JPH0232099A - 抗血液凝固作用を有するポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒト胎盤を始めとするヒト組織より得られる
抗血液凝固物質（以下、ＣＰＢｌｌと称する）と同様の
抗血液凝固活性を存するポリベブチド、該ポリペプチド
をコードするＤＮＡ　、該ＤＮＡを含む組換えベクター
、該組換えベクターを保持する形質転換体細胞、該ポリ
ペプチドを有効成分とする抗血液凝固剤および該ポリペ
プチドの製造法に関する。

（従来の技術〕 従来、抗血液凝固物質としてはヘパリン、ヘパリンコフ
ァクター−ＩＮ　、アンチトロンビン−ＩＩ＋、α２−
マクログロブリン、α１−トリプシンインヒビター、Ｃ
Ｉ−エステラーゼインヒビター、プロティンＣ等が知ら
れているが、実用に供されているのはヘパリンのみであ
る。しかしヘパリンには出血傾向を招く副作用があるた
め、その使用方法及び使用量が極めて限定されており、
抗血液凝固剤としては安全性の面から満足すべきもので
はなかった。

斯かる状況の下で本出願人は、先にヒト胎盤からＣＰＢ
ＩＩを分離精製することに成功し、特許出願した（特願
昭８１−２４３７７８号）。

ＣＰＢＴＩは、下記の性質を有する医薬と１ノて有用な
物質である。

■　分子量（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法、還元状態） ７３．０００±２，０００ ■　等電点（アンフオライトを用いる等電点カラム電気
泳動法） ６．２〜６．６ ■　安定性 仁　５０℃、３０分加熱処理で失活 口、　　ｐＨ５，５〜８．５で安定（３７℃）八、血漿
中３７℃、１５分で安定 ■　作用 仁　カルシウム再加凝固時間を延長 口、　プロトロンビン時間を延長 八、活性化部分トロンボプラスチン時間を延長 ■　アミノ酸分析 アミノ酸分析で、アスパラギン酸、スレオニン、セリン
、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、シス
チン、バリン、メチオニン、インロイシン、ロイシン、
チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リジン及び
アルギニンの存在が認められる。

さらに本出願人は、　ＣＰＢＩＩに特異的な千ツクロー
ナル抗体を作成し、特許出願した（特願昭６３−８６７
５３号）、このモノクローナル抗体を利用することによ
り、ＣＰＢＩＩの高感度検出、精製等を行うことができ
る。

（発明が解決しようとする課題） しかしながら現在ＣＰＢＩ＋を得るためにはヒト胎盤を
始めとしたヒト組織を原材料とする必要があることから
、いくつかの問題があフた。すなわちヒト組織中より得
られる　ＣＰＢＩＩの量には限りがあること、原材料で
あるヒト組織の入手には困難が伴い、安定して供給する
ことは難しいこと、ヒト組織中に存在し得る病原ウィル
スの危険性が無視できないこと等である。

従って、より安価に、より大量に、より安定して、かつ
、より安全にＣＰＢＩＩ又はこれと同様な作用を有する
物質を供給する方法の開発が望まれていた。

（課題を解決するための手段〕 本発明者らは、こねらの問題点を解決すべく鋭意研究を
重ねた結果、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーより　ＣＰ
ＢＩ！特異的抗体をプローブどして利用することにより
　ＣＰＢＩ＋ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片が得
られること、更にこのＤＮＡ断片を組み込んだ組換えベ
クターを用いて微生物細胞を形質転換し、ＣＰＢ１１遺
伝子を発現させることにより　ＣＰＢ１１様ポリペプチ
ドが製造できることを見い出し、本発明を完成した。

本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ　、組換えベ
クター、形質転換体細胞は、例えば次の如くして製造さ
れる。

すなわち、（１）ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーより　
ＣＰＢＩＩ特異的抗体を用いて抗体陽性クローンなスク
リーニングし、（２）単離された抗体陽性クローンより
組換えＤＮＡを調製し、この組換えＤＮＡよりｅＤＮＡ
断片を制限酵素処理によって切出し、プラスミドベクタ
ーに組込む。（３）得られたｃＤＮＡ組換えベクターに
より宿主細胞を形質転換し、本発明の形質転換体細胞を
得る。得られた未発明形質転換体細胞を培養し、菌体中
より本発明ＤＮＡ断片を含む本発明の組換えベクターを
得る。更に得られた組換えベクターを適当な制限酵素で
切断し、本発明のＤＮＡ断片を得る。

次に上記各工程について更に詳しく説明する。

（１）ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーより抗体陽性クロ
ーンのスクリーニング。

ｃＤＮＡライブラリーはヒト胎盤よりｍＲＮＡを調製し
、逆転写５Ｐ素と適当なベクターを用いて作成する事が
できるが、市販のｅＤＮＡライブラリー、例えばクロン
チック社製ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（λｇｔｌｌ
）を利用する事ができる。

λｇｔｔｘをベクターとして作成されたｃＤＮＡライブ
ラリーは特異抗体をプローブとしてヤングとデイヴイス
の方法（）Ｉｕｙｎｈ、　Ｔ、Ｖ、、Ｙｏｕｎｇ。

Ｒ，Ａ、ａｎｄ　　Ｄａｖｉｓ、Ｒ，Ｗ、（１９８５）
Ｉｎ　　：　　ＤＮＡ　　ＣＩｏｎ−１−９」≦　　：
　　八　ＰｒａｃｔＬｃａｌ　　Ａｐｐｒｏａｃｈ、　
　　ｖｏｌ、１．（Ｄ、Ｍ。

Ｇｌｏｖｅｒ、ｅｄ、ｌ、ｐｐ４９−７８．　　ｒｕｎ
、Ｐｒｅｓｓ。０ｘｆｏｒｄ、）を応用してスクリーニ
ングに付し、特異抗体陽性クローンを単離する事ができ
る。

プローブとして用いる一次抗体としては、ＣＰＢＩ！特
異抗体、例えば、抗ＣＰＢ１１ウサギポリクローナル抗
体、抗ＣＰＢ！Ｉマクスポリクローナル抗体、抗ＣＰＢ
１１モノクローナル抗体を用いる事が出来るが、就中抗
ＣＰＢＩＩモノクローナル抗体、特に抗ＣＰＢＩ！マウ
スモノクローナル抗体が好ましい。抗体は、血清、腹水
、細胞培養液、精製イムノグロブリン、いずれの状態で
も使用できる。

抗原と結合した一次抗体の検出には、放射性ヨード（１
２ｓＩ）ラベルしたプロティンＡ、放射性ヨード（＋２
５Ｉ）ラベルした抗イムノグロブリン抗体を用いてオー
トラジオグラフィーにより行う方法、パーオキシダーゼ
ラベルした抗イムノグロブリン抗体、又はアルカリ性フ
ォスファターゼラベルした抗イムノグロブリン抗体を用
いて酵素抗体法により行う方法を利用する事が出来る。

なお、抗ＣＰＢ１１モノクローナル抗体は、例えばケー
ラーとミルスタインの報告（Ｎａｔｕｒｅ。

２５［ｉ％、　４９５〜４９７頁、　１９７５年）に記
載の方法によって製造することができる。すなわち、ヒ
ト胎盤より抽出、精製したＣＰＢＩＴでマウスを免疫し
、該マウスより牌細胞を採取し、これとマウス骨髄腫細
胞を細胞融合させる。融合処理を施した細胞なＩＩ　Ａ
　Ｔ選択培地を用いて培養し、ハイブリドーマのみを増
殖させる。ハイブリドーマが増殖した培養液に対してＣ
ＰＢＩＴを抗原として酵素抗体法によりスクリーニング
を行い、　　ＣＰＢｌｌに特異的なモノクローナル抗体
を生産するバイプリドーマを得た。得られたハイブリド
ーマを培養した培養液又は接種したマウスの腹水からモ
ノクローナル抗体が得られる。

（２）　　ＣＰＢＩＩ　ｃＤＮＡ組換えベクターの作成
単離された抗体陽性クローンよりヤングとデイヴイスの
方法（Ｈｕｙｎｈ、　Ｔ、Ｖ、、　Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ。

Ａ、　ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ、　Ｒ，Ｗ、（１９８５）Ｉ
ｎ　：　ＤＮＡ　ＣＩｏｎ−鵬：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃ
ａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、　ｖｏｌ、１．（Ｄ、Ｍ。

Ｇｌｏｖｅｒ、ｅｄ、）、ｐｐ４９−７８．　ＩＲＬ　
Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、）により組換えλｇｔｌ
ｌファージＤＮＡを抽出精製する。精製された組換えλ
ｇｔｌｌファージＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化す
る事によりｃＤＮＡをベクターＤＮＡより分離する事が
出来る。得られたｃＤＮＡを同じ＜ＥｃｏＲＩ消化した
種々のクロニング用プラスミドベクターと再結合し、組
換えプラスミドベクターを作成する。利用出来るプラス
ミドベクターとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ
３２５、ｐｌ、Ｉ（：１８　、　ｐｌＪｃ１１８、ｐＴ
Ｚ１８Ｒなどが挙げられる。

（３）　　ＣＰＢ　ＩＩ　ｃＤＮＡ組換えベクターによ
る宿主細胞の形質転換、本発明組換えベクターおよび本
発明ＤＮＡの調製。

得られたＣＰＢＩＩｃＤＮＡ組換えベクターをその組換
えベクターの持つ遺伝子マーカーをａ犬限に利用できる
種々の宿主細胞に導入し、該宿主細胞を形質転換せしめ
る。宿主細胞としては、大ＩＩＭ菌が好ましく、Ｅ、ｅ
ｏｌｉ　：　Ｋ１２株の種々の変異株、例えば）ＩＢＩ
ＯＩ　、Ｃ６００Ｋ　。

ＪＭＩＯＩ　、ＪＭ１０５　、　χ１７７６、ＭＶ１３
０４などが利用でき、組換えベクターの導入にはカルシ
ウム処理によるコンピテント細胞法などが用いられる。

形質転換細胞をベクターの遺伝子マーカーに応じた涜択
培地中で培養し、菌体中から本発明の組換えベクターが
採取される。

又、ｐｃ１１１８、ｐＴ７：１８Ｒをベクターとして用
いた場合、得られた組換えベクターを保持する形質転換
体大腸菌にヘルパーファージＭ１３に０７を感染させる
事により一本鎖ＤＮＡを調製する事ができる。得られた
一木ｆｉ　ＤＮＡは、ジデオキシシーケンス法（Ｓａｎ
ｇｅｒ、　Ｆ、　、　Ｎ１ｅｋｌｅｎ。

Ｓ、　　ａｎｄ　Ｃｏｕｌｓｏｎ、　Ａ、Ｒ，ＤＮＡ　
ｓｅｎｑｕｅｎＣｉｎｇｗｉｔｈ　　ｃｈａｉｎ　　ｔ
ｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ　　１ｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、　　
ＰｒｏｃＮａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅ１．　ＵＳＡ、
７４，５４［１３−５４６７４９７７）によりＤＮＡ塩
基配列を決定する事がで参る。

その塩基配列のうち、本発明で目的とするポリペプチド
をコードする部分の塩基配列は例えば第２図の通りであ
る。

本発明のＤＮＡ断片は、前記アミノ酸配列をコードする
能力を有すれば、上記の塩基配列には限定されるもので
はない。また本発明の組換えベクターも、前記アミノ酸
配列をコードする塩基配列を有し、かつ複製可能であわ
ば、大腸菌由来、枯草菌由来、酵母由来等いずれのベク
ターとの組換えでもよい。

本発明ポリペプチドは、前記本発明組換えベクターを保
持する形質転換細胞を培養し、その培養物から採取、製
造することができる。しかし、本発明ポリペプチドを効
率よく生産するためには、転写の下流方向へ順に次の■
〜■の塩基配列、 ■　プロモーターどして作用する塩基配列■　リポソー
ム結合部位である塩基配列■　開始コドンである塩基配
列 ■　本発明ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩
基配列 ■　終止コドンである塩基配列 ■　転写ターミネータ−として作用する塩基配列 を含む発現用組換えベクターを構築し、これを用いて宿
主細胞を形質転換することが好ましい。

このような発現用組換えベクターを得るためのベクター
の宿主としては、細束のごとき単細胞微生物、特に大腸
菌（Ｅ、ｅｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）
　、ストレプトミセス（５ｔｒｅｐｔｏＩＩｌｙｃｅｓ
）が好ましい。大腸菌を宿主とした場合には、Ｅ、ｃｏ
ｌｉ　Ｋ１２株の種々の変異株、例えばＨＢＩＯＩ　、
　（：６００に、　ＪＭＩＯＩ、ＪＭ１０５　、　ＪＭ
１０９　、Ｚ　１７７６、ＭＶ１３０４などが利用でき
る。

ベクターとして利用するＤＮＡは、プラスミドが好まし
い。例えば、大腸菌を宿主とした場合、プラスミドＤＮ
Ａは、大腸菌１１ＩＩ胞中にてプラスミドが増殖する為
に必要なりＮＡ配列、例えば（：ｏｌＥ１系のプラスミ
ドの複製起点のＤＮＡ配列を有し、更にプロモーター、
転写ターミネータ−として働＜　ＤＮＡ配列を有し、更
に好ましくは形質転換大腸菌の選択マーカーとなる遺伝
子を鳴む。プロモーターとしては、例えばλＰＬ、　ｌ
ａｃ　、　ｔｒｐ　、　ｔａｃ　、　ｔｒｃ、１１１１
１などのプロモーターが、転写ターミネータ−としては
、例えばｒｒｎｔ＋リボゾーマルＩＩＮＡ転写ターミネ
ータ−などが挙げらねる。選択マーカー遺伝子どしては
アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テ
トラザイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性
遺伝子などが挙げられ、これらの遺伝子の１　ｆｌまた
は２種以上が用いられる。

上記ベクターに、本発明ポリペプチドのアミノ酸配列を
コードし得る塩基配列を有するＤＮＡ　、すなわち本発
明ＤＮＡ断片を組み込むには、こわを含むＤＮＡを適当
な制限酵素で切断し、必要であれば適当なリンカ−を付
加した後、適当な制限酵素で切断したベクターと結合さ
せることにより行わわる。用いられる制限酵素としては
、例えばＥｃｏＲＩ　、　　５ｐｈＩ　。

Ｐｓｔ　Ｉ　　、　旧ｎ　ｄ　ＩＩＩ　、　ＢａｍＨＩ
　　、　　Ｘｈｏ　Ｉ　　、　　Ｘｂａ　Ｉ　　、Ｂａ
ｎ１ｌｌ　、　　Ｓｍａ　Ｉ、　Ｎｃｏ　Ｉなどが挙げ
られる。

エキソヌクレアーゼＩｌｌ、　Ｂａ１３１　、　ＳＲヌ
クレアーゼ、エキソヌクレアーゼ■、ムングビーンヌク
レアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ■などの核酸修飾酵素も
利用できる。用いられるリンカ−どしては、ＥｃｏＲＩ
リンカ−Ｓｍａ　Ｉリンカ−１Ｎｃｏ　Ｉリンカ−Ｂａ
ｍＨＩリンカ−Ｘｈｏ　Ｉリンカ−５Ｂ　ｉ　ｎ　ｄＩ
Ｉ＋ＩＩＩ−Ｐｓｔ　Ｉリンカ−Ｓｐｈ　ｘリンカ−Ｘ
ｂａ　Ｉリンカ−などが利用できる。

得られた発現用組換えベクターをコンピテント細胞法、
プロトプラスト法、カルシウム共沈法、電気パルス法な
どを用いて宿主細胞に導入すれば、本発明ポリペプチド
を効率的に生産する能力を有する形質転換体細胞が得ら
れる。

本発明ポリペプチドは、得られた形質転換体細胞を培養
し、該培養細胞及び／又は蛸養液から抽出、分離するこ
とにより製造される。

形質転換体細胞の培養に際しては、種々の天然培地、合
成培地が用いられる。培地は、糖類、アルコール類、有
機酸塩などの炭素源；蛋白質混合物、アミノ酸類、アン
干ニウム塩などの窒素源；無機塩類を含Ａ７でいる事が
望ましい。更に、ビタミン類、選択マーカー遺伝子に対
応した抗生物質類を添加する事が望まれる８発現の制御
が可能なベクターであれば、培養途中で遺伝子発現を銹
導する操作を加える必要がある。培養後、遠心ＩＡ理を
行い培養液と培養細胞とに分別する。本発明ポリペプチ
ドが培養細胞中に蓄積する様な場合には、例えば凍結融
解、超音波処理、フｌノンチブレス、酵素処理、ホモジ
ナイザーなどを用いて細胞を破壊した後に、例えばＥＣ
Ｔ八、界面活性剤、尿素、塩酸グアニジンなどを用いて
本発明ポリペプチドを可溶化する必要がある。

得られた本発明ポリペプチドを含む培養液又は培養細胞
抽出液を種々のカラムクロマトグラフィーに付すことに
より、精製された本発明ポリペプチドを得ることができ
る。カラムクロマトグラフィーとしては、イオン交換ク
ロマトグラフィー　アフィニティークロマＩ・グラフィ
ー　ゲルクロマトグラフィーを単独又は組合せて用いる
ことができる。

かくして得られた本発明ポリペプチドは、次の性質を有
する。

■　アミノ酸配列 本発明ＤＮＡ断片の塩基配列より翻訳される本発明ポリ
ペプチドのアミノ酸配列は第１図の如くであると判断さ
れる。

■　分子量 ７５．７００　（アミノ酸配列より推定）７３．０００
±２．０００　　（５０５−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法、還元状態） 本発明ポリペプチドを抗血液凝固剤の有効成分として使
用する場合の剤型としては、注射剤が挙げられる。注射
剤どしては、凍結乾燥粉末を用時、注射用蒸留水、生理
食塩水等に溶解して投与する形態が好ましい。投与部位
としては、静脈内が適当である。

投与量は疾患の重傷度、患者の体重等により異なるが、
通常１０　ｕ　ｇ　〜１０　ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙである
ことが好ましい。尚、本発明ポリペプチドは、上記投与
量の範囲内においては全く異常が認められず、安全であ
る。

（発明の効果） 本発明ポリペプチドは、強力な抗血液凝固活性を示すこ
とから、これを有効成分として含有する抗血液凝固剤は
、血液凝固活性先進に起因する種々の疾患、例えば脳梗
塞、心筋梗塞等の脳、心臓、末梢血管における血栓症あ
るいはＤＩＧ　（播種性向管内凝固）等の予防及び治僚
に有用である。

また、本発明ポリペプチドは、ヒト胎盤由来の抗血液凝
固物質（ＣＰＢｌｌ）と同様の性質を有することから、
ヒトに対し抗原性を有さない安全な物質である。さらに
、　ＣＰＢＩＩは抗血液凝固剤として有用であるにもか
かわらず、ヒト胎盤の入手の困難性等から大量に生産す
ることができないという欠点があったが、本発明ポリペ
プチドは大量かつ安価に製造できるものである。

〔実施例〕

次に参考例および実施例を挙げて本発明を説明する。

参考例１ 抗ＣＰＢ１１モノクローナル抗体の調製：（１）抗原（
ＣＰＢＩりの精製 （１）ヒト胎盤５個（約２５００ｇ　）より、膜等を除
去し、生理食塩水で充分洗浄後ミンチする。これに５０
＋ｌ１Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐｌ（７，４）２ｕを加
え、ワーリングブレンダーを用いて破砕し、次いで更に
、ポリトロン（Ｐｏ１ｙｔｒｏｎ）で磨砕する。得られ
たホモジネートを７．ＯＯＯｒｐｍｌ　５分間遠心分１
１５ｊｌ　ｌ、、沈渣を分取した。得られた沈漬に再度
５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（＋ｌＨ７，４）　２　ｎ
、を加え、ポリトロンでホモジナイズし、７．ＯＯＯｒ
ｐｍ１５分間遠心分離して洗浄沈漬を得た。この操作を
数回繰り返し、血液成分を除去して、洗浄沈渣約９００
ｇを得た。

（１１）（１）で得た沈渣９００ｇに、５０　ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡを含む５０ｍＭ）−リス−塩酸緩衝液（ｐｕ７．
４）を約２℃加え、ワーリングブレンダーでホモジナイ
ズする。このホモシネ−１−を４℃にて、−夜攪拌後７
．０００ｒｐｍ　１５分間遠心分離して、抽出液２Ｅ、
を得た。

（１１）（１１）で得た抽出液に固形硫安を加え、３５
％飽和とし、４℃で３０分〜数時間放置後、７，０００
ｒｐｃ＋１５分間遠心分離し上清を分取した。この上清
に更に硫安を加え、８５％飽和とし、４℃で２時間放置
した後７．０００ｒｐｍ　１５分間遠心分離し、沈渣を
分取した。得られた沈渣を２０ｍＭ１−リス−塩酸緩衝
液の少量に溶かし、同緩衝液に対し、４℃で一夜、充分
に透析した。透析中に生じた沈澱は、７，０００ｒｐｍ
１５分間遠心分離して除き、透析液３９０Ｉ１１．ｆｆ
を得た。

（ｉＶ）得られた透析液を、２０ＩＩ＋Ｍトリスー塩酸
綴４１液（ｐＨ７，４）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨバ
ール（φ５．５　ｘ　１９ｃｍ）に吸着させ、同緩衝液
にて充分洗浄した後、０〜０．３　Ｍ塩化ナトリウムを
含む同緩衝液４℃を用い、直線濃度勾配により１分画２
０ｍｆ！。

どなる様に溶出させた。活性画分は、はぼ０．２Ｍ塩化
すｌ・リウム濃度付近にて溶出され、２００ｍ！！、の
活性画分を得た。

（Ｖ）得られた活性画分をダイアフローメンブランフィ
ルタ−ＹＭ−１０を用いて濃縮した。

濃縮液をセファデックスＧ−１００を用いるゲルＩＰＡ
＜φ４．５　ｘ　７５ｃｍ）に付し、生理食塩水で１分
画８　　ａｉｌになるように溶出させ、活性画分７０〜
８２を集め、これを限外濾過により濃縮１ノで、　ＣＰ
ＢＩＩ　１４　　＋＋＋ｊ２（蛋白型ｉ５９．３ｍｇ、
　Ｌｏｗｒｙ法）を得た。

・（２）免疫牌細胞の調製 上述の如く精製したＣＰＢＩＩ　１　Ｏ０ｕｇをフロイ
ント・コンプリート・アジュバントに乳濁化させｎ＾Ｌ
　Ｂ　／　［：系マウスの腹腔内に投与した。

以後、２週間の間隔で５０ｕｇのＣＰＢｌｌとアジュバ
ント乳濁液を２回投与し、最後にＣＰＢｌｌ　５０ｕｇ
のみを投与し免疫を完了した。

３日後にマウスを殺し、牌臓を摘出、細断した後１００
メツシユのナイロン網で′１ＰＡし、牌臓の単離細胞を
得た。

（３）ハイプリドーマの調製 得られた免疫牌細胞に低張液（１５５ｍＭ塩化アンモニ
ウム）を加え赤血球を溶血した後ｌ５ｃｏｖｅ’ｓ　Ｍ
ｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｅｏ　ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ
（ＩＭＤＭ）で細胞を洗った。マウス＋髄腫細胞ＰＡＩ
はＩＭＤＭで２回洗った。両細胞数を計測し、牌細胞と
ＦＡＩ細胞の割合を５対１にして遠心した。上清を捨て
、細胞沈渣に融合用緩衝液（マンニトール０．２５Ｍ　
、　　Ｃａ１ｆ□０．１１１１Ｍ、　Ｍｇ（：ｕ　２０
．１ｍＭ、　ＴｒｌＳ−ＨＣＩ　０．２ｍＭ、　ｐＨ７
，２）を加えよく攪拌した後遠心する。この操作を２回
繰返した。細胞沈渣に融合用緩衝液を加え細胞密度を４
Ｘ１０’１０＋ｊ２に調製した。細胞融合装置（島津製
作所５５１１−１型）の電極間に１００〜２００　μ℃
滴下し、Ｉ　ＭＨｚ　。

４０　Ｖで１０秒間電圧をかけた後３００■、１／６０
秒で数回電気パルスをかけた。５分間静首した後ＩＭＤ
Ｍで電極間の細胞を洗い出し遠心管に移した後１，００
Ｏｒｐｍ８分間遠心した。

沈漬を１０％ＦＣ５添加ＩＭＤＭで浮遊し再度遠心して
上清を捨てた。

ヒボキサンチン　１０−’Ｍ、　　アミノプテリン　４
Ｘ１０−’Ｍ及びチミジン　　１，６×１０−’Ｍヲ加
エタ（）ＩＡＴ−）　１０　％ＦＣ５ｉ加ＩＭＤＭを用
い沈渣を４ｘｌＯ’／ｆｆ１ｎに再浮遊し、９６ウエル
マイクロプレートに１００μ℃ずつ分注した。３〜４日
ごと１こ培地５０μ！追加し、細胞の増殖を見た。

＋＋ＡＴ選択により、ハイブリドーマのみ増殖すること
を確認した。

（４）抗体産生ハイブリドーマの検索 ハイブリドーマが増殖したウェルの培養液を採取し酵素
免疫法により　ＣＰＩＩｌｌに対する抗体産生ハイブリ
ドーマを調べた。まず、９６ウエルマイクロプレート（
イムノプレートＩ、ヌンク社製）に　ＣＰＩ！１夏を０
１μｇ／１００μＩｌ／ウェル分注し、２５℃で１８時
間静置し吸着させる。次いで検体である培養液を１００
μ℃／ウェル注入し、２５℃で２時間反応させる。０．
０５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎ　）で３回洗浄後、ワサビパーオキシダ
ーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ　　（カベル社製）を１０
０μｐ／ウェル加え、２時間後ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３
回洗浄する。

これに　０．００１％過酸化水素、０．４　ｍｇ／ｒｎ
、Ｑオルトフェニレンジアミン（シグマ社製）の０．１
Ｍクエン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，０）を
加え、波長４９２０ｍの吸光度を測定した。

検体中、ＣＰＢｌｌに対する抗体が存在したウェルにの
み発色が観察されるので、発色したウェルの細胞を採取
した。

（５）　　ＣＰＢｌｌに対するモノクローナル抗体産生
細胞のクローニング マウスのＵ腔にＩＭＤＭを注射して採取した腹腔細胞を
フィーダー細胞として使用した。

１０％ＦＣ５添加ＩＭＤＭに浮遊した腹腔細胞（１×１
０５個／１ｆｌ）を９６ウエルマイクロプレートに１０
０μ℃ずつ分注した。翌日、抗体産生ハイブリドーマを
５個／ｍ、ｆｌに調製し、各ウェルに１００μ２ずつ分
注した。

３日ごとに培地を交換し適当な量まで細胞が増殖したウ
ェルから順に培養上清を採取し、上記と同一の方法によ
り、抗体産生を確認した。陽性のウェルは再度クローニ
ングし、抗ＣＰＢＩ＋モノクローナル抗体産生ハイプリ
ドーマを得た。これらのハイブリドーマは、４種類得ら
れ、それぞれ産生する抗ＣＰＢＩ！モノクローナル抗体
のｆ！順により、　ＣＰＢＩＩ−８２９、ＣＰＢｌｌ−
１（７６、ＣＰＢｌｌ　−８３１１、［：ＰＢ　ＩＩ　
−Ｈ５１１と命名した。

参考例２ 抗ＣＰＢＩ［モノクローナル抗体の調製ニア週令以上の
ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスにブリスタン（アルドリッチ社製
）０．５ｍｆ１．を腹腔内投与し、約１週間後、上記で
得たバイプリドーマｌＸｌ０’個／マウス腹腔内接種し
た。約１０日後、７２ス腹腔より腹水を採取した。これ
を３，０００ｒｐｍ、　　１０分間遠心分離し、上清を
分取しその５　＋ｎＱに硫酸アンモニウムを終濃度が５
０％飽和になるように加え、４℃で６０分間攪拌する。

次いで、１０，０００ｒｐｍ　、　２０分間遠心分離し
、沈漬を０．１Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）に溶か
し同緩衝液に対して透析した。

こわに等量の１．５Ｍグリシン−３Ｍ塩化すトリウム緩
衝液（ｐ１４８．９　）を加えた同緩衝液で平衡化した
Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　［：Ｌ−４
Ｂ　　（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィー
に付した。

モノクローナル抗体の溶出は、０．１　Ｍクエン酸緩衝
液（ｐＨ４）で行い、抗ＣＰＢ［！モノクローナル抗体
を得た。　ＣＰＤＩＩ−１１２９を用いた場合は、［’
：ＰＢ　ＬＩ　−Ａ２９　２２．２ｍｇ、　　ＣＰＢ　
Ｉ＋−１（７６を用いた場合は、　ＣＰＢＩＩ−Ａ７６
　７．８ｍｇ、　　ＣＰＢＩＩ　−Ｈ３１１を用いた場
合は、　ＣＰＢＩＩ　−Ａ３１１　１６ｎ＋ｇ、、ＣＰ
Ｂ１１−）１５１１を用いた場合はＣ［’ＢＩ＋−八５
１１へ　２９ｍｇをそれぞれ得た。

参考例３ 免疫吸着クロマトグラフィーによるＣＰＢＩＩの精製： （１）抗ＣＰＢ１１モノクローナル抗体の担体への結合 ブロムシアン活性化セファロース４Ｂ　（０，４ｇ）を
ｌｌ１１Ｍ塩酸、０．１ｍＭ重炭酸ナトリウム−０，５
Ｍ塩化す１−リウム（ｐｌ（８，３）緩衝液で順次洗浄
し、ブロムシアン活性化セファ０−ス４Ｂのカップリン
グ緩衝液（１，５ｎ＋、＋７．）溶液を調製した。

これに、精製モノクローナル抗体ＣＰＢＩＩＡ７６　２
ｍｇのカップリング緩衝ン夜（１ｍｌ１．）　ｍ液を加
え、室温で２時間振とうしグラスフィルターで脱水した
。更に、　０．１　Ｍ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，
０）　１０　　ｍ、９を加え、室温で２時間振とうし、
残った活性部位をブロックした。

得られた抗体結合セファロース４Ｂを、　０．１Ｍトリ
ス−塩酸−〇、５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（り８８．３
）、０．１Ｍ酢酸−０，５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐ
）１４．０　）で交互に３回洗浄し、０．１Ｍ　ｌ−リ
ス−塩酸緩衝液（ｐ）１７．４　）で平衡化し、抗体カ
ラム７６を得た。

（２）抗体カラムによるＣＰＢＩＩの精製上記で作成し
た抗体カラム７６に、参考例１−　（１）　−（ｉｉ　
＞　で得た粗ＣＰＢＩＩ溶液をかけ、平衡化に用いた緩
衝液で充分洗浄した。

ＣＰＢＩＩの溶出は、■０．１Ｍ酢酸−０，５Ｍ塩化ナ
ト・リウム緩衝液（ｐｌ（３，５）を用いる方法あるい
は、■０．２Ｍグリシンー塩酸Ｍ衝液（ｐ）１２．３　
）を用いる方法で行うことができる。

ＣＰＢｌｌは、素通り画分には認められず、溶出画分か
ら８０％以上の回収率で精製することができた。

［；ＰＢＩＩの測定は、参考例４の方法で行った。

参考例４ 抗ＣＰＢＩｊモノクローナル抗体を用いる　ＣＰＢＩＩ
の測定： Ｓ、コシタケらの方法（Ｊ、Ｂｉｏｅｈｅｍ、　！１２
．１４１３−１４２４．１９８２　）に準じてホースラ
デイツシュ（西洋わさび）ペルオキシダーゼ（以下ＨＲ
Ｐと略す）を、抗ＣＰＢＩ［モノクローナル抗体に結合
させた。このＨＲＰ標識抗ＣＰＩＩ１１モノクローナル
抗体を用いて、以下の如＜　　ＥＬＩＳＡ法によりＣＰ
Ｂｌｌの測定を行った。９６ウエル平底マイクロブレー
トの各ウェルに０．０５Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ９，８
）に溶解したモノクローナル抗体を１００μＬずつ添加
し、２５℃で２時間コーティングした。ＰＢＳ−Ｔｗｅ
ｅｎで洗浄後、試料の０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆｌ、
、２５　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　０．０５％Ｔｗｅｅｎ　
　　２　０　　　（ｐＨ７，４）　　緩衝ン夜溶ン夜　
１００　　μ　ｕを加えた。２５℃で一晩反応させた後
、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ＨＲＰ標識モノクロー
ナル抗体のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ希釈溶液を１００ｕｕ加
え、２５℃で２時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｃｎで
洗浄後、１００μｍの基質溶ン夜（オ゛ルトフエニレン
ジアミン　０．４ｍｇ／ｍ、Ｑおよび０．０１％過酸化
水素の０４１Ｍクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ５，０）を
添加し、２５℃で３０分間反応させた。　　４．５Ｍ硫
酸５０μｍを加えて反応を停止さぜた後、４９２ｎｍに
おける吸光度を測定した。その結果、コーティング用モ
ノクローナル抗体としてＣＰＢＩＩＡ２９を用い、標識
用子ツクローナル抗体としてＣＰＢＩＩＡ−７６、ＣＰ
ＢＩＩ　−Ａ３１１、ＣＰＢＩＮ−Ａ５１１を用いた場
合、及びコーティング用モノクローナル抗体として　Ｃ
ＰＢＴＩ　−Ａ３１１を用い、標識用モノクローナル抗
体として　ＣＰＢＩＩ−Ａ２ワ、　ＣＰＢ＋Ｉ−Ａ７６
を用いた場合には、１〜１００　ｎｇ／ｖｌの範囲のＣ
ＰＢＩＩを検出できる。

またコーティング用モノクローナル抗体として　ＣＰＢ
ｌｌ−Ａ２９を用い、標識用千ツクローナル抗体ど１ノ
で、ＣＰＢＩＩ　−Ａ３１１を用いた場合の検量線は、
極めて感度が高く、しかも良好な直線性を示した。

実施例１ 抗ＣＰＲＩ＋ポリクローナル抗体の調製：（１）ウサギ
抗血清の調製 参考例１にて作成したＣＰＢＩＩ　　０．８ｍｇをフロ
イント完全アジュバントに乳濁化させ、ウサギ（白色在
来種、雄性）の足四に投与した。

以後、２週間の間隔で０．８ｍｇのＣＰＩＩＩＩとアジ
ュバント乳濁液を２回投与し、最後に同玉のＣＰＢｌｌ
をフロイント不完全アジュバントに乳濁化さゼ、皮下投
与１ノ免疫を完了した。免疫の完了したウサギを全採血
し、８０ｍｕの血清を得た。　ＣＰＢｌｌを抗原として
オクタロニ法で本血清の抗体価を測定したところ、８倍
の抗体価が得られた。

（２）抗体の精製 （１）で得られた抗血清１３０ｍ１にヒト・アルブミン
溶液（４ｍｇ／ｎｆ１．）を２．５＋ｌ１４２加え、室
温・２時間放百後、１４，０００ｒｐＩｌｌ、１０分間
遠心し、抗ヒト・アルブミン抗体を吸収した。得られた
上清７８ｍｊｌに７８ｍｎのＰＢＳ（０，２！］％リン
酸二ナトリウム、０．０２％　リン酸−カリウム、０．
８％　食塩、０，０２％　塩化カリウム）を加え、更に
１５（３［Ｉｌｕの飽和硫安溶液を加えた。４℃で一晩
放置後、１０．ＯＯＯｒｐｍで１０分間遠心し、沈澱を
得た。得られた沈澱をＰＢＳに溶解し、充分量のＰＢＳ
に対しｒａ析した。得られた透析液を１０．００Ｏｒｐ
ｍで１０分間遠心したのち、ＰＢＳで平衡化したＰｒｏ
ｔｅｉｎＡ−セルロファインカラムに吸着させた。Ｐ　
Ｂ　Ｓで洗浄後、０．１５Ｍ食塩を含む０．１　Ｍグリ
シン−塩酸緩衝液（ｐ）１２．７　）で溶出、トリス溶
液でｐＨを中性に調製し、　Ｃａ１ｐｈｏｂｉｎｄｉｎ
　　（ｇ木ら、産婦血液１２　（１）　、４１〜４８．
１９８８　）を固定化したセファロースカラムを通過さ
せた。通過液にヒト胎盤より調製したりボコルチン画分
（旧ｑａｎｇら、Ｃｅ１ｌ、４６巻、１９１頁、１９８
６年）を加え４℃で一晩放置後、１５　、０００ｒｐＩ
１１で１０分間遠心し、抗リボコルチン抗体を吸収した
。遠心上清をＣＰＢｌｌを固定化したセファロースカラ
ムに吸着させ、ＰＢＳで洗浄後、０．１５Ｍ食塩を含む
０．１Ｍ　グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２，７）で溶出
、トリス溶液でｐＨを中性に調製した６溶出液を蒸溜水
に透析後、凍結乾燥し精製抗ＣＰＢＩＩポリクローナル
抗体１０．３ｍｇを得た。

実施例２゜ ＣＰＢＩＩ　ｃＤＮＡのクローニング：（１）ヒト胎盤
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング： ■　ｃＤＮＡライブラリー ヒト胎盤ｅＤＮＡライブラリーは、クロンチック社製（
Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　１ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎ
ｃ、）でλｇｔｌｌファージのＥｃｏＲＩ部位に平均１
．８ｋｌ＋のヒト胎盤ｍＲＮＡより逆転写酵素を用いて
作製されたｃＤＮＡがＥｃｏＲＩリンカ−を介して結合
されている。ライブラリーは、１．０Ｘ１０’個の独立
クローンより成る組換えλｇ目エファージである。

■　宿主大腸菌Ｙ１０９０　（八ｒｃｃ　３７１９７）
を使用し、アンピシリン（１００μｇ／ｌｎ、Ｑ）とマ
ルトースを含むＬＢ寒天平板（バクトドリブトンｘｏｇ
、バクトイーストエキストラク［・５ｇ、食塩５ｇ、マ
ルトース２ｇ、寒天１５ｇ、蒸溜水１ｋ、ｐＨ７゜５）
にストリークし、３７℃で一夜培養した。生じた単コロ
ニーをアンピシリン（１００μｓ／ｍ、１２）とマルト
ースを含むＬＢ培地（バクトドリブトン１０ｇ、バクト
イ−ストエキストラクト５ｇ、ｉｋｌＪＫ５ｇ５マルト
ース２ｇ、蒸溜水１　ｊ２．　ｐＨ７，５）に移植し、
３７℃で一夜振盪培養した。

■　ファージライブラリーの感染 ０．２ｍｕの宿主大腸菌ＹＩＯ！１０の一夜培養液とλ
、稀釈液（１０ｍＭｆ−リス塩酸緩衝液、１０ｍＭ塩化
マグネシウム、ｐＨ７，５）で５．５Ｘ１０’ｐｆｕ／
　ｍｆ！、とノ♂るように調製したライブラリー０１ｍ
℃を混ぜ、室温で２０分間放置してファージを宿主菌に
吸着させた。、４５℃に保温してＪ、−Ｓいたマルトー
スを含むＬＢ上層寒天培地（バクトドリブトン１０ｇ１
バクトイ−ストエキストラクト５ｇ２食塩５ｇ１マルト
ース２ｇ、寒天７゜２ｇ、蒸溜水１ｆ！、、ｐＨ７，５
）２．５ｍｊ２を加え混合した後、マルトースを含む直
径９ｃｍの１．Ｂ寒天平板十に撤与４２℃、３時間半培
養した。

■　ニトロセルロースフィルターへの転写１０ｍＭイソ
プロピルβ−Ｄガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で飽和
後、乾燥した滅菌ニトロセルロースフィルターを４２℃
で３時間半培養したえｇｔｌｌファージプラークの生じ
たＬＢ寒天平板に被せた。更に３７℃、３時間半培養し
た後、フィルターをｑ１］がし、ファージブラ・−りの
生じた平板は４℃に保存した。フィルターをＴＢＳＴ　
（１０ｍＭｆ−リス塩酸緩衝液、１５０ｍＭ食塩、０．
０５％　Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８，０）で洗浄後、１％
ウシ血清アルブミン／ＴＢＳＴで室温、３０分間ブロッ
キングを行った。

■　−次抗体の結合 フィルターを一次抗体溶液に移し、ゆっくりと振盪しな
がら室温で６０分間反応させた。−次抗体としては、Ｔ
ＢＳＴに溶かした抗ＣＰＢＩ夏ウサギポリクローナル抗
体（実施例１、で得られたもの）溶液を室温３０分間放
置し、不純抗体の吸収を行フてかう用いた。

抗ＣＰＢＩ！ウサギポリクローナル抗体溶液は、０．１
μｇ／１Ｉｌｆｔの抗ＣＰＢＩ［ウザギボリクローナル
抗体、１　ｍｇ／ｍｊ２ウシ血清アルブミン、０．２５
μｇ　７ｍ１ｌの大腸菌エキス１ヘラクｌ−（Ｐｒｏｍ
ｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を含むものを用いた
。

−次抗体反応後、ＴＢＳＴでフィルターを１０分間ずつ
３回洗浄した。

■　二次抗体の結合 フィルターを二次抗体溶液に移し、ゆっくりと振盪しな
がら室温３０分間反応させた。

二次抗体としては、アルカリ性フォスファターゼ結合抗
ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）　（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐ
ｏ−ｒａｔｉｏｎ％）をＴＢＳＴで１／７．５００倍に
稀釈したものを用いた。

ＴＢＳＴでフィルターを１０分間ずつ３回洗浄、ＡＰ緩
衝液（１００ｍＭトリス塩酸緩衝液、１０ｔ）＋ｎＭ食
塩、５ｍＭ塩化マグネシウム、ｐ）＋９．５）で−回洗
浄した。

■　発色 ５　ｔｎｌのＡＰ緩衝液に３３μ℃のニトロブルーテト
ラゾリウム溶液（５０ｍｇ／ｍｕ　）と６６μでの５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート溶
液（５０ｍｇ／ｍｕ　）を混ぜた発色基質溶液にフィル
ターを浸した。

室温、１時間発色後、反応停止液（２０ｍＭトリス塩酸
緩衝液、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム、ｐ
Ｈ８，０）に移し、発色を停止した。

■　陽性プラークの調製、純化 発色の認められた陽性スポットに対応するプラークを寒
天培地ごと取り、０．１ｍＡのＴＭＧ緩衝液（１０ｍＭ
Ｉ−リス塩酸緩衝液、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０
０μｇ　／ａｆｔゼラチン、ｐＨ７，４）に穆し、クロ
ロホルムを２滴加え、４℃で４，０００ｒｐｍ、　　１
５分間遠心し、上清にクロロホルムを１滴加えて４℃に
保存した。

約１ｘｉｏ’個のプラークについて上記のスクリーニン
グを行ったところ、２６株の陽性プラークを得た。

発色の強かフた４株についてファージ液を適当に稀釈し
、更に２回スクリーニング操作を繰返し純化ファージ株
、Ｃ−１，Ｃ−４，０−５，Ｃ−６を得た。

（２）組換えファージＤＮＡの調製 得られた４株の組換えファージを宿主大腸菌Ｙ１０８８
（ＡＴＣＣ３３７１９５）に感染させ、４２℃でファー
ジを誘発させ、λファージの調製法（Ｂｅｒｎａｒｄ　
Ｐｅｒｂａｌ、　ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮ　ＯＦ　　λ
ＰＨＡＧＥ　　ＤＮＡ、　　ｉｎ　　Ａ　　ＰＲＡＣ：
ＴＩＣＡＬ　　ＧＬＩＩＤＥ　　ＴＯＭＯＬＥＣＩＩ−
ＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ、　ｐｐ１７５−１８４、Ａ　Ｗ
ｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃ−１ｅｎｃｅ　　Ｐｕｂｌｉ
ｃａｔｉｏｎ、　　１９８４．　　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ
、　　Ｕ、　　Ｓ。

Ａ）に準じて、プレート法による少量調製、大量調製、
液体培養による大量調製を経て、１０９ｐｆｕ／＋ｎｆ
ｌの組換えファージを得ｊご　。

え［ｌＮＡ調製法（Ｂｅｒｎａｒｄ　Ｐｅｒｂａｌ、　
ＰＩＪＲＩＦＩｆｌ：Ａ−・Ｔｌ０ＮＯＦλＤＮＡ、１
ｎＡＰＲＡＣＴＩＣＡＬＧＬＩＩＤＥＴ。

ＭＯＬＥＣ１ｌ＋、ΔＲＣＬＯＮＩＮＧ、ｐｐ１８４−
１８７．Ａ　　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ
　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、　１９８４．　ＮｅｗＹｏ
ｒｋ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）に従い、ポリエチレングリコー
ル沈澱法により１０　”ｐｆｕ／　＋＋ｌに′ａ縮した
ファージ７夜をグリセリンのステップワイズ遠心（Ｂｅ
ｒｎａｒｄ　Ｐｅｒｂａｌ著、小林成保監訳、遺伝子操
作実験実用ハンドブック、ｐｐ１７５，１９８５゜ジャ
チック出版）により精製した。

精製組換えファージを用いて、同じくえＤＮＡの調製法
に従って、組換えファージＤＮへの調製を行い、３００
ｍｕの培養液から約５０〜ｉｏｏμｇのＤＮＡが得られ
た。

（３）　ＣＤＮＡのサブクローニング ベクターとしてｐ［ＩＧＧａ４宝酒造株式会社製）を用
いた。　＋）ｌ］Ｇ１１８をＥｅｏＲＩで切断し、同じ
＜ＥｃｏＲＩで切断した４株の組換えλ８ｔ１１ファー
ジＤＮＡとＤＮＡライゲーションキッ１−（宝酒造株式
会社製）を用いて連結した。

宿主大腸菌ＭＶ１３０４　（宝酒造株式会社製）に得ら
れた組換えベクターを導入したところ、得られた形質転
換体ＭＶ１３０４より４株の組換えλｇｔｌ　１フアー
ジに対応する挿入方向と分子量の異なる組換えベクター
が得られた。Ｃ−ｔからは組換えベクター　ｐＫＳＩ　
１１゜ｐＫｓＩ　１２．　ｐＫｓ　Ｉ　１３が、Ｃ−４
からはｐＫｓＩ４１が、Ｃ−５からはｐＫｓ　Ｉ　５１
．ｐＫｓ　Ｉ　５３が、Ｃ−６からはｐＫＳ　Ｉ６１．
ｐＫｓ　Ｉ　６３．ｐＫｓ　Ｉ　６４がそれぞれ得られ
た。

種々の制限酵素を用いて各種組換えベクターを切断し、
第３図に示した様に制限酵素地図を作製した。ＣＰＢＩ
Ｉ　　ｅＤＮＡは挿入断片中にＥｃｏＲＩ部位を含み、
サブクローニングにより大断片を保持するサブクローン
と小断片を保持するサブクローンが得られる。最も長い
ｃＤＮＡ断片を含む組換えファージＣ−６より得られた
　ｐＫｓＩ６４と　［）ＫＳＩ６１を第４図に示した。

ｐＫｓＩ［ｉ４と　ｐＫｓＩ６１の分子量は、それぞれ
５、ＩＫｂ　と３．７ｋｂであった。

（４）　　ＣＰＢＩＩ　　ｃＤＮ＾ＤＮＡ列の確認得ら
れた　ＣＰＢＩＩ　　ｃＤＮＡ組換えベクターを様々な
制限酵素、エキソヌクレアーゼＩｎ　、ムングビーンヌ
クレアーゼを用いて処理し、ｃＤＮＡの短鎖化を行い、
ｐＨ（：１１Ｂをベクターとして短鎖化プラスミドを再
構築した。得られた短鎖化プラスミドを用いて宿主大腸
菌ＭＶ１３０４を形質転換した。得られた形質転換体細
胞培養液にヘルパーファージＭ１３に０７（宝酒造株式
会社製）を感染させ増殖したファージ粒子より一本鎖Ｄ
ＮＡを調製し、ジデオキシ−ケンス法（ＳＡＮＧＥＲ，
Ｆ、、　　ＮＩＣに１、ＥＮ、Ｓ　　ａｎｄ　　ＣＯＩ
］ＬＳＯＮ、　　Ａ。

Ｒ，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔｌ
、ｓ、Ａ、　　７４５４６３〜５４６７　、１９７７）
により第３図に示した計画に従い、Ｉ）ＮＡ塩基配列を
決定した。

第５図にＣＰＢＩＩ　　ｃＤＮＡの全塩基配列を示した
が、ＣＰＢＩＩポリペプチドを完全にコードする２、４
２５ｂｌ）のｃＤＮＡを得る事ができた。オーブンリー
ディングフレームの検索を行った結果、４塩基目のＧＣ
Ｃから始まり、２，０１９塩基目で終わるＧＡＣまでの
２，０１６塩基がＣＰＢＩＩの６７２アミノ酸残基より
なるポリペプチドをコードしている事が判明した。

本発明ポリペプチドをコードしているｃ　Ｄ　’Ａ　Ａ
はＥｃｏＲＩ切断部位を１個含む為、２種のプラスミド
に別れてクローニングされている。木ｃＤＮＡを接続し
一木のＤＮＡどする目的で、第６図に示した様に種々の
制限酵素、ＤＮＡ修飾酵素、ＤＮＡリンカ−を用いてｐ
ＫｓＩ６４と　ｐＫＳ　１６１より、本発明ポリペプチ
ドを完全にコードするオーブンリーディングフレーム含
むｐＫＳ１７３を構築した。木組換えベクターｐＫｓＩ
７３を保持するＥ、ｃｏｌｉ　ＭＶ１３０４／　ｐＫｓ
Ｉ　７３は、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研条寄第１９５２号として寄託した。

実施例３゜ 発現用組換えベクターの構築及び該組換えベクターによ
る宿主細胞の形質転換： （１）発現ベクターの選択 実施例２．にて構築１ノだｐＫｓＩ７３は本発明ポリペ
プチドの翻訳開始部位ＡＴＧの」−流にマルチクローニ
ングサイトを持ち、適当な制限酵素で本発明ポリペプチ
ドをコードするｃＤＮΔ断片を切出す事が出来る。かく
して切り出したｃＤＮＡ断片を強力なプロモーターの下
流にＥｃｏＲＩ　、　　Ｓｐｈ　Ｉ、ＰｓｔＩ　、　　
Ｓａｌ　Ｉ、ｘｂａＩ。

Ｂａｍ１（Ｉ、　Ｓｍａ　Ｉ、　Ｋｐｎ　ｒ、　Ｓａｃ
　Ｉなどの制限酵素部位を持つ発現ベクターに連結する
事により容易に発現し得る。そこで大腸菌の強力なプロ
モーターであるｔａｃプロモーターを含み、リポソーム
結合部位の下流にＥｃｏＲＩ、Ｓｍａｌ　、　ＢａｍＨ
Ｉ　％５ａｌＩ　、　　Ｐｓｔｌ　、、Ｈｉｎｄｌｌｌ
の制限酵素部位を持つ発現ベクターｐＫに２２３−３（
ファルマシア社製）を用いることにした。

（２）発現用１１換えベクターの構築 実施例２で構築したベクター　ｐＫｓＩ７３をＩ’ｓｔ
　　１とｌ（ｉ　ｎ　ｄ　１１１で切断し、ｐにに２．
２３−３の　Ｉ”ｓｔＩ　−Ｈｉｎｄｌｌｌ間にＤＮＡ
ライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて接
続し、発現用組換えベクター　ｐＫｓ　Ｉ　Ｘ２６６を
構築１ノた。

しかしながら、　９ＫＳ　Ｉ　Ｘ２６Ｂはリポソーム結
合部位と翻訳開始部位ＡＴＧとの距離が離れており、発
現効率が悪い事が予想された。そこでｐＫＳＩ　Ｘ２６
６を　Ｓｍａ　Ｉで切断後、再結合し、ｐＫＳ　Ｉ　Ｘ
２２１ｉを更ニｐＫｓ　Ｉ　Ｘ２２６をＥｃｏＲＩ切断
後、再結合し、ｐＫＳ　Ｉ　Ｘ２Ｏ３を構築した。この
手順を第７図に示す。

（３）発現用組換えベクターによる宿主細胞の形質転換 （２）で構築された発現用組換えベクターｐＫｓＩ　Ｘ
２６８、　ｐＫｓ　Ｉ　Ｘ２２６、　ｐＫＳ　Ｉ　Ｘ２
Ｏ３をヴイースタース・シマニスの方法（Ｈａｎａｈａ
ｎ、　Ｄ。

（１９８５）　　Ｉｎ：　　ＤＮＡ　　Ｃｌ０ｎｉｎζ
：　　Ａ　　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　　Ａｐｐ−ｒｏａｃ
ｈ、　ｖｏｌ、１、（Ｄ、　Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒ、　ｅ
ｄ、）、ｐｐ１２１゜ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏ
ｒｄ、）により調製した宿主大ｆｌｉ菌ＪＭ１０５（（
：、　Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｊ、　Ｖｉｅ
ｉｒａａｎｄ　Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｉｍｐｒｏｖ
ｅｄ　Ｍ１３　ｐｈａｇｅ　ｃｌｏｎ−ｉｎｇｖｅｃｔ
ｏｒｓ　ａｎｄ　ｈｏｓｔ　５ｔｒａｉｎｓ：　ｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　　ｏｆ　　ｔｈｅ
　　Ｍ１３ｍｐ１８　　ａｎｄ　　ｐＬＩｃ１９　　ｖ
ｅｃ−ｔｏｒｓ、　Ｇｅｎｅ　３３．１０３−１１９．
１９８５）コンピテント細胞に導入した。形質転換体細
胞Ｅ、ｃｏｌｉの選択は、アンピシリン１００μｇ／ｍ
ＩＬを含む１、Ｂ寒天平板（バクトドリブトン　１％、
バクトイ−ストエクストラクト　０．５　　％、食塩１
％、寒天１．５％）上で行った。

得られた形質転換体細胞のうちＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０
５／　ｐＫｓ　Ｉ　Ｘ２Ｏ３は通商産業省工業技術院微
生物工業技術研究所に微工研条寄１９５３号として寄託
した。

実施例４、 ウェスタンブロッティング法による本発明ポリペプチド
の発現の確認 実施例３．にて作製されたＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０５／
ｐＫＳＩ　Ｘ２Ｏ３をアンピシリン１００μｇ／ＩＩｎ
を含むＬＢ寒天平板士にて３７℃、１夜培養し、生じた
コロニーを５００＋ｎｆｌ三角フラスコに分注した５０
＋ｎρのＭＭ培地（１，０５％　リン酸二カリウム、０
．４５％　リン酸−カリウム、　０゜１％　硫安、０．
０５％　クエン酸ナトリウム、０．０２％硫酸マグネシ
ウム、０．２％　グルコース、５μｇ／ｆｌ　　チアミ
ン塩酸）に接種し、３７℃で３時間振盪培養した。イソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを最終濃度
１　ｍＭとなる様に加えて５更に１２時間振盪培養を続
けた。集菌後、［１，５＋＋＋ｆ！、のＴＥ（ｌｏｍＭ
　）−リス塩酸緩衝液、２５１Ｍ　ＥＤＴＡ％ｐＨ８，
０）に懸濁した。ドライアイス／エタノール中で凍結１
ノ、続けて解凍した、凍結融解を更に二度繰り返した後
、４℃にて１５、ＯＱＱｒｐｍ、１０分間遠心し菌体破
砕液上清を得た。菌体破砕液上清をミリポアフィルタ−
を通過させ、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０５／ｐＫＳ　Ｉ　
Ｘ２Ｏ３抽出液を得た。

得られた抽出液１５μｍをβ−メルカプしエタノールに
て還元後、ＳＤＳポリアクリルアミド電気沫ｙｊＪ（１
０％ゲル）に付し、抗ＣＰＢＩＩモノクローナル抗体　
ＣＰＢＩＩＡ−２９、ＣＰＢＩＩ　−Ａ３１１、ＣＩ’
ＢＩＩ　−Ａ３１１、各１μｇ／ｍｆ１．の混合液どウ
ェスタンブロッティングＡＰシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ
Ｂｉｏｔｅｃ製）を用いてウェスタンブロッティングを
行ったところ、　ＣＰＢＩＩに相当する分子量を持った
本発明ポリペプチドの発現を確認出来た（第８図）。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明ポリペプチドのアミノ酸配列を示す図
面である。 第２図は、本発明ｃＤＮＡの塩基配列を示す図面である
。 第３図は、本発明ｅＤＮＡ挿人断片の制限酵素地図を示
す模式図である。 第４図は、本発明組換えベクターｐＫｓＩ６４と［）Ｋ
ＳＩ６１の制限酵素地図を示す模式図である。 第５図は、本発明ｃＤＮＡの全塩基配列及びこれに対応
するアミノ酸配列を示す図面である。 第６図は、本発明組換えベクターｐＫＳＩ７３の構築方
法を示す説明図である。 第７図は、本発明のペプチド発現用組換えベクター　ｐ
ＫＳＩ　Ｘ２Ｏ３の構築方法を示す説明図である。 第８図は、本発明ポリペプチドのＳＯＳポリアクリルア
ミド電気泳動上におけるウェスタンブロッティングの結
果を示す図面である。 以　　上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第１図に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド。 ２、第１図に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を
   有するＤＮＡ断片。 ３、塩基配列が第２図に示すものである請求項第２項記
   載のＤＮＡ断片。 ４、請求項第２項又は第３項に記載のＤＮＡ断片に相補
   的な塩基配列を有するＤＮＡ断片。 ５、第１図に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列又
   はこの塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡ断片
   と、複製可能なベクターからなる組換えベクター。 ６、転写の下流方向へ順に次の［１］〜［６］の塩基配
   列、 （１）プロモーターとして作用する塩基配列（２）リボ
   ソーム結合部位である塩基配列 （３）開始コドンである塩基配列 （４）第１図に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列 （５）終止コドンである塩基配列 （６）転写ターミネーターとして作用する塩基配列 を含有する組み換えベクター。 ７、請求項第５項又は第６項に記載の組換えベクターを
   保持する形質転換体細胞。 ８、請求項第１項記載のポリペプチドを有効成分として
   含有する抗血液凝固剤。 ９、請求項第７項記載の形質転換体細胞を培養し、該培
   養物から生産されたポリペプチドを採取することを特徴
   とする請求項第１項記載のポリペプチドの製造法。