JPH0884596A - 生物学的に活性なポリペプチドの組換え製造方法 - Google Patents

生物学的に活性なポリペプチドの組換え製造方法

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JPH0884596A
JPH0884596A JP5333712A JP33371293A JPH0884596A JP H0884596 A JPH0884596 A JP H0884596A JP 5333712 A JP5333712 A JP 5333712A JP 33371293 A JP33371293 A JP 33371293A JP H0884596 A JPH0884596 A JP H0884596A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、抗原に対する免疫応答を抑制する
ことができるグリコシル化阻害因子（ＧＩＦ）の製造方
法およびこのＧＩＦを用いてヒトの免疫応答を抑制する
方法を提供することを目的とする。 【構成】 抗原特異的および抗原非特異的グリコシル化
阻害因子のためのポリペプチド、ポリヌクレオチド、そ
れらのフラグメント、およびそれらに対する単クローン
性抗体、ならびに、上記のポリペプチドをコードする構
造遺伝子からの、生物学的に活性なポリペプチドの組換
え製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本出願は、1992年６月３日に出願されたPC
T/US92/04614号の一部継続出願である。また、PCT/US92
/04614号は1991年６月３日に出願された第709,375 号の
一部継続出願であり、この第709,375 号は1990年６月４
日に出願された出願番号第533,889 号の一部継続出願で
ある。
【０００２】
【産業上の利用分野】本発明は、抗原に対するヒトの免
疫応答を抑制するために利用することのできるヒトグリ
コシル化阻害因子（ＧＩＦ）、およびＧＩＦをコードす
るポリヌクレオチド配列に関する。
【０００３】
【従来の技術】免疫応答は多くの場合有益であると考え
られるが、場合によっては免疫応答の生じた動物にとっ
て抗原に対するその免疫応答が実は有害となることもあ
る。免疫応答が、それを受ける個体が深刻な病的続発症
にかかりやすいような状態を作り出す例としては、紅斑
性狼瘡のような自己免疫疾患がある。紅斑性狼瘡の場
合、罹患者の甲状腺、赤血球、ＤＮＡ、および血小板の
決定基に反応する抗体がしばしば存在する。
【０００４】免疫応答の抑制が記述されるもう一つの例
としては、アレルギーの治療がある。アレルゲンに対す
るＩｇＥ抗体が枯草熱を引き起こし、外因性の喘息のよ
うな他のアレルギー疾患に関係していることが、明確に
なっている。アレルギー疾患におけるＩｇＥのきわめて
重大な役割から、アレルゲンに対するＩｇＥ抗体形成の
制御および抑制がアレルギー疾患の根本治療の一つであ
る可能性が高まった。例えば、ブタクサアレルゲンに対
して感受性の枯草熱患者の血清中には、このアレルゲン
に対するＩｇＥ抗体が常時検出される。ＩｇＥ抗体価は
花粉のシーズン後に上昇するが、その後それ以外の期間
にはごくわずかしか低下しない。血清中のＩｇＥの半減
期はわずか２−３日であるから、ＩｇＥ抗体価の持続
は、この抗体がアレルゲンに暴露されることがないにも
かかわらず患者のリンパ系細胞によって連続して合成さ
れ続けていることを示す。
【０００５】過去２０年にわたって、実験動物で、Ｉｇ
Ｅ抗体応答を制御するために、いくつかの様々な試みが
行なわれた。このような試みの一つは、古典的な免疫療
法または脱感作療法を改良することであった。この療法
では、アレルギー患者はごく微量のアレルゲンの注射を
繰り返し受ける。脱感作療法によって一部の患者の臨床
的な症状が改善されることが示された。しかしながら、
枯草熱患者の血清中のＩｇＥ抗体価は、治療後も減少し
なかった。この療法の主な免疫学的効果は、ＩｇＧ抗体
形成の増強と、花粉シーズン後のＩｇＥ抗体価上昇の抑
制である。
【０００６】脱感作療法または免疫抑制療法の限界は、
副作用のため患者が大量のアレルゲンに耐えられないこ
とである。この問題点を克服するために、例えば尿素−
変性抗原またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−結
合抗原といった化学的に修飾されたアレルゲンを治療に
用いる試みが行なわれた。修飾抗原は天然の抗原に対す
る抗体とは結合しないので、比較的大量の修飾抗原をア
レルギー症状を引き起こすことなしに注射することが可
能である。しかしながら、修飾抗原は抗原特異的Ｔ細胞
を刺激することができる。修飾抗原をマウスに静脈注射
することによって、天然抗原に対する一次ＩｇＥ抗体応
答を抑制する抗原特異的サプレッサーＴ細胞の産生が引
き起こされることが証明された。しかしながら、抗体価
が最大に達した後に治療を始めた場合には、この療法は
継続中のＩｇＥ抗体産生に対して最低限の効果しか有し
ていなかった（Takatsu および Ishizaka, J. Immuno
l.,117, 1211,1976）。マウスでの観察と一致して、枯
草熱患者でのポリエチレングリコール結合抗原の臨床試
験は、この治療がＩｇＥ抗体価を下げることができない
ことを示した。修飾抗原を繰り返し注射することによっ
て継続中のＩｇＥ抗体産生を抑制することができないの
は、おそらくアレルギー患者に比較的大量の抗原特異的
ヘルパーＴ細胞が存在するためであろう。修飾抗原は抗
原特異的サプレッサーＴ細胞の産生を誘導するのみなら
ず、ヘルパーＴ細胞数も増加させるので、治療による後
者の影響によってサプレッサーＴ細胞の効果が打ち消さ
れたのであろう。この解釈は、免疫したマウスに抗原特
異的サプレッサーＴ細胞を移植した結果、継続中のＩｇ
Ｅ抗体産生が抑制されたという事実によって支持される
（Takatsu および Ishizaka, J. Immunol., 117, 1211,
1976）。以上の結果より、ヘルパーＴ細胞の数を増加さ
せることなしに抗原特異的サプレッサーＴ細胞を産生す
ることが可能であれば、枯草熱患者において持続するＩ
ｇＥ抗体産生を抑制することが可能であることが示唆さ
れた。
【０００７】1980年以来、本発明者らは、免疫グロブリ
ンのイソタイプに特異的な様式でＩｇＥ合成を選択的に
制御する様々な方法を研究してきた。この研究の結果と
して、ＩｇＥに対して親和性を有し、ＩｇＥ合成を選択
的に制御する二種類のＴ細胞因子が発見された。ＩｇＥ
結合因子（ＩｇＥ−ＢＦ）の一方は、ＩｇＥ応答を選択
的に増強し、他方のＩｇＥ−ＢＦはその応答を選択的に
抑制する。このＩｇＥ増強因子とＩｇＥ抑制因子の主要
な相違点は分子内の糖質部分であるとおもわれる。Ｉｇ
Ｅ増強因子はレンチルレクチンおよびコンカナバリンＡ
に結合するが、ＩｇＥ抑制因子はこれらのレクチンに結
合しない（Yodoi ら、J. Immunol., 128, 289, 1982
）。ＩｇＥ増強因子またはＩｇＥ抑制因子のいずれか
一方を選択的に生産するための細胞メカニズムの分析、
ならびにこれらの因子の遺伝子クローニングによって、
ＩｇＥ増強因子およびＩｇＥ抑制因子は構造遺伝子を共
有すること、およびこれらの因子の糖質部分の性質およ
び生物活性は翻訳後のグリコシル化過程で確立されるこ
とが示された（Martens ら、Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A.,84, 809, 1987 ）。生理的条件下で、このグリ
コシル化過程は、この過程を促進または阻害する二つの
Ｔ細胞因子によって制御される。これらの因子をグリコ
シル化阻害因子（ＧＩＦ）およびグリコシル化促進因子
（ＧＥＦ）と命名する。
【０００８】ＧＩＦに特徴的な性質は、その生化学的活
性である。このリンホカインはリポモジュリン（ホスホ
リパーゼ阻害タンパク質）に対するモノクローナル抗体
と結合し、ホスホリパーゼ阻害タンパク質のリン酸化さ
れた誘導体であるとおもわれる（Uedaら、J. Immunol.,
130, 878, 1983 ）。また、ＧＩＦの主な供給源が抗原
特異的サプレッサーＴ細胞（Ｔｓ）であることが、マウ
スで明らかになった（Jadieuら、J. Immunol., 133, 32
66, 1984）。オボアルブミン（ＯＶＡ）特異的サプレッ
サーＴ細胞ハイブリドーマに関するその後の実験から、
抗原（ＯＶＡ）で処理した同系マクロファージでハイブ
リドーマ細胞を刺激すると、ＯＶＡに親和性を有するＧ
ＩＦ（抗原結合性ＧＩＦ）の産生が起こることが示され
た。しかしながら、同じハイブリドーマはＯＶＡに親和
性を示さないＧＩＦ（非特異的ＧＩＦ）を構成的に分泌
した。非特異的ＧＩＦとＯＶＡ結合性ＧＩＦとの関係に
関する研究によって、抗原結合性ＧＩＦは抗原結合性ポ
リペプチド鎖および非特異的ＧＩＦからなることが明ら
かになった（Jardieu およびIshizaka, Immune Regulat
ion By Characterized Polypeptides, Goldstein他、
編、Alan R. Liss, Inc., N. Y., 595ページ、1987）。
抗原結合性ＧＩＦは他の研究者によって報告された抗原
特異的サプレッサーＴ細胞因子（ＴｓＦ）と共通の抗原
決定基を有し、抗原（担体）特異的な様式で抗体応答を
抑制することも明らかになった。さらに、抗原結合性Ｇ
ＩＦのみならず、他の研究者によって報告された抗原特
異的ＴｓＦも、モノクローナル抗リポモジュリン(141-B
9)と結合した免疫吸着剤に結合し、この免疫吸着剤を酸
性ｐＨで溶出することによって回収された。
【０００９】アレルギー治療における脱感作療法の大き
な限界にも関わらず、この療法は現在でも用いられてい
る。結論として、抗原特異的ではあるが、現行の脱感作
療法でみられるような副作用を持たない技法がまさに必
要とされている。免疫応答の抑制は、受容者対移植片
（ＨＶＧ）および移植片対受容者（ＧＶＨ）拒絶反応を
抑えるためにきわめて重要である。不幸にして、ＨＶＧ
やＧＶＨの場合だけでなく自己免疫疾患の場合にも、免
疫応答の抑制には、限られた効果しかなく、特異的と言
うよりはむしろ全身的に作用する毒性の高い薬剤を使用
する。このような療法の現況は、毒性が低く特異性の高
い免疫抑制剤の必要性を暗示する。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】ヒトにおいて抗原に対
する免疫応答を抑制するためのよりよい方法は、抗原に
特異的に結合できる、免疫抑制に有効な量のヒトＧＩＦ
を投与することであると考えられる。こうすることによ
って、Ｔサプレッサー因子の濃度が特に優位なものとな
り、その結果として抗原に対する免疫応答が減少する。
このような結果を達成するための方法を本発明は提供す
る。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は、実質的に精製
されたヒト抗原特異的および抗原非特異的ＧＩＦ、なら
びにＧＩＦをコードするヌクレオチド配列を提供するも
のである。生物学的に活性なポリペプチドの一般的な組
換え製造方法も提供される。本発明は、望ましくない免
疫応答に関わる抗原に対して特異性を有する、実質的に
純粋なヒト抗原特異的ＧＩＦに関する。このヒト抗原特
異的ＧＩＦは、望ましくない免疫応答を抗原特異的な様
式で免疫抑制するために、きわめて有用である。
【００１２】本発明に於いては、アレルゲンに特異的に
結合可能なヒト抗原特異的ＧＩＦが望ましい。本発明の
特に望ましい実施態様に於いて、ミツバチ毒の主要アレ
ルゲンであるホスホリパーゼＡ2 （ＰＬＡ2 ）のエピト
ープと結合するヒト抗原特異的ＧＩＦを開示する。この
特異性によって、上記の抗原特異的ＧＩＦおよび同様の
特異性を有する類似の抗原特異的ＧＩＦを、ＰＬＡ2 に
対するヒト免疫応答を抑制するために用いることができ
る。別の特に望ましい実施態様に於いて、スギ(Japanes
e cedar)花粉のエピトープと結合するヒト抗原特異的Ｇ
ＩＦを開示するが、このＧＩＦをこの抗原に対するヒト
免疫応答を抑制するために利用することができる。
【００１３】ハチ毒ＰＬＡ2 に対して抗原特異性を有す
るＧＩＦの生産に利用される知見を、当業者は容易に他
の抗原に拡大適用することができ、結果として余分な実
験を行なうことなしに他の抗原に対して抗原特異性を有
する他のＧＩＦ分子を調製し精製することができる。結
論として、広く新分野を拓くという本発明の特徴によっ
て、自己免疫疾患やアレルギーといった免疫応答が介在
する病気を抑えるために使用することができる、他のア
レルゲンに対するヒト抗原特異的ＧＩＦの調製が可能と
なる。ほとんどのアレルギーや様々の自己免疫疾患の場
合のように、望ましくない免疫応答の抗原が公知である
場合には、様々なヒト抗原特異的ＧＩＦの生産は特に容
易である。
【００１４】本発明のヒトＰＬＡ2 特異的ＧＩＦは、Ａ
ＴＣＣ受託番号HB10473 を有する細胞系ＡＣ５から得ら
れた抗原特異的ＧＩＦから得られるか、またはこれと同
一の性質を有する。本発明のヒトスギ花粉特異的ＧＩＦ
は、細胞系３１Ｅ９から得られた抗原特異的ＧＩＦから
得られるか、またはこれと同一の性質を有する。
【００１５】ハイブリドーマの作成とその特徴を検定す
る方法 ハイブリドーマを作成するために用いられる一般的方法
はよく知られている（Kohlerら、European J. Imm., 6:
292, 1976）。簡単に述べると、ミツバチ毒に対してア
レルギーであるヒトに由来する末梢血液単核細胞(PBMC)
を化学修飾したＰＬＡ2 の存在下で培養した。非付着細
胞を回収し、次にＩＬ−２およびリポコルチン−１とと
もに培養した後、リンパ芽球様細胞系ＢＵＣと融合させ
た。ハイブリドーマをＰＬＡ2 特異的ヒトＧＩＦの産生
でスクリーニングした。
【００１６】より一般的には、本発明はヒト抗原特異的
ＧＩＦを産生する連続的継代ハイブリドーマ細胞系を作
成するための方法に関するものであり、この方法は以下
の段階を含んでいる： （ａ）抗原に対して活性化され、ＩＬ−２およびホスホ
リパーゼＡ2 阻害物質の存在下で培養したヒト抗原感作
Ｔ細胞を得ること；さらに （ｂ）活性化Ｔ細胞を融合によって融合相手の細胞系と
結合させ、ヒト抗原特異的ＧＩＦを産生する能力を有す
るハイブリドーマを作成すること。
【００１７】抗原感作Ｔ細胞は、末梢血液の単核細胞分
画を含む種々の試料からとることが出来る。次いで、抗
原感作Ｔ細胞は、感作に用いられた抗原の存在下で培養
することによって活性化され、続いてその活性化Ｔ細胞
をインターロイキン−２（ＩＬ−２）およびホスホリパ
ーゼＡ2 阻害物質の存在下で増殖させる。このような目
的に特に有用なホスホリパーゼＡ2 阻害物質はリポコル
チンである。あるいはまた、２−（ｐ−アミルシンナモ
イル）−アミノ−４−クロロ安息香酸（ONO-RS-082,ONO
Pharmaceutical Co. ）といった、ＰＬＡ2 阻害活性を
有する合成化合物を使用することができる。
【００１８】一次抗原がＴ細胞に対して毒性を示す場合
のような特定の条件下では、抗原を化学修飾することが
望ましい。このような修飾に利用しうる物質は、塩酸グ
アニジンおよび臭化シアンを包含するが、当業者は余分
な実験をすることなしに容易に同様の物質を捜し出すこ
とができる。一般に、抗原の外部構造を破壊しない物質
を用いることが望ましいが、これはこのような外部構造
がサプレッサーＴ細胞の抗原のエピトープ認識に重要で
あると考えられているためである。しかしながら、この
ような問題は例えば多くのアレルゲンのような細胞毒性
のない大多数の抗原にとって重要ではない。結論として
は、典型的なアレルゲンでは、Ｔ細胞を刺激するために
天然の分子を使用することができる。
【００１９】本発明はヒト抗原特異的ＧＩＦを産生する
抗原特異的ヒトＴ細胞およびＴ細胞ハイブリドーマを作
成するための方法に関する。このようなＴ細胞およびハ
イブリドーマは、免疫抑制されるべき免疫応答に関わる
抗原に特異的な反応性を示す。本発明のヒト抗原特異的
ＧＩＦの抗原特異性を有するヒト抗原特異的ＧＩＦを産
生するＴ細胞ハイブリドーマを分離することは、目的と
するヒト抗原特異的ＧＩＦの作用のパターンを判定する
型どおりのスクリーニング技法を用いて行うことができ
る。したがって、ＰＬＡ2 に特異的なヒトＧＩＦの場
合、あるヒト抗原特異的ＧＩＦ試料がＰＬＡ2 に対して
アレルギー反応を示す患者に由来する細胞の免疫応答を
抑制するならば、そのヒト抗原特異的ＧＩＦ試料と本発
明のハイブリドーマによって産生されるＰＬＡ2 に特異
的なヒトＧＩＦとは同等である。
【００２０】あるヒト抗原特異的ＧＩＦが本発明のヒト
抗原特異的ＧＩＦの特異性を有しているかどうかを判定
するためのさらに別の方法は、本発明のヒト抗原特異的
ＧＩＦをそれが通常反応する抗原（例えばハチ毒ＰＬＡ
2 ）とともにプレインキュベートし、ヒト抗原特異的Ｇ
ＩＦ試料がその抗原と結合する能力を阻害するかどうか
を判定することである。もしヒト抗原特異的ＧＩＦ試料
が阻害されたならば、その試料は、十中八九、本発明の
ヒト抗原特異的ＧＩＦと同じエピトープ特異性を有す
る。
【００２１】本発明で用いられるように、「エピトー
プ」という用語は、ヒト抗原特異的ＧＩＦまたは本発明
のモノクローナル抗体と特異的に反応する決定基を包含
するものとする。エピトープの決定基は通常、化学的に
活性な分子の原子団、例えばアミノ酸または糖側鎖、か
らなり、特異的な三次元構造上の特徴、並びに特異的な
電荷の特徴を有するのが通例である。
【００２２】さらに別の態様に於て、本発明は実質的に
純粋なヒト抗原特異的ＧＩＦを調製する方法に関するも
のであり、それは以下の段階を含んでなる； （ａ）ヒト抗原特異的ＧＩＦを産生する能力を有するハ
イブリドーマ細胞系を培養して、該細胞系にヒト抗原特
異的ＧＩＦを産生させること；および、 （ｂ）培養上清から実質的に純粋なヒト抗原特異的ＧＩ
Ｆを単離すること。
【００２３】このように使用されるハイブリドーマ細胞
系は、上記のようにして作成される。さらに望ましく
は、培養時には、このハイブリドーマを予め抗原特異的
ＧＩＦが結合する抗原で処理した同系マクロファージと
共に培養するか、またはＣＤ３やＴ細胞リセプターに対
する抗体で処理することによって、ヒト抗原特異的ＧＩ
Ｆを産生するようにする。
【００２４】培養上清からヒト抗原特異的ＧＩＦを単離
し、または実質的に精製するために様々な技法を使用す
ることができる。特に有用な技法は、抗原特異的ＧＩＦ
の結合する抗原を用いたアフィニティー精製であり、例
えば固相に結合した抗原を用いる。この技法の応用とし
ては、２種類のアフィニティー免疫吸着剤を段階的に利
用して、ヒト抗原特異的ＧＩＦを実質的に精製すること
も出来る。このような方法に於て、実質的に純粋なヒト
抗原特異的ＧＩＦを単離する段階は以下の通りである； （ｉ）ヒトＧＩＦと特異的に反応するモノクローナル抗
体とハイブリドーマ細胞系培養液を反応させること； （ii）モノクローナル抗体からヒトＧＩＦを溶出するこ
と； （iii ）溶出したＧＩＦを、ヒト抗原特異的ＧＩＦが結
合する抗原と反応させること； （iv）抗原からヒト抗原特異的ＧＩＦを溶出すること；
および （ｖ）ヒト抗原特異的ＧＩＦを回収すること。
【００２５】あるいはまた、110BH3のような抗原特異的
ＧＩＦに対するモノクローナル抗体と結合した免疫吸着
剤を、抗原を結合させた免疫吸着剤の代わりに用いても
よい。実質的に純粋なヒト抗原特異的ＧＩＦを単離する
段階は以下の通りである； （ｉ）ハイブリドーマ細胞系培養液をヒト抗原特異的Ｇ
ＩＦが結合するモノクローナル抗体と反応させること； （ii）ヒトＧＩＦをモノクローナル抗体から溶出するこ
と； （iii ）溶出したＧＩＦをヒトＧＩＦと特異的に反応す
るモノクローナル抗体と反応させること； （iv）ヒト抗原特異的ＧＩＦをモノクローナル抗体から
溶出すること；および （ｖ）ヒト抗原特異的ＧＩＦを回収すること。
【００２６】ハイブリドーマ細胞をＡＢＣ培地のような
無血清培地に適応させることによってヒト抗原特異的Ｇ
ＩＦの精製が容易になる。サブクローンを抗−ＣＤ３で
処理し、続いてそのハイブリドーマ細胞をProtein A で
コーティングした培養シャーレで培養した後、培養上清
中の抗原結合ＧＩＦを下記のようにイオン交換クロマト
グラフィーによって精製することができる。このような
条件のもとで、実質的に純粋なヒト抗原特異的ＧＩＦを
単離するための方法は以下の段階を包含する； （ｉ）ハイブリドーマ細胞系培養上清を陰イオン交換マ
トリックスと接触させること； （ii）そのマトリックスからヒトＧＩＦを溶出するこ
と； （iii ）溶出したＧＩＦを、ヒトＧＩＦと特異的に反応
するモノクローナル抗体と反応させるか、もしくはヒト
抗原特異的ＧＩＦが結合する抗原と反応させるか、また
はその両者と反応させること； （iv）ヒト抗原特異的ＧＩＦを溶出すること；および （ｖ）ヒト抗原特異的ＧＩＦを回収すること。
【００２７】したがって、ヒト抗原特異的ＧＩＦを単離
するために、例えば上記のように抗原特異的ＧＩＦが結
合する抗原を使用し、またはヒトＧＩＦと特異的に反応
する抗体を使用し、またはその両者を使用することによ
って、或いはイオン交換クロマトグラフィー精製はアフ
ィニティー精製と組み合わせて用いて、ヒト抗原特異的
ＧＩＦを単離する。
【００２８】望ましい実施態様に於て、ＤＥＡＥ（ジエ
チルアミノエチル）Sepharose は、抗原特異的ヒトＧＩ
Ｆの精製に利用されるマトリックスである。利用可能な
他のイオン交換材料には、ほとんどすべての市販の陰イ
オン交換アガロースおよびセルロース、例えばポリ硫酸
化アガロース、を包含し、特にＱＡＥ（第４級アミン）
誘導体、ecteola （エピクロロヒドリントリエタノール
アミン）、ＴＥＡＥ（トリエチルアミノエチル）誘導
体、およびＡＥ（アミノエチル）セルロースを包含する
が、それらに限定されない。当業者はこれらの様々なイ
オン交換材料の結合および溶出に関する特異的なパラメ
ーターを知ることができ、または特別の実験を行なうこ
となしに容易に確認することができる。
【００２９】ハイブリドーマ細胞系培養上清を、約２０
ｍＭ塩類、例えばＮａＣｌで平衡化した陰イオン交換マ
トリックスに添加すると、ＧＩＦのほとんどがカラムを
通過し、残りは約６０ｍＭまでの塩濃度によって溶出さ
れる。ＤＥＡＥからの溶出に望ましいＮａＣｌ濃度は１
０ｍＭTris中約２０−約６０ｍＭである。ヒトＧＩＦの
アフィニティー精製に特に有用であるモノクローナル抗
体は、細胞系３８８Ｆ1 によって産生されるモノクロー
ナル抗体、または細胞系３８８Ｆ 1 によって産生される
モノクローナル抗体と同じ特異性を有するモノクローナ
ル抗体、及び、細胞系１１０ＢＨ３によって産生される
モノクローナル抗体であるか、またはこれと同じ特異性
を有するモノクローナル抗体である。
【００３０】ヒト抗原特異的および抗原非特異的ＧＩＦ
の治療への利用 「抑制する」という用語は、治療を受けるヒトに於いて
望ましくない免疫応答の有害な影響を減らすことを意味
する。「免疫抑制に有効」という用語は、使用したヒト
抗原特異的または非特異的ＧＩＦの量が、望ましくない
免疫応答に起因する疾病または症状の原因を抑制するの
に量的に十分であることを意味する。
【００３１】本発明のヒトＧＩＦを投与するための用量
の範囲は、免疫応答の症状が一定の抑制を受けるよう
な、望ましい効果を生じるに十分な量である。用量は、
例えば不必要な交差反応、アナフィラキシー型反応など
のような有害な副作用を引き起こすほど多量であっては
ならない。一般に用量は、患者の年齢、健康状態、性別
および病気の程度によって変化すると考えられ、当業者
はこれを決定することができる。医師は、なんらかの治
療に逆行する徴候があればその用量を調整することがで
きる。一日または数日間、一日当り一回または二回以上
の投与で、用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／投与から
約２ｍｇ／ｋｇ／投与まで変化し得るが、約０．００１
ｍｇ／ｋｇ／投与から約０．２ｍｇ／ｋｇ／投与までが
望ましい。
【００３２】本発明のヒト抗原特異的ＧＩＦは、注射に
よって、または長時間のゆっくりとした潅流によって、
非経口的に投与できる。本発明のヒトＧＩＦは、静脈
内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮的に投与
可能である。非経口投与の製剤は、滅菌された水性また
は非水性溶液、懸濁液および乳濁液を包含する。非水性
溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレ
ングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレ
イン酸エチルのような注射可能な有機エステルがある。
水性担体は水、含水アルコール溶液、乳濁液、または懸
濁液を包含し、塩類液および緩衝剤を包含する。非経口
賦形剤は、食塩水、リンゲルブドウ糖液、ブドウ糖およ
び食塩、乳酸塩リンゲル液、または不揮発油(fixed oi
l) を包含する。静脈注射用賦形剤は、流動性栄養補充
物、電解質補充物（例えば、リンゲルブドウ糖液を基本
とするもの）などを包含する。例えば、抗菌剤、抗酸化
剤、キレート剤、および不活性ガスなどのような、防腐
剤および他の添加物が含まれていてもよい。
【００３３】また本発明は、本発明のヒト抗原特異的ま
たは抗原非特異的ＧＩＦを含む薬剤または医薬組成物を
調製するための方法に関する。このような薬剤は、抗原
に対する望ましくない免疫応答の治療に用いられ、その
抗原は本発明のヒト抗原特異的ＧＩＦと結合する能力を
有する。本発明はまた、モノクローナル抗体およびこの
ような抗体を産生するＢ細胞ハイブリドーマに関する。
この抗体はヒトＧＩＦに特異的に反応する。さらに、本
発明は、抗原特異的ＧＩＦと特異的に反応するが、非特
異的ＧＩＦと反応しないモノクローナル抗体（およびＢ
細胞ハイブリドーマ）を提供する。この型の代表的なモ
ノクローナル抗体は１１０ＢＨ３である。
【００３４】上記のように、ハイブリドーマを作成する
ための技法は当業者によく知られている。簡単に説明す
ると、本発明のＢ細胞ハイブリドーマは、アフィニティ
ー精製したヒトＧＩＦでＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、
さらに後に追加免疫することによって調製された。最終
免疫から２週間後に、動物から脾臓細胞をとり、予め致
死量の放射線照射を行なった同系のＢＡＬＢ／ｃマウス
に移入した。移入を受けた同系マウスは、精製ヒトＧＩ
Ｆで二回免疫され、最終免疫から二週間後にその脾臓細
胞をＳＰ２／０−１４ＡＧ骨髄腫細胞系と融合させた。
ハイブリドーマをヒトＧＩＦに対するモノクローナル抗
体の産生でスクリーニングした。
【００３５】対象となるモノクローナル抗体の作用のパ
ターンを判定する型どおりのスクリーニング技法を用い
て、本発明のモノクローナル抗体の反応性を有するモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマを単離するこ
とができる。したがって、あるモノクローナル抗体試料
がヒトＧＩＦとは反応するがマウスＧＩＦとは反応しな
いならば、その抗体試料と本発明のハイブリドーマが産
生する抗体とは同等である。
【００３６】当業者は、抗イディオタイプ抗体を生成す
ることによって、モノクローナル抗体３８８Ｆ1 または
他のすべての本発明のモノクローナル抗体の特異性を有
するモノクローナル抗体を産生する他のハイブリドーマ
の単離を行なうことができる（Herlynら、Science, 23
2, 100 1986）。抗−イディオタイプ抗体は、対象とな
るハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗
体上に存在する固有の決定基を認識する抗体である。こ
のような決定基は、抗体の超可変部に存在する。一定の
エピトープに結合するのはこの領域であり、したがって
抗体の特異性を担っている。対象とするモノクローナル
抗体で動物を免疫することによって、抗−イディオタイ
プ抗体を調製することができる。免疫された動物は、こ
のようなイディオタイプ決定基に対する抗体を産生する
ことによって、免疫した抗体のイディオタイプ決定基を
認識しこれに応答する。第２の動物によって産生された
抗−イディオタイプ抗体は、単一のハイブリドーマによ
って産生され、第２の動物を免疫するために用いられた
モノクローナル抗体に特異的であるので、この抗−イデ
ィオタイプ抗体を使用することによって、免疫するため
に用いたハイブリドーマの抗体と同一のイディオタイプ
を持つ他のクローンを同定することができる。またそれ
によって本発明のモノクローナル抗体の特異性を有する
モノクローナル抗体を産生する他のハイブリドーマを見
いだすために必要なスクリーニングの総量を少なくし、
非常に簡易にすることができる。
【００３７】二つのハイブリドーマのモノクローナル抗
体の間でイディオタイプが同一であることは、それら二
つのモノクローナル抗体が同一のエピトープ決定基を認
識するという点に関して同一であることを示す。したが
って、モノクローナル抗体上のエピトープ決定基に対す
る抗体を使用することによって、同じエピトープ特異性
のモノクローナル抗体を発現する他のハイブリドーマを
同定することができる。
【００３８】あるいはまた、本発明のモノクローナル抗
体が特定の抗原、例えば通常３８８Ｆ1 が反応するヒト
ＧＩＦと結合するのを、あるモノクローナル抗体試料が
妨げるかどうかを判定することによって、そのモノクロ
ーナル抗体が本発明のモノクローナル抗体と同じ特異性
を有するかどうかを判定して、余分な実験なしにそのモ
ノクローナル抗体を評価することができる。モノクロー
ナル抗体試料が、例えば３８８Ｆ1 による結合の減少を
示して、３８８Ｆ1 と競合するならば、これら二つのモ
ノクローナル抗体は同じエピトープと結合する可能性が
高い。同様の試験をモノクローナル抗体１１０ＢＨ３に
利用することができる。
【００３９】モノクローナル抗体が３８８Ｆ1 のような
本発明のモノクローナル抗体の特異性を有するかどうか
を判定するためのさらに別の方法は、３８８Ｆ1 が通常
反応する例えばヒトＧＩＦのような抗原とともに３８８
Ｆ1 をプレインキュベートし、モノクローナル抗体試料
のその抗原を認識する能力が阻害されるかどうかを判定
することである。もしモノクローナル抗体試料が阻害さ
れるのであれば、たぶん、その試料は本発明のモノクロ
ーナル抗体と同じエピトープ特異性を有する。
【００４０】ある特定の条件のもとでは、診断や治療上
の有効性の点から、あるイソタイプのモノクローナル抗
体が他のものより望ましいことがある。モノクローナル
抗体の特定のイソタイプは、直接、最初の融合から選択
することによって、あるいは二次的に異なるイソタイプ
のモノクローナル抗体を産生する親ハイブリドーマから
クラススイッチ変異体を単離する血縁選択法を利用する
ことによって、調製することができる（Steplewskiら、
Proceedings of National Academy of Science, USA, 8
2, 888653,1985; Spira ら、Journal of Immunological
Methods, 74,307, 1984 ）。したがって、本発明のモ
ノクローナル抗体は、ATCC HB10472により産生されたモ
ノクローナル抗体３８８Ｆ1 の特異性を有するクラスス
イッチ変異体を包含する。この細胞系は、１９９０年６
月４日に先だって、Maryland州Rockville のAmerican T
ype Culture Collection (ATCC) に３０年間の寄託に付
された。
【００４１】本発明で使用される「抗体」という用語
は、完全な分子だけでなく、例えばFab およびF(ab')2
といった、エピトープ決定基と結合可能なそのフラグメ
ントも包含することとする。本発明のモノクローナル抗
体は、本明細書中で言及した様々なタイプのヒトＧＩＦ
を精製するための免疫アフィニティークロマトグラフィ
ーに使用することもできる。このような免疫アフィニテ
ィークロマトグラフィーが利用可能であるような一つの
方法は、例えば本発明のモノクローナル抗体のＣＮＢｒ
−Sepharose-４Ｂ、Affigel(BioRad) またはTresyl活性
化Sepharose(Pharmacia)への結合を利用することによ
る。他のタンパク質混合物に由来するヒトＧＩＦを特異
的に結合させて、その単離および精製を可能にするため
に、これらの固相に結合したモノクローナル抗体を用い
ることができる。例えば低ｐＨのカオトロピック薬剤、
または尿素のような当業者に公知の技法を用いて、結合
したＧＩＦをアフィニティークロマトグラフィー材料か
ら溶出することができる。
【００４２】もうひとつの実施態様において、本発明
は、実質的に純粋な融合ポリペプチドR1-[X1-X2-X1-X2-
Lys-Arg]-R2 （式中、R1は担体ペプチドであり、R2は構
造遺伝子によりコードされたポリペプチドであり、X1は
Lys またはArg であり、X2はアミノ酸である。）を提供
する。上記の「担体ペプチド」またはシグナル配列は融
合ペプチド配列のアミノ末端に位置する。真核生物の場
合は、この担体ペプチドは小胞体を横切って融合ポリペ
プチドを輸送する働きをすると考えられている。その
後、分泌タンパク質がゴルジ体を通過して分泌小胞およ
び細胞外空間、または好ましくは外部環境へ輸送され
る。本発明に従って利用することができる担体ペプチド
はタンパク質分解酵素認識部位を包含するプレプロペプ
チドを含む。許容できる担体ペプチドは、カルシトニン
または他のホルモンのアミノ末端プロ領域を含み、これ
らはフランキング二塩基性部位(flanking dibasic site
s)で切断される。プロカルシトニンは、Lys-Arg 切断部
位を認識するプロホルモンのコンベルターゼ(convertas
e)によりプロセッシングされる。しかしながら、本発明
は、担体としてのこのペプチドの使用のみに限定される
ものではないことに留意しなければならない。本明細書
で記載したようなプロカルシトニンと同様の性質を有す
る他の担体ペプチドも当業界では公知であり、また過度
の実験を行うことなく容易に利用できる。
【００４３】本発明のひとつの実施態様において、シグ
ナル配列である担体ペプチドは、特にこの担体ペプチド
のＮ末端の近くに位置する発現ベクター内に含まれる。
このシグナル配列は融合タンパク質を小胞体の方向に向
かわせる。典型的には、このシグナル配列は、２〜３個
の極性残基で始まり高含有量の疎水性アミノ酸が続く約
１６〜約２９個のアミノ酸のリーダーからなる。他の点
で、検出可能な知られた保存配列はない。本発明の実施
例で使用されたベクターはカルシトニンのプロ領域を使
用するけれども、融合タンパク質を小胞体および外部環
境へ輸送する手段を提供する他のシグナル配列は本発明
において等しく有効である。そのようなシグナル配列は
当業者に知られている。
【００４４】本発明の担体ペプチドは、Ｐ４およびＰ６
位に追加のArg/Lys 残基を含む二塩基モチーフ(Lys-Ar
g) を有するタンパク質分解酵素認識部位を含有する。
切断認識部位の相違は、タンパク質分解の特異性に対し
て異なるプロセッシング酵素が存在することを意味す
る。好ましくは、この切断部位は配列X1-X2-X1-X2-lys-
Arg （式中、X1はLys またはArg であり、X2はアミノ酸
である）からなる約６個のアミノ酸である。この認識部
位を利用することによっては、構造遺伝子によりコード
された極めて高い活性を有するタンパク質を作りうる。
【００４５】タンパク質分解部位を認識するプロセッシ
ング酵素の例としては、哺乳類酵素のフリン（furin)、
酵母ペプチドプロセッシング酵素Kex2の相同体、および
他のプロホルモンであるコンベルターゼ(PCs) を挙げる
ことができる。好ましくは、本発明の担体ペプチドは、
前駆体の切断部位で、Arg/Lys-X2-Arg/Lys-X2-Lys-Arg
配列を有するタンパク質分解酵素認識部位を含む。
【００４６】本発明の融合ポリペプチドは、好ましく
は、融合ポリペプチドのカルボキシ末端で、構造遺伝子
によりコードされたポリペプチドを含む。構造遺伝子は
担体および切断部位と結合した形で発現される。構造遺
伝子は、発現ベクター中で担体および切断部位をコード
する遺伝子と結合させてあり、その結果、融合ポリペプ
チドは一単位として発現される。ＧＩＦは本発明の融合
ポリペプチドの形で発現させるために使用することがで
きる構造遺伝子の一例である。
【００４７】本発明は、実質的に純粋なポリペプチドを
提供する。本明細書中で使用される「実質的に純粋な」
なる用語は、天然において結合している他のタンパク
質、脂質、炭水化物、または他の物質を実質的に含まな
いポリペプチドをいうものとする。当業者は、このポリ
ペプチドのエピトープと結合するモノクローナル抗体を
用いるアフィニティークロマトグラフィーのような、タ
ンパク質を精製するための標準的な技法を用いて、この
ポリペプチドを精製することができる。実質的に純粋な
ポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル上で単一の主
要バンドを形成するであろう。また、このポリペプチド
の純度は、アミノ末端アミノ酸配列分析により決定する
ことができる。このポリペプチドは、ポリペプチドの活
性が残っている限り、ポリペプチドの機能性フラグメン
トを含む。ポリペプチドの生物学的活性を有するより小
さいペプチドは本発明に包含される。
【００４８】本発明は、また、融合ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌク
レオチドは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡを含む。融
合ポリペプチドのすべてあるいは一部をコードするすべ
てのポリヌクレオチドもまた、その切断生成物が生物学
的活性を有するポリペプチドをコードする限り、本発明
に包含されるものとする。そのようなポリヌクレオチド
には、天然の、合成の、および意図的に操作されたポリ
ヌクレオチドが含まれる。例えば、このポリヌクレオチ
ドは、部位特異的突然変異誘発されてもよい。また、こ
のポリヌクレオチド配列は、アンチセンス配列および遺
伝子コードの結果縮重する配列を含む。２０個の天然ア
ミノ酸があるが、そのほとんどは、１個以上のコドンで
特定される。従って、ヌクレオチド配列によりコードさ
れる融合ポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に変化し
ない限り、すべての縮重するヌクレオチド配列は本発明
に包含される。
【００４９】本発明は、本発明のヌクレオチド配列に相
補的なポリヌクレオチドも提供する。「相補的な」ヌク
レオチド配列は、その相補的配列がハイブリダイズする
条件下で、特定のヌクレオチド配列とハイブリダイズす
るであろう。これらの条件には、温度、ｐＨ、緩衝液お
よびヌクレオチド組成が含まれる。例えば、二重鎖ＤＮ
Ａ分子の陽性および陰性鎖は相補的なヌクレオチド配列
である。本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１５
塩基の長さ、典型的には１８塩基以上の長さであり、目
的とするポリペプチドをコードするゲノミックＤＮＡに
選択的にハイブリダイズするフラグメントを含む。選択
的ハイブリダイゼーションとは、その相補体である標的
ＤＮＡへのヌクレオチド配列の非特異的結合を回避する
条件（例えば、ｐＨ、温度、緩衝液）を意味する。
【００５０】本発明のＤＮＡ配列は、いくつかの方法で
得ることができる。例えば、このＤＮＡは当業界で周知
のハイブリダイゼーション法を用いて単離することがで
きる。これらは、１）共通のヌクレオチド配列を検出す
るための、ゲノミックまたはｃＤＮＡライブラリーへの
プローブのハイブリダイゼーション；２）共通の構造的
特徴を検出するための、発現ライブラリーの抗体スクリ
ーニング；および３）ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣ
Ｒ）による合成を含むが、それに限定されるものではな
い。
【００５１】ハイブリダイゼーション法は、標識された
混合合成オリゴヌクレオチドプローブを用いる組換えク
ローンのスクリーニングに有用である。そこでは、各プ
ローブは、変性した二重鎖ＤＮＡの異質な混合物を含む
ハイブリダイゼーション試料における特定のＤＮＡ配列
の完全な相補体である可能性がある。そのようなスクリ
ーニングにおいて、ハイブリダイゼーションは、好まし
くは一本鎖ＤＮＡまたは変性した二重鎖ＤＮＡのどちら
かで行われる。ハイブリダイゼーションは、目的とする
ポリペプチドに関係するｍＲＮＡ配列が極めて少量しか
存在しない供給源に由来するｃＤＮＡクローンの検出に
おいて特に有用である。換言すると、非特異的な結合を
回避するための緊縮(stringent) ハイブリダイゼーショ
ン状態を用いることによって、例えば、その完全な相補
体である混合物中における単一のプローブへの標的ＤＮ
Ａのハイブリダイゼーションによって、特定のｃＤＮＡ
クローンをオートラジオグラフィーにより可視化するこ
とができる（Wallace, etal., Nucleic Acid Research,
9:879, 1981)。
【００５２】ｃＤＮＡライブラリーを含む抗原非特異的
ＧＩＦは、例えば、種々のｃＤＮＡを卵母細胞に注入
し、生じるｃＤＮＡ遺伝子産物を十分な時間発現させ、
例えば、抗原非特異的ＧＩＦポリペプチドに特異的な抗
体を用いるか、またはＧＩＦ活性の機能的なアッセイを
用いて、所望のｃＤＮＡ発現産物の存在を試験すること
によって、スクリーニングすることができる。あるい
は、抗原非特異的ＧＩＦポリペプチドに特異的な抗体を
用いて少なくとも一つのエピトープを持つ抗原非特異的
ＧＩＦポリペプチドについて、間接的にｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングすることもできる。そのような
抗体はポリクローナル、あるいはモノクローナルのいず
れでも、抗原非特異的ＧＩＦｃＤＮＡの存在を示す発現
産物を検出するために使用することができる。
【００５３】核酸ハイブリダイゼーションに依拠するス
クリーニング法は、適当なプローブが入手できる限り、
いかなる生物からいかなる遺伝子配列を単離することも
可能にする。問題になっているタンパク質をコードする
配列の一部に相当するオリゴヌクレオチドプローブは、
化学的合成することができる。このためには、短い、オ
リゴペプチド長のアミノ酸配列が知られていなければな
らない。このタンパク質をコードするＤＮＡ配列は遺伝
子コードから演繹することができるが、コードの縮重を
考慮に入れなければならない。配列が縮重している場合
には、混合添加反応を行うことが可能である。これに
は、変性した二重鎖ＤＮＡの異質な混合物が含まれる。
【００５４】ポリペプチドをコードする特定のＤＮＡ配
列の開発は以下のようにして得られる；１）ゲノミック
ＤＮＡ由来の二重鎖ＤＮＡ配列の単離；２）目的のポリ
ペプチドに必要なコドンを提供するためのＤＮＡ配列の
化学的製造；および３）真核供与体細胞から単離された
ｍＲＮＡの逆転写による二重鎖ＤＮＡ配列のインビトロ
合成。後者の場合には、ｍＲＮＡの二重鎖ＤＮＡ相補体
が最終的に形成され、これはｃＤＮＡと一般に言われ
る。組換え法に使用するための特定のＤＮＡ配列を開発
するためのこれらの３つの方法のうち、ゲノミックＤＮ
Ａ単離物の単離が最も一般的でない。哺乳類ポリペプチ
ドを微生物で発現しようとする場合は、イントロンが存
在するので、特にそうである。
【００５５】ＤＮＡ配列の合成は、所望のポリペプチド
産物のアミノ酸残基の全配列が公知である場合、しばし
ば望ましい方法となる。所望のポリペプチドのアミノ酸
残基の全配列が公知でない場合、ＤＮＡ配列の直接的な
合成は可能ではなく、ｃＤＮＡ配列の合成が望ましい方
法である。興味のあるｃＤＮＡ配列を単離するための標
準的な方法の中には、高いレベルの遺伝子発現を有する
供与体細胞に豊富なｍＲＮＡの逆転写に由来するプラス
ミド−またはファージ−含有ｃＤＮＡライブラリーを形
成する方法がある。ポリメラーゼ連鎖反応法と組み合わ
せて用いられる場合、ほとんど発現しない産物でさえク
ローニングできる。ポリペプチドのアミノ酸配列の重要
な部分が公知の場合、標的ｃＤＮＡに存在すると推定さ
れる配列とまったく同じの標識された一本鎖または二本
鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプロープ配列を作製して、一本鎖
形態に予め変性したｃＤＮＡクローン上で行うＤＮＡ／
ＤＮＡハイブリダイゼーション法を採用してもよい（Ja
y et al., Nucl.Acid Res.11:2325, 1983) 。
【００５６】ラムダｇｔ１１のようなｃＤＮＡ発現ライ
ブラリーは、少なくとも１個のエピトープを持つポリペ
プチドの発現について、このポリペプチドに特異的な抗
体を用いて、間接的にスクリーニングされうる。そのよ
うな抗体はポリクローナルまたはモノクローナルのいず
れかで、ｃＤＮＡによりコードされたタンパク質の存在
を示す発現産物を検出するために使用することができ
る。
【００５７】本発明の融合ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列を適当な宿主細胞へのＤＮＡ移入によりインビ
トロに発現させることができる。「宿主細胞」は、ベク
ターが増幅でき、そのＤＮＡが発現できる細胞である。
この用語には、当該宿主細胞のいかなる子孫も含まれ
る。突然変異が複製の間に生じることがあるので、子孫
のすべてが親細胞と同一ではないかもしれないことが理
解される。しかしながら、そのような子孫は「宿主細
胞」という用語が使用される時には、含まれるものとす
る。安定な移入の方法、換言すれば、外来ＤＮＡが宿主
中に継続して維持される方法は、当業界で公知である。
【００５８】本発明においては、ポリヌクレオチド配列
は組換え発現ベクター中に挿入されてもよい。「組換え
発現ベクター」なる用語は、抗原非特異的ＧＩＦ、例え
ば、担体ペプチドの遺伝子配列の挿入または組み込みに
より、前もって操作された当業界で公知のプラスミド、
ウィルスまたは他のベヒクルをいうものとする。そのよ
うな発現ベクターは、宿主の挿入された遺伝子配列の効
率的な転写を促進するプロモーター配列を含む。発現ベ
クターは、典型的には、複製起点、プロモーター、なら
びに形質転換された細胞の表現型選択を可能にする特定
の遺伝子を含む。本発明の使用に適したベクターには、
細菌における発現のためのＴ７を基礎とする発現ベクタ
ー（Rosenberg et al., Gene 56:125, 1987)、哺乳類細
胞での発現のためのpMSXND発現ベクター(LeeおよびNath
ans, J. Biol. Chem. 263:3521,1988) 、および昆虫細
胞での発現のためのバキュロウィルス由来のベクターが
含まれるが、それに限定されるものではない。ＤＮＡセ
グメントは調節要素、例えば、プロモーター（例えば、
Ｔ７、メタロチオネインＩ、またはポリヘドリンプロモ
ーター）に機能するように結合しているベクターに存在
し得る。
【００５９】本発明のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド配列は、原核生物および真核生物において発
現させることができる。宿主には、微生物、酵母、昆
虫、および哺乳類生物が含まれうる。本発明の好ましい
宿主は真核生物である。真核生物のまたはウィルスの配
列を有するＤＮＡ配列を原核生物において発現させる方
法は当業界で周知である。宿主で発現および複製可能な
生物学的に機能するウィルスおよびプラスミドＤＮＡベ
クターは当業界で公知である。そのようなベクターは、
本発明のＤＮＡ配列を組み込むために使用される。本発
明の宿主細胞は融合タンパク質の切断部位を認識する酵
素を元来コードすることが好ましい。しかし、融合ポリ
ペプチドの発現が望まれる宿主細胞が切断部位を認識す
る酵素をもともと有していないならば、そのような酵素
をコードする遺伝子配列を融合タンパク質のポリヌクレ
オチド配列と一緒に宿主細胞へ同時トランスフェクショ
ンすることができる。
【００６０】組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は
当業者に周知の慣用の技術により行ってもよい。宿主が
大腸菌のような原核生物の場合には、指数増殖期後に回
収し、続いて当業界に周知の手法によるCaCl2 法を用い
て処理した細胞から、ＤＮＡの取り込みが可能なコンピ
テント細胞を作製することができる。あるいは、MgCl 2
またはRbClを使用してもよい。また、形質転換は宿主細
胞のプロトプラストを形成した後または電気穿孔法によ
り行うこともできる。
【００６１】宿主が真核生物の場合には、燐酸カルシウ
ム共沈法、マイクロインジェクション、電気穿孔法、リ
ポソームに内包されたプラスミドやウィルスベクターの
挿入のような慣用の機械的手法のようなＤＮＡのトラン
スフェクションの方法を用いてもよい。また、真核細胞
を本発明の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、
および単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子のような選
択可能な表現型をコードする第２の外来ＤＮＡ分子によ
り同時トランスフェクションさせることもできる。もう
ひとつの方法は、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）ま
たはウシ乳頭腫ウィルスのような真核ウィルスベクター
を用いて一時的に感染させるか、または真核細胞を形質
転換してタンパク質を発現させることである（Eukaryot
ic ViralVectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gl
uzman ed., 1982) 。
【００６２】微生物を用いてあるいは真核細胞を用いて
発現させた本発明のポリペプチドを単離し精製する技法
は、例えば、分取クロマトグラフィー分離およびモノク
ローナルおよびポリクローナル抗体の使用を含むような
免疫学的分離といったいかなる慣用手段であってもよ
い。以上の開示は、本発明を概括的に記述する。以下の
特定の実施例を参照することによって、より完全な理解
を得ることができるが、これらの実施例は説明のみを目
的として本明細書中に提示され、本発明の範囲を限定す
ることを意図するものではない。
【００６３】
【実施例】実施例１ ヒト抗原特異的グリコシル化阻害因子（ＧＩＦ）を産生
するハイブリドーマ細胞系の調製および精製技法 Ａ．抗原 ハチ毒由来の凍結乾燥ホスホリパーゼＡ2 （ＰＬＡ2 ）
は、Sigma ChemicalCo., St. Louis, MO より購入し
た。変性ＰＬＡ2 （Ｄ−ＰＬＡ2 ）および臭化シアン処
理ＰＬＡ2 は、Kingら、（Arch. Biochem and Biophy
s., 172; 661, 1976）によって記載された方法によって
調製した。Ｄ−ＰＬＡ2 を調製するために、５ｍｇのＰ
ＬＡ2 を０．１Ｍ Tris HCl 緩衝液ｐＨ８．６に溶解
し、５ｍｇ／ｍｌジチオスレイトール存在下６Ｍ塩酸グ
アニジン中で変性させた。室温で１８時間後、スルフヒ
ドリル基をヨード酢酸を用いてカルボキシメチル化し
た。変性タンパク質を０．０２Ｍ酢酸に対して透析し、
使用するまで−４０℃に保った。ＰＬＡ2 内のメチオニ
ン結合を切断するために、１０ｍｇのハチ毒ＰＬＡ2 を
０．４ｍｌ蒸留水に溶解し、１００ｍｇＣＮＢｒを含有
する１．２ｍｌギ酸を添加した。室温で２時間後、混合
物を水で二倍に希釈し、Speed Vac 中で凍結乾燥した。
天然ＰＬＡ2 をTresyl活性化Sepharose （Pharmacia ）
に、製造業者の勧める方法にしたがって結合させた。特
に言及しない限り、１ｍｇタンパク質を１ｍｌSepharos
e に結合させた。
【００６４】Ｂ．抗体 精製ヒトＥ骨髄腫タンパク質ＰＳ、ハイブリドーマH-1
DNP-E-26由来のモノクローナルマウスＩｇＥ（Liu ら、
J. Immunol., 124; 2728, 1980）およびモノクローナル
抗−ＣＤ３（ＯＫＴ３）は既報の論文に記載されたのと
同様に調製した（Cariniら、J. Immunol. Methods, 12
7; 221, 1990 ）。モノクローナル抗−Ｔ細胞レセプタ
ーαβ、ＷＴ３１Ｃ（Spits ら、J. Immunol., 135; 19
22, 1985）を含有する腹水は、DNAX Institute of Mole
cular and Cellular Biology, Palo Alto, CA のJ. DeV
ries博士の厚意により提供を受けた。ウサギリポモジュ
リン１４１Ｂ９（Iwata ら、J. Immunol., 132; 1286,
1984）に対するマウスモノクローナル抗体は既報の記載
と同様に調製した（Askasakiら、J. Immunol., 131; 31
72, 1986）。マウスＩｇＧに対する特異的に精製された
ヤギ抗体は、抗Ｈ（γ）鎖および抗Ｌ鎖の両方を含有す
るが、これはすでに報告されている（Suemura ら、J. I
mmunol., 125; 148, 1980 ）。フルオレセイン標識した
ヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体はCappelから購入した。ヒト
ＩｇＧおよび抗−リポモジュリン抗体（１４１Ｂ９）を
ＣＬ−Sepharose ４Ｂに結合させた；約５ｍｇタンパク
質を１ｍｌSepharose に結合させた。
【００６５】Ｃ．細胞系 １０％ウシ胎児血清、２ｍＭＬ−グルタミン、５０μＭ
２−メルカプトエタノールおよび抗生物質を添加したＲ
ＰＭＩ１６４０培地で、ＲＰＭＩ８８６６リンパ芽球様
細胞を培養した（ＲＰＭＩ１６４０培養基）。マウスＴ
細胞ハイブリドーマ１２Ｈ５細胞（Iwata ら、J. Immun
ol., 140; 2534, 1988）は、既報の論文（Huffら, Pro
c. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 129; 509, 1982 ）に記
載された高濃度グルコースダルベッコ改変イーグル培地
（ＤＭＥＭ）中に維持された。ヒトリンパ芽球様細胞系
ＣＥＭ（ＢＵＣ）のヒポキサンチングアニンホスホリボ
シルトランスフェラーゼ−欠損変異株は、すでに報告さ
れている（HuffおよびIshizaka, Proc. Natl. Acad. Sc
i. U.S.A. 、81; 1514, 1984）。
【００６６】Ｄ．細胞培養およびハイブリドーマの構築 ミツバチ毒に対してアレルギーを示す患者から末梢血液
を採り、Ficoll-Paque(Pharmacia) での遠心分離によっ
て、この血液の単核細胞（ＰＢＭＣ）を得た。抗原感作
Ｔ細胞を活性化するために、ＲＰＭＩ１６４０培養基に
３ｘ１０6 有核細胞／ｍｌの濃度でＰＢＭＣを懸濁し、
１０μｇ／ｍｌＤ−ＰＬＡ2 またはＣＮＢｒ処理ＰＬＡ
2 の存在下で３日間培養した。非付着細胞を回収し、新
培養基に再懸濁し（２ｘ１０5 細胞／ｍｌ）、次に３μ
ｇ／ｍｌ組換えヒトリポコルチン１（BiogenのJ. Brown
ing 博士およびB. Pepinsky 博士の厚意により提供され
た）の存在下、６０ユニット／ｍｌ精製ＩＬ−２（クロ
マトグラフィーで精製されたヒトＩＬ−２、Electro-nu
cleonics, Silverspring, MD）とともに４日間培養し
た。
【００６７】Ｔ細胞ハイブリドーマを構築するために、
予めＩＬ−２によって増殖させた１．２ｘ１０7 Ｔ細胞
を２倍の細胞数のＢＵＣ細胞と混合した。混合細胞をペ
レット状にし、ポリエチレングリコール（１３００−１
６００ＭＷ、Sigma ）を用いて融合させた。細胞融合に
関する詳細な方法は、すでに報告された通りである（Hu
ffら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 、81; 1514, 19
84）。ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（Ｈ
ＡＴ）含有ＤＭＥＭに細胞を再懸濁し、５ｘ１０4 細胞
を９６ウェルプレートの各ウェルに分注した。完全ＤＭ
ＥＭ中で週２回継代培養してハイブリッドクローンを維
持した。Ｔ細胞ハイブリドーマを刺激するために、８μ
ｇ／ｍｌＯＫＴ３を用いて、０℃で４０分間この細胞を
処理し、この抗体処理細胞（１ｘ１０6 ／ｍｌ）を、予
め１０μｇ／ｍｌ抗−ＭＧＧでコーティングしたLimbro
組織培養ウェル（Flow Labs, Mclean, VA ）に分注し
た。２４時間培養後、培養上清を得た。
【００６８】Ｅ．ＣＤ３およびＴｃＲの検出 ５％ＦＣＳおよび１０μＭＮａＮ3 を添加したＲＰＭＩ
１６４０培地中で、８μｇ／ｍｌＯＫＴ３または１：１
０００希釈抗−ＴｃＲαβ（ＷＴ３１）含有腹水ととも
に、ハイブリドーマ細胞（１ｘ１０6 ／試料）を、０℃
で４０分間、インキュベートした。対照として、同じ細
胞のアリコートを同一濃度のマウスＩｇＧ2a （Becton
-Dickinson, イソタイプ対照）で処理した。５％ＦＣＳ
含有ＰＢＳで細胞を二回洗浄し、次にフルオレセイン標
識した抗−マウスＩｇＧとともに４０分間インキュベー
トした。洗浄後、細胞に付随する蛍光をBecton-Dickins
onのFACScan を用いて分析した。
【００６９】抗−マウスＩｇＧでコーティングされたウ
シ赤血球を用いたロゼット形成によって、ＣＤ３+ ハイ
ブリドーマ細胞を同定した。Wilhelm らの方法（J. Imm
unol. Methods, 90; 89, 1986 ）によって、この抗体を
赤血球に結合させた。簡単に述べると、０．５ｍｌのウ
シ赤血球沈渣を塩類液で４回洗浄し、０．７５ｍｌの
０．５μｇ／ｍｌ精製抗−ＭＧＧに懸濁した；この細胞
懸濁液に２５μｌＣｒＣｌ3 （１６．５ｍｇＣｒＣｌ3
を５ｍｌ塩類液に溶解する）をゆっくり混合しながら添
加し、得られた細胞懸濁液を３０℃で１時間インキュベ
ートした。抗−ＭＧＧ結合赤血球を塩類液で４回洗浄
し、５ｍｌＦＣＳ（約１ｘ１０9 赤血球／ｍｌ）に再懸
濁した。ＣＤ３+ 細胞を検出するために、５％ＦＣＳお
よび８μｇ／ｍｌＯＫＴ３を含有する８０μｌＤＰＢＳ
に１０6 ハイブリドーマ細胞のペレットを懸濁した。０
℃で４５分後、細胞を２回洗浄し、８０μｌＤＰＢＳ−
５％ＦＣＳに再懸濁し、抗−ＭＧＧでコーティングされ
た赤血球およびクリスタルバイオレットの懸濁液２０μ
ｌをこの細胞懸濁液に添加した。この混合物を２００ｇ
で５分間遠心分離し、チューブを０℃で２時間インキュ
ベートした。ペレットを徐々に再懸濁し、顕微鏡下でロ
ゼット形成した細胞を検査した。
【００７０】Ｆ．ＣＤ３+ 細胞の濃縮 ８μｇ／ｍｌＯＫＴ３（１．５ｘ１０6 細胞）で処理し
たハイブリドーマ細胞を、抗−ＭＧＧが結合した赤血球
（約４ｘ１０8 赤血球）と混合して、上記の方法によっ
てロゼットを形成した。ペレットを再懸濁し、６０％お
よび５０％パーコール層からなるパーコール勾配の上端
にのせた。チューブを 1200RPM（700ｇ）で２０分間、
室温で遠心分離した。ペレット状の細胞を培養基で２回
洗浄し、０．８３％ＮＨ4 Ｃｌ緩衝液で、０℃１分間、
処理することによって、赤血球を溶解させた。細胞をＤ
ＭＥ培養基で洗浄し、これに再懸濁し、細胞数を増加さ
せるために培養した。ＣＤ３+ 細胞のさらなる純化は細
胞選別によって行なわれた。ハイブリドーマ細胞をＯＫ
Ｔ３で処理し、フルオレセイン標識した抗−ＭＧＧで染
色した。FACSTAR （Becton-Dickinson）を用いた細胞選
別によって、ポジティブに染色された細胞を選択した。
【００７１】Ｇ．ＩｇＥ−ＢＦの精製および検出 Ｔ細胞ハイブリドーマの培養上清を、DiafloＹＭ１００
メンブラン（AmiconCorp., Lexington, MA ）で濾過
し、濾液をＹＭ５メンブランで限外濾過して１０倍に濃
縮した。既報の方法にしたがって（IshizakaおよびSand
berg, J. Immunol., 126; 1692, 1981）ＩｇＥ結合Seph
arose を用いてこの濾液中のＩｇＥ−ＢＦを精製した。
培養濾液中またはＩｇＥ−Sepharose からの酸溶出画分
中のＩｇＥ−ＢＦの存在は、既述の方法（Kisakiら、J.
Immunol., 138; 3345, 1987）にしたがって、ＦcεＲ
+ Ｂリンパ芽球様細胞系、ＲＰＭＩ８８６６細胞とヒト
ＩｇＥコーティングウシ赤血球（Ｅ−ＩｇＥ）とのロゼ
ット形成の阻止によって評価された。３００ＲＰＭＩ８
８６６細胞のうち、ロゼット形成細胞（ＲＦＣ）の割合
を三回測定し、平均値＋ＳＤとして表示した。
【００７２】１２Ｈ５細胞によって産生されるげっ歯類
ＩｇＥ−ＢＦを同じ方法によって検出したが、ただし指
示細胞としてはラットＩｇＥコーティングウシ赤血球を
用い、ＦcεＲ+ Ｂ細胞の供給源としてはNipportronngy
lus brasiliensis に感染したLewis 系ラットの腸間膜
リンパ節細胞を用いた（Yodoi およびIshizaka, J.Immu
nol., 124; 1322, 1980 ）。
【００７３】Ｈ．ＧＩＦの検出 Ｔ細胞ハイブリドーマ１２Ｈ５細胞（Iwata ら、J. Imm
unol., 140; 2534,1988）を用いて、ＧＩＦを検出し
た。ハイブリドーマ細胞の懸濁液を等量の検査試料と混
合し、その細胞懸濁液を１０μｇ／ｍｌマウスＩｇＥと
ともに２４時間培養した。培養上清をＣＦ５０Ａメンブ
ランで濾過し、ＩｇＥ−ＢＦ含有濾液をレンチルレクチ
ンSepharose （Yodoi ら、J. Immunol., 125; 1436, 19
80）で分画した。非結合タンパク質（流出画分）および
０．２Ｍαメチルマンノシドで溶出されたタンパク質
（溶出画分）の両者を、ＩｇＥ−ＢＦの存在について、
ロゼット形成阻止技法で評価した。１２Ｈ５細胞をマウ
スＩｇＥとのみ培養したときは、その細胞によって産生
されたほとんどすべてのＩｇＥ−ＢＦは本質的にレンチ
ルレクチンSepharose に結合し、αメチルマンノシドで
溶出することによって回収された。したがって、流出／
溶出画分のロゼット形成阻止パーセントの比は、０．２
より小さい。十分量のＧＩＦがマウスＩｇＥとともに１
２Ｈ５細胞の培養に添加された場合には、その細胞によ
って産生されたＩｇＥ−ＢＦの大部分は、レンチルレク
チンに対する親和性を欠いており、流出画分に回収され
た （Iwata およびIshizaka, J. Immunol., 141; 327
0, 1988）。したがって、流出／溶出画分のロゼット形
成阻止パーセントの比が３．０またはそれより高いなら
ば、ＧＩＦは（＋）と判定した。
【００７４】Ｉ． ＧＩＦの分画 ハイブリドーマ由来のＧＩＦがハチ毒ＰＬＡ2 に対して
親和性を有するかどうかを判定するために、ハイブリド
ーマ細胞の培養上清を抗原−結合Sepharoseで分画し
た。ハイブリドーマ細胞をＯＫＴ３抗体（８μｇ／ｍ
ｌ）で処理し、この抗体処理細胞懸濁液または非処理細
胞懸濁液（１．５ｘ１０6 細胞／ｍｌ）のうち８ｍｌの
アリコートを、抗−ＭＧＧでコーティングした組織培養
フラスコで培養した。培養上清を４倍に濃縮し、２ｍｌ
試料を０．４ｍｌＩｇＥ−Sepharose に吸着させた。流
出画分を０．５ｍｌＰＬＡ2 −Sepharose と一晩混合
し、免疫吸着剤を小カラムに詰めた。流出画分を回収し
た後、カラムをＤＰＢＳで洗浄し、１．０ｍｌグリシン
ＨＣｌ緩衝液、pH3.0 で溶出した。既述の方法（Akasak
i ら、J. Immunol., 136; 3172, 1987）によって、抗−
リポモジュリン（１４１Ｂ９）Sepharose で、ＧＩＦを
部分精製した。
【００７５】Ｊ．ホスホリパーゼ阻害活性の測定 アフィニティー精製ＧＩＦをアルカリ性ホスファターゼ
で既述のように処理した（Uedeら、J. Immunol., 139;
898, 1983 ）。簡単に述べると、１ｍｌの調製物をTris
- ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．２に対して透析し、１単位の
不溶性アルカリ性ホスファターゼ（子ウシ腸、Sigma ）
と室温で２時間混合した。遠心分離後、上清を０．１Ｍ
Tris- ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０に対して透析した。生
合成過程で3 Ｈ−オレイン酸により標識された大腸菌お
よびブタ膵臓ＰＬＡ2 （Sigma）を用いて、アルカリ性
ホスファターゼ処理試料のホスホリパーゼＡ2 阻害活性
を測定した（Rothutら、Biochem. Biophys. Res. Commu
n., 117; 878, 1983）。詳細な方法は、Ohnoら（Intern
at. Immunol., 1; 425, 1989）に記載されている。簡単
に述べると、ブタ膵臓ＰＬＡ2 （１ｘ１０-5ユニット）
をＧＩＦと混合し、総容量１５０μｌとした。２５℃で
５分後、 3Ｈ標識大腸菌の懸濁液５０μｌ(5000cpm) を
添加し、その混合物を２５℃で５分間インキュベートし
た。５０μｌの２ＭＨＣｌを添加して反応を止め、５０
μｌの１００ｍｇ／ｍｌＢＳＡをこの混合物に添加し
た。この懸濁液を５５００ｇで１分間遠心分離し、２５
０μｌ上清中の放射能をシンチレーション分光計で測定
した。
【００７６】Ｋ．イオン交換カラムクロマトグラフィー 無血清培地中のＡＣ５細胞の培養上清を、限外濾過によ
って２５から１００倍に濃縮した。１０，０００ｒｐｍ
で２０分間遠心分離した後、上清を蒸留水で８倍に希釈
し、TrisでｐＨ８．０に調整し、ただちに１０ｍＭ Tr
isＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０で平衡化したＤＥＡＥ−Se
pharose ＣＬ−６Ｂ（Pharmacia ）カラム（３ｍｌ容）
にかけた。流出（通過）画分を回収した後、カラムを４
カラム容の２０ｍＭＮａＣｌ含有１０ｍＭTris- ＨＣｌ
緩衝液で洗浄し、洗液を通過画分に合わせた。４カラム
容の５０ｍＭ，７５ｍＭ，１００ｍＭ，１５０ｍＭ，お
よび２００ｍＭＮａＣｌ含有１０ｍＭTris- ＨＣｌ緩衝
液、ｐＨ８．０でカラムに結合したタンパク質を良好に
溶出した。各溶出画分を濃縮し、ダルベッコのリン酸緩
衝塩類液（ＤＰＢＳ）に対して透析した。
【００７７】Ｌ．ゲル濾過 ＤＢＰＳ中の試料１ｍｌをSuperose 12 カラム（１．６
ｘ５０ｃｍ、Pharmacia ）にかけ、ＨＰＬＣ（Beckman,
System Gold）を用いて、流速１ｍｌ／分でＤＰＢＳに
よりこのカラムからタンパク質を溶出し、適当な画分を
集めた。ヒトＩｇＥ（ＰＳタンパク質、ＭＷ：１８５，
０００）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＭＷ：６７，
０００）、オボアルブミン（ＭＷ：４３，０００）、大
豆トリプシンインヒビター（ＭＷ：２０，１００）、お
よびシトクロームＣ（ＭＷ：１２，５００）を用いて、
このカラムを分子量で標準化(calibrate) した。ＩｇＥ
を除くすべての標準タンパク質は、Sigma から購入し
た。標準タンパク質の保持時間はそれぞれ４１．９７，
５２．０８，５５．１３５，６２．０９７，および７
１．６７分であった。
【００７８】Ｍ．ＧＩＦのアフィニティー精製 完全ＤＭＥ培地中のＣＬ３クローン培養上清を、限外濾
過によって５倍に濃縮し、１４１Ｂ９−Sepharose また
は抗−ＧＩＦSepharose カラム（５ｍｌ容）を通して一
晩再循環処理することによって、上清中のＧＩＦをこの
免疫吸着剤カラムに吸着させた（Iwata ら、J. Immuno
l., 141: 3270, 1988）。この免疫吸着剤を２０カラム
容のＤＰＢＳで洗浄し、ビーズに結合したタンパク質を
０．１ＭグリシンＨＣｌ緩衝液、ｐＨ３．０で溶出する
ことによって回収した。１４１Ｂ９−Sepharose を用い
た同一の技法によって、２３１Ｆ１細胞由来のマウスＧ
ＩＦを精製した。
【００７９】無タンパク質培地中で培養したＡＣ５細胞
培養上清中のＧＩＦを単離するために、この上清を限外
濾過によって５０から１００倍に濃縮した。ＤＥＡＥ−
Sepharose カラムから得られたこの上清の適当な画分
を、５−６ｍｌにまで濃縮し、４℃で一晩、モノクロー
ナル抗ＧＩＦ抗体と結合したAffigel 10- 免疫吸着剤
１．０−１．５ｍｌと混合した。この懸濁液を小カラム
に充填し、免疫吸着剤を４０カラム容のＤＰＢＳで洗浄
した。一部の実験では、免疫吸着剤を４０カラム容のＤ
ＰＢＳおよび２０カラム容の０．５ＭＮａＣｌ含有ＰＢ
Ｓで洗浄した。０．１５ＭＮａＣｌ含有０．０５Ｍグリ
シンＨＣｌ緩衝液、ｐＨ３．０−３．２、で免疫吸着剤
に結合したタンパク質を溶出した。
【００８０】Ｎ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＧＩＦの検出 アフィニティー精製ＧＩＦを脱イオン水中の０．０１％
ＳＤＳに対して透析し、Speed vac （Savant Instrumen
ts, Hicksville, NY）中で凍結乾燥した。次に、Laemml
i System（Laemmli, U. K., Nature, 227: 680, 1970）
を用いて、１５％ポリアクリルアミドスラブゲル中での
ＳＤＳゲル電気泳動によって試料を分析した。ゲルを固
定し、タンパク質バンドを銀染色によって検出した（Oc
hsら、Electrophoresis, 2: 304, 1981 ）。分子量標準
は、Pharmacia から購入した。
【００８１】Ｏ．ＥＬＩＳＡアッセイ モノクローナル抗−ＧＩＦ抗体を検出するために、Stee
leらによって記載された方法（J. Immunol., 142: 221
3, 1989）を多少変更して用いた。簡単に述べると、
０．１Ｍ炭酸コーティング緩衝液、ｐＨ９．６で希釈し
た１００μｌアフィニティー精製ＧＩＦでImmulon I プ
レート（Dynatech）を一晩コーティングした。以下の各
操作段階の間に、０．０５％Tween20 含有リン酸緩衝塩
類液（ＰＢＳ）で、プレートを３回洗浄した。ＰＢＳ中
の２％ＢＳＡで、６−９時間、プレートをブロックし
た。次いで、各試験試料の１００μｌをウェルに添加
し、そのプレートを一晩４℃に保持した。アルカリ性ホ
スファターゼ結合ヤギ抗−マウスＩｇ（Zymed Lab, So.
San Francisco, CA）およびアルカリ性ホスファターゼ
基質（Sigma ）を用いて、マウスＩｇのプレートへの結
合を検出した。基質添加の３０分後に、マイクロプレー
トリーダーＭＲ５０００（Dynatech Lab）において４１
０ｎｍのフィルターでＥＬＩＳＡシグナルを読み取っ
た。ＥＬＩＳＡアッセイでマウスｍＡｂのためのイソタ
イプ判定キット（Zymed Lab ）を使用することによっ
て、モノクローナル抗体のイソタイプを決定した。
【００８２】アフィニティー精製ＧＩＦ調製物の画分の
ＧＩＦを検出するために、ビオチン−アビジンシステム
および増幅法（Stanley ら、J. Immunol. Methods, 83:
89, 1985 ）を用いて、感度を高めた。Maxi-Sorp マイ
クロタイタープレート（Nunc, Copenhagen, Denmark ）
を５０μｌの各画分でコーティングした。３７℃で２時
間インキュベートした後、プレートをTween/ＰＢＳで洗
浄し、４℃で一晩、２％ＢＳＡでブロックした。洗浄
後、５０μｌのビオチン結合ｍＡｂ１４１−Ｂ９（２０
０ｎｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加し、そのプレートを３
７℃で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、
５０μｌの１：１５００希釈ストレプトアビジン−アル
カリ性ホスファターゼ複合体（Zymed Lab ）を各ウェル
に添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、ウ
ェルに結合したアルカリ性ホスファターゼの量を増幅シ
ステムによって測定した（Stanley ら、J. Immunol. Me
thods, 83: 89, 1985 ）（GIBCO-BRL, Bethesda, MD
）。ＥＬＩＳＡシグナルを４９０ｎｍで測定した。
【００８３】実施例２ ヒト抗原特異的ＧＩＦを産生するハイブリドーマの特性
決定 上記のように、ハチ毒に感受性の患者のＰＢＭＣを、１
０μｇ／ｍｌＤ−ＰＬＡ2 の存在下で３日間培養し、活
性化されたＴ細胞を３μｌ／ｍｌ組換えリポコルチン存
在下で４日間、ＩＬ−２によって増殖させた。次に、Ｔ
細胞をＢＵＣ細胞と融合させてハイブリドーマを構築し
た。本実験に於て、４ハイブリドーマクローンが得られ
た。完全ＤＭＥＭで各ハイブリドーマクローンを培養
し、培養上清をＹＭ１００メンブランで濾過した。濾液
を１０倍に濃縮し、１２Ｈ５細胞を用いてＧＩＦの存在
について評価した。表１に示された結果は、４ハイブリ
ドーマクローンのうち二つが構成的にＧＩＦを分泌する
ことを示す。 表１ ＧＩＦ産生ハイブリドーマの選択 3H-オレイン酸放出c GIF 活性a 放出 阻害ハイブリドーマ 流出／溶出 (cpm) (％) Ｃｌ １ 0/26 (−) ＮＤ -- Ｃｌ ２ 2/33 (−) 390±27 4 Ｃｌ ３ 29/0 (＋) 257±25 37 Ｃｌ ７ 27/5 (＋) 303±17 26 対 照 0/31b 408±15 -- ａ）各クローンの培養濾液を１０倍に濃縮した。一容量
の濾液を、同量の１２Ｈ５細胞懸濁液に添加し、１０μ
ｇ／ｍｌマウスＩｇＥの存在下でこの細胞を２４時間培
養した。縦列の数字は、レンチルレクチンSepharose か
らの流出／溶出画分によるロゼット形成阻止パーセント
を表す。ＩｇＥ−ＢＦ非存在下でのＩｇＥ−ＲＦＣの割
合は２４．４＋０．３（ＳＤ）％であった。 ｂ）１２Ｈ５細胞を１０μｇ／ｍｌマウスＩｇＥのみと
ともに培養し、培養濾液中のＩｇＥ−ＢＦをレンチルレ
クチンSepharose で分画した。 ｃ）培養濾液を１４１Ｂ９−Sepharose で分画し、この
免疫吸着剤からの酸溶出物を、もとの培養上清の１／１
００容となるまで濃縮した。この試料をアルカリ性ホス
ファターゼで処理し、脱リン酸化物質の膵臓ホスホリパ
ーゼＡ２阻害能を評価した。ハイブリドーマクローンＣ
Ｌ３上のＣＤ３決定基の存在を、フローサイトメトリー
およびロゼット形成技法によって評価した。８μｇ／ｍ
ｌのモノクローナル抗体ＯＫＴ３で細胞を処理し、次
に、フルオレセイン標識したヤギ抗−マウスＩｇで染色
した。全細胞の１０％足らずが染色された。またＯＫＴ
３処理細胞のうちわずかに６−８％が抗−ＭＧＧ結合赤
血球とロゼット形成することが明らかになった。結論と
して、実施例１に記載されたロゼット形成法を用いて、
ＣＤ３+細胞は純化された。パーコール層での密度勾配
遠心分離法によって、抗−ＭＧＧ結合赤血球とロゼット
形成した細胞を、ロゼット形成しない細胞から分離し、
完全ＤＭＥＭ中で培養することによって増殖させた。同
様の手順を３回繰り返して、ＣＤ３+ 細胞集団を純化し
た。最終的な細胞調製物をＯＫＴ３で処理した後、抗−
ＭＧＧ結合赤血球とともにインキュベートすることによ
って細胞集団の８０−９０％がロゼットを形成すること
が明らかになった。フローサイトメトリーにおいて、細
胞の７５％がＯＫＴ３によって染色された。しかしなが
ら、４代継代して２週間細胞を培養した結果、約５２％
までＣＤ３+ 細胞が減少した（フローサイトメトリーに
よる測定）場合には、ＣＤ３+ 細胞集団を細胞選別によ
ってさらに純化し、培養によって細胞を増殖させた。細
胞選別を２回繰り返した後、安定的にＣＤ３を発現する
ＣＬ３集団が得られた。ＯＫＴ３およびＷＴ３１（抗−
ＴｃＲαβ）によるこの細胞集団の蛍光染色は、ほぼ１
００％の細胞がＣＤ３を表現し、細胞の大部分がＴｃＲ
αβを表現することを示した。ＣＤ３+ 細胞集団および
ＣＤ３- 細胞集団を培養し、１２Ｈ５細胞をもちいてＧ
ＩＦの有無について培養濾液を評価した。ＣＤ３+ 細胞
の培養濾液にはＧＩＦ活性が検出されたが、ＣＤ３- 集
団の培養濾液には検出されなかった。この結果は、ＧＩ
Ｆの起源がＣＤ３+ 細胞であることを示した。
【００８４】マウスＧＩＦに特有の性質の一つはモノク
ローナル抗−リポモジュリン（１４１Ｂ９）がこのリン
ホカインと結合していることであるので、ＣＬ３細胞に
由来するヒトＧＩＦが１４１Ｂ９結合Sepharose に吸着
されるかどうかを判定することとした。ＣＤ３+ , ＣＬ
３クローンを培養して、１リットルの培養上清を得た。
ＹＭ１００メンブランで濾過した後、濾液を５ｍｌに濃
縮し、１ｍｌの１４１−Ｂ９Sepharose で分画した。流
出画分を回収した後、免疫吸着剤を１０カラム容のＤＰ
ＢＳで洗浄し、次に５カラム容のグリシン−ＨＣｌ緩衝
液、ｐＨ３．０で溶出した。ＤＰＢＳに対して透析した
後、１２Ｈ５細胞を用いて、分画におけるＧＩＦ活性の
分布を測定した。表２に示す結果は、この培養濾液中の
ＧＩＦ活性のほとんどすべてが、１４１−Ｂ９Sepharos
e に結合し、酸性ｐＨでの溶出によって回収されたこと
を示す。 表２ 抗−リポモジュリンSepharose a でのアフィニティー クロマトグラフィーによって精製された ＣＬ３クローン由来ヒトＧＩＦ 141B9-Sepharoseb ＧＩＦ活性c からの画分 希釈 流出／溶出 流 出 1:10 0/31(−) 洗 浄 1:10 0/35(−) 溶 出 1:10 42/0(＋) 1:40 45/0(＋) 1:80 39/0(＋) 培地対照 -- 0/34 ａ）ＣＬ３クローンの培養上清をＹＭ１００メンブラン
で濾過し、濾液を２００倍に濃縮した。濃縮した濾液の
５ｍｌを１ｍｌの１４１Ｂ９−Sepharose で分画した。 ｂ）流出画分を回収した後、５カラム容のＤＰＢＳで免
疫吸着剤を洗浄し、次に５カラム容のグリシンＨＣｌ緩
衝液、ｐＨ３．０で溶出した。 ｃ）１２Ｈ５細胞を用いて、表１に記載されたのと同様
の方法によって、ＧＩＦ活性を評価した。縦列の数字
は、レンチルレクチンSepharose からの流出／溶出画分
によるロゼット形成阻止パーセントを表す。ＩｇＥ−Ｂ
Ｆ不存在下でのＩｇＥ−ＲＦＣの割合は、このアッセイ
では２２．９±０．６（ＳＤ）％であった。（＋）はＧ
ＩＦの存在を示す。以前の実験で、マウスＧＩＦがホス
ホリパーゼ阻害タンパク質のリン酸化誘導体であるとい
う証拠が示された（Uedeら、J. Immunol., 139: 898, 1
983 ）。したがって、ＣＬ３クローンの培養濾液中のＧ
ＩＦは、１４１Ｂ９−Sepharose を用いて精製された。
他の三クローン、ＣＬ１，ＣＬ２，およびＣＬ７、の培
養濾液を、同様に１４１Ｂ９−Sepharose で分画した。
この免疫吸着剤からの酸溶出物をアルカリ性ホスファタ
ーゼで処理し、膵臓ホスホリパーゼＡ2 によって生合成
過程で標識された大腸菌からの 3Ｈ−オレイン酸の放出
を阻害する能力を調べた（Rothutら、Biochem. Biophy
s. Res. Commun., 117: 878, 1983）。表１に示す結果
は、ＣＬ３およびＣＬ７由来のアフィニティー精製ＧＩ
Ｆはホスホリパーゼ阻害活性を発揮するが、ＣＬ１およ
びＣＬ２由来の同一画分はホスホリパーゼＡ2 を阻害し
なかったことを示す。
【００８５】実施例３ ＧＩＦの抗原結合性 前の実験で、リポコルチン存在下でＩＬ−２によって増
殖させた抗原活性化Ｔ細胞が、ハチ毒ＰＬＡ2 に親和性
を示さないＧＩＦを構成的に分泌することが示されてい
るが、同じ細胞にＣＤ３が架橋結合することによって、
ＩｇＥ−ＢＦとともにこの抗原の結合したSepharose に
親和性を有するＧＩＦの産生が生じた。このような発見
から、ＣＬ３クローンが抗原結合ＧＩＦおよびＩｇＥ−
ＢＦを産生するかどうかを判定することとした。細胞を
０℃でＯＫＴ３で処理し、この抗体処理細胞（１．５ｘ
１０6 細胞／ｍｌ）を抗ＭＧＧでコーティングしたウェ
ルで培養した。対照として、非処理のＣＬ３細胞を抗Ｍ
ＧＧでコーティングしたウェルで培養した。培養上清を
ＹＭ１００メンブランで濾過し、限外濾過で７倍に濃縮
した。濃縮した培養濾液を１ｍｌＩｇＥ−Sepharose に
一晩吸着させ、非結合タンパク質画分および２ｍｌ洗液
を合わせた。このＩｇＥ−Sepharose を完全に洗浄し、
グリシンＨＣｌ緩衝液で溶出した。ＲＰＭＩ８８６６細
胞をＦcεＲ+細胞の供給源として用いて、ＩｇＥ−Seph
arose からの溶出画分をＩｇＥ−ＢＦの存在について評
価した。 表３ ＣＬ３クローン由来ＧＩＦは ハチ毒ＰＬＡ2 に結合しない PLA2-Sepharosec でのＧＩＦ活性 処 理 a IgE-BF b 流出 洗浄 溶出 (％) ＯＫＴ３ 23 34/0 (＋) 21/0 (＋) 0/24(−) な し 0 28/0 (＋) 22/13(±) 0/26(−) ａ）ＣＤ３処理または非処理細胞を抗−ＭＧＧでコーテ
ィングしたウェルで培養した。 ｂ）３０ｍｌ培養上清をＹＭ１００で濾過し、濾液を４
ｍｌに濃縮した。この試料を１．０ｍｌＩｇＥ−Sephar
ose に吸着させた。酸溶出画分を４．０ｍｌに調整し、
ロゼット形成阻止によってＩｇＥ−ＢＦについて評価し
た。ＩｇＥ−ＢＦ不存在下でのＩｇＥ−ＢＦの割合は、
３７．７±１．０％であった。 ｃ）ＩｇＥ−Sepharose からの流出画分の１．０ｍｌを
ＰＬＡ2 −Sepharose で分画した。この流出、洗浄、お
よび酸溶出画分を１．３ｍｌに調整し、１２Ｈ５細胞を
用いてＧＩＦ活性について評価した。縦列の数字はレン
チルレクチンSepharose からの流出／溶出画分によるロ
ゼット形成阻止パーセントを表す。ＩｇＥ−ＢＦ不存在
下でのＩｇＥ−ＲＦＣの割合は、２１．７±０．６（Ｓ
Ｄ）％であった。 表３に示した結果は、抗−ＣＤ３処理細胞はＩｇＥ−Ｂ
Ｆを産生するが、非処理細胞は検出可能な量のＩｇＥ−
ＢＦを産生しなかったことを示す。ＩｇＥ−Sepharose
からの流出画分を２倍に濃縮し、１ｍｌ試料を０．２５
ｍｌＰＬＡ2 −Sepharose で分画した。この流出画分、
洗浄液、および溶出画分を１．５ｍｌに調整し、それら
の試料をＧＩＦ活性について評価した。表３に示すよう
に、非刺激細胞および抗−ＣＤ３処理細胞のどちらに由
来するＧＩＦも、ＰＬＡ2 −Sepharose に結合しなかっ
た。
【００８６】抗−ＣＤ３処理ＣＬ３細胞由来のＧＩＦが
ＰＬＡ2 と結合しないのは、Ｔ細胞の活性化にＤ−ＰＬ
Ａ2 を用いたことと関係があると考えられた。この可能
性を調べるために、ハチ毒感受性の患者のＰＢＭＣから
もっと多くのＴ細胞ハイブリドーマを構築した。Ｔ細胞
ハイブリドーマを構築する手順は上記と全く同様である
が、但しＤ−ＰＬＡ2 の代わりにＣＮＢｒ−処理ＰＬＡ
2 、１０μｇ／ｍｌでＰＢＭＣを刺激した。この実験の
結果として、２２のハイブリドーマクローンが得られ
た。各クローンの培養濾液のＧＩＦアッセイは、２２ク
ローンのうち１０個が構成的にＧＩＦを産生することを
示した（結果は示さない）。７個のＧＩＦ分泌クローン
をＯＫＴ３で処理し、抗−ＭＧＧでコーティングしたシ
ャーレでこの抗体処理細胞を培養した。培養濾液を４倍
に濃縮し、ＩｇＥ−Sepharose に吸着させた。 表４ 抗−ＣＤ３−処理ハイブリドーマ細胞a による 抗原−結合ＧＩＦの産生 PLA2-Sepharosec におけるＧＩＦ活性 クローン IgE-BF b 流出 溶出 (％) ＡＣ５ 20 0/21 (−) 31/0 (＋) ＡＦ１０ 36 19/0 (＋) 0/21 (−) ＢＡ６ 8 29/0 (＋) 0/24 (−) ＢＥ１２ 65 0/31 (−) 25/0 (＋) ＢＦ５ 65 0/27 (−) 20/0 (＋) ＣＢ７ 64 0/28 (−) 17/0 (＋) ＣＥ５ 58 0/28 (−) 35/0 (＋) ａ）１．２ｘ１０7 細胞をＯＫＴ３で処理した。細胞を
８ｍｌの培養基に再懸濁し、抗−ＭＧＧでコーティング
したフラスコに分注した。培養上清を４倍に濃縮し、Ｉ
ｇＥ−Sepharose に吸着させた。ＩｇＥ−Sepharose か
らの流出液をさらにＰＬＡ2 −Sepharose で分画し、そ
の流出および溶出画分のＧＩＦ活性を測定した。 ｂ）ＩｇＥ−Sepharose からの酸溶出画分をＩｇＥ−Ｂ
Ｆの有無について評価した。ＩｇＥ−ＢＦ非存在下での
ＩｇＥ−ＲＦＣの割合は２６．３±０．６（ＳＤ）％で
あった。 ｃ）１２Ｈ５細胞を用いてＧＩＦ活性を測定した。数字
はレンチルレクチンSepharose からの流出／溶出画分に
よるロゼット形成阻止パーセントを表す。ＩｇＥ−ＢＦ
非存在下でのＩｇＥ−ＲＦＣの割合は、２６．０±０．
７（ＳＤ）％であった。（＋）はＧＩＦの存在を示す。 表４に示すように、７クローンのうち６クローンのＩｇ
Ｅ−Sepharose からの酸溶出画分は検出可能な量のＩｇ
Ｅ−ＢＦを含有した。ＰＬＡ2 −Sepharose でＩｇＥ−
Sepharose からの流出画分をさらに分画し、この免疫吸
着剤からの流出および溶出画分のＧＩＦ活性を測定し
た。表４に示す結果は、７クローンのうち５クローンに
由来するＧＩＦの大部分がＰＬＡ2 −Sepharose に結合
し、酸性ｐＨでの溶出により回収されることを示す。こ
れらのクローンが抗原結合ＧＩＦを産生するためにはＣ
Ｄ３の架橋結合が必要であることを確認するために、こ
れらの５クローンを、抗−ＣＤ３で処理せずに、抗−Ｍ
ＧＧでコーティングしたウェルで培養した。予想通り、
培養上清はＩｇＥ−ＢＦを含有せず、上清中のＧＩＦは
ＰＬＡ2 −Sepharose に結合しなかった。
【００８７】本発明は、ハチ毒ＰＬＡ2 に対してアレル
ギー反応を起こす患者のＰＢＭＣに由来するＧＩＦ産生
Ｔ細胞集団の発達を可能にし、このＴ細胞からＧＩＦ産
生ハイブリドーマを確立する技術を提供する。典型的な
ハイブリドーマはＣＤ３決定基およびＴＣＲαβを表現
し、このことはこれらがＴ細胞ハイブリドーマであるこ
とを意味する。さらに、ハイブリドーマ上のＴｃＲ複合
体は機能していると思われる。親Ｔ細胞（Cariniら、J.
Immunol. Methods, 127: 221, 1990 ）およびＧＩＦ産
生ハイブリドーマ（表３、４）の大部分はいずれも、Ｃ
Ｄ３の架橋結合によってＩｇＥ−ＢＦを産生した。ま
た、モノクローナル抗体ＷＴ３１および抗−ＭＧＧによ
ってＣＬ３およびＡＣ５クローンのＴｃＲαβが架橋結
合した結果、ＩｇＥ−ＢＦが産生された（結果は示さな
い）。代表的なＣＤ３+ ハイブリドーマをさらに調べた
結果、ＣＬ３，ＢＥ１２，ＡＣ５およびＣＢ７クローン
のすべてがＣＤ４およびＣＤ８をともに表現した。ハイ
ブリドーマ構築に用いられたＢＵＣ細胞はＣＤ４+ ＣＤ
８- であるので（J. Stobo博士からの私信）、ハイブリ
ドーマの親Ｔ細胞がＣＤ４およびＣＤ８をともに表現す
るかどうかは明かでない。
【００８８】本実験はＴ細胞ハイブリドーマの一部がそ
の細胞上のＣＤ３の架橋結合によって抗原（ＰＬＡ2 ）
結合ＧＩＦを産生することを示した。この発見は、代表
的なマウスＧＩＦ−産生ハイブリドーマが抗原パルスし
た同系マクロファージによる刺激によって、または細胞
上のＣＤ３の架橋結合によって、抗原結合ＧＩＦを産生
するという事実と一致し（Iwata およびIshizaka, J. I
mmunol., 141: 3270,1988, Iwata ら、J. Immunol., 14
3: 3917, 1989）、二つの種に由来する抗原結合ＧＩＦ
間の類似性を示唆した。マウスの系では、ハイブリドー
マから得られた抗原結合ＧＩＦはインビボ抗体応答を担
体（抗原）−特異的に抑制した。ハイブリドーマ由来の
抗原結合ＧＩＦが抗原結合ポリペプチド鎖と非特異的Ｇ
ＩＦからなること（Jardieu およびIshizaka, Immune R
egulation by Characterized Polypeptides, G. Goldst
ein 他編、Alan R. Liss, New York, p.595, 1987 ）お
よびその抗原結合鎖はエフェクター型サプレッサーＴ細
胞因子（ＴｓｅＦ）と共通の抗原決定基１４−１２を共
有すること（Iwata ら、同上、1989）も明らかになっ
た。異なる実験から、モノクローナル抗リポモジュリン
抗体１４１−Ｂ９および抗−Ｉ−Ｊ抗体の両方が、ＧＩ
Ｆのみならず、ＴｓｅＦおよびＴｓｉＦの非抗原結合鎖
（Ｉ−Ｊ+ 鎖）にも結合することが示されている（Jard
ieu ら、J. Immunol., 138: 1494, 1986, Steeleら、J.
Immunol., 142: 2213, 1989）。以上の知見を総合する
と、抗原結合ＧＩＦがＴｓｅＦと同一であることが示唆
される。代表的なマウスＴｓハイブリドーマ７１Ｂ４の
親Ｔ細胞は、ＯＶＡ刺激脾臓細胞を同一抗原で刺激し、
次にＧＩＦの存在下で抗原活性化Ｔ細胞を増殖させるこ
とによって得られた（Iwata およびIshizaka, J. Immun
ol., 141: 3270, 1988）。同じ方策を用いて、本実験で
はヒトＴ細胞ハイブリドーマの親細胞を得た。実際、ヒ
トハイブリドーマ由来の非特異的ＧＩＦとＰＬＡ2 結合
ＧＩＦはいずれも、以前の研究でマウスＴｓＦがやはり
結合することが明らかになっている１４１Ｂ９−Sephar
ose に結合した（Steeleら、J. Immunol., 142: 2213,
1989）。ヒトＴ細胞ハイブリドーマ由来のＰＬＡ2 結合
ＧＩＦがヒト抗原特異的ＴｓｅＦに相当する可能性があ
る。しかしながら、抗原結合ＧＩＦがマウスＴｓｉＦと
同等である可能性もまだある。発明者の研究室での最近
の実験は、ホスホリパーゼＡ2インヒビターの存在下で
細胞を前培養した後、抗原（コンアルブミン）で刺激さ
れた抗原提示細胞で刺激した場合、典型的なマウスヘル
パーＴ細胞クローンＤ１０．Ｇ４．１は抗原結合ＧＩＦ
を産生することができることを示している（Ohnoら、In
ternat. Immunol., 2: 257, 1990）。この抗原結合ＧＩ
Ｆはモノクローナル抗体１４−３０と結合した。このモ
ノクローナル抗体はむしろＴｓｉＦに特異的であること
が明らかにされている（Fergusonおよび Iverson, J. I
mmunol., 136: 2896, 1986）。Green ら（J. Mol. Cell
Immunol., 3: 95, 1987）は、ＵＶ照射抗原刺激マクロ
ファージを用いた抗原刺激によってＤ１０．Ｇ４．１ク
ローンが抗原結合ＴｓＦを産生すること、およびこの因
子が補助分子とともに、エフェクター型抗原特異的Ｔｓ
の産生を誘導することも報告した。アレルギー患者由来
のＰＢＭＣはヘルパーＴ細胞を含有するので、ヒトハイ
ブリドーマ由来の抗原結合ＧＩＦがＴｓｅＦではなくＴ
ｓｉＦに相当する可能性がまだある。
【００８９】Takeuchiら（J. Immunol., 141: 3010, 19
88）は、ＫＬＨで刺激した個体、すなわち大量の同一抗
原の注射を繰り返し受けた個体、のＰＢＭＣからＴｓｅ
クローンを確立した。また、Modulin ら（Nature, 322:
459, 1986）は、らい腫らい患者の病変からＴｓクロー
ンを確立した。しかしながら、本発明以前には、ヒトＴ
ｓ細胞由来のサプレッサー活性を仲介するエフェクター
分子（ＴｓＦ）は同定されていない。ヒトＧＩＦとマウ
スＧＩＦとの類似性は、ヒトＴ細胞ハイブリドーマ由来
のＰＬＡ2 結合ＧＩＦがヒトサプレッサーＴ細胞に由来
するＴｓＦに相当することを示唆する。抗原結合ＧＩＦ
を産生するＴ細胞ハイブリドーマは、この分子の生化学
的解析を容易にするであろう。ＴｓならびにＴｓＦ（抗
原結合ＧＩＦ）がＩｇＧ抗体応答よりもＩｇＥ抗体応答
をより有効に抑制することがマウスでは繰り返し示され
ている （Ishizakaら、J. Immunol., 114: 110, 1975
）。ヒトＴ細胞ハイブリドーマ由来のアレルゲン結合
ＧＩＦが実際にＴｓＦに相当するならば、Ｔ細胞因子が
親Ｔ細胞のドナーのＩｇＥ抗体応答を抑制することは、
当然予想される。
【００９０】実施例４ スギ花粉特異的ＧＩＦを産生するハイブリドーマ細胞系
の調製 日本において、スギ花粉は主要なアレルゲンであり、人
口のかなりの部分に季節性のアレルギー性鼻炎および結
膜炎を引き起こす。他の抗原に対する本発明の知見の一
般的な適用可能性を調べるために、抗原特異的ＧＩＦ産
生Ｔ細胞およびＴ細胞ハイブリドーマを調製するための
方法（上記）をスギアレルゲンに対してアレルギー反応
を起こす患者の末梢血液単核細胞に適用した。
【００９１】スギ（Cryptomeria japonica）に含まれる
主要なアレルゲンは、cryj-1と命名された４０ｋＤａの
糖タンパク質である（Yasueda ら、J. Allergy and Cli
n. Immunol., 71: 77, 1983 ）。本研究のために、多少
の改変を加えた上記方法によってスギ花粉抽出物からア
レルゲンを単離した。簡単に述べると、花粉をエーテル
で脱脂し、０．１２５Ｍ炭酸水素アンモニウムで３回抽
出した。臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムによ
って抽出物中の炭水化物を除去した。抽出物中のタンパ
ク質を８０％飽和硫酸アンモニウムで沈澱させ、その沈
澱を０．０５ＭTris-HCl 緩衝液、ｐＨ７．８に溶解し
た。このTris-HCl緩衝液で十分透析した後、タンパク質
画分をＤＥＡＥセルロースカラム（ＤＥ−５２，Whatma
n ）にかけ、通過画分を得た。この画分を濃縮し、０．
０１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０に対して透析し、この緩
衝液で平衡化したＣＭセルロースカラム（ＣＭ−５２，
Whatman ）にかけた。カラムをこの緩衝液で洗浄し、カ
ラムに残留したタンパク質を０．３Ｍ塩化ナトリウム含
有０．１Ｍリン酸緩衝液で溶出した。Sephacryl S-200
HRカラムでのゲル濾過によってこの溶出液中のタンパク
質をさらに分画し、cryj-1を含有する主要タンパク質画
分を得た。この画分の主なタンパク質は、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって４２ｋＤａと測定
され、このタンパク質のＮ末端アミノ酸配列はcryj-1と
同一であった。このタンパク質を、１．５ｍｇ／ｍｌゲ
ルの割合で、Affigel 10に結合させた。
【００９２】合成ホスホリパーゼＡ2 阻害物質、２−
（ｐ−アミルシンナモイル）−アミノ−４−クロロ安息
香酸（ＯＮＯ−ＲＳ−０８２，ONO Pharmaceutical C
o.）を、組換えヒトリポコルチンＩの代わりに用いた。
以前の実験から、ＯＮＯ−ＲＳ−０８２がホスホリパー
ゼＡ2 の特異的阻害物質であり、マウス脾臓細胞培養に
おいてＧＩＦ産生細胞の発生を促進することが明らかに
なっていた（Ohnoら、International Immunology, 1: 4
25, 1989）。オボアルブミン感作マウスの脾臓細胞をオ
ボアルブミンで刺激し、２μＭのＯＮＯ−ＲＳ−０８２
または３μｇ／ｍｌの組換えヒトリポコルチンＩのいず
れかの存在下で、ＩＬ−２によって抗原活性化Ｔ細胞を
増殖させたとき、ＧＩＦを産生する抗原特異的Ｔ細胞が
生じた。抗原刺激Ｔ細胞およびＴ細胞ハイブリドーマの
構築は、上記とほぼ同様に行なわれたが、ただし抗原と
して精製cryj-1を用い、ホスホリパーゼＡ2 阻害物質と
してＯＮＯ−ＲＳ−０８２を用いた。このようにして、
スギ花粉に対してアレルギー反応を起こす患者の末梢血
液から単核細胞を得て、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）
を含有するＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。１０μｇ
／ｍｌ cryj-1 の存在下で、単核細胞の懸濁液（３ｘ１
０6 細胞／ｍｌ）を３日間培養した。非付着細胞を回収
し、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ培地に再懸濁し
（３ｘ１０5 細胞／ｍｌ）、６０ユニット／ｍｌヒトＩ
Ｌ−２および２μＭのＯＮＯ−ＲＳ−０８２の存在下で
４日間培養した。次に、このようにして増殖させた細胞
を回収し、ＢＵＣ細胞と融合させてハイブリドーマを構
築した。
【００９３】ハイブリドーマをモノクローナル抗−ＣＤ
３抗体ＳＰＢ−Ｔ３ｂ（Spits ら、Hibridoma 2: 423,
1983）で処理し、細胞上のＣＤ３の存在を免疫蛍光法に
よって調べた。ＣＤ３＋のハイブリドーマだけを限界希
釈によってサブクローニングした。１０％ＦＣＳを含有
する完全ＤＭＥ培地でＣＤ３＋ハイブリドーマクローン
を維持し、１２Ｈ５細胞を使用することによって各クロ
ーンの培養上清をＧＩＦの存在について評価した。一患
者に由来するハイブリドーマについて得られた結果を表
５に示す。３ハイブリドーマ；３１Ｅ９，３１Ｂ７，お
よび３２Ｂ４の培養上清中にＧＩＦ活性を検出した。別
の２ハイブリドーマ３１Ｈ６および３１Ｈ３の上清は、
弱いＧＩＦ活性を有すると思われる。こうして得られた
ＧＩＦ産生ハイブリドーマを抗−ＣＤ３抗体で処理した
後、抗−マウス免疫グロブリンで処理し、その細胞を２
４時間培養した。次に、培養上清をcryj-1結合免疫吸着
剤で分画した。この免疫吸着剤からの通過画分および酸
溶出画分に存在するＧＩＦ活性を１２Ｈ５細胞を用いて
評価した。その結果は表５に含まれるが、３１Ｅ９細胞
由来のＧＩＦはcryj-1-Affigelに結合し、酸性ｐＨでの
溶出で回収されるが、３１Ｂ７細胞由来のＧＩＦは抗原
結合免疫吸着剤に結合しなかったことを示す。以上の結
果は、抗−ＣＤ３で刺激することによって３１Ｅ９細胞
がcryj-1に親和性を有するＧＩＦを産生することを示
す。 表５ ヒトスギアレルゲン−特異的ハイブリドーマの作成a ハイブリドー ％ロゼッド形成阻止 b cryj-1Sepharosec 中のGI活性 マクローン （流出／溶出） 非結合 結合 無 0/23 0/29 -- ３１Ｈ６ 20/13(±) 5/20 (−) 12/10(±) ３１Ａ１１ 0/25 (−) ND -- ３１Ｅ９ 28/5 (＋) 0/22 (−) 20/0 (＋) ３１Ｈ３ 23/12(±) 0/34 (−) 38/16(±) ３１Ｂ７ 32/5 (＋) 20/5 (＋) 4/24 (−) ３１Ｆ７ 0/26 (−) ND -- ３２Ｂ４ 22/0 (＋) 22/14(±) 38/22(±) ａ）この表中のハイブリドーマは２回の異なる実験から
誘導された。 ｂ）刺激を行なわなかったハイブリドーマの培養上清を
ＧＩＦの存在でスクリーニングした。１２Ｈ５細胞のア
リコートを各ハイブリドーマの培養上清とともにマウス
ＩｇＥ存在下でインキュベートした。１２Ｈ５細胞の培
養上清をＣＦ５０Ａで濾過してＩｇＥを除去し、濾液を
レンチルレクチンSepharose で分画した。流出および溶
出画分におけるＩｇＥ−ＢＦをロゼット形成阻止によっ
て評価した。縦列の数字はレンチルレクチンSepharose
からの流出／溶出画分によるロゼット形成阻止パーセン
トを表す。（＋）（−）の表示は、それぞれＧＩＦの存
在および非存在を示す。 ｃ）代表的なハイブリドーマを抗−ＣＤ３抗体で処理
し、培養上清をcryj-1結合Affigel で分画した。通過
（非結合）画分および酸溶出（結合）画分中のＧＩＦ活
性の存在を１２Ｈ５細胞を用いて測定した。１２Ｈ５細
胞培養濾液をレンチルレクチンSepharose で分画した。
数字はレンチルレクチンSepharose からの流出／溶出画
分によるロゼット形成阻止パーセントを表す。３１Ｅ９
細胞由来のＧＩＦは、cryj-1-Affigelに結合し、酸性ｐ
Ｈでの溶出によって回収されるが、３１Ｂ７細胞由来の
ＧＩＦはcryj-1-Affigelカラムに保持されなかった。
【００９４】実施例５ ヒトＧＩＦに特異的なモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマ細胞系の調製および特性決定 Ａ．ハイブリドーマの構築およびスクリーニング 抗−リポモジュリン（１４１−Ｂ９）-Sepharoseを用い
て、Ｔ細胞ハイブリドーマＣＬ３の培養上清中のヒトＧ
ＩＦを精製した。アフィニティー精製ＧＩＦを完全フロ
イントアジュバントに混合し、２週間間隔で３回この抗
原を腹腔内に注入して、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し
た。最終免疫から２週間後、免疫したマウスの脾臓細胞
を採り、あらかじめ６２５Ｒγ線を照射した同系のＢＡ
ＬＢ／ｃマウスに１ｘ１０7 脾臓細胞を移入した。移入
を受けたマウスは細胞移入後ただちに、および２週間後
に、不完全フロイントアジュバントに包含される精製Ｇ
ＩＦで免疫された。追加免疫から１週間後、その脾臓細
胞をＨＰＲＴ−欠失Ｂ細胞系ＳＰ２／０−１４ＡＧと融
合させた。支持細胞層としてＢＡＬＢ／ｃマクロファー
ジとともにＨＡＴ培地中でこの細胞を培養した。この培
養で得られた１０２個のハイブリドーマクローンはマウ
ス免疫グロブリンの産生によって選択され、Ｉｇ−産生
ハイブリドーマはＥＬＩＳＡアッセイおよび続いて１２
Ｈ５細胞を用いたバイオアッセイにより抗−ＧＩＦ抗体
産生によって選択された。
【００９５】ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、Immulon I
プレート（Dynatech）をアフィニティー精製ＧＩＦでコ
ーティングした。対照ウェルにはＤＰＢＳを容れた。ウ
ェルを２％ＢＳＡでブロックした後、培養上清を各ウェ
ルに分注し、マウスＩｇのウェルへの結合を、アルカリ
性ホスファターゼ結合抗−マウスＩｇ抗体を用いて判定
した。表６に示すように、１１ハイブリドーマクローン
の培養上清が有意なＥＬＩＳＡシグナルを与えた。 表６ 抗−ＧＩＦ−産生ハイブリドーマa の選択 ハイブリドーマ ELISA GIF活性c Ｉｇクローン イソタイプ シグナル/ 対照b 流出／溶出 無 -- 0/0 29/1 (＋) ３３４Ｆ IgM 0.195/0.003 33/1 (＋) ３５５Ｃ IgM 0.388/0.012 28/0 (＋) ３３８Ｈ IgM 0.316/0.050 0/29(−) ３１８Ｈ IgM 0.149/0.046 0/31(−) ３８８Ｆ1 IgG2a 0.892/0.100 0/28(−) ４７６Ｂ IgM 0.100/0.020 0/20(−) ４８９Ｇ IgM 0.174/0.00 7/15 (?) ４８１Ｆ IgM 0.460/0.092 18/0 (＋) ３３５Ｃ IgM 0.203/0.073 0/27(−) ４１９Ａ IgM 0.542/0.15 27/1 (＋) ３１２Ｆ IgM 0.533/0.029 14/8 (±) 培地対照 -- 0/0 0/31 ａ）ＥＬＩＳＡアッセイで陽性であった培養上清を、Ｃ
Ｌ３クローン由来のＧＩＦと結合する能力について評価
した。 ｂ）ＢＳＡコーティングウェルへのハイブリドーマ培養
上清中のマウスＩｇの非特異的結合と比較した、ＧＩＦ
コーティングウェルへの同上清中のＩｇの結合。４１０
ｍμでの光学濃度。 ｃ）ハイブリドーマの培養上清と精製ＧＩＦの混合物を
ＹＭ１００メンブランで濾過し、濾液のＧＩＦ活性を調
べた。１２Ｈ５細胞をマウスＩｇＥとともに、濾液の存
在下で培養した。細胞によって産生されたＩｇＥ−ＢＦ
をレンチルレクチンSepharose で分画し、レクチン結合
Sepharose からの流出および溶出画分におけるＩｇＥ−
ＢＦをロゼット形成阻止によって評価した。数字は流出
／溶出画分によるロゼット形成阻止パーセントを表す。
ＧＩＦは細胞によって産生されるＩｇＥ−ＢＦの性質を
変換する（上欄対下欄）。（＋）はＧＩＦの存在を表
す。
【００９６】次に、１２Ｈ５細胞を用いて、１１ハイブ
リドーマクローンの培養上清中の抗ＧＩＦの存在を判定
した（Iwata ら、J. Immunol., 140: 2534, 1988）。５
０％飽和硫酸アンモニウム沈澱によって、各クローンの
培養上清のグロブリン画分を得た。リン酸緩衝塩類液に
対して透析した後、この画分をもとの培養上清の１／５
容量に調整した。１４１Ｂ９Sepharose を用いて、アフ
ィニティー精製ＧＩＦのアリコートをＣＬ３クローンか
ら調製した。これらのアリコートを等量の各クローン由
来のグロブリン画分と混合し、その混合物を４℃で一晩
インキュベートした。次に、この混合物をＹＭ１００メ
ンブランで濾過し、濾液中のＧＩＦの存在を調べた。次
に、１２Ｈ５細胞懸濁液のアリコートを等量の濾液と混
合し、その細胞懸濁液を１０μｇ／ｍｌマウスＩｇＥ存
在下で２４時間培養した。培養上清をＣＦ５０Ａメンブ
ランで濾過してＩｇＥを除去し、濾液中のＩｇＥ結合因
子をレンチルレクチンSepharose で分画した。実験の結
果は、表６に包含されるが、３３８Ｈ，３１８Ｈ，３８
８Ｆ1 ，４７６Ｂおよび３３５Ｃクローンの培養上清に
よってＧＩＦが除去されることを示しており、このこと
はこれらのハイブリドーマが抗−ＧＩＦを産生すること
を示す。
【００９７】Ｂ．モノクローナル抗−ＧＩＦによるヒト
ＧＩＦの精製 ＧＩＦに対するモノクローナル抗体を産生する６ハイブ
リドーマクローンの中で、３８８Ｆ1 だけがＩｇＧ抗体
を産生した。このハイブリドーマをサブクローニング
し、５％ＦＣＳを添加した高濃度グルコースダルベッコ
培地で培養した。培養上清を限外濾過で濃縮し、プロテ
インA-Sepharose を用いて上清中のＩｇＧを回収した。
次にこのモノクローナル抗体をTresyl活性化Sepharose
に結合させて免疫吸着剤を調製した。このモノクローナ
ル抗体が抗−リポモジュリン（１４１Ｂ９）Sepharose
に結合するのと同じ分子に結合することができるかどう
かを判定するために、培養上清中のＧＩＦを１４１Ｂ９
Sepharose に吸着させ、酸性ｐＨでの溶出によって回収
した。次に、このアフィニティー精製ＧＩＦ調製物を抗
−ＧＩＦ（３８８Ｆ1 ）結合Sepharose で分画した。流
出画分を得た後、免疫吸着剤カラムを１０カラム容のダ
ルベッコリン酸緩衝塩類液（ＤＰＢＳ）で洗浄し、つい
で、グリシンＨＣｌ緩衝液、ｐＨ３．０で溶出した。１
２Ｈ５細胞を用いて、流出および溶出画分の階段希釈の
ＧＩＦ活性を測定した。表７に示す結果は、１４１Ｂ９
−Sepharose からの酸溶出画分のＧＩＦが抗−ＧＩＦ
（３８８Ｆ 1 ）−Sepharose と結合し、酸性ｐＨでの溶
出によって再び回収されることを示す。この結果は、抗
−リポモジュリンおよび抗−ＧＩＦの両方がヒトＧＩＦ
に結合することを示す。 ａ）ＣＬ３クローン培養上清中のＧＩＦを抗−リポモジ
ュリンSepharose を用いて精製した。アフィニティー精
製したＧＩＦ（１．５ｍｌ）を０．７５ｍｌの３８８Ｆ
1 −結合Sepharose で分画した。流出画分を回収した
後、カラムを１０カラム容のＤＰＢＳで洗浄し、次に、
３カラム容のグリシンＨＣｌ，ｐＨ３．０で溶出した。 ｂ）表４に記載されたのと同様の方法で１２Ｈ５細胞を
用いてＧＩＦ活性を評価した。縦列の数字はレンチルレ
クチンSepharose からの流出／溶出画分によるロゼット
形成阻止パーセントを表す。（＋）はＧＩＦの存在を示
す。抗−ヒトＧＩＦがマウスＧＩＦと結合可能かどうか
を判定するために、Ｔｓハイブリドーマ、２３１Ｆ1 細
胞由来のマウスＧＩＦを１４１Ｂ９-Sepharoseを用いて
精製し、精製されたマウスＧＩＦのアリコートを１４１
Ｂ９-Sepharoseまたは３８８Ｆ1-Sepharose のいずれか
によって分画した。流出画分を得た後、免疫吸着剤を３
カラム容のＤＰＢＳで洗浄し、次に３カラム容のグリシ
ンＨＣｌ緩衝液、ｐＨ３．０で溶出した。予想された通
り、すべてのＧＩＦ活性が１４１Ｂ９Sepharose に吸着
され、酸性ｐＨでの溶出で回収された。流出画分および
洗浄画分のいずれにも、ＧＩＦ活性は存在しなかった。
同じＧＩＦ調製物を３８８Ｆ1−Sepharose で分画した
場合、弱いＧＩＦ活性が流出画分に検出された。活性の
大部分はＤＰＢＳによる洗浄で検出されたが、酸溶出画
分は検出可能なＧＩＦ活性を含有しなかった。マウスＧ
ＩＦは非常に低い親和性で抗−ヒトＧＩＦと結合し、中
性ｐＨでの洗浄によって免疫吸着剤から解離すると思わ
れる。以上の結果は、モノクローナル抗体３８８Ｆ1 が
ヒトＧＩＦに特異的であることを示す。
【００９８】Ｃ．イオン交換クロマトグラフィーによる
ヒトＧＩＦの精製 ＡＣ５細胞を限界希釈によってサブクローニングし、Ｃ
Ｄ３+ クローンを得た。次に、この細胞を無血清ＡＢＣ
培地に順化させた。フローサイトメトリーによって、こ
の培地で培養したサブクローン上のＣＤ３の表現を確認
した。ＣＤ３+サブクローンの培養上清を１０−３０倍
に濃縮し、その調製物の階段希釈のＧＩＦ活性を測定し
た。このような結果に基づいて、サブクローン（ＡＣ５
−２３）を選択したが、これはこのサブクローンの１０
倍濃縮上清の１：３希釈物が、１２Ｈ５細胞をグリコシ
ル化ＩｇＥ−ＢＦ産生から非グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦ
産生へと変換することができたためである。
【００９９】ヒトＧＩＦをイオン交換クロマトグラフィ
ーで精製することができるかどうかを判定するために研
究が行なわれた。ＡＢＣ培地中のＡＣ５サブクローンの
培養上清を２５倍に濃縮した。濃縮された培養上清のう
ち１０ｍｌのアリコートを、TrisでｐＨ８．０に調整
し、蒸留水で８倍に希釈し、次にＤＥＡＥ-Sepharoseカ
ラムにかけた。濃度増加するＮａＣｌを含有する１０ｍ
Ｍ Tris 緩衝液でカラムに結合したタンパク質を溶出し
た。各画分を１０ｍｌに濃縮しＧＩＦ活性を測定した。 表８ ＤＥＡＥ-Sepharose画分におけるＧＩＦ活性の分布 Tris HCl＋ タンパク質含量 画分 NaCl(mM)a (μg)b ＧＩＦ活性 c １ 20 65.5 21/0 (＋) ２ 50 35.5 20/6 (＋) ３ 75 42.5 7/20(−) ４ 100 38.5 3/19(−) ５ 150 41.5 0/21(−) ６ 200 42.0 0/20(−) 培地対照 0/22(−) ａ）ＡＣ５細胞の濃縮された培養上清を蒸留水で８倍に
希釈して、ＤＥＡＥ-Sepharoseカラムにかけた。画分１
は２０ｍＭＮａＣｌ含有１０ｍＭ Tris-ＨＣｌ，ｐＨ
８．０による洗浄液と合わせた、通過画分を表す。濃度
増加するＮａＣｌを含有する１０ｍＭ Tris-ＨＣｌで、
カラムを段階的に溶出した。 ｂ）各画分を濃縮した後、全タンパク質を回収した。２
００ｍＭＮａＣｌ含有Tris緩衝液で溶出した後、多くの
タンパク質がカラムに保持された。 ｃ）１２Ｈ５細胞を用いてＧＩＦ活性を検出した。数字
はレンチルレクチンSepharose からの流出／溶出画分に
よるロゼット形成阻止パーセントを表す。ＩｇＥ−ＢＦ
不存在下でのＲＦＣの割合は、２２．６±０．７（Ｓ
Ｄ）％であった。（＋）（−）の表示は、ＧＩＦの存在
および非存在を示す。 表８に示すように、通過画分および５０ｍＭＮａＣｌ溶
出画分にＧＩＦ活性が検出されたが、他の画分には検出
されなかった。最初の二つの画分の階段希釈の力価測定
によって、通過画分が５０ｍＭ画分より高いＧＩＦ活性
を有することが明らかになった。
【０１００】個々の培養上清で繰り返し実験することに
よって、ＡＣ５細胞の培養上清を１００倍に濃縮し、蒸
留水で３倍に希釈した後、カラムに通した場合には、培
養上清中のＧＩＦの大部分をＤＥＡＥ-Sepharoseカラム
から回収することができることを確認した。通過画分お
よび５０ｍＭＮａＣｌ含有１０ｍＭ Tris 緩衝液による
洗浄液をあわせ、ＤＥＡＥ-Sepharoseにのせた元の試料
の容量にまで濃縮した。濃縮された培養上清および通過
（５０ｍＭＮａＣｌ）画分の階段希釈のＧＩＦ活性を検
定した結果、両方の試料とも１：３０希釈物が、１２Ｈ
５細胞をグリコシル化ＩｇＥ−ＢＦ産生から非グリコシ
ル化ＩｇＥ−ＢＦ産生へと変換することができることが
示された。ＤＥＡＥ-Sepharoseに通すことによって、培
養上清中のタンパク質の７５−８０％を除去できること
も明らかになった。
【０１０１】ＧＩＦの分子量を見積もるために、ＤＥＡ
Ｅ-Sepharoseからの濃縮された通過画分０．５ｍｌをSu
perose-12 カラムにかけ、１ｍｌ／分の流速でタンパク
質を溶出した。この実験に於て、５ｍｌの画分を集め、
各画分のＧＩＦ活性を１２Ｈ５細胞を用いて測定した。
ＧＩＦ活性は画分９で検出されたが、これは７０から７
５分の間に回収された。画分６および８も弱い活性を有
するので、画分６、８、９の階段希釈のＧＩＦ活性を測
定した。画分９の１：１０希釈でＧＩＦが検出された
が、他の画分の１：２希釈では検出されなかった。これ
らの結果は、ヒトＧＩＦの主要な分子種の分子量が、１
１から１８ＫＤａの範囲にあることを示唆した。ＧＩＦ
分子の大きさをもっとよく見積もるために、１ｍｌまた
は２．５ｍｌの画分を集めた以外は同じ方法でSuperose
-12 でのゲル濾過を繰り返し行なった。３回の異なる実
験から、ＧＩＦの大部分が６８から７２分の間に回収さ
れることが示された。ゲル濾過による見積もりによれ
ば、ＧＩＦの分子量は１２−１８ＫＤａであると思われ
る。
【０１０２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってＧＩＦを同定す
る研究も行なった。ＡＢＣ培地でのハイブリドーマ培養
上清２リットルを１００倍に濃縮し、ＤＥＡＥ-Sepharo
seカラムで分画した。上記の実験に基づいて、濃縮した
上清を脱イオン水で３倍に濃縮し、ＤＥＡＥ-Sepharose
に通した。通過画分を濃縮し、ヒトＩｇＧ結合Sepharos
e に予め吸着させ、その画分中のＧＩＦを３８８Ｆ１−
結合Affigel でのアフィニティークロマトグラフィーに
よって精製した。一部の実験では、免疫吸着剤からの酸
溶出画分をｐＨ８．０に調整し、３８８Ｆ１−結合Affi
gel でのアフィニティー精製を繰り返し行なった。還元
および非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによってアフィ
ニティー精製ＧＩＦ調製物の分析を行なった。アフィニ
ティー精製試料の主要バンドは、還元条件下で１４ＫＤ
ａの分子量を有し、非還元条件下では１５ＫＤａであっ
た。さらに、６７ＫＤａのバンドがたびたび観察され
た。アフィニティー精製調製物の一部をＤＰＢＳに対し
て透析し、その調製物中のＧＩＦ活性を検定した。透析
および凍結乾燥に於てＧＩＦの回収率を１００％と仮定
すると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた試料は１：２５０の
ＧＩＦ力価を有するべきである。
【０１０３】１４ＫＤａタンパク質とＧＩＦとの関係を
判断するために実験を行なった。ＡＣ５クローンの培養
上清２リットル中のＧＩＦをＤＥＡＥ-Sepharoseクロマ
トグラフィーと、それに続く３８８Ｆ１−Affigel での
アフィニティー精製によって、精製した。免疫吸着剤か
らの酸溶出液をｐＨ８．０に調整し、限外濾過によって
１ｍｌに濃縮し、Superose 12 カラムで分画した。２．
５ｍｌずつの溶出画分を１２Ｈ５細胞を用いて活性測定
した。この実験に於て、ＧＩＦ活性の大部分が、６７．
５から７０分の間に溶出された画分に検出された。その
画分中のＧＩＦの存在をビオチン結合ｍＡｂ１４１−Ｂ
９を用いたＥＬＩＳＡによって確認した。ＥＬＩＳＡシ
グナルは弱かったが、ＧＩＦ含有画分のみがＥＬＩＳＡ
シグナルを与えた。ＧＩＦ含有画分の１ｍｌを凍結乾燥
しＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。その結果は、ＧＩＦ含
有画分中に１４ＫＤａペプチドが存在することを確認し
た。
【０１０４】実施例６ マウスＧＩＦの精製およびアミノ酸配列決定 抗−リポモディリンモノクローナル抗体１４１Ｂ９を用
いて、ＧＩＦ産生マウスＴ細胞ハイブリドーマ２３１Ｆ
1 細胞（Iwata, et al., J. Immunol., 132:1286, 198
4) の培養上清から、マウスＧＩＦを精製した。ＦＡＳ
Ｔ−γカラムを用いて、ハイブリドーマ１４１Ｂ９を注
入したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹水からモノクローナル抗
体１４１Ｂ９を精製した。調製物中の約１０ｍｇのＩｇ
Ｇ1 は、１ｍｌのAffigel 10ビーズと結合した。ＧＩＦ
を得るために、10％Nu- 血清を添加した高濃度グルコー
スダルベッコ改変イーグル培地(Collaborative Researc
h)で２３１Ｆ1 細胞を培養した。培養物中の２３１Ｆ1
細胞の数が１〜２×１０6 個／ｍｌに達した後、細胞を
回収し、無血清ＤＭＥＭに1.５×１０6 個／ｍｌの濃度
で再懸濁し、４８時間培養した。この細胞の培養上清を
限外濾過で１０００倍に濃縮し、濃縮された培養上清の
１０ｍｌを２ｍｌの１４１Ｂ９結合Affigel と６〜１２
時間４℃で混合した。上記の免疫吸着剤を５０ｍＭのＮ
ａＣｌを含有する１０ｍＭの燐酸緩衝液で、次いで５０
０ｍＭのＮａＣｌを含有する同じ緩衝液で、よく洗浄し
た。その後、免疫吸着剤に保持されたタンパク質を0.１
Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ3.０で溶出した。アフ
ィニティー精製したＧＩＦを１／１０容の１００％（wt
/vol) トリクロロ酢酸と混合した。この混合物を−２０
℃に１５分間保ち、15,000×g で５分間遠心分離して沈
殿物を回収した。この沈殿物中のタンパク質を１５％ポ
リアクリルアミド／ＳＤＳゲル中、還元条件下で電気泳
動にかけ、１０ｍＭＣＡＰＳ緩衝液、ｐＨ１1.０中のポ
リビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に電気ブロッ
トした。クマシー ブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染
色することによってタンパク質のバンドを可視化した
後、１４ｋＤａのバンドのアミノ酸配列決定を行った。
【０１０５】ＰＶＤＦ−免疫タンパク質を還元し、イン
サイチュでＳ−カルボキシメチル化し、その後、８％ア
セトニトリルを含有する９０ｍＭトリス緩衝液中で１ｐ
ｍｏｌのアクロモバクタープロテアーゼＩ（和光純薬）
で２０時間３０℃で消化した。消化したペプチドを、0.
０５％トリフルオロ酢酸で平衡化した５μＣ８−３００
Ａカラム（Waters) を用い、移動相としての水中で、逆
相ＨＰＬＣにより分離した。ペプチドを２−プロパノー
ル／アセトニトリル（７：３）中の0.０２％トリフルオ
ロ酢酸の直線勾配（２〜５０％）で溶出した。２１４ｎ
ｍに吸収を示す主要ペプチドピークを回収し、このペプ
チドのアミノ酸配列分析を微量配列決定法用改良プログ
ラム(Iwamatsu, et al., J. Biochem., 110:51-158, 19
91) を有するガス相配列決定機（Applied Biosystems M
odel 470A)を用いて行った。単離したペプチドのアミノ
酸配列を以下に示す。
【０１０６】
【化１】
【０１０７】アクロバクタープロテアーゼＩによる消化
の後ＰＶＤＦに保持されたペプチドフラグメントを、８
％アセトニトリルを含有する１００ｍＭ重炭酸アンモニ
ウム（ｐＨ7.８）中、２ｐｍｏｌのエンドプロテイナー
ゼＡｓｐ−Ｎ（Boehringer Mannheim)により、１６時間
３０℃で更に消化した。この消化の後、４つの主要ペプ
チドをＨＰＬＣで回収し、上記のようにして配列決定し
た。各ペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである。
【０１０８】
【化２】
【０１０９】エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ消化の後
に膜に保持されたペプチドを、８％アセトニトリルを含
有する100mM の重炭酸アンモニウム（ｐＨ7.８）中で、
１ｐｍｏｌのトリプシン−ＴＰＣＫ(Worthington Bioch
emical) により２０時間３０℃でさらに消化した。ひと
つの主要ペプチド（Ｔ−１）を回収し、配列決定した。
【０１１０】
【化３】
【０１１１】小型の一片のＰＶＤＦ−固定化タンパク質
シ−クエンサー（Shimazu PSQ-1)を注入することによ
り、Ｎ末端のアミノ酸配列を直接配列決定した。
【０１１２】
【化４】
【０１１３】分析されたペプチドの約８５％がＮ末端メ
チオニン残基の欠失を示した。
【０１１４】実施例７ ｃＤＮＡクローニングおよびマウスＧＩＦの配列決定 Ｎ末端アミノ酸配列および上記したもうひとつのペプチ
ド（ＡＮ−５）の配列に基づいて、オリゴヌクレオチド
を合成した。ポリメラーゼ連鎖反応法により部分ｃＤＮ
Ａを増幅し、得られたｃＤＮＡを用いてマウスｃＤＮＡ
ライブラリーを釣り上げることを試みた。ＰＣＲに使用
した合成プライマーは以下の通りであった。
【０１１５】
【化５】
【０１１６】細胞質ＲＮＡをＧＩＦ産生マウスＴハイブ
リドーマ２３１Ｆ1 から単離した。オリゴ（ｄＴ)-セル
ロースを用いてｍＲＮＡを精製した後、２３１Ｆ1 ＲＮ
Ａを鋳型としてｄＴ15で開始した逆転写によりｍＲＮＡ
鋳型に対する一本鎖ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲを標準
的な条件で行った。簡単に言うと、この鋳型ＤＮＡを９
４℃で１分間変性し、上記したプライマーとともに５９
℃で１分間アニールし、次いで、７２℃で４５秒間伸長
させた。続いてのクローニングおよびＤＮＡ配列決定の
ために、ＰＣＲで増幅した0.２Ｋｂのフラグメントをｐ
ＣＲ１０００ベクター(Invitrogen, La Jolla, CA)に連
結した。このフラグメントのヌクレオチド配列を確認し
た後、挿入物をEcoRI 消化により切断し、マウスＴ細胞
ハイブリドーマ２３１Ｆ1 細胞のｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングしたが、これはUni-ZAPcDNA 合成キッ
ト(Stratagene, La Jolla, カリフォルニア）を用いて
構築したものである。EcoRI 認識部位を二本鎖ｃＤＮＡ
に結合させたが、これをその後XhoIにより消化させ、ｃ
ＤＮＡをUni-ZAP XRベクターに連結した。このｃＤＮＡ
ライブラリーを、上記0.２ＫｂのＤＮＡとのハイブリダ
イゼーションによりスクリーニングした。５０万個の独
立のクローンをスクリーニングした後、７個のクローン
を単離した。この７個すべてのクローンの制限酵素切断
地図を作製したところ、単一のパターンが示めされた。
【０１１７】最も長いクローン（0.６５Ｋｂ）を標準的
なジデオキシ法によるＤＮＡ配列決定のために選択し
た。このヌクレオチド配列および演繹されるマウスＧＩ
Ｆのアミノ酸配列を図１に示す。下線は、精製したマウ
スＧＩＦのエドマン分解において同定されたペプチドの
位置を示している。ＧＩＦタンパク質の大きさの見積も
りは１３ｋＤａであり、これはＴハイブリドーマ２３１
Ｆ1 細胞由来の精製ＧＩＦの大きさと相関がある。最初
のメチオニンコドンの隣の(flanking)ヌクレオチド配列
は翻訳開始則(translation initiation rule) を支持す
る。この挿入物の長さは0.６５Ｋｂであった。マウスＴ
細胞および組織ＲＮＡのノーザンブロット分析により、
0.６５〜0.７０Ｋｂに単一種のｍＲＮＡの存在が示さ
れ、このことは、得られたｃＤＮＡが全長であることを
示唆している。また、ヌクレオチド８２の５’上流にメ
チオニン残基が見出されないので（図１）、このマウス
ＧＩＦタンパク質はシグナルペプチドを持たないことが
見出された。
【０１１８】実施例８ ヒトＧＩＦをコードするｃＤＮＡの単離 ヒトＴ細胞ハイブリドーマＡＣ５を抗−ＣＤ３抗体で染
色し、ＧＩＦ産生ＣＤ３＋サブクローンをｍＲＮＡの供
給源として採用した。オリゴ（ｄＴ）−セルロース上の
ＲＮＡの分画を繰り返してｍＲＮＡを単離したが、その
後これを鋳型として用いて、ZAP-cDNA合成キットを使用
してｃＤＮＡを合成した。EcoRI 認識部位を結合させた
後、二重鎖ｃＤＮＡをXhoIで消化し、Sephacryl S-400
スピンカラムに通す濾過によりサイズ選択した。その
後、ｃＤＮＡをUni-ZAP XRベクターと連結し、組換えフ
ァージライブラリーを構築した。このライブラリーにお
いて、挿入物を含むファージの比率は全ファージの８８
〜９６％であった。このｃＤＮＡライブラリーを、マウ
スＧＩＦをコードするｃＤＮＡのフラグメントとのハイ
ブリダイゼーションによりスクリーニングした。大腸菌
ＸＬ１をマウスＧＩＦ−ｃＤＮＡを含むファージミド(p
hagemid)とともに培養し、細菌中のＤＮＡを抽出した。
プラスミドを遠心分離で精製し、BamHI およびXhoIによ
り消化した。アガロース上の電気泳動の後、500bp のバ
ンドを抽出し、Gene clean II キット(BIO 101) を用い
て精製した。このｃＤＮＡをStratageneのPrim-It gold
キットを用いてα-32P-ATPで標識した。
【０１１９】５×１０4pfuを含有するライブラリーとと
もに大腸菌ＰＬＫ−Ｆを培養し、ファージを大腸菌でコ
ーティングしてあるナイロン膜(Duralose, Stratagene)
に移した。この膜をＬＢボトムプレートの上に置き、３
７℃に一晩保った。0.５ＭのＮａＯＨで処理し、トリス
で中和して、２×ＳＳＣで洗浄した後、この膜を８０℃
で乾燥し、ＤＮＡを膜上に固定した。
【０１２０】このｃＤＮＡライブラリーのスクリーニン
グのために、上記の膜を超音波処理したサケ精子ＤＮＡ
で前処理し、その後、５分間１００℃で加熱しておいた
32P標識マウスＧＩＦｃＤＮＡとともに、一晩６０℃で
インキュベートした。この膜を２回それぞれ、0.１％Ｓ
ＤＳを含有する６×ＳＳＣおよび0.１×ＳＳＣプラス0.
１％ＳＤＳで洗浄し、ラジオオートグラフィーのフィル
ムに暴露した。陽性クローンからファージを抽出し、ス
クリーニングを２回以上繰り返して陽性クローンを単離
した。スクリーニングされた200,000 個のファージの中
で、２７個の陽性クローンが単離された。これらの陽性
ファージクローンが実際にマウスＧＩＦｃＤＮＡに相同
的なｃＤＮＡを含むことを確認するために、各陽性ファ
ージクローンからファージミドＤＮＡを得て、１％アガ
ロースゲルで電気泳動し、Zeta-probe膜にブロットし、
その後32P 標識マウスＧＩＦｃＤＮＡとハイブリダイズ
させた。
【０１２１】ヒトＧＩＦｃＤＮＡのヌクレオチド配列を
決定するために、各ファージクローン由来のファージミ
ドをEcoRI およひXhoIにより消化して、電気泳動を行っ
て挿入物を得た。２７個のクローンのうち、0.５Ｋｂの
挿入物を持つ７個のクローンについてジデオキシ法によ
り配列決定した。この挿入物をSacI、PstIおよびSmaIに
より消化し、フラグメントをｐＵＣ１９またはpBluescr
ipt SK- ベクターにサブクローニングした。プラスミド
ＤＮＡをアルカリＳＤＳ法により精製し、配列Ｖｅｒ２
（ＵＳＢ）を用いてクローンを配列決定した。全長のｃ
ＤＮＡ（ＰＮＹ１０６）の全ヌクレオチド配列を図２に
示した。この配列は、ＧＩＦｃＤＮＡのヌクレオチド３
９０〜３９２のコドンがＡＡＴ（アスパラギン）である
のに対し、ＭＩＦｃＤＮＡがＡＧＴ（セリン）のコドン
を持つ他は、主張されているヒトＭＩＦｃＤＮＡ(Weise
r, et al., Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 86:7522-752
6, 1989) の配列に相同的であった。もうひとつの差異
は、ｐＹＮ１０６における５’末端非コード領域がＭＩ
Ｆのそれよりも４０塩基長いことであった。
【０１２２】ＲＮアーゼ保護アッセイをいくつかのＴハ
イブリドーマ細胞中で行い、ＧＩＦｃＤＮＡにより検出
されたｍＲＮＡの構造に重複性があるか否かを測定し
た。その結果、ＧＩＦに相当するｍＲＮＡはたった一種
類であることが確認された。
【０１２３】実施例９ 組換えＧＩＦの大腸菌における発現 Ａ．細菌発現系の構築 本実施例は、大腸菌におけるヒトおよびマウスＧＩＦポ
リペプチドの発現に関するものである。EcoRI およびXh
oI部位でBlueScriptに挿入したヒトＧＩＦｃＤＮＡを以
下のオリゴヌクレオチドプライマーとともにアニールし
た。
【０１２４】
【化６】
【０１２５】これらのプライマーをホスホルアミダイト
法（McBride, et al., TetrahedronLett, 24:245-248,
1983)により合成した。その５’末端のプライマーは、
好ましい細菌での発現のためのシャイン・ダルガルノ配
列(Scherer, et al., Nucl.Acids.Res., 8:3895-3950,
1980) を含み、各プライマーはそれぞれ、AflII および
BamHI を含んでいた。
【０１２６】ヒトＧＩＦｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反
応法（ＰＣＲ）（Mullis, et al.,Method in Enzymol,
155:335-350, 1987) を用いて増幅した。特に言及しな
いか限り、各ＰＣＲサイクルにおける変性工程は９４℃
で１分間に設定し、伸長は７２℃で２分間で行った。ア
ニーリングの温度と時間は反応毎に可変としたが、これ
は、同時に行ういくつかの異なるＰＣＲに予想される要
求に基づいて自由度があることを示すものである。
【０１２７】アガロースゲルから単離された増幅したｃ
ＤＮＡフラグメントをAflII およびBamHI により消化
し、唯一のAflII およびBamHI 部位でTrp プロモーター
およびTrpAターミネーターを持つpST811ベクター（図
３、特開昭63-269983 号）に連結挿入した。pTMK-hGIF
と称するこの新規なプラスミド（図４）をコンピテント
ＲＲ１大腸菌宿主細胞にトランスフォームした。アンピ
シリン耐性（pST811ベクターに存在するマーカー遺伝
子）に基づいてプラスミド含有細胞を選択した。この合
成オリゴヌクレオチドおよび全ヒトＧＩＦ遺伝子のＤＮ
Ａ配列をプラスミドＤＮＡのＤＮＡ配列決定により確認
した。
【０１２８】マウスＧＩＦの細菌発現系をヒトＧＩＦと
同じ手法により、BluScript に挿入したマウスＧＩＦｃ
ＤＮＡから構築した。ＰＣＲを用いてマウスＧＩＦｃＤ
ＮＡの両末端にAflII およびBamHI 部位を形成するため
のプライマーは以下のとおりであった。
【０１２９】
【化７】
【０１３０】ｐＳＴ８１１ベクター中にマウスＧＩＦｃ
ＤＮＡを含むプラスミドをｐＴＭＫ−ｍＧＩＦと命名し
た。または、AflII およびBamHI による切除により、ヒ
トまたはマウスＧＩＦをコードする配列をｐＴＭＫ−ｈ
ＧＩＦまたをｐＴＭＫ−ｍＧＩＦから回収し、モレキュ
ラー クローニング(Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Maniatis,et al., 1982)に記載の手法を用い
て、PL、lac 、tac またはOmpFプロモーターを持つ所望
の細菌ベクターに挿入することもできるであろう。これ
らの典型的な細菌ベクターを、当業界に公知の他のベク
ターと同様に、細菌宿主細胞にトランスフォームし、Ｇ
ＩＦを発現させることができるであろう。
【０１３１】Ｂ．ＧＩＦを産生する大腸菌の培養 プラスミドｐＴＭＫ−ｈＧＩＦまたはｐＴＭＫ−ｍＧＩ
Ｆを含むＲＲ１大腸菌を５０μｌ／ｍｌのアンピシリン
を含有する２０ｍｌのルリア培地で培養し、一晩３７℃
で増殖させた。種培養物を0.８％グルコース、0.４％カ
ザミノ酸、１０ｍｇ／ｌチアミンおよび５０ｍｇ／ｌア
ンピシリンから構成される１リットルのＭ９培地に無菌
的に移し、３７℃で３時間培養した。この初期インキュ
ベーションの最後に、４０ｍｇのインドールアクリル酸
を添加し、培養物をさらに５時間３７℃でインキュベー
トした。
【０１３２】実施例１０ 大腸菌において発現された組換えＧＩＦ産物の精製 湿潤重量で約５ｇの回収した細胞を水に懸濁して３０ｍ
ｌの体積にし、フレンチプレス（8000psi で４回繰り返
した）で破壊した。上清および破壊した細胞のペレット
を、１５０００×ｇで１０分間４℃で遠心分離により分
離した。この細胞ペレットを二回水で洗浄した。ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、このペレッ
トのほとんどがヒトＧＩＦタンパク質であることが明ら
かになった。また、上清は可溶性ヒトＧＩＦタンパク質
を含有していた。可溶性ＧＩＦの不溶性ＧＩＦに対する
比は、約１：３であった。
【０１３３】Ａ．可溶性ＧＩＦの精製 可溶性ＧＩＦ画分を一晩−８０℃で凍結させ、ゆっくり
と室温に温めた。不溶性物質を１５０００×ｇで１５分
間の遠心分離により除去した。この工程で、細菌の不純
物のほとんどが除去できた。５０ｍＭの酢酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ5.０）を添加して上清をｐＨ6.０に調整
し、４℃で、２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ6.
０）で平衡化したCM-Sepharose Fast Flow (Pharmacia)
カラム（５×１８ｃｍ）にかけた。このカラムを２ｍｌ
／分の流速で２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ6.
０）で洗浄し、ＮａＣｌ段階勾配によりタンパク質を溶
出した。２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ6.０）
中で0.５ＭＮａＣｌによりＧＩＦを溶出した。ヒトＧＩ
Ｆの純度をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より見積もったところ、９５％以上の純度であった。
【０１３４】Ｂ．不溶性ＧＩＦの精製および再生 ６ＭのグアニジンＨＣｌおよび２５ｍＭのＥＤＴＡを含
有する0.２ＭのトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ8.０）１０ｍ
ｌ中に、不溶性ヒトＧＩＦを含有するペレット画分を懸
濁し、穏やかに攪拌しながら室温で３時間インキュベー
トして、ヒトＧＩＦを可溶化した。残っている不溶性物
質を１５０００ｇで１５分間の遠心分離により除去し
た。
【０１３５】可溶性ＧＩＦ画分を６Ｍのグアニジン−Ｈ
Ｃｌ、２５ｍＭのＥＤＴＡおよび0.２Ｍのトリス緩衝液
（ｐＨ8.０）で平衡化したSephacryl S-200 Super Fine
(Pharmacia)カラム（５×１００ｃｍ）にかけ、２ｍｌ
／分の流速で室温で溶出した。ボイド容量が溶出した
後、１０ｍｌの画分を回収し、ウェスタンブロット染色
法によるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
りＧＩＦを分析した。ＹＭ５ミリポア限外濾過膜を用い
て、約１２０ｍｌのＧＩＦ陽性画分を５ｍｌまで濃縮し
た。
【０１３６】可溶化したＧＩＦの再生のために、室温で
穏やかに攪拌しながら、試料をゆっくりと２０ｍＭのト
リス緩衝液（ｐＨ8.０）２リットルに添加した。２４時
間後、ＹＭ５膜を用いて混合物を１０倍に濃縮した。残
っている大腸菌不純物を除去するために、２０ｍＭのト
リス緩衝液（ｐＨ8.０）で平衡化したＴＳＫ ＤＥＡＥ
−５ＰＷＤ（東ソー）カラム（7.５×７５ｍｍ）に試料
をかけた。試料をカラムにかけた後、このカラムを同じ
緩衝液で洗浄し、0.５ｍｌ／分の流速で室温にてカラム
緩衝液中の０〜0.１ＭのＮａＣｌの勾配によりＧＩＦを
溶出した。ウェスタンブロットで決定したＧＩＦ含有画
分をＹＭ５膜を用いて濃縮した。ヒトＧＩＦの純度をＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により見積もっ
たところ、９５％以上の純度であった。組換えマウスＧ
ＩＦを上記と同じ手法で精製した。
【０１３７】実施例１１ 組換えＧＩＦのアミノ酸配列決定および分析 Ａ．組換えヒトＧＩＦのアミノ酸配列 ＤＥＡＥカラムから得られた精製組換えヒトＧＩＦをＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ＰＶＤ
Ｆ膜にブロットした。この膜をポンソーＳで染色し、Ｇ
ＩＦバンドをこの膜から切り出した。Shimazu PSQ-1 タ
ンパク質シークエンサーを用いて、Ｎ末端アミノ酸配列
を決定した。約６０％の組換えヒトＧＩＦがＮ末端に以
下の１０個のアミノ酸を有していた。
【０１３８】
【化８】
【０１３９】この配列は、ヒトＧＩＦのｃＤＮＡ配列か
ら演繹された配列と同一であった。約４０％のＧＩＦが
Ｎ末端の1Met残基を欠失していた。
【０１４０】Ｂ．組換えマウスＧＩＦのアミノ酸分析 ２４時間１１０℃で、減圧管中、0.２％のフェノールを
含有する２回蒸留した5.７ＭのＨＣｌ中で、ＤＥＡＥカ
ラムから得られた精製組換えマウスＧＩＦを加水分解し
た。この加水分解した試料を0.０２ＭのＨＣｌ中に懸濁
し、そのアミノ酸組成を決定した（HITACHI 835S アミ
ノ酸分析機) 。これらの結果（表９）を分析すると、酸
加水分解の際に起こる分解のために、Cys 、Thr 、Met
およびTrp 残基の数は、ｃＤＮＡ配列から演繹される数
よりも少ないことが一般に認識された。このようにHis
残基の値が低いのは、NH3 からの分離が不十分であった
ことによる可能性がある。このアミノ酸組成分析におい
て、Leu のような内標準を既知の量で含有させておいた
ので、試料中のタンパク質を定量することができた。組
換えマウスＧＩＦの２８０ｎｍにおける吸光係数は1.８
９であった。 表９ 大腸菌誘導ｍＧＩＦのアミノ酸組成の量 １モルのタンパク質当たりの 分子当たりの アミノ酸組成のモル 予想される残基 アミノ酸分子 ＲＵＮ１ ＲＵＮ２ ＲＵＮ３ ＡＳＰ＋ＡＳＮ 10.19 10.12 10.31 14 ＧＬＵ＋ＧＬＮ 6.98 6.97 7.93 8 ＣＹＳ 0.96 0.59 1.08 3 ＳＥＲ 9.11 9.03 9.12 9 ＧＬＹ 8.98 8.97 8.78 9 ＨＩＳ 0.000 1.70 1.86 3 ＡＲＧ 5.07 4.81 4.84 4 ＴＨＲ 3.85 3.78 3.82 6 ＡＬＡ 10.37 10.43 10.30 10 ＰＲＯ 8.42 8.17 8.19 7 ＴＹＲ 4.63 4.60 4.55 5 ＶＡＬ 7.47 7.49 7.57 8 ＭＥＴ 3.13 3.03 3.05 4 ＩＬＥ 6.14 6.09 6.10 6 ＬＥＵ 11.00 11.00 11.00 11 ＰＨＥ 4.28 4.02 4.35 4 ＴＲＰ 0.00 0.00 0.00 1 ＬＹＳ 2.92 2.95 2.87 3
【０１４１】実施例１２ ＧＩＦに対するポリクローナル抗体の製造 フロインド不完全アジュバント中の１００μｇの同じＧ
ＩＦ試料を、２〜３週間毎に３匹のウサギに皮下注射し
た。１１４日後に、このウサギの血清を回収し、プロテ
インＡアフィニティーカラムクロマトグラフィー（Pros
ep-A. BioProcessing)でＩｇＧを精製した。約１５０ｍ
ｇのＩｇＧが２５ｍｌの血清から得られた。この抗体は
マウスＧＩＦおよびヒトＧＩＦを認識し、ウェスタンブ
ロット法およびＧＩＦの精製に使用することができた。
【０１４２】実施例１３ 哺乳類細胞における組換えＧＩＦの発現 Ａ．直接発現用の哺乳類細胞発現系の構築 本実施例は、哺乳類細胞におけるヒトＧＩＦポリペプチ
ドの発現に関するものである。EcoRI およびXhoI部位で
BlueScriptに挿入したヒトＧＩＦｃＤＮＡを以下のオリ
ゴヌクレオチドプライマーとともにアニールした。
【０１４３】
【化９】
【０１４４】各プライマーはBglII またはKpnI部位を含
んでいた。ＰＣＲによりこのヒトＧＩＦｃＤＮＡを増幅
し、アガロースゲルから単離し、BglII およびKpnIによ
り消化した。このフラグメントを、連結反応により、Bg
lII 部位およびこれに続くPstI部位を持つ改変ＳＲαベ
クター（Takabe, et al., Mol.Cell.Biol., 8:466-472,
1988)に挿入した。SRα-hGIF （図５）と命名した、こ
のプラスミドをコンピテントＤＨ５大腸菌細胞にトラン
スフォームした。ＳＲαベクター上に存在するAmpr 遺
伝子に基づいてプラスミドを含む細胞を選択した。プラ
スミドＤＮＡを培養細胞から単離し、全ヒトＧＩＦ遺伝
子のヌクレオチド配列をＤＮＡ配列決定により確認し
た。
【０１４５】Ｂ．追加のシグナル配列を持つ哺乳類発現
系の構築 ＤＮＡ構造の分析によると、ＧＩＦはシグナル配列を持
たないようなので、ＧＩＦポリペプチドが、トランスフ
ェクションされた細胞から構成分泌経路を通って分泌さ
れるように、ＧＩＦにシグナル配列を導入するためにも
う一つの発現系を構築した。ポリペプチドホルモン、成
長因子および血漿タンパク質を含む、多くの分泌タンパ
ク質が前駆体として合成され、翻訳後タンパク質分解プ
ロセッシングを受けるが、翻訳後タンパク質分解プロセ
ッシングはその分泌および生物学的活性の発現のために
しばしば要求されるものである。例えば、ヒトカルシト
ニンは大きな前駆体分子であるプロカルシトニンとして
甲状腺の内分泌Ｃ細胞により合成される（Craig, et a
l., Nature, 295:345-347, 1982) 。プロカルシトニン
は、Ｎ末端プロ領域、カルシトニン、およびＣ末端プロ
領域から成るが、端部の二つ並んだ塩基性アミノ酸部位
でタンパク質分解プロセッシングを受けて、カルシトニ
ンペプチドを生成する（Burns, et al., Mol.Endocrino
l., 3:140-147,1989)。従って、プロカルシトニンは神
経内分泌起源のタンパク質コンベルターゼにより切断さ
れることが推測される（Smeekens, et al., J.Biol.Che
m. 265:2997-3000, 1990; Proc.Natl.Acad. of Sci., 8
8:340-344, 1991)。さらに、ヒトプロカルシトニンのＮ
末端プロ領域は−４位に追加のArg 残基を有し、カルボ
キシ末端にArg-Ser-Lys-Arg の配列を有するが、この配
列はプロセッシング酵素であるフリンにより認識されう
る切断モチーフである(Fuller, et al., Science,246:4
82-486, 1989)。
【０１４６】本実施例においては、ヒトＧＩＦｃＤＮＡ
をヒトカルシトニン前駆体のＮ末端プロ領域をコードす
る遺伝子の３’末端と読み枠内で融合させ、ＳＲαベク
ターに挿入した。また、ヒトフリンｃＤＮＡをクローニ
ングし、ＳＲαベクターに挿入した。両方のベクターを
ＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）に同時
トランスフェクションしたところ、成熟ヒトＧＩＦが分
泌される結果となった。
【０１４７】1.ｃＤＮＡのクローニング ヒトカルシトニンｃＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲに
より、シグナルペプチドおよびヒトプロカルシトニン
（pro-CT) （Steerbergh, et al., FASEB Letter207:9
4, 1986)のＮ末端プロ領域をコードするｃＤＮＡフラグ
メントを増幅した。ｍＲＮＡをヒト甲状腺カルチノーマ
ＴＴ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １８０３）から単離し、
ＰＣＲの鋳型として使用したｃＤＮＡに逆転写した。
【０１４８】以下に示すような、PstI部位を持つオリゴ
ヌクレオチドプライマーを合成し、ヒトカルシトニン前
駆体遺伝子を増幅した。
【０１４９】
【化１０】
【０１５０】増幅した遺伝子をPstIで消化したＳＲαベ
クターにクローニングした。BlueScriptに挿入したヒト
ＧＩＦｃＤＮＡを以下に示すオリゴヌクレオチドプライ
マーとともにアニールした。
【０１５１】
【化１１】
【０１５２】上記のプライマーは、それぞれ、BglII 部
位とKpnI部位を持っていた。増幅した遺伝子は、Arg-Se
r-Lys-Arg の配列に続いてｈＧＩＦ配列をコードしてい
る。この遺伝子をその後連結反応によりBglII およびKp
nIで消化したＳＲαに挿入したが、このＳＲαは上記し
たようなヒトカルシトニン前駆体遺伝子を有するもので
ある。SRα-hcGIF（図６）と命名したこの新規なプラス
ミドをＤＨ５大腸菌細胞にトランスフォームした。プラ
スミドＤＮＡを培養細胞から単離し、全ヒトカルシトニ
ン前駆体およびヒトＧＩＦ遺伝子のＤＮＡ配列をＤＮＡ
配列決定により確認した。
【０１５３】ヒトフリンｃＤＮＡを同じＰＣＲ増幅法に
よりクローニングした。Poly(A) +mRNAをヒト膀胱カル
チノーマ細胞系HT1376(ATCC CRL 1472) から単離し、cD
NAに逆転写し、ＰＣＲ鋳型として使用した。ABI 394 Ｄ
ＮＡ合成機（Applied Biosystems, Inc. CA)を用いて、
６個のオリゴヌクレオチドプライマー（以下に示すＦ１
〜Ｆ６）を公表されているフリンｃＤＮＡ配列（Fulle
r, et al., Science, 246:482, 1989) に基づいて作製
した。それぞれ、ヒトフリンＤＮＡの１〜９５１、９２
２〜１６０４、および１５６５〜２３８５のコード化配
列をカバーする、３個のｃＤＮＡフラグメントを対応す
るＰＣＲ生成物から精製した。２個のフラグメント間の
２７ｂｐの重なりを利用して、アミノ末端タンパク質配
列をコードするｃＤＮＡフラグメントを隣接するｃＤＮ
Ａフラグメントとともにアニールした。第１のフラグメ
ントの５’末端と第２のフラグメントの３’末端に相当
するプライマーを用いて、得られたｃＤＮＡ混合物を再
アニールした。得られた1.６ＫｂのｃＤＮＡを、Bsp HI
部位を通して残りのカルボキシル末端のフリンをコード
する第３のｃＤＮＡフラグメントと連結した。全ｃＤＮ
Ａ構築物をＴＡクローニングベクターｐＣＲ１０００(I
nvitrogen, La Jolla, CA)にサブクローニングした。ヒ
トフリンｃＤＮＡ配列をSequenase キット(United Stat
e BiochemicalCorp., OH)を用いて決定した。制限部位
マッピングおよび部分配列分析から、上記のクローニン
グしたｃＤＮＡは以前に報告されているヒトフリンと同
一であることが明らかとなった。全長のヒトフリンを含
むEcoRI-NotIフラグメントを哺乳類発現ベクターpEFneo
にクローニングした。このpEFneoは、改変したpEF-BOS
にneo-発現ユニットを挿入することにより作成したもの
である(Mizushima, et al., Nucl.Acid Res., 18:5322,
1990)。
【０１５４】ＰＣＲによるヒトフリンｃＤＮＡのクロー
ニングに使用した６個の合成オリゴヌレオチドプライマ
ーは以下の通りである。
【０１５５】
【化１２】
【０１５６】Ｆ１およびＦ２は、１〜９５１のフリンコ
ード化配列を増幅するために使用し、Ｆ３およびＦ４
は、９２２〜１６０４を増幅するために使用した。両Ｐ
ＣＲ産物とも、２７ｂｐの重なりを利用してアニール
し、得られたｃＤＮＡ混合物をＦ１およびＦ４のプライ
マーを用いて再アーニルした。1.６Ｋｂの誘導されたｃ
ＤＮＡを、BspHI 部位を通して、ヒトフリン遺伝子のフ
ラグメント１５６５〜２３８５をコードするＦ５および
Ｆ６増幅ｃＤＮＡフラグメントと連結した。全フリンｃ
ＤＮＡをEcoRI で消化したＳＲαベクターに挿入した。
SRα-hfurin と命名したこの新規なプラスミドを、ＤＨ
５大腸菌にトランスフォームした。プラスミドＤＮＡを
培養細胞から単離し、合成オリゴヌクレオチドおよび全
ヒトフリン遺伝子のＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定により
確認した。
【０１５７】Ｃ．ＣＯＳ−１細胞におけるＧＩＦの発現 プラスミドSRα-hGIF またはSRα-hcGIFとSRα-hfurin
をCOS-1 細胞にトランスフェクションした。１０％ハン
クスＢＳＳ、２％ＦＣＳ、４０μg/mlのＤＥＡＥデキス
トラン、１００μＭクロルキンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ
１２（１：１）培地に、１μg/mlの濃度でプラスミドＤ
ＮＡを添加した。この混合物を培養皿中のCOS-1 細胞の
上にのせ、インキュベートした（５時間、３７℃、５％
ＣＯ2)。インキュベーションの後、細胞を洗浄し、一晩
培養した（１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２
（１：１）培地中、３７℃）。再度洗浄した後、細胞を
２０μg/mlウシインシュリン(Sigma) 、２０μg/mlヒト
トランスフェリン(Sigma) 、４０mMモノエタノールアミ
ン、0.１μＭ亜セレン酸ナトリウム、および１mg/mlＢ
ＳＡを含有する無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で１週間
３７℃で培養した。対照として、挿入物を含まないベク
ターをCOS-1 細胞にトランスフェクションした。
【０１５８】抗−マウスＧＩＦポリクローナル抗体を用
いて、培養上清中のＧＩＦの量をウェスタンブロット法
により見積もった。SRα-hcGIFをトランスフェクション
したCOS-1 細胞由来の上清は成熟形態のＧＩＦを含むこ
とが示された。カルシトニン−ＧＩＦとともに発現され
たフリンは、ＧＩＦの分泌を可能にするカルシトニン前
駆体配列を切断した。COS-1 細胞から分泌されたＧＩＦ
の量は、分泌されたカルシトニン前駆体−ＧＩＦの量に
匹敵した。
【０１５９】当業者は、SRα-hGIF またはSRα-hcGIFに
匹敵する他の哺乳類発現ベクターを構築することができ
る。ヒトＧＩＦコード化配列をSRα-hGIF またはSRα-h
cGIFからBglII およびKpnIによる切除により回収し、pC
D(Okayama, et al., Mol.Cell.Biol., 2:161, 170, 198
2)、pCDM8(Seed, et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USAUS
A, 84:3365-3369, 1987)およびpDSVE(U.S.Ser.Nos.025,
344および152.045)のような多くのベクターへの連結反
応により挿入することができるであろう。これらのベク
ターを適当な宿主細胞、例えば、CHO 、3T3 およびBHK
細胞にトランスフォームすることにより、ＧＩＦが発現
するであろう。ＧＩＦの分泌を増加させるために、好ま
しいベクター系、シグナル配列を含むあるいは含まない
ＧＩＦｃＤＮＡ、および適当な宿主細胞を選択すること
は型通りの作業であろう。
【０１６０】Ｄ．フリンｃＤＮＡと同時トランスフェク
ションせずに組換え切出しペプチドを分泌させるための
ユニークな融合発現ベクターの構築 フリンは多くの組織の中で発現しており、多くはゴルジ
領域に存在する（ブレスナーム(Bresnaham,P.A)等、J.C
ell.Biol.111:2851,1990；ミツイ(Mitui,Y)等、J.Biol.
Chem.266：16954,1991）が、このことはフリン若しくは
フリン様酵素は構成分泌経路を通じての成熟タンパクの
分泌に対するプロタンパク質の切断に関与することを示
すものである。ＣＯＳ細胞中のフリン様酵素の存在は、
スメーケンス(Smeekens)等（Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.
A,89:8822,1992）によって予測されていた。従って、Ｃ
ＯＳ細胞中のフリン様酵素は、前記酵素に対する適切な
切断モチーフが使用されれば、成熟ペプチドの分泌に対
する組換え融合タンパク質のプロセッシングに利用する
ことができる。
【０１６１】Fc cDNAは、効率的なタンパク質分解切断
部位を設計する試験目的で利用した。ヒトＩｇＧのＦｃ
フラグメントはシグナルペプチドを持たず、またこのＦ
ｃフラグメントをコードするｃＤＮＡフラグメントは翻
訳開始コドンＡＴＧを有さず、該タンパク質は通常ほ乳
類細胞へのcDNAのトランスフェクションによって発現さ
れない。pro-CTをFcフラグメントの担体ペプチドとして
使用し、ＣＯＳ−１細胞中に推定されるフリン様酵素に
よって認識される適当な切断モチーフを形成するよう
に、pro-CTのカルボキシル末端のアミノ酸配列を改変し
た。プロセッシング酵素の切断モチーフについての予め
得られている情報に基づき、異なった４種のアミノ酸配
列をpro-CT中に導入した。pro-CTをコードするcDNAはヒ
トカルシトニンｃＤＮＡを鋳型として用い、表１０に挙
げる様な一つの５’末端プライマー（ＣＴ１）及び異な
る四種の３’末端プライマー（ＣＴ２、ＣＴ３、ＣＴ
４、及びＣＴ５）を使用するＰＣＲによって増幅した。
異なった位置に数種の塩基残基を導入する事によって、
プライマーＣＴ２、ＣＴ３、ＣＴ４、及びＣＴ５を改変
し、ＣＯＳ−１細胞の推定されるエンドプロテアーゼに
よるプロセッシング効率に対するこのような変化の効果
を検討した。表１０ ヒトpro-CTのＰＣＲ増幅のための オリゴヌクレオチドプライマーのリスト
【０１６２】
【化１３】
【０１６３】破線による矢印は５’から３’方向の合成
プライマーを示すものである。ＣＴ１はｐｒｏ−ＣＴの
アミノ末端をコードし、その他の四種のプライマーはpr
o-CTのカルボキシル末端をコードするものである。平線
の矢印はエンドプロテアーゼによる切断部位を示すもの
である。ＣＴ２−ＣＴ５中のヌクレオチド配列、ＡＧＡ
ＴＣＴＡＧＡはBgl II及びXbalにより認識される。
【０１６４】プラスミドを構築するために、ＥｃｏＲＩ
制限部位をＣＴ１中に導入し、BglIIプラスXba I制限部
位をその他の４種のプライマー中に導入した。対応する
４種のpro-CT cDNAフラグメントを作成した後、それら
をプラスミドpBluescript II KS (+) （Stratagene）の
EcoRI及びXba１部位にサブクローニングした。Not Iは
このプラスミドベクター上でXba Iの後ろの近接する制
限部位となるために、前記のpro-CT cDNAはEcoRI及びNo
t Iによって切除された。次に、突然変異させた３’末
端を有する４種の異なったpro-CT cDNAの各々を、キメ
ラレトロウイルスプロモーターであるSRα（タカベ(Tak
abe)等、Mol.Cell.Biol.,8:466,1988）を有する、ほ乳
類発現ベクターpME18S中に挿入した。この新規なプラス
ミドベクターをpMEpro-CT（図７）と命名した。このベ
クターはｉ）ＳＶ４０プロモータープラスこのレトロウ
イルスの長い末端繰り返しのＲ領域と融合したキメラプ
ロモーターＳＲα、ｉｉ）pro-CT、及びｉｉｉ）ＳＶ４
０初期ポリ（Ａ）付加シグナルからなる。目的とする外
来遺伝子の挿入のために、pro-CTのカルボキシル末端タ
ンパク質分解切断部位に続いて、BgI II、Xba I、及びN
ot Iの多重クローニングサイトを含ませた。BgI II及び
Xba Iにより認識されるヌクレオチド配列（ＡＧＡＴＣ
ＴＡＧＡ）は読み枠中のＡｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ残基を
コードする。従って、この枠に従って外来cDNAを導入
し、pro-CT cDNAと融合させることができる。
【０１６５】G1及びG2の２種の２８ヌクレオチドプライ
マーを用い、ヒト白血病細胞系ＡＲＨ−７７（ＡＴＣ
Ｃ、ＣＲＬ１６２１）に由来するpoly(A)+ｍＲＮＡを鋳
型として使用するＰＣＲ増幅法によって、ヒトIgGのFc
cDNA を得た。５’末端プライマーＧ１（５’−ＣＴＣ
ＴＡＧＡＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣ−
３’）及び３’末端プライマーＧ２（５’−ＧＧＣＧＧ
ＣＣＧＣＣＧＣＡＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧ−
３’）はそれぞれ下線を付したXba I部位及びNot 1部位
を含む。このようにして得られたFc cDNAをプラスミドp
Bluescript II KS(+)のXba I及びNot I部位にサブクロ
ーニングした。このcDNAフラグメントをＡＢＩ２７０Ａ
配列決定機（Applied Biosystems,Inc.,CA）を使用して
配列決定した。このFc cDNAはヒンジ領域での３個のＣ
ｙｓ残基の一番目のものの後に位置するＡｓｐ残基で始
まる配列をコードしていた（エリソン(Ellison)等、Nuc
l.Acids.Res.10,4071,1982 ）。前記のcDNAをpro-CT領
域後の読み枠内でpMEpro-CT中に挿入した。
【０１６６】１．キメラタンパク質の分泌と切断 pro-CT領域とFcフラグメントを含む融合タンパク質がプ
ラスミドでトランスフェクションされたＣＯＳ−１細胞
から分泌形態で産生されているか調べるために、２つ並
んだ塩基性アミノ酸Ｌｙｓ−Ａｒｇ残基だけでpro-CTを
コードするcDNAを含むキメラプラスミドを使用した。抗
−ヒトＩｇＧでトランスフェクションされた細胞の培養
上清の免疫ブロット分析は、融合タンパク質が主に非還
元条件下で分子量約６６ｋＤａ及び還元条件下で３７ｋ
Ｄａの分子量で検出されることを示した。pMEpro-CTの
プラスミドＤＮＡでトランスフェクションされた細胞の
培養上清の同様な免疫ブロット分析によっても、抗-IgG
CTとの反応性を有するタンパク質が産生されていない
ことが確認された。
【０１６７】非還元形態の主要タンパクの分子サイズが
還元形態で見いだされるものの約２倍であるという知見
に基づき、融合タンパク質が２量体タンパク質として合
成されているに違いなと仮定した。pro-CT領域において
Ｃｙｓ残基が全く存在しないことから、前記の２量体は
Ｆｃフラグメントのヒンジ領域におけるＣｙｓ残基間で
形成されるジスルフィド結合に由来する可能性がある。
それにも関わらず、前記タンパク質の分子サイズ（２量
体として６６ｋＤａ、及び単量体として３７ｋＤａ）
は、該タンパク質が成熟Fcフラグメントではなく、pro-
CT及びFcフラグメントから成る融合タンパク質を現すも
のであることを示している。
【０１６８】プロセッシング効率は、異なった切断モチ
ーフを有するキメラcDNAをＣＯＳ−１細胞にトランスフ
ェクションすることにより決定される。免疫ブロット分
析によれば、適切なタンパク質分解切断によって放出さ
れた前記のFcフラグメントは、キメラプラスミドが切断
部位において２つ並んだ塩基性アミノ酸Ｌｙｓ−Ａｒｇ
モチーフをコードするpro-CT cDNAを含む場合には、検
出できないと言うことが示された。抗-IgG CT抗体と反
応した分泌タンパク質のすべてが還元条件下で３７ｋＤ
ａの融合タンパク質であった。融合タンパク質が、Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇモチーフの他、Ｐ６位にＡｒｇ残基を有する
場合にも、同様の結果が得られた。融合タンパク質が、
Ｌｙｓ−Ａｒｇモチーフの他、Ｐ４位にＡｒｇ残基を有
する場合には、Fcフラグメントがトランスフェクション
されたＣＯＳ−１上清中で検出された。しかしながら、
成熟Fcフラグメントは抗-IgGに反応する分泌タンパク質
のうちごくわずかな画分にすぎない。対照的に、pro-CT
のカルボキシル末端のＰ４及びＰ６位の両方にＡｒｇ残
基を有する融合タンパク質は最も効率的にプロセッシン
グされて、成熟Fcフラグメントを分泌した。ＣＯＳ細胞
が切断モチーフのＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌ
ｙｓ−Ａｒｇを有する融合タンパク質の形成のためのキ
メラプラスミドとともにトランスフェクションされた場
合には、極わずかの量の担体タンパク質と大量の担体タ
ンパク質、及び大量の成熟Fcフラグメントが上清中に検
出された。この結果は、ＣＯＳ細胞がＡｒｇ−Ｘ−Ａｒ
ｇ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ配列を認識するプロセッシング
酵素を有していることを示すものである。
【０１６９】２． 生物活性な組換えGIFの発現のため
のpMEpro-CTプラスミドの応用 Fcフラグメントの分泌のための上述した実験は、ＣＯＳ
細胞での推定されるフリン様酵素の切断モチーフがＡｒ
ｇ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ａｒｇであることを示す
ことから、この配列を生物活性な組換GIFの形成のため
に使用した。Pro-Ct cDNAを、ＣＴ１及びＣＴ４プライ
マー（表１０参照）を使用してＰＣＲによって増幅し、
その増幅したcDNAをPME-pro-CTプラスミド中に挿入し
た。ヒトGIFcDNAを、SRαhcGIFについて前述した方法に
よって、前記のプラスミド中に導入し、pro-CT cDNAと
融合させた。ＣＯＳ細胞中へのプラスミドのトランスフ
ェクションによって１３ｋＤａのＧＩＦが分泌された。
【０１７０】実施例１４ 哺乳類細胞において発現された組変えGIF産物の精製 アフィニテイー精製のために、モノクローナル抗−ヒト
GIF、３８８Ｆ１（トーマス(Thomas)等、J.Immunol.,14
8:729,1992）若しくは組変えマウスＧＩＦに対するポリ
クローナルラビット抗体のどちらかを、製造業者によっ
て推奨された手法に従ってAffigel１０（Biorad）若し
くはHiTrap NHS-活性化カラム（Pharmacia）に結合させ
た。モノクローナル抗体（２ー３ｍｇ）若しくはポリク
ローナル抗血清のγグロブリン画分（８ー１２ｍｇ）を
１ｍｌのゲルに結合させた。
【０１７１】免疫吸着剤上の培養上清の分画は４℃でお
こなった。ＣＯＳ−１細胞の培養上清を、限外濾過によ
って１０ー２０倍に濃縮し、該濃縮上清の１０−１５容
量を１容量の免疫吸着剤カラムに一晩通した。濃縮物質
の容量が限られる場合には、２−４容量の上清を１容量
の免疫吸着剤と一晩混合し、該懸濁液をカラムに充填し
た。前記のカラムを、７−１０カラム容のＰＢＳによっ
て洗浄し、カラム中に保持されたタンパク質を、３−４
カラム容の０．１ＭグリシンＨＣｌ緩衝液、ｐＨ３．０
を用いて溶出させた。トリス緩衝液でｐＨを７−８に調
節した後、前記の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析
し、GIFを銀染色法若しくはポリクローナル抗ー組換えG
IFを用いるウェスタンブロットによって検出した。洗浄
画分及び酸溶出画分をバイオアッセイ用のＲＰＭＩ１６
４０媒地に対して透析した。酸で溶出させた画分中の１
３ｋＤａタンパク質の純度は９０％以上であった。
【０１７２】また、哺乳類細胞由来GIFを、慣用のカラ
ムクロマトグラフィーによって精製した。本実施例で
は、１００ｍｌのＣＯＳ−１上清を１０倍に濃縮し、Ｐ
ＢＳで平衡化したＴＳＫ Ｇ２０００ＳＷ（東ソー）カ
ラム（２１．５ｘ６００ｍｍ）にかけた。前記のカラム
を、３ｍｌ／分の流速で室温にて使用した。ポリクロー
ナル抗ＧＩＦ抗体を用いるウェスタンブロット法により
測定したところ、ＧＩＦは低分子量と見積もられた画分
に溶出した。ＧＩＦ含有画分を溜め、限外濾過により濃
縮し、２０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ8.０で平衡化
したTSK DEAE-5PW（東ソー）カラムにかけた。流速0.５
ml/ 分で室温にてこのカラムに通した。添加した後、こ
のカラムを同じ緩衝液で洗浄し、ＧＩＦをこの洗浄段階
で回収した。大腸菌誘導ＧＩＦとCOS-1 由来ＧＩＦとの
ＤＥＡＥに対する結合能力の差異は、Ｏ結合グリコシル
化または燐酸化の存在により説明できる。
【０１７３】Vydac Protein C4逆相カラム（The Separa
tions Group)(4. ６×１５０ｍｍ）を用いて、ＧＩＦの
さらなる精製を行った。ＤＥＡＥカラムからのＧＩＦ画
分（１０ｍｌ）をＣ４カラムにかけ、１００ｍＭ酢酸ア
ンモニウム緩衝液で平衡化し、流速0.４ｍｌ／分で室温
にてカラム緩衝液中の０〜９０％エタノールの勾配によ
りＧＩＦ精製した。ＧＩＦは、５０〜６０％エタノール
を含有する画分に溶出し、これをＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動およびポリクローナル抗−ＧＩＦ抗
体を用いるウェスタンブロット法により同定した。
【０１７４】実施例１５ 組換えＧＩＦの生物学的活性 Ａ．組換えＧＩＦのＧＩＦ活性の評価 マウスＴ細胞ハイブリドーマ１２Ｈ５細胞をグリコシル
化ＩｇＥ結合因子（ＩｇＥ−ＢＦ）産生から非グリコシ
ル化ＩｇＥ−ＢＦ産生に変換する試験試料の能力によ
り、組換えヒトＧＩＦのグリコシル化阻害活性を評価し
た（Iwata およびIshuzaka, J.Immunol., 141:3270, 19
88) 。このアッセイにおいて、１２Ｈ５細胞を２４時間
１０μｇ／ｍｌのマウスＩｇＥとともに試験試料の存在
下あるいは非存在下で培養した。培養上清をＣＦ５０Ａ
膜を通して濾過してＩｇＥを除去した。濾液をレンチル
レシチンSepharose カラムにかけ、このカラムを２カラ
ム容のＤＰＢＳで洗浄した。このカラムに保持されたタ
ンパク質を0.２Ｍのαメチルマンノシドで溶出した。洗
浄液と合わせた通過画分および溶出画分を各々２日間Ｄ
ＰＢＳに対して透析し、これらの画分を濃縮した。前に
記載した手法(Yodoi,et al., J.Immunol., 124:425, 19
80)により、ＩｇＥでコーティングした固定化ウシ赤血
球によるＦｃεＲ＋Ｂ細胞のロゼット形成を阻止する画
分の能力により、これらの画分におけるＩｇＥ−ＢＦの
存在を評価した。線虫Nippostrongylusbrasiliensisに
感染したラットの腸間膜リンパ節細胞をＦｃεＲ＋細胞
の供給源として採用した。１２Ｈ５細胞をマウスＩｇＥ
のみとともに培養した場合、その細胞により産生された
ほとんどすべてのＩｇＥ−ＢＦがレンチルレクチンSeph
arose と結合し、αメチルマンノシドによる溶出により
回収された。従って、流出／溶出画分間のロゼット形成
阻止パーセントの比は、0.２よりも小さかった。十分な
量のＧＩＦを１２Ｈ５細胞の培養物にマウスＩｇＥとと
もに添加すると、この細胞により生成されるＩｇＥ−Ｂ
Ｆの大部分はレンチルレシチンSepharose に保持され
ず、溶出画分に回収された。従って、流出／溶出画分間
のロゼット形成阻止パーセントの比が2.０以上であるな
らば、試験試料中のＧＩＦは（＋）とされた。
【０１７５】プラスミドSRα-hcGIFおよびSRα-furinに
より同時トランスフェクションしたCOS-1 細胞の培養上
清は、１２Ｈ５細胞をグリコシル化ＩｇＥ−ＢＦ産生か
ら非グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦ産生に変換する能力を有
している。階段希釈の20倍濃縮した培養上清のＧＩＦ活
性を上記の方法により評価したところ、その活性は１：
１００の希釈で検出された。濃縮した上清の４ｍｌアリ
コートを２ｍｌの３８８Ｆ1(モノクローナル抗−ＧＩ
Ｆ）−結合 Sepharose上で分画し、ほとんどすべての活
性（＞７５％）を酸溶出画分中に回収した。その画分に
おいて、１３ｋＤａのペプチドだけが検出された。ウェ
スタンブロットにより、このタンパク質をＧＩＦと同定
した。通過および酸溶出画分のＧＩＦ生物活性の力価測
定により、前画分の活性は溶出画分中に回収されたそれ
の１／１０より小さいことが示された。ＧＩＦ活性の検
出のための溶出画分の最大希釈におけるこの１３ｋＤａ
のタンパク質の濃度は、１０ｎｇ／ｍｌであった。
【０１７６】３８８Ｆ1Affigelからの酸溶出画分を、さ
らにポリクローナル抗−組換えｍＧＩＦのγグロブリン
画分と結合したAffigel 上で分画した。すべてのＧＩＦ
生物活性およびその画分における１３ｋＤａのペプチド
は免疫吸着剤に結合し、酸溶出画分中に回収された。階
段希釈の大腸菌由来γＧＩＦを対照として比較すること
により、この画分におけるこの１３ｋＤａのぺプチドの
濃度を見積もった。ＧＩＦ生物活性の検出に要求される
このタンパク質の最小濃度は５ｎｇ／ｍｌであった。そ
の結果をまとめると、活性な組換えｈＧＩＦは、モノク
ローナル抗−ヒトＧＩＦおよび組換えＧＩＦ（１３ｋＤ
ａタンパク質）に対するポリクローナル抗体の両者に結
合し、酸溶出により回収されたことが示された。
【０１７７】モノクローナル抗リポモジュリン１４１−
Ｂ９と結合したSepharose 上で同じ培養上清を分画し
た。またもや、免疫吸着剤からの酸溶出画分はＧＩＦ活
性を有していた。pME pro-CT-hGIF プラスミド（実施例
１３、Ｄ２）によるCOS-1 細胞のトランスフェクション
により、ヒトＧＩＦが得られたので、このトランスフェ
クションされたCOS 細胞の培養上清を388F1 affigel 上
で分画し、酸溶出により回収された１３ｋＤａのペプチ
ドのＧＩＦ生物学的活性を評価した。この方法により得
られた１３ｋＤａのペプチド１０〜２０ｎｇ／ｍｌはＧ
ＩＦ活性の検出に十分であった。この結果は、実施例１
３Ｄに記載の手法が、生物活性の高いＧＩＦを生成する
ための有効な方法であることを示していた。
【０１７８】組換えｈＧＩＦの生物活性がハイブリドー
マ由来ＧＩＦのそれに匹敵するかどうか測定するため
に、ＧＩＦ産生ヒトＴ細胞ハイブリドーマ３１Ｅ９をＤ
ＭＥＭ中に培養し、ポリクローナル抗ｒＧＩＦ抗体と結
合した免疫吸着剤を用いて培養上清中のＧＩＦを精製し
た。酸溶出画分中の１３ｋＤａのＧＩＦの濃度をウェス
タンブロットにより見積もり、１２Ｈ５細胞を用いてこ
の画分のＧＩＦ活性を力価測定した。その結果により、
５〜１４ｎｇ／ｍｌの１３ｋＤａペプチドは１２Ｈ５細
胞を非グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦの産生に変換するのに
十分であることが示された。従って、ＩｇＥ−ＢＦのグ
リコシル化を変換する能力に関して、組換えＧＩＦはハ
イブリドーマ由来ＧＩＦに匹敵するようである。また、
この実験は、ハイブリドーマ由来ＧＩＦは組換えＧＩＦ
に対する抗体と反応したことを示している。
【０１７９】前の実験は、マウスハイブリドーマ由来Ｇ
ＩＦの生物活性はアルカリ性ホスファターゼでの処理
（Ohno, et al., Intemat.Immunol., 1:425, 1989)によ
り３〜１０倍に増加したことを示していたので、組換え
ｈＧＩＦの生物学的活性に対するこの影響を調べること
にした。388F1-Affigel からのアフィニテイ精製したｒ
ＧＩＦにウシ血清アルブミンを２ｍｇ／ｍｌの濃度で添
加し、0.１ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのトリスＨ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ8.２）に対して透析した。調製物の半
分を十分な不溶性アルカリ性ホスファターゼ(Sigma) と
混合し、酵素濃度を５単位／ｍｌとし、この懸濁液を穏
やかに２時間室温にて攪拌した。この時間の後、この酵
素を遠心分離により除去し、ＲＰＭＩ １６４０培地に
対して透析し、アルカリ性ホスファターゼ処理および非
処理試料におけるＧＩＦ活性を評価した。これらの検討
により、１：３０の希釈で非処理組換えＧＩＦは１２Ｈ
５細胞を非グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦの産生に変換する
が、１：６０の希釈では変換しないのに対し、アルカリ
性ホスファターゼ処理試料におけるＧＩＦ活性は１：２
００の希釈でも検出可能であることが示された。
【０１８０】大腸菌の形質転換により得られた、あるい
はプラスミドSRα-hGIF によるCOS-1 細胞のトランスフ
ェクションにより得られた組換えＧＩＦ調製物の生物活
性を比較した。大腸菌の可溶性画分からの生成ＧＩＦ
（実施例１０Ａを参照）を３８８Ｆ1-Affigel またはポ
リクローナル抗−ＧＩＦ−結合affigel 上でさらに分画
し、酸性ｐＨでの溶出により回収した。
【０１８１】これらの調製物はすべて、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにおいて１３ｋＤａの単一のバンドを与えた。この１
３ｋＤａのＧＩＦの濃度を銀染色法により見積もり、１
２Ｈ５細胞を用いて、アフィニテイ精製したＧＩＦのＧ
ＩＦ生物活性を力価測定した。その結果は、１００〜２
００ｎｇ／ｍｌのＧＩＦが、この細胞をグリコシル化Ｉ
ｇＥ−ＢＦの産生から非グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦの産
生へ変換するのに要求されることを示した。プラスミド
SRα-hGIF でトランスフェクションされたCOS-1 細胞の
培養上清からのＧＩＦを３８８Ｆ1-Affigel を用いて精
製し、ＧＩＦ活性を評価した。１２Ｈ５細胞を変換する
ための１３ｋＤａのＧＩＦの最小濃度は約１５０ｎｇ／
ｍｌであった（表１１）。 表１１ アフィニテイ精製した組換えＧＩＦの生物学的活性 組換えGIF 免疫吸着剤 濃度a ＧＩＦ力価b 13kDaタンパク質の最小濃度 μg/ml ng/ml hcGIF 388F1 0.8 1:100 ８ 388F1 に 0.2 1: 40 ５ 続いて抗-GIF 141B9 0.1 1: 10 １０ hGIF 388F1 1.5 1: 10 １５０ 大腸菌- 388F1 2.0 1: 20 １００ 由来GIF 非分画 10.0 1: 10 １０００ poly抗-GIF 2.0 1: 10 ２００ ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで見積もった、各調製物における
１３ｋＤａのＧＩＦタンパク質の濃度 ｂ）調製物のＧＩＦ活性は１２Ｈ５細胞を用いて力価測
定した。 ｃ）１２Ｈ５細胞をグリコシル化ＩｇＥ−ＢＦ産生から
非グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦ産生に変換するのに要求さ
れる１３ｋＤａのＧＩＦの最小濃度
【０１８２】B. マクロファージ遊走阻止活性の欠如 ｃＤＮＡヌクレオチド配列中のＧＩＦとＭＩＦとの相同
性（Weiser, et al.,上掲書, 1989) のため、ＧＩＦを
ＭＩＦ活性について試験した。ヒトＭＩＦは、ヒト単球
並びにモルモット及びマウスのマクロファージの遊走を
抑制するため、組換え体ｈＧＩＦの活性を、マウスマク
ロファージを用いて測定した。無菌鉱物油３ｍｌを正常
ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射し、３日後に腹腔浸出
細胞を回収した。単核細胞を、遠心分離によりＦＣＳ層
を通して回収し、約５×107 の単核細胞を含む細胞ペレ
ットを、１５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中の予め温めた
０．３５％アガロース５０μｌに懸濁した。この懸濁液
の小滴１μｌを、平底９６ウェルのマイクロタイタープ
レートの各ウェルの中央に分布させ、これを氷上に５分
間保持した。このウェルに、１５％ＦＣＳを加えたＤＭ
ＥＭを試料と共に加え、全容量１００μｌで試験される
ようにした。一つの試験試料を、三重又は四重に評価し
た。各小滴の直径を、倒立顕微鏡の下で測定した。２０
ないし２４時間のインキュベーションの後、遊走する細
胞の外側の領域の直径を測定し、遊走指数を計算した。
遊走の阻止率は、下記の式により計算した。 遊走阻止率＝(1−試験試料の遊走指数／試料なしの遊走
指数）×100 ｒｈＧＩＦのＭＩＦ活性を、正の対照としてマウスγ−
インターフェロンを用いて評価した。ＳＲα−ｈｃＧＩ
Ｆ及びＳＲα−ｈｆｕｒｉｎによるＣＯＳ−１細胞の同
時トランスフェクションにより組換えｈＧＩＦの階段希
釈物を得、上記のように３８８Ｆ１−ａｆｆｉｇｅｌを
用いてアフィニティ精製した。該調製物のＧＩＦ力価は
１：１００であったが、最終希釈度１：８又は１：４
で、マクロファージ遊走の有為な阻止は検出されなかっ
た。同じ実験において、１単位／ｍｌのＩＦＮγは、マ
クロファージの遊走を２０ないし４８％阻止した。
【０１８３】これらの結果を、寒天小滴中のヒトの単球
（Remold, H.G. and Menddls A.D.,Methods in Enzymol
ogy 116: 379, 1985) を用い、ヒトＭＩＦを正の対照と
して用いて確認した。組換えｈＧＩＦは、１：１００の
希釈度で、１２Ｈ５細胞を、非グリコシル化ＩｇＥ−Ｂ
Ｆを形成するように切り替えることができ、約０．８μ
ｇ／mlの１３ｋＤａ ＧＩＦペプチドを含んでいたが、
最終希釈度１：５でヒトの単球の遊走を阻止することは
できなかった。これらの結果は、ｒｈＧＩＦが生物学的
活性において、ＭＩＦとは異なることを示している。
【０１８４】実施例１６ 組換えｈｃＧＩＦによる抗原特異的サプレッサーＴ細胞
のインビトロ生成 前の実験は、ラット−マウスＴ細胞ハイブリドーマ２３
Ａ４細胞由来のＧＩＦが、抗原感作脾臓細胞 (Iwata,
M. and Ishizaka, K.; J. Immunol. 141: 3270,1988)か
らの抗原特異的サプレッサーＴ細胞の生成を促進するこ
とを示した。ＢＤＦ1 マウスが、アルム吸収オボアルブ
ミンにより、ＩｇＥ抗体応答について免疫されると、そ
の脾臓細胞は、抗原刺激に際して、グリコシル化増強因
子（ＧＥＦ）を構造的に分泌し、ＩｇＥ強化因子（グリ
コシル化ＩｇＥ−ＢＦ）及び抗原結合ＧＥＦの両方を産
生する。抗原感作脾臓細胞がオボアルブミンにより刺激
され、抗原で刺激されたＴ細胞がＧＩＦの存在下でＩＬ
−２により増殖すると、細胞はＧＩＦを分泌する。抗原
刺激により、これらの細胞が非グリコシル化ＩｇＥ−Ｂ
Ｆ及び抗原結合ＧＩＦを産生し、後者は、担体に特異的
な方法で、同系マウスのＤＮＰ−ＯＶＡに対する抗体応
答を抑制する。この現象をさらに完全に探究するため
に、組換えｈｃＧＩＦが、インビトロでＧＩＦ産生Ｔ細
胞を生成する能力を有しうるか否かを調べることにし
た。
【０１８５】ＢＤＦ1 マウスを、水酸化アルミニウムゲ
ルに吸着させたオボアルブミン１μｇを用いて、ＩｇＥ
抗体応答のために感作した。免疫感作から２週間後に、
脾臓細胞を得、懸濁液（５×１０6 細胞／ｍｌ）を１０
μｇ／ｍｌのＯＶＡと共に３日間培養して、抗原感作Ｔ
細胞を活性化した。その後、抗原活性化細胞（２．５×
１０5 細胞／ｍｌ）のアリコートを、組換えマウスＩＬ
−２（５０単位／ｍｌ）を用い、ｒｈｃＧＩＦ（０．２
５μｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で増殖させた。４
日間培養した後、細胞を回収し、３回洗浄し、新鮮な培
地に１．５×１０6 細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。Ｇ
ＩＦ（＋）又はＧＩＦ（−）培養物から回収された細胞
懸濁液４ｍｌを、ｌａb 及びｌａd の両方を有する８×
１０5 個のＯＶＡ添加ＬＢ２７．４細胞（アメリカンタ
イプカルチャーコレクション，ロックビル，ＭＤ）とと
もに２４時間インキュベートした。抗原刺激Ｔ細胞の培
養上清液を、ＩｇＥ結合Sepharose に吸収させ、ＩｇＥ
−ＢＦを酸溶出により, 免疫吸着剤から回収した。その
後、ＩｇＥ−Sepharose からの通過画分を、ＯＶＡ結合
Sepharose 上で分画し、グリシン−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ
３．０で溶出することにより、ＯＶＡ結合因子を回収し
た。ＩｇＥ−Sepharose からの溶出物（即ち、ＩｇＥ−
ＢＦ）を、レンチルレクチンSepharose 上で分画し、こ
れらの因子の性質を調べた。表12に示された結果は、Ｉ
Ｌ−２単独で増殖されたＴ細胞からのＩｇＥ−ＢＦの大
部分が、レンチルレクチンSepharose に結合し、α−メ
チルマンノシドで溶出することにより回収されたことを
示す。これとは対照的に、ｈｃＧＩＦの存在下でＩＬ−
２により増殖されたＴ細胞は、非グリコシル化ＩｇＥ−
ＢＦを生成し、これは、レンチルレクチンSepharose 上
に保持されなかった。
【０１８６】ＧＥＦ又はＧＩＦ活性とＯＶＡ結合因子と
の関係も評価した。抗原刺激により、ＩＬ−２単独で増
殖されたＴ細胞はＯＶＡ結合ＧＥＦを生成するのに対
し、組換えＧＩＦの存在下で増殖されたＴ細胞はＯＶＡ
結合ＧＩＦを生成した（表12）。そのようなＴ細胞由来
のＯＶＡ結合ＧＩＦが、抗原（担体）に特異的な様式(I
wata, M. and Ishizaka, K.; J. Immunol., 1988) で、
ＢＤＦ1 マウスの抗体応答を抑制することが示された。
従って、組換えＧＩＦは、抗原特異性サプレッサーＴ細
胞因子を産生するサプレッサーＴ細胞の生成を促進し
た。 表12 組換えｈｃＧＩＦ及びＩＬ−２によるＧＩＦ産生細胞の生成 ＯＶＡ特異的Ｔ細胞a ＩｇＥ−ＢＦの性質b ＯＶＡ結合因子c の増殖 ＧＥＦ ＧＩＦ ＩＬ−２ ４／２８ ＋ − ＩＬ−２＋ｈｃＧＩＦ ２６／６ − ＋ ａ 抗原刺激Ｔ細胞を、組換えｈｃＧＩＦの存在下又は
非存在下で、ＩＬ−２により増殖させた。 ｂ ＩＬ−２により増殖されたＴ細胞を、抗原刺激ＬＢ
２７．４細胞で刺激した。上清中のＩｇＥ−ＢＦを、レ
ンチルレクチンSepharose 上で分画した。数字は、各々
レンチルレクチンSepharose からの流出／溶出画分によ
るロゼット阻害率示す。 ｃ 各々１２Ｈ５細胞及び２３Ａ４細胞を用いて、ＯＶ
Ａ- Sepharose からの酸溶出画分のＧＩＦ及びＧＥＦ活
性を評価した。
【０１８７】実施例１７ 組換えＧＩＦのインビボ活性 組換えＧＩＦのインビボ活性 前の実験は、ＧＩＦ産生ハイブリドーマの培養濾液のＧ
ＩＦに富む画分を、免疫したマウスに、初回免疫の日か
ら始めて繰り返して注入することにより、ＩｇＥ及びＩ
ｇＧ抗体応答のいずれもが抑制されることを示した(Aka
saki, M., et al., J. Immunol. 136: 3172, 1986)。組
換えＧＩＦが同じインビボ効果を有するか否かを調べる
ために、大腸菌で発現させたｒｈＧＩＦ（実施例１０
Ａ）及びＣＯＳ−１細胞で発現させたｒｈＧＩＦ（実施
例１３Ａ）を、実施例１０及び１４に記載した方法によ
り均質になるまで精製し、ＩｇＥ及びＩｇＧ１抗体応答
を抑制する能力について評価した。ＢＤＦ1 マウスを、
２ｍｇのアルムに吸着させた０．２μｇＤＮＰ−ＯＶＡ
を腹腔内に注射することにより免疫感作した。組換えＧ
ＩＦを、0 、2 、4 、6 、8 、10及び12日目に腹腔内に
注射し、血清中の抗ＤＮＰ抗体をＥＬＩＳＡにより測定
した。
【０１８８】第一の実験においては、ＰＢＳ中の大腸菌
由来ｒＧＩＦを、１８μｇ／投与の用量で投与し、対照
マウスにはＰＢＳのみを投与した。グリコシル化ＩｇＥ
−ＢＦの生成から、非グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦの生成
へ１２Ｈ５細胞を切り替えするためのｒＧＩＦの最小濃
度は約１μｇ／ｍｌであった。対照マウス及びＧＩＦ処
理マウスの両方において、ＩｇＥ抗体力価は、２週間で
最大になり、その後下降したが、ＩｇＧ１抗ＤＮＰ抗体
力価は、免疫感作の後、４ないし５週間増加し続けた。
従って、２週間目におけるＩｇＥ抗体力価及び４週間目
におけるＩｇＧ１抗体力価をＧＩＦ処理群と未処理群と
の比較のために使用した。 大腸菌由来ｒＧＩＦの効果 試料 Ｎ 抗ＤＮＰ ＩｇＥa ＩｇＧ１b 対照 ６ ６．７±３．５ ７８．０ ｒＧＩＦ ３ １．５±１．３（ｐ＜０．０５） ４．５ ａ 免疫感作後２週間（μｇ／ｍｌ） ｂ 免疫感作後４週間（μｇ／ｍｌ） 第二の実験においては、ＳＲα−ｈｃＧＩＦベクターを
用いて発現させたＣＯＳ−１由来ｒｈＧＩＦを、２．５
μｇ／注射の用量で腹腔内投与した。１２Ｈ５細胞の非
グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦの生成への変換のためのｈＧ
ＩＦの最小濃度は０．２μｇ／ｍｌであった。対照マウ
スにはＰＢＳのみを投与した。結果を下記に示す。 哺乳類細胞系由来ｒＧＩＦの効果 試料 Ｎ 抗ＤＮＰ ＩｇＥa （μｇ／ｍｌ） 対照 ８ ２．６±１．２ ｒＧＩＦ ５ ０．７±０．５５（ｐ＜０．０５） ａ 免疫感作後２週間 ＧＩＦに対して副作用を示す動物はなかった。実施例は
ＧＩＦの免疫抑制効果を示す。
【０１８９】実施例１８ 抗原特異的グリコシル化抑制因子に対するモノクローナ
ル抗体の生産 Ａ．材料及び方法 １．抗原及び抗体：凍結乾燥したハチ毒ホスホリパーゼ
Ａ2 （ＰＬＡ2 ）は、Sigma Chemical Co., St Louis,
MOから得た。結晶オボアルブミン（ＯＶＡ）はオハイオ
州クリーブランドのNutritional Biochemical Corp. か
ら得た。ＰＬＡ2 分子中のアミノ酸残基13ないし28に相
当する合成ペプチド、及びアミノ酸残基25ないし40に相
当する合成ペプチドは、Howard Grey 博士( カリフォル
ニア州, La JollaのCytel Corp.)により提供された。Ｐ
ＬＡ2 分子中のアミノ酸19ないし35に相当するペプチド
は、日本の前橋市のキリン医薬研究所により合成され
た。これらの合成ペプチドの全ては、ＨＰＬＣにより精
製され、そのアミノ酸配列が確認された。モノクローナ
ル抗ヒトＧＩＦ抗体，３８８Ｆ1 （ＡＴＣＣ ＨＢ １
０４７２）は実施例５に記載した。
【０１９０】２． 細胞系：実施例３に記載したヒトＴ
細胞ハイブリドーマＡＣ５細胞は、ＣＤ３及びＴＣＲα
βの両方を発現し、構成的にＧＩＦを分泌する。これら
の細胞を、１０％ＦＣＳ，１０％ＮＣＴＣ １３５培地
（Gibco, Grand island, NY), １０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩
衝液，０．２ｕ／ｍｌウシインシュリン（Sigma)，５０
μｇ／ｍｌピルビン酸ナトリウム、１５０μｇ／ｍｌオ
キザロ酢酸及び抗生物質を加えた高グルコースＤＭＥＭ
中で培養した。
【０１９１】抗ヒトＧＩＦを産生するＢ細胞ハイブリド
ーマは、アフィニティー精製した抗原結合ＧＩＦ（下記
参照）により免疫感作したＢＡＬＢ／ｃマウス(Jackson
Lab, Bar Harbor, ME) の脾臓細胞から構築した。最後
の追加免疫感作から１週間目に、脾臓細胞を、Iwata et
al., J. Immunol., 132: 1286, 1984 に記載された手
法により、ヒポキサンチンホスホリボトランスフェラー
ゼ欠損Ｓｐ２／０ ＡＧ１４細胞（Schulman, et al.,
Nature, 271: 269, 1978) と融合した。このハイブリド
ーマのサブクローニングは限界希釈により行った。この
ハイブリドーマを、上記の完全ＤＭＥＭ培地中に維持し
た。
【０１９２】３．ＧＩＦの分画及び精製 無血清培地中の未刺激ＡＣ５細胞の培養液上清中の非特
異性ＧＩＦを、ＤＥＡＥ Sepharoseカラムのクロマトグ
ラフィーにより純化した。培養上清を、２０〜１００倍
に濃縮し、蒸留水で３倍に希釈し、トリスでｐＨ８．０
に調整し、その後、５０ｍＭのＮａＣｌを含有するトリ
スＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０で平衡化したＤＥＡＥSephar
ose （Pharmacia)カラムに通した。通過画分及び緩衝液
によるカラムの洗浄液を合わせ、濃縮した。もとの培養
上清中の非特異的ＧＩＦは、３８８Ｆ1 結合Affigel を
用いてアフィニティ精製した。濃縮した培養上清を免疫
吸着剤を通して一晩再循環させた。３０カラム容量のＤ
ＰＢＳで洗浄した後、免疫吸着剤に結合したタンパク質
を、０．１ＭグリシンＨＣｌ緩衝液，ｐＨ３．０で溶出
することにより回収した。
【０１９３】抗原結合ＧＩＦを生産するために、ＡＣ５
細胞をＣＤ３の架橋により刺激した（Thomas, et al.,
J. Immunol. 148: 729, 1992) 。この細胞 (５×１０6
ｍｌ）を、５μｇ／ｍｌのモノクローナル抗ＣＤ３（Ｓ
ＰＣ−Ｔ3 ｂ）で、４℃で３０分間処理し、抗体処理細
胞を１０μｇ／ｍｌの抗マウスＩｇと共に４℃で３０分
間インキュベートした。洗浄した後、細胞をＡＢＣ培地
に、２×１０6 細胞／ｍｌで再懸濁し、２４時間培養し
た。培養の上清を限外濾過により１０ないし１５倍に濃
縮し、ＰＬＡ2 結合Sepharose カラムを通して一晩再循
環させた。カラムをＤＰＢＳで洗浄し、カラム中に残っ
ているタンパク質を０．１ＭグリシンＨＣｌ緩衝液，ｐ
Ｈ３．０で溶出することにより回収した。
【０１９４】アフィニティ精製したＧＩＦを、ＨＰＬＣ
（Beckman System Gold, Fullteron, CA) に連結したSu
perose１２カラム（１．６×５０ｃｍ，Pharmacia)を通
してゲル濾過により分画した。このカラムから、ＰＢＳ
を用いて０．８５ｍｌ／分の流速でタンパク質を溶出さ
せた。カラムをＢＳＡ（分子量６７，０００），ＯＶＡ
（分子量４３，０００），大豆トリプシンインヒビター
（分子量２０，１００）及びチトクロームＣ（分子量１
２，５００）でキャリブレーションした。いくつかの実
験においては、アフィニティ精製したＧＩＦ調製物を還
元し、アルキル化した。０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有す
る０．０５ＭトリスＨＣｌ緩衝液中のＧＩＦ調製物を、
１０ｍＭのジチオスレイトールと共に室温で１時間イン
キュベートし、その後、３０％モル過剰のヨードアセト
アミドでアルキル化した。還元し、アルキル化した試料
を同じSuperose１２カラムにかけ、タンパク質をＰＢＳ
で溶出させた。
【０１９５】４．ＥＬＩＳＡ分析：Ｎｕｎｃ Ｆプレー
ト（Max Sorp, Nunc) の各ウェルを、５０μｌの階段希
釈度のＧＩＦ調製物で、４℃で一晩、２重又は３重にコ
ーティングした。プレートを、基質の添加の前の工程を
除く以下の工程間に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（Si
gma)を含有するリン酸塩緩衝液で５回洗浄した。該プレ
ートを、Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ中の２％のＢＳＡで、３７
℃で１時間ブロックした。ｍＡｂ ３８８Ｆ 1 のＧＩＦ
への結合が、増幅システムにより検出された。１５０ｎ
ｇ／ｍｌのビオチニル化ｍＡＢ ３８８Ｆ1 を含むＰＢ
Ｓ５０μｌを各ウェルに添加した。３７℃で２時間イン
キュベートし、洗浄した後、ストレプトアビジン結合ア
ルカリ性ホスファターゼ(Zymed) の適当な希釈液(1:600
0)５０μｌを各ウェルに加え、プレートを３７℃で２時
間インキュベートした。プレートを、０．１５ＭのＮａ
Ｃｌを含有する０．０５Ｍ トリスＨＣｌ緩衝液，ｐＨ
７．５中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、５０μ
ｌのアルカリ性ホスファターゼ基質、及び続いて増幅溶
液（GIBCO/Bethesda Research Lab)と共に３０分間イン
キュベートすることによりＥＬＩＳＡシグナルを発色さ
せた。４９０ｎｍでの吸収を、ＥＬＩＳＡリーダーＭＲ
５０００（Dynatech) 中で測定した。
【０１９６】また、ＥＬＩＳＡは、抗原結合ＧＩＦに対
するモノクローナル抗体についても行われた。Ｍａｘ−
Ｓｏｒｐプレートを、ＧＩＦ標本でコーティングし、Ｂ
ＳＡでブロックした後、ＰＢＳ中のモノクローナル抗体
（２００ｎｇ／ｍｌ）５０μｌを各ウェルに添加し、プ
レートを３７℃で２時間インキュベートした。ｍＡＢの
アイソタイプに応じて、ホースラディッシュペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗マウスＩｇＭ（Biorad) 若
しくは抗マウスＩｇＧ（Zymed)の１：３０００希釈物、
又はＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ＋Ａ＋Ｍ（Zymed)の１：
２０００希釈物を各ウェルに添加した。ＥＬＩＳＡシグ
ナルは、ペルオキシダーゼ基質（Zymed)により発色さ
れ、４０５ｎｍの吸収により調べられた。
【０１９７】５．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロッティ
ング：アフィニティ精製したＧＩＦを、０．０１％ＳＤ
Ｓに対して透析し、凍結乾燥した。その後、試料を、１
５％ポリアクリルアミドスラブゲル中で、Ｌａｅｍｅｌ
ｉシステム（Laemeli, U.K., Nature, 227:680, 1980)
を用いて、ＳＤＳゲル電気泳動により分析した。タンパ
ク質のバンドは、銀染色法により検出した(Ochs, et a
l., Electrophoresis, 2:304, 1981)。免疫ブロッティ
ングについては、アフィニティ精製したＧＩＦを、還元
条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。標準とし
て、精製した大腸菌からの組換えＧＩＦを並行に電気泳
動にかけた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中のタンパク質は、
PVDF膜(Immobilon-P, MIllipore)にブロットされ、この
膜は、Blocker Blotto(Pierce)で、４℃で一晩インキュ
ベートすることによりブロックされた。ＰＢＳ，ｐＨ
７．５中の０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄した後、
膜をウサギ抗ｒＧＩＦの１μｇ／ｍｌのＩｇＧ画分で３
７℃で１時間処理した。ＨＲＰ結合ロバ抗ウサギＩｇＧ
及びＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ）により、続いてオートラジオグラフィーに
より、ウサギＩｇＧのタンパク質バンドへの結合を検出
した。Ｘ線フィルム上のｒＧＩＦバンドの位置は、１４
ｋＤａ標準として用いられた。
【０１９８】Ｂ． 抗原結合ＧＩＦに対して特異的なモ
ノクローナル抗体の生産：ＡＣ５細胞を、抗ＣＤ３で、
続いて抗ＭＧＧで処理し、上清中の抗原結合ＧＩＦをＰ
ＬＡ2 結合Sepharose を用いてアフィニティー精製し
た。この調製物は、１：３０ないし１：６０の希釈度
で、１２Ｈ５細胞を、グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦの生成
から、非グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦの生成に変換するこ
とができた。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＣＦＡ中の調製物
０．１ｍｌを腹腔内投与することにより免疫感作し、続
いて不完全フロインドアジュバント中の同じ抗原の追加
注射を５回行った。最後の追加注射の２週間後に、動物
を殺し、その脾臓細胞を、Ｂ細胞系ＳＰ２／０ＡＧ１４
と融合した。
【０１９９】ハイブリドーマの培養上清を、マウスＩｇ
の存在について試験した。Ｉｇを産生するこれらのハイ
ブリドーマを、さらに抗ＧＩＦの存在についてＥＬＩＳ
Ａ分析により試験した。Ｍａｘｉ−Ｓｏｒｐウェルに、
ＰＬＡ2 結合ＧＩＦでコーティングし、培養上清中のマ
ウスＩｇのＧＩＦコーティングウェルへの結合を、ＨＲ
Ｐ結合抗マウスＩｇＧ＋Ａ＋Ｍを用いて測定した。８つ
のハイブリドーマの培養液上清がＥＬＩＳＡによる実質
的な吸収を呈した。８つのハイブリドーマの上清中の抗
ＧＩＦ抗体の存在は、アフィニティー精製したＰＬＡ2
結合ＧＩＦのアリコートを各培養液上清と共にインキュ
ベートし、続いてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ１００（Amersha
m) を通してこの混合物を濾過することにより確認され
た。８つのハイブリドーマからの抗体全てが、ＧＩＦと
結合するということが、濾液のＧＩＦ活性の分析により
示された。これとは反対に、ＰＬＡ2 結合ＧＩＦ自体の
濾液では、活性が有った。
【０２００】その後、同じ培養液上清を、非特異的ＧＩ
Ｆに対するモノクローナル抗体の存在について試験し
た。Ｍａｘｉ−Ｓｏｒｐプレートを、アフィニティー精
製した非特異的ＧＩＦ又は抗原特異的ＧＩＦでコーティ
ングし、各Ｂ細胞ハイブリドーマの培養上清をウェルに
添加した。３７℃で２時間インキュベートした後、ウェ
ルを洗浄しＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ＋Ａ＋Ｍの１：２
０００希釈物を各ウェルに添加した。ＥＬＩＳＡシグナ
ルを、ペルオキシダーゼ基質で発色させ、４０５ｎｍの
吸収を測定した。ＧＩＦでコーティングし、ＨＲＰ結合
抗体及び基質とインキュベートした対照ウェルの吸収を
差し引いた。この実験の結果は、二つのハイブリドー
マ、即ち１１０及び２０５のみが、抗原非特異的ＧＩＦ
によってよりも、ＰＬＡ2 結合ＧＩＦ（即ち、抗原特異
的ＧＩＦ）によって、実質的により高いＥＬＩＳＡシグ
ナルを与えることを示した。このハイブリドーマ１１０
及び２０５は、限界希釈によりサブクローニングされ、
各クローンの培養上清は、ＰＬＡ2 結合ＧＩＦに対する
モノクローナル抗体の選択的結合について、ＥＬＩＳＡ
により試験された。繰り返してサブクローニングした
後、二つのハイブリドーマの各々のサブクローン、即ち
１１０ＢＨ３及び２０５ＡＤ２が得られた。これらの培
養液の上清は、抗原結合ＧＩＦによってのみＥＬＩＳＡ
シグナルを与えた。モノクローナル抗体１１０ＢＨ３は
μκアイソタイプであり、２０５ＡＤ２はλ 1 κアイソ
タイプであった。
【０２０１】両方のモノクローナル抗体ともＰＬＡ2 特
異的ＧＩＦに結合するが、非特異的ＧＩＦには結合しな
いことの確認は、バイオアッセイにより行った。ＧＩＦ
調製物のアリコートを、１１０ＢＨ３細胞及び２０５Ａ
Ｄ２細胞のいずれかの培養上清を用いて、一晩インキュ
ベートし、得られた混合物を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ１０
０を通して濾過した。１２Ｈ５細胞を用いての濾液中の
ＧＩＦ活性の測定により、両方の抗体ともＰＬＡ2 結合
ＧＩＦには結合するが、非特異的ＧＩＦには結合しない
ことが示された。次に、モノクローナル抗体 １１０Ｂ
Ｈ３を、ハイブリドーマの培養上清から、硫酸アンモニ
ウムの１／３飽和溶液を用いて沈澱させることにより、
純化し、５ｍｇのＩｇＭを１．５ｍｌのSepharose に結
合させた。その後、ＡＣ５細胞からのＰＬＡ2 結合ＧＩ
Ｆ及び非特異的ＧＩＦを抗体結合Sepharose を用いて分
画した。ＰＬＡ2 結合ＧＩＦを、抗ＣＤ３処理ＡＣ５細
胞の培養上清から、ＰＬＡ2 結合Sepharose によるアフ
ィニティ精製により製造し、一方、非特異的ＧＩＦを非
刺激ＡＣ５細胞の培養上清から３８８Ｆ1 結合Sepharos
e を用いて製造した。表13に示した結果は、ＰＬＡ2 結
合ＧＩＦは１１０ＢＨ３を結合させた免疫吸着剤に結合
し、酸性ｐＨで溶出により回収されるが、非特異的ＧＩ
Ｆは免疫吸着剤に保持されないことを示した。 表１３ 110 ＢＨ3 結合 Sepharosea 上でのＧＩＦ調整物の分画 免疫吸着剤b ＰＬＡ2-結合ＧＩＦ 非特異的ＧＩＦ からの画分 希釈 ＧＩＦ活性c 希釈 ＧＩＦ活性c 未分画 1:10 25/0 (＋) 1:30 28/0 (＋) 通 過 1:2 0/30 (−) 1:30 29/4 (＋) 洗 浄 1:2 0/23 (−) 1:2 3/32 (−) 溶 出 1:10 25/0 (＋) 1:2 0/30 (−) 対照の培地 0/33 1/30 a PLA2- 結合GIF および非特異的GIF は、それぞれ1:
10および1:30の希釈で、12H5細胞を、グリコシル化IgE-
BFの生成から非グリコシル化IgE-BFの生成に変換でき
た。 b GIF 調製物1 mlを110 BH3-結合Sepharose0.25 mlと
混合した。通過画分とDPBSでの洗浄物1 mlを合わせた
（通過画分) 。カラムを DPBS 5 mlで洗い (洗浄)、そ
の後グリシンＨＣｌ緩衝液、pH 3.0で溶出した( 溶出)
。透析後、各画分をGIF 分析のために1.0 mlに濃縮し
た。 c GIF 活性を12H5細胞を使用して測定した。この列の
数字は、レンチルレクチンSepharose からの流出/ 溶出
画分によるロゼット形成阻止パーセントを表す (方法を
参照のこと) 。( ＋)(−) はGIF 活性の存在または非存
在を示す。 ELISA による抗原- 結合GIF と非特異的GIF の検出を試
みた。非特異的GIF は、DEAE- Sepharose カラムによる
イオン交換カラムクロマトグラフィーによる、非刺激AC
5 細胞の培養上清の分画により、純化した。NaCl 50 mM
を含むトリス緩衝液での通過画分を濃縮した。抗-CD3-
刺激細胞の培養上清中の抗原- 結合因子を、PLA2- 結合
Sepharose を使用して精製し、そして酸溶出液中の因子
を110BH3- 結合Sepharose 上で、さらに分画した。抗原
- 特異的および非特異的GIF 調製物の両方が、1:60の希
釈で12H5細胞を、グリコシル化IgE-BFの生成から非グリ
コシル化IgE-BFの生成に変換させた。次いで、Max-Sorb
ウェルを段階希釈のひとつの調製物でコーティングし、
そしてブロッキングした後、モノクローナル抗体の388F
1 または110 BH3 をウェルに添加した。モノクローナル
抗体 388F1は、非特異的GIF と抗原- 結合GIF 調製物の
両方でELISA シグナルを示したが、一方モノクローナル
抗体 110-BH3は抗原- 結合因子とは反応したが非特異的
GIF とはしなかった。アッセイにおいて、モノクローナ
ル抗体を無関係なIgG2a またはIgM で置換した場合はシ
グナルが検出されなかったので、ELISA シグナルはモノ
クローナル抗体の特異的結合によるものと思われる。
【０２０２】上述のアフィニティ精製した抗原- 結合因
子をPLA2- Sepharose 、続いて110BH3- Sepharose を使
用して得、この調製物をSDS-PAGEで分析した。抗原- 結
合GIF をPLA2- 結合Sepharose 、続いて110BH3- 結合Se
pharose を使用して精製した。免疫吸着剤からの酸溶出
画分を0.01%SDSの存在下で蒸留水に対して透析し凍結乾
燥した。この調製物を還元および非還元条件下でのSDS-
PAGEと銀染色法により分析した。調製物は、非還元条件
下で85 kDa、66 kDa、58 kDaの3 つの主バンドと13 kDa
の弱いバンドを示した。還元条件下では、85 kDaバンド
が消え、そして数個の新しいバンドが検出された。還元
条件下で検出された主バンドの1 つは14kDaであり、そ
の移動度は非特異的GIF のものに相当するので、このバ
ンドがGIF であるかどうかを決定するために分析を行な
った。抗原- 結合GIF の別の調製物を、110BH3- Sephar
ose によるアフィニティークロマトグラフィーにより、
抗-CD3- 刺激AC5 細胞の培養上清から得た。12H5細胞を
使用した免疫吸着剤からの通過および酸溶出画分の階段
希釈における、GIF 活性の力価測定により、培養上清中
のGIF 活性の大部分は免疫吸着剤に結合し、そして酸溶
出により回収されることが示された。活性は溶出画分の
1:30希釈物中に検出されたが、通過画分は1:6 のGIF 力
価を示した。表16に示すように、溶出画分はモノクロー
ナル抗体 110BH3 と205AD2の両方でELISA シグナルを示
したが、流出画分はこの抗体で有意なELISA シグナルを
示さなかった。溶出画分は、非常に高濃度のGIF を含有
しているが、しかしながら、非特異的GIF に対する抗体
(388F1) を使用した場合は、通過画分は弱いがはっきり
としたELISA シグナルを示した。次いで、溶出画分を還
元条件下でSDS-PAGEにより、その後、rGIFに対するポリ
クローナル抗体を使用する免疫ブロッティングにより分
析した。大腸菌由来の組換えGIF を同一のゲルの隣のウ
ェルに添加した。還元条件下での電気泳動後、ゲル中の
タンパク質はPVDF膜に移動し、次いで抗-rGIF のγグロ
ブリン画分で処理された。両方の膜で、対照として使用
したrGIFはX 線フィルム上に、はっきりとしたバンドを
示した( データ省略) 。分子量マーカーは18 kDa以下の
いずれのタンパク質も含んでいなかったので、x-線フィ
ルム上のrGIFを13 kDaマーカーとして使用した。この結
果から、抗体は実際に13 kDaバンドに結合していること
が示された。13 kDaバンドと非特異的GIF の間の関係
を、非刺激AC5 細胞の培養上清から、388F1-結合Sephar
ose のアフィニティークロマトグラフィーにより精製し
た非特異的GIF の分析により確認した。SDS-PAGEおよび
抗- rGIF抗体を用いた免疫ブロッティングによる非特異
的GIF 調製物の分析により、この非特異的GIF もこれら
の抗体と反応する13 kDaタンパク質であることが示され
た。 表１４ 110 ＢＨ3- Sepharosea からの通過および溶出画分間の ＧＩＦ活性とＧＩＦ抗原の分布 110 ＢＨ3- Sepharose ＧＩＦb 力価 ＥＬＩＳＡシグナル からの画分 205DA2c 100BH3c 388F1 d 通 過 1:3 0.063 0.093 0.36 酸- 溶 出 1:15 0.750 1.068 0.86 a 抗-CD3- 処理細胞の培養上清を濃縮し、110BH3- Se
pharose 上で分画した。画分を濃縮した上清の元の体積
まで濃縮し、2 倍に希釈し、その後 GIF活性とELISA 分
析のために力価測定した。 b 12H5細胞をグリコシル化IgE-BFの生成から非グリコ
シル化IgE-BFの生成に変換できる画分の最大希釈 c 405 nmでの吸収 d 490 nmでの吸収 13 kDa GIFと抗原- 結合ポリペプチド鎖は、お互いに結
合して抗原−結合GIFを形成すると推測された。その場
合は、生理的条件下では抗原- 結合GIF の分子の大きさ
は非特異的GIF のものより大きいであろう。この可能性
を試験するために、AC5 細胞からのPLA2- 結合GIF を11
0-BH3-Sepharose を使用して部分的に精製し、そして調
製物をSuperose12カラムを通してゲル濾過により分画し
た。各画分を、モノクローナル抗体の 388F1と110 BH3
を使用してELISA により抗原- 結合GIF について評価し
た。その結果は、mAb 388F1 により検出されたGIF の大
部分は、55.5分と60.5分の間に、58.5分でのピークでカ
ラムから溶出されたことを示している。分子の大きさ
は、その溶出時間から見積って、74 kDaであった。予測
したように、この画分は、12H5細胞を使用したバイオア
ッセイで測定したGIF活性を有していた。GIF-含有画分
はモノクローナル抗体 110BH3 でELISA シグナルを示し
たことは注目すべきである。この結果から、モノクロー
ナル抗体 388F1により認識された抗原決定基とモノクロ
ーナル抗体 110BH3 により認識された抗原決定基は同一
の分子と結合していることが強く示唆される。
【０２０３】抗原- 結合GIF が実際に、抗原- 結合鎖と
非特異的GIF から成るのであれば、抗原- 結合GIF は還
元およびアルキル化処理により、別々のポリペプチドに
解離するかもしれない。この可能性を調べるために、ア
フィニティ精製した抗原- 結合GIF を10 mM DTT 中で還
元した。ヨードアセトアミドを用いてアルキル化した
後、試料を同一のSuperose12カラムにかけ、そして388F
1-抗原と110BH3- 抗原の分布をELISA により測定した。
その結果から、還元およびアルキル化物質中のGIF の約
半分が、その溶出時間が15 kDa分子に相当する画分に回
収されたことが示唆された。元の抗原- 結合GIF を分画
した場合は、同じ画分がGIF を含まなかったので、15 k
DaのGIF は抗原- 結合 GIFに由来するようである。実験
により、110BH3により認識される分子の2 つのピークも
示された; 最初のピークは元の抗原- 結合GIF に相当
し、2 番目のピークの溶出時間は62-64 kDa に相当し
た。後者の画分はELISA での測定により、かなりの量の
GIF を含んでいなかったので、この画分中のタンパク質
は、抗原特異的結合に関与する抗原- 結合GIF の切断生
成物に相当するのであろう。
【０２０４】C. 抗原- 結合GIF のエピトープ特異性:
PLA2- 結合GIF が、ハチ毒PLA2に特異的であることを確
認するために実験を行った。抗原- 結合GIF を抗-CD3-
刺激 AC5細胞の培養上清から、PLA2- 結合Sepharose に
吸収させ、その後酸性pHで結合タンパク質を溶出して精
製した。調製物のアリコートをOVA-結合Sepharose と一
晩混合し、そして通過および酸溶出画分中のGIF 活性を
測定した。予想したように、本質的に全てのGIF 活性が
OVA-Sepharose に保持されず、そして通過画分に回収さ
れた。OVA-セファロースをDPBSで洗浄し、そして免疫吸
着剤をグリシン-ＨＣｌ緩衝液、pH 3.0で溶出した。し
かしながら、GIF 活性は酸溶出画分には検出されなかっ
た。
【０２０５】マウスTsハイブリドーマ3B3 由来のPLA2-
結合GIF についての前の実験により、この因子が、ハチ
毒PLA2分子中のアミノ酸残基19-34 を表すペプチドに対
する親和性を有することが示されているので、AC5 細胞
由来のヒト抗原- 結合GIF が、PLA2分子由来のアミノ酸
19-35 を表す合成ペプチドと結合しているSepharoseに
結合できるかどうかを調べることにした。表15に示すよ
うに、本質的に調製物中の全てのGIF 活性がp19-35- Se
pharose で吸収され、そして酸性pHでの溶出により回収
された。エピトープ特異性を確認するために、PLA2- 結
合GIF のアリコートを、アミノ酸13-28 、19-35 または
25-40 を表す0.2 mg/ml の合成ペプチドと6 時間インキ
ュベートし、そして各混合物をPLA2- Sepharose で吸収
した。通過画分および酸溶出画分中のGIF 活性の測定に
より、GIF のPLA2- Sepharose への結合はp13-28または
p19-35により阻害されるが、p25-40によっては阻害され
ないことが示された（表15) 。この結果をELISA により
確認した。PLA2- 結合GIFをp25-40の存在下または非存
在下でPLA2- Sepharose で吸収した場合は、免疫吸着剤
からの酸溶出画分は、110BH3でELISA シグナルを示す
が、通過区分はシグナルを示さなかった。同じPLA2- 結
合GIF を、p19-35の存在下で同じ免疫吸着剤で吸収する
と、酸溶出画分は示さないが、通過画分はモノクローナ
ル抗体でELISAシグナルを示した。この結果を集約する
と、PLA2分子中のアミノ酸19-28 の配列は、抗原- 結合
GIF により認識されるエピトープを含有することが示さ
れた。 表１５ ＰＬＡ2-結合ＧＩＦのエピトープ特異性 実験 免疫吸着剤 添加したペプチド ＧＩＦ活性c 通過 溶出 １a ＰＬＡ2-Sepharose なし 2/28 (−) 23/6 (＋) Ｐ19-35-Sepharose なし 3/30 (−) 28/4 (＋) 対照の培地 なし 4/28 --- ２b ＰＬＡ2-Sepharose なし 0/28 (−) 27/3 (＋) P13-28 22/0 (＋) 0/23 (−) P19-35 20/5 (＋) 0/28 (−) P25-40 2/25 (−) 23/0 (＋) 対照の培地 なし 3/24 --- a GIF 力価が1:10である、PLA2- Sepharose からの酸
溶出画分6 mlをp19-35と結合させたSepharose 1.5 ml上
で分画した。通過、洗浄および酸溶出の各画分を6.0 ml
に調整し、そしてそのGIF 活性を12H5細胞を使用して測
定した。 b GIF 力価が1:30である、PLA2- Sepharose からの酸
溶出画分のアリコート0.5 mlを、適切なペプチドの存在
下または非存在下でPLA2- Sepharose 0.5 mlと一晩混合
した。PLA2- Sepharose からの通過および酸溶出画分の
両方を1.0 mlに調整し、RPMI 1640 培地に対して透析
し、そしてGIF 活性を評価した。12H5細胞の懸濁液1 ml
を、等体積の試験する試料と混合し、IgE の存在下で培
養した。 c 数値は、レンチルレクチンSepharose からの流出/
溶出画分によるロゼット形成阻止パーセントを表す。
（＋)(−) はGIF の存在と非存在を示す。
【０２０６】材料の寄託 以下の細胞系を、American Type Culture Collection,
1301 Parklawn Drive,Rockville, MD, USA （ＡＴＣ
Ｃ）に寄託した：細胞系 ＡＴＣＣ受託番号 寄託年月日 ３８８Ｆ1 ＨＢ１０４７２ １９９０年５月３１日 ＡＣ５ ＨＢ１０４７３ １９９０年５月３１日 ３１Ｅ９ ＨＢ１１０５２ １９９２年６月２日 １１０ＢＨ３ ＨＢ−１１３４５ １９９３年５月１４日 これらの寄託は、特許手続きの目的のために微生物の寄
託の国際承認に関するブダペスト条約、およびそれらに
基づく規則（ブダペスト条約）の規定にしたがって行な
われた。これは、寄託日から３０年間の生育可能な培養
の維持を保証する。ＡＴＣＣによって、その生物はブダ
ペスト条約の条件のもとで利用可能となるが、この条約
は、関連する米国特許の発行に際して、またはあらゆる
米国または外国の特許出願の公衆への開示の際に、培養
子孫の永続的かつ無制限の利用可能性を社会に対して保
証し、米国特許法第１２２条およびそれにしたがう長官
規則にしたがって資格を与えられた米国特許商標局長官
によって決定されたものに対して、その子孫の利用可能
性を保証する（特に８８６ＯＧ６３８に関する３７ＣＦ
Ｒ§１．１４を包含する）。
【０２０７】本出願の譲受人は、その培養寄託物が適当
な条件下で培養されたときに死滅または消失または破壊
された場合には、通告に基づいて、ただちに同一培養物
の生育可能な検体と交換することに同意した。寄託され
た系統の利用可能性は、あらゆる政府の特許法に基づく
権限のもとで付与される権利に違反して本発明を実施す
る許可と解釈されるべきでない。
【０２０８】前述の明細書は、当業者に本発明を実施で
きるようにさせるために十分であると考えられる。寄託
された態様は本発明の一態様の単なる実例として意図さ
れ、機能的に同等であるあらゆる細胞系が本発明の範囲
に含まれるので、本発明は寄託された細胞系によって範
囲を限定されない。材料の寄託は、本文に含まれる記述
が最良の方法を含めて本発明のあらゆる態様の実施を可
能にするには不十分であることを認めるものではない
し、また寄託物の対応する特定の実例に請求の範囲を限
定すると解釈されるべきでない。実際、本明細書に示
し、記述したほかに、本発明の様々な変更が前述の記載
から当業者に明白となるであろうが、そうした変更は添
付の特許請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、マウスＧＩＦのｃＤＮＡクローンのヌ
クレオチド配列および演繹されるアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、ヒトＧＩＦのｃＤＮＡクローンのヌク
レオチド配列および演繹されるアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、pST811ベクターの地図を示す。
【図４】図４は、pTMK-hGIF ベクターの地図を示す。
【図５】図５は、SRα-hGIF ベクターの地図を示す。
【図６】図６は、SRα-hcGIFベクターの地図を示す。
【図７】図７は、融合発現ベクターpMEproCTの地図を示
す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 16/18 8318−4Ｈ 19/00 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 5/10 15/02 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 石坂 公成 アメリカ合衆国 92037 カリフォルニア 州 ラ ホヤ，アヴェニーダ ウィルフレ ード 6571 (72)発明者 ユン−サイ リュウ アメリカ合衆国 92122 カリフォルニア 州 サンディエゴ，ナンバー 1106，ショ アライン ドライブ 7130 (72)発明者 三箇山 俊文 日本国群馬県群馬郡群馬町福島314−５

Claims (49)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 実質的に純粋であり、構造遺伝子により
    コードされた生物学的活性を有するポリペプチドの製造
    方法であって、 ａ．下記式の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレ
    オチド配列により形質転換した真核細胞を培養し、 Ｒ1-〔Ｘ1-Ｘ2-Ｘ1-Ｘ2-Lys-Arg 〕- Ｒ2 （式中、Ｒ1 は担体ペプチドであり、Ｒ2 は構造遺伝子
    によりコードされたポリペプチドであり、Ｘ1 はLys ま
    たはArg であり、Ｘ2 はアミノ酸である。） ｂ．上記の構造遺伝子によりコードされた実質的に純粋
    なポリペプチドを単離する 段階を含む前記の製造方法。
  2. 【請求項２】 担体ペプチドがタンパク質前駆体のプロ
    領域である、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 プロ領域がカルシトニン前駆体に由来す
    る、請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 構造遺伝子によりコードされたポリペプ
    チドが抗原非特異的グリコシル化阻害因子（ＧＩＦ）で
    ある、請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 ＧＩＦがマウスのものである、請求項４
    記載の方法。
  6. 【請求項６】 ＧＩＦがヒトのものである、請求項４記
    載の方法。
  7. 【請求項７】 実質的に純粋であり、生物学的活性を有
    するＧＩＦの製造方法であって、 ａ．ＧＩＦをコードするポリヌクレオチド配列を機能し
    うる結合様式で含むベクターでトランスフェクションし
    た宿主細胞を培養し、 ｂ 実質的に純粋であり、生物学的活性を有するＧＩＦ
    を単離する 段階を含む前記の製造方法。
  8. 【請求項８】 ＧＩＦをコードするポリヌクレオチド
    が、下記式のポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
    ドと機能しうるように結合している、請求項７記載の方
    法。 Ｒ1-〔Ｘ1-Ｘ2-Ｘ1-Ｘ2-Lys-Arg 〕- （式中、Ｒ1 は担体ペプチドであり、Ｘ1 はLys または
    Arg であり、Ｘ2 はアミノ酸である。）
  9. 【請求項９】 担体ペプチドがタンパク質前駆体のプロ
    領域である、請求項８記載の方法。
  10. 【請求項10】 プロ領域がカルシトニン前駆体に由来す
    る、請求項９記載の方法。
  11. 【請求項11】 ＧＩＦがマウスのものである、請求項７
    記載の方法。
  12. 【請求項12】 ＧＩＦがヒトのものである、請求項７記
    載の方法。
  13. 【請求項13】 免疫抑制に有効な量の抗原非特異的ＧＩ
    Ｆをヒトに投与することを含む、抗原に対するヒトの免
    疫応答を抑制する方法。
  14. 【請求項14】 投与が非経口的なものである、請求項13
    記載の方法。
  15. 【請求項15】 非経口投与が皮下、筋肉内、腹腔内、腔
    内、経皮的、または静脈内注射である、請求項14記載の
    方法。
  16. 【請求項16】 投与を約0.001 mg/kg/投与〜約２mg/kg/
    投与の用量で行う請求項13記載の方法。
  17. 【請求項17】 投与を約0.001 mg/kg/投与〜約0.2 mg/k
    g/投与の用量で行う請求項13記載の方法。
  18. 【請求項18】 免疫抑制に必要な量の実質的に精製され
    た抗原非特異的ＧＩＦおよび医薬的に不活性な担体を含
    む医薬組成物。
  19. 【請求項19】 ＧＩＦがヒトのものである、請求項18記
    載の医薬組成物。
  20. 【請求項20】 ＧＩＦがマウスのものである、請求項18
    記載の医薬組成物。
  21. 【請求項21】 下記式の実質的に純粋な融合ポリペプチ
    ド。 Ｒ1-〔Ｘ1-Ｘ2-Ｘ1-Ｘ2-Lys-Arg 〕- Ｒ2 （式中、Ｒ1 は担体ペプチドであり、Ｒ2 は構造遺伝子
    によりコードされたポリペプチドであり、Ｘ1 はLys ま
    たはArg であり、Ｘ2 はアミノ酸である。）
  22. 【請求項22】 担体ペプチドがタンパク質前駆体のプロ
    領域である、請求項21記載の融合ポリペプチド。
  23. 【請求項23】 プロ領域がカルシトニン前駆体に由来す
    る、請求項22記載の融合ポリペプチド。
  24. 【請求項24】 構造遺伝子によりコードされたポリペプ
    チドが抗原非特異的グリコシル化阻害因子（ＧＩＦ）で
    ある、請求項21記載の融合ポリペプチド。
  25. 【請求項25】 ＧＩＦがマウスのものである、請求項24
    記載の融合ポリペプチド。
  26. 【請求項26】 ＧＩＦがヒトのものである、請求項24記
    載の融合ポリペプチド。
  27. 【請求項27】 請求項21記載の融合ポリペプチドをコー
    ドする単離されたポリヌクレオチド配列。
  28. 【請求項28】 請求項27記載のポリヌクレオチドを含む
    組換え発現ベクター。
  29. 【請求項29】 ベクターがウィルスである、請求項28記
    載のベクター。
  30. 【請求項30】 ベクターがプラスミドである、請求項28
    記載のベクター。
  31. 【請求項31】 請求項28記載のベクターを含む宿主細
    胞。
  32. 【請求項32】 宿主が真核生物である、請求項31記載の
    宿主細胞。
  33. 【請求項33】 宿主が COSである、請求項32記載の宿主
    細胞。
  34. 【請求項34】 抗原特異的ＧＩＦ上のエピトープと結合
    するモノクローナル抗体。
  35. 【請求項35】 モノクローナル抗体が、ATCC受託番号Ｈ
    Ｂ−１１３４５を有するハイブリドーマ細胞系110BH3に
    より産生されたモノクローナル抗体の特異性を持つ、請
    求項34記載のモノクローナル抗体。
  36. 【請求項36】 モノクローナル抗体が、ATCC受託番号Ｈ
    Ｂ−１１３４５を有するハイブリドーマ細胞系110BH3に
    より産生されたモノクローナル抗体である、請求項34記
    載のモノクローナル抗体。
  37. 【請求項37】 抗原非特異的ＧＩＦをコードする単離さ
    れたポリヌクレオチド配列。
  38. 【請求項38】 ＧＩＦ配列が、 ａ．ＴがＵであってもよい図１の核酸配列、 ｂ．ＴがＵであってもよい図２の核酸配列、 ｃ．図１および図２の核酸配列に相補的な核酸配列、お
    よび ｄ．ＧＩＦをコードするゲノミックＤＮＡに選択的にハ
    イブリダイズする、少なくとも１５塩基の長さのａ、ｂ
    またはｃのフラグメント の核酸配列からなる群より選択される、請求項37記載の
    ポリヌクレオチド。
  39. 【請求項39】 請求項37記載のポリヌクレオチド配列を
    含む組換えベクター。
  40. 【請求項40】 ベクターがウィルスである、請求項39記
    載のベクター。
  41. 【請求項41】 ベクターがプラスミドである、請求項39
    記載のベクター。
  42. 【請求項42】 請求項39記載のベクターを含む宿主細
    胞。
  43. 【請求項43】 宿主が原核生物である、請求項42記載の
    宿主細胞。
  44. 【請求項44】 宿主が大腸菌である、請求項43記載の宿
    主細胞。
  45. 【請求項45】 宿主が真核生物である、請求項42記載の
    宿主細胞。
  46. 【請求項46】 宿主が COS細胞である、請求項45記載の
    宿主細胞。
  47. 【請求項47】 生物学的に活性なＧＩＦの製造方法であ
    って、 ａ．請求項42記載の宿主細胞を培養し、 ｂ．その培養物から実質的な純粋なＧＩＦを単離する 段階を含む、前記の製造方法。
  48. 【請求項48】 宿主細胞が真核生物である、請求項47記
    載の方法。
  49. 【請求項49】 宿主細胞が COS細胞である、請求項48記
    載の方法。
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