하다. 3' 말단에서는 링커서열이 보이지 않으므로 3'말단의 Eco RI 부위는 내부부위인 것으로 보인다. 그러므로, mRNA 크기는 전체길이 전사체에서 추가의 400bp의 3' (또는 5') 비암호서열을 예상할 수 있다.
[실시예 2]
배양된 포유동물 세포내에서의 신규한 사람 쿠니즈형 저해인자의 발현
클론 J-2-11에 의해 암호화된 신규한 사람 쿠니즈형 저해인자를 포유동물 발현벡터 Zem 229R에서 발현시켰다. 벡터 Zem 229R은 수탁번호 69447로 E.coli형질 전환체로서 American Type Culture Collection (12301 ParkLawn Dr., Rockville, MD 20852)에 1993년 9월 28일에 기탁되었다. Eco RI로 분해하여 선형화시킨 Zem 229R에 J-2-11/pUC19로 부터의 약 1Kb EcoRI단편을 라이게이션 시켰다. 형질전환체를 프로모터에 대하여 적당한 방향으로 삽입체를 함유하는 플라스미드에 대하여 스크리닝하였다. 양성 클론을 동정하고 플라스미드 DNA를 제조하였다. 플라스미드 DNA를 인산칼슘 매개 트랜스펙션을 사용하여 BHK 570세포를 트랜스펙션시키는데 사용하였다 (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro and Dearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981: Graham and Van der Eb, Virology 52: 456, 1973).
BHK 570세포는 수탁번호 CRL 10314로 1989년 2월 20일에 American Type Culture Collection (ATCC; 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD, 20852, USA)에 기탁되었다. 트랜스펙션된 세포를 초기에 메토트렉세이트 1㎛을 함유하는 배지의 존재하에서 선택한후, 10㎛ 메토트렉세이트를 함유하는 배지에서 더 엄밀하게 선택하였다.
10㎛ 메토트렉세이트에서 선택한후에, 임의적으로 선택된 클론을 성장배지에서 6웰 접시에 넘치도록 성장시켰다 (표 1). 넘치도록 성장된후에, 소모된 배지를 따라내고, 세포를 포스페이트완충염수(PBS; 표 1)으로 세척하여 남아있는 어떠한 혈청도 제거하였다. 혈청이 없는 배지(표 1)를 세포에 첨가하고, 세포를 24-48시간동안 성장시켰다. 조건배지를 수집하고 실시예 4A에 자세히 설명된 측정방법을 사용하여 트립신 저해활성에 대하여 측정하였다.
높은 레벨의 트립신 저해활성을 갖는 클론을 대규모 배양을 위해 선택하였다. 클론으로부터의 세포를 팽창시켜 작거나 큰 세포공장에 시딩하고 아프로티닌 10㎎/L (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark)을 함유하는 성장배지(표 1)에서 넘치도록 성장시켰다. 넘치도록 성장된 후에 배지를 제거하고, PBS로 세포를 세척하고 아프로티닌 10㎎/L 를 함유하는 혈청이 없는 배지(표 1)를 첨가하였다. 배지를 2-4일마다 수집하고 -20℃에서 보관하였다.
[실시예 3]
효모 Saccharomyces cerevisiae에서 쿠니즈형 저해인자 도메인의 발현
A. SEQ ID NO:2의 아미노산 34 내지 89로 이루어진 TFPI-2의 쿠니즈형 저해인자 도메인의 발현.
플라스미드 pJ-2-11/pUC19에서 암호화되고 아미노산 34의 글루탐산으로부터 아미노산 89의 이소루신까지의 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열로 구성되는 쿠니즈형 저해인자 도메인을 PCR-발생 서열로부터 효모 Saccharomyces cerevisiae 균주에서 발현시켰다. 쿠니즈형 저해인자 도메인을 암호화하는 DNA서열을 pJ-2-11/pUC19로 부터 증폭시켰다. 합성올리고뉴클레오티드 프라이머 M-2161 과 M-2177(각각, SEQ ID NO:5 및 6)을 PCR증폭 프라이머로서 설계하였다. 합성 올리고뉴클레오티드 M-2177은 SEQ ID NO : 1의 뉴클레오티드 288-305에 상보적이고 또한 Xba I 부위의 앞에 있는 번역 정지코돈을 함유하는 5' 연장을 가진다. 올리고뉴클레오티드 M-2161은 SEQ ID NO : 1의 뉴클레오티드 138-145에 앞서는 SEQ ID NO : 7로 나타낸 합성 리더 서열의 뉴클레오티드 215-235와 동일한 서열을 갖는다. 1㎍의 플라스미드 pJ-2-11/pUC19, 올리고뉴클레오티드 M-2161 및 M-2177(각각, SEQ ID NO:5 및 6) 각각 100pmol과 GENEAMP 키트(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT)에서 제공되는 시약을 제조자의 지시에 따라 사용하여 100㎕의 최종부피에서 PCR반응을 실행한다. 19 사이클(94℃에서 20초, 50℃에서 20초, 그리고 72℃에서 30초)동안 반응을 증폭시키고 이어서 72℃에서 10분 배양한다. 205bp의 단편을 아가로스켈 전기영동으로 분리시킨다.
합성 신호서열(SEQ ID NO: 7)을 암호화하는 DNA서열을 플라스미드 pKFN-1000으로부터 얻은 단편을 PCR증폭하여 얻는다. 플라스미드 pKFN-1000은 합성 효모신호리더펩티드를 암호화하는 DNA서열을 함유하는 플라스미드 pTZ 19R(Mead et al., Prot, Engin. 1: 67-74, 1986)의 유도체이다. 플라스미드 pKFN-1000은 여기에 그 전부가 참고로 포함되는 WO 90/10075에 기술되어 있다.
플라스미드 pKFN-1000의 Eco RI부위로부터 235염기쌍의 하류에 있는 DNA서열과 그 암호화된 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 7과 8에 나타낸다. 플라스미드 pKFN-1000의 0.7kb Pvu II 단편을 주형으로 사용한다. 합성 올리고뉴클레오티드 NOR-1478(SEQ ID NO: 9)은 Eco RI부위 (SEQ ID NO: 7의 뉴클레오티드 1-6)의 바로 상류서열과 동일하다. 합성 올리고뉴클레오티드 NOR-2523(SEQ ID NO : 10)은 SEQ ID NO: 7내 암호화 서열의 뉴클레오티드 215-235와 상보적이다. 0.1㎍의 0.7kb Pvu II단편, 올리고뉴클레오티드 NOR-1478및 NOR-2523 (각각, SEQ ID NO: 9와 10)각각 100pmol 과 GENEAMP 시판키트(Perkin Elmer Cetus)에서 제공되는 시약을 제조자의 지시에 따라 사용하여 100㎕의 최종부피에서 PCR 반응을 수행한다. PCR반응을 상기와 같이 증폭시킨다. 257bp PCR 생성물을 아가로스겔 전기영동으로 분리한다.
쿠니즈형 저해인자 도메인에 작동가능하게 연결되는 완전한 합성신호서열을 암호화하는 DNA 서열을 상기의 PCR단편 2개를 증폭시켜서 얻는다. 프라이머 NOR-1478(SEQ ID NO: 9)와 M-2177(SEQ ID NO: 6) 각각 100pmol, 그리고 상기의 PCR단편 2개 각각 0.1㎍을 사용하여 상기와 같이 PCR반응을 실행한다. 16사이클(94℃에서 1분, 50℃에서 2분, 71℃에서 3분) 동안 PCR반응을 증폭시키고 이어서 72℃에서 10분 배양한다. 437bp의 단편을 아가로스겔 전기영동으로 정제한다. 그다음 단편을 Eco RI과 Xba I으로 분해하고, 생성된 408bp의 단편을 Eco RI과 Xba I으로 분해되어 선형화된 플라스미드 pTZ19R과 라이게이션시킨다. 라이게이션 혼합물을 콤피턴트 제한 마이너스, 변형 플러스 E. Coli균주로 형질전환하고, 암피실린 존재하에서 형질전환체를 선택한다. 선택된 형질전환체로부터 제조된 플라스미드 DNA를 서열화하고 쿠니즈형 저해인자 도메인과 융합된 합성 효모신호서열의 DNA서열을 함유하는 플라스미드를 동정한다.
뒤이어, 분비신호-쿠니즈형 저해인자 도메인을 암호화하는 Eco RI-Xba I단편을 분리하고 플라스미드 pMT-636내로 서브클로닝한다. 플라스미드 pMT-636은 셔틀벡터 pCPOT (플라스미드 pCPOT는 1984년 5월 9일, American Type Culture Collection ; 12301 ParkLawn Dr., Rockville, MD 에 수탁번호 39685로 기탁되었다)에서 유래되었고, 여기에서 Saccharomyces cerevisiae LEU2 유전자를 함유하는 0.4kb Hpa I-Nru I 단편은 결실되고, 게다가 Eco RI-Xba I 방향성 클로닝 부위와 측접하는 Saccharomyces cerevisiae TPI 1 프로모터와 TPI 1터미네이터를 함유하여 DNA삽입체는 Schizosaccharomyces pombe POT 1유전자(Norris et al., 상기참조.)와 동일한 방향으로 전사된다.
플라스미드 pMT-636는 여기에 그 전부가 참고로 포함된 WO 89/01968과 WO 90/10075에 기술되어 있다. 플라스미드 pMT-636은 Nco I과 Xba I으로 분해되어 9.3kb단편으로 분리된다. 또한 플라스미드 pMT-636은 Nco I과 Eco RI으로 분해되어 1.6kb 단편으로 분리된다. pMT-636 으로부터의 두 단편을 Eco RI-Xba I 단편으로 라이게이션시킨다. 정방향으로 신호서열-쿠니즈형 저해인자 도메인 단편을 함유하는 플라스미드를 S. cervisiae MT-663(a/α△tpi/△tpi pep4-3/pep4-3)내로 형질전환한다. 유일한 탄소원으로 글루코스로 성장시켜 형질전환체를 선택하고 YEPD 배지에서 배양하였다. 실시예4에 기술된 대로 형질전환체를 활성에 대해 측정한다. 쿠니즈형 억제인자를 실시예 5에 기술된 대로 정제한다.
B. SEQ ID NO: 2의 아미노산 34 내지 152로 이루어진 TFPI-2의 쿠니즈형 억제인자 도멘인의 발현.
아미노산 34번의 글루탐산으로부터 아미노산 152번의 리신까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 이루어진 TFPI-2의 쿠니즈형 억제인자 도메인을 암호화하는 DNA구조체를 올리고 뉴클레오티드 프라이머 M-216과 M-2162 (SEQ ID NO: 5와 SEQ ID NO : 11)를 사용하여 실시예1에 기술된 바와 같이 사람게놈 DNA로 부터 증폭시킨다. 생성된 PCR- 발생단편을 겔-정제하고 상기 신호서열과 연결시킨다. pTZ19R벡터내 TFPI-2 암호서열과 합성신호서열로 이루어진 플라스미드 중간물질을 사용하여 효모발현벡터의 구성을 위한 신호서열-TFPI-2 단편을 얻는다. 신호서열-TFPI-2를 암호화하는 플라스미드 중간물질로부터의 Eco RI-Xba I 단편을 상기 효모발현벡터 MT-636 내로 서브클로닝 시킨다. 정확한 삽입체를 갖는 후보 플라스미드를 상기 Saccharomyces cerevisiae 균주 MT-636 내로 형질전환 한다.
선택된 형질전환체를 실시예 4에 기술된 대로 활성에 대해 측정하였다. 쿠니즈형 저해인자를 실시예 5에 기술된대로 정제한다.
C. SEQ ID NO: 2의 아미노산 34 내지 211로 이루어진 TFPI-2의 쿠니즈형 저해인자 도메인의 발현.
아미노산 34번의 글루탐산으로부터 아미노산 211번의 알라닌까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 이루어진 TFPI-2의 쿠니즈형 저해인자 도메인을 암호화하는 DNA구조체를, 첫번째로 Bgl II와 Hind III로 플라스미드 pJ-2-11/pUC19를 분해하여 세개의 쿠니즈형 도메인을 암호화하는 528bp의 Bgl II-Hind III단편을 얻음으로써 구성된다. pJ-2-11/pUC19 로부터의 쿠니즈형 저해인자 도메인의 암호서열을 실시예 3B에 기술된 플라스미드 중간물질내 TFPI-2암호서열을 대체함으로써 합성신호서열 (SEQ ID NO: 7)에 연결한다. 플라스미드 중간물질을 Bgl II와 Xba I로 분해하여 벡터- 함유단편을 분리시킨다. 단편을 함유하는 Bgl II-Xba I 벡터를 pJ-2-11 /pUC19 로부터의 Bgl II-Hind III단편과 번역 정지코돈을 함유하는 Hind III-Xba I 링커와 라이게이션 시킨다. TFPI-2 암호서열과 적당한 방향으로 연결된 합성신호서열을 함유하는 플라스미드를 동정한다.
신호서열-TFPI-2를 암호화하는 플라스미드 중간물질로부터의 Eco RI-Xba I 단편을 상기 효모발현벡터 MT-636 내로 서브클로닝한다. 정확한 삽입체를 갖는 후보플라스미드를 상기 Saccharomyces cerevisiae 균주 MT-663 내로 형질전환 한다.
선택된 형질전환체를 실시예4에 기술된 대로 활성에 대해 측정한다. 쿠니즈형 저해인자를 실시예5에 기술된대로 정제한다.
[실시예 4]
[활성측정법]
A. 포유동물의 세포 배양물 상청액 상의 트립신 저해활성 측정법.
쿠니즈형 저해인자를 발현시키는 세포로부터의 조건배지를 트립신 저해활성에 대해 측정하였다. 각 클론에 대해, 조건배지 20-100㎕를 100mM NaCl, 50mM Tris(pH 7.4)중의 2.4㎍/㎖의 트립신(Worthington Biochemical, Freehold. NJ)을 함유하는 용액에 첨가하여 300㎕의 최종부피를 얻었다. 반응물 23℃에서 30분간 배양한후, 20㎕의 10mM 색원성 기질 S-2251(D-Val-Leu-Lys-Nan; Chromogenix, AB, Molndal, Sweden)을 0.6mM의 최종농도가 되게 가하였다. 잔류트립신 활성도를 405nm의 흡광도로 측정하였다.
B. 효모배양물 상청액상의 활성 측정법
3.2㎕의 각 소모배지 샘플을 80㎕의 측정 완충액(50mM Tris HCl, pH 7.4, 100mM NaCl, 2mM CaCl2, 0.1%w/v PEG 20,000)으로 희석시킴으로써 실시예3에 기술된 효모의 형질전환체의 배양물로부터의 소모배지상에서 트립신 저해활성을 측정한다. 희석된 상청액을 측정완충액에 희석된 80㎕의 133nM 소 트립신(Novo Nordisk A/S)에 첨가하고, 혼합물을 10분간 실온에서 배양한다. 배양후, 측정 완충액에 희석된 100㎕의 1.8mM 펩티딜 니트로아닐리드 기질 S2251(D-Val-Leu-Lys-Nan; Kabi)을 각 샘플에 첨가하고, 샘플을 30분간 기질과 함께 배양한다. 트립신 저해활성은 무색용액으로 지시된다. 어떠한 쿠니즈형 저해인자도 발현하지 않는 효모균주로부터의 상청액에 의해 황색용액으로 나타나는 대조반응을 행한다.
[실시예 5]
[쿠니즈형 저해인자의 정제]
A. 트렌스펙션된 포유동물의 세포배양 상청액으로 부터의 쿠니즈형 저해인자의 정제
다음에 상세히 기술되는 헤파린 아가로스, MONO Q, MONO S 그리고 SUPEROSE 12크로마토그래피를 순차적으로 이용하는 조건배지로부터 재조합 TFPI-2를 정제하낟. 대략 5리터의 혈청없는 조건배지를 1N NaOH로 pH 7.5로 조정하고 0.22-㎛ 필터로 여과시켰다. 2.6×35㎝헤파린 세파로스 컬럼(Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ)를 4℃에서 완충액 A(50mM Tris HCl (pH 7.5), 10%글리세롤)로 평형화시켰다. 여과된 배지를 유속 3ml/min으로 평형화된 컬럼에 적용하였다.
샘플을 가한후, 컬럼을 0.2M NaCl을 함유하는 완충액 A로 세척하였다. 트립신 (실시예4A)을 저해하는 능력으로 알 후 있는 TFPI-2 활성을 1M NaCl을 함유하는 완충액 A로 컬럼으로부터 용출하였다. 헤파린 세파로스 컬럼으로부터의 용출액을 4℃에서 25mM Tris -HCl (pH 7.5), 10% 글리세롤에 대해 투석하였다. 보유액을 실온에서 25mM Tris-HCl (pH 7.5), 10% 글리세롤로 평형이 이루어진 MONO Q (MONO Q HR 5/5; Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ) 같은 구슬모양의 친수성 수지에 가교결합된 4차 아민기를 갖는 음이온 교환기를 함유하는 5×50mm컬럼상에서 FPLC (Pharmacia Biotech Inc.) 시켰다. TFPI-2를 1㎖/ 분의 유속으로 선형 NaCl 구배 (0-0.5M NaCl)의 컬럼으로부터 용출하였다. TFPI-2분획들은 풀상태로 만들고, 25mM 시트르산 나트륨 (pH 5.0), 10% 글리세롤에 대해 투석하였다. 그다음 보유액을 실온에서 0.5ml/분의 유속으로 MONO S (MONO S HR 5/5, Pharmacia Biotech Inc.) 같은 구슬모양의 친수성 수지에 커플링된 전하를 띤 술폰기를 가진 양이온 교환기를 함유하는 5×50mm컬럼상에서 FPLC 시켰다. TFPI-2활성은 25mM 시트르산나트륨 ( pH 5.0), 10% 글리세롤로부터 25mM Tris-HCl(pH 7.5), 10% 글리세롤, 1M NaCl 까지 구배용출을 하는 MONO S 컬럼에서 용출하였다. TFPI-2활성을 함유하는 분획들을 풀상태로 만들고 한외여과로 약 1ml로 농축하였다. 농축한 샘플들을 실온에서 50mM Tris-HCl(pH 7.5), 100mM NaCl에서 실온에서 SUPEROSE 12 와 같은 1×103내지 3×105분자량의 단백질을 분리하는데 적당한 공극률을 가진 가교결합한 아가로스 겔 여과 매트릭스를 통하여 FPLC 시켰다.
TFPI-2활성을 갖는 FPLC로부터 용출한 분획들을 SDS-PAGE에 적용하고 순수한 분획들을 모아 -80℃에서 보관하였다.
B. 효모배양 상청액으로부터 쿠니즈형 저해인자들의 정제
쿠니즈형 저해인자들을 Norris et al.(상기참조: 여기에서 참고로 포함됨)이 설명한 대로 본질적으로 효모배양 상청액으로부터 정제하였다. 선택한 형질전환체들을 약 25의 OD600이 될때까지 30℃에서 약 40시간동안 10리터의 YEPD에서 성장시켰다. 배양물을 원심분리하고 상청액을 옮긴다. 정제를 위해 300ml-1000ml 앨리큇의 상청액을 pH 2.3에 맞추고, 20mM 비신, pH 8.7 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MD)으로 평형이 이루어진 S-세파라오스 (Pharmacia-LKB Biotechnology AS, Alleroed, Denmark) 8㎖를 보유하는 컬럼에 적용했다. 컬럼을 20mM 비신, pH 8.7로 광범위하게 세척을 한 후에 쿠니즈형 저해인자를 1M NaCl을 함유하는 30ml의 20mM 비신 pH 8.7로 용출하였다. 용출한 물질은 20mM NH4HCO3, pH 7.8로 평형이 이루어진 세파덱스 G-25 컬럼 (Pharmacia-LKB Biotechnology AS, Alleroed, Denmark; 2.5×30㎝) 에 적용시킴으로써 탈염시킨다. 쿠니즈형 저해인자를 20mM NH4HCO3, pH 7.8로 용출하였다. 쿠니즈형 저해인자를 20mM 비신 pH 7.8로 평형이 이루어진 Mono S 컬럼 (Pharmacia-LKB, Biotechnology AS, Alleroed, Denmark;0.5×5㎝)에서 크로마토그라피로 더 정제 및 농축하였다. 10분동안 2ml/ 분의 평형완충액으로 세척한 후에 쿠니즈형 저해인자의 구배용출은 평형완충액에서 0-0.6M NaCl로 부터 1㎖/ 분 속도로 12분간 이루어졌다.
피크 샘플들을 모아서 쿠니즈형 저해인자를 20분간 5%A (물중의 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)에서 45%B (아세토니트릴중의 0.7% TFA)까지 4ml/ 분의 구배용출로 Vydac 214 TP510 컬럼 (Mikro-lab, Aarhus, Denmark; 10×25㎝)에서 역상 HPLC를 사용하여 정제하였다.
정제한 생성물은 물에서 동결건조하여 저해인자 활성을 측정한다. 쿠니즈 저해인자활성은 Norris et al. (상기참조)가 본질적으로 설명한 방법을 사용하여 측정한다. 간단히는 여러가지 고정 농도의 쿠니즈형 저해인자를 100mM NaCl, 50mM Tris HCl, pH7.4에서 0.24㎍/㎖의 돼지트립신 (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark), 12.8CU/1사람 플라스민(Kabi, Stockholm. Sweden)이나 0.16nkat/ml사람 플라스마 칼리크레인(Kabi)의 존재에서 배양한다. 30분 배양후 잔류효소활성은 측정완충액중에서 색원성 펩티딜니트로아닐리드 트립신/ 플라스민 기질들 S2251(D-Val-Leu-Lys-Nan:Kabi)나 S2302(D-Pro-Phe-Arg-Nan:Kabi)를 0.6mM 함유하는 기질용액의 절단에 의해 측정한다. 샘플들을 30분간 배양한 후에 각 샘플의 흡광도를 405nm에서 측정한다. 플라스민이나 트립신 활성은 405nm에서 흡광도의 감소로서 측정된다. 결과들로부터 겉보기 저해상수 Ki를 계산한다.
[실시예 6]
사람트롬빈, 사람인자 XA와 사람인자 VIIA/조직인자의 복합체의 아미도분해 활성들에 대한 재조합 TFPI-2의 영향
A. 트롬빈 아미도분해 활성측정
사람트롬빈의 아미도분해 활성을 저해하는 재조합 TFPI-2의 능력은 사람 트롬빈(Pedersen et al., J. Biol. Chem. 265: 16786-16793, 1990에 의해 기술된 대로 제조함: 이것은 모두 여기에 참고로 포함된다)과 여러농도의 재조합 TFPI-2를 사용하여 비색측정법으로 결정하였다. 분석법은 마이크로티터 플레이트 포맷으로 설치되었다. 200ml의 반응물들을 마이크로리터 플레이트의 웰에서 제조하였다. 반응혼합물들은 50mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.1% BSA, 5mM CaCl2중의 다양한 농도의 재조합 TFPI-2 및 20mM사람 트롬빈을 함유하였다. 반응물들을 37℃에서 15분간 배양하였다. 배양을한후, 50㎕의 10mM 색원성 기질 S-2238(H-D-Phe-Pip-Arg-p-니트로아닐리드, Chromogenix, AB, Molndal, Sweden)을 각 웰에 가하였다. 405nm에서의 흡광도를 동역학 마이크로 플레이트 판독기(Model UVMAX, Molecular Devices)에서 결정하였다. 재조합 TFPI-2는 S-2238에 대한 사람 트롬빈의 아미도 분해활성에 아무 영향이 없다는 것을 보여주었다.
B. 사람인자 Xa 아미도분해 측정
인자 Xa의 아미도분해 활성을 저해하는 재조합 TFPI-2의 능력은 상기한 20nM 사람 트롬빈의 대신에 20nM 사람인자 Xa(Kondo, and Kisiel, Blood 70, 1947-1954, 1987에 의해 기술된 대로 제조: 이것은 모두 여기에 참고로 포함된다)를 사용하여 상기한 바와 같이 비색측정법으로 결정하였다. 사람 트롬빈 대신에 사람인자 Xa로 치환하여 상기한 바와 같이 반응물들을 준비 및 배양하였다. 배양에 이어서, 50㎕의 10mM의 색원성 기질 S-2222(벤조일-Ile-Glu-Gly-Arg-p-니트로아닐리드, Chromogenix, AB, Molndal, Sweden)을 각 웰에 가하였다. 405nm에서의 흡광도를 동역학 마이크로플레이트 판독기 (Model UVMAX, Molecualr Devices)에서 결정하였다. 재조합 TFPI-2는 투여량에 의존하는 방식으로 색원성 기질 S-2222에 대한 20nM 인자 Xa의 아미도분해 활성을 약하게 저해한다는 것을 나타내었다.
C. 사람인자 VIIa/조직인자 아미도분해 측정
인자 VIIa/조직인자 복합체의 아미도분해 활성을 저해하는 재조합 TFPI-2의 능력은 상기한 20nM 사람 트롬빈의 대신에 고돈 베하르(Gordon Vehar, Genentech Inc., South San Francisco, CA)에 의해 제공된 219-아미노산, 세포의 도메인(TF1-219)로 구성되는 70nM 재조합의 끝이잘린 사람 조직인자 아포프로테인(Paborsky et al., J. Biol. Chem. 266: 21911-21916, 1991에 의해 기술된 대로 제조: 이것은 모두 여기에 참고로 포함된다)과 피터 윌드구스(Peter Wildgoose, Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark)에 의해 제공된 20nM 재조합 사람인자 VIIa(Pedersen et al., Biochemistry 28: 9331-9336, 1989에 의해 기술된 대로 제조; 이것은 모두 여기에 참고로 포함된다.)를 사용하여 비색측정법으로 결정하였다. 사람 트롬빈 대신에 사람인자 VIIa와 TF1-219로 치환하여 상기한 바와 같이 측정을 준비하고 배양하였다. 배양에 이어서 50㎕의 10mM 10mM 색원성기질 S-2288(H-D-Ile-Pro-Arg-p-니트로아닐리드, Chromogenix, AB)을 각 웰에 기하였다. 405nm에서의 흡광도를 동역학 마이크로 플레이트 판독기 (Model UVMAX, Molecular Devices)에서 결정하였다. 재조합체 TFPI-2는 투여량에 의존하는 방식으로 색원성 기질 S-2288에 대한 20nM 인자 VIIa-조직인자의 아미도분해 활성을 저해한다는 것을 보여주었다.
[실시예 7]
아미노산 서열분석
자동적인 아미노산 서열결정은 온라인 페닐티오히단토인 분석기가 장착된 가스증기 서열화기(Beckman Instruments; Model LF 3000등)에서 시행하였다. 페닐티오히단토인 피크들을 서열화기의 시스템 골드 소프트웨어를 사용하여 적분하였다. 약 100피코몰의 단백질이 서열분석에 적용되었다. 하나의 재조합체 TFPI-2 제제의 아미노 말단 아미노산 서열분석은 주서열(~70%)의 Asp-Ala-Ala-Gln-Glu-Pro-Thr-Gly-Asn-Asn-(SEQ ID NO : 12)와 부서열(~30%)의 Ala-Gln-Glu-Pro-Thr-Gly-Asn-Asn-(SEQ ID NO : 13)를 나타내었고 시그날 펩티다제에 의해 교대로 있는 절단부위나 정제동안에 엑소펩티다제에 의한 가능한 아미노-말단 분해를 설명한다. 전술한 바로부터 발명의 특정 구체예를 여기에 예시의 목적으로 설명하였지만, 발명의 사상과 범위를 벗어나지 않는 한도에서 여러가지의 수정을 할 수도 있음이 인정될 것이다. 따라서 본 발명은 첨부된 청구범위로서 이외에는 제한되지 않는다.
[서열목록]
(1) 일반 정보
(2) SEQ ID NO : 1에 대한 정보
(2) SEQ ID NO : 2에 대한 정보
(2) SEQ ID NO : 3에 대한 정보
(2) SEQ ID NO : 4에 대한 정보
(2)SEQ ID NO : 5에 대한 정보
(2) SEQ ID NO : 6에 대한 정보
(2) SEQ ID NO : 7에 대한 정보
(2) SEQ ID NO : 8에 대한 정보
(2) SEQ ID NO : 9에 대한 정보
(2) SEQ ID NO : 10에 대한 정보
(2) SEQ ID NO : 11에 대한 정보
(2) SEQ ID NO : 12에 대한 정보
(2) SEQ ID NO :13에 대한 정보
(2) SEQ ID NO : 14에 대한 정보
(2) SEQ ID NO : 15에 대한 정보

Claims (20)

  1. 사람 쿠니즈형 저해인자를 암호화하는 DNA 절편으로 이루어지는 분리된 DNA 분자에 있어서, 상기 쿠니즈형 저해인자는 각 Xaa가 개별적으로 시스테인을 제외한 어떤 아미노산도 되는 SEQ ID NO : 15의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 DNA분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 DNA절편은 아미노산 번호 1의 메티오닌으로부터 아미노산 번호 235의 페닐알라닌까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열; 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호 89의 이소루신까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열; 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호 152의 리신까지 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 또는 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호 211의 알라닌까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 DNA분자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 DNA 절편은 1 내지 165의 SEQ ID NO : 14의 뉴클레오티드 서열로 이루어지며, 각 뉴클레오티드 트리플렛 1 내지 3, 4 내지 6, 160 내지 162 및 163 내지 165는 개별적으로 시스테인을 제외한 어떤 아미노산도 암호화하는 것을 특징으로 하는 분리된 DNA분자.
  4. 제3항에 있어서, 상기 DNA 절편은 뉴클레오티드 39로부터 뉴클레오티드 743까지의 SEQ ID NO : 1의 뉴클레오티드 서열, 뉴클레오티드 138로부터 뉴클레오티드 305까지의 SEQ ID NO : 1의 뉴클레오티드 서열, 뉴클레오티드 138로부터 뉴클레오티드 493까지의 SEQ ID NO : 1의 뉴클레오티드 서열 또는 뉴클레오티드 138로부터 뉴클레오티드 671까지의 SEQ ID NO : 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 DNA분자.
  5. 전사 프로모터; 각 Xaa가 개별적으로 시스테인을 제외한 어떤 아미노산도 되는 SEQ ID NO : 15의 아미노산 서열로 이루어지는 사람 쿠니즈형 저해인자를 암호화하는 제1 DNA 절편; 및 전사 테미네이터로 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 DNA구조체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 제1 DNA절편은 아미노산 번호 1의 메티오닌으로부터 아미노산 번호 235의 페닐알라닌까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열; 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호 89의 이소루신까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열; 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호 152의 리신까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 또는 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호의 211의 알라닌까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 DNA구조체.
  7. 제5항에 있어서, 상기 제1 DNA 절편은 1 내지 165의 SEQ ID NO : 14의 뉴클레오티드 서열로 이루어지며, 각 뉴클레오티드 트리플렛 1 내지 3, 4 내지 6, 160 내지 162 및 163 내지 165는 개별적으로 시스테인을 제외한 어떤 아미노산도 암호화하는 것을 특징으로 하는 분리된 DNA구조체.
  8. 제5항에 있어서, 상기 제1 DNA절편은 뉴클레오티드 39로부터 뉴클레오티드 743까지의 SEQ ID NO : 1의 뉴클레오티드 서열, 뉴클레오티드 138로부터 뉴클레오티드 305까지의 SEQ ID NO : 1의 뉴클레오티드 서열, 뉴클레오티드 138로부터 뉴클레오티드 493까지의 SEQ ID NO : 1의 뉴클레오티드 서열 또는 뉴클레오티드 138로부터 뉴클레오티드 671까지의 또는 SEQ ID NO : 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 DNA구조체.
  9. 전사 프로모터; 제1 DNA 절편의 발현에 요구되는 추가적 DNA 절편들에 작동가능하게 연결된, 각 Xaa가 개별적으로 시스테인을 제외한 어떤 아미노산도 되는 SEQ ID NO : 15의 아미노산 서열로 이루어지는 사람 쿠니즈형 저해인자를 암호화하는 제1 DNA 절편; 및 전사 테미네이터로 이루어지는 DNA 구조체를 함유하는 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  10. 제9항에 있어서, 상기 제1 DNA절편은 아미노산 번호 1의 메티오닌으로부터 아미노산 번호 235의 페닐알라닌까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열; 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호 89의 이소루신까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열; 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호 152의 리신까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 또는 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호의 211의 알라닌까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  11. 제9항에 있어서, 상기 제1 DNA 절편은 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 165의 SEQ ID NO : 14의 뉴클레오티드 서열로 이루어지며, 여기서 각 뉴클레오티드 트리플렛 1 내지 3, 4 내지 6, 160 내지 162 및 163 내지 165는 개별적으로 시스테인을 제외한 어떤 아미노산도 암호화하는 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  12. 제9항에 있어서, 상기 제1 DNA절편은 뉴클레오티드 39로부터 뉴클레오티드 743까지의 SEQ ID NO : 1의 뉴클레오티드 서열, 뉴클레오티드 138로부터 뉴클레오티드 305까지의 SEQ ID NO : 1의 뉴클레오티드 서열, 뉴클레오티드 138로부터 뉴클레오티드 493까지의 SEQ ID NO : 1의 뉴클레오티드 서열 또는 뉴클레오티드 138로부터 뉴클레오티드 671까지의 SEQ ID NO : 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  13. 사람 쿠니즈형 저해인자의 제조방법으로서, 제1 DNA절편의 발현에 요구되는 추가적 DNA절편들에 작동가능하게 연결된, 각 Xaa가 개별적으로 시스테인을 제외한 어떤 아미노산도 되는 SEQ ID NO : 15의 아미노산 서열로 이루어지는 사람 쿠니즈형 저해인자를 암호화하는 제1 DNA 절편으로 이루어지는 DNA구조체를 함유하는 숙주세포를 배양하는 단계와, 상기 쿠니즈형 저해인자를 분리하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 제1 DNA절편은 아미노산 번호 1의 메티오닌으로부터 아미노산 번호 235의 페닐알라닌까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열; 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호 89의 이소루신까지의 SEQ ID NO : 2의 아미노산 서열; 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호 152의 리신까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 또는 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호의 211의 알라닌까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 사람 쿠니즈형 저해인자의 제조방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 제1 DNA 절편은 뉴클레오티드 1내지 뉴클레오티드 165의 SEQ ID NO : 14의 뉴클레오티드 서열로 이루어지며, 여기서 각 뉴클레오티드 트리플렛 1 내지 3, 4 내지 6, 160 내지 162 및 163 내지 165는 개별적으로 시스테인을 제외한 어떤 아미노산도 암호화하는 것을 특징으로 하는 사람 쿠니즈형 저해인자의 제조방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 제1 DNA절편은 뉴클레오티드 39로부터 뉴클레오티드 743까지의 SEQ ID NO : 1의 뉴클레오티드 서열, 뉴클레오티드 138로부터 뉴클레오티드 305까지의 SEQ ID NO : 1의 뉴클레오티드 서열, 뉴클레오티드 138로부터 뉴클레오티드 493까지의 SEQ ID NO : 1의 뉴클레오티드 서열 또는 뉴클레오티드 138로부터 뉴클레오티드 671까지의 SEQ ID NO : 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 사람 쿠니즈형 저해인자의 제조방법.
  17. 각 Xaa가 개별적으로 시스테인을 제외한 어떤 아미노산도 되는 SEQ ID NO : 15의 아미노산 서열로 이루어지는 아미노말단과 카르복시말단을 갖는 분리된 사람 쿠니즈형 저해인자.
  18. 제17항에 있어서, 상기 저해인자는 아미노산 번호 1의 메티오닌으로부터 아미노산 번호 235의 페닐알라닌까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열; 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호 89의 이소루신까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열; 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호 152의 리신까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 또는 아미노산 번호 34의 글루탐산으로부터 아미노산 번호의 211의 알라닌까지의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 사람 쿠니즈형 저해인자.
  19. 제17항에 있어서, 상기 저해인자는 그것의 아미노말단에서 SEQ ID NO : 12 또는 SEQ ID NO : 13의 아미노산 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 사람 쿠니즈형 저해인자.
  20. 플라스미드 J-2-11/pUC 19를 함유하는 E. coli 숙주세포(ATCC 수탁번호 69425).
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