JPH09504696A

JPH09504696A - ヒトＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害物質

Info

Publication number: JPH09504696A
Application number: JP7513390A
Authority: JP
Inventors: エー．スプレッチャー，シンディー; カイジール，ウォルト; シー．フォスター，ドナルド
Original assignee: ザイモジェネティクス，インコーポレイティド; ユニバーシティオブニューメキシコ
Priority date: 1993-11-05
Filing date: 1994-11-02
Publication date: 1997-05-13
Anticipated expiration: 2016-08-20
Also published as: US5728674A; US5914315A; CN1139955A; KR960705850A; FI961886A0; EP0726953B1; FI961886A; US20020098560A1; US5455338A; US20050004021A1; WO1995012674A1; CA2175797A1; US7541449B2; AU8131294A; AU685190B2; ATE262587T1; DE69433647D1; JP3201527B2; CN1073159C; US6656746B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、新しいKuzitz型阻害物質をコードするDNA セグメントを含む分離されたDNA 分子を提供する。同様に提供されているのは、第１のDNA セグメントがその発現のために必要とされる付加的なDNA セグメントに作動的に連鎖されている、新しいヒトKunitz型阻害物質をコードする第１のDNA セグメントを含むDNA構成体、ならびにかかるDNA 構成体を収容する宿主細胞及び宿主細胞からタンパク質を産生するための方法、である。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトKunitz型プロテアーゼ阻害物質発明の背景血液凝固は、場合によってフイブリン凝塊を発生させるさまざまな血液成分又は因子の複雑な相互作用から成るプロセスである。一般に、凝固「カスケード」と呼ばれてきたものに参与する血液成分は、それ自体活性化された凝固因子である活性化体の作用によりタンパク質分解酵素に変換される酵素的に不活性なタンパク質であるプロ酵素又はチモーゲンである。このような変換を受けた凝固因子は一般に「活性因子」と呼ばれ、小文字の後記「ａ」の付加により表わされる（例えばIIIａ因子）。２つの糸が血液凝固を促進し、かくして正常な止血作用に参与する。これらの糸は、「内因性」及び「外因性」凝固経路と呼ばれてきた。現在、内因性経路は、フイブリン形成の成長と維持において一つの役目を果たし、「外因性」経路は、フイブリン形成の開始にとって極めて重要である重複するメカニズムであると考えられている。第Ｘ因子から第Ｘａ因子への活性化において経路は収束し、「共通」の経路を通ってフイブリン形成まで進む。血管損傷の後、組織因子は、第 VII因子から第VIIａ因子への変換を容易にするようカルシウム依存型の要領で第 VII因子と複合することによって「外因性」凝集経路を開始する。第VIIａ因子− 組織因子複合体は直接第Ｘ因子をＸａへと活性化させることができる。内因性経路は、「内因性」凝固カスケードの開始にとって必要とされる酵素である第ＸＩａ因子を生成するべく第ＸＩ因子を分割する第ＸIIａ因子又はトロンビンの生成によって活性化され得る。「外因性」経路を介してのフイブリン形成は、第Ｘａ因子依存型の要領で経路を調節する組織因子経路阻害物質タンパク質（TEPI）の存在により制御される。多価のKunitz型阻害物質であるTEPIは、第Ｘａ因子、組織因子及び第VIIａ因子との四元性複合体を形成し、かくして遊離第Ｘａ因子及び第IIａ因子の形成を阻害することによって、外因性経路を調節すると考えられている（Broza et al.，Biochemistry 29;7539-7546，1990; これは本書にその全体が参考として内含されている）。いくつかの例、例えば腎臓透析、深静脈血栓症及び播種性血管内凝固(DIC)においては、ヘパリン、クマリン、クマリン誘導体、インダンジオン誘導体といった抗凝固剤又はその他の作用物質を使用することによって、凝固カスケードを遮断することが必要である。例えば、透析において、処置中の凝固を防ぐために、ヘパリン処理又はクエン酸塩イオンでの体外処置（米国特許4500,309号）を使用することができる。ヘパリンは同様に、外科手術を受けている患者における深静脈血栓症を防止するのにも使用される。しかしながら、低用量のヘパリンでの治療は、重大な出血をひき起こす可能性がある。その上、ヘパリンは約80分の半減期をもつことから、血液から急速に消失する。ヘパリンは抗トロンビンIII（ATI II）のための補因子として作用し、抗トロンビンIIIは、DIC 処理において急速に枯渇することから、適正なヘパリン用量を維持することは往々にして困難であり、ATIII及びヘパリンのレベルを連続的に監視することが必要になる。ATIII枯渇が極限になると、ヘパリンも有効でなくなる。さらに、ヘパリンの長期使用は、血小板凝集を増大させ、血小板計数を減少させる可能性があり、又骨粗鬆症の進行に関与してきた。インダンジオン誘導体も、有害な副作用をもつ可能性がある。以上で簡単に説明した抗凝固剤に加えて、抗凝固活性をもつものと主張されているさまざまな組成物が、当該技術分野の範囲内で開示されている。このような組成物の１つは、ヒトのさい帯動脈から 32000ダルトンのポリペプチドを分離したReutelings perger et al.,(Eur．J．Biochem．151：625-629，1 985)によって開示されている。もう１つの組成物はWarn-Cramer et al．(Circul ation Suppl.第２部、74：2-408ii，抄録#1630，1986)により開示されている。彼らは、血漿中の 34500の見かけの分子量をもつ第VIIａ因子阻害物質を検出した。タンパク質阻害物質は、ファミリーメンバー間の広範な配列相同性及びジスルフィド架橋の保存に基づいて一連のファミリーへと分類される（再考のためには、Laskowski and Koto，Annu．Rev．Biochem．49：593-626，1980を参照のこと）。Kunitzファミリーのセリンプロテアーゼ阻害物質が、アプロチニン（ウシ膵臓トリプシン阻害物質）とのその相同性によって特徴づけられる。アプロチニンは、トリプシン、キモトリプシン、プラスミン及びカリクレインを含むさまざまなセリンプロテアーゼを阻害するものとして知られている。Kunitz型阻害物質のドメインが、インター−α−トリプシン阻害物質(Hochstrasser et al.，Hoppe- Seylers．Z．Physial．Chem．357 ：1659-1661，1969 及びTschesche et al.，Eu r．J．Biochem．16 ：187-198，1970)，ρ−アミロロイドタンパク質前駆物質及びα₃−コラーゲンVI型(Chu et al.，EMBO.J. 9 ：385-393，1990)といったさらに大きいタンパク質において報告されてきた。TEPI（外因性経路阻害物質(EPI )又はリポタンパク質関連凝固阻害物質（LACI）としても知られている）は、負の電荷をもつアミノ酸末端を正の電荷をもつカルボキシル末端によってフランキングされた３つの縦列Kunitz型阻害物質から成る血漿プロテアーゼ阻害物質である。第１及び第２のKunitz型ドメインはそれぞれ第VIIａ因子及び第Ｘａ因子の活性を阻害することが示されてきた。当該技術分野においては、従来の抗凝固剤組成物に付随する望ましくない副作用を生成しない、抗凝固活性をもつ改良型組成物に対するニーズがなおも存在している。本発明はこのニーズを満たし、さらにその他の関連する利点を提供する。従って、本発明の目的は、深静脈血栓症及びDIC の治療において及び抗凝血剤として使用するための類似の阻害物質プロフィールをもつ阻害物質のKunitzファミリーの新しいプロテアーゼ阻害物質を提供することにある。発明の要約簡略に述べると、本発明は、Kunitz型阻害物質をコードするDNA セグメントを含む DNA分子において、このDNA セグメントが１〜165の配列番号14のヌクレオチド配列を含み、各々のヌクレオチドトリプレット１〜３，４〜６，160 〜162 及び163 〜165 が個々にシステイン以外のいずれかのアミノ酸をコードするDNA 分子を提供している。本発明の１態様においては、Kunitz型阻害物質は、ヌクレオチド138 からヌクレオチド305 までの配列番号１のヌクレオチド配列を含んでいる。発明のもう１つの態様においては、Kunitz型阻害物質はヌクレオチド39からヌクレオチド743 までの配列番号１のヌクレオチド配列を含んでいる。もう１つの態様においては、Kunitz型阻害物質は、ヌクレオチド138 〜ヌクレオチド49 3 までの配列番号１のヌクレオチド配列を含んでいる。発明のさらにもう１つの態様においては、Kunitz型阻害物質は、ヌクレオチド138 からヌクレオチド671 までの配列番号１のヌクレオチド配列を含んでいる。発明の１つの態様においては、DNA セグメントは、各Ｘａａが個々にシステイン以外のいずれかのアミノ酸である配列番号15のアミノ酸配列を含むKunitz型阻害物質をコードする。本発明の１つの態様においては、DNA セグメントは、グルタミン酸、アミノ酸番号34からイソロイシン、アミノ酸番号89までの配列番号２のアミノ酸配列を含むKunitz型阻害物質をコードする。発明のもう１つの態様においては、DNA セグメントは、Met、アミノ酸１からP he 、アミノ酸番号235 までの配列番号２のアミノ酸配列を含むKunitz型阻害物質をコードする。本発明のもう１つの態様においては、DNA セグメントは、グルタミン酸、アミノ酸番号34からリシン、アミノ酸152 までの配列番号２のアミノ酸配列を含むKunitz型阻害物質をコードする。本発明のさらにもう１つの実施態様においては、DNA セグメントは、グルタミン酸、アミノ酸番号34からアラニン、アミノ酸番号211 までの配列番号２のアミノ酸配列を含むKunitz型阻害物質をコードする。本発明は同様に、第１のDNA セグメントの発現にとって必要な付加的なDNA セグメントに対し作動的に連鎖されたヒトKunitz型阻害物質をコードする第１のDN A セグメントを含むDNA 構成体、かかる構成体を収容する宿主細胞、ならびに宿主細胞を培養し前記Kunitz型阻害物質を分離する段階を含むヒトKunitz型阻害物質を産生するための方法をも提供する。本発明のもう１つの態様においては、分離されたKunitz型阻害物質が提供されている。もう１つの実施態様では、分離されたヒトKunitz型阻害物質は、各Ｘａａが個々にシステイン以外のいずれかのアミノ酸である配列番号15のアミノ酸配列を含んでいる。発明の１つの態様では、Kunitz型阻害物質は、Met 、アミノ酸１からPhe 、アミノ酸番号235 までの配列番号２のアミノ酸配列；グルタミン酸、アミノ酸番号34からイソロイシン、アミノ酸番号89までの配列番号２のアミノ酸配列；グルタミン酸、アミノ酸番号34からリシン、アミノ酸番号152 までの配列番号２のアミノ酸配列又はグルタミン酸、アミノ酸番号34からアラニン、アミノ酸番号211 までの配列番号２のアミノ酸配列を含む。本発明のもう１つの態様においては、Kunitz型阻害物質はさらに、配列番号12 又は配列番号13のアミノ酸配列をそのアミノ末端に含んでいる。本発明のもう１つの態様においては、ヒトKunitz型阻害物質に特異的に結合する分離された抗体が提供されている。１つの実施態様においては、抗体はモノクローナル抗体である。本発明のさらにもう１つの態様においては、各Ｘaaが個々にシステイン以外のいずれかのアミノ酸である配列番号15のアミノ酸配列を含む薬学組成物が提供されている。発明の一態様においては、薬学組成物は、Met 、アミノ酸１からPhe 、アミノ酸番号235 までの配列番号２のアミノ酸配列；グルタミン酸、アミノ酸番号34からイソロイシン、アミノ酸番号89までの配列番号２のアミノ酸配列；グルタミン酸、アミノ酸番号34からリシン、アミノ酸番号152 までの配列番号２のアミノ酸配列又は、グルタミン酸、アミノ酸番号34からアラニン、アミノ酸番号 211 までの配列番号２のアミノ酸配列を含むヒトKunitz型阻害物質を含む。発明のさらにもう１つの態様においては、各Ｘaaが個々にシステイン以外のいずれかのアミノ酸である配列番号15のアミノ酸配列を含むヒトKunitz阻害物質を、血液凝固を阻害するのに充分な量で投与することを含んで成る、哺乳動物の体内での血液凝固を阻害する方法が開示されている。発明のもう１つの態様においては、メチオニン、アミノ酸１からフェニルアラニン、アミノ酸番号235 までの配列番号２のアミノ酸配列；グルタミン酸、アミノ酸番号34からイソロイシン、アミノ酸番号89までの配列番号２のアミノ酸配列；グルタミン酸、アミノ酸番号 34からリシン、アミノ酸152 までの配列番号２のアミノ酸配列又はグルタミン酸、アミノ酸番号34からアラニン、アミノ酸番号211 までの配列番号２のアミノ酸配列を含むKunitz型阻害物質が、血液凝固を阻害するのに充分な量で投与される、哺乳動物の体内での血液凝固の阻害方法が開示されている。本発明のさらにもう１つの態様においては、配列番号12又は配列番号13のアミノ酸配列をさらに含むKunitz型阻害物質が、血液凝固を阻害するのに充分な量で投与される、哺乳動物の体内での血液凝固の阻害方法が開示されている。発明のもう１つの態様では、配列番号１のヌクレオチド配列、配列番号１のヌクレオチド変異体又は配列番号１又はその変異体に対し相捕的なDNA 配列をコードするDNA セグメントを含むKunitz型阻害物質ドメインをコードする核酸とハイブリッド形成できる、少なくとも12のヌクレオチドから成るプローブが提供されている。これらの態様及びその他の態様は、以下の詳細な説明を参照することによって明白になることだろう。発明の詳細な説明本発明は、新しいヒトKunitz型阻害物質を提供する。本発明の阻害物質の１つの利点は、それらが第Ｘａ因子の不在下で第VIIａ因子を阻害し、かくして内因性又は外因性経路を介しての第Ｘａ因子の産生を必要としないこと、にある。より特定的には、本発明は、組織因子経路阻害物質（TFPI）とアミノ酸配列相同性及び全体的ドメイン組織を共有する、これまでに知られていない新規のKunitz型阻害物質を提供する。この新しいKunitz型阻害物質は、TFPI−２と呼ばれてきた。本発明の特長の中には、新しいヒトKunitz型阻害物質をコードする分離された DNA 分子がある。このような分離された分子は、その天然の環境から分離されcDNA及びゲノミッククローンを内含するものである。本発明の分離されたDNA 分子は、それらに天然に付随しているその他の遺伝子の無い状態で提供され、プロモーター及びターミネーターといった調節領域を表わす自然に発生する５′及び３′の未翻訳配列を含んでいる可能性がある。自然に発生する５′及び３′の未翻訳領域内の調節領域の同定は、当業者にとって明白なことであろう（再考のためには、本書に参考として内含されている、Dynan及びT ijan，Nature 316：774-778，1985 ； Birnstiel et al.，Cell 41：349〜359 ，1985; Proudfoot，Trends in Biochem，Sci，14:105-110，1989; 及びSam-bro ok et al.，分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、Cold Spring Harbo r，NY，1989；を参照のこと）。本発明の分離されたDNA 分子は、組換え型ヒトKunitz型阻害物質を産生する上で有用である。従って、本発明は、当該技術分野において既知の方法を用いて直ちに精製することのできるヒトKunitz型阻害物質を大量に産生するという利点を提供する。（一般に、Scopes、タンパク質精製、Springer-Verlag，NY，1982、を参照のこと）。代替的には、本発明のタンパク質は、Barany及びMerri Field( 「ペプチド、その分析、合成、生物学」第２巻中、Gross及びMeienhufer、編集 Academic Press，NY，p１〜284，1980)の方法といったような固相合成によって、又は部分的固相技術、フラグメント縮合又は古典的溶液付加によってといった従来の合成方法を用いて合成することができる。従って、本発明のもう１つの特長は、分離されたヒトKunitz型阻害物質である。本発明の分離されたタンパク質及びペプチドは、少なくとも約50％の均質性、より好ましくは70％〜80％の均質性をもつタンパク質であり、特に製薬的用途のためには、95〜99％以上の均質性をもつタンパク質調製物が最も好まれる。 Kunitz型阻害物質の活性は、基本的にNorris et al．(Biol，Chem，Hoppe-Sey ler 371 ：37-42，1990)によって記述されている方法を用いて測定することができる。簡単に言うと、25℃で100mM のNaCl，50mMのトリスHCl，0.01％のTWEEN 80（ポリオキシエチレンソルビタン；モノオレエート）（pH7.4）中で0.24μｇ／mlのブタトリプシン（Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark），12.8CU/ｌのヒトプラスミン(Kabi，Stockholm，Sweden)又は0.16nkat／mlのヒト血漿カリクレイン（Kabi）の存在下で、さまざまな定まった濃度のKunitz型阻害物質をインキュベートする。30分のインキュベーションの後、検定緩衝液中に0.6mMの色素産生ペプチジンニトロアニリドトリプシン／プラスミン基質Ｓ2251（D-Val-Le u-Lys-Nan：Kabi）又はＳ2302（D-Pro-Phe-Arg-Nan：Kabi）を含む溶液の分割によって、残留酵素活性を測定する。標本を30分間インキュベートさせ、その後各標本のの吸収率を405nm で測定する。405nm での吸収率の減少又は460nm での蛍光Emの減少として、酵素活性の阻害を測定する。結果から、見かけの阻害定数Ki を計算する。本発明のKunitz型阻害物質は、なかんづく深静脈血栓症、播種性血管内凝固、肺塞栓症の治療のため及び外科手術後の血栓症の予防のため、開示された方法において使用できる。本発明は、配列番号14、配列番号１又はその一部分のヌクレオチド配列を含む DNA 配列によってコードされ、及び／又は配列番号15、配列番号２又はその一部に開示されているアミノ酸配列を含む新しいヒトKunitz型阻害物質に関する。TF PI−２のアミノ酸配列、配列番号２をその他のKunitz型阻害物質、より特定的にはTFPIと比較すると、タンパク質が３つの推定上のKunitz型阻害物質を内含していることがわかった。当業者にとっては明らかであるように、各々の個別ドメイン又はこれらのドメインの組合せを、本発明において使用する目的で合成的に又は組換え型DNA 技術によって調製することができる。推定上のKuni tz型阻害物質ドメインは、システイン、、アミノ酸番号36からシステイン、アミノ酸番号86まで；システイン、アミノ酸番号96からシステイン、アミノ酸番号14 9 まで；及びシステイン、アミノ酸158 からシステイン、アミノ酸208 までの配列番号２に示されたアミノ酸配列を含む。より特定的には、本発明のKunitz型阻害物質は、システイン、アミノ酸番号36からシステイン、アミノ酸番号86までの配列番号２のアミノ酸配列を含んでいる。Kunitzドメインは、ジスルフィド結合を形成するものと信じられている。６つの特異的に置かれたシステイン残基の場所によって規定される（Laskowski及びKato、同書、及びBroze et al.，Biochem istry （生化学）29：7539-7546，1990を参照のこと）。第１及び第６のシステイン残基が各Kunitzドメインの境界を規定する。従ってTFPI−２の場合、Kunitzドメインは、残基36及び89，96及び149，158及び208(配列番号２に従って番号付け )により制限されている。適切なジスルフィド結合形成及びタンパク質コンホーメーションを提供するためには、Kunitzドメインを規定するシステイン残基の各々にフランキングする少なくとも２つのアミノ酸残基を内含していることが望ましい。しかしながら、これらのフランキング残基の同一性は、重要ではない。かくして、ポリペプチドコアがそのアミノ又はカルボキシル末端上でシステイン残基以外の２〜４個又はそれ以上のアミノ酸残基によってフランキングさている、上述の「コア」Kunitz配列を含む個々のKunitzドメインの変異体を調製することが可能である。さらに、当業者にとっては明らかとなるように、Kunitz型阻害物質のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端の延長部分を合成的に又は組換え型 DNA 技術を用いて調製でき、阻害物質活性についてテストすることができる。本発明のタンパク質をコードするDNA 配列は、阻害物質コーディング配列の一部に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブを用いた、関係はあるものの全く異なるKunitz型阻害物質のゲノミッククローンに対応するcDNAについてのスクリーニングの間に、予想外に同定された。cDNAクローンの分析により、TF PI−２という呼称で、これまで未知の唯一のKunitz型阻害物質をコードしたクローンが明らかになった。本発明のタンパク質は、本書に開示されているDNA 配列に実質的に類似したものであるDNA 配列によってコードされ得る。本発明の中で使用する「実質的に類似した」DNA 配列というのは保存的アミノ酸置換及び／又はアミノ酸のわずかな付加、置換又は欠失を含むTFPI−２遺伝子の対立遺伝子変異体及び遺伝子的に工学処理された又は合成の変異体をも包含するものである。 DNA 配列変異体は同様に、宿主選好コドンがヒト配列内の類似コドンに置換させられているDNA コード内の縮重をも包含する。さらに、実質的に類似のDNA 配列というのは、高い又は低い緊縮性の下で本発明のDNA 配列にハイブリッド形成することのできるDNA 配列（Sambrook et al，同書、参照）及び、例えば本発明のアミノ酸配列にへと、遺伝子コードの結果として縮重したものであるDNA 配列である。遺伝子的に工学処理された変異体は、オリゴヌクレオチドで誘導された部位特異的突然変異誘発を用いて、又は制限エンドヌクレアーゼ消化及びアダプター連結を用いて、又は文献中に充分に立証されたその他の方法（例えばSambrook et al.，同書及びSmithet al.，遺伝子工学：その原理と方法、Plenum Press 1 981;本書に参考として内含、を参照のこと）を用いて得ることができる。本発明のDNA 分子は、Maniatis et al.（本書に参考として内含されている「分子クローニング：実験室マニュアル」Cold Spring Ha rbor，NY，1982)，Sambrook et al.（本書に参考として内含されている「分子クローニング：実験室マニュアル、第２版」Cold Spring Harbor，NY，1989）又は Mullis et al.（本書に参考として内含されている米国特許第4,683,195号）によって記述されているもののような標準的クローニング方法を用いて分離することができる。代替的には、本発明のコーディング配列は、自動DNA 合成装置上での合成によってといったような当該技術分野において周知のものである標準的技術を用いて合成することができる。以下でより詳細に論述する通り、新しいこれまで未知であったヒトKunitz型阻害物質が1.0kb のcDNAインサートとして同定されており、これには配列番号１のDNA 配列が含まれている。本発明の１実施態様においては、本発明のKunitz型阻害物質をコードするDNA 配列が、配列番号１又はその補体から設計されたプライマを用いたPCR 増幅によって得られる。 TFPI−２をコードするDNA 分子は同様に、本書で開示するDNA 配列及び方法を用いて、胎盤、肝臓又はへその静脈細胞cDNA又はゲノミックライブラリーをスクリーニングすることによって、イヌ、ウサギ、トリ、ブタ、マウス、ラット及びウシといったヒト以外の動物からも得ることができる。本発明のDNA 分子又はその一部分は、例えば細胞内で直接TFPI−２配列を検出するためのプローブとして使用することができる。このようなDNA 分子は一般に合成オリゴヌクレオチドであるが、クローニングされたcDNA又はゲノミック配列から生成することができ、一般に少なくとも12個のヌクレオチド、より頻繁には約14個から約25個以上までのヌクレオチド、時として40〜60個のヌクレオチドを含み、場合によっては実質的部分さらには全部のTFPI−２遺伝子又はcDNAを含むことになる。本発明の合成オリゴヌクレオチドは、対応するTFPI−2 DNA 配列（配列番号１）又はその補体に対し少なくとも85％の同一性を有する。プローブとして使用するためには、分子は、当該技術分野において既知の方法に従って、例えば酵素、ヒオチン、放射性核種、蛍光体、化学発光体、常磁性粒子を用いて、検出可能なシグナルを提供するべく標識づけされる。本発明のプローブは、塞栓障害といった細胞代謝疾患を検出するため診断方法において使用することができる。本発明において使用されるDNA 分子は、標識づけが可能であり、サザン又はドットブロットに類似したバイブリダイゼーション手順において使用できる。当業者には理解できるように、本発明のDNA 分子がTFPI−２配列に対しハイブリッド形成できるようにする条件は、当該技術分野において周知の方法によって決定することができ、例えばSambrook et al.(本書に参考として内含されている「分子クローニング：実験室マニュアル」、第２版、Cold Spring Harbor，NY，1989) によって再考されている。当業者であれば、文献中の周知の方法（例えば、Samb rook et al.，同書ｐ11.45 〜11.53 を参照）によるさまざまな手順の中で用いるのに適するように、DNA分子のハイブリダイゼーション条件（すなわちハイブリダイゼーションの緊縮性）を変動させることができるだろう。ハイブリダイゼーションの緊縮性が高くなればなるほど、検出されるミス対合配列の数は少なくなる。代替的には、緊縮性が低くなると、関連する配列を同定することが可能となる。代替的には、DNA 配列を増幅するべく本発明のDNA 配列及び例えばポリメラーゼ連鎖及び(PCR)（Saiki et al.，Science 239 ；487，1987; Mullis et al.，米国特許4,686,195号；及びMullis et al.，米国特許4,683,202号により開示）を用いて、TFPI−２タンパク質配列変異体を同定することができ、これらのDNA 配列は次にアガロースゲル上でその特徴的サイズによって検出されるか、或いは又配列の異常を検出するべく配列決定されてもよい。本発明のKunitz型阻害物質をコードするDNA 分子は、DNA 構成体へと挿入することができる。本発明において使用されている、発現ベクターとしても知られる DNA 構成体は、その他の形では天然に存在しないような要領で組合せされ並置された１本鎖又は２本鎖のいずれかのDNA 分子又はかかる分子のクローンのことを意味するものとして理解される。本発明のDNA 構成体は、第１のDNA セグメントの発現に必要とされる付加的なDNA セグメントに作動的に連鎖された、Kunitz型阻害物質をコードする第１のDNA セグメントを含んで成る。本発明において、付加的なDNA セグメントには、一般にプロモータ及び転写ターミネータが内含され、さらには、エンハンサー及びその他の要素も内含される可能性がある。単数又は複数の選択可能なマーカーも内含されうる。さまざまな原核生物及び真核生物の宿主細胞の中でクローニングされたDNA セグメントにとって有用なDNA 構成体は、容易に入手可能な構成成分又は市販の供給業者からの購入物を用いて調製することができる。１つの実施態様においては、DNA 配列は、各Ｘaaが個々にシステイン以外のいずれかのアミノ酸である配列番号15のアミノ酸配列を含むKunitz型阻害物質をコードする。もう１つの実施態様においては、DNA 配列は、メチオニン、アミノ酸番号１からフェニルアラニン、アミノ酸番号235 までの配列番号２のアミノ酸配列を含むKunitz型阻害物質をコードする。もう１つの実施態様では、第１のDNA 配列は、グルタミン酸、アミノ酸34からイソロイシン、アミノ酸番号89までの配列番号２のアミノ酸配列を含むKunitz型阻害物質をコードする。本発明のもう１つの実施態様においてはKunitz型阻害物質は、グルタミン酸、アミノ酸番号34からリシン、アミノ酸番号15 2 までの配列番号２のアミノ酸配列を含んで成る。本発明のさらにもう１つの実施態様においては、Kunitz型阻害物質は、グルタミン酸、アミノ酸番号34からアラニン、アミノ酸番号211 までの配列番号２のアミノ酸配列を含んで成る。 DNA 構成体は同様に、問題のポリペプチド又はタンパク質の分泌を誘導するのに必要なDNA セグメントも含んでいる可能性がある。このようなDNA セグメントは少なくとも１つの分泌シグナル配列を内含し得る。リーダー配列、プレプロ配列及び／又はプレ配列とも呼ばれる分泌シグナル配列は、細胞からの成熟ポリペプチド又はタンパク質の分泌を誘導するべく作用するアミノ酸配列である。このような配列は、疏水性アミノ酸のコアによって特徴づけられ、標準的に（ただし排他的にではなく）、新しく合成されたタンパク質のアミノ末端に見い出される。きわめて往々にして、分泌ペプチドは、分泌中に成熟タンパク質から分割される。このような分泌ペプチドは、分泌経路を通過するにつれての成熟タンパク質からの分泌ペプチドの分割を可能にするプロセッシング部位を内含している。好ましいプロセッシング部位は、Saccharomyces cerevisiae KEX2 遺伝子によって認識されるもののような二塩基性分割部位である。特に好ましいプロセッシング部位は、Lys-Arg プロセッシング部位である。プロセッシング部位は、分泌ペプチド内でコードされてもよいし、例えばインビトロ突然変異誘発によりペプチドに付加されてもよい。好ましい分泌シグナルとしては、α因子シグナル配列(プレプロ配列：Kurjan 及びHerskowitz，Cell 30：933-943，1982; Kurjan et al.，米国特許第454608 2 号；Brake，EP 116.201)，PH05シグナル配列(Beck et al.，WO86／00637)，BA R１分泌シグナル配列(MacKay et al.,米国特許第4,613,572 号; MacKay，WO87／ 002670), SUC２シグナル配列(Carlsen et al.，分子及び細胞生物学、３：439-447，198 3)，α−１−抗トリプシンシグナル配列（Kurachi et al.，Proc，Natl. Acad. Sci. USA 78; 6826-6830，1981),α−２プラスミン阻害物質シグナル配列( Tone et al.，J．Biochem．(Tokyo) 102 ；1033-1042，1987)及び組織プラスミノーゲン活性化体シグナル配列（Pennica et al.，Nature 301 ：214〜221, 19 83)、が含まれる。代替的には、von Heinje（European Journal of Bioche-mist ry （欧州生化学ジャーナル）、133 ：17-21，1983; Journal of Molecular Bio logy (分子生物学ジャーナル、184： 99-105，1985; Nucleic Acids Research （核酸研究）14：4683-4690，1986)によって確立された規則に従って、分泌シグナル配列を合成することができる。特に好ましいシグナル配列は、本書にその全体が参考として内含されているWU90／10075 に記述された合成シグナルLaC212 s px(1-47)-ERLEである。分泌シグナル配列は、単独で使用することもできるし、組合わせることもできる。例えば、（本書にその全体が参考として内含されている米国特許5,037,243 号に記述されている）第３のバリヤドメインをコードする配列を組合わせた形で、第１の分泌シグナル配列を使用することができる。第３のバリヤドメインは、問題のDNA セグメントから３′のところ又はDNA セグメントまで５′のところで適切な読取り枠内に、そして分泌シグナル配列と問題のDNA セグメントの両方と適切な読取り枠内にある状態で位置づけすることができる。適当なプロモーター、ターミネーター及び分泌シグナルの選択は、当該技術分野における通常の技術レベルの範囲内に充分入るものである。Saccharomyces ce revisiae 内でクローニングされた遺伝子を発現するための方法は一般に当該技術分野において知られている。（「遺伝子発現技術」、Methods in Engymology 、第185 巻、Goeddel (ed.) ，Academic Press，San Diego，CA，1990及び「酵母遺伝学及び分子生物学の手引き」Methods in Enzymology ，Guthrie 及びFink（編）、Academic Press，Sa ndiego，CA，1991; 両書共本書に参考として内含、を参照のこと）。本発明のタンパク質は同様に糸状真菌例えば真菌Aspergillus の菌株の中でも発現させることができる（本書に参考として内含されているMcknight et al.,米国特許第4,93 5,349 号）。培養された哺乳動物細胞及び例えば E．coliの中でのクローニングされた遺伝子の発現については、Sambrook et al.（本書に参考として内含されている、「分子クローニング；実験室マニュアル、第２版、Cold Spring Harbor ，NY，1989）の中で詳細に論述されている。当業者には明白であるように、文献中で充分に立証されている調節配列、ベクター及び方法を用いて、鳥類、昆虫及び植物細胞といったその他の宿主細胞の中で、本発明のタンパク質を発現することが可能である。酵母において、本発明において使用するための適当な酵母ベクターとしては、 YRp.7(Struhl et al.，Proc．Natl．Acad．Sci USA 76:: 1035-1039，1978) ，YEp13(Broach et al.，Gene 8 ：121-133，1979)，POT ベクター（本書に参考として内含されているKawasaki et al，米国特許第4,931,373 号）、pJDB249 及びpJDB219 (Beggs，Nature 275 ；104 〜108，1978)及びその誘導体がある。酵母内で使用するための好ましいプロモータとしては、酵母解糖遺伝子からのプロモータ（Hitzeman et al.，J．Biol Chem，255：12073-12080，1980; Alber a nd Kawasaki，J．Mol．Appl，Genet,1 ：419-434，1982 ：Kawasaki、米国特許第4,599,311 号）又はデヒドロゲナーゼ遺伝子(Young et al.，化学薬品用の微生物の遺伝子工学、Hollaender et al.，（eds.）p355，Plenum，New York，19 82; Ammerer，Meth，Enzymol．101 ：192-201，1983)が含まれる。この点において、特に好ましいプロモータは、 TPI１プロモータ（Kawasaki、米国特許第4,59 9,311 号、1986）及びADH2-4 ^c プロモータ（本書に参考として内含されているRu ssell et al.，Nature 304 ：652-654，1983; Ivoni and Kilgore、米国特許出願番号07／784,653 号、CA1,304,020 及びEP284044号）である。発現ユニットには同じく、転写ターミネータも含まれ得る。好ましい転写ターミネータは、 TPI １ターミネータ（Alber and Kawasaki、同書）である。本発明のDNA 構成体を含む宿主細胞は次に、Kunitz型阻害物質を産生するべく培養される。細胞は、特定の宿主細胞の成長のために必要とされる栄養分を含む培地の中で標準的方法に従って培養される。適当なさまざまな培地が当該技術分野において知られており、これには炭素供給源、窒素供給源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネラル及び成長因子が含まれる。成長培地は一般に、例えばDNA 構成体上で選択可能なマーカーにより補完されるか又はDNA 構成体と同時トランスフェクションされている必須栄養素の欠乏又は薬物選択によって、DNA 構成体を含む細胞について選択することになる。例えば、酵母細胞は好ましくは、非アミノ酸窒素供給源、無機塩、ビタミン及び必須アミノ酸補充物を含む化学的に規定された培地の中で培養される。培地の pHは好ましくは２以上８未満のpH、好ましくはpH6.5 に維持される。安定したpH を維持するための方法には、好ましくは水酸化ナトリウムの付加を通しての一定のpHの制御及び緩衝がある。好ましい緩衝剤には、コハク酸及びビスートリス(S igma Chemical Co.，St．Louis，MO）が含まれる。アスパラギン連鎖されたグリコシル化に必要とされる遺伝子内に欠陥をもつ酵母細胞は、好ましくは、浸透圧安定剤を含む培地の中で成長させられる。好ましい浸透圧安定剤は、 0.1Ｍ〜 1.5Ｍ、好ましくは 0.5Ｍ又は 1.0Ｍの間の濃度で培地内に補足されたソルビトールである。培養された哺乳動物細胞は一般に、市販の血清含有又は血清無しの培地の中で培養される。使用される特定の宿主細胞に適した培地の選択は、当該技術分野における通常の技術レベルの範囲内にある。本発明の１つの実施態様において、本発明のタンパク質は、哺乳動物の中で発現される。哺乳動物の宿主細胞内に外因性DNA を導入するための方法としては、本書に参考として内含されているリン酸カルシウムに媒介されるトランスフェクション(Wigler et al.，Cell 14：725，1978; Corsaro and Pearson,体細胞遺伝学 7：603, 1931; Graham and Van der．Eb、ウィルス学52：456，1973）、電気穿孔法(Neumann et al.，EMBO．J ．1 ：841-845，1982)及びDEAE−デキストラン媒介トランスフェクション(Ausubel et al.，eds.，分子生物学における一般的プロトコル、John Wiley and Sons，Inc.，NY，1987)が含まれる。Boehring er Mannheim のトランスフェクション試薬（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート；Boehringer，Mannheim，Indianapolis，IN）又はLIPOFECTION試薬(Ｎ−［１− （２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン：GIBCO-BRL，Gai thersburg，MD)を含む市販の試薬をメーカーからの指示に従って使用したカチオン性脂質トランスフェクションも同じく使用可能である。培養された哺乳動物細胞中の組換え型タンパク質の産生は、例えば、本書に参考として内含されている Levinson et al.，米国特許第4,713,339 号；Hagen et al.，米国特許第4,784,9 50 号；Palmiter et al.,米国特許第4,579,821 号；及びRingold.米国特許第4,6 56,134 号によって開示されている。好ましい培養された哺乳動物細胞としては、COS-1(ATCC No．CRL 1650)，COS-7(ATCC No．CRL．1651)，BHK（ATCC No．CRL 1632)，BHK570(ATCC N o．CRL 10314)及び293（ATCC No．CRL 1573; Graham et al., J．Gen．Virol．3 6 ：59-72，1977）細胞系統が含まれる。付加的な適当な細胞系統が当該技術分野において知られており、American Type Culture Collection，Rockville，Maryl and、といった公的な寄託機関から入手可能である。本書に記述されている方法を用いて発現された組換え型Kunitz型阻害物質は、遠心分離又はろ過により培地から細胞を分離すること、例えば硫酸アンモニウムなどの塩を用いて上清又はろ液のタンパク様の成分を沈降させること、例えばイオン交換クロマトグラフィ又はアフィニティクロマトグラフィなどのさまざまなクロマトグラフィ手順による精製、を含む従来の手順によって、分離され精製される。タンパク質精製の方法は、当該技術分野において既知のものであり（一般に、本書に参考として内含されているScopes，R.，タンパク質精製、Springer-V erlag，NY(1982)を参照のこと）、本発明の組換え型タンパク質の精製に適用することができる。本発明のKunitz型阻害物質は、トリプシンに結合するのに阻害物質の能力を使用することができる（原文不明）。簡単に言うと、50mMの最終濃度になるまで固体トリス−HCl を付加し４ＭのNaOHで滴定することによって、合計約１リットルの発酵上清をpH8.0 に調整する、あらゆる細胞破片を除去するべくろ過した後、上清を、CNBrで活性化されたセファロースに吸着させたウシトリプシンのカラムに加える（35mlのゲルにつき350mg のウシトリプシン）。150ml の 0.1Ｍトリス −HCl(pH8.0)，0.5 ＭのNaClそして次に150ml の0.01Ｍのトリス−HCl(pH8.0)で順次カラムを洗浄してから、結合した材料を200ml の 0.2Ｍのグリシン−HCl(pH 3.0)で溶離させる。10mlの分画を逆相HPLCにより収集し分析する。タンパク質含有分画を組合わせる。５％のＢ（アセトニトリル中の0.7％のTFA)及び95％のＡ(H₂O中の0.1％のTFA) で平衡化した予備的逆相HPLCカラム（Vydac，The Separations Group，Hesperia ，CAなど）に、プールした材料を付加する。流速は４ml／分に維持する。標本の付加の後、カラムを、214nm での基線が達成されるまで、５％のＢで洗浄する。５〜85％のＢで80分にわたり分画収集を伴うグラジエント溶離を実施する。逆相 HPLC (Vydac)によりUV吸収材料を含む分画を分析し、組合わせて、クロマトグラフィ的に純粋な材料のプールを得る。真空遠心分離により、プールされた分画から溶剤を除去する。主要プール内の阻害物質の合計収量及び濃度を、逆相HPLC分析及びアプロチニン標準との比較によって見積る。最終調製物を、電子噴霧質量分光法（SCIEXAPI III）などによって特徴づけする。 Kunitz阻害物質のタンパク質分解分割が潜在的な問題である場合、本発明のKu nitz阻害物質は同様に基本的にNorris et alによって記述されている方法を用いても精製することができる(本書にその全体が参考として内含されている、Biol ．Chem．Hoppe-Seyler 371 ：37-42，1990)。簡単に言うと、選択された形質転換体を、約25というOD₆₀₀ に達するまで30℃で約40時間、10リットルのYEPD中で成長させる。培養を遠心分離し、上清を傾瀉させる。300ml 〜1000mlの上清アリコートをpH2.3 に調整し、予めpH8.7 のBicine(Sigma Chemical Co.，St．Louis ，MO)で平衡化したＳ−セファロース(Pharmacia-LKB Biotechnology AS，Allero ad，Denmark)などといった８mlのビーズ化されたアガロースマトリクスを保持するカラムに付加する。カラムをpH8.7 の20mMのBicineで大量に洗浄した後、Kuni tz型阻害物質を、１ＭのNaClを含むpH8.7 の2OmMのBicine30mlで溶離する。溶離した材料を、pH7.8 の20mMのNH₄HCO₃ で平衡化された Sephadex Ｇ−25カラム（ビーズ化されたデキストランマトリクスPharmacia-LKB Biotechn ology AS，Alleroed，Denmark; 2.5×30cm）などに付加することによって脱塩する。pH7.8 の20mMのNH₄HCO₃ で、Kunitz型阻害物質を溶離する。 pH8.7 の20mMのBicineで平衡化されたMONO Sカラム（Pharmacia-LKB Biotechn ology AS，Alleroed，Denmark; 0.5×５cm）などの、ビーズ化された親水性樹脂にカップリングされた帯電したスルフォン基を伴う陽イオン交換体を含むカラム上でのクロマトグラフィにより、Kunitz型阻害物質をさらに精製し濃縮する。10 分間２ml／分で平衡化緩衝液で洗浄した後、Kunitz型阻害物質のグラジエント溶離を、平衡化緩衝液中の０〜 0.6ＭのNaClで１ml／分で12分にわたり実施する。ピーク標本をプールし、20分間で５％のＡ(0.1％の水中トリフルオロ酢酸(TFA)) から45％のＢ(アセトニトリル中の 0.7％のTFA)までの４ml／分でのグラジエント溶離で、Vydac 214TP510カラム（Mikro-lab，Aarhus，Denmark; 1.0 ×25cm）などの上での逆相HPLCを用いて、Kunitz型阻害物質を精製する。精製した産物を水中で凍結乾燥させ、阻害物質活性を測定する。代替的には、ヘパリンアガロース、MONO Q(Pharmacia)などといったビーズ化された親水性樹脂に架橋された第４アミンを伴う陰イオン交換体、MONO S(Pharm acia)などといったビーズ化された親水性樹脂にカップリングされた帯電したスルフォン基を伴う陽イオン交換体、及びSUPEROSE12 (Pharmacia)などといった１ ×10³ 〜３×10⁵ MWのタンパク質の分離のための異なる多孔性をもつ架橋されたアガロースゲルろ過マトリクスを用いて、逐次クロマトグラフィにより調整培地からTFPI−２を精製することができる。簡単に言うと、１ＮのNaOHでpH7.5 に調整され0.22μｍのフィルターを通してろ過された、血清を含まない調整培地を、緩衝液Ａ（50mMのトリス−HCl(pH7.5)， 10％のグリセロール）で４℃で平衡化されたヘパリンセルロースカラム（Pharma cia Biotech Inc.，Piscataway，NJ）などに付加する。ろ過された培地を３ml／分の流速で付加する。0.2ＭのNaClを含む緩衝液Ａでカラムを洗浄する。トリプシンを阻害するその能力によって判断されるようなTEPI−２活性（例４Ａ）を、１ＭのNaClを含む緩衝液Ａを用いてカラムから溶離させる。ヘパリンセファロースカラムからの溶離液を、25mMのトリス−HCl(pH7.5)，10％グリセロールに対し４℃で透析する。室温で25mMのトリス−HCl(pH7.5)，10％グリセロールで平衡化されたMONO Q（MONO Q HR５／５；Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，NJ）などといったビーズ化された親水性樹脂に架橋された第４アミン基を伴う陰イオン交換体を含む５×50mmのカラム上で、保持物をFPLC(Pharmacia Biotech Inc.) に付す。１ml／分の流量で線形NaCl勾配（０〜 0.5ＭのNaCl）でカラムからTFPI −２を溶離させる。TFPI−２分画をプールし、25mMのクエン酸ナトリウム(pH5.0 )，10％グリセロールに対し透析させる。次に保持物を、 0.5ml／分の流量でMON O S（MONO S HR ５／５，Pharmacia Biotech Inc.）などといったビーズ化された親水性樹脂にカップリングされた帯電したスルフォン基を伴う陽イオン交換体上で、室温でFPLCに付す。25mMのクエン酸ナトリウム(pH5.0)，10％のグリセロールから25mMのトリス−HCl(pH7.5)，10％のグリセロール、１ＭのNaClまでのグラジエント溶離で、MONO Sカラムから、TFPI−２活性を溶離する。TFPI−２活性を含む分画をプールし、限外ろ過により約１mlまで濃縮する。濃縮した標本を、 50mMのトリス−HCl (pH7.5)，100mMのNaClの中で室温で、SUPEROSE12（Pharmaci a Biotech Inc.，Piscataway，NJ）などといった１×10³ から３×10⁵ MWまでのタンパク質の分離に適した多孔性をもつ架橋したアガロースゲルろ過マトリクスを播断して、FPLCに付す。TFPI−２活性を伴うFPLCから溶離された分画を、SDS-PAGEに付し、純枠分画をプールし、−80 ℃で保管した。本発明は同様に、薬学的に受容可能な担体又はビヒクルと共に本発明のKunitz 型阻害物質を含む薬学組成物にも関する。本発明の組成物において、Kunitz型阻害物質は、例えばRemington's Pharmaceutical Science，1985の中に記述されているような薬学組成物を調剤する立証済みの方法のいずれかによって調剤することができる。この組成物は標準的には、全身的注射又は輸注に適した形をしていてよく、従って、無菌水又は等張食塩水又はグルコース溶液を用いて調剤できる。従って、本発明のKunitz型阻害物質は、組織因子経路阻害物質が有用である治療目的の利用分野での使用にとって有利なものであると考えられている。かかる利用分野としては、播種性血管内凝固、深静脈血栓症、肺塞栓症、そして外科手術後の血栓症の予防が含まれる。当業者にとっては明白であるように、本発明の Kunitz型阻害物質は、その他の治療薬と組合わせてこのような薬の抗血栓又は抗凝固活性を増大させることができる。例えば、TFPI−２は、血栓崩壊療法において組織プラスミノーゲン活性化因子と合わせて使用することができる。本発明の Kunitz型阻害物質の使用は、第VIIａ因子／組織因子複合体を阻害するそれらの能力の結果として、必要が示されている。かくして、本発明のKunitz型阻害物質は、哺乳動物体内の血液凝固を阻害するための方法の中で使用することができる。かかる方法には、一般に、血液凝固を阻害するのに充分な量でKunitz型阻害物質を投与することが含まれる。かかる量は、治療対象の状態の重症度に応じて変動する可能性があり、体重１kgにつき約 10μｇから10 mgまで変動する。好ましくは、投与されるKunitz型阻害物質の量は、 100μｇ／ kgと５mg／kgの範囲内にあり、100μｇ／kgと１mg／kgの範囲が最も好ましい範囲である。上述の薬学的用途の他に、上述のKunitz型阻害物質は、例えばスクリーニング検定又はアフィニティクロマトグラフィによってKunitz型阻害物質に直接又は間接的に結合する例えばヒト材料からのプロテアーゼ又はレセプタなどの有用な天然の物質を分離するために使用することができる。本発明の１つの態様においては、その誘導体を含むKunitz型阻害物質ならびにこれらのタンパク質の一部分又はフラグメントは、Kunitz型阻害物質に特異的に結合する抗体を調製するために利用される。本書で使用されている通り、「抗体」という語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメント例えばＦ（ab′）２及びFab フラグメントならびに組換えにより産生される結合パートナーが含まれる。これらの結合パートナーは、特異的に結合するモノクローナル抗体をコードする遺伝子からの可変領域を取り込んでいる。抗体は、それらが10⁷ ／Ｍ以上のKaでKunitz型阻害物質に結合する場合に、特異的に結合するものとして定義される。モノクローナル抗体又は結合パートナーの親和力は、当業者であれば容易に決定できる（Scatchard，Ann，NY Acad．Sci ．51 ：660-672，1949を参照のこと）。分離した抗体というのは、その他の血液が実質的に無い抗体のことである。ポリクローナル及びモノクローナル抗体を調製するための方法は、文献中で充分記述されてきた（例えば、Sambrook et al.,同書；Hurell，J.G．R.，Ed.，モノクローナルハイブリドーマ抗体：技術と応用、CRE．Press，Inc.，Boca Raton ，FL.，1982を参照）。当業者には明白であるように、ポリクローナル抗体は、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス又はラットといったさまざまな温血動物から生成することができる。Kunitz型阻害物質の免疫原性は、フロインドの完全又は不完全アジュバントといったアジュバントの使用を通して増大させることができる。Kunitz型阻害物質に対し特異的に結合する抗体を検出するためには、当業者にとって既知のさまざまな検定を利用することができる。例示的検定は、抗体：実験室マニュアル、Harlow及びLane(Eds)，Cold Spring Harbor La boratory Press，1988の中で詳述されている。かかる検定の代表例としては、同時免疫電気泳動法、放射性免疫検定法、放射性免疫沈降法、酵素結合免疫吸着検定法、ドットブロット検定法、阻害又は競合検定法及びサンドイッチ検定法、がある。モノクローナル抗体の調製のための付加的技術を、組換え型モノクローナル抗体を構築し発現するために利用することも可能である。簡単に言うと、mRNA をＢ細胞集団から分離して、Stratocyte（La Jolla，CA）から得ることのできる λIMMUNOZAP（H）及びλIMMUNOZAP（L）ベクターといった適当なベクター内で重鎖及び軽鎖免疫グロブリンcDNA発現ライブラリーを生成するためにこれを利用する。次に、これのベクターを個々にスクリーニングするか又は同時発現させて、 Fab フラグメント又は抗体を形成する（Huse et al.，Science 246 ：1276-128 1，1989; Sastry et al.，Proc．Natl．Acad.Sci．USA, 86：5728 〜5732，198 9）。ひきつづき、陽性プラークを、E．coli 内でのモノクローナル抗体フラグメントの高レベル発現を可能にする非溶菌プラスミドへと変換させる。上述のもののような結合パートナーは同様に、特異的結合抗体をコードする遺伝子の可変領域を取込むように、組換え型DNA 技術を利用して構築することもできる。これらのタンパク質の構築は、当業者であれば容易に達成できる（例えば、Larrick et al.，Biotec hnology 7 ：934-938，1989; Reichmann et al., Nature 322 ：323-327，198 8 及びRoberts et al. Nature 328 ：731-734，1987 を参照のこと）。適切な抗体又は結合パートナーがひとたび得られると、文献中で充分に記述されている数多くの技術によりこれらを分離し精製することができる（例えば抗体：実験室マニュアル、同書、を参照のこと）。適当な技術には、タンパク質又はペプチドアフィニティカラム、HPLC又はRP-HPLC、プロテインＡ又はプロテインＧカラム上での精製又はこれらの技術のあらゆる組合せ、が含まれる。本発明においては、抗体又は結合パートナーを定義するのに用いられるような「分離された」という語は、「その他の血液成分を実質的に含まない」ことを意味している。本発明の抗体及び結合パートナーは、さまざまな方法で使用することができる。例えば、Kunitz型阻害物質の組織分布は、特異的にKunitz型阻害物質に結合する標識づけされたモノクローナル抗体を用いて組織薄片をインキュベートし、それに続いて結合した抗体の存在を検出することによって決定することができる。本発明の中で使用するのに適した標識は、当該技術分野において充分知られており、なかでも、フルオロセイン、イソチオシアネート、フイコエリスリン、ホースラディッシュペルオキシダーゼ及びコロイド金、が含まれる。本発明の抗体は、同様に、本発明のKunitz型阻害物質の精製のためにも使用できる。固体支持体に対する抗体のカップリング及びタンパク質精製におけるその利用は、文献中で充分に知られている（例えば本書にその全体が参考として内含されている、分子生物学の方法、第１巻、Walker(Ed.)，Humana Press，New Jersey，1984を参照のこと）。以下の例は、制限的な意味のない例示を目的として提供されるものである。例 GIBCO BRL Life Technologies，Inc(GIBCO BRL)及びNew England Biolabs から、制限エンドヌクレアーゼ及びその他のDNA 修飾酵素（例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、仔ウシアルカリ性ホスファターゼ、DNA ポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）、Ｔ４ポリヌクレオチドリガーゼ）を入手し、相反する指摘のないかぎり、メーカーの指示通りに使用した。 Applied Biosystemsの380 Ａ型DNA 合成装置上でオリゴヌクレオチドを合成し、変性ゲル上のポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって精製した。Maniatis et al．(分子クローニング：実験室マニュアル、Cold Spring Harbor Laborato ry，1982)又はSambrook et al.(分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、Cold Spring Harbor，New York，1989)により記述されている通りに、E．coli 細胞を形質転換させた。放射性標識付けされたプローブ及びハイブリダイゼーション溶液は、基本的にSambrook et al.（本書にその全体が参考として内含されている分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、Cold Spring Harbor， New York，1989）によって記述されている通りに調製した。例１新しいヒトKunitz阻害物質cDNAのクローニングアンチセンス30−mer オリゴヌクレオチド（ZC4792、配列番号３）を用いて、さまざまなヒト組織源からのPoly（Ａ）⁺ RNA をスクリーニングした。Clonteck Laboratories，Inc．(Palo Alto，CA)から、心臓、脳、胎盤、肝臓、肺、骨格筋、腎臓及び膵臓からのヒトpoly（Ａ）⁺ RNAのブロット（HUMAN MTN BLOT）を入手した。ブロットを、55℃で４時間、予備ハイブリダイゼーション溶液(５×S SPE（表１），２×Denhardt's（表１）， 0.5％のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)， 100μｇ／mlの音汲処理されたサケ精子DNA)の中で予備ハイブリッド形成させた。予備ハイブリダイゼーションの後、予備ハイブリダイゼーション溶液を除去し、4.7 ×10⁶cpm／mlの32ｐ標識付けされたZC4792（配列番号３）を含む予備ハイブリダイゼーション溶液で交換した。55℃で一晩インキュベートさせた後、ハイブリダイゼーション溶液を除去し、ブロットを２×SSC（表１），0.05％SDS 内で一回、室温で20分間洗浄し、その後55℃で20分間２×SSC(表１)，0.1％のSDS 内で洗浄した。ブロットを2.5 時間フィルムに露呈した。結果として得られたラジオグラフは、大部分のレーン内で数多くのバンドを示し、ブロット内に表わされた組織の大部分における関連する配列の存在を表わしていた。ブロットを、30分間60℃と65℃の間の温度で２×SSC（表１）の中でより高い緊縮性で洗浄し、その後ブロットを一晩フィルムに露呈した。第２のオートラジオグラフは、胎盤及び肝臓について1.6kb のバンドの存在を、又膵臓内に約1.2k b の見かけ上小さいバンドの存在を示していた。精製水中で固体を溶解させる。体積を１リットルにする。オートクレーブで滅菌する。Kunitzファミリーからヒト胎盤プロテアーゼ阻害物質をコードするcDNA を得るために、基本的に上述の通り、放射性標識付けされたZC4792（配列番号３）を用いて、λgtil内のヒト胎盤cDNAライブラリー（Clontech Laboratories，I nc，Palo．Alto，CA）をスクリーニングした。ライブラリを滴定し、 240万個の独立したプラークを得るため合計12の平板上で、平板１枚につき２×10⁵pfuを平板培養した。ICN BIOTRANSナイロン膜(ICN，Irvine,CA)を用いて、重複プラークリフトを調製した。膜を１時間50℃で５×SSC(表１)、 0.5％SDS 内で予備洗浄し、その後予備ハイブリダイゼーション溶液＃１（表１）中で55℃で一晩予備ハイブリダイゼーションに付した。予備ハイブリダイゼーション溶液を除去し、 7 .2×10⁷cpmのZC4792プローブ（配列番号３）を含む新鮮な予備ハイブリダイゼーション溶液＃１（表１）で交換した。予備ハイブリダイゼーションと同じ条件下でハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイゼーション溶液を除去し、ブロットを２×SSC(表１)，0.1％SDS 中で60℃で洗浄した。14の陽性プラークを同定し、放射性標識付けされたZC4792 （配列番号３）を用いてプラークを精製した。アミロイド前駆体タンパク質相同体との相同性をもつクローンを同定し排除するため、アミロイド前駆体タンパク質相同体コーディング配列を含むクローンであるZGKI13（受入れ番号69090 でE．coli 形質転換体として1992年10月14日付けでAmerican Type Culture Collection，12301 Park Lawn Dr.，Rockville，MDに寄託されたもの）からの特異的フラグメントで、14のクローンのプラーク精製からの三次フィルターをプローブ採査した。プローブとしては、ZGKI13の任意プライミングを行なった880bp のPst Ｉ−Xho Ｉフラグメントを使用した。標識づけされたプローブを２×10⁶cpm／ml含む予備ハイブリダイゼーション溶液＃２の中で65℃で一晩フィルターをハイブリッド形成させた。ハイブリダイゼーションの後、溶液を除去し、フィルターを65℃で0.2×SSC（表１），0.1％のSDS の中で洗浄した。14のプラークのうちの４つは、ZGKI13アミロイドタンパク質前駆体をコードすることが示された。これらの４つのクローンは廃棄した。Ｊ−２−11と呼ばれる10個の残りの精製済みファージクローンの１つから２本鎖DNA を調製した。プラスミドDNA をEcoRＩで消化して、約１kbのcDNAインサートを分離した。EcoRＩフラグメントをEcoRＩ−線形化pUC19 へとサブクローニングした。クローニングされたフラグメントの配列分析は、プロテアーゼ阻害物質のKunitzファミリーと強い相同性を示すクローンの３つの領域を実証した。Ｊ− ２−11クローンに特異的な標識づけされたプローブで決定して、９つの残るファージクローン（上述）の三次フィルターをスクリーニングした。三次フィルターを、キナーゼ添加されたオリゴヌクレオチドZC6281プローブ（配列番号４）を２×10⁶cmp／ml含む予備ハイブリダイゼーション溶液＃２（表１）の中で55℃で一晩ハイブリッド形成させた。ハイブリダイゼーションの後、プローブを除去し、フィルターを２×SSC(表１)，0.1％のSDS 中で60℃で洗浄した。フィルターのオートラジオグラフィは、９つのクローン候補が全てＪ −２−11に相同な配列を含んでいることを示した。１つのクローンを選択し、Ｊ −２−11／pUC19 と呼称した。プラスミドＪ−２−11／pUC19 は、1993年９月17日付けで、受入れ番号69425 にてAmerican Type Culture Collection(12301 Parklawn Dr.，Rockwille，MD) にE. coli形質転換体として寄託された。プラスミドＪ−２−11／pUC19 は、配列番号１の中に示されている配列を含むことがわかっている。配列を分析すると、36のヌクレオチドの５′の非コーディング配列、235 のアミド酸をコードする 705 のヌクレオチドの読取り枠、及び235 のヌクレオチド３′非コーディング領域が示された。演繹したアミノ酸配列（配列番号１と配列番号２）とその他のKu nitz型阻害物質の比較は、TFPIとのアミノ酸相同性及びドメイン構造類似性を示した。写しの組織分布を決定するため、TFPI−２配列（ZC6281；配列番号４）に対応する³²Ｐ−末端−標識付けされたオリゴヌクレオチドを用いて、ヒトの組織からのpoly（Ａ）⁺ mRNAのブロットをスクリーニングした。ブロットは、数時間55℃ で５×SSPE（表１），２×Denhardt（表１），0.5％のSDS，100μｇ／mlのサケ精子DNA を含む予備ハイブリダイゼーション溶液の中で予備ハイブリッド形成させた。予備ハイブリダイゼーションの後、溶液を除去し、キナーゼZC6281（配列番号４）を含む新鮮な予備ハイブリダイゼーション溶液中で55℃で一晩、ブロットをハイブリッド形成させた。65℃で 0.2 ×SSC(表１)，0.1％SDS 中にて、ブロットを洗浄し、フィルムに露呈した。オートラジオグラフ分析は、TFPI−２が胎盤及び肝臓内で転写されていることを示した。それに続くノーザン分析は、ヒトのへそ静脈内皮細胞内のTFPI−２写しの存在を立証した。１つの主要な写しが 1.4kbで明らかであり、−２kbでわずかな写しが考えられる。最長のTFPI−２クローンのサイズに基づき、ポリアデニル化配列が全く見られないことから、クローンが３′−非コーディング配列のいくつかが欠如している不完全な写しを表わしていることも可能である。リンカー配列が全く見られないことから、３′末端にあるEcoRＩ部位が内部部位であると思われる。従って、mRNAのサイズは、全長写し内の付加的な400bpの３′（又は５′）非コーディング配列を予測することになる。例２培養された哺乳動物細胞内の新しいヒトKunitz型阻害物質の発現哺乳動物の発現ベクターZem229R の中でクローンＪ−２−11によりコードされた新しいヒトKunitz型阻害物質は発現された。ベクターZem229R は、受入れ番号 69447 にて、E．coli 形質転換体としてAmerican Type Culture Collection(123 01 Parklawn Dr．Rockville，MD．20852)に、1993年９月28日付けで寄託された。EcoRＩでの消化によって直線化されたZem229R 内に、Ｊ−２−11／pUC19 からの約１kbのEcoRＩフラグメントを連結させた。プロモータに対する適切な配向でインサートを含むプラスミドについて、形質転換体をスクリーニングした。陽性クローンを同定し、プラスミドDNA を調製した。プラスミドDNA は、リン酸カルシウム媒介のトランスフェクションを用いてBHK570細胞をトランスフェクションするのに使用した(Wigler et al.，Cell 14 ：725，1978; Corsaro and Pearson ，体細胞遺伝学７：603，1981：Graham and VanduEb，ウイルス学 52：456，1973)。BHK570細胞は、1989年12月20日付で受入れ番号CRL 10314 にてAmerican Type Culture Collection（ATCC; 12301 Parklawn，Dr.，Rockwil le，MD．20852，USA）に寄託された。トランスフェクションを受けた細胞をまず最初に、１μＭのメトトレキセートを含む培地の存在下で選択し、その後10μＭのメトトレキセートを含む培地内でより緊縮性の高い選択を行なった。10μＭのメトトレキセート内での選択の後、任意に選択したクローンを、成長培地（表１）中で６ウェルの皿の中で集密的になるまで成長させた。集密性に達した後、消費した培地を傾瀉し、細胞をリン酸緩衝溶液(PBS、表１)で洗浄して残っている血清を全て除去した。無血清培地（表１）を細胞に付加し、24〜48時間細胞を成長させた。調整培地を収集し、例４Ａで詳述されている検定方法を用いてトリプシン阻害物質活性について検定した。大規模培養のためには、最高のレベルのトリプシン阻害物質活性をもつクローンが選択された。クローンからの細胞を膨張させ、小さい又は大きい細胞ファクトリのいずれかに播種し、10mg／Ｌのアプロチニン(Novo Nordisk A／S，Bagsva erd，Denmark)を含む成長培地（表１）中で、集密性に至るまで成長させた。集密性に達した後、培地を除去し、細胞をPBS で洗浄し、10mg／Ｌのアグロチニンを含む無血清培地（表１）を付加した。２−４日毎に培地を収集し−20℃で保管した。例３酵母Saccharomyces cerevisiae内でのKunitz型阻害物質ドメインの発現Ａ．配列番号２のアミノ酸34〜89を含むTFPI−２のKunitz型阻害物質ドメインの発現グルタミン酸、アミノ酸34からイソロイシン、アミノ酸番号89までの配列番号２のアミノ酸配列を含みプスミドpJ− ２−11／pUC19 内でコードされたKunitz型阻害物質ドメインは、PCR で生成された配列からの酵母Saccharomyces cerevisiaeの菌株内で発現される。Kunitz型阻害物質ドメインをコードするDNA 配列は、pJ−２−11／pUC19 から増幅される。合成オリゴヌクレオチドプライマＭ−2161及びＭ−2177（それぞれ配列番号５及び６）がPCR 増幅プライマとして設計されている。合成オリゴヌクレオチドＭ −2177は、配列番号１のヌクレオチド288-305 に相補的であり、さらに、翻訳停止コドンとそれに続くXbＩ部位を含む５′伸長部を支持している。オリゴヌクレオチドＭ−2161は、配列番号７に示されている合成リーダー配列のヌクレオチド 215 〜235 とそれに続く配列番号１のヌクレオチド138-154 と同一の配列を含んでいる。PCR 反応は、１μｇのプラスミドpJ−２−11／pUC19 、各々100pmoleのオリゴヌクレオチドＭ−2161及びＭ−2177（それぞれ配列番号５及び６）そして GENEAMP キット(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)の中に提供されている試薬、をメーカーの指示に従って使用して、 100μｌの最終体積にて実施される。反応を19サイクル（94℃で20秒、50℃で20秒、72℃で30秒）増幅させ、その後10分間72℃でインキュベートする。205bp のフラグメントを、アガロースゲル電気泳動により分離する。プラスミドpKFN-1000 からフラグメントのPCR 増幅により、合成シグナル配列（配列番号７）をコードするDNA 配列を得る。プラスミドpKFN-1000は、合成酵母シグナルリーダーペプチドをコードするDNA 配列を含むプラスミドpTZ19Rの誘導体（Mead et al., Prot．Engin. １：67-74，1986）である。プラスミドpKF N-1000は、本書にその全体が参考として内含されているWO90／10075 の中で記述されている。プラスミドpKFN-1000 のEcoRＩ部位から下流にある235 の塩基対の DNA 配列及びコードされたアミノ酸配列は、配列番号７及び８に示されている。鋳型としては、プラスミドpKFN-1000の0.7kb の Pv uIIフラグメントが使用される。合成オリゴヌクレオチドNOR-1478（配列番号９）は、EcoRＩ部位のすぐ上流の配列（配列番号７の１〜６までのヌクレオチド）と同一である。合成オリゴヌクレオチドNOR-2523（配列番号10）は、配列番号７のコーディング配列のヌクレオチド215 〜235 に相補的である。PCR 反応は、0. 1μｇの0.7kb Pvu IIフラグメント、各々100pmoler のオリゴヌクレオチドNOR-1 478及びNOR-2523（それぞれ配列番号９及び10）及びGENEAMP 市販キット（Perki n Elmer Cetus）からの試薬をメーカーの指示に従って用いて、 100μｌの最終体積にて実施する。PCR 反応を、上述のとおり増幅させる。アガロースゲル電気泳動により、 257bpのPCR 産物を分離する。 Kunitz型阻害物質ドメイン配列に作動的に連鎖された完全な合成シグナル配列をコードするDNA 配列を、上述の２つのPCR フラグメントを増幅することによって得る。PCR 反応は、各々100pmoles のプライマーNOR-1478（配列番号No.9）及びＭ−2177（配列番号６）及び各々 0.1μｇの上述の２つのPCR フラグメントを用いて、上述の通り実施される。PCR 反応を、16サイクル（94℃で１分、50℃で２分、71℃で３分）増幅させ、その後72℃で10分間インキュベートする。437bp のフラグメントをアガロースゲル電気泳動により精製する。その後フラグメントをEcoRＩ及び XbaＩで消化し、結果として得られた408bp のフラグメントを、Ec oRＩ及び XbaＩでの消化により直線化されたプラスミドpTZ19Rと連結させる。連結混合物を、コンピーテントな制限マイナス、修飾プラスE．coli 菌株へと形質転換せ、形質転換体をアンピシリンの存在下で選択した。選択された形質転換体から調製されたプラスミドDNA を配列決定し、Kunitz型阻害物質ドメインに融合された合成酵母シグナル配列のDNA 配列を含むプラスミドを同定する。その後、分泌シグナル−Kunitz型阻害物質ドメインをコードするEcoRＩ− Xba Ｉフラグメントを分離し、プラスミドpMT-636 へとサブクローニングさせる。プラスミドpMT-636 は、Saccharomyces cerevisiae LEU2遺伝子を含む0.4kb の H paＩ-NruＩフラグメントが欠失したシャトルベクターpCPOT （プラスミドpCPOT は1984年５月９日付けで受入れ番号39685 号にてAmerican Type Culture Collec tion; 12301 Parklawn Dr.，Rockwille，MDに寄託された）から誘導されたものであり、さらに、DNA インサートがSchizosaccharomyces pombe POT1遺伝子と同じ方向に転写されるようにEcoRＩ− XbaＩ同性クローニング部位をフランキングするTPI1ターミネーター及びSaccharomyces cerevisiae TP11プロモータを含んでいる（Norris et al．同書）。プラスミドpMT-636については、本書にその全体が参考として内含されているWO89／01-968及びWO90／10075の中で記述されている。プラスミドpMT-636 を、9.3kb のフラグメントを分離するべく NcoＩ及び XbaＩで消化させる。プラスミドpMT-636 と同様に、 NcoＩ及びEcoRＩで消化させて、 1.6kbフラグメントを得る。pMT-636 からの２つのフラグメントをEcoR Ｉ− XbaＩフラグメントと連結させる。適正な配向でシグナル配列−Kunitz型阻害物質ドメインフラグメントを含むプラスミドを、S. cerevisiae NT-663 （ａ／α Δtpi ／Δtpi pep４−３／ pep４−３）へと形質転換させる。唯一の炭素供給源としてのグルコース上で成長について形質転換体を選択し、YEPD培地内で培養させる。例４で記述されている通りに活性について形質転換体を検定する。例５に記述されている通りに、Kunitz型阻害物質を精製する。Ｂ．配列番号２のアミノ酸34〜152 を含むTFPI−２のKunitz型阻害物質ドメインの発現。グルタミン酸、アミノ酸番号34から、リシン、アミノ酸番号152 までの配列番号２のアミノ酸配列を含むTFPI−２のKunitz型阻害物質ドメインをコードするDN A 構成体を、オリゴヌクレオチドプライマＭ−2161及びＭ−2162（配列番号５及び配列番号11）を用いて、例１に記述されヒトゲノミックDNA から増幅させる、結果として得られたPCR により生成されたフラグメントをゲル精製し、上述の通りシグナル配列に接合させる。ベクターpTZ19R内のTFPI−２コーディング配列及び合成シグナル配列を含むプラスミド中間体を用いて、酵母発現ベクターの構築のためのシグナル配列−TFPI−２フラグメントを得る。シグナル配列−TFPI−２をコードするプラスミド中間体からのEcoRＩ− XbaＩフラグメントを、上述の通り酵母発現ベクターMT−636 の中にサブクローニングさせる。適正なインサートをもつプラスミド候補を上述の通りに、Saccharomyces cerevisiae菌株MT-663 内に形質転換する。例４に記述されている通り、選択された形質転換体を活性について検定する。 Kunitz型阻害物質を、例５に記される通りに精製する。Ｃ．配列番号２のアミノ酸34〜211 を含むTFPI−２のKunitz型阻害物質の発現、グルタミン酸、アミノ酸番号34からアラニン、アミノ酸番号211 までの配列番号２のアミノ酸配列を含むTFPI−２のKunitz型阻害物質ドメインをコードするDNA 構成体を、３つのKunitz型ドメインをコードする 528bpのBglII−HindIIIフラグメントを得るべく BglII及びHindIIIでまずプラスミドpJ−２−11／pUC19 を消化することによって、構築する。pJ−２−11／pUC19 からのKunitz型阻害物質ドメインコーディング配列を、例38に記述されたプラスミド中間体の中のTFPI−２コーディング配列を置換することによって合成シグナル配列（配列番号７）に接合させる。ベクター含有フラグメントを分離するため、プラスミド中間体を BglII及び XbaＩで消化する。 B alII− XbaＩベクタを含有するフラグメントを、翻訳停止コドンを含むHindIII − XbaＩリンカー及びpJ−２−11／pUC19 からの BglII−HindIIIフラグメントと連結させる。TFPI−２コーディング配列と適正な配向で接合された合成シグナル配列を含むプラスミドを同定する。シグナル配列−TFPI−２をコードするプラスミド中間体からのEcoRＩ− XbaＩフラグメントを、上述の通りに酵母発現ベクターMT−636 へとサブクローニングさせる。適正なインサートをもつプラスミド候補を、上述の通りSaccharomyces cerevisiae菌株MT−663へと形質転換させる。選択された形質転換体を例４に記述されているように活性について検定する。例５で記述された通り、Kunitz型阻害物質を精製する。例４活性検定Ａ．哺乳動物細胞培養上清についてのトリプシン阻害活性検定トリプシン阻害物質活性について、Kunitz型阻害物質を発現する細胞からの調整培地をトリプシン阻害物質活性について検定した。各クローンについて、 100 mMのNaCl，50mMのトリス(pH7.4)中に24μｇ／mlのトリプシン(Worthington Bioc hemical，Freehold，NJ)を含む溶液に対して、20〜 100μｌの調整培地を付加して、 300μｌの最終体積を得た。30分間23℃で反応をインキュベートし、その後、20μｌの10mMの色素産生基質Ｓ−2251（D-Val-Leu-Lys-Nan：加した。残留トリプシン活性を405nm での吸収度によって測定した。Ｂ．酵母培養上清についての活性検定 80μｌの検定緩衝液（50mMのトリスHCl，pH7.4，100mM のNaCl，２mMのCaCl₂ ，0.1％ｗ／ｖのPEG20000）で、 3.2μｌの消費された各々の培地標本を希釈することによって、例３に記述された酵母形質転換体の培養からの消費された培地について、トリプシン阻害活性を測定する。検定緩衝液の中で希釈された80μｌの133nM のウシトリプシン(Novo Nordisk A／S)に対して、希釈上清を付加し、室温で10分間、混合物をインキュベートする。インキュベーションの後、検定緩衝液の中で希釈された 100μｌの1.8mM のペプチジルニトロアニリド基質Ｓ2251 (D-Val-Len-Lys-Nan; Kabi)を各標本に付加し、30分間基質と共に標本をインキュベートする。トリプシン阻害活性は、無色の溶液によって指示される。黄色の溶液を結果としてもたらす対照反応が、Kunitz型阻害物質を全く発現しない酵母菌株からの上清により生成される。例５ Kunitz型阻害物質の精製Ａ．トランスフェクションを受けた哺乳動物細胞培養上清からのKunitz型阻害物質の精製以下でさらに詳しく説明するように、ヘパリンアガロース、MONOQ，MONOS及び SUPERROSE12 クロマトグラフィの逐次応用によって、組換え型TFPI−２を調整培地から精製した。１ＮのNaOHを用いて約５リットルの無血清調整培地をpH7.5 に調整し、0.22μｍのフィルターを通してろ過した。 2.6×35cmのヘパリンセファロースカラム（Pharmacia Bioteck Inc.，Piscataway，NJ）を緩衝液Ａ（50mMのトリス−HCl（pH7.5），10％のグリセロール）で４℃で平衡化させた。ろ過済みの培地を、３ml／分の流速で平衡化されたカラムに付加した。標本付加の後、カラムを、 0.2ＭのNaClを含む緩衝液Ａで洗浄した。トリプシンを阻害するその能力によって判断されるようなTFPI−２活性（例４Ａ）を、１ＭのNaClを含む緩衝液Ａでカラムから溶離させた。ヘパリンセファローズカラムからの溶離液を、４℃で25mMのトリス−HCl(pH7.5)，10％のグリセロールに対し透析した。保持物を、室温で、25mMのトリス−HCl(pH7.5)， 10％のグリセロールで平衡化されたMONOQ（MONO Q HR 5／5：Pharmacia Bioteck Inc.，Piscataway，NJ）などといったビーズ化された親水性樹脂に架橋された第４アミン基を伴う陰イオン交換体を含む５×50mmのカラム上でFPLC（Pharmaci a Biotech Inc.）に付した。１ml／分の流速で、線形NaCl勾配（０〜0.5ＭのNaC l）でカラムからTFPI−２を溶離させた。TFPI−２分画をプールし、25mMのクエン酸ナトリウム(pH5.0)，10％のグリセロールに対し透析した。次に、 0.5ml／分の流速で、MONO S (MONO S HR 5／5，Pharmacia Biotech Inc.)といったビーズ化された親水性樹脂などにカップリングされた帯電したスルホン基を伴う陽イオン交換体を含む５×50mmのカラム上で、室温で、保持物をFPLCに付した。25mM のクエン酸ナトリウム（pH5.0)，10％のグリセロールから25mMのトリス−HCl(pH 7.5)，10％のグリセロール、１ＭのNaClまでのグラジエント溶離で、MONOＳカラムから、TFPI−２活性を溶離した。TFPI−２活性を含む分画をプールし、限外ろ過により約１mlまで濃縮させた。濃縮した標本を、50mMのトリス−HCl(pH7.5)， 100mMのNaCl中で室温で、SUPER-OSE12(Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，N J)などといった１×10³ から３×10⁵ MWまでのタンパク質の分離に適した多孔性をもつ架橋されたアガロースゲルろ過マトリクスを横切ってFPLCに付した。TFPI −２活性を伴うFPLCから溶離された分画をSDS-PAGEに付し、純粋分画をプールし −80℃で保管した。Ｂ．酵母培養上清からのKunitz型阻害物質の精製基本的にNorris et al（本書に参考として内含されている同書）によって記述されている通りに、酵母培養上清からKunitz型阻害物質を精製する。約25のOD₆₀ ₀ が達成されるまで、30℃で約40時間10リットルのYEPD中で、選択した形質転換体を成長させる。培養を遠心分離させ、上清を傾瀉させる。精製のためには上清の 300ml〜1000mlのアリコートをpH2.3 に調整し、20mMの pH8.7のBicine（Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO）で予め平衡化された８m lのＳ−セファロース(Pharmacia-LKB Biotechnology AS，Alleroed，Denmark）を保持するカラムに付加する。カラムをpH8.7 の20mMのBicineで大量に洗浄した後、１ＭのNaClを含む20mMのpH8.7 のBicine30mlでKunitz型阻害物質を溶離する。pH7.8 の20mMのNH₄HCO₃ で平衡化された Sephadex Ｇ−25カラム（Pharmacia- LKB Biotechnology AS，Alleroed，Denmark; 2.5×30cm）に適用することによって、溶離した材料を脱塩する。Kunitz型阻害物質は、pH7.8 の20mMのNH₄HCO₃ で溶離させる。さらにKunitz型阻害物質をさらに、pH8.7 の20mMのBicineで平衡化されたMono Ｓカラム（Pharmacia-LKB Biotechnology AS，Alleroed，Denmark; 0.5×５cm）上のクロマトグラフィにより、精製し濃縮させる。10分間２ml／分で平衡化緩衝液で洗浄した後、平衡化緩衝液内で０〜0.6ＭのNaClで１ml／分にて12分にわたりKunitz型阻害物質のグラジエント溶離を実施する。ピーク標本をプールし、20 分で５％Ａ(水中の 0.1％のトリフルオロ酢酸(TFA))から45％Ｂ(アセトニトリル中0.7％のTFB)までの４ml／分でのグラジエント溶離を伴うVydac214TP510 カラム（Mikrolab，Aarhus，Denmark; 1.0×25cm）上の逆相HPLCを用いて、Kunitz型阻害物質を精製する。精製産物を水中で凍結乾燥させ、阻害物質活性を測定する。 Kunitz阻害物質の活性は、基本的にNorris et al（同書）により記述されている方法を用いて測定される。簡単に言うと、さまざまな一定の濃度のKunitz型阻害物質を、pH7.4 の100mM のNaCl，50mMのトリスHCl、中の0.24μ ｇ／mlのブタトリプシン(Novo Nordisk A／S，Bagsvaerd，Denmark)，12.8cu／ｌのヒトプラスミン（Kabi, Stockholm，Sweden）又は0.16nkat／mlのヒト血漿カリクライン（Kabi）の存在下でインキュベートする。30分のインキュベーションの後、検定緩衝液中の0.6mM の色素産生ペプチジルニトロアニリドトリプシン／プラスミン基質Ｓ2251(D-Val-Len-Lys-Nan; Kabi)又はＳ2302(D-Pro-Phe-Arg- Nan; Kabi)のいずれかを含む基質溶液の分割により、残留酵素活性を測定する。標本を30分間インキュベートし、その後各標本の吸収率を405nm で測定する。40 5nm での吸収率の減少としてプラスミン又はトリプシン活性を測定する。結果から、見かけの阻害定数Kiを計算する。例６ヒトトロンビン、ヒト第ＸＡ因子及びヒト第VIIＡ因子／組織因子の複合体のアミド分解活性に対する組換え型TFPI−２の効果Ａ．トロンビンアミド分解活性検定ヒトトロンビンのアミド分解活性を阻害する組換え型TFPI−２の能力を、ヒトトロンビン（本書にその全体が参考として内含されているPedersen et al., J. Biol． Chem． 265 ：16786-16793, 1990;により記述されている通りに調製されたもの）及びさまざまな濃度の組換え型TFPI−２を用いた比色分析検定により決定した。検定は、マイクロタイタープレートフォーマットで進められた。マイクロタイタープレートのウェルの中で 200μｌの反応を準備した。反応混合物は、50mMのトリス−HCl(pH7.5)，0.1％のBSA,５mMのCaCl₂ 中にさまざまな濃度の組換え型TFPI−２及び20nMのヒトトロンビンを含んでいた。反応を15分間37℃ でインキュベートした。インキュベーションの後、各ウェルに対して50μｌの10mMの色素産生基質Ｓ−2238 （H-D-Phe-Pir-Arg-p-ニトロアニリド、Chromogenix, 置(UVMAX型、Malecular Devices)の中で405nm での吸収率を決定した。組換え型 TFPI−２は、Ｓ−2238に向かうヒトトロンビンのアミド分解活性に対しいかなる影響ももたないことが示された。Ｂ．ヒト第Ｘａ因子アミド分解検定第Ｘａ因子のアミド分解活性を阻害する組換え型TFPI−２の能力は、上述の20 nMのヒトトロンビンの代りに、20nMのヒト第Ｘａ因子（本書にその全体が参考として内含されているKondo and KisielのBlood 70，1947-1954，1987 によって記述されている通りに調製されたもの）を用いて、上述の通りの比色分析によって決定された。反応は、ヒトトロンビンをヒト第Ｘａ因子で置換して、前述の通りに進められ、インキュベートされた。動的マイクロプレート読取装置(UVMAX型、Malecular Devices)の中で405nm での吸収率を決定した。組換え型TFPI−２は、用量依存的要領で、色素産生基質Ｓ−2222に向かっての20nMの第Ｘａ因子のアミド分解活性をわずかに阻害することが示された。Ｃ．ヒト第VIIａ因子／組織因子のアミド分解検定第VIIａ因子／組織因子の複合体のアミド分解活性を阻害する組換え型TFPI− ２の能力は、上述の20nMのヒトトロンビンの代りに、Peter Wildgoose(Novo Nor disk A／S，Bagsvaerd，Denmark)により提供された20nMの組換え型ヒト第VIIａ因子（本書にその全体が参考として内含されているPedersen et al.，Biochemis try （生化学）28：9331-9336，1989により記述される通りに調製されたもの）及びGordon Vehar(Genentech Inc.，South San Francisco，CA)により提供された219 アミノ酸の細胞外ドメインから成る70nMの組換え型切形ヒト組織因子アポタンパク(TF_1-219)（本書にその全体が参考として内含されている Paborsky et al，J．Biol．Chem．266：21911-21916，1991 により記述されている通りに調製されたもの）を用いて比色検定により決定された。検定は、ヒトトロンビンをヒト第VIIａ因子及びTF_1-219 で置換えて、上述のとおりに進められ、インキュベートされた。インキュベーションの後、各ウェルに対し、50μｌの10mMの色素産生基質Ｓ−2288（H-D-Ile-Pro-Arg-p-ニトロアニリド、Chromogenix，AB)を付加した。動的マイクロプレート読取装置(UVMAX型、Mole cular Devices)の中で405nm での吸収率を決定した。組換え型TFPI−２は、用量依存的要領で色素産生基質Ｓ−2288に向かう20nMの第VIIａ因子−組織因子のアミド分解活性を阻害するものであることが示された。例７アミノ酸配列分析オンラインフェニルチオヒダントイン分析装置の備わった気体蒸気シークエネーター(Beckman Instruments; LF3000型又はそれと類似のもの)の中で、自動アミノ酸配列決定を実施した。シークエネーターと共に供給されたSYSTEM GOLD ソフトウェアを用いて、フェニルチオヒダントインピークを積分した。約100 ピコモルのタンパク質を配列分析に付した。組換え型TFPI−２の単一の調製物のアミノ末端アミノ酸配列分析は、Asp-Ala-Ala-Gln-Glu-Pro-Thr-Gly-Asn-Asn（配列番号12）の主要配列（−70％）とAla--Gln-Glu-Pro-Thr-Gly-Asn-Asn（配列番号 13）の副次的配列（−30％）を示し、このことは、シグナルペプチダーゼによる代替的な分割部位又は精製中のエキソペプチダーゼによるアミノ末端分解の可能性のいずれかを示唆している。上述のことから、例示を目的として本書では本発明の特定の実施態様について記述してきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなくさまざまな修正を加えることができる、ということがわかるだろう。従って、本発明は、添付のクレームのみによって制限されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 9358−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 15/02 9453−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｐ 21/02 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ｃ 21/08 9281−4Ｂ 5/00 ＢＣ１２Ｑ 1/68 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/64 ＡＣＢ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者カイジール，ウォルトアメリカ合衆国，ニューメキシコ 87111, アルバカーキ，ラサラデスエステノースイースト 3420 (72)発明者フォスター，ドナルドシー. アメリカ合衆国，ワシントン 98115，シアトル，ノースイーストワンハンドレッドエイティーファーストストリート 3002

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトKunitz型阻害物質をコードするDNA セグメントを含む分離されたDNA 分子において、このKunitz型阻害物質には、各Ｘaaが個々にシステイン以外のいずれかのアミノ酸である配列番号15のアミノ酸配列が含まれている、分離された DNA 分子。２．前記DNA セグメントには、メチオニン、アミノ酸１からフェニルアラニン、アミノ酸番号235 までの配列番号２のアミノ酸配列；グルタミン酸、アミノ酸番号34からイソロイシン、アミノ酸番号89までの配列番号２のアミノ酸配列；グルタミン酸、アミノ酸番号34からリシン、アミノ酸152 までの配列番号２のアミノ酸配列又は、グルタミン酸、アミノ酸番号34からアラニン、アミノ酸番号211 までの配列番号２のアミノ酸配列が含まれている、請求の範囲第１項に記載の分離されたDNA 分子。３．前記DNA セグメントには、１〜165 までの配列番号14のヌクレオチド配列が含まれており、各々のヌクレオチドトリプレット１〜３，４〜６，160 〜162 及び163 〜165 が個々にシステイン以外のいずれかのアミノ酸をコードする、請求の範囲第１項に記載の分離されたDNA 分子。４．前記DNA セグメントには、ヌクレオチド39からヌクレオチド743 までの配列番号１のヌクレオチド配列、ヌクレオチド138 からヌクレオチド305 までの配列番号１のヌクレオチド配列、ヌクレオチド138 からヌクレオチド493 までの配列番号１のヌクレオチド配列又はヌクレオチド138 からヌクレオチド671 までの配列番号１のヌクレオチド配列が含まれている、請求の範囲第３項に記載の分離されたDNA 分子。５．第１のDNA セグメントの発現のために必要とされる付加的な DNA セグメントに対し作動的に連鎖されたヒトKunitz型阻害物質をコードする第１のDNA セグメントを含んで成るDNA 構成体において、前記Kunitz型阻害物質には、各々のＸaaが個々にシステイン以外のいずれかのアミノ酸である配列番号15 のアミノ酸配列が含まれている、DNA 構成体。６．前記第１のDNA セグメントには、メチニオン、アミノ酸１からフェニルアラニン、アミノ酸番号235 までの配列番号２のアミノ酸配列、グルタミン酸、アミノ酸番号34からイソロイシン、アミノ酸番号89までの配列番号２のアミノ酸配列、グルタミン酸、アミノ酸番号34からリシン、アミノ酸152 までの配列番号２のアミノ酸配列又は、グルタミン酸、アミノ酸番号34からアラニン、アミノ酸番号211 までの配列番号２のアミノ酸配列が含まれている、請求の範囲第５項に記載のDNA 構成体。７．前記第１のDNA セグメントが１〜165 の配列番号14のヌクレオチド配列を含んでおり、各ヌクレオチドトリプレット１〜３，４〜６，160 〜162 及び163 〜165 が個々にシステインを除くいずれかのアミノ酸をコードする、請求の範囲第５項に記載のDNA 構成体。８．前記第１のDNA セグメントには、ヌクレオチド39からヌクレオチド743 までの配列番号１のヌクレオチド配列、ヌクレオチド138 からヌクレオチド305 までの配列番号１のヌクレオチド配列、ヌクレオチド138 からヌクレオチド493 までの配列番号１のヌクレオチド配列又はヌクレオチド138 からヌクレオチド671 までの配列番号１のヌクレオチド配列が含まれている、請求の範囲第５項に記載のDNA 構成体。９．第１のDNA セグメントの発現のために必要とされる付加的なDNA セグメントに作動的に連鎖された、ヒトKunitz型阻害物質をコードする第１のDNA セグメントを含むDNA 構成体を含む宿主細胞において、前記 Kunitz型阻害物質には、各Ｘaaが個々にシステイン以外のいずれかのアミノ酸である配列番号15のアミノ酸配列が含まれている、宿主。 10．前記第１のDNA セグメントには、メチオニン、アミノ酸１からフェニルアラニン、アミノ酸番号235 までの配列番号２のアミノ酸配列；グルタミン酸、アミノ酸番号34からイソロイシン、アミノ酸番号89までの配列番号２のアミノ酸配列；グルタミン酸、アミノ酸番号34からリシン、アミノ酸152 までの配列番号２のアミノ酸配列又は、グルタミン酸、アミノ酸番号34からアラニン、アミノ酸番号211 までの配列番号２のアミノ酸配列が含まれている、請求の範囲第９項に記載の宿主細胞。 11．前記第１のDNA セグメントは、１〜165 までの配列番号14のヌクレオチド配列が含まれており、各々のヌクレオチドトリプレット１〜３，４〜６，160 〜 162 及び163 〜165 が個々にシステイン以外のいずれかのアミノ酸をコードする、請求の範囲第９項に記載の宿主細胞。 12．前記第１のDNA セグメントには、ヌクレオチド39からヌクレオチド743 までの配列番号１のヌクレオチド配列、ヌクレオチド138 からヌクレオチド305 までの配列番号１のヌクレオチド配列、ヌクレオチド138 からヌクレオチド493 までの配列番号１のヌクレオチド配列又はヌクレオチド138 からヌクレオチド671 までの配列番号１のヌクレオチド配列が含まれている、請求の範囲第９項に記載の宿主。 13．ヒトKunitz型阻害物質を産生するための方法において、 Kunitz型阻害物質が、各Ｘaaが個々にシステイン以外のいずれかのアミノ酸を含んでいる配列番号15のアミノ酸配列を含む、第１の DNA セグメントの発現のために必要とされる付加的なDNA セグメントに作動的に連鎖されたヒトKunitz型阻害物質をコードする第１のDNA セグメントを含んで成るDNA 構成体を収容する宿主を培養する段階；及び前記Kunitz型阻害物質を分離する段階、を含んで成る方法。 14．前記第１のDNA セグメントには、メチオニン、アミノ酸１からフェニルアラニン、アミノ酸番号235 までの配列番号２のアミノ酸配列；グルタミン酸、アミノ酸番号34からイソロイシン、アミノ酸番号89までの配列番号２のアミノ酸配列；グルタミン酸、アミノ酸番号34からリシン、アミノ酸152 までの配列番号２のアミノ酸配列又は、グルタミン酸、アミノ酸番号34からアラニン、アミノ酸番号211 までの配列番号２のアミノ酸配列が含まれている、請求の範囲第13項に記載のヒトKunitz型阻害物質の産生方法。 15．前記第１のDNA セグメントには、１〜165 までの配列番号14のヌクレオチド配列が含まれており、各々のヌクレオチドトリプレット１〜３，４〜６，160 〜162 及び163 〜165 が個々にシステイン以外のいずれかのアミノ酸をコードする、請求の範囲第13項に記載のヒトKunitz型阻害物質の産生方法。 16．前記第１のDNA セグメントには、ヌクレオチド39からヌクレオチド743 までの配列番号１のヌクレオチド配列、ヌクレオチド138 からヌクレオチド305 までの配列番号１のヌクレオチド配列、ヌクレオチド138 からヌクレオチド493 までの配列番号１のヌクレオチド配列又はヌクレオチド138 からヌクレオチド671 までの配列番号１のヌクレオチド配列が含まれている、請求の範囲第13項に記載のヒトKunitz型阻害物質の産生方法。 17．各Ｘaaが個々にシステイン以外のいずれかのアミノ酸である配列番号15のアミノ酸配列を含むカルボキシ末端とアミノ末端を有する分離されたヒトKunitz型阻害物質。 18．前記阻害物質には、メチオニン、アミノ酸１からフェニルアラニン、アミノ酸番号235 までの配列番号２のアミノ酸配列；グルタミン酸、アミノ酸番号34 からイソロイシン、アミノ酸番号89までの配列番号２のアミノ酸配列；グルタミン酸、アミノ酸番号34からリシン、アミノ酸152 までの配列番号２のアミノ酸配列又は、グルタミン酸、アミノ酸番号34からアラニン、アミノ酸番号211 までの配列番号２のアミノ酸配列が含まれている、請求の範囲第17項に記載の分離されたヒトKunitz型阻害物質。 19．さらに、配列番号12と配列番号13のアミノ酸配列をそのアミノ末端に含んでいる、請求の範囲第17項に記載の分離されたヒトKunitz型阻害物質。 20．薬学的に受容可能な担体又はビヒクルと組合わせた形で請求の範囲第17項に記載のヒトKunitz型阻害物質を含む薬学組成物。 21．前記Kunitz型阻害物質には、メチオニン、アミノ酸１からフェニルアラニン、アミノ酸番号235 までの配列番号２のアミノ酸配列；グルタミン酸、アミノ酸番号34からイソロイシン、アミノ酸番号89までの配列番号２のアミノ酸配列；グルタミン酸、アミノ酸番号34からリシン、アミノ酸152 までの配列番号２のアミノ酸配列又は、グルタミン酸、アミノ酸番号34からアラニン、アミノ酸番号21 1 までの配列番号２のアミノ酸配列が含まれている、請求の範囲第20項に記載の薬学組成物。 22．前記ヒトKunitz型阻害物質がさらに、配列番号12と配列番号13のアミノ酸配列をそのアミノ末端に含んでいる、請求の範囲第20項に記載の薬学組成物。 23．各Ｘaaが個々にシステイン以外のいずれかのアミノ酸である配列番号15のアミノ酸配列を含むヒトKunitz型阻害物質に特異的に結合する分離された抗体。 24．モノクローナル抗体である、請求の範囲第23項に記載の分離された抗体。 25．各Ｘaaが個々にシステイン以外のいずれかのアミノ酸である配列番号15のアミノ酸配列を含むヒトKunitz型阻害物質に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。 26．配列番号１のヌクレオチド配列、配列番号１のヌクレオチド変異体又は配列番号１又はその変異体に相補的なDNA 配列をコードするDNA セグメントを含むヒトKunitz阻害物質をコードする核酸とハイブリット形成できる、少なくと12個のヌクレオチドのプローブ。 27．プラスミドＪ−２−11／pUc19(ATCC 受入番号69425)を含むE．coli 宿主細胞。 28．血液凝固を阻害するのに充分な量で請求の範囲第17項に記載のヒトKunitz 阻害物質を投与することを含んで成る哺乳動物の体内での血液凝固を阻害する方法。 29．Kunitz型阻害物質には、メチオニン、アミノ酸１からフェニルアラニン、アミノ酸番号235 までの配列番号２のアミノ酸配列；グルタミン酸、アミノ酸番号34からイソロイシン、アミノ酸番号89までの配列番号２のアミノ酸配列；グルタミン酸、アミノ酸番号34からリシン、アミノ酸152 までの配列番号２のアミノ酸配列又は、グルタミン酸、アミノ酸配列34からアラニン、アミノ酸番号211 までの配列番号２のアミノ酸配列が含まれている、請求の範囲第28項に記載の哺乳動物の体内での血液凝固を阻害する方法。 30．前記Kunitz型阻害物質が、配列番号12又は配列番号13のアミノ酸配列をそのアミノ末端にさらに含んでいる、請求の範囲第28項に記載の哺乳動物の体内での血液凝固を阻害する方法。