DK169708B1 - Komplex sonde, DNA-sekvens, som hybridiserer med sonden, og som koder for en fysiologisk aktiv del af faktor VIII:C, og ekstrachromosomalt element indeholdende en sådan DNA-sekvens - Google Patents

Description

DK 169708 B1

Den foreliggende opfindelse angår en kompiex sonde, en DNA-*sekvens, som hybridiserer med sonden, og som koder for en fysiologisk aktiv del af faktor VIII:C, samt et ekstra-chromosomalt element, som indeholder en sådan DNA-sekvens 5 Faktor VIIIC er et plasmaprotein, der deltager i intrinsicdelen ved blodkoagulering. Det findes ikke eller er defektivt i individer med arvet X chromosombundet recessiv blødningsforstyrrelse, hæmofili A. Man har mødt store vanskeligheder ved at isolere faktor VIIIC på grund af dets yderst ringe koncentra-10 tion i plasma og den kendsgerning, at det synes at være et mellemprodukt eller endeligt nedbydningsprodukt af et større proteinforstadie. Forsøg på at isolere faktor VIIIC har ført til komplekse blandinger af forskellige polypeptider med betydelig heterogenitet og varierende molekylvægte.

15 En af de løsninger, der i udstrakt grad er anvendt til fremstilling af fysiologisk aktive proteiner, indebærer isolering af det pågældende protein i oprenset form. Det pågældende protein giver uvurderlig hjælp ved fremstillingen af en rekombinant DNA-evne til fremstilling af proteinet. Når man er 20 i besiddelse af de pågældende protein, kan man fremstille monoklonale antistoffer, der er specifikke for proteinet, og som kan anvendes til at etablere fremstillingen af proteinet i lysater, ekspression fra messenger-RNA i oocyter eller fra cDNA-gen i encellede mikroorganismer. Herudover kan man ved 25 bedømmelse aminosyresekvensen udvikle sonder, der anvender codoner til at kode for den pågældende aminosyresekvens, til hybridisering af messenger-RNA, chromosomalt DNA eller cDNA, og som derfor muliggør afsløringen, isoleringen og ekspressionen af det relevante gen eller den relevante information og 30 fremstillingen af det ønskede produkt med højt udbytte i en eller flere værter.

I US patentskrift nr. 4 361 509 og de deri anførte referencer beskrives rensning af faktor VIIIC. Se også Fulcher og Zimmerman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79: 1648 - 1652.

DK 169708 B1 2

Tuddenham et al., J. of Lab. Clinical Medicine (1979) 93.:40 -53 beskriver rensning af faktor VIIIC under anvendelse af polyklonale antistoffer. Austen, British J. Haematology (1979) 43.:669 - 674 beskriver anvendelsen af aminohexyl-sepharose til 5 rensning af faktor VIIIC. Weinstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981) 78: 5137 - 5141 beskriver et studie over virkningen af thrombin på faktor VIII. Se også Kuo et al., Abstracts for IX International Congress of Thrombosis and Hemostasis, (København, juli 1983).

10 Det har nu overraskende vist sig, at der ud fra isoleret rent faktor VIIIC kan frembringes komplexe sonder, som kan anvendes til at undersøge genome DNA-fragmenter for homologe sekvenser, hvorved kan isoleres hybridiseringsfragmenter, som kan manipuleres yderligere til frembringelse af et DNA-fragment, 15 der koder for en fuldstændig subenhed eller fragment og/eller anvendes til isolering af det fuldstændige mRNA, hvorfra ds cDNA kan opnås. DNA-sekvensen kan herefter yderligere manipuleres til indførsel i en ekspressionsvektor, og ekspressionsvektoren kan anvendes til indførsel i en forenelig værtsorga- 20 nisme til udtrykkelse af polypeptidet.

Den foreliggende opfindelse angår en komplex sonde med følgende formel:

TCT GTA ATC AAA TAG CGA CGA CAC CTT TCT GAC ACC CTA ATG CCG TAC CG G GG CC G

25 I et andet aspekt angår opfindelsen en DNA-sekvens, hvilken DNA-sekvens er ejendommelig ved fra ca. 10 til 25 kbp stammende fra et pattedyrsgenom, der koder for i det mindste en fysiologisk aktiv del af Faktor VIII:C, og som hybridiserer med en sonde ifølge opfindelsen.

30 I et yderligere aspekt angår opfindelsen en DNA-opbygning hvilken DNA-opbygning er ejendommelig ved en DNA-sekvens ifølge DK 169708 B1 3 opfindelsen knyttet til en encellet mikroorganismekloningsvektor.

De komplekse sonder, DNA-sekvenserne og DNA-opbygningerne ifølge opfindelsen kan anvendes i forbindelse med fremstilling 5 af human faktor VIIIC, precursorer og subenheder heraf ved ekspression i en mikroorganisme eller i pattedyrsvævdyrknings-celler. I forbindelse med opfindelsen er foretaget isolering af ren faktor VIIIC, subenheder og fragmenter heraf og bestemmelse af deres fysiologiske forhold, specielt ved at anvende throm-10 binnedbrydning. Mindst en del af hver af de relaterede rækker af polypeptider sekvensbedømmes, og sekvenserne kan anvendes til at frembringe komplekse sonder.

Opfindelsen tilvejebringer fremgangsmåder og præparater til udtrykkkelse af faktor VHIC-subenheder og fragmenter til 15 fremstilling af faktor VIII som en præcursor eller i dens aktive form eller tilvejebringer enkelte subenheder til anvendelse sammen med naturligt tilgængelige subenheder. Subenhederne og fragmenterne er i besiddelse af en eller flere biologiske egenskaber, der er associeret med faktor VIIIC som 20 f.eks. epitope pladser, koaguleringsevne og immunogenisitet, således at de kan anvendes til fremstilling af antistoffer, der anvendes som reagenser, specielt som mærkede reagenser ved immunoundersøgelsesmetoder.

Human faktor VIIIC er et komplekst protein, som kan isoleres på 25 i alt væsentligt ren form, og som udviser en tilsyneladende molekylvægt på ca. 460 kD. Efter elektroforese under denatureringsbetingelser opnås en lang række fragmenter med varierende molekylvægt: 240, 160, 140, 115, 92,5, 80 og 77 kD, hvor de to sidstnævnte findes at vandre som en dublet. Analyse 30 af fragmenterne ved kemisk spaltning og proteasespaltning omfattende thrombin, under anvendelse af antistoffer for at følge immunogene forhold og spaltningsmønstre for at følge strukturelle forhold, viser, at 92,5 kD-polypeptidet er beslægtet med 240, 160, 140 og 115-polypeptiderne, mens 77/80- DK 169708 B1 4 dubletten synes ikke at have fælles indent i ficerbare egenskaber med andre peptider bortset fra 240 kD-polypeptidet. Det findes yderligere, at 77/80 kD-dubletten konverteres af thrombin til en 67/70 kD-dublet, mens 92,5 kD-polypeptidet, der er til stede 5 i det rensede faktor Vllic-materiale, der er behandlet med thrombin, spaltes af thrombin, direkte eller indirekte, i to polypeptider på ca. 40 og 52,5 kD. Det har vist sig, at de elektroforetisk isolerede 77/80 kD-dublet-polypeptider har deres N-endestillinger blokeret, medens 67/70 kD dublet-10 polypeptiderne ikke har deres N-endestillinger blokeret.

Det har yderligere vist sig, at stedet for faktor VIIIC omfatter exoner med store introner, hvor exoner omfatter forskellige områder associeret med faktor VIIIC. Enkelte exoner kan således isoleres, der omfatter specifikke polypeptider 15 eller fragmenter deraf, der står i forbindelse med faktor VHIC-komplekset. Ved at identificere specifikke aminosyrese-kvenser i forbindelse med faktor Vllic-subenheder og fragmenter heraf kan man selektivt isolere exoneme fra genomt DNA og anvende exonerne som sådan, sammen, eller i forbindelse med 20 syntetisk DNA til opnåelse af sekvenser, der koder for og frembringer polypeptidsubenheder af faktor VIIIC eller fragmenter heraf.

Bekvemt kan faktor VHIC-genome DNA-sekvenser indeholdende både exoner og introner indføres i en ekspressionsvektor passende 25 til transcription og translation i pattedyrceller til opnåelse af både væsentlige mængder af korrekt sammenknyttet messenger-RNA, der er i stand til cDNA-kloning og til fremstilling af faktor VIIIC, subenheder eller fragmenter. Herudover kan DNA-sekvenserne isoleret fra genomet anvendes til hybridisering til 30 naturlige messenger-RNA, der koder for VIIIC. Messenger-RNA kan herefter anvendes til at fremstille ds cDNA, der koder for subenhederne af faktor VIIIC. DNA-sekvenserne kan anvendes til ekspression ved indførsel af en passende ekspressionsvektor, der er i besiddelse af de nødvendige regulerende signaler for 35 transcription og translation. Faktor VHIC-genekspressions- DK 169708 B1 5 vektoren (en ekspressionsvektor, der bærer en eller flere ‘gener, der koder for hele eller en del af faktor VIIIC, precursor, subenheder eller fragmenter heraf) kan indføres i en passende værtsorganisme, og værten dyrkes til ekspression af 5 faktor VIIIC. Ved passende udvælgelse af værtsorganismerne kan faktor VIIIC-DNA indføres neden for en secernerende leder og produktionssignaler, således at produktet vil secerneres fra værten og oparbejdes til opnåelse af det komplette polypeptid. Afhængig af hvad der er passende, kan polypeptidet yderligere 10 bearbejdes til indførsel af egenskaber eller substitutenter, der forekommer på det naturligt forekommende polypeptid.

I det første trin i den omhandlede opfindelse fås særdeles ren faktor VIIIC og karakteriseres. Den rene faktor VIIIC kan fås fra kommercielt tilgængelig humant antihæmofilifaktor (AHF), 15 der fremstilles ud fra frisk normal human plasma som et cryoprecipitat og som repræsenterer en ca. 40 gange berigelse. Faktor VIIIC koncentreres yderligere og renses ved opløsning af anti-hæmofilifaktoren i en passende puffer som f.eks. saltvand-imidazol-lysin-HCl, pH 7,4 efterfulgt af chromatografi på en 20 affinitetssøjle, der indeholder enten polyklonale eller monoklonale antistoffer over for faktor VIIIC eller faktor VIIIR. Bekvemt bindes antistofferne covalent til en sepharose-understøttelse. Faktor VIIIC kan elueres fra søjlen under anvendelse af en kombination af forholdsvis store koncentratio-25 ner af calciumion sammen med glycerol. De fraktioner, der fås fra søjlen, kan herefter dialyseres med en passende puffer som beskrevet ovenfor indeholdende lave koncentrationer af calciumion, og der kan herefter yderligere renses under anvendelse af en aminohexyl-sepharosesøjle, der elueres med en høj 30 calcium- eller natriumchloridkoncentrations-puffer. Yderligere chromatografiske behandlinger som f.eks. gelatinesepharose-, HPLC-, ionbytning på dextransulfat- eller Mono Q-affinitets-søjler, der anvender lectiner eller antistoffer over for faktor VIIIC, giver yderligere rensning. Specielt fjerner anvendelsen 35 af dextransulfat spor af forurening som f.eks. fibrinogen, fibronectin, IgG fra præparatet, således at man opnår et DK 169708 B1 6 produkt, der i det væsentlige er uden fremmede proteiner. Aktiviteten af fraktionerne fra søjlerne kan kontrolleres for den ene eller begge biologiske og antigene virkninger under anvendelse af koagulationsmetoder (kommercielt tilgængelige 5 prøvemetoder) og antistoffer specifikke over for faktor VIIIC. Baseret på koncentrationen af faktor VIII i plasma kan opnås renhed på ca. 200000 gange ved ovennævnte metode.

Karakterisering af faktor VIIIC

Gelfiltrering angiver, at faktor VIIIC opfører sig som et 10 kompleks med en tilsyneladende molekylvægt på ca. 460 kD. Under anvendelse SDS-gelelektroforese (under denaturerende betingelser) kan syv enkelte polypeptider isoleres med forskellig molekylvægt. Fragmenterne defineres ved hjælp af deres molekylvægt og er på 240, 160, 140, 115, 92,5, 80 og 77 kD. Disse 15 fragmenter karakteriseredes på følgende måde.

Den første undersøgelse omfatter anvendelse af inhibitorantistoffer isoleret for hæmofile patienter, idet antistofferne betegnes som Z og E. Begge antistoffer reagerer med 77/80 kD-dubletten. E-antistoffet reagerer kraftigt med 240 kD-polypep-20 tidet og svagt med adskillige bånd mellem dubletten og 240 kD-polypeptidet. Z-antistoffet reagerer også svagt med 240 kD-polypeptidet.

I immunoprecipitationsforsøg udfælder E-antistoffet 77/80 kD-dubletten såvel som højmolekylære arter af 160, 140, 115 og 25 92,5 kD med dubletten blandt de stærkere bånd. Inklusion af EGTA bevirker tabet af båndene bortset fra dubletten, hvilket indicerer, at 92,5 kD-arten er associeret med 77 kD og/eller 80 kD-arter i et kompleks, der er styret med en Ca^-bro.

I den næste undersøgelse fremstilledes monoklonale antistoffer, 30 der både hæmmer faktor VIIIC, der styrer koaguleringsevnen, og reagerer med komponenterne i komplekset: DK 169708 B1 7

Klasse I reagerer med 77/80 kD-dubletten og 240 kD-polypepti-derne; klasse II reagerer med 160, 140, 115 og 92,5 kD-polypep-tiderne. Immunoprecipitation af thrombinnedbrudt faktor VIIIC med klasse I antistoffer angiver, at 70/67 kD-dubletten, der 5 fremkommer, stammer fra 77/80 kD-dubletten, der findes i faktor VIIIC. Klasse II monoklonalerne indicerer, at 160, 140 og 115 kD-peptiderne er precursorer for 92,5 kD-peptidet. Et 40 kD-peptidspaltningsprodukt af 92,5 kD-peptidet blev også bundet med klasse Il-antistofferne. Et ELISA-forsøg under anvendelse 10 af monoklonale antistoffer med og uden EGTA bekræfter CaH-broassocieringen mellem 92,5 kD og 77 kD og/eller 80 kD-komponenterne af faktor VHIC-komplekset.

Både humane inhibitor og monoklonale antistoffer kan anvendes ved immunosorbents®j lebehandlingsmetoder til opnåelse af faktor 15 VIIIC eller anvende EGTA til at opløse dens bestående bestanddele, 92,5 kD og 77/80 kD-arteme.

Den næste undersøgelse omfatter thrombinnedbrydning af renset faktor VHIC-materiale ved pH 6,8 eller 7,4. Prøver undersøgtes for koaguleringsevne og TCA udfældet til gelanalyse. Koagu-20 leringsevne viste sig at stige med tiden og herefter aftage sammenfaldende med en nedgang eller en forøgelse i mængden åf 92,5 kD-arter. Thrombinbehandling af renset faktor VIIIC-materiale i kort tid (5-15 minutter) forøger mængden af 92,5 kD-arter, medens 77/80 kD-dubletten delvis omdannes til 67/70 25 kD-dublet. Dersom der anvendes lange thrombinnedbrydningstider, f.eks. 1 time, nedbrydes 92,5 kD-proteinet, og to nye peptider på 40 og 52,5 kD kommer til syne, idet 40 kD-peptidet bibeholder de immunogene egenskaber fra 92,5 kD-arterne. 52,5 kD-Peptidet viser sig at være et spaltningsprodukt ved kemiske og 30 enzymatisk nedbrydning, idet mønstre og slutprodukter er analoge med 92,5 kD-arterne.

I den næste undersøgelse isoleredes enkelte faktor VIIIC-subenheder og precursorer f.eks. 140, 77/80, 92,5 kD-arterne) ved præparativ SDS-gelelektroforese, og en tidsafhængig DK 169708 B1 8 thrombinnedbrydning af de isolerede polypeptider blev herefter udført. 240 kD-Fragmentet isoleret fra en præparativ gel frembragte 160, 140, 115 og 92,5 kD-bånd. 80 kD og 77 kD-fragmen-terne frembragte henholdsvis et 70 kD og 67 kD-fragment.

5 Et faktor VHIC-kompleks frembringes indeholdende 77 kD og/eller 80 kD-arterne og 92,5 kD-polypeptid som et calciumforbundet kompleks i stærk oprenset form. Renheden af faktor VHIC-materialet (komplekset og precursorarterne) er sædvanligvis højere en 80%, ofte højere end 90%, og kan være 98% eller 10 højere baseret på det totale protein, og kompleksets renhed er i det mindste 20%, sædvanligvis 30% baseret på det totale protein, efter anti-faktor VIIIR-immunosorbent og aminohexyl-sepharosesøjlerne. Anvendelsen af yderligere chromatografiske behandlinger som f .eks. dextransulfat forøger renhedsgraden til 15 mindst 90% og sædvanligvis højere for faktor VHIC-materialet (kompleks plus precursor). Renheden af faktor VHIC-komponen-ter, 92,5 kD-arter og 77/80 kD-dubletten isoleret ved præparativ SDS-gelelektroforese er sædvanligvis på mindst, 98%. Som angivet ovenfor kan komplekset fås under anvendelse af monoklo-20 nåle antistoffer, der er specifikke for en speciel dublet eller for 92,5 kD-polypeptidet. Komplekset kan herefter skilles fra antistoffer under anvendelse af et denaturerende eller chaio-tropisk opløsningsmiddel som f.eks. henholdsvis vandigt urinstof eller thiocyanat.

25 Fremstilling af sonder

En partiel aminosyresekvens af N-endestillingen af 67 og 70 kd-polypeptiderne er følgende: 123456789 10 11 ? Phe Gin Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile 30 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met DK 169708 B1 9

Baseret på denne sekvens kan sonder for 67/70 kD-dubletten (og således 77/80 kd-dubletten, hvorfra den stammer) fremstilles med følgende sekvenser:

Sonde 1: 3' GTA ATA AAA TAA CGX CGX CA 5' (x=G,C,A,T)

5 (ikke-kodende) G G G G

T

Sonde 2: 3' AAA GTT TTC TTC TGX TCT GT 5»

(ikke-kodende) G C T T C

GCX

10 Sonde 3: 5' GAA CGX TTA TGG GAT TAT GGX ATG 3'

(ikke-kodende) G AGA G C C

G CTX

Sonde 4: (ikke-kodende)

15 3' TCT GTA ATG AAA TAG CGA CGA CAC CTT TCT GAC ACC CTA ATG CCG TAC 5' CG G -GG CC G

N-endedelen af aminosyresekvensen af 92,5 kD-proteinet er i det væsentlige følgende: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 20 Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

Trp Asp Tyr Met Gin Ser Asp ? Gly Glu Leu Pro Val

Baseret på denne aminosyresekvens kan en sonde for 52,5 kD-proteinet fremstilles baseret på kodestrengen nedenfor:

25 5»-GCA ACT AGA AGA TAT TAT TTG GGG GCA GTT GAA TIG TCA TGG GAT TAT-3* AGG A A A AT

Aminosyresekvenserne af de tre fragmenter af 77/80 kD-pro-teinerne er følgende: DK 169708 B1 10 123 456789 10 11 12

Tyr Ala Ala Thr Ser Gin Val Leu Leu Pro Ser Lys 123456789 10

Val Thr Gly Val Thr Thr Gin Gly Val Lys 5123 4567 8 9 10 11 12

Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gin Asp Leu Tyr

Baseret på de respektive sekvenser kan sonder fremstilles baseret på de ikke-kodende strenge som angivet nedenfor:

Sonde 1: 3' -ATA CGT CGT TGA AGT GTT CAA AAC AAC GG-5'

10 T A T T T

Sonde 2: 3'-CAA TGA CCT CAA TGA TGA CTT CCT CAA ΤΤΤ-5»

T T T T T T

Sonde 3: 3'-TAC CTT CAA AAC CCT ACG CTT CGT GTT CTA AAC ATA-5*

T T T

15 Sekvenserne af disse peptider og fremstillingen af de tilsvarende sonder er beskrevet nedenfor detaljeret i den eksperimentelle del.

Isolering af DNA

Ovennævnte sonder kan anvendes til detektion og isolering af 20 enten genomt DNA eller messenger-RNA. Kloning af genom-DNA indebærer spaltning af det genome DNA med et eller flere restriktionsenzymer til opnåelse af et delvist nedbrydningsprodukt og størrelsesselektion af fragmenter på ca. 10 - 25 kb. Restriktionsnedbrydningsprodukterne bør være inkomplette, 25 således at der vil være klonet overlappende fragmenter. Disse fragmenter kan klones i den passende vektor til frembringelse af et "bibliotek" af kloner i mikroorganismer f.eks. bakterier som E. coli. Forskellige vektorer kan anvendes herunder DK 169708 Bl 11 plasmider eller vira som f.eks. pBR322, X, charon 4a, EMBL-4 ‘eller lignende.

DNA'et afsøges med de ovenfor beskrevne enzymatiske radiomærkede sonder og homologe sekvenser afsløres. De sekvenser, der 5 hybridiserer med en eller flere af sonderne, kan reklones og atter rehybridiseres en eller flere gange.

Et eller flere restriktionsenzymer, der er forskellig fra det oprindelige restriktionsenzym/enzymer, der anvendes, kan herefter anvendes til opnåelse af mindre fragmenter, der 10 sædvanligvis ligger fra ca. 1 - 10 kb, mere almindeligt fra ca.

1 6 kb. Disse fragmenter kan herefter subklones og undersøges for at identificere positive fragmenter. Herefter kan de synetiske sonder anvendes som primere til sekvensundersøgelse af DNA-fragmenteme. De fragmenter, der lettest kan sekvensbe-15 dømmes, er de, der omfatter en sekvens komplementær til en eller flere af ovenfor identificerede grupper, hvor den homologe sekvens er fra ca. 5 baser og indtil og ikke mere end 500 baser fra 5'-endestillingen. Andre fragmenter af interesse omfatter de ved endestillingerne af det oprindeligt klonede 20 fragment, da disse i andre kloner vil være repræsenteret i biblioteket og således anvendes til at "gå" langs chromosomet, indtil hele det ønskede gen er udvundet.

Efter sekvensbedømmelse af DNA-fragmentet baseret på den bestemte sekvens, kan fragmentet yderligere manipuleres.

25 Baserede på sekvensen kan man identificere en åben aflæsningsramme, der omfatter den bestemte aminosyresekvens. Ved at bestemme restriktionspladser kan man yderligere reducere størrelsen af fragmentet uden tab af kodesekvenser, skønt fjernelse af en kort sekvens ved N-endestilligen er tilladelig, 30 da denne kan erstattes under anvendelse af passende adaptorer. Hvor restriktionspladser ikke er let tilgængelige ved passende stillinger, kan DNA-fragmentet modificeres ved Bal31-resektion i varierende tider, idet de frembragte fragmenter klones, og 51-endestillingerne bestemmes ved forskellige metoder. Man kan DK 169708 B1 12 bekvemt tilvejebringe et genkendelsessted for et specielt restriktionsenzym ved passende selektion af 3’-baserne, hvortil det resekterede fragment fastbindes. På denne måde kan man undersøge de fremstillede kloner for forudbestemte restrik-5 tionspladser, hvilket vil angive tilstedeværelsen af et fragment, der er resekteret til den ønskede plads.

De ønskede exoner eller fragmenter heraf sædvanligvis på mindst 50 bp, mere foretrukkent på mindst ca. 100 bp endog på ca. 250 bp eller mere kan denatureres og anvendes som sonder for mRN 10 fra humane celler, specielt celler, der fremstiller mRNA for faktor VIIIC. Ved isolering af hybridiserende mRNA, kan mRNA undersøges ved translation i oocyter eller et reticulocytlysat og fremstillingen af faktor VIIIC afsløres ved antistoffer over for faktor VIIIC eller koaguleringsevne baseret på binding til 15 faktor VHIC-subenheder. mRNA'et kan herefter omvendt tran-scriberes under anvendelse af f.eks. AMV omvendt transcriptase. Forskellige metoder kan anvendes til konvertering af ss cDNA til ds cDNA, idet der anvendes omvendt transcriptase eller DNA-polymerase I (Klenow-fragment) til frembringelse af den anden 20 streng, efterfulgt af fjernelse af den endestillede slynge, afhængig af hvad man ønsker, med en nuclease som f.eks. S^-nuclease. Når der er opnået en ufuldstændig kopi, kan messengeren "gå en tur" eller primed cDNA-syntese kan anvendes, indtil 5' -kodesekvensen af mRNA er blevet kopieret, og der er 25 opnået en DNA-sekvens, der koder for hele kodedelen af mRNA.

Baseret på ovennævnte metoder kan DNA-sekvenser, der koder for polypeptidprecursoren/precursorerne for faktor VIIIC eller hovedfragmenterne heraf anvendes til ekspression, eller mindre fragmenter, der koder for specifikke subenheder af faktor VIIIC 30 som f.eks. 92,5 kD, 80 kD eller 77 kD, kan anvendes.

Til precursorpolypeptidet (profaktor VIIIC) kan genet være blunt-afsluttet ved den ene eller begge ender og indskudt i en ekspressionsvektor, der indeholder komplementære ender, eller DK 169708 B1 13 kan spaltes neden for den 5' -kodende endestilling og bindes til en adaptor til passende indførelse i vektoren.

Fragmenter, der har den korrekte N-endestilling, der kan være ved den kodende sekvens for 70 kD eller 80 kD-polypeptidet, 5 eller have en 51-endestilling neden for den oprindelige base, sædvanligvis ikke mere end 30 baser nedenfor og mere sædvanlig ikke mere end 20 baser nedenfor, kan herefter indskydes i en passende vektor under anvendelse af adaptorer, afhængig af hvad der ønskes.

10 Forskellige vektorer kan anvendes til opnåelse af ekstra-chromosomale elementer afhængig af den pågældende vært, udtrykkelsesmåden, om den er konstitutiv eller induceret, af de ønskede markører, om sekretion ønskes eller lignende. (Med vektoren påtænkes at opnå et intakt replikationssystem).

15 Adskillige vektorer er for øjeblikket tilgængelige, der tilvejebringer transcriptionelle eller translationelle regulerende signaler, der er accepteret enten af pattedyrsværter som f.eks. vævsdyrkningsceller eller af prokaryotiske eller eukaryotiske mikroorganismeværter som f.eks. E. coli, B.

20 subtilis, B. thermophilus, s. cerevisiae eller lignende.

Vektorerne vil indeholde et replikationssystem, der genkendes af værten, skønt i visse tilfælde kan integration af en opbygning indeholdende transcriptionelle og translationelle regulerende signaler og den pågældende cistron være ønskelig i 25 værtsgenomet. I disse situationer vil opbygningen sædvanligvis være omgivet af sekvenser, der er homologe med sekvenserne i værtsgenomet.

Ekspressionsvektorerne, der anvendes, vil indeholde transcriptionelle og translationelle signaler, der genkendes af 30 værten. De transcriptionelle signaler vil indeholde promotoren og terminatoren såvel som hjælpesignaler som f.eks. en eller flere fremmere. Herudover kan regulering af transcription tilvejebringes ved at indbefatte operatorer, aktivatorer, DK 169708 B1 14 gener, der tilvejebringer repression, eller lignende. Andre sekvenser, der står i forbindelse med transcription, omfatter afslutning, polyadenylering osv. Til translation kan der, afhængig af værten, være en ribosomal bindingsplads, en 5 initiationscodon, stopcodoner eller lignende.

Sædvanligvis anvendes ikke-kodende 5'- og 3*-omgivende områder fra gener, der stammer fra værten, således at signalerne genkendt af værten vil findes i passende forhold. Disse omgivende regioner kan være knyttet til genet, der koder for 10 faktor VHIC-precursoren, subenheden eller fragmentet heraf, således at genet er i aflæsningsrammen med initiationscodonen og enten bærer sin egen stopcodon eller er indskudt umiddelbart ovenfor for en eller flere stopcodoner.

En vektor vil normalt indeholde en eller flere markører, der 15 tilvejebringer selektion og som muliggør kontinuert selektiv tryk under værtens vækst. Disse markører kan omfatte fototropi i en auxotrop vært, antibiotikaresistens, toxinresistens osv.

Hvor der forefindes en secernerende leader og oparbejdenings-signaler, vil det nødvendigvis være nødvendigt at tilvejebringe 20 en adaptor. Ved at tilvejebringe et passende restriktionsstéd ved DNA-sekvensens endestilling, der koder for en secernerende leader og produktionssignaler, eller oven herfor, kan man syntetisere en oligonucleotid adaptor, der sædvanligvis er fra ca. 10 - 50 bp, der kan indskydes mellem den secernerende 25 leader og produktionssignalerne eller den afkortede del heraf, og det pågældende gen, der indeholder en 5'-endestilling ved initiationscodonen af genet, eller nedenfor, således at adap-toren genopretter alle de nødvendige manglende baser og tilvejebringer genet, der er i aflæsningsramme med initiations-30 codonen af leadersekvensen.

De frembragte konstruktioner, der omfatter det ønskede gen, kan herefter indføres i en vært, der er i stand til at vokse i en -kultur, på almindelige metoder f.eks. ved transformation, DK 169708 B1 15 konjugation, transfektion eller lignende. Værten kan herefter •dyrkes i et passende næringssubstrat, og produktet kan isoleres på almindelige måder. Dersom produktet tilbageholdes intracel-lulært, kan cellerne høstes og lyseres; dersom de udskilles, 5 kan produktet isoleres fra næringssubstratet. Produktet kan herefter renses ved chromatografi f.eks. ved affinitets-chromatografi, elektroforese, ekstraktion, HPLC eller lignende.

Til ekspression i en pattdyrcelle kan et pattedyrvirus anvendes som vektoren f.eks. SV-40, papilloma-virus, maloney-muse-10 sarcomavirus, adenovirus eller lignende. Disse vira er blevet modificeret til anvendelse som ekspressionsvektorer i pattedyrscellekulturer. Et eksempelvis system anvender COS-celler, der bærer et integreret SV-40-genom, og som frembringer det store T-antigen, der er nødvendig for SV-40-replikation 15 (Gluzman, Cell (1981) 23.:175). Et fragment, der spænder fra Hpal-pladsen ved 0,76 på SV-4O-kortet til BamHI-pladsen ved 0,14 SV-4 O-kortet, kan anvendes som en vektor. Det rekombinante plasmid opnået ved at sammenknytte faktor VHIC-genet eller en del heraf med SV-4O-vektoren kan anvendes til at overføres til 20 abe CV-l-celler.

Rensede subenheder og fragmenter af faktor VIIIC kan anvendes til at forøge koaguleringsevnen for individer, der kræver den pågældende subenhed. Faktor VIIIC kan også anvendes inden for terapien. De omhandlede polypeptider kan anvendes til 25 fremstilling af monoklonale antistoffer over for faktor VIIIC, dens subenheder og fragmenter deraf. Subenhederne og fragmenterne kan også anvendes som reagenser, der kan mærkes og sammen med antistoffer anvendes til diagnostiske formål til undersøgelse af tilstedeværelsen af en eller flere subenheder eller 30 nedbrydningsproduktet heraf i fysioloigske væsker som blod eller serum.

Følgende eksempler illustrerer opfindelsen nærmere.

DK 169708 B1 16 I foreliggende beskrivelse med krav betegner Ab antistof og Ag antigen.

Forsøgsorocedure

1. Rensning af faktor VIIIC

5 Human faktor VIIIC blev isoleret fra i handelen tilgængelige cryoprecipitatpræparater ved a) immunosorbentchromatografi under anvendelse af en polyklonal anti-VIIIR-sepharosesøj le ved en metode, der først er beskrevet af E.G.D. Tuddenham, N.C. Trabold, J.A. Collins og L.W. Hoyer, J. of Lab. Clinical 10 Medicine (1979) 93.:40, og b) en chromatografisk separation på aminohexylsubstitueret agarose som oprindeligt beskrevet af D.E.G. Austen, British J. of Hematology (1979) 43.:660. Detaljer ved procedurerne er beskrevet i det følgende.

Gedeanti-human faktor VIII relateret antigen (VIIIR) serum 15 opnået fra Atlantic Antibody (katalog nr. 040-01) blev behandlet med enten en standard 0 - 50% ammoniumsulfatfraktion efterfulgt af DEAE-cellulosesøjlechromatografi, eller en lignende 0 - 33% fraktion uden efterfølgende chromatografi. Disse materialer blev derpå konjugeret til CNBr-aktiveret 20 Sepharose CL2B eller 4B (Pharmacia, 17-0140-01 eller 17-0430- 01) og udhældt som en søjle (anti-VIIIR-sepharosesøjle).

"HEMOFIL", et stabilt, tørret præparat af antihæmofil faktor (faktor VIII, AHF, AHG) på koncentreret form fremstillet ud fra frisk, normalt humant plasma, repræsenterende en ca. 40 ganges 25 berigelse for faktor VIIIC, blev opløst i følgende puffer: 0,02 M imidazol, 0,15 M NaCl, 0,1 M lysin-Hcl, 0,02% NaN3, pH 7,4.

Efter opløsning blev "HEMOFIL” påført den i det foregående beskrevne anti-VIIIR-sepharosesøjle. Ikke-specifikt bundet protein blev elueret med ovennævnte puffer modificeret til 0.5 DK 169708 B1 17 M NaCl. Dernæst blev faktor VIIIC elueret med ovennævnte puffer, indeholdende 0.35 M CaCl2 med tilsætning af 10% glycerol, ^om stabiliserer faktor VHIC-aktiviteten. Aktive fraktioner fra immunosorbentsøjlen blev samlet og dialyseret 5 mod puffer (0,02 M imidazol, 0,15 M NaCl, 0,1 M lysin-HCl, 0,025 M CaCl2, 0,02% NaN3. 10% glycerol, pH 7,4). En aliquot af de dialyserede fraktioner, som indeholdt 1100 enheder faktor VIIIC, blev anbragt på aminohexyl-Sepharose 4B-søjlen (1x6 cm) bragt i ligevægt med dialysepuffer som beskrevet i det 10 foregående. Faktor VHIC-aktivitet blev elueret med samme puffer indeholdende enten 0,35 M CaCl2 eller 2 M NaCl. Aktiviteten fandtes i et volumen på 2 ml med 500 enheder faktor VIIIC pr. ml. Efterfølgende eksperimenter udført på samme måde gav en udvinding på 25% fra anti-VIIIR-søjlen og en udvinding på 90% 15 fra aminohexylsøjlen. Alternativt føres samlet, dialyseret materiale elueret fra immunosorbentsøjlen først til en dex-transulfatagarose (Pharmacia) søjle (1,5 x 6 cm) bragt i ligevægt med dialysepufferen som nævnt i det foregående og elueret med samme puffer. Adskillige mindre forureninger, 20 f.eks. fibrinogen, fibronectin, IgG, tilbageholdes på søjlen, mens faktor VIIIC kommer ud i gennemstrømningen, som samles og anbringes på aminohexyl-sepharosesøjlen som før.

Både biologisk, dvs. størknende, og antigen (CAg) aktivitet blev vist at være til stede i den rensede faktor VIIIC, hvilket 25 blev vist ved de efterfølgende prøver, der indikerede en 5000 ganges rensning i forhold til den 40 ganges koncentration i "Hemofil". Under anvendelse af et i handelen tilgængeligt standardiseret trekomponentudstyr fra General Diagnostics, (APTT, Faktor VIII deficient plasma, Verify Normal Citrate) 30 blev en koaguleringsprøve udført og indikerede høje koncentrationer af faktor VIIIC biologisk aktivitet.

De anvendte antistoffer stammede fra inhibitorpatienter, en med en lavtiter (LZ) som dæk-Ab og en med en høj titer (HZ) som det mærkede Ab. Disse antistoffer anvendtes ved to forskellige 35 forsøgstyper. I et RIA-forsøg mærkes HZ-Ab med I125, medens i et DK 169708 B1 18 ELISA-forsøg, kobles HZ til peberrodsperoxidase. Mærkning med I125 af antistof HZ for RIA-forsøget udførtes som beskrevet af Hunter, W.M., i Radioimmunoassay, Weir, D.M., udg. Handbook of Experimental Immunology, tredie udgave, vol. 1, Blackwell 5 Scientific Publications, Oxford, 1978. HPR-HZ-konjugation udførtes som beskrevet af Wilson og Nakane, i Immunofluorescence and Related staining Techniques, Knapp et al., udgivere Elsevier, North-Holland Biomedical Press, Amsterdam, 1978, p. 215-224. LZ havde en aktivitet på 700 Bethesda-enheder/ml,

10 medens HZ havde en aktivitet på 1500 Bethesda-enheder/ml. Dækantistof (LZ) fortyndedes til 3,5 /xg/ml i 0,1 M NaHC03, pH

9,8 (RIA) eller 0,05 M imidazol, 0,1 M NaCl, 0,01% Thimerosal, 0,05% Tween 20, 5% BSA (ELISA) eller til begge forsøg PBS-CMF (til 1 liter: 200 mg KC1, 200 mg KH2P04, 8,0 g NaCl, 1,15 g 15 vandfrit Na2HP04, pH 7,4), og 1 ml sattes til hvert rør (polystyren) og inkuberedes natten over ved stuetemperatur. Denne opløsning fjernedes ved af sugning, og rørene vaskedes tre gange med 3 - 3,5 ml 0,15 M NaCl eller PBS-CMF indeholdende 0,05% Tween 20. Prøver eller standarder (General Diagnostics, Verify 20 Normal Citrate, katalog nr. 34112) fortyndes og sættes til rørerne til et totalt rumfang på 0,9 ml pr. rør og inkuberes natten over ved stuetemperatur (fortyndinger foretoges i 0,02 M Tris, 0,15 M NaCl, 5% BSA, 0,05% Tween 20, 0,01% Thimerosal, pH 6,5 for RIA eller 0,05 M imidazol. 0,1 NaCl, 0,01% Thimero-25 sal, 0,05% Tween 20, 5% BSA for ELISA eller PBS-CMF til begge forsøg. Opløsninger fjernedes ved af sugning, og rørene vaskedes som tidligere beskrevet. Til RIA tilsættes 5 x 105 cpm ølmærket antistof over for faktor VIIIC (HZ) i 600 eliter RIA-fortyndingspuffer til hvert rør, der herefter inkuberedes ved 30 37*C i 16 - 18 timer; opløsningerne fjernedes, rørene vaskedes som tidligere beskrevet og blev talt i en γ-tæller. Til ELISA-forsøget sattes 0,9 ml peroxidasekon jugeret anti-f aktor VIIIC(HZ) til hvert rør, der herefter inkuberedes natten over ved stuetemperatur; opløsningerne fjernedes, og rørene vaskedes 35 som før, hvorefter 0,9 ml OPD-opløsning tilsattes (til 100 ml: 0,73 g citronsyre, 1,19 g dinatrium surt phosphat, 0,15 g o-phenylendiamin, pH 5,0 med 250 /iliter 10% H202 tilsat lige inden DK 169708 B1 19 brugen), og der inkuberedes ved stuetemperatur i 30 minutter i mørke. For at afbryde reaktionen tilsattes hvert rør 0,5 ml 6 N HCl (eller 0,9 ml i M H2S04), og OD492 aflæstes.

II. Opbygning af faktor VlllC-komplekset 5 A. Immunoorecipitationsforsøg

Gelfiltreringsforsøg udførtes med en AcA 44-søjle på faktor VHIC-renset materiale under følgende betingelser: 0,1% insulin (som bærerprotein for stabilisering), 0,25 M CaCl2, 0,01% Thimerosal, 0,05 M imidazol, pH 7,2. Faktor VlllC-koagulering 10 og antigenvirkning af eluatet kontrolleredes. Der observeredes to antigene toppe. En med Faktor VHIC-koaguleringsevne opførte sig som et kompleks med en tilsyneladende molekylvægt på ca. 460000 under disse betingelser (oprindelig). Den anden top (uden koaguleringsevne) eluerede ved en observeret molekylvægt 15 lidt under 67000.

Dersom der analyseredes ved standardanalytisk Laemmli SDS-gelelektroforese (Laemmli, Nature (1970) 227:680-685) opnåedes forskellige proteinarter på 240, 160, 140, 115, 92,5, 80 og 77 kD. Forholdet mellem disse proteiner og faktor VIIIC bestemtes 20 ved standardimmunoprecipitationsmetoder. I immunoprecipita-tionsmetoden anvendtes S. aureus protein A-sepharose (CL4B eller polystyrenkugler (1/8 inc, Precision Plastic Ball Co.) beklædt med affinitetsrenset andet antistof (gedeanti-mus IgG eller anti-human IgG) for at adskille antigen-Ab-komplekser fra 25 fri 125I-mærket faktor VIIIC.

Proteinerne, der eluerede fra affinitetssøjlen, blev iodbehand-let og herefter omsat med antistoffer specifikke for faktor VIIIC. Antistofferne var humane inhibitorantistoffer isoleret fra hæmofile patienter og betegnet anti-faktor VIIIC (Z) og (E) 30 eller inhibitorantistof (Z) og (E).

DK 169708 B1 20

Resultaterne viste, at begge antistoffer reagerede med 77/80 kD-dubletten. "E"-antistoffet reagerede også stærkt med 240 kD-båndet og gav svag precipitation med adskillige bånd (160, 140, 115, 92,5 kD) mellem dubletten og 240 kD-arten. nZ"-antistoffet 5 precipiterede også 92,5 kD og 240 kD-proteiner. Den stærke reaktion mellem "E"-antistof og 240 kD-arten antyder, at denne art er en precursor for faktor VIIIC.

Antistof-søjlerenset faktor VHIC-fraktion iodbehandledes og omsattes med humant inhibitorantistof både med og uden EGTA 10 (ethylenglycol-bis(β-aminoethylether) -Ν,Ν,Ν1,N1 -tetraeddike-syre). Dette muliggør en undersøgelse af den rolle som divalente kationer spiller, specielt Ca·”· i forbindelse med faktor VlllC-polypeptideme. Man fandt, at inhibitorantistof (E) udfælder 77/80 kD-dubletten, samt de højmolekylære arter af 15 160, 140, 115 og 92,5 kD. Dubletten er altid blandt de stærkere bånd. (Dette immunoprecipitationsforsøg udførtes med polystyren. Denne metode bevirker en lavere baggrund, og det mærkede IgG i faktor VHIC-præparatet udfældes ikke). Inklusion af EGTA bevirker tabet af de højmolekylære bånd (92,5 - 160 20 kD), men havde ingen virkning på mængden af udfældet dublet. Et lignende forsøg anvendte Z-antistof koblet til Sepharose som en immunosorbent: renset faktor VIIIC påføres søjlen og efter binding via 77/80 kD, elueres 92,5 kD-polypeptidet selektivt med EDTA (ethylendiamintetraeddikesyre). Metoden anvendes 25 præparativt til fraktionering af 92,5 kD-arterne. Denne immunosorbentsøj le eller en lignende en præpareres med polyklo-nale antistoffer over for faktor VIIIC. Når der elueres med chaiotropiske eller denaturerende opløsningsmidler som f.eks. henholdsvis thiocyanatopløsninger eller vandigt urinstof i 30 stedet for EGTA renses faktor VIIIC yderligere. Disse resultater tyder på, at 92,5 kD-peptidet kan være associeret ikke-covalent til 77/80 kD-dubletten via en Ca^-bro. Inhibitorantistoffet synes at indvirke direkte kun på dubletten. De højmolekylære bånd (115 kD, 140 kD, 160 kD) er sandsynligvis 35 precursorer for 92,5 kD, hvilket indikeres af det monoklonale DK 169708 B1 21 antistofs evne rettet mod 92,5 kD-polypeptidet til at krydsreagere med 115 kD, 140 kD og 160 kD-polypeptiderne.

Forholdet mellem de forskellige proteinarter fra affinitetssøjlen demonstreredes ved immunoprecipitation af iodbehandlet, 5 renset faktor VIIIC med monoklonale antistoffer fremstillet som beskrevet af G. Kohler and C. Milstein (Eur. J. of Immunol. (1975) 6:511). Balb/c-mus immuniseredes med væskefaseimmu- noadsorberet faktor VIIIC. Miltceller (108) kobledes med 107 NSO eller NSI-mus-myelomaceller. Fusionsprodukterne udsåedes i to 10 96-brøndsmikrotiterplader. Et miltcellefødelag anvendtes med 104-celler/brønd. Kolonier var mikroskopisk synlige fra den femte dag, og supernatanterne undersøgtes med få dages mellemrum under anvendelse af et ELISA-forsøg. Følgende lag anvendtes: første, faktor VIIIC elueret fra hexyl-Sepharose 4B-15 søjle som beskrevet i afsnit I ovenfor; andet, hybridomacelle-supernatant; tredje peberrodsperoxidase (HPR)-mærket gedeanti-mus IgG; fjerde HPR-substrat.

Adskillige grupper af monoklonale antistoffer blev identificeret, hvoraf to hæmmede faktor VHIC-koagulationsevne: gruppe 20 I-antistoffer reagerede med 80/77 kD-dubletten og 240 kD-polypeptiderne, og gruppe Il-antistoffer reagerede med proteinerne på 240, 160, 140, 115 og 92,5 kD. Immunoprecipitation af thrombin-nedbrudt faktor VIII med gruppe I-monoklonale antistoffer indicerer, at den frembragte 70/67 kD-dublet 25 stammer fra 77/80 kD-dubletten (se nedenfor). Gruppe III-monoklonale antistoffer tyder på, at 160, 140, 115 kD-peptider-ne er precursorer for 92,5 kD-peptidet. De monoklonale antistoffer fra gruppe III reagerede yderligere med et 40 kD-peptid frembragt ved thrombinnedbrydning af renset faktor VIIIC-30 materiale.

Et forsøg som det ovenfor beskrevne under anvendelse af EGTA for at undersøge rollen af Ca^-ionen i faktor VHIC-komplekset udførtes også under anvendelse af et monoklonalt antistof baseret i ELISA-forsøg med følgende lag: første monospecifikt DK 169708 B1 22 anti-(muse-IgG); andet, gruppe III-monoklonalt antistof (anti- 92,5 kD); tredje renset faktor VlllC-materiale; fjerde HRP-humant inhibitorantistof over for 77/80 kD. Tilsætning af EGTA fjernede bunden HRP-aktivitet til stede i kontrollen uden 5 chelator. Den kendsgerning, at gruppe I og gruppe III monoklo-nale antistoffer rettet over for henholdsvis 77/80 kD-dubletten og 92,5 kD-proteinerne hver især er hæmmende over for faktor VHIC-koagulationsevne tyder på, at begge er essentielle komponenter af faktor VHIC-komplekset.

10 B Thrombinaktiverϊησ af faktor VIIIC

Aminohexyl-koncentreret affinitetsrenset faktor VIIIC er aktiveret ved hjælp af thrombin (Boehringer, fremstillingsnummer 1072302), idet der anvendtes to forskellige sæt pH-betingelser (6,8 og 7,4).

15 Udtagne prøver blev undersøgt for koagulationsevne og herudover TCA-udfældedes prøver (på ca. 2,5 enheder hver) til gelanalyse.

I de første forsøg var VHIC-aktiviteten til at begynde med 46 enheder/ml. Dette fortyndedes til en slutkoncentration på 11,5 enheder/ml i faktor VHIC-puffer (20 mM imidazol, pH 6,8, 150 20 mM NaCl, 200 mM lysin, 25 mM CaCl2 og 10% glycerol) Slutkon-centrationen af thrombin var 0,12 enheder/ml (ca. 1 enhed thrombin pr. 100 koagulationsenheder VIIIC). Resultaterne viste, at koagulationsevnen steg til ca. 180 enheder/ml herefter af tog til ca. 40 enheder/ml (i det væsentlige udgangs-25 værdien) sammenfaldende med en lignende forøgelse og nedgang i mængden af 92,5 kD-arter. Dette peger således på, at 92,5 kD-arteme er en del af det aktive faktor VlllC-kompleks.

Yderligere forsøg med mere koncentreret faktor VHIC-præparater blev udført; for at anvende thrombinaktivering på præparativ 30 måde. For at frembringe 92,5 kD-polypeptid sattes thrombin til det rensede faktor Vllic-materiale (pH 7,4) i et forhold på ca. 1000-2000 koagulationsenheder faktor VIIIC til 1 enhed throm- DK 169708 B1 23 binaktivitet, og man lod reagere i en kort tid (5-15 minutter, afhængig af hæmofilprøven). Det fremkomne produkt påførtes herefter en 7,5% præparativ gel, og peptiderne fraskiltes ved elektroforese, idet gelbåndene blev udskåret og elektroelueret.

5 Dersom thrombinnedbrydning udføres i kort tid kan mængden af 92,5 kD-arter fordobles eller tredobles; på samme tid er 77/80 kD-dubletten kun delvis omdannet til 67/70 kD-arter. For at optimere betingelser for isolering af 67/70 kD-dubletten udføres en længerevarende (mere end 1 time) thrombinnedbryd-10 ning. I dette tilf.ælde spaltes 92,5 kD-arten yderligere til frembringelse af mindre fragmenter. To nye peptider 52,5 kD og 40 kD kommer til syne efter thrombinbehandling. 40 kD-peptidet reagerer med det ittonoklonale antistof rettet mod 92,5 kD-arter og må derfor være et spaltningsprodukt. 52,5 kD-peptidet 15 stammer også fra 92,5 kD-proteinet hvilket vises ved en sammenligning af kemiske og enzymatiske spaltningsmønstre dvs. både 92,5 kD og 52,5 kD-arterne viser, dersom de underkastes CNBr eller endoproteinase lys C-spaltning, et antal fælles fragmenter (ved hjælp af SDS-PAGE).

20 Til endoproteinase lys C-nedbrydning anvendes et vægtforhold mellem lys C til protein på ca. 1:1 - 100 sædvanligvis 1:10. I den pågældende nedbrydning anvendtes 10 pmol (4,8 μg) lys c sammen med 200 pmol (14 μg) 70 kD-polypeptid i ca. 100 μΙΐΐβΓ 0,025 M Tris-HCl, pH 7,7, 0,001 M EDTA, 0,08% SDS, og blandin-25 gen inkuberedes ved 37^0 i 6 timer indtil natten over for at opnå fuldstændig nedbrydning. Native polyacrylamidgeler som beskrevet af Orstein, Ann. N.Y. Acad. Sci. (1964) 121: 321-349 anvendtes til isolering af lys C-nedbrydningsprodukterne.

C. Thrombinnedbrydning af qelisoleret VHIC-relaterede pro-30 teiner

For at bekræfte precursor-produktforholdet af disse peptider isoleredes en række bånd ved præparativ SDS-gelelektroforese, DK 169708 B1 24 elektroelueredes og underkastedes thrombinnedbrydning. Resultaterne var følgende: 1. 240 kD-proteinet frembragte multiple bånd herunder 160, 140, 92,5 kD, men intet mindre end 92,5 kD dvs. ingen 5 77/80 kD eller 67/70 kD-dublet. Herudover udførtes et tidsforløb for nedbrydning med 240 kD-fragmentet og analyseredes for gelelektroforesemønster, koagulationsevne og faktor VHIC-antigen (CAg) aktivitet. Gelresultaterne var de samme som ovenfor, og i det væsentlige 10 udvandtes ingen CAg eller koagulationsevne.

2. 160 kD og 92,5 kD-gelisolerede polypeptider viste sig ikke at være substrater for thrombin eller isolering fra gelen.

3. Thrombin spalter specifikt gelisoleret 77 kD og 80 kD- 15 arter til frembringelse og henholdsvis nye polypeptider på 67 kD og 70 kD. Efter thrombinbehandling udfælder monoklonale antistoffer af gruppe I ikke alene 77/80 kD-dubletten, men også de nye 67 og 70 kD-arter.

D. Aminosvresekvensanalvse 20 Delvis aminosyresekvensinformation blev opnået ved standardmetoder for 67/80 kD-peptiderne, 77/80 kD-peptiderne og 52,5 kD-peptidet isoleret ved hjælp af præparativt SDS-elektrofore-se. Den elektroforetiske analyse indicerer sammen med amino-syresekvensresultaterne, at de gelisolerede 77/80 kD, 67/70 kD, 25 92,5 kD og 52,5 kD-polypeptiderne blev opnået med >95%, sædvanligvis 98% renhed. De gelisolerede peptider blev påført en gasfaseproteinsekvenser (Applied Biosystems). PTH-amino-syrerae blev påført en HPLC-søjle (IBM cyano, 25 cm), og aminosyresekvensen bestemt ud fra de fremkomne chromatogrammer.

30 Følgende sekvens blev bestemt for 67/70 kD-dubletten ved dens aminoendestilling (angivet med et mærke i Appendix B): DK 169708 B1 25 1234567 89 10 11 .? Phe Gin Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met 5 Under anvendelse af informationen opnået ved aminosyresekvensen af den N-endestillede del af 67/70 kD-proteinet fremstilledes følgende oligonucleotidsonder, der skulle anvendes til at undersøge humane genom-biblioteker. Phosphoramidmetoden beskrevet af M.S. urdea et al., Proc. Natl. Aca. Sci. USA 10 (1983) 80:7461 - 7465 anvendtes:

Sonde 1: 3' GTA ATA AAA TAA CGX CGX CA 5' (X=G,C,A,T)

G G G G

T

Sonde 2: 3' AAA GTT TTC TTC TGC TCT GT 5'

15 G C T T C

GCX

Sonde 3: 5' GAA CGX TTA TGG GAT TAT ggx ATG 3*

G AGA G C C

G CTX

20 Sonde 4: 3' TCT GTA ATG AAA TAG CGA CGA CAC CTT TCT GAC ACC CTA ATG CCG TAC 5*

CG G G G CC C

Et skema viser områderne for aminosyresekvensen, hvorfra hver sonde stammer: 12 3 4 S 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 ? phe Gin Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met

AAA GTT TTC TTC TGX TCT GTA ATA AAA TAA CGX CGX CA GAA CGX TTA TGG GAT TAT GGX ATG

G C T T GCC G G G G G AGA G C C

GT G CTX

A _

Sonde l-20mer (384) Sonde 3-24»er (1152)

30-60% GC 38-63% GC

--Tm=52-64*C ' Tm=6S-78*C

sonde 2-20 ner (512) 20-55% GC --—-----------1

Tm=48-62'C Sonde 4-48 mer (256) DK 169708 B1 26 52,5 kD proteinet, der er angivet nedenfor, stammer fra 92,5 kD-proteinet, idet følgende aminosyresekvens ved N-endestil-1ingen bestemtes: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 5 Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

Trp Asp Tyr Met Gin Ser Asp ? Gly Glu Leu Pro Val

Baseret på aminosyresekvensen for 52,5 kD-peptidet syntetiseredes en delvis degenereret sonde, der havde følgende nucleotid-10 sekvens (kodning):

5' -GCA ACT AGA AGA TAT TAT TTG GGG A G G A A

GCA GTT GAA TTG TCA TGG GAT TAT-3'

A AT

15 Denne sonde er værdifuld til undersøgelse af både genome og cDNA-biblioteker.

Aminosyresekvenserne for to peptider opnået ved nedbrydning af 77/80 kD-dubletten med endoproteinase lys C (Boehringer-Mannheim) bestemtes. Nedbrydningen blev udført på følgende 20 måde. 77/80 kD-dubletten blev elektroforesebehandlet på en polyacrylamidproteingel, og båndene svarende til dubletterne blev elektroelueret. Det fraskilte materiale blev renset og nedbrudt med endoproteinase lys C, og de fremkomne peptider blev fraskilt ved omvendt fase HPLC. Fraktionerne, der svarede 25 til toppe for absorbans ved 280 nm, blev sekvensbedømt under anvendelse af en automatiseret sekvenser (Applied Biosystems, Foster City, CA, Model A70A). Den første sekvens var følgende: 1234 56789 10 11 12

Tyr Ala Ala Thr Ser Gin Val Leu Leu Pro Ser Lys DK 169708 B1 27

Baseret på denne aminosyresekvens syntetiseredes en delvis degenereret sonde med følgende nucleotidsekvens (ikke-kodende) streng:

3' -ATA CGT CGT TGÅ AGT GTT CAA AAC AAC GG-51 5 T A T T T

Det andet peptid havde følgende sekvens: 1 2 3456789 10

Val Thr Gly Val Thr Thr Gin Gly Val Lys

Baseret på denne aminosyresekvens fremstilledes en delvis 10 degenereret sonde, der havde følgende nucleotidsekvens (ikke-kodende) :

3'-CAA TGA CCT CAA TGA

T T T T

TGA GTT CCT CAA TTT-5'

15 T T

77/80 kD-dubletten blev også nedbrudt med trypsin. Dubletmaterialet blev renset som beskrevet for nedbrydning med endoproteinase lys C ovenfor. Lysiner blev blokeret ved citraconylering for at muliggøre nedbrydning kun ved argini-20 nerne. Citraconylering udførtes ved at opslæmme proteinerne i en denaturerende puffer, reducere og carboxymethylere de opslæmmde proteiner og behandle med citraconanhydrid, idet man holdt pH mellem 8,5 og 9,0. Efter citraconylering blev proteinerne nedbrudt med trypsin, og de fremkomne peptider 25 fraskilt ved omvendt fase HPLC. De fraktioner, der svarede til absorbanstoppe ved 280 nm, blev sekvensbestemt som ovenfor. Sekvensen var følgende: 123456789 10 11 12

Met Gly Val Leu Gly Cys Glu Ala Glh Asp Leu Tyr DK 169708 B1 28

Baseret på denne aminosyresekvens syntetiseredes en delvis degenereret sonde, der havde følgende nucleotidsekvens (ikke-kodende):

3 ' -TAG CTT CAA AAC CCT ACG CTT CGT GTT CTA AAC ATA-51 5 T T T

Dersom metoder til bestemmelse af N-endestillingssekvenserne af 80 og 77 kD-arterne udføres, viste det sig, at deres amino-endestillinger var blokeret. Derfor bestemtes N-endestillings-sekvensen ud fra det materiale, der blev opnået ved en alterna-10 tiv rensningsmetode, der omfattede immunoaffinitetschromatogra-fi og ionbytterchromatografi, og som udelukkede anvendelsen af præparativ SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Rensning af 80/77 kD-dubletten indebærer tilsætning af faktor VlllC-koncentrat til en monoklonal antistofsøjle efterfulgt af chromatografi på 15 en mono S-kat ionbytter. Dette materiale havde en ublokeret N-endestilling, hvilket viste, at blokeringen afsløret i gelrenset 80/77 kD var en artefakt, der skyldtes gelelektrofore-sen. Aminoendestillingssekvenserne bestemt for både 80 og 77 kD-arterne er følgende (angivet med en markering i Appendix B): 20 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Glu Ile Thr ? ? ? Leu Gin ? Asp 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Gin Glu Glu Ile Asp Tyr ? Asp Asp Ile DK 169708 B1 29 E. Aminosvresammensætning

Aminosyresammensætningerne for 77/80 kD-peptiderne bestemtes ved standardmetoder at være følgende:

Aminosyre 80 kD 77 kD

5 Asp 58 54

Glu 74 76

Cys 12 14

Ser 47 44

Gly 51 46 10 His 8 12

Arg 32 29

Thr 35 29

Ala 35 33

Pro 33 30 15 Tyr 25 25

Val 46 44

Met 17 17

Ile 33 35

Leu 49 48 20 Phe 32 31

Lys 47 47

Totalt antal aminosyrer 634 608

Beregnet molekylvægt: 82 kD 79 kD

F. Fremstilling af human 4x qenombibliotek 25 Omkring 3 mg DNA blev fremstillet ud fra cellekulturlysater af GM1416-celler (human lymphoblastoid cellelinie indeholdende 4 kopier af X-kromosom).

Denne DNA blev delvis nedbrudt med restriktionsenzymet Sau3A, og det nedbrudte DNA (400 - 500 jug) fraktioneret på 10% - 40% 30 sucrosegradienter. Fraktioner i størrelsesområdet 10 - 25 kilobaser blev slået sammen, dialyeret over i Tris-EDTA og renset over Schliecher og Scheull Elutio-d sterile engangs- DK 169708 B1 30 søjler. Prøver af denne DNA blev ligeret til EMBL-4-arme, der var opnået efter nedbrydning med BamHI og Sall og isolering på en gradient og herefter indpakket i bakteriofag-λ med en effektivitet på 1 x 106 pfu/μg af indført DNA. Den anvendte 5 vektor EMPL-4 er en modificeret form af bakteriofag-λ (se Karn et al., Methods Enzymol. (1983) 101:3 - 19). Det totale Bibliotek bestod af 5 x 106-fag.

G. Udstrvqninq og undersøgelse af human 4x-qenomsamlinq

Bakteriofagen blev adsorberet til E. coli stamme DP50, og 20 10 plader blev tilsået med 50000 pfu pr. plade (150 x 15 mm størrelse) til opnåelse af 1 x 106 pfu ialt. (Detalje for metoder med hensyn til plader, dækagar, adsorption og ud-strygning findes i Molecular Cloning, A Laboratory Manual af T. Maniatis, E.F. Fritsch og J. Sambrook; Cold Spring Harbor Lab, 15 New York, 1982.)

Nitrocellulosefiltre blev påført overfladen af hver plade indeholdende fagpletter (således at molekyler af ikke-indhyllet fag-DNA overføres til filtrene) ialt to gange, og der hybridi-seredes med 32P-mærket 256-gange degenereret 48-mer sonde-DNA 20 (sonde nr. 4). (Detaljer om nitrocelluloseoverførselsmetoder ér angivet i Maniatis et al., supra). Præhybridisering og hybridi-sering blev udført i Wallace-blanding indeholdende i 1 liter: 310 ml destilleret H2O, 200 ml 50% dextransulfat, 180 ml 1 M Tris-HCl, pH 8,0, 225 ml 4 M Nacl, 20 ml 0,25 M EDTA, 50 ml 25 lOOx Denhardts opløsning, 5 ml 100% NP-40 og 10 ml 10% SDS.

Sonden blev mærket ved enzymatisk overførsel af 32P04 fra y-APT32 til 5'-phosphatenden af hver sonde DNA-molekyle katalyseret ved hjælp af T4-polynucleotidkinase. Hybridiseringsbe-tingelserne var følgende: 10 ml hybridiseringsblanding/filter 30 x 5000 cmp mærket sonde nr. 4/degeneration/ml. Hybridiseringen udførtes natten over ved 37°C. Filtrene blev vasket i 6XSSC, 1 ml EDTA ved 50 - 55°C, lufttørret og anvendt til at eksponere røntgenfilm.

DK 169708 B1 31 H. Karakterisering af positive kloner 23 pletter, der gav positive signaler ved den første undersøgelse, blev genudsået på plader, fag-DNA overført til nitrocellulose og hybridiseret med friskt mærket sonde nr. 4 5 (sekundære). 11 pletter, der gav positive signaler, blev atter overført til plade, fag-DNA overført til nitrocellulose og hybridiseret med friskt mærket sonde nr. 4 (tertiære). 8 pletter, der gav positive signaler, isoleredes og DNA-præ-pareredes (100 ml flydende kultur for hver). DNA1 en svarende 10 til hver af de 8 kloner blev nedbrudt med EcoRI (for at frigøre indskudt humant genom-DNA fra λ-vektor-DNA'en), og de fremkomne fragmenter blev fraskilt efter størrelse under anvendelse af elektroforese på 0,8% agarosegel, denatureret og overført til nitrocellulose. Dette blev gentaget 4 gange, og hver filter 15 hybridiseret med 32P-mærket sonde nr. 1, 2, 3 eller 4. Filterne anvendtes til at eksponere røntgenfilm, og der viste sig et enkelt bånd på ca. 4,4 kb i størrelse som hybridiserede med alle 4 sonder for to kloner. Disse to kloner var identiske bortset fra at den ene havde mere indskudt DNA end den anden 20 (klonbetegnelserne er 23 D for det store indskud på 15,21 kb og 11 for det mindre indskud på omtrent 13 kb) . 4,4 kb gelisoleret EcoRI-fragment blev subklonet i vektor M13 og pUC-9 (et derivat af pBR322). DNA-sekvensbedømmelse ved hjælp af dideoxymetoden på Ml3 DNA under anvendelse af den synetiske sonde nr. 3 og 25 dens reverse komplement som primer blev udført.

4,4 kb-fragmentet blev delvis sekvensbedømt og havde følgende sekvens, der omfattede sonde nr. 4 sekvensen angivet i parentes, og den partielle aminosyresekvens af 67/70 kD-fragmentet, der oprindelig var bestemt, er angivet i klammer.

DK 169708 B1 32

1 10 val ser phe phe arg ala gin arg glu arg leu ser gly asn GG GTG TCC TTC TTC AGG GCT CAG AGG GAG CGA TTA AGT GGC AAC

20 glu ala asn arg pro gly lys leu pro phe leu arg val ala thr

GAA GCA AAC AGG CCT GGA AAA CTT CCC TTT CTG AGA GTA GCA ACA

30 40 glu thr leu gin arg leu pro pro ser tyr trp ile leu leu leu

GAA ACT CTG CAA AGA CTC CCT CCA AGC TAT TGG ATC CTC TTG CTT

50 gly ile pro leu trp tyr ser glu tyr gin lys lys ser gly lys

GGG ATA CCA CTA TGG TAC TCA GAG TAC CAA AAG AAG AGT GGA AAG

60 70 ser gin glu lys ser pro glu lys thr ala phe lys lys lys asp

TCC CAA GAG AAG TCA CCA GAA AAA ACA GCA TTT AAG AAA AAG GAT

80 thr ile leu ser leu asn ala cys glu ser asn his ala ile ala

ACC ATT TTG TCC CTG AAC GCT TGT GAA AGC AAT CAT GCA ATA GCA

90 100 ala ile asn glu gly gin asn lys pro glu ile glu val thr trp

GCA ATA AAT GAG GGA CAA AAT AAG CCC GAA ATA GAA GTC ACC TGG

110 ala lys gin asn arg thr glu arg leu cys ser gin asn pro pro

GCA AAG CAA AAT AGG ACT GAA AGG CTG TGC TCT CAA AAC CCA CCA

120 130 val leu lys arg his gin arg glu ile thr arg thr thr leu gin

GTC TTG AAA CGC CAT CAA CGG GAA ATA ACT CGT ACT ACT CTT CAG

140 ser asp gin glu glu ile asp tyr asp asp thr ile ser val glu .

TCA GAT CAA GAG GAA ATT GAC TAT GAT GAT ACC ATA TCA GTT GAA

150 160 met lys lys glu asp phe asp ile tyr asp glu asp glu asn gin

ATG AAG AAG GAA GAT TTT GAC ATT TAT GAT GAG GAT GAA AAT CAG

170 ser pro arg ser phe gin lys lys thr [arg his tyr phe ile ala

AGC CCC CGC AGC TTT CAA AAG AAA ACA\CGA CAC TAT TTT ATT GCT

180 .T190 ala val glu arg leu trp asp tyr gly met\ ser ser ser pro his

GCA GTG GAG AGG CTC TGG GAT TAT GGG ATG/ AGT AGC TCC CCA CAT

200 val leu arg asn arg tyr glu cys ile gly tyr ser phe ala leu

GTT CTA AGA AAC AGG TAT GAA TGC ATT GGT TAT TCC TTT GCT CTG

210 211 leu leu OP

CTC TTG TGA CATTTGACTTTACCAGATGATGACACCAACC

DK 169708 B1 33

Denne klon svarer således til genet for 77/80 kd-dubletpro-•teinet, hvilket, som det er vist ovenfor, svarer delvis til det humane faktor VHIC-kompleks.

Klon 23D subklonedes i fag M13 som EcoRI-fragmenter, og 5 sekvensen svarende til det indførte humane DNA blev bestemt. Den komplette 15,121 kb-sekvens af klon 23D-sekvensen er angivet i appendix A. Subklonbetegnelserne er angivet i den højre margen af sekvensen og refererer til EcoRI-EcoRI-fragmen-tet, der strækker sig i 3'-retningen. En åben aflæsningsramme 10 på 3,110 kb viste sig at findes fra 3'-enden af 70-3-fragmentet til midten af 4,4 kb-fragmentet. Den åbne aflæsningsramme omfatter således i det mindste en del af koderegionen for 77/80 kb-dubletproteinet.

I. Sammenligning af genom-DNA med cDNA

15 3 cDNA-kloner blev opnået på følgende måde: klon Cl blev opnået ved at undersøge et human lever-cDNA-bibliotek med en sonde, der var opbygget af 4,4 kb-EcoRI-fragment af klon 23D. Klon C2 blev også opnået ved at undersøge et human lever-cDNA-bibliotek med 4,4 kb-sonden. Klon 2-11 blev opnået ved at undersøge et 20 human nyre-cDNA-bibliotek med en syntetisk 45-mer-sonde baseret på DNA-sekvensen fundet ved 31 -enden af den åbne aflæsningsramme af klon 23 D (nucleotiderne 9391 til 9435 i Appendix A) Sonden bestod af den ikke-kodende streng med følgende sekvens:

Ser Pro Arg Ser Phe Gin Lys Lys

25 5'-AGO CCC CGC AGC TTT CAA AAG AAA

ikke-kodende 3'-TCG GGG GCG TCG AAA GTT TTG TTT (sonde)

Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala ACA CGA CAC TAT TTT ATT GCT-3« 30 TGT GCT GTG ATA AAA TAA CGA-5'

Klonerne blev sekvensundersøgt og deres beliggenhed i forhold til det genome DNA af klon 23D bestemt ved hjælp af sammen- DK 169708 B1 34 ligning af sekvenserne. Klon Cl, der er 304 kp i længde, lapper over med den åbne aflæsningsramme fra nucleotid 7773 til 8077 nummereret som i Appendix A. Klon C2, der er 878 bp i længde, lapper delvis over med 3'-enden af den åbne aflæsningsramme, 5 der begynder ved nucleotid 9538 og strækker sig ud over nucleotid 9497, der er ved 3'-enden af den åbne aflæsningsramme. Klon 2-11, der er 572 bp i længde, lapper også over 3·-enden af den åbne aflæsningsramme, der begynder ved nucleotid 9190 og strækker sig ud over dennes afslutning. Disse fund 10 bekræfter således, at den åbne aflæsningsramme er transcri-beret.

Kodeinformationen, der stammer fra den 4,4 kb åbne aflæsningsramme, kan kombineres med yderligere kodningsinformation, der stammer fra kloner 2-11 og C2 for at fremstille og udstrække 15 sekvensen af 3,841 kb svarende til den totale kendte kodesekvens som angivet i Appendix B. Regionerne, der svarer til Cl, C2 og 2-11-sonderne, er rammet ind.

For at fremstille faktor VIIIC indføres DNA-sekvenserne fra klon 23 eller klon 11 i en SV-40-promotor som beskrevet af Laub 20 et al., J. Virology (1983) 48:271, således at de er under kontrollen af den SV-40 tidlige promotor. Det fremkomne rekombinant-plasmid kan transfekteres i COS-celler (Guzman, supra). Alternativt kan kodesekvensen indføres i et plasmid f.eks. pBR322, i hvilket er indført de lange endestillede 25 gentagelser af Maloney-musesarcomavirus, således at klon 23 eller 11-sekvenseme er under den transcriptionelle kontrol af det virale regulerende system. Opbygningerne kan herefter indføres i 3T3-muse-fibroblaster til effektiv ekspression (se Perkins et al., Molecular and Cellular Biology, juni 1983, Vol.

30 3, Nr. 6, p. 1123).

Ovennævnte resultater viser, at genomt DNA er isoleret, der koder for subenheder af faktor VHIC-komplekset. Ved anvendelse af dette genome DNA, kan DNA yderligere manipuleres til opnåelse af en sekvens, der koder for faktor VHIC-kompleks- DK 169708 B1 35 subenheder. DNA'en kan herefter anvendes i en ekspressionsvektor til fremstilling af faktor VHIC-subenheder, der kan anvendes på en hel række måder f.eks. som reagenser ved diagnostiske undersøgelser, som terapeutiske midler, til 5 fremstilling af monoklonale eller polyklonale antistoffer, der herefter kan anvendes til rensning af faktor VIII-kompleks eller andre formål. De genome DNA-sekvenser kan også anvendes til isolering af mRNA, der koder for profaktor VIIIC til opnåelse af precursorproteinet. Dette protein kan herefter 10 administreres til in vivo oparbejdning.

Den omhandlede metode har tilvejebragt en DNA-sekvens, der omfatter den specifikke sekvens ved eller nabostillet til 5’-endestillingen af den sekvens, der koder for 67/70 kD-dublet-ten, hvilken specifikke sekvens også findes i 77/80 kD-dublet-15 ten ca. 200 - 400, mere nøjagtig ca. 275 - 325 baser nedenfor 5’-endestillingen» · DK 169708 B1 36

APPENDIX A

1 GAATTCCCCGGATCTCTTATATTCCATTGACTTATTGGTCTATCTTTGTACCAGTAACAT EcoRI 581 CTTAAGGGGCCTAGAGAATATAAGGTAACTGAATAACCAGATAGAAACATGGTCATTGTA - 1 ecorl, 10 binl,

5 61 A CT AT CTT ATAGT AAGTTTT AATATTTGTTAGTATAATTC CTC CAA CTTTGCT CT CTTTG

TGAT AGAATAT CATTCAAAATTATAAA CAATCATATTAAGGAGGTTGAAACGAGAGAAAC

121 ATTTTT ATAT AAATTTTAGAATCATCTTGT CAATTTTAT CAATAAAA ATAT CTTCTGAGG T AAAAAT AT ATTT AAAAT CTT AGT AGAACAGTTAAAATAGTTATTTTTATAGAAGA CTCC

171 mboll,

181 TTTTGATAGGGATTACATTGATTCTGCAGATCAATTTGGGGGAGCATACCTCTTGACAAT AAAACTATCCCTAATGTAACTAAGACGTCTAGTTAAACCCCCTCGTATGGAGAACTGTTA

204 pstl,

10 241 ATTGAGTATTCCTGTCCATGAGCATGGTTTAGTTATTTATTTACATCTTTTAAATTTTCT

TAACTCATAAGGACAGGTACTCGTACCAAAT CAATAAATAAATGTAGAAAATTTAAAAGA

256 bstXI, 289 ahalll,

301 CTTGGCAATGTTTTTGTAAAAT-TTTAGTGTACAGGTCTTGCACATTTTT6TAAAGTGTAT GAACCGTTACAAAAACATTTTAAAATCACATGTCCAGAACGTGTAAAAACATTTCACATA

361 T CTTTGGT ATTTAATGCT ATT AT AAT ATTTTTT ATGGTAT CAGTTTTT GT CAATTGTGTT AGAAACCATAAATTACGATAATATTATAAAAAATACCATAGTCAAAAACAGTTAACACAA

η c 421 TTTCTAGAAATATGTCCCTTTCATCTAAGTTGTTTAATTTACTTGAAGTAAGTTATTTGT

AAAGATCTTTATACAGGGAAAGTAGATTCAACAAATTAAATGAACTTCATTCAATAAACA

423 xbal,

481 AATGTTCTTTTATCATCCTTATAATGTCTGTACTGATGTCTCCGTTTTCATACCTGATAT TTACAAGAAAATAGTAGGAATATTACAGACATGACTACAGAGGCAAAAGTATGGACTATA

541 TGTTATTTATATTTTATCTATTTTAAGTTTATCGCCTGCACCCACTAACTCGTCATCTAG ACAATAAATATAAAATAGATAAAATTCAAATAGCGGACGTGGGTGATTGAGCAGTAGATC

601 CATTAGGTATAT CTCCCAATGATATCCCTCGCCCCTCCCCCTAGTGCACATGTACCCTAA 20 GTAATCCATATAGAGGGTTACTATAGGGAGCGGGGAGGGGGATCACGTGTACATGGGATT

621 ecar5,

661 AACTTAAAGTATAATAAAAAAAAAAAGTTTGTCGCCTTTGTTATAGGTTCATCAAATTTA TTGAATTTCATATTATTTTTTTTTTTCAAACAGCGGAAACAATATCCAAGTAGTTTAAAT

721 CTAATCCTACCATAGGATCAAATTTTTGCTTTGTTCATCAGGTCATGGAATTAAAAAAAT GATTAGGATGGTATCCTAGTTTAAAAACGAAACAAGTAGTCCAGTACCTTAATTTTTTTA

A

735 binl,

781 TTTTTT GTTTT GTTT ATTTT CT ATGTTGAATTTTTATTTTTATTTTG CTTTGCATTT CAT 25 AAAAAACAAAACAAATAAAAGATACAACTTAAAAATAAAAATAAAACGAAACGTAAAGTA

841 TTATTT CTGGTCTTTTGTTATTATTCCAATACTTTCTCTGGATTCAGTTTTCTTTTTCTT AATAAAGACCAGAAAACAATAAT AAGGTTATGAAAGAGACCTAAGTCAAAAGAAAAAGAA

A

897 mboll,

901 CTTGACTTCTTGAGATTAAAACTTGGTTCATTGATTTTCAACATTTCTTACTTTTTAAAA GAACTGAAGAACT CTAATTTTGAACCAAGTAACTAAAAGTTGTAAAGAATGAAAAATTTT

A

954 ahalll,

no 961 GTTCATACAAAGCATAAATTTCCCTTTATATACTGCTTTAACCCCATATCACAAATTTTG CAAGT AT GTTT CGT ATTT AAAGGGAAAT AT ATGACGAAATT GGGGT AT AGTGTTT AAAAC

1021 ATGAGT CAT ATTTTT ATT AT CATTGA GTTTAAAATATTTTATAAATTTTA CGTTATTT CT TACTCAGTATAAAAATAATAGTAACTCAAATTTTATAAAATATTTAAAATGCAATAAAGA

1048 ahalll,

1081 TGTTTTATT CATAGTTATTTTACAGTGTTTTACTTAATTTCCCAATATATGGCGATTTTC ACAAAATAAGTATCAATAAAATGTCACAAAATGAATTAAAGGGTTATATACCGCTAAAAG

35 DK 169708 B1 37

1141 TGGCT CTCTCTCTGTTGCTGATTTATTTGTTTTACTGTGATCACATAACATACTCTATAT ACCGAGAGAGAGACAACGACTAAATAAACAAAATGACACTAGTGTATTGTATGAGATATA

1178 hall,

5 1201 TATTTCAATCATTTGAAATTTGTTGAGACTTGCTATATGCCCAGTGAATAATTTAATTTG

ATAAAGTTAGTAAACTTTAAACAACTCTGAACGATATACGGGTCACTTATTAAATTAAAC

1261 ATTAATGGCCCACTGCATTTGAAACAAATATGTCTTTGCTGTTATTGGGTAGAGTGTCAT TAATTACCGGGTGACGTAAACTTTGTTTATACAGAAACGACAATAACCCATCTCACAGTA

1321 ATATTTGCCTATTATGTCAAGTTGCTTTATCATGTTTTTAAAATCCTTATAAACTTCCTG TAT AAACGGATAATACAGTT CAACGAAAT AGTACAAAAATTTTAGGAATATTTGAAGGAC

1357 ahalll,

1381 ATATTTTATCTGTTTCTTACAGACATGGAGGAAACTGTGACATCTCTGTGATTGTTGAGT 10 TATAAAATAGACAAAGAATGTCTGTACCT CCTTTGACACTGTAGAGACACTAACAACTCA

1441 TTGTTATTTTGATTTTTGTATTTGTTAGTAAGAATGTTTCAAAATAAATGAGGCAATATA AACAATAAAACTAAAAACATAAACAATCATTCTTACAAAGTTTTATTTACTCCGTTATAT

1501 AAATCAGGTGCTTACAACTTTAAGGTTGTATTCTTATTAAATCAATTCTTTCATCTTTGT TTTAGT CCACGAATGTTGAAATTCCAACATAAGAATAATTTAGTTAAGAAAGTAGAAACA

1561 GAAATGTCCTTTTTGTCTGAAGTAGTACTTGTTGCCTTAAACGT CTGCATTGTCTAAAAT CTTTACAGGAAAAACAGACTTCATCATGAACAACGGAATTTGCAGACGTAACAGATTTTA

1584 seal,

15 1621 TTATACACCTGCACTATCATATTTATTTTGCTTAATGTTTGTGTGGTATATATTTCCCAT

AATATGTGGACGTGATAGTATAAATAAAACGAATTACAAACACACCATATATAAAGGGTA

1681 T CTTTT CTTTT CAACCTATCTCTATC CTT AT ATTT A CA GTGTGT CTTTTTT AA CATTTT C AGAAAAGAAAAGTTGGATAGAGATAGGAATATAAATGTCACACAGAAAAAATTGTAAAAG

1741 TGTAGTGCAAGTCTGTTGGTTAATTAATTTTGTCAGTTTTTGCTTCTCTGAAAAGTCTTT ACATCACGTTCAGACAACCAATTAATTAAAACAGTCAAAAACGAAGAGACTTTTCAGAAA

1801 ATTTCTGTTTTTGAATTATATCTTCACTGTGTATAGAATTCTGGGTTTGTGGTTGTTGTT EcoRI #61 TAAAGACAAAAACTTAATATAGAAGTGACACATATCTTAAGACCCAAACACCAACAACAA - 1821 mball, 1836 ecorl, 1861 TTT GTTTT ATT A CATTTT GTTTT ATTGGTTTTT CCCT CAG CACTTT AAAAATG CCGCTCC aaacaaaataatgtaaaacaaaataaccaaaaagggagtcgtgaaatttttacggcgagg 1904 ahalll, 1921 attgtttctacttgcatagtttttcacaataagtttgttgtaattcccatttgcattcaa taacaaagatgaacgtatcaaaaagtgttattcaaacaacattaagggtaaacgtaagtt 1981 ctgtacataatgtatctttttaaaaaaatctggatggcttcaagctctttactttgattt

^ GACATGT ATTACAT AGAAAAATTTTTTT AGACCTACCGAAGTT CGAGAAATGAAACT AAA

1999 ahalll,

2041 TT GT GT GTGT GT GTGT GTGTGT GT GTGTGTGTGTGTGTGTGTTA CTTTGG CATTCTCTAG AACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAATGAAACCGTAAGAGATC

2101 GCTT ATT CAATCTGTAATTTGGTAT CATTAATTTTGAAAAATATTTAT CAT CTGTGT CTT CGAATAAGTTAGACATTAAACCATAGTAATTAAAACTTTTTATAAATAGTA6ACACAGAA

2157 mball,

2161 CAAATATTGCTTCTAATTCTTTCTCTTCTTCTGGTATTGCATTTACATATATTATACTGT 30 GTTTATAACGAAGATTAAGAAAGAGAAGAAGACCATAACGTAAATGTATATAATATGACA

2184 mball, 2187 mball,

2221 T CAATTTTGTCACACAGCTCTTGAATATGCTGTT CTAGTTTGTTTTCTAACTATTTTTCC

agttaaaacagtgtgtcgagaacttatacgacaagatcaaacaaaagattgataaaaagg

2281 TTCTAGTTGTTCAGTTTTGTTGACATTTATTGACCTATTTTTACTTCAGTAATTGTTTCC AAGATCAACAAGTCAAAACAACTGTAAATAACTGGATAAAAATGAAGTCATTAACAAAGG

2341 TGGGTTGTTGAGTTAATTGATGAACTCATAGATGACATACAATTTATCTTTTTATT CTTG ACCCAACAACTCAATTAACTACTTGAGTATCTACTGTATGTTAAATAGAAAAATAAGAAC

35 DK 169708 B1 38

2401 TGTCACTTGTGCTT7TGATGTCACAT CTAGGAAGGCTTTGTCTAGCCCAAGGCCACATTT ACAGTGAACACGAAAACTACAGTGTAGATCCTTCCGAAACAGATCGGGTTCCGGTGTAAA

2461 ACTTCCATATTTTCTTCTAAGAGTTTGATAGTTGTAGCTGTTACATATATGTCTATGATC 5 TGAAGGTATAAAAGAAGATT CTCAAACTAT CAACAT CGACAATGTATATACAGATACT AG

2473 mball,

2521 T AGTTT GAATAAATTTTT GTGTATGGTGTGAAGAAGAGGTCTAACCT CTTTTTTATTTTT ATCAAACTTATTTAAAAACACATACCACACTTCTTCTCCAGATTGGAGAAAAAATAAAAA

2550 mball, 2553 mball,

2581 TGCATGTAAACATCCAGTTGTCCCGGCACCATTTGTTGAAAATATGATTCTTTTCCCATT ACGTACATTTGTAGGTCAACAGGGCCGTGGTAAACAACTTTTATACTAAGAAAAGGGTAA

- n 2641 AAGTCATCTTGACACCCTTGTTGAAAATCAATTGACCATAAATGTGAGAGTTTATTTCTG 10 TTCAGTAGAACTGTGGGAACAACTTTTAGTTAACTGGTATTTACACTCTCAAATAAAGAC

2701 AACTCTCCATTCTGTTCCATTGACCCATACGTCTTCTATAAATTCCTTATAGCTAATTCT TTGAGAGGTAAGACAAGGTAACTGGGTATGCAGAAGATATTTAAGGAATATCGATTAAGA

2732 mball,

2761 ACATTAGACTTTGGTTTTTCAGATGTGGTCATCTCATTAGATTATGGTGATATGTTTGGT TGTAATCTGAAACCAAAAAGTCTACACCA6TAGAGTAATCTAATACCACTATACAAACCA

2821 T ACAAGTTTTAT CTTCTC CTTGG CAA CATTTTTTTTATTA CTGCT CTTCTTTTATT CGTT ATGTTCAAAATAGAAGAGGAACCGTTGTAAAAAAAATAATGACGAGAAGAAAATAAGCAA

2832 mball, 2865 mball,

2881 TTTGTTSTT C CTTT CT CTTTTT GT GAGACAGGGT CT CACT CTGTTGCCCAGGGTGGAGTA AAACAACAAGGAAAGAGAAAAACACTCTGTCCCAGAGTGAGACAACGGGTCCCACCTCAT

2907 tthIIIl,

2941 AGTGGTGTGATCATGGCTCACTGCAGCCTCAACCTCCTGGGCTCAAGCAATCCTCCCACC • TCACCACACTAGTACCGAGTGACGTCGGAGTTGGAGGACCCGAGTTCGTTAGGAGGGTGG

2948 bcll, 2961 pstl, 20

3001 TCAGCCTCCCAAGTAGTGGGACTACAGGCATGCACCATCATGCCAGGCTAACTTTTTTAT AGTCGGAGGGTTCATCACCCTGATGTCCGTACGTGGTAGTACGGTCCGATTGAAAAAATA

3028 sphl,

3061 TTTTTGTAGAGACAGGGTCTTGCTTTGTTGCCCAGGCTGGTCTT6AACTCCAAGCTCAAG AAAAACATCTCTGTCCCAGAACGAAACAACGGGTCCGACCAGAACTTGAGGTTCGAGTTC

3071 tthIIIl, 3121 CAATCCTCCAACCTCAGCTTCCCAAAGTGCTGGGATTACCAGTATGAGCCACTGCACCTG 25 GTTAGGAGGTTGGAGTCGAAGGGTTTCACGACCCTAATGGTCATACTCGGTGACGTGGAC · 3142 bsfcXl,

3181 G C CTTGTTGTTC CTTTCTT C CTTTT AT CTTGT AGTAT CTTGATCCTTTTTGCTT ATTATT CGGAACAACAAGGAAAGAAGGAAAATAGAACATCATAGAACTAGGAAAAACGAATAATAA

3196 mball,

3241 TATCATTGAGGTGAGTTTGTTCTAAATAAACTTTTCGCAGAAAGTTTATGTAGATATATT

atagtaactccactcaaacaagatttatttgaaaagcgtctttcaaatacatctatataa 3301 AATATCAATGAGGCATTAGGAGTGAGTTTTAGATTAGCAGGAATTCTCTTATGAAAGGTA EcoRI #79 30 TTATAGTTACTCCGTAATCCTCACTCAAAATCTAATCGTCCTTAAGAGAATACTTTCCAT - 3341 ecorl,

3361 TTGATTGTATGTGTGAGTTTTCAGCCTTTACTTCTCTCCAGCCCATCAAGATCAAAGCTG AACTAACATACACACTCAAAAGTCGGAAATGAAGAGAGGT CGGGTAGTT CTAGTTT CGAC

3418 pstl,

3421 CAGAGTTGTTTACATTTCAGAATTTCTTTCCTCCCCTCCCCACCTTGCAAAACAGACTTA GTCTCAACAAATGTAAAGT CTTAAAGAAAGGAGGGGAGGGGTGGAACGTTTTGT CTGAAT

35 DK 169708 B1 39

3481 CAGTGCAAAAATGACTTGTCAATGTGATTCTTTCTTCTGGTCCCATCTTTCCTACCTTTT GTCACGTTTTTACTGAACAGTTACACTAAGAAAGAAGACCAGGGTAGAAAGGATGGAAAA

3513 mboll, 5

J 3541 GAGACTTGTGTTGAAAGGAGTCCAGTAAAACCACCGATGCTAGCTTGTATACCCTGATCC CTCTGAACACAACTTTCCTCAGGTCATTTTGGTGGCTACGATCGAACATATGGGACTAGG

3601 CATTGTTATAATGAATGACTGACTGTTTTTCATATCAAAGTATAATACTTGCACCTTGAT GTAACAATATTACTTACTGACTGACAAAAAGTATAGTTTCATATTATGAACGTGGAACTA

3661 AGAAGAAAGAAACAAGGCCAGGCACAGTGGTTCATGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAG TCTTCTTTCTTTGTTCCGGTCCGTGTCACCAAGTACGGACATTAGGGTCGTGAAACCCTC

3662 mboll, 3706 bstXI,

1 n 3721 GCTGAAGTAGGAGGAATAATTAGACTTTGATATTAAAAATGGGGAAGATATGGCGGTATA

χυ CGACTTCATCCTCCTTATTAATCTGAAACTATAATTTTTACCCCTTCTATACCGCCATAT

A

3764 mboll,

3781 AGATATGAGGAAGTATGTCTTCTTGGACTTTTCTSAAATCTGCCAGCCATGAGCATCCAC TCTATACTCCTTCATACAGAAGAACCTGAAAAGACTTTAGACGGTCGGTACT CGTAGGTG

3798 mboll,

3841 TCTTTTTATCTTTTGATACCTGTTTTATATTAACTATACTTCTATTTTGTGGTTTCATGG AGAAAAATAGAAAACTATGGACAAAATATAATTGATATGAAGATAAAACACCAAAGTACC

15 3901 CTTCAGATATCTTCCAGCTTAATTGTACTCTGTCTTTAATTATTTGCAGCAATTTCTGAA

GAAGTCTATAGAASGTCGAATTAACATGAGACAGAAATTAATAAACGTCGTTAAAGACTT

3906 ecorS, 3.91.0 mboll,

3961 AGGAGCAAGAAGAAAGGCCAGCCCTTTCTTCACTACCTTAAAAACTGGTCAT CTTTTGAA T CCT CGTT CTT CTTT C CGGT CGGGAAAGAAGT GAT GGAATTTTT GACCA6T AGAAAACTT

A A

3969 mboll, 3987 mboll,

4021 ACCCCATGAAAGGCACAGTGGGTGACCATCTACATCAGGAGTGGGCAAACTATGGCCCTT TGGGGTACTTTCCGTGTCACCCACTGGTAGATGTAGTCCTCACCCGTTTGATACCGGGAA

20 4041 bstE2,

4081 GGGTAGTCTGGTCTCTGTCCGTTTTTGTAAGGTTTTATTGGAACCCATACACACACAAAC CCCATCAGACCAGAGACAGGCAAAAACATTCCAAAATAACCTTGGGTATGTGTGTGTTTG

4141 TGATCATCTCTTGTTATGTGTTAAGTTTTCTTATAATTATTCTTTTCTATTTCATCCAGC ACTAGTAGAGAACAATACACAATTCAAAAGAATATTAATAAGAAAAGATAAAGTAGGTCG

A A

4141 bell, 4197 pvull,

4201 TGAATTA C CATTT CA C CTTGTGTATG C CCTTT CCAGT CTTAAATTATAGAAGCTATGT CT 25 ACTTAATGGTAAAGTGGAACACATACGGGAAAGGTCAGAATTTAATATCTTCGATACAGA

4261 TTGTGGTTTTAAATTATGGAAGCTGTGCCTTCTTGTGTTTTAGTATGGCAAGATATTTGT AACACCAAAATTTAATACCTTCGACACGGAAGAACACAAAATCATACCGTTCTATAAACA

4268 ahalll,

4321 T CTTACTTTTCCT CTAGAATCTGCAGTGGATTACTTTCAGAAGTAGGTATTGCCTCTAAG AGAATGAAAAGGAGATCTTAGACGTCACCTAATGAAAGTCTTCATCCATAACGGAGATTC

4333 xbal, 4341 'pstl,

_n 4381 TTTCCTGACTTCTGTTTCCTTCTCCCTGTTCTGTAGTATATTTATAGATTGCATGTTTTC JO AAAGGACTGAAGACAAAGGAAGAGGGACAAGACAT CATATAAATATCTAACGTACAAAAG

4441 TCGTCCTTAAACAAGGTACAAATATGTTCTGATCAAGGTTTGCTAGCCGAGAGGATAAST AGCAGGAATTTGTTCCATGTTTATACAAGACTAGTTCCAAACGATCGGCTCTCCTATTCA

A

4470 bell, 4501 GGCTTGCTCTTAGCCTAACTCTCTGTCTACTTAATGGATGTCGAATTCCCTTCTCAACTC EcoRI #70-3 CCGAACGAGAATCGGATTGAGAGACAGATGAATTACCTACAGCTTAAGGGAAGAGTTGAG -

A

45 43 scai-l , : 35 DK 169708 B1 40

4561 AACAGCTAGTAACTAGTTCCAAGATCGGATAATAGCTTACAGAATTAATTAGTTCAGTGA TTGTCGATCATTGATCAAGGTTCTAGCCTATTATCGAAJGTCTTAATTAATCAAGTCACT

4621 AAGCCCTGGTTTGATCACAGAGGCAGGAGACTGATC7ATA7ATTTGTAGTGCTGACTA6A 5 TTCGGGACCAAACTAGTGTCTCCGTCCTCTGACTAGATATATAAACATCACGACTGATCT

4632 bcll,

4681 CCCCAACTTGGCCAGATAGCTTATACCTATGTCAGAAGTTGGAGGAGGAGATTGACAGCT GGGGTTGAACCGGTCTATCGAATATGGATACAGTCTTCAACCTCCTCCTCTAACT6TCGA

4689 ball, 4736 pvull,

4741 GAGGTGTCTCCAAGGGAATTACAATTATTTTCATTTTCTTTGTGTCTGTAATTATGTCTC CTCCACAGAGGTTCCCTTAATGTTAATAAAAGTAAAAGAAACACAGACATTAATACAGAG

- _ 4801 TTTT CTT A CTT CAAATTTT GT AT AT GT GAAATTT CTT AATTTTT ATTTGGTT ATTTATTT

10 AAAAGAATGAAGTTTAAAACATATACACTTTAAAGAATTAAAAATAAACCAATAAATAAA

4861 TATTGACTTTTT CATCAAACAACCAACTCTAAGTTCTTGGATTGAAATTTATGAATTAAT ATAACTGAAAAAGTAGTTTGTTGGTTGAGATTCAAGAACCTAACTTTAAATACTTAATTA

4921 TATAATGTTTTAAATTTACCATTAGTCACACATACAATACAAAAAGATATTTTCATTACA ATATTACAAAATTTAAATGGTAATCAGTGTGTATGTTATGTTTTTCTATAAAAGTAATGT

Λ 4929 ahalll,

4981 AAATTTTAACCCAAGCCATTAAAACTAAACTCCAGCTTGGTCACCATTCCTAATACCAGG , _ TTTAAAATTGGGTTCGGTAATTTTGATTTGAGGTCGAACCAGTGGTAAGGATTATGGTCC

15 5019 bst52,

5041 CCCCTCTCAGAGGAGGGTAAATAAAAGTCCATTTTGGTAACTAGTTTGACGAGAATCTCT GGGGAGAGTCTCCTCCCATTTATTTTCAGGTAAAACCATTGAT CAAACTGCTCTTAGAGA

5101 AATTGTTTCCCTGTTTTTCTTATAATGTCTGCCTTTGAATTATCCTCTTTTTTTCAAGAG TT AA CAAAGGGACAAAAAGAATATTACAGACGGAAA CTTAATAGGAGAAAAAAAGTT CT C

5161 TTCCATCATATAATGTATTCCTTTTTGCTTACAGATTGACCTCCTAGAGGCATGCATCCC AAGGT AGT AT ATTACAT AAGGAAAAACGAAT GT CT AACT GGAGGAT CT CCGTACGT AGGG

20 5210 sphl, 5212 ava3,

5221 CCTGCTCCAGTCTGAGCTGGTTCTCTCTAGGCCTGAGGCTCAGTTATCAACTTGGGACTT GGACGAGGTCAGACTCGACCAAGAGAGATCCGGACTCCGAGTCAATAGTTGAACCCTGAA

5222 tthIIIl, 5249 stul, 5252 mstll,

5281 TTATTTACCCTCCCTCAGGATAGGTACCTGGTTCTTGGATACCAGGTCTTACTCTTGTTT AATAAATGGGAGGGAGTCCTATCCATGGACCAAGAACCTATGGTCCAGAATGAGAACAAA

5293 mstll, 5303 kpnl,

λγ 5341 GAGATACTCCTTTATTTTGGTGGCAAACATTCCATAATCACTTCCTGATAATGGTGACAT CTCTATGAGGAAATAAAACCACCGTTTGTAAGGTATTAGTGAAGGACTATTACCACTGTA

5401 TTGAGGTAGATTTTCTGAGTCTTTATATGTTAGAATATGTTTTTATTCTCCTTTGCCACT AACT CCAT CT AAAAGACT CAGAAATATACAAT CTTATACAAAAATAAGAGGAAACGGTGA

5461 TGATTGATAATTTGGCTGCACATAGAATGTAAGCATTCACAGGGCTTTTGGGAGCAGCTT ACTAACTATTAAACCGAC6TGTATCTTACATTCGTAAGTGTCCCGAAAACCCTCGTCGAA

5521 CCCTTGAGAAGAAGGTGGATGCAGTTAAGATCTTCCCTGAAAAGACTGTGTGAAATGACA GGGAACTCTTCTTCCACCTACGTCAATTCTAGAAGGGACTTTTCTGACACACTTTACTGT

M MM

30 5528 mboll, 5548 bglll, 5551 mball,

5581 AGGCTATTGAGGTACCCAACGGGTAGCTTGGTAAAGGTGTATCTTGTCTCTTATGTTTAT TCCGATAACTCCATGGGTTGCCCATCGAACCATTTCCACATAGAACAGAGAATACAAATA

5591 kpnl, 5639 ava3,

5641 GCATCTACTTTACCACCATGTAATTAGCCTATTATAACTTGTTGCATTCCTTCACTCAGC CGTAGATGAAATGGTGGTACATTAATCGGATAATATTGAACAACGTAAGGAAGTGAGTCG

5701 TAATCTTGTTCATGGTAGAAATTAATATTGCTAGTACCATGGTAGAATTTTATATTAGCT

attagaacaagtaccatctttaattataacgatcatggtaccatcttaaaatataatcga 35 5737 ncal, DK 169708 B1 41

761 GGATCCTAGACCTAAATGCTCCTTCCTTGTGCTTACATATTCTGCAAGTGGGTGACAGTG CCTAGGATCTGGATTTACGAGGAAGGAACACGAATGTATAAGACGTTCACCCACTGTCAC

5761 bamhl binl,

5 321 GATGCTAGGTATTGTGTTATGTGATTTCAATGTATTATATGATGGGGTAGATACTATTAG

ctacgatccataacacaatacactaaagttacataatatactaccccatctatgataatc 851 cctcatttgaaaattagaaacctattgttcagaaagtttaagtgactttctcaaagtcac ggagtaaacttttaatctttggataacaagtctttcaaattcactgaaagagtttcagtg 941 acagctggtaaatggtagaactgggatttgaatccaggcaatctgatggatttaagagga tgtcgaccatttaccatcttgaccctaaacttaggtccgttagactacctaaattctcct

A

5942 pvull,

1 n .001 ACCTGTGCCACTATGTGATATAGCAATAACATCTAGCCAATATAAATACTTTCCTGAATT

TGGACACGGTGATACACTATATCGTTATTGTAGATCGGTTATATTTATGAAAGGACTTAA

,061 AAATCACTGTCATATTCAGAGAGTTCTGTGTCACTATTAAGACCCTCCATTATTGTGTAT TTT AGTGA CAGT AT AAGT CT CT CAAGACA CAGT GAT AATT CTGGGAGGTAATAACACAT A

6063 ecopDXI,

,121 ATTAATTACATTTCCCTATTTTAATCCCAATATCTATTCATTTTTATCACAGTCCTTTCT TAATTAATGTAAAGGGATAAAATTAGGGTTATAGATAAGTAAAAATAGTGTCAGGAAAGA

,181 TATGGTCACAAACAGGCATAGTACAACAGCAGCAATGCAAAAACCACTTTTATATTACAT 15 ATAOCAGTGTTTGTCCGTATCATGTTGTCGTCGTTACGTTTTTGGTGAAAATATAATGTA

,241 GTTCCAGGGATTTAACCCAATGACCTGTGATATAATGATACTGACTAGTATTTTTTCATT CAAGGTCCCTAAATTGGGTTACTGGACACTATATTACTATGACTGATCATAAAAAAGTAA

,301 TATCTGGGAATGGGAGAGAACCTCTAACAGAACGTTTTAGAATCTGTGTTATGAGTAACC atagacccttaccctctcttggagattgtcttgcaaaatcttagacacaatactcattgg

b361 AGAGTCTTAGTTCTTCCTCATCTCCAGGTCTATGGATTCTGGGGTGCCACAACTCAGACT TCTCAGAATCAAGAAGGAGTAGAGGTCCAGATACCTAAGACCCCACGGTGTTGAGTCTGA

A Λ 6372 mboll, 6334 bstXI,

20 b421 TTCGGAAGCAGAGGCATGACCGCCTTACTGAAGGTTTCTAGTTGTGACAAGAACACTGGT

AAGCCTTCGTCTCCGTACTGGCGGAATGACTTCCAAAGATCAACACTGTTCTTGTGACCA

6481 GATTATTACGAGGACAGTTATGAAGATATTTCAGCATACTTGCTGAGTAAAAACAATGCC CTAATAATGCTCCTGTCAATACTTCTATAAAGTCGTATGAACGACTCATTTTTGTTACGG

6502 mboll, S541 ATTGAACCAAGAAGCTTCTCCCAGAATTCAAGACACCCTAGCACTAGGCAAAAGCAATTT 4.3kbEcoRI T AA CTTGGTT CTT CGAAGAGGGT CTT AAGTT CTGTGGGAT CGTGATCCGTTTT CGTT AAA - Λ Λ 6552 hindlll, 6564 ecarl, 25

6601 AATGCCACCACAATTCCASAAAATGACATAGAGAAGACTGACCCTTGGTTTGCACACAGA TTACGGTGGTGTTAAGGTCTTTTACTGTATCTCTTCTGACTGGGAACCAAACGTGTGTCT

6633 mboll,

5661 ACACCTATGCCTAAAATACAAAATGTCTCCTCTAGTGATTTGTTGATGCTCTTGCGACAG TGTGGATACGGATTTTATGTTTTACAGAGGAGATCACTAAACAACTACGAGAACGCTGTC

A

6716 tthIIIl,

6721 AGTCCTACTCCACATGGGCTATCCTTATCTGATCTCCAAGAAGCCAAATATGAGACTTTT

3Q tcaggatgaggtgtacccgataggaatagactagaggttcttcggtttatactctgaaaa 6781 tctgatgatccatcacctggagcaatagacagtaataacagcctgtctgaaatgacacac agactactaggtagtggacctcgttatctgtcattattgtcggacagactttactgtgtg

6841 TTCAGGCCACAGCTCCATCACAGTGGGGACATGGTATTTACCCCTGAGTCAGGCCTCCAA AAGTCCGGTGTCGAGGTAGTGTCACCCCTGTACCATAAATGGGGACTCAGTCCGGAGGTT

6855 bstXI, 6884 tthIIIl, 6891 stul, 6901 ttaagattaaatgagaaactggggacaactgcagcaacagagttgaagaaacttsatttc aattctaatttactctttgacccctgttgacgtcgttgtctcaacttctttgaactaaag 35 6929 pstl, 6945 mboll, DK 169708 B1 42

i.961 AAAGTTTCTAGTACATCAAATAATCTGATTTCAACAATTCCATCAGACAATTTGGCAGCA TTTCAAAGAT CATGTAGTTTATTAGA CTAAAGTTGTTAAGGTAGT CTGTTAAA C CGT CGT

7021 GGTACTGATAATACAAGTTCCTTAGGACCCCCAAGTATGCCAGTTCATTATGATAGTCAA 5 CCATGACTATTATGTTCAAGGAATCCTGGGGGTTCATAC6GTCAAGTAATACTATCAGTT

7040 mstll,

7031 TTAGATACCACTCTATTTGGCAAAAAGTCATCTCCCCTTACTGAGTCTGGTGGACCTCTG AATCTATGGTGAGATAAACCGTTTTTCAGTAGAGGGGAATGACTCAGACCACCTGGAGAC

7141 AGCTTGAGTGAAGAAAATAATGATTCAAAGTTGTTAGAATCAGGTTTAATGAATAGCCAA TCGAA CTCACTT CTTTTATTACTAAGTTT CA A CA AT CTTAGTCCAAATTACTTAT CGGTT

7150 mball,

i n 7201 GAAAGTTCATGGGGAAAAAATGTATCGTCAACAGAGAGTGGTAGGTTATTTAAAGGGAAA

xu CTTTCAAGTACCCCTTTTTTACATAGCAGTTGTCTCTCACCATCCAATAAATTTCCCTTT

A

7249 ahalll,

7261 AGAGCTCATGGACCTGCTTTGTTGACTAAAGATAATGCCTTATTCAAAGTTAGCATCTCT TCT CGAGTAC CTGGA CGAAA CAACTGATTT CTATTAC6GAATAAGTTT CAAT CGTAGAGA

7262 sacl,

7321 TTGTTAAAGACAAACAAAACTTCCAATAATTCAGCAACTAATAGAAAGACTCACATTGAT AA CAATTTCTGTTTGTTTTGAAGGTTATTAAGT CGTTGATTAT CTTT CTGAGTGTAACTA

15 7381 6GCCCATCATTATTAATTGASAATAGTCCATCAGTCTGGCAAAATATATTAGAAAGTGAC

CCGGGT AGT AAT AATTAACT CTT AT CAGGT AGT CAGACCGTTTTAT AT AAT CTTT CACTG

7403 bstXI,

7441 ACTGAGTTTAAAAAAGTGA CACCTTTGATTCATGACAGAATGCTTATGGACAAAAATGCT T GACT CAAATTTTTT CACT GTGGAAACT AAGTACTGT CTT ACGAAT ACCT GTTTTT A CGA

7447 ahalll,

7501 ACAGCTTTGAGGCTAAATCATATGTCAAATAAAACTACTTCATCAAAAAACATGGAAATG „ Λ TGTCGAAACT C CGATTT AGT AT A C AGTTT ATTTT GAT GAAGT AGTTTTTT GT A C CTTTAC

20 7519 ndel,

7561 GTCCAACAGAAAAAAGAGGGCCCCATTCCACCAGATGCACAAAATCCAGATATGTCGTTC CAGGTTGTCTTTTTTCTCCCGGGGTAAGGTGGTCTACGTGTTTTAGGTCTATACAGCAAG

7578 apal,

7621 TTTAAGATGCTATTCTTGCCAGAATCAGCAAGGTGGATACAAAGGACTCATGGAAAGAAC AAATTCTACGATAAGAACGGTCTTAGTCGTTCCACCTATGTTTCCTGAGTACCTTTCTTG

7681 TCTCTGAACTCTGGGCAAGGCCCCAGTCCAAAGCAATTAGTATCCTTAGGACCAGAAAAA 25 AGAGA CTTG AG A C C CGTT C C6GGGT CA5GTTT CGTT AAT CAT AGGA AT C CTGGT CTTTTT

7724 mstll,

7741 TCTGTGGAAGGTCAGAATTTCTTGTCTGAGAAAAACAAAGTGGTAGTAGGAAAGGGTGAA AGACACCTTCCAGTCTTAAAGAACA6ACTCTTTTTGTTTCACCATCATCCTTTCCCACTT

7801 TTTACAAAGGACGTAGGACTCAAAGAGATG6TTTTTCCAAGCAGCAGAAACCTATTTCTT AAAT GTTT C CTGCAT C CT GAGTTT CT CTA CCAAAAAGGTT CGT CGT CTTTGGAT AAAGAA

7861 ACTAACTTGGATAATTTACATGAAAATAATACACACAATCAAGAAAAAAAAATTCAGGAA TGATTGAACCTATTAAATGTACTTTTATTATGTGTGTTAGTTCTTTTTTTTTAAGTCCTT

30 7918 mholl,

7921 GAAATAGAAAAGAAGGAAACATTAATCCAAGAGAATGTAGTTTTGCCTCAGATACATACA CTTT AT CTTTT CTT C CTTT GT AATT AGGTT CT CTT A C AT CA AA A CGGAGTCT ATGT ATGT

7981 GTGACTGGCACTAAGAATTTCATGAAGAACCTTTTCTTACTGAGCACTAGGCAAAATGTA CACTGACCGTGATTCTTAAAGTACTTCTTGGAAAAGAATGACTCGTGATCCGTTTTACAT

A * 8004 mball, 8007 xmnl,

8041 GAAGGTTCATATGACGGGGCATATGCTCCAGTACTTCAAGATTTTAGGTCATTAAATGAT _ CTTCCAAGTATACTGCCCCGTATACGAGGTCATGAAGTTCTAAAATCCAGTAATTTACTA

35 Λ 2042 ndsl, 2C5C ndal, 8070 seal, DK 169708 B1 43

2101 TCAACAAATAGAACAAAGAAACACACAGCTCATTTCTCAAAAAAAGGGGAGGAAGAAAAC AGTTGTTTATCTTGTTTCTTTGTGTGTCGA6TAAAGAGTTTTTTTCCCCTCCTTCTTTTG

8152 mball,

5 3161 TTGGAAGGCTTGGGAAAT CAAACCAAGCAAATTGT AGAGAAATATGCATGCACCACAAGG

AACCTTCCGAACCCTTTAGTTTGGTTCGTTTAACATCTCTTTATACGTACGTGGTGTTCC

Λ *+ A

8204 ava3, 8206 sphl, 8220 ecar5,

3221 ATATCTCCTAATACAAGCCAGCAGAATTTTGTCACGCAACGTAGTAAGAGAGCTTTGAAA TATAGAGGATTATGTTCGGTCGTCTTAAAACAGTGCGTTGCATCATTCTCTCGAAACTTT

A

8277 xmnl,

3281 CAATTCAGACTCCCACTAGAAGAAACAGAACTTGAAAAAAGGATAATTGTGGATGACACC GTTAAGTCTGAGGGTGAT CTT CTTTGTCTTGAACTTTTTTCCTATTAACACCTACTGTGG

10 8299 mball,

3341 TCAACCCAGTGGTCCAAAAACATGAAACATTTGACCCCGAGCACCCTCACACAGATAGAC

agttgggtcaccaggtttttgtactttgtaaactggggctcgtgggagtgtgtctatctg 8376 aval,

8401 TACAATGAGAAGGAGAAAGGGGCCATTACTCAGTCTCCCTTATCAGATTGCCTTACGAGG ATGTTACTCTTCCTCTTTCCCCGGTAATGAGTCAGAGGGAATAGTCTAACGGAATGCTCC

3461 AGTCATAGCATCCCTCAAGCAAATAGATCTCCATTACCCATTGCAAAGGTATCATCATTT 15 T CAGTAT CGTAGGGAGTT CGTTT AT CT AGAGGTAATGGGTAACGTTTCCATAGTAGT AAA

8485 bg 111,

3521 CCATCTATTAGACCTATATATCTGACCAGGGTCCTATTCCAAGACAACTCTTCTCATCTT GGT AGAT AAT CTGGATATATAGACTGGTCCCAGGATAAGGTTCTGTTGAGAAGAGTAGAA

A A

8569 mball, 8577 mball,

8581 CCAGCAGCATCTTATAGAAAGAAAGATTCTGSGGTCCAAGAAAGCAGTCATTTCTTACAA GGTCGTCGTAGAATATCTTTCTTTCTAAGACCCCAGGTTCTTTCGTCAGTAAAGAATGTT

o n 8641 GGAGCCAAAAAAAATAACCTTTCTTTAGCCATTCTAACCTTGGAGATGACTGGTGATCAA

CCTCGGTTTTTTTTATTGGAAAGAAATCGGTAAGATTGGAACCTCTACTGACCACTAGTT

A

8694 bell,

8701 AGAGAGGTTGGCTCCCTGGGGACAAGTGCCACAAATTCAGTCACATACAAGAAAGTTGAG TCTCTCCAACCGAGGGACCCCTGTT CACGGTGTTTAAGTCAGTGTAT6TTCTTTCAACTC

S 761 AACACTGTTCTCCCGAAACCAGACTTGCCCAAAACATCTGGCAAAGTTGAATTGCTTCCA TTGTGACAAGAGGGCTTTGGTCTGAACGGGTTTTGTAGACCGTTTCAACTTAACGAAGGT

A

8809 xmnl,

25 8821 AAAGTTCACATTTAT-CAGAAGGACCTATTCCCTACGGAAACTAGCAATGGGTCTCCTGGC

TTTCAAGTGTAAATAGTCTTCCTGGATAAGGGATGCCTTTGATCGTTACCCAGAGGACCG

A

8877 ball,

8881 CATCTGGATCTCGTGGAAGGGAGCCTTCTTCAGGGAACAGAGGGAGCGATTAAGTGGAAT GTAGACCTAGAGCACCTTCCCTCGGAAGAAGTCCCTTGTCTCCCTCGCTAATTCACCTTA

8886 binl, 8907 mball,

8941 GAAGCAAACAGACCTGGAAAAGTTCCCTTTCTGAGAGTAGCAACAGAAAGCTCTGCAAAG

cttcgtttgtctggaccttttcaagggaaagactctcatcgttgtctttcgagacgtttc 30

9001 ACTCCCTCCAAGCTATTGGATCCTCTTGCTTGGGATAACCACTATGGTACTCAGATACCA TGAGGGAGGTTCGATAACCTAGGAGAACGAACCCTATTGGTGATACCATGAGTCTATGGT

9008 bstxi, 9018 bamhl binl,

9061 AAAGAAGAGTGGAAATCCCAAGAGAAGTCACCAGAAAAAACAGCTTTTAAGAAAAAGGAT TTTCTTCTCACCTTTAGGGTTCTCTTCAGTGGTCTTTTTTGTCGAAAATTCTTTTTCCTA

A

9064 mball,

9121 ACCATTTTSTCCCTGAACGCTTGTGAAAGCAATCATGC'AATAGCAGCAATAAATGAGGGA 25 TGSTAAAACAGGGACTTGCGAACACTTTCGTTAGTACGTTATCGTCGTTATTTACTCCCT

DK 169708 B1 44

7181 CAAAATAAGCCCGAAATAGAAGTCACCTGGGCAAAGCAAGGTAGGACTGAAAGGCTGTGC GTTTTATT CGGGCTTTAT CTT CAGTGGACCCGTTTCGTTCCATCCTGACTTT CCGACACG

7241 TCTCAAAACCCACCAGTCTTGAAACGCCATCAACGGGAAATAACTCGTACTACTCTTCAG 5 AGAGTTTTGGGTGGTCAGAACTTTGCGGTAGTTGCCCTTTATTGAGCATGATGAGAAGTC

9294 mboll,

9301 TCAGATCAAGAGGAAATTGACTATGATGATACCATATCAGTTGAAATGAAGAAGGAAGAT AGT CT AGTT CT CCTTT AA CTGATACTA CT ATGGT AT AGT CAA CTTTACTT CTT C CTT CTA

9348 mboll, 9355 mboll,

7361 TTTGACATTTATGATGAGGATGAAAATCAGAGCCCCCGCAGCTTTCAAAAGAAAACACGA AAACTGTAAATACTACTCCTACTTTTAGTCTCGGGGGCGTCGAAAGTTTTCTTTTGTGCT

- n 9421 CACTATTTTATTGCTGCASTGGAGAGGCTCTGGGATTATGGGATGAGTAGCTCCCCACAT

10 GTGATAAAATAACGACGTCACCTCT CCGAGACCCTAATACCCTACTCATCGA6GG6TGTA

9434 pstl,

9481 GTTCTAAGAAACAGGTATGAATGCATTGGTTATTCCTTTGCTCTGCTCTTGTGACATTTG CAAGATTCTTTGT CCATACTTACGTAACCAATAAGGAAACGAGACGAGAACACTGTAAAC

9501 ava3,

9541 ACTTTACCAGATGATGACACCAACAATGAGAGTTAGAGGATGAAAAATCAAGGTGTCTTG TGAAAT GGT CTA CTA CT GT GGTT GTT A CT CT CAAT CT C CTACTTTTTAGTT CCACAGAAC

15 9601 AAACTCTTACTCTGGTGASATAGAGAGAAGAGAGGTTTACAASAGGGTAGAGGAATCAGG

TTTGAGAATGAGACCACTCTATCTCTCTTCTCTCCAAATGTTCTCCCATCTCCTTAGTCC

9627 mboll,

9661 GACAAGAAGGA5CAATGGGGAGCAGGAAGAAAGTCAACCTCACCTATCAACCTTATGAGC CTGTTCTTCCTCGTTACCCCTCGTCCTTCTTTCAGTTGGAGTGGATAGTTGGAATACTCG

9686 mboll, 9720 pstl,

9721 TGCAGGGGAAATCTTAGTCTCATCAGAGAACTTTAAGCAAGGCAGAAGGAAGAAGCAAGT ACGTCCCCTTTAGAATCAGAGTAGTCTCTTGAAATTCGTTCCGTCTTCCTTCTTCGTTCA

20 9769 mboll,

9781 TCGTGTTAAAGAGGTTAAGGACTTGGGGAGGATTGGTTTTCATGATACTGGGGATCCAGA AGCACAATTTCTCCAATTCCTGAACCCCTCCTAACCAAAAGTACTATGACCCCTAGGTCT

9832 bamhl binl,

9841 GGGCAAAGTAGGATGATTTTATTTTTAGGTGAGTAGAGGGAGGTTGAGCAGTCAAGTAGT CCCGTTTCATCCTACTAAAATAAAAATCCACTCATCTCCCTCCAACTCGTCAGTTCATCA

9701 ACAGAGAAATGTGGAATATAAACATAAGGAGAGTCAGTCAGTCACAAATATTTATGGAAC 25 TGTCTCTTTACACCTTATATTTGTATTCCTCTCAGTCAGTCAGTGTTTATAAATACCTTG

9961 ACCTACTACATGCCAGACACTTTTGTACACATTGGAGTGCAGCACAGCAGGAGCTTATAT TGGATGAT6TACGGTCTGTGAAAACATGTGTAACCTCACGTCGTGTCGTCCT CGAATATA

0021 TCTATTGGAAAGAGCAAGAGACAAGTTAGTACAAAACTAArATAAGGCAATCTCAATTGTG AGATAAC CTTT CT CGTT CT CTGTT CAATCATGTTTT6ATTT ATTCCGTTAGAGTT AACAC

0081 TTGTTCAGAAGATAGAATAGAATAATATGGTAGAGAGAATAATATGATAGAGTAATACGT AACAAGTCTTCTATCTTATCTTATTATACCATCTCTCTTATTATACTATCTCATTATGCA

10088 mboll,

30 0141 AGAGTGTTACATTAGCTGTGGTGGTCATAGAAATCATCTTTGAGGAGTTGAGACCTAAAT

TCTCACAATGTAATCGACACCACCAGTATCTTTAGTAGAAACTCCTCAACTCTGGATTTA

0201 GATGATAACAGGCCAGCTGATGGAGCTCTGAGAGAAGATGTTTCCAGACAGAGGGAAGAG CTACTATTGTCCGGTCGACTACCTCGAGACTCTCTTCTACAAAGGTCTGTCTCCCTTCTC

10214 pvull, 10223 saol, 10234 mboll, 10255 mboll,

0261 AAAATGCAAAGGCCCTGAGAATGGAAAAAGTTTACCATGTTTGAGGAACAAGAAGGGACA TTTTACGTTTCCGGGACTCTTACCTTTTTCAAATGGTACAAACTCCTTGTTCTTCCCTGT

0321 AGCATGACTTGTCACTTTCCCACCTTGCTTTCTAGCTCAAGTAAGCCCTTATTGCTGCAT 35 TCGTACTGAACAGTGAAAGGGTGGAACGAAAGATCGAGTTCATTCGG-GAATAACGACGTA

DK 169708 B1 45 3381 tgcaaccatagactatttccctagtccactgactttctcattctcctggacctctatctt

ACGTTGGTATCTGATAAAGGGATCAGGTGACTGAAAGAGTAAGAGGACCTGGAGATAGAA

0441 AGATTTTCTGTGTTTTCCTTAAATCTCGAGCACCTTTTTTCCATTCTCCAATGCCCATTT 5 TCTAAAAGACACAAAAGGAATTTAGAGCT CGTGGAAAAAAGGTAAGAGGTTACGGGTAAA

10465 aval xhal,

0501 T CACTCTTAGCTGATGCTGTGCAATGAACCTCCACAGACTCCCAACATCACATTTACTGG AGTGAGAATCGACTACGACACGTTACTTGGAGGTGTCTGAGGGTTGTAGTGTAAATGACC

0561 CATTTGTACCCATATACTCTGCCTGCACACTTATTACAATAAATAGAGTGTCTGTGCTCC GTAAACATGGGTATATGAGACGGACGTGTGAATAATGTTATTTATCTCACAGACACGAGG

10619 mstll,

._ 0621 TAAGGCCAACCTCTCCAGTTTTGTACTTGATTCCCATCTCTTCTCCCTT CATAAAAAATG

10 ATTCCGGTTGGAGAGGT CAAAACATGAACTAAGGGT AGAGAAGAGGGAAGTATTTTTTAC

10659 mboll,

0681 TTGCTCCAGCAATTTCTCCTTTCTCCCTTACATCATCAATTTATCTCTCCACTAGATTAA AACGAGGTCGTTAAAGAGGAAAGAGGGAATGTAGTAGTTAAATAGAGAGGTGATCTAATT

0741 TCTCATCAACATCAATCATGCTATTATTTCCTCCCCTATCTTTACAGAAACCGTCTTAAA AGAGTAGTTGTAGTTAGTACGATAATAAAGGAGGGGATAGAAATGTCTTTGGCAGAATTT

0801 ATAATTGTCCCTGCTTGCAGCCTTTGCATCTTTTCCTGCCATTCTCTCCTCTTTAACCCA TATTAACAGGGACGAACGT CGGAAACGTAGAAAAGGACGGTAAGAGAGGAGAAATTGGGT 15

0861 CTCCAAAGAAGCTTTTATCTCTATTATTTCATAAGAACTACATTTTCAAGGTCATTATTG GAGGTTT CTT CGAAAAT AGAGAT AAT AAAGTATT CTTGATGT AAAAGTT CCAGTAATAAC

10869 hindlll, 0921 ATCTTTACATTACTGATTACTAGCCCTCATCTTATTTGAATTCTCAGTAGTATTTGAGAG EcoRI #76 TAGAAATGTAATGA CTAATGATCGGGAGTAGAATAAACTTAAGAGTCAT CATAAACTCTC - 10958 ecarl,

0981 GTGATTACTCCATCGTTGATACAGGTTCTCACTTGGTTTCTCTAACACCACTTTTCTTCA 20 CACTAATGAGGTAGCAACTATGTCCAAGAGTGAACCAAAGAGATTGTGGTGAAAAGAAGT

11035 tnboll,

1041 CTTTTCTACTAAACTTACTGCCAATCTTTGTCAACTTTGCGAGTCCTTCTTCATCCCCCT GAAAAGATGATTTGAATGACGGTTAGAAACAGTTGAAACGCTCAGGAAGAAGTAGGGGGA

A

11088 mboll,

1101 AATCTTTAAAGGTTAGAGTGCTCCAGGGATTAGTTCTCCAACTTCTTCTTTATTCTATTT TTAGAAATTTCCAATCTCACGAGGTCCCTAATCAAGAGGTTGAAGAAGAAATAAGATAAA

25 11105 ahalll, 11144 mboll,

1161 ATACTCACTCTGTGACGACATTGTTTAGCCTCATGATTTTAAGTACTATCTATCTGCAGA TATGAGTGAGACACTGCTGTAACAAATCGGAGTACTAAAATTCATGATAGATAGACGTCT

11202 seal, 11214 pstl,

1221 TAATTCCAGTTGAATATCTGGAGATATTCTCAGATCTCTCTCCTGAAGTCAAAATTTACA ATTAAGGTCAACTTATAGACCTCTATAAGAGTCTAGAGAGAGGACTTCAGTTTTAAATGT

Λ 11252 bglll,

1281 TATCAACTCCCTACCTTAACATGCACACAATTAGACTCTTAATTCCTGCCCCTTCCCAAA 30 ATAGTTGAGGGATGGAATTGTACGTGTGTTAATCTGAGAATTAAGGACGGGGAAGGGTTT

1341 ACCTGCTGATTGCTCAGCCTTCTCCATGGCAATCAAAAACCATTCCTGGCCGGGCATGGT TGGACGACTAACGAGTCGGAAGAGGTACCGTTAGTTTTTGGTAAGGACCGGCCCGTACCA

11364 ncol,

1401 GGCTCACTCCT5TAACCCCAGCACTTGGGGAAGCTGAGGCAGGTGGATTGGTTGAGCCCC CCGAGTGAGGACATTGGGGT CGTGAACCCCTTCGACTCCGTCCACCTAACCAACTCGGGG

11434 tthIIIl ,

oc 1461 AGASTTC4 ^GATCAGCCTGGGCAACATGGCAAAACCT CATCTCTATTAAAAATACAAAAA -53 TC'C.'.AGTTCTA3TCGG.M:cGTrGTACC5TTTTGGAGTAGAGATAATTTTTATG7TTTT

DK 169708 B1 46

'.521 TTAGCCAGGCGTGGTGGTGCACACCTGCAGTCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCACGAG AATCGGTCCGCACCACCACGTGTGGACGTCAG6GTCGATGAGTCCTCCGACTCCGTGCTC

5 115AS pstl,

1581 AATCGCTTGAACTGGGGAGACGGAGGTTGCAGTGAGCTGAGATGGCCTCACTGCACTCCA TTAGCGAACTTGACCCCTCTGCCTCCAACGTCACTCGACTCTACCGGAGTGACGTGAGGT

1641 GCCTGGGCAACAGAGTCAGACTTGATCTCAAAAAAATAAATAAGTAAAACCATTCCCTAT CGGACCCGTTGTCTCAGTCTGAACTAGAGTTTTTTTATTTATT CATTTTGGTAAGGGATA

1701 TTCAGTT ATT CAGTCACAGATCTTGAAGTTTTCCAACTCTTTTTTT CTTACATTAACATC AAGT CAATAAGTCAGTGTCTAGAACTT CAAAAGGTTGAGAAAAAAAGAATGTAATTGTAG

11718 bglll,

10 1761 TAATCTGTAAAGGATCCTGTATTAGTCCATTTTCACACTGCTAATAAAGACATACCTGAG

ATTAGACATTTCCTAGGACATAATCAGGTAAAAGTGTGACGATTATTTCTGTATGGACTC

11772 bamhl binl,

1821 ACTGGGCAATTTACAAAAGAAAGAAGTTTAATGGACTCACAGTTCCACATGGCTGGGGAG TGACCCGTTAAATGTTTTCTTTCTTCAAATTACCTGAGTGTCAAGGTGTACCGACCCCTC

Λ Λ 11865 bstXI, 11879 etui,

1881 SCCTCACAATCATGGCAGAAGGCAGGGAG5AGCAAGTTATATCTCACATGATGGCACAGG CGGAGTGTTAGTACCGTCTTCCGTCCCTCCTCGTTCAATATAGAGTGTACTACCGTGTCC

15

1941 CAAAGAGAGAGAGCTTGTGCAGGGAAACTCCTCTTTTTAAAACCATCAGATCTTGTGAGA GTTTCTCTCTCTCGAACACGTCCCTTTGAGGAGAAAAATTTTGGTAGTCTAGAACACTCT

11976 ahal11, 11988 bglll,

2001 CTTATTCACTATCATGAGAACAGCAAGGGAAGGACCTACTGCCATGATTCAGTTACCTCC GAATAAGTGATAGTACTCTTGTCGTTCCCTTCCTGGATGACGGTACTAAGTCAATGGAGG

2061 TATCAGGTCCCTCCCACAGAACATGGGAATTCAAGATGAGATTTGGGTAGGGACACAGCC EcoRI #17 ATAGTCCAGGGAGGGTGTCTTGTACCCTTAAGTTCTACTCTAAACCCATCCCTGTGTCGG - 20 12087 ecorl,

2121 AAACCATATCATTCCACCCCATCCCCTCCCAAATCTCGTGTCCTCACATTTCAAAACCAA

TTTGGTATAGTAAGGTGGGGTAGGGGAGGGTTTAGAGCACAGGAGTGTAAAGTTTTGGTT

2181 TCATGCCTTCCCAACAGTCCCCCAAAGTCATAACA CATTTCAGCATTAACTCAAAAGTCC

AGTA CGGAAGGGTTGT CAGGGGGTTTCAGTATTGTGTAAAGT CGTAATTGAGTTTTCAGG

2241 ACAGTCCAATGTCTCATCTAASACAAGGCAAGTCCCTTCCACCTATGAGCATGTAAAGTC

TGT CAGGTT ACAGAGTAGATT CTGTTCCGTT CAGGGAAGGT GGATACTCGTACATTT CAG

2301 AAAAGCAAGTTAGTTACTTCCTAGATACAATGGGGTATAGGCATTGGGTAAATACAGCCA

25 TTTTCGTTCAATCAATGAAGGATCTATGTTACCCCATATCCGTAACCCATTTATGTCGGT

.2361 TTCCAAATGGGAGAAATTGGCCAAAACAAAGGGCCTACAGGCCCCATGCAAGTCTGAAAT

AAGGTTTACCCTCTTTAACCGGTTTTGTTTCCCGGATGTCCGGGGTACGTTCAGACTTTA

A

12378 ball,

.2421 TCTACGGGGCAGTCAAATCTTAAATCTCTAAAGTGATCTCCTTTGACTCCATGTCTTGCA

AGATGCCCCGTCAGTTTAGAATTTAGAGATTTCACTAGAGGAAACTGAGGTACAGAACGT

.2481 TCTGAGTCATGCTGATGCAAGAGGTGGGTGCCCATGGTCTTGGGCAGCTCCACCCCTGTG

AGACTCAGTACGACTACGTTCTCCACCCACGGGTACCAGAACCCGTCGAGGTGGGGACAC

30 12512 bstXI ncol, 12530 bstXl,

.2541 G CTTT GCAGGGTACAGCCTCC CTT GTGTCTGC CTT CATGGG CTGGCATTTT CTGTAG CTT

CGAAACGTCCCAT6TCGGAGGGAACACA6ACGGAAGTACCCGACCGTAAAAGACATCGAA

12601 TTCCAGATGCTGGTGCAAGTTTCTGATGGATCTACCATTCCGGGGTCTGGAGGACGGTGG

AAGGT CTACGACCACGTTCAAAGACTACCTAGATGGTAAGGCCCCAGACCTCCTGCCACC

12628 binl,

12661 CCCTCTTCTCACAGCTCCACTAGGTGGTACCCCAGTAGGGACTCTGTGTGGGTGCCCTGA

GGGASAAGAGTGT CGAGGTGATCCACCATGGGGTCATCCCTGAGACACACCCACGGGACT

35 1256- abs-11, 12685 kpnl, DK 169708 B1 47

2721 GCCCACATTTCCCTTCTGCACTGCCCTAGCAGAGTTTCTACATGAAGGCCCACCCCCGCA CSGGTGTAAAGGGAAGACGTGACGGGATCGTCTCAAAGATGTACTTCCGGGTGGGGGCGT

2731 GCAAACTTCTGCCTGGGCATCCAGGCACTTCCATTAATTTCTAAACAACAAASCATTCAA 5 CGTTTGAAGACGGACCCSTAGGTCCGTGAAGGTAATTAAAGATTTGTTGTTTCGTAAGTT

2341 GAGGCGACTTGGSTGCTATTAAGGGCA7TCAGTTTCATAASGGAAGCAGAGCATAAAAGT CTCCGCTGAACCCACGATAATTCCCGTAAGTCAAAGTATTCCCTTCGTCTCGTATTTTCA

2901 TTGGAAAATTTSCAGCCTGATAATGTTAGAGAAAAGCAAATCCCATTTTCTGAGGAGAAA

aaccttttaaacgtcggactattacaatctcttttcgtttagggtaaaagactcctcttt

2961 TTCAAGCAGGCTGCAGAAATTTGCATAAGTAATGAGGAGCCGAATGTTAATCCCAAGACA AAGTTCGTCCGACGTCT7TAAACGT ATT CATTACTCCTCGGCTTACAATTAGGGTTCTGT

Λ Λ 12971 pstl, 13013 bsfcXI,

10 3021 ATSGGGAAAATGTCTCCAGGGCATGTCA6AGGTCTTCACACCAGCCCCTCCCATCACCGG

TACCCCTTTTACAGAGGTCCCGTACAGTCTCCAGAAGTGTGGTCGGGGA.GGGTAGTGGCC

13Q53 mboll,

3081 CCCAGAGGCCTAAGAGGAAAAAGTTGTTTCATGGGCTGGGCCCAGGATCCCCATGCTGTG GGGTCTCCGGATTCTCCTTTTTCAACAAAGTACCCGACCCGGGTCCTAGGGGTACGACAC

Λ Λ Λ 13086 'atul j 13118 apal, 13125 barchl binl,

3141 TSCAGCCTAGGGAGTCGGTGCCTTGTGTCCCAGCCGCTACAGCCATGGCTGAAAGGGGTC , _ ACGTCGGATCCCTCAGCCACGGAACACAGGGTCGGCGATGTCGGTACCGACTT7CCCCAG

15 Λ λ 13146 avr2, 13183 τιοοί, 3201 AATGTAGAGCTCAGGCTGTGGCTTCATAGGGTACAAGTCCCAAGCCTTGSCAGCTTCCAC ttacatctcgagtccgacaccgaagtatccgatgttcagggttcggaaccgtcgaaggtg 13207 sacl,

3261 atgatgttgagcctgcgagtgcacagaagtcaagaactggggtttgggaacttccgccta TACTACAACTCGGACGCTCACGTG7CTTCASTTCTTGACCCCAAACCCTTSAAGGCGGAT

3321 GATTTCAGAAGATGTATGAAAACACCTGGATGCCTAGGCAGAAGTTTGCTGCGGGGGTGG

20 ctaaagtcttctacatacttttgtggacctacggatccgtcttcaaacgacgcccccacc • 13328 mboll, 13353 avr2, 13379 apal, 3331 gccctcatggagaacctctgctagggcagtgcagaagggaaatgtgggctcagagcacac cgggagtacctcttggagacgatcccgtcacgtcttccctttacacccgagtctcgtgtg

.'3441 ACACAGAGTCCCTGCTGGGGTACCACCTAGTGGAGCTGTGAGAAGAGGACCACCGTCCTC ) TGTGTCTCAGGGACGACCCCATGGTGGATCACC'TCGACACTCTTCTCCTSGTGGCAGGAG

j 134S9 Scpnl, 13482 mboll,· ...

.3301 CAGGCCCCAGAATGGTAGATACCCTAAATCATCTCTTTCAAATTCGAAGTTCCACAAATC *5 GTCCGGGGT CTT ACCATCTATGSGATTTAGTAGAGAAAGTTTAAGCTT CAAGGTGTTTAG

!3561 TCTAGGACAGGAGCAAAATGCCACCAGTATCTTTGCTAAAACATAACAAGAGTTACCTTT

agatcctgtcctcgttttacsgtggtcatagaaacgattttstattgttctcaatggaaa .3621 sctccagttcccaacaagttcctcatctctatctgagaccacctcagcctggatttcatt cgaggtcaagggttgttcaaggagtagagatagactctggtggagtcggacctaaagtaa

.3681 ‘stccatatcattatcagccttttsgtcaaagccattcaacaagtctctagagasttccaa caggtatagtaatagtcggaaaaccagtttcggtaagttgtt CAGAGATCT CTCAAGGTT

13726 xbal, 30 :3741 ACTTTCCACATTTTCCTGTCSTCTTCTGAGCCCTCCAA.ACTSTTCCAACCTCTGCCTGTT tgaaaggtgtaaaaggacagcagaagactcgggaggtttgacaaggttggagacggacaa Λ 13762 mboll,

i3S01 ACCCAGTTCCAAAGTCGCTTCCACATTTTTGGGTATCTTTTCAGCAGCACCCCACTCTAC TG6GTCAAGGTTTCAGCGAAGGTGTAAAAACCCATAGAAAAGTCGTCGTGGGGTGAGATG

13321 bstXI, 13852 bstXI, 13361 tggtaccaacttactgtattagtctgttctcacactgctgataaasatatacctgas.ict 35 accatggttgaatgacataatcagacaagaststgacgactatttctatatggactctga 17-162 ’·.-.--. ’ .

« DK 169708 B1 48

5921 GGGAAATTTACAAAGGAAAGAGGTTTTATGGACTTACTGTTCCACATGGCTGGGGAGGCC CCCTTTAAATGTTTCCTTT CTCCAAAATACCTGAATGACAAGGTGTACCGACCCCT CCGG

A A

5 13962 bstXI, 13976 stul,

5981 TCAAAATCATGGCAGAAGGCAAGGAGGAGCAAGTCTTGTCTTACATGGATGGCAGCAGGC

agttttagtaccgtcttccgttcctcctcgttcagaacagaatgtacctaccgtcgtccg

4041 AAAGAAAGAAAGCTTGTGCAGGAAAACTCTTTTTTTTCTTTTCTTCTTTTTAGACAGAGA TTTCTTTCTTTCGAACACGTCCTTTTGAGAAAAAAAAGAAAAGAAGAAAAATCTGTCTCT

14Q5Q hindlll, 14082 raboll, 14098 bglll,

4101 TCTTGCTCTGTCACGCAGGCTGGAGTCAGTGGCGTGAGTCTTGGCTCACTGCAACCTCCA AGAACGAGACAGTGCGTCCGACCTCAGTCACCGCACT CA6AACCGAGTGACGTTGGAGGT

10 4161 CCTCCCGGGTTCAAGTGATTCTCCTGCCTCAGCCTTCCAAGTAGCTGGTACTACAGGCAT

GGAGGG CC CAAGTT CA CTAAGAGGACGGAGT CGGAAGGTT CATCGACCATGATGT CCGTA

, A A A

14164 aval smal xmal, 14184 tthllll, 14197 bstXI,

4221 GTGCCACCACATGAGATGAGATTTTGGTAGGGACACAGCCAAACCATATCATTCCCCCTG CACGGTGGTGTACTCTACTCTAAAACCATCCCTGTGTCGGTTTGGTATAGTAAGGGGGAC

4281 TCCCCTCCCAAATCTCATGTCCTCACATTTCAAAACCAATCATGCCTTCCCAACAGTCCC AGGGGAGGGTTT AGAGT A CAGGAGTGTAAAGTTTTGGTTAGTACGGAAGG6TTGT CAGGG

4341 CCAAAGTCATAACTCATTTCAGCATTAACTCAAAAGTCCACAGTATTTTTAGTAGAGATG 15 GGTTTCAGT ATTGAGT AAAGT CGT AATTGAGTTTT CAGGTGT CAT AAAAATCAT CTCTAC

4401 GGGTTTCACCATATTGGCCAGACTGGTCTCTAACTCCTGACCTTATGATCCGCCCGCCTT CCCAAAGTGGTATAACCGGTCTGACCAGAGATTGAGGACTGGAATACTAGGCGGGCGGAA

A

14415 ball,

4461 GGCCTCCCAAAGCACTGGGATTACAGGTGTGAGCCACCATGCCCAGCCAAAAACTCTTCT CCGGAGGGTTTCGTGACCCTAATGTCCACACTCGGTGGTACGGGTCGGTTTTTGAGAAGA

14467 bsfcXI, 14515 mboll,

on 4521 TTTTA AAACCAT CAGTT CT C6ATGAGACTTATT CA CT AT CACAAGAACAGCATAGGAAAG AAAATTTTGGT AGT CAAGAGCTACT CTGAAT AAGT GAT AGT GTT CTTGT CGTATCCTTTC

14522 ahalll, 14579 bglll,

4581 ATCTGCCCCCATGATTCAATTACCTCCCACCAGGTCCCTCCCACAACACATGGGAATTCA EcoRI #55 TAGACGGGGGTACTAAGTTAATGGAGGGTGGTCCAGGGAGGGTGTTGTGTACCCTTAAGT

14634 ecorl,

4641 CGATGAGATTTGGGTGGGGATCCTCTTGGCTATCATTTCAAAAAATAGTCAGGGTTGATT GCTACTCTAAACCCACCCCTAGGAGAACCGATAGTAAAGTTTTTTATCAGTCCCAACTAA

A

25 14658 bamhl binl,

4701 ATGGACTTAGTATTGAATAAGATGAAAATGTACTGAAATGGAACGATGAAGATAATTGAC TACCTGAATCATAACTTATTCTACTTTTACATGACTTTACCTTGCTACTTCTATTAACTG

A

14748 «boll,

4761 CAGGGAAAGCAGGTTACAAGCCAAGAGAGGATACAGTGTCACTTCAGATGCTATAAAAGT GTCCCTTTCGTCCAATGTTCGGTTCTCTCCTATGTCACAGTGAAGTCTACGATATTTTCA

4821 GATGTTTTTATTTTTTGAATGTTATTTGGCTATATTTTCAAATTATCTGCACTGCATATG CTACAAAAATAAAAAACTTACAATAAACCGATATAAAAGTTTAATAGACGTGACGTATAC

30 14875 Tidal,

4881 CACTGCTTCTGTAATAATAAAAGGGTATTAAAATAATAAAATCAAGT CTATAAATCACAC GTGACGAAGACATTATTATTTTCCCATAATTTTATTATTTTAGTTCAGATATTTAGTGTG

494· 1 ACACACACCCCAGCCTCTTCTCTACACCTCAGTGACTACCAACCACATCTAAATTATCAT TGTGTGTGGGGTCGGAGAAGAGATGTGGAGTCACTGATGGTTGGTGTAGATTTAATAGTA

A

14956 mboll,

SC01 CATTTCTCATCTGAATTATTGCAAGAAGCCATTGCAATAATTCAGATGAGAGTTGATACA 35 GTAAAGAGTASACTTAATAACGTTCTTCGGTAACGTTATTAAGTCTACTCTCAACTATGT

5061 AAGCCTTCCTGTTTCCAACCTTACCCTCATATAGTCTTTTCCCAACATTGCATCTAAAGT TTCGGAAGGACAAAGGTTGGAATGGGAGTATATCAGAAAAGGGTTGTAACGTAGATTTCA

5121 AATTTTTCAAATTGCAATTCTGATCCGGGGAATTC TTAAAAAGTTTAACGTTAAGACTAGGCCCCTTAAG

15150 ecarl, DK 169708 B1 49

APPENDIX B

ValTyrGlyPheTrpGIyAlaThrThrGlnThrPheGlySerArgGlyMefcThrAlaLeu 1 GTCTATGGATTCTGGGGTGCCACAACTCAGACTTTCGGAAGCAGAGGCATGACCGCCTTA CAGATACCTAAGACCCCACGGTGTTSAGTCTGAAAGCCTTCGTCTCCGTACTGGCGGAAT

5 LeuLysValSerSerCysAspLysAsnThrGlyAspTyrTyrGluAspSarTyrGluAap 61 CTGAAGGTTT ctagttstgacaagaacactggtgaTtattacgaggacagttatgaagat

GACTTCCAAAGATCAACACTGTTCTTGTGACCACTAATAATGCTCCTGTCAATACTTCTA

A

11S mboll,

IleSerAlaTyrLeuLeuSerLysAsnAsnAlalleGluProArgSerPheSerGlnAsn 121 ATTTCAGCATACTTGCTGAGTAAAAACAATGCCATTGAACCAAGAAGCTTCTCCCAGAAT TAAAGTCGTATGAACGACTCATTTTTGTTACGGTAACTTGGTTCTT CGAAGAGGGTCTTA

A A

165 hindlll, 177 ecorl, 10 SerArgHisProSerThrArgGlnLysGlnPheAsnAlaThrThrlleProGluAsnAsp

131 tcaagacaccctagcactaggcaaaagcaatttaatgccaccacaattccagaaaatgac AGTT CTGTGGGATCGTGATCCGTTTTCGTTAAATTACGGTGGTGTTAAGGTCTTTTACTG

IleGluLysThrAspPraTrpPheAlaHisArgThrPraMstProLysHeGlnAsnVal 261 ATAGAGAAGACTGACCCTTGSTTTGCACACAGAACACCTATGCCTAAAATACAAAATGTC TATCTCTTCTGACTGGGAACCAAACGTGTGTCTTGTGGATACGGATTTTATGTTTTACAG

266 mboll,

SerSerSerAspLeuLeuMetLeuLeuArgGlnSerProThrProHisGlyLeuSerLeu 301 TCCTCTAGTGATTTGTTGATGCT CTTGCGACAGAGTCCTACTCCACATGGGCTATCCTTA

15 AGGAGATCACTAAACAACTACGAGAACGCTGTCTCAGGATGAGGTGTACCCGATAGGAAT

329 tthIIIl,

SerAspLeuSlnGluAlaLysTyrGluThrPheSerAspAspProSerProGlyAlalle 361 TCTGATCTCCAAGAAGCCAAATATGAGACTTTTTCTGATGATCCATCACCTGGAGCAATA AGACTAGAGGTTCTTCGGTTTATACTCTGAAAAAGACTACTAGGTAGTGGACCTCGTTAT

AspSarAsnAsnSerLeuSerGluMetThrHisPheArgProGlnLeuHisHisSerGly 621 gacagtaataacagcctgtctgaaatgacacacttcaggccacagctccatcacagtggs

CTGT CATTATTGT CGGACAGACTTTACTGTGTGAAGTCCGGTGTCGAGGTAGTGTCACCC

A

20 «68 bstXI,

AspMetValPheThrProGluSerGlyLeuGlnLeuArgLeuAsnGluLysLeuGlyThr 681 GACATGGTATTTACCCCTGAGTCAGGCCTCCAATTAAGÅTTAAATGAGAAACTGGG5ACA CTGTACCATAAATGGGGACTCAGTCCGGAGGTTAATTCTAATTTACTCTTTGACCCCTGT

697 tViIHl, 506 stul,

ThrAlaAlaThrGluLeuLysLysLeuAspPheLysValSerSerThrSerAsnAsnLeu S61 ACTGCAGCAACAGAGTTGAAGAAACTTGATTTCAAAGTTTCTAGTACATCAAATAATCTG

TGACGTCGTTGTCTCAACTTCTTTGAACTAAAGTTTCAAAGATCATGTAGTTTATTAGAC

562 pstl, 558 mboll', 2 5

IleSerThrlleProSerAspAsnLeuAlaAIaGlyThrAspAsnThrSerSerLeuGly 601 ATTTCAACAATTCCATCAGACAATTTGGCAGCAGGTACTGATAATACAAGTTCCTTAGGA

TAAAGTTGTTAAGGTAGTCTGTTAAA CCGT CGT C CATGACTATTATGTTCAAGGAATCCT

653 mstll,

ProProSerMetPraValHisTyrAspSerGlnLeuAspThrThrLeuPheGlyLysLys 661 cccccaagtatgccagttcattatgatagtcaattagataccact ctatttggcaaaaag

G6GGGTT CATA CGGT CAAGT AAT ACT AT CAGTT AAT CT ATGGTGAGATAAACCGTTTTT C

SerSerProLeuThrGluSerGlyGIyProLeuSerLauSerGluGluAsnAsnAspSer Λ 721 TCATCTCCCCTTACTGAGTCTGGTGGACCTCTGAGCTTGAGTGAAGAAAATAATGATTCA

30 AGTAGAGGGGAATGACTCAGACCACCTGGAGACTCGAACTCACTTCTTTTATTACTAAGT

• 763 mboll,

LysLeuLeuGluSerGlyLeuMetAsnSerGlnGluSerSerTrpGlyLysAsnValSer 781 aagttgttagaatcaggtttaatgaatagccaagaaagttcatggggaaaaaatgtatcg ttcaacaatcttagtccaaattacttatcggttctttcaagtaccccttttttacatagc

SerThrGluSerGlyArgLeuPheLysGlyLysArgAlaHisGIyProAIaLeuLauThr 861 TCAACAGAGAGTGGTAGGTTATTTAAAGGGAAAAGAGCTCATGGACCTGCTTTGTTGACT

agttgtctctcaccatccaataaatttcccttttctcgagtacctggacgaaacaactga

A A

35 862 ahalll, 875 saol, DK 169708 B1 50

LysAspAsnAlaLeuPheLysValSerlleSerLeuLeuLysThrAsnLysThrSerAsn 901 AAAGATAATGCCTT ATT CAAAGTTAGCAT CT CTTTGTTAAAGACAAACAAAACTTCCAAT TTT CT ATT A CGGAAT A AGTTT CAATCGTAGAGAAACAATTT CT GTTT GTTTTGAAGGTT A

c AsnSerAlaThrAsnArgLysThrHisIleAspGlyPraSerLeuLeuIleGluAsnSer

3 961 AATTCAGCAACTAATAGAAAGACTCACATTGATGGCCCATCATTATTAATTGAGAATAGT

TTAAGTCGTTGATTATCTTTCTGAGTGTAACTACCGGGTAGTAATAATTAACTCTTATCA

ProSerValTrpGlnAsnlleLeuGluSerAspThrGluPheLysLysValThrPt-oLeu .021 CCATCAGTCTGGCAAAATATATTAGAAAGTGACACTGAGTTTAAAAAAGTGACAeCTTTG GGTAGT CAGACCGTTTTATATAAT cttt CACTGTGACT CAAATTTTTTCACTGTGGAAAC

1021 bstxi, 1060 ahalll,

IleHisAspArgMetLeuMetAspLysAsnAlaThrAlaLsuArgLeuAsnHisMetSer 1081 ATTCATGACAGAATGCTTATGGACAAAAATGCTACAGCTTTGAGGCTAAATCATATGTCA 10 TAAGTACTGTCTTACGAATACCTGTTTTTACGATGTCGAAACTCCGATTTAGTATACAGT

1132 ndsl,

AsnLysThrThrSerSerLysAsnMetGluMetValGlnGlnLysLysGluGlyPralle 11« AATAAAACTACTTCATCAAAAAACATGGAAATGGTCCAACAGAAAAAAGAGGGCCCCATT TTATTTTGATGAAGTAGTTTTTTGTACCTTTACCAGGTTGTCTTTTTTCTCCCGGGGTAA

1191 apal,

ProPraAspAlaGlnAsnProAspMetSerPhePheLysMetLeuPheLeuProGluSer 1201 CCACCAGATGCACAAAATCCAGATATGTCGTTCTTTAAGATGCTATTCTTGCCAGAATCA

15 ggtggtct]acgtgttttaggtctatacagcaagaaattctacgataagaacggtcttagt

AlaArgTrpIleGlnArgThrHisGlyLysAsnSerLsuAsnSBrGlyGlnGlyProSBr

1261 gcaaggtggatacaaaggactcatggaaagaactctctgaactctgggcaaggccccagt CGTTCCACCTATGTTTCCTGAGTACCTTTCTTGAGAGACTTGAGACCCGTTCCGGGGTCA

cDNA done

PraLysGlnLeuValSerLeuGlyProGluLysSsrValGluGlyGlnAsnPheLBuSer ni 1321 CCAAAGCAATTAGTATCCTTAGGACCAGAAAAATCTGTGGAAGGTCAGAATTTCTTGTCT ^

GGTTTCGTTAATCATAGGAATCCTGGTCTTTTTAGACACCTTCCAGTCTTAAAGAACAGA

A

1337 instil,

SluLysAsnLysValValValGlyLysGlyGluPheThrLysAspValGlyLBuLysGlu 20 1381 gagaaaaacaaagtggtagtaggaaagggtgaatttacaaaggacgtaggactcaaagag

CT CTTTTTGTTTCACCATCATCCTTTCCCACTTAAATGTTTCCTGCATCCTGAGTTTCTC

MetValPheProSerSerArgAsTiLeuPheLeuThrAsnLeuAspAsnl-BuHisGluAsn 1441 ATGGTTTTTCCAAGCAGCAGAAACCTATTTCTTACTAACTTGGATAATTTACATGAAAAT

TACCAAAAAGGTT CGTCGTCTTTGGATAAAGAATGATTGAACCTATTAAATGTACTTTTA

AsnThrHisAsnGlnGluLysLyslleGlnGluGluIleGluLysLysGluThrLeuIle 1501 AATACACACAATCAAGAAAAAAAAATTCAGGAAGAAATAGAAAAGAAGGAAACATTAATC TTATGTGTGTT A G TT CTTTTTTTTTA AGTCCTT CTTTAT CTTTTCTTC CTTTGTAATTAG

1531 raball,

GlnGluAsnValValLeuPraGlnlleHisThrValThrGIyThrLysAsnPheMetLys 1561 CAAGAGAATGTAGTTTTGCCTCAGATACATACAGTGACTGGCACTAAGAATTTCATGAAG

GTTCTCTTACATCAAAACGGAGTCTATGTATGTCACTGACCGTGATTCTTAAAGTACTTC

A A

1617 mboll, 1620 xmnl,

AsnLeuPheLeuLeuSerThrArgGlnAsnValGluGlySerTyrAspGlyAlaTyrAla 1621 AACCTTTTCTTACTGAGCACTAGGCAAAATGTAGAAGGTTCATATGACGGGGCATATGCT

TTGGAAAAGAATGACTCGTGATCCGTTTTACATCTTCCAAGTATACTGCCCCGTATACGA

A A

1661 ndel, 1673 ndsl, 30 ProValLauGlnAspPheArgSerLeuAsnAspSerThrAsnArgThrLysLysHisThr

1681 CCAGTACTT CAAGATTTTAGGT CATTAAATGAtTCAACAAATAGAACAAAGAAACACACA

ggtcatgaagttctaaaatccagtaatttactaagttgtttatcttgtttctttgtgtgt 1683 seal,

AlaHisPheSerLysLysGIyGluGluGluAsnLeuGluGlyLeuGlyAsnGlnThrl.ys 1741 GCTCATTTCTCAAAAAAAGGGGAGGAAGAAAACTTGGAAGGCTTGGGAAATCAAACCAAG

cgagtaaagagtttttttcccctccttcttttgaaccttccgaaccctttagtttggttc 1765 mball, 35 DK 169708 B1 51

GlnlleValGIuLysTyrAlaCysThrThrArqlleSerPraAsnThrSerGlnGlnAsn 1801 CAAATTGT AGAGAAATATGCATGCACCACAAGfaATAT CTCCT AATACAAGCCAGCAGAAT GTTTAACATCTCTTTATACGTACGTGGTGTTCCTATAGAGGATTATGTTCGGTCGTCTTA

g 1817 ava3, 1819 sphl, 1833 ecorS,

PheValThrGlnArgSerLysArqAlaLeuLysGlnPheArgLsuPraLeuGluGluThr 1861 TTTGTCACGCAACGTAGTAAGAGAGCTTTGAAACAATTCAGACTCCCACTAGAAGAAACA AAACAGTGCGTTGCATCATT CTCTCGAAACTTTGTTAAGT CTGAGGGTGATCTT CTTTGT

Λ A a < 1820 xranl, 1912 mball,

GluLeuGluLysArgllelleValAspAspThrSerThrGlnTrpSerLysAsnMetLys 1921 GAACTTGAAAAAAGGATAATTGTGGATGACACCTCAACCCAGTGGTCCAAAAACATGAAA CTTGAACTTTTTTCCTATTAACACCTACTGTGGAGTTGSGTGACCAGGTTTTTGTACTTT

t λ HisLeuThrProSerThrLeuThrGlnlleAspTyrAsnGluLysGluLysGlyAlalla

-LU 1981 CATTTGACCCCGAGCACCCTCACACAGATAGACTACAATGAGAAGGAGAAAGGGGCCATT

GTAAACTGGGGCTCGTGGGAGTGTGTCTATCTGAT6TTACTCTTCCTCTTTCCCCGGTAA

1989 aval,

ThrGlnSerProLeuSerAspCysLeuThrArgSerHisSerlleProGlnAlaAsnArg 2041 actcagtctcccttatcagattgccttacgaggagtcatagcatccctcaagcaaataga tgagtcagagggaatagtctaacggaatgctcctcagtatcgtagggagttcgtttatct 2098 bg111, ,_ SerPraLeuProIleAlaLysValSerSerPheProSerlleArgProIleTyrLeuThr 15 2101 tctccattacccattgcaaaggtatcatcatttccatctattagacctatatatctgacc

AGAGGTAATGGGTAACGTTTCCATAGTAGTAAAGGTAGATAATCTGGATATATAGACTGG

ArgValLeuPhaGlnAspAsnSerSerHisLeuProAlaAlaSerTyrArgLysLysAsp 2161 AGGGTCCTATTCCAAGACAACTCTTCTCATCTTCCAGCAGCATCTTATAGAAAGAAAGAT tcccaggataaggttctgttgagaagagtagaaggtcgtcgtagaatatctttctttcta 2182 mball, 2190 mball,

SerGlyValGlnGluSerSerHisPheLeuGlnGlyAlaLysLysAsnAsnLeuSerLeu 2221 TCTGGGGTCCAAGAAAGCAGTCATTTCTTACAAGGAGCCAAAAAAAATAACCTTTCTTTA

AGACCCCAGGTTCTTTCGT CAGTAAAGAATGTTCCTCGGTTTTTTTTATTGGAAAGAAAT

20

AlalleLeuThrLeuGluMetThrGlyAspGlnArgGluValGlySerLeuGlyThrSer 2281 GCCATTCTAACCTTGGAGATGACTGGTGATCAAASAGAGGTTGGCTCCCTGGGGACAAGT CGGTAAGATTGGAACCTCTACTGACCACTAGTTTCTCTCCAACCGAGGGACCCCTGTTCA

2307 bell,

AlaThrAsnSarValThrTyrLysLysValGluAsnThrValLeuProLysPiOAspLeu 2341 GCCACAAATTCAGTCACATACAAGAAAGTTGAGAACACTGTT CTCCCGAAACCAGACTTG

CGGTGTTTAAGTCAGTGTATGTTCTTTCAACTCTTGTGACAAGAGGGCTTTGGTCTGAAC

ProLysThrSerGlyLysValGluLeuLeuProLysValHisIleTyrGlnLysAspLeu -j c 2401 CCCAAAACATCTGGCAAAGTTGAATTGCTTCCAAAAGTTCACATTTATCAGAAGGACCTA

GGGTTTTGTAGACCGTTTCAACTTAACGAAGGTTTT CAAGTGTAAATAGTCTTCCTGGAT

2422 xmnl,

PheProThrGluThrSerAsnGlySerProGlyHisLeuAspLeuValGluGlySerLeu 2461 ttccctacggaaactagcaatgggtctcctggccatctggatctcgtggaagggagcctt

AAGGGATGCCTTTGATCGTTACCCAGAGGACCGGTAGACCTAGAGCACCTTCCCTCGGAA

2490 ball, 2499 binl, 2520 mboll,

LeuGlnGlyThrGluGlyAlalleLysTrpAsnGluAlaAsnArgProGlyLysValPro ._ 2521 CTTCAGGGAACAGAGGGAGCGATTAAGTGGAATGAAGCAAACAGACCTGGAAAAGTTCCC

30 GAAGTCCCTTGTCTCCCTCGCTAATTCACCTTACTTCGTTTGTCTGGACCTTTTCAAGGG

PheLeuArgValAlaThrGluSerSerAlaLysThrProSarLysLeuLeuAspIPraLeuI 2581 TTTCTGAGAGTAGCAACAGAAAGCTCTGCAAAGACTCCCTCCAAGCTATTGGAfCCTCTTi AAAGACT CT CAT C.6TTGT CTTT CGAGACGTTT CT GAGGGAGGTT CGAT AACCTA GGAGAAj

2621 bstXI, 2631 bamhl binl,_ I

AlaTrpAspAsnHisTyrGlyThrGlnlleProLysGluGluTrpLysSerGlnGluLysl 2641 GCTTGGGATAACCACTATGGTACTCAGATACCAAAAGAAGAGTGGAAATCCCAAGAGAAG.

CGAACCCTATTGGTGATACCATGAGTCTATGGTTTTCTTCrCACCTTTAGGGTTCTCTTC; 35 2677 mball, . ! cDNA clone ; 2-11 DK 169708 B1 52 i i

SerProGluLysThrAlaPheLysLysLysAspThrlleLeuSerLeuAsnAlaCysGlul 2701 TCACCAGAAAAAACAGCTTTTAAGAAAAAGGATACCATTTTGTCCCTGAACGCTTGTGAA! AGTGGTCTTTTTTGTCGAAAATTCTTTTTCCTATGGTAAAACAGGGACTTGCGAACACTTi c SerAsnHisAlalleAlaAlalleAsnGluGlyGlnAsnLysPraGluIleGluValThrj

3 2761 AGCAATCATGCAATAGCAGCAATAAATGAGGGACAAAATAAGCCCGAAATAGAAGTCACC

TCGTT AGTACGTTATCGT CGTT ATTTACTCCCT GTTTT ATT CGGGCTTT AT CTT CAGT GGj

TrpAlaLysGlnGlyArgThrGluArqLeuCysSerGlnAsnProPraValLeuCysArgi 2821 · TGGGCAAAGCAAGGTAGGACTGAAAGGCTGTGCTCTCAAAACCCACCAGTCTTGAAACGC ACCCGTTTC|TjcCATCCT|^^CGACACGAGAGTTTTGGGTGGTCAGAACTTTGCG|

HisGlnArgGluileThrArgThrThrLeuGlnSerAspGlnGluGluIleAspTyrAspj 2881 catcaacgSgaaataactcgtactactcttcagtcagatcaagaggaaattgactatgat! gtagttgccctttattgagcatgatgagaagtcagtctagttctcctttaactgatacta; 2q 2907 mboll,

AspThrlleSerValGluMetLysLysGluAsaPheAspIleTyrAspGfuAspGluAsn ·

29A1 gataccatatcagttgaaatgaagaaggaagatJtttgacatttatgatgaggatgaaaat . CTATGGTATAGTCAACTTTACTTCTTCCTTCTAjAAACTGTAAATACTACTCCTACTTTTA I

'-&έ8ζ&£8ΐ}ζα/67χά. - _ί_!

GlnSerProArgSerPheGlnLysLysThrArgHisTyrPhelleAlaAlaValGluArg i 3001 i CAGAGCCCCCGiAGCTTTCAAAAGAAAACACGACACTATTTTATTGCTGCAGTGGAGA6G j GTCTCGGGGGCGTCGAAAGTTTTCTTTTGTGCTGTGATAAAATAACGACGTCACCTCTCC I

1C- I 3047 psfcl, ‘ 1^ I III - Γ I LeuTrpAspTyrGlyMetSerSerSerProHisValLeuArgAsnArgAlaGlnSerGly 3061 i CTCTGGGATTATGGGATGAGTAGCTCCCCACATGTTCTAAGAAACAGSGCTCAGAGTGGC I 1 SAGACCCTAATACCCTACTCATCGAGGGGTGTACAAGATTCTTTGTCCCGAGTCTCACCG 1 Ϊ SerVa1ProGInPheLysLysVa1ValPheGlnGluPheThrAspGlySerPheThrGln r 3121 ' ASTGTCCCTCAGTTCAAGAAAGTTGTTTTCCAGGAATTTACTGATGGCTCCTTTACTCAG i [ TCACAGGGAGTCAAGTTCTTTCAACAAAAGGTCCTTAAATGACTACCGAGGAÅATGAGTC j I ProLeuTyrArqGlyGluLeuAsnGluHiaLeuGlyLeuLeuGlyProTyrlleArgAla i 3181 , CCCTTATACCGTGGAGAACTAAATGAACAflTTGGGACTCCTGGGGCCATATATAAGAGCA ' ; GGGAATATGGCACCTCTTGATTTACTTGTAAACCCTGAGGACCCCGGTATATATTCTCGT >

20 .-- I

1 GluValGluAsqAsnlleMetValThrPheArgAsnGlnAlaSarArgProTyrSerPhe 3241 , GAAGTTGAAGATAATATCATGGTAACTTTCAGAAATCAGGCCTCTCGTCCCTATTCCTTC I 1 CTTCAACTTCTATTATAGTACCATTGAAAGTCTTTAGTCCGGAGAGCAGGGATAAGGAAG , I ~ i j 3247 mball, 3278 stul, l > TyrSerSerLeuIleSerTyrGluGluAspGlnArgGlnGlyAlaGluPraArgLysAsn I 3301 1 TATTCTAGCCTTATTTCTTATGAGGAAGATCAGAGGCAAGGAGCAGAACCTAGAAAAAAC |

ATAAGATCGGAATAAAGAATACTCCTTCTAGTCTCCGTTCCTCGTCTTGGATCTTTTTTG

i 332S nball, I

25 ! PheValLysProAsnGluThrLysThrTyrPheTrpLysValGlnHisHisMetAlaPra [ cDNA clone 3361 ; TTTGTCAAGCCTAATGAAACCAAAACTTACTTTTGGAAAGTGCAACATCATATGGCACCC C2‘ 1 AAACAGTTCGGATTACTTTGGTTTTGAATGAAAACCTTTCACGTTGTAGTATACCGTGGG ' ' “ 1 ‘ 3409 ndel,

I I

ThPLysAspGluPheAspCysLysAlaTrpAlaTyrPheSerAspValAspLeuGluLys 1 3421 I ACTAAAGATGAGTTTGACTGCAAAGCCTGGGCTTATTTCTCTGATGTTGACCTGGAAAAå ) TGATTTCTACTCAAACTGACGTTTCGGACCCGAATAAAGAGACTACAACTGGACCTTTTT .

i l 1 AspValHisSerGlyLeuIleGlyPraLeuLsuValCysHisThrAsnThrLeuAsnPro .

3481 ! GATGTGCACTCAGGCCTGATTGGACCCCTTCTGGTCTGCCACACTAACACACTGAACCCT

30 1 CTACACGTGAGTCCGGACTAACCTGGGGAAGACCAGACGGTGTGATTGTGTGACTTGGGA i I ~ * ‘3492 stul, 1 1 AlaHisGlyArgGlnValThpValGlnGluPbeAlaLeuPhsPheThpllePheAspGlu * 3541 1 GCTCATGGfaAGACAAGTGACAGTACAGGAATTTGCTCTGTTTTTCACCATCTTTGATGAG .

, CGAGTACCCTCTGTTCACTGTCATGTCCTTAAACGAGACAAAAAGTGGTAGAAACTACTC 1 ! ThrLysSerTrpTyrPheThrGluAsnMetGluArgAsnCysArgAlaPraCyaAanlla ! 3601 , accaaaagctggtacttcactgaaaatatggaaagaaactgcagggctccctgcaatatc ! TGGTTTTCGACCATGAAGTGACTTTTATACCTTTCTTTGACGTCCCGAGGGACGrTATAG 35 .3639 pstl, 53 DK 169708 B1 i 'GlnMetGluAspProThrPheLysGluAsnTyrArgPheHisAlalleAsnGlyTyrlle * 3661 CAGATGGAAGATCCCACTTTTAAAGAGAATTATCGcTTCCATGCAATCAATGGCTACATA ·’ GTCTACCTTCTAGGGTGAAAATTTCTCTTAATAGCGAAGGTACGTTAGTTACCGATGTAT , i

5 ‘3667 mboll, 3679 ahalll, I

'MetAspThrLeuPraGlyLeuValMetAlaGlnAspGlnArglleArgTrpTyrLeuLeu ' 3721 .ATGGATACACTACCTGGCTTAGTAATGGCTCAGGATCAAAGGATTCGATGGTATCTGCTC i ;TACCTATGTGATGGACCGAATCATTACCGAGTCCTAGTTTCCTAAGCTACCATAffACGAG ' .3753 binl, j 'SerMetGlySerAsnGluAsnl1eHisSarlleHisPhaSarGlyHisValPheThrVal , 3751 AGCATGGGCAGCAATGAAAACATCCATTCTATTCATTTCAGTGGACATGTGTTCACTGTA I TCGTACCCGTCGTTACTTTTGTAGGTAAGATAAGTAAAGTCACCTGTACACAAGTGACAT | in ArgLysLysGlu 1

*· 3841 CGAAAAAAAGAG I

GCTTTTTTTCTC I

15 20 25 30 35

Claims (3)

1. Kompleks sonde med følgende formel: TCT GTA ATG AAA TAG CGA CGA CAC CTT TCT GAC ACC CTA ATG CCG TAC CG G GG CC G

2. DNA-sekvens kendetegnet ved fra ca. 10 til 25 kbp stammende fra et pattedyrsgenom, der koder for i det mindste en fysiologisk aktiv del af Faktor VIII:C, og som hybridiserer med en sonde ifølge krav 1.

3. DNA-opbygning kendetegnet ved en DNA-sekvens 10 ifølge krav 2 knyttet til en encellet mikroorganisme-kloningsvektor.