KR940004541B1 - 트레포네마 히오디센테리아 박테린의 제조방법 - Google Patents

트레포네마 히오디센테리아 박테린의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

트레포네마 히오디센테리아 박테린의 제조방법
본 발명은 트레포네마 히오디센테리아(Trepomena hyodysenteriae) 박테린의 제조방법에 관한 것이다.
돼지 이질은 이유후의 돼지에게 주로 감염되는 심한 점액 출현성 설사이다. 이 질병은 일반적으로 화학요법제 및 항생물질의 사용을 통하여 조절되어 왔다. 지금까지, 이 질병을 억제하는데에 효과적인 비약제성 예방제는 존재하지 않았다. 혐기성 스피로헤타균인 트레포네마 히오디센테리아는 돼지 이질의 주된 병인물로서 인지된다. 미합중국 특허 제4, 100,272호에는 트레포네마 히오디센테리아의 치사된 세포를 함유하는 백신 또는 박테린을 사용하여 돼지 이질에 대한 돼지의 저항력을 증강시키는 내용이 기술되어 있다.
상기의 선행기술 방법은 박테린 생성물의 활성이 비교적 낮기 때문에 상업적으로 허용되지 못했다. 기술된 처리 스케줄에는 6가지의 정맥내 주사가 포함된다. 보다 소수의 근육내 주사를 포함하는 처리에서 사용할 수 있는 박테린이 바람직하다.
콜레스테롤이 풍부한 분취물은 몇몇 생물의 성장 촉진제로서 유용한 것으로 알려져 있다. 문헌[J.Bacteriol. Vol. 135, No. 3, pp. 818-827(1978)에는 콜레스테롤이 풍부한 분취물의 미오코플라스마 뉴모니아(Myocoplasma pneumoniae) 및 미코플라스마 아르트리티디스(Mycoplasma arthritidis)의 성장 촉진제로서의 용도가 기술되어 있다. 문헌[J. Gem. Microbiology, Vol. 116, pp. 539-543(1980)]에는 트레포네마 히오디센테리아의 성장에 있어서 USP 콜레스테롤의 용도가 기술되어 있다.
돼지 이질의 억제용으로 적합한 박테린에 계속해서 포함시키기 위하여, 콜레스테롤이 풍부한 소의 분취물을 특정적으로 사용하여 트레포네마 히오디센테리아 세포의 수율을 증가시키는 것을 제시하는 공지의 선행기술을 존재하지 않는다.
본 발명에 따라, 트레포네마 히오디센테리아 생성세포를 박테린에 계속해서 사용하기 위하여 적절한 영양배지에서 트레포네마 히오디센테리아를 성장시키는 공정이 제공되는데, 이때 영양 배지는 콜레스테롤이 풍부한 소의 분취물을 함유한다.
본 발명의 공정은 트레포네마 히오디센테리아의 병원성 균주라면 어떠한 것이라도 사용하여 수행할 수 있다. 병원성 균주는 전형적인 돼지 이질 감염을 유발시킬 수 있는 균주이다. 두가의 특정한 균주(B204 및 B234)가 이러한 목적에 유용한 것으로 밝혀졌다. 이들 균주는 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 제 ATCC 31212호(B204) 및 제 ATCC 31287호(B234)로 기탁되어 있다.
트레포네마 히오디센테리아 균주는 송아지 태아 혈청 또는 양 태야 혈청이 첨가된 트립신 콩육즙(Difco Laboratories), 덱스트로즈, 1-시스테인 HCl, 비타민 B-12, 및 효모 추출물의 혼합물로 이루어진 배지에서 성장시킬 수 있다. 본 발명에 따른 개선점은 트레포네마 히오디센테리아 세포를 성장시키기 위한 이러한 배지중에 콜레스테롤이 풍부한 소의 분취물이 포함되는 점이다. 콜레스테롤이 풍부한 소의 분취물을 배지의 용량을 기준으로 하여 1.0 내지 2.5용량%의 양으로 존재하는 것이 바람직하지만, 0.1 내지 5.0용량의 %의 양으로 사용할 수 있다.
본 발명의 공정에 사용하기에 적합한 콜레스테롤이 풍부한 소의 분취물은 몇몇 공급처로부터 판매되고 있다. 미합중국 특허 제4,290,774호에서 기술 및 청구된 공정에 따라 소의 혈청으로부터 제조한 콜레스테롤 콘센트레이트 코드 82-010(Cholesterol Concentrate Code 82-010)(Miles Scientific Division of Miles Laboratories, Inc. 에서 판매)이 유용하다. 또 하나의 유용한 물질은 보빈 콜레스테롤 콘센트레이트 리스트 3200(Bovine Cholesterol Concentrate List 3200)(Biocell Laboratories에서 판매)이다. 본 발명의 공정에 사용되는 바람직한 콜레스테롤이 풍부한 소의 분취물은,
(a) 액체상의 콜레스테롤을 함유한 소의 혈장이나 혈청 또는 그의 분취물을 실리카 흡착제와 접촉시켜 콜레스테롤을 흡착시키는 단계 ;
(b) 흡착된 콜레스테롤을 남아있는 액체상의 혈장 또는 혈청으로부터 분리시키는 단계 ;
(c) 흡착된 콜레스테롤을 동결 및 해빙시키는 단계 ;
(d) 흡착된 콜레스테롤을 9.0 내지 11.5의 pH에서 용출시키는 단계 ;
(e) 용출된 콜레스테롤 용액을 한외여과로 농축시키는 단계 ;
(f) 농축된 콜레스테롤 용액의 pH를 11.0 내지 11.4로 조절하는 단계 ;
(g) 농축된 콜레스테롤 용액을 탄산나트륨과 물에 대하여 연속적으로 투석하는 단계 ;
(h) 투석한 콜레스테롤 용액을 한외여과로 더욱 농축시켜 콜레스테롤의 농도를 50 내지 3000mg/dl로 만드는 단계 ;
(i) 농축된 콜레스테롤 용액의 pH를 7.0 내지 11.0으로 조절하는 단계 ;
(j) 농축된 콜레스테롤 용액을 50 내지 100℃에서 30분 내지 24시간 동안 가열하는 단계 ;
(k) 콜레스테롤이 풍부한 정제된 소의 분취물을 회수하는 단계를 포함하는 공정으로 제조한다.
이러한 특정 분취물 및 그의 제조공정은 본 발명과 동시에 출원되었으나 공동 양수인에게 양도된 공동 계류중인 미합중국 특허원 제 732,856호에 기술 및 청구되어 있다.
콜레스테롤이 풍부한 분취물의 제조에 사용되는 출발물질은 콜레스테롤을 함유하는 소의 혈액 혈장이나 혈청 또는 그의 분취물이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 바람직한 출발물질은 소의 혈청이다. 출발물질이 혈청인 경우, 가용성 염(예 : 시트르산 나트륨)을 0.25 내지 1.0의 이온 강도로 가하는 것이 바람직하다. 기타의 적절한 염에는 염화나트륨, 인산나트륨, 인산칼륨, 황산암모늄 및 황산나트륨이 포함된다. 가용성 염을 상기에서 언급한 농도로 가하면, 이어지는 실리카 흡착 단계에서 흡착되는 콜레스테롤의 양이 증가한다. 소의 혈장은 보통 시트르산 염을 항응고제로서 첨가하는 것을 포함하는 방법으로 수거한다. 이 염의 농도는 보통 흡착 단계에 사용하기에 충분하며, 그밖의 염을 더 첨가할 필요는 전혀 없다.
혈장 또는 혈청 출발물질은 0 내지 50℃, 바람직하게는 20 내지 25℃의 온도에서 유지시킨다. pH는 5.5 내지 9.0, 바람직하게는 7.0 내지 8.0으로 조절한다.
본 발명에 유용한 실리카 흡착제는 까다로운 조성을 갖지 않는다. 적절한 실리카 물질은 카보실(Cabosil)이란 상품명으로 시판(Cabot Corporation에서 판매)되는 미세 실리카 및, 에로실 380(Aerosil 380)이란 상품명으로 시판(Cary Company에서 판매)되는 실리카 분말이다. 액체 혈장 또는 혈청에 가하는 실리카의 양은 2 내지 50g/ℓ, 바람직하게는 10 내지 20g/ℓ이다.
액체 혈장 또는 혈청에 현탁시킨 실리카 현탁액을 약 3 내지 4 시간 동안 혼합한다. 흡착된 콜레스테롤이 함유된 실리카를 남아 있는 액체 혈장 또는 혈청으로부터 분리시키는데, 이때 원심분리로 분리시키는 것이 바람직하며, 이어서 액체 상을 버린다. 실리카 페이스트를 -20℃에서 동결시킨 다음, 이 온도에서 1주일 이상, 바람직하게는 2주일 동안 보존한다. 이어서, 동결된 페이스트를 24 내지 48시간 동안에 걸쳐 실온(약 20 내지 25℃)으로 해빙시킨다. 해빙된 페이스트로부터 분리되는 액체는 모두 버린다.
실리카 페이스트를 세척하여 바람직하지 못한 단백질을 모두 제거한다. 이는 약 0.15M의 염화나트륨을 함유하는 수성염 용액중에 페이스트를 현탁시켜 수행한다. 기타의 유용한 염은 나트륨 아세테이트 및 인산 나트륨이다. 염 용액은 페이스트 중량의 약 2배를 사용한다. 페이스트를 액체로부터 분리시킨다. 이러한 염용액을 사용한 세척공정을 2회 반복하여 흡수된 단백질을 제거하는 것이 바람직하다.
세척한 페이스트를 약 2용량의 탈염수 또는 증류수에 현탁시킨 다음, 적절한 알칼리성 물질(예 : 수성 수산화나트륨)을 가하여 pH를 9.0 내지 11.5, 바람직하게는 10.4 내지 10.6으로 조절한다. 현탁액을 약 2시간동안 교반하는데, 이동안 상기의 알칼리성 물질을 주기적으로 가하여 pH를 목적한 수준으로 유지시킨다.
이와 같이 처리하면, 목적한 콜레스테롤 분취물이 실리카로부터 용출된다. 이어서, 현탁액을 12 내지 24시간, 바람직하게는 12 내지 18시간 동안 침전시킨다. 콜레스테롤이 함유된 상등액을 더욱 처리하기 위하여 사이핀으로 빨아올린다. 콜레스테롤이 풍부한 목적한 분취 생성물을 제조하기 위하여 이러한 첫번째 용출물만을 사용하는 것이 바람직하다. 그러나, 상기의 알칼리 현탁단계, 용출단계, 교반단계 및 침전단계를 2회이상 반복하여 두번째 및 세번째 용출물로 부터의 상등액을 첫번째 용출물질과 함께 모을 수 있다. 실리카는 버린다.
콜레스테롤 용액을 여과 및 원심분리로 정제하여 실리카를 완전히 제거시킨 다음, 한외 여과법을 이용하여 초기 용적의 15 내지 50%, 바람직하게는 20%로 농축시킨다. 알칼리를 첨가하여 pH를 11.0 내지 11.4, 바람직하게는 11.2로 조절한다. 이는 잔류하는 실리카를 제거시키기 위한 가용화 단계를 도움을 준다.
콜레스테롤 농축물을 처리하여 존재하는 염을 거의 모두 제거시킨다. 염을 제거하기 위한 바람직한 방법은 탄산나트륨과 물에 대하여 연속적으로 투석하는 것이다. 이러한 염 제거단계는 이어지는 열 처리단계 때문에 중요하다. 상당한 양의 염이 존재하면, 가열할때에 콜레스테롤의 바람직하지 못한 변성이 야기된다.
투석된 콜레스테롤 용액을 한외여과로 더욱 농축시켜 콜레스테롤의 농도를 50 내지 300mg/dl, 바람직하게는 1000 내지 2000mg/dl로 만든다.
농축된 콜레스테롤 용액의 pH를 7.0 내지 11.0, 바람직하게는 7.6으로 조절하여, 이를 성장 배지에 사용하기에 가장 적합한 상태로 만든다. 용액을 30분 내지 24시간, 바람직하게는 30 내지 60분 동안 50 내지 100℃, 바람직하게는 80℃로 가열하여 콜레스테롤의 보관 안정성을 증가시킨다. 용액을 실온으로 냉각시킨 다음, 멸균 여과시켜 콜레스테롤이 풍부한 정제된 분취물을 회수한다. 이 생성물은 순수한 콜레스테롤이 아니라, 제조공정을 통과한 소량의 미확인 물질과 혼합된 것이다.
순수한 콜레스테롤은 콜레스테롤이 풍부한 소의 분취물에 의해 달성된 방식으로는 트레포네마 히오디센테리아의 성장에 조금도 영향을 미치지 않으므로 본 발명에 사용하기에 부적당하다.
트레포네마 히오디센테리아 세포는 이 분야의 숙련가에게 잘 알려진 조건하에 콜레스테롤이 풍부한 소의 분취물을 함유하는 배지에서 성장시킨다. 그런다음, 생성된 세포를 포르말린, 메르티올레이트 또는 베타-프로피올락톤과 같은 약제를 사용하여 매우 잘 알려진 방법으로 치사시킨다. 세포를 수거한 다음, 적절한 담체 배지에 현탁시켜 목적한 박테린을 제조한다.
박테린의 활성은 보조제를 사용하여 보다 증강시킬 수 있다. 본 발명의 공정에 따라 제조된 트레포네마 히오디센테리아 세포와 함께 사용하기에 바람직한 보조제는 폴리알릴사카리드와 가교결합된 아크릴산 중합체와 미합중국 특허 제3,919,411호에 기술 및 청구된 특정한 유제 시스템과의 혼합물이다. 이러한 보조제는 하브로겐(HAVLOGEN)이란 상품명으로 시판(the Bayvet Division of Miles Laboratories, Inc.에서 판매)되고 있다.
상기의 방법으로 제조한 트레포네마 히오디센테리아 박테린을 3주간 간격으로 단 2회만 근육내 주사함으로써 돼지 이질에 대한 돼지의 저항력을 상당히 증가시킬 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예로 더욱 설명된다.
[실시예 1]
콜레스테롤이 풍부한 소의 분취물을 하기의 방법으로 제조한다. 신선한 소의 혈청을 20 내지 25℃의 온도로 만든 다음, 14.7g/ℓ의 시트르산 나트륨(혈청의 이온 강도 : 0.5)을 가한다. 생성된 용액을 30분 동안 진탕시킨 다음, 적당량의 1N 수산화나트륨을 가하여 pH를 7.0으로 조절한다. 미분된 실리카를 10g/ℓ의 양으로 가한 다음, 생성된 슬러리를 실온에서 3시간 동안 진탕시킨다. 흡착된 물질이 함유된 실리카를 원심분리에 의하여 액체상으로 부터 분리시킨 다음, 액체를 버린다. 실리카 페이스트를 -20℃에서 동결시킨 다음, 그 온도에서 2주일 동안 보관한다. 동결된 페이스트를 48시간 동안에 걸쳐 실온에서 해빙시킨다. 생성된 액체를 버린다. 실리카 페이스트를 2용량의 0.85%(중량/용량) 염화나트륨 수용액(0.146M NaCl)중에 현탁시킨다. 이를 15분 동안 서서히 혼합하고, 이어서 적어도 3시간 이상 동안 침전시킨다. 상등액을 사이핀으로 빨아올려 버린다. 이 세척단계를 2회 반복한다. 세척된 페이스트를 2용량의 탈염수에 현탁시킨다. 1N 수산화나트륨을 가하여 pH를 10.5로 조절한다. 생성된 현탁액을 실온에서 2시간 동안 교반하는데, 이동안 pH를 10.5로 재조정한다. 교반을 멈추고, 현탁액을 18시간동안 침전시킨다. 상등액을 사이펀으로 분리시킨 다음, 여과 및 원심분리로 정제한다. 실리카를 버린다. 정제된 용액을 한외여과로 초기 용량의 20%로 농축시킨다. 농축된 물질에 1N 수산화나트륨을 가하여 pH를 11.2로 조절한다. 농축된 물질을 pH 11.2에서 6용량의 0.01M 탄산나트륨에 대하여 투석한다. 이어서, 이를 6용량의 탈염수에 대하여 투석한다. 농축물의 콜레스테롤 농도를 공지의 기술로 분석한 다음, 한외여과로 더욱 농축시켜 콜레스테롤의 농도가 1000mg/dl로 되게 한다. 1N 염산을 가하여 pH를 7.6으로 조절한 다음, 생성된 용액을 80℃에서 1시간 동안 가열한다. 용액을 실온으로 냉각시킨 다음, 멸균여과시킨다. 여과된 물질을 콜레스테롤이 풍부한 정제된 소의 분취물로서 회수한다.
트레포네마 히오디센테리아 균주 ATCC-31212의 동결된 사이드(seed)를 13ml의 트립신 콩육즙(Difco Laboratories, 27.5g/ℓ), 10%의 송아지 태아 혈청, 0.5%의 덱스트로오즈, 0.05%의 1-시스테인 HCl 및 0.25mog/ml의 비타민 B-12가 함유된 유리관에 주입시킨다. 이러한 %는 중량/용량을 기준으로 한다. 관을 밀봉한 다음, 10용량%의 수소, 80용량%의 질소, 10용량%의 이산화탄소를 함유하는 염기성 대기하에 37℃에서 72시간 동안 배양한다. 생성된 시이드 배양물을 동일한 배지가 함유된 2개의 관에 옮긴다음, 이를 동일한 조건하에 37℃에서 24시간 동안 배양한다.
관의 내용물은 모은다. 200ml의 트립신 콩육즙, 1%의 효모 추출물, 5%의 양의 혈청, 0.5%의 덱스트로오즈, 0.05%의 1-시스테인 HCl 및 0.25mog/ml의 비타민 B-12를 각각 함유하는 2개의 500ml들이 병에 상기에서 모은 활성 시이드 배양물 7ml 분획씩을 각각 가한다. 이러한 %는 중량 용량을 기준으로 한다. 병속의 내용물을 상기에서 언급한 혐기성 대기하에 37℃에서 혼탁해질때까지(약 24시간 동안) 배양한다.
생성된 성장 시이드 배양물을 2분획으로 나눈 다음, 각 분획을 단독으로 사용하여 7ml의 트립신 콩육즙, 1%의 효모 추출물, 3%의 양의 혈청, 1%의 덱스트로오즈, 0.05%의 1-시스테인 HCl 및 0.25mog/ml의 비타민 B-12가 각각 함유된 2개이 14ℓ들이 파일럿 발효기중 하나에 주입시킨다. 이러한 %는 중량/용량을 기준으로 한다. 발효기중 하나를 상기에서 기술한 바와 같이 제조한 콜레스테롤이 풍부한 소의 분취물 2.5용량%로 더욱 보충한다. 두개의 발효기를 모두 상기에서 언급한 혐기성 대기하에 37℃에서 44시간 동안 배양한다. 5N 수산화나트륨을 주기적으로 가하여 pH를 6.5로 조절한다.
상기의 배양이 끝나갈때, 각 발효기로부터 적절한 샘플을 채취하고, 이어서 발효기의 내용물을 0.15용량%의 포르말린으로 처리하여 세포를 비활성화시킨다. 세포샘플을 현미경적으로 조사한 다음, 총 세포수를 페트로프-하우저 계산 챔버(Petroff-Hauser counting chamber)에서 측정하고, 5%의 소 혈액을 새로이 부은 아가 판상에서 연속적으로 희석하여 생존 세포수를 측정한다. 혈액 아가판을 50용적%의 수소 및 50용량%의 이산화탄소로 이루어진 혐기성 대기하에 37℃에서 4일동안 배양한다. 트레포네마 히오디센테리아 콜로니를 용혈현상의 개별 지역으로서 관찰한다. 이들 조사의 결과는 하기의 표 1에 기재된 바와 같다.
[표 1]
Figure kpo00001
콜레스테롤이 풍부한 소의 분취물이 존재하면, 총 세포수가 2배로 되고, 생존 세포수가 100배 증가하며, 세포 형태에 양성적인 영향을 미친다는 것을 상기의 데이타로 부터 알 수 있다.
[실시예 2]
상기의 실시예 1에서 기술한 바와 같이 제조한 트레포네마 히오디센테리아 ATCC-31212의 시이드 배양물을 200ml의 트립신 콩육즙, 1%의 효모 추출물, 3%의 양의 혈청, 1%의 덱스트로오즈, 0.05%의 1-시스테인 HCl 및 0.25mog/ml의 비타민 B-12가 각각 함유된 3개의 500ml들이 병에 3용량%의 농도로 주입시킨다. 이러한 %는 중량/용량을 기준으로 한다. 병중의 하나(대조물)에는 실시예 1에서 기술한 바와 같이 제조한 콜레스테롤이 풍부한 소의 분취물 2.5용량% 함유시킨다. 다른 하나의 병에는 콜레스테롤 콘센트헤이트 코드 82-010(Miles Laboratories, Inc.에서 판매)를 2.5% 함유시킨다. 남은 하나의 병에는 보빈 콜레스테롤 콘센트헤이트 리스트 3200(Biocell Laboratories에서 판매)을 2.5용량% 함유시킨다. 접종시킨 이들 병을 10용량%의 수소, 80용량%의 질소 및 10용량%의 이산화탄소로 이루어진 혐기성 대기하에 37℃에서 38시간동안 배양시킨다. 병의 내용물에 2N 수산화나트륨을 가하여 24 내지 31시간에서 pH가 7.0이 되도록 조절한다. 각 병의 총세포수를 페트로프-하우저 계산 챔버에서 측정한다. 결과는 하기의 표 2에 기재된 바와 같다.
[표 2]
Figure kpo00002
여러 공급처로부터의 콜레스테롤이 풍부한 소의 분취물을 사용하여 바람직하게 많은 세포수의 트레포네마 히오디센테리아를 제조할 수 있다는 것을 상기의 데이타로부터 알 수 있다.
[실시예 3]
바람직한 콜레스테롤 분취물로 보충된 배지와 트레포네마 히오디센테리아 균주 ATCC-31287를 사용하여 실시예 1의 공정을 일반적으로 반복하여 고농도의 세포를 제조한다.
[실시예 4]
성장 배지중에서 바람직한 콜레스테롤 분취물을 사용하여 실시예 1에서 기술한 방법으로 제조한 치사시킨 트레포네마 히오디센테리아 세포를 10용량%의 HALOGEN 보조제(참조 : 미합중국 특허 제3,919,411호) 및 1 : 10,000 머티올레이트와 혼합하여 백신 또는 박테린을 제조한다. 백신은 1ml당 2×10개의 세포를 함유한다. 수득한 백신을 5가지의 개별적인 도전시험에 사용하여 돼지 이질에 대한 백신의 효율성을 측정한다. 각각의 백신 접종/도전시험에 있어서, 돼지는 돼지 이질을 앓는 적이 없는 무리중에서 선택되며, 혼성이고, 일반적인 요오크셔, 햄프셔 또는 크로스 종이다. 1차 백신 접종할 때에 돼지는 이유후 적어도 3주일 경과되었으며, 35 내지 40ℓb이다.
모든 백신 접종 도전시험은 백신 접종한 돼지와 돼지를 격리시킬 수 있는 분리시설에서 수행한다. 항생제를 전혀 함유하지 않는 단백질 성장 식량을 돼지에게 공급한다. 도전하기 전에, 돼지의 직장을 면봉으로 닦고, 이어서 트레포네마 히오디센테리아 및 살모넬라(Salmonella) 종이 없는 것을 확인한 다음, 적절한 분리배지에서 시험한다.
최종세포수를 치사시키지 않는 것을 제외하고는 실시예 1과 유사한 공정으로 성장시킨 트레포네마 히오디센테리아 균주 ATCC-31212 또는 -31287를 사용하여 돼지를 위장내적으로 도전한다. 도전용량은 108내지 109개의 미생물을 함유하도록 희석한 100ml의 활성 배양물로 이루어지는데, 이를 각 돼지에게 위관을 통하여 투석한 다음, 48시간 동안 단식시킨다.
도전 받은 각 돼지를 도전 후 28일 동안의 관찰기간 동안 1일 기준으로 관찰한다. 임상적인 질병이 시작되면, 이질에 걸린 돼지의 직장을 면봉으로 닦아 원인물질을 분리시킨다. 면봉을 스펙티노마이신(Spectinomycin) 혈액 아가판에서 준 배양한 다음, 42℃에서 4 내지 6일 동안 배양하고, 이어서 스피로헤타균의 존재를 위한 용혈 아가반을 현미경적으로 조사함으로써 트레포네마 히오디센테리아 감염을 확인한다. 5개의 시험동안 사망한 각 돼지를 부검한다. 결장 점막으로부터 채취한 직장 면봉을 상기에서와 같이 준배양한다.
각 돼지의 도전에 대한 임상적인 반응은 하기의 임상지수를 사용하여 측정한다.
Figure kpo00003
각종 분석 방법을 이용하여 임상지수 데이타를 평가하면, 하기와 같이 정의된다.
a) 1일 임상지수(DCI)-도전 받은 각 돼지의 1일 임상지수는 상기에서 언급한 세가지 변수를 사용하여 계산한다.
DCI=일반적인 상태+분변의 조성+분변의 경도
b) 1일 그룹 임상지수(DGCI)-백신 접종 그룹과 대조 그룹의 1일 그룹 임상지수는 하기의 방정식으로 계산한다 :
Figure kpo00004
c)개별적인 누적 임상지수(ICCI)-도전후 총 28일 동안에 걸친 각 돼지의 누적 임상지수는 하기와 같이 계산한다 :
Figure kpo00005
d) 그룹 누적 임상지수(GCCI)-백신 접종 그룹과 대조 그룹의 그룹 누적 임상지수는 하나의 특정그룹내에서 각 돼지의 ICCI를 평균하여 수득한다.
Figure kpo00006
시험 1 : 10 마리의 돼지를 두개의 방에 똑같이 나누어 넣는다. 5마리의 백신 접종 그룹은 상기에서 언급한 백신을 5ml의 근육내 투여용량으로 3주일 간격으로 2회 접종한다. 5마리의 백신 접종하지 않은 대조군 돼지는 다른 방에 넣는다. 2회 접종한 지 2주일 후, 모든 돼지를 바이러스 트레포네마 히오디센테리아 ATCC-31212로 도전한다.
시험 2 :29마리의 돼지를 분류하여 23마리의 백신 접종 그룹을 5개의 방에 넣고, 6마리의 대조 그룹을 2개의 방에 넣는다. 백신 접종 그룹은 상기에서 언급한 박테린을 5ml의 근육내 투여용량으로 3주일 간격으로 2회 접종한다. 시험 1에서와 동일하게 도전한다.
시험 3 :10마리의 돼지를 두개의 방에 똑같이 나누어 넣는다. 5마리의 백신 접종 그룹은 상기에서 언급한 박테린을 5ml의 근육내 투여 용량으로 3주일 간격으로 2회 접종한다. 나머지 5마리의 돼지는 백신 접종하지 않은 대조군으로서 사용한다. 2차 접종한지 주일 후, 모든 돼지를 바이러스 트레포네마 히오디센테리아 ATCC-31287로 도전한다.
시험 4 :46마리의 돼지를 분류하여 36마리의 백신 접종 그룹을 9개의 방에 넣고, 10마리의 백신 접종하지 않은 대조 그룹을 2개의 방에 넣는다. 백신 접종 그룹은 상기에서 언급한 박테린을 5ml의 용량으로 3주일 간격으로 2회 접종한다. 시험 3에서와 동일하게 도전한다.
시험 5 :46마리의 돼지를 분류하여 36마리의 백신 접종 그룹을 9개의 방에 넣고, 10마리의 백신 접종하지 않은 대조 그룹을 2개의 방에 넣는다. 백신 접종 그룹은 상기에서 언급한 박테린을 5ml의 용량으로 3주일 간격으로 2회 접종한다. 시험 1에서와 동일하게 도전한다.
5개 시험은 총 105마리의 백신 접종 돼지와 36마리의 대조 돼지를 포함한다. 5개 시험의 결과를 요약하면 표 3 및 4와 같다.
[표 3]
Figure kpo00007
균주 ATCC-31212로 위장내적으로 도전하면, 백신 접종 돼지에서 17.2%(64마리중 11마리)의 임상적 이질이 관찰되고, 대조군 돼지에서 71.4%(21마리중 15마리)의 임상적 이질이 관찰된다. 이는 백신 접종 돼지에서 임상적 이질이 발생하는 실제적인 경우가 75.9% 감소되는 것을 나타낸다. 도전후 총 28일간의 관찰기간 동안 계산한 누적 임상지수(GCCI)는 백신 접종하지 않은 대조군이 83.2인 것에 비하여 백신 접종 그룹은 10.4이다. 이는 임상지수로 측정되는 바와 같이 전체적인 임상적 증세(설사, 이질, 수척함, 사망)에서 87.5%의 감소를 나타낸다. 대조군 돼지는 21마리중 5마리가 도전 후에 사망(23.8%)하였으나, 백산 접종 돼지는 한 마리도 사망하지 않았다. 백신 접종 돼지에서는 임상적 이질의 시작이 지연되고, 임상적 질병의 지속기간도 감소된다. 백신 접종 그룹에서는 식욕감퇴증상이 다소 저하된다.
[표 4]
Figure kpo00008
대조 그룹
Figure kpo00009
균주 ATCC-31287로 위장내적으로 도전하면, 백신 접종 돼지에서 35.4%(41마리중 14마리, 1마리±)의 임상적 이질이 관찰되고, 대조군 돼지에서 70.0%(15마리중 10마리, 1마리 ±)의 임상적 이질이 관찰된다. 이는 백신 접종 돼지에서 이질이 발생하는 실제적인 경우가 49.4% 감소되는 것을 나타낸다. 백신 접종 돼지의 그룹 누즉 임상지수는 백신 접종하지 않은 대조군이 73.5인 것에 비하여 18.6이다. 이는 백신 접종 그룹의 전체적인 임상적 증세에서 74.7%의 감소를 나타낸다. 대조군 돼지는 15마리중 2마리가 도전후에 사망(13.3%)하였으나, 백신 접종 돼지는 한 마리도 사망하지 않았다. 백신 접종 돼지에서는 임상적 이질의 시작이 상당히 지연되었으며, 임상적 질병의 지속기간도 감소되었다.
임상적 이질의 원인물질로서의 트레포네마 히오디센테리아의 확인은 직장면봉을 스펙테노마이신 혈액 아가 판상에서 준배양한 경우에서 성취된다. 동시에, 살모넬라종을 위한 선택적인 배지상에서 준배양하면, 음성적인 결과가 나타난다.
사망한 돼지의 결장 내용물을 유혈성이며 물과 같고, 결장자체는 심한 염증이 있으며 융모가 없다. 부검시에 장내 벽으로부터 채취한 직장면봉은 트레포네마 히오디센테리아에 대하여 양성적이며, 살모넬라종에 대하여 음성적이다. 도전후 28일째에 보호된 백신 접종 그룹으로부터 채취한 직장면봉은 42℃의 온도하에 스펙티노마이신 혈액 아가판상에서 준배양한 모든 경우에서 음성적이다.
총 141마리의 백신 접종 돼지와 대조군 돼지를 고려하여, 5가지의 시험을 통한 임상적 반응을 표 5로 요약할 수 있다. 36마리의 백신 접종하지 않은 대조 그룹중에서 25.5마리(70.8%)가 임상적 이질에 걸린 것에 비하여, 백신 접종 그룹은 105마리중에서 25.5마리(24.3%)가 임상적 이질에 걸렸다. 이는 모든 백신 접종 돼지에서 임상적 이질이 발생하는 비율이 65.7% 감소된 것을 나타낸다. 백신 접종 돼지는 도전 후에 한마리도 사망하지 않았으나, 대조군 돼지는 36마리중 7마리(19.4%)가 도전 후에 사망했다. 총 105마리의 백신접종 돼지의 그룹 누적 임상지수는 13.6이며, 36마리의 백신 접종하지 않은 대조 그룹의 GCCI는 79.2이다.
이는 모든 백신 접종 돼지의 전체적인 임상적 증세(설사, 이질, 수척함, 사망)에서 82.8%의 감소를 나타낸다.
5가지의 개별 시험으로부터 수득한 백신 접종/도전의 결과를 고려하여 내릴 수있는 결론은, 트레포네마 히오디센테리아 박테린은 돼지 이질을 방지하는 데에 있어서 보조제로서 실지 조건하에서 사용할 경우, 한정된 정도의 효력을 나타낸다는 것이다.
[표 5]
Figure kpo00010
백신 접종 도전시험 1,2,3,4,5
트레포네마 히오데센테리아 균주 ATCC-31212 및 -31287로 위장내적으로 도전받은 돼지의 임상적 반응

Claims (6)

  1. 트레포네마 히오디센테리아 세포를 박테린중에 계속해서 사용하기 위하여 콜레스테롤이 풍부한 소의 분취물을 함유하는 적절한 영양배지 중에서 트레포네마 히오디센테리아를 성장시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 콜레스테롤이 풍부한 소의 분취물이
    (a) 액체상의 콜레스테롤을 함유하는 소의 혈장이나 혈청 또는 그의 분취물을 실리카 흡착제와 접촉시켜 콜레스테롤을 흡착시키는 단계
    (b) 흡착된 콜레스테롤을 남아있는 액체상의 혈장 또는 혈청으로부터 분리시키는 단계
    (c) 흡착된 콜레스테롤을 동결 및 해빙시키는 단계
    (d) 흡착된 콜레스테롤을 9.0 내지 11.5의 pH에서 용출시키는 단계
    (e) 용출된 콜레스테롤 용액을 한외여과로 농축시키는 단계
    (f) 농축된 콜레스테롤 용액의 pH를 11.0 내지 11.4로 조절하는 단계
    (g) 농축된 콜레스테롤 용액을 탄산나트륨과 물에 대하여 연속적으로 투석하는 단계
    (h) 투석시킨 콜레스테롤 용액을 한외여과로 더욱 농축시켜 콜레스테롤의 농도를 50 내지 3000mg/dl로 만드는 단계
    (i) 농축된 콜레스테롤 용액의 pH를 7.0 내지 11.0으로 조절하는 단계
    (j) 농축된 콜레스테롤 용액을 50 내지 100℃에서 30분 내지 24시간 동안 가열하는 단계 , 및
    (k) 콜레스테롤이 풍부한 정제된 소의 분취물을 회수하는 단계를 포함하는 공정으로 제조되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 영양배지가 콜레스테롤이 풍부한 소의 분취물 0.1 내지 5.0용량%를 함유하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 영양배지가 콜레스테롤이 풍부한 소의 분취물 1 내지 2.5용량%를 함유하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 영양배지가 콜레스테롤이 풍부한 소의 분취물 2.5용량%를 함유하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 영양배지가
    (a) 액체상의 콜레스테롤을 함유하는 소의 혈장 또는 혈청을 실리카 흡착제와 접촉시켜 콜레스테롤을 흡착시키는 단계, 콜레스테롤을 흡착시키는 단계
    (b) 흡착된 콜레스테롤을 남아있는 액체상의 혈장 또는 혈청으로부터 분리시키는 단계
    (c) 흡착된 콜레스테롤을 동결 및 해빙시키는 단계
    (d) 흡착된 콜레스테롤을 10.4 내지 10.6의 pH에서 용출시키는 단계
    (e) 용출된 콜레스테롤 용액을 한외여과로 농축시켜 용적을 출발용량의 15 내지 50%로 만드는 단계
    (f) 농축된 콜레스테롤 용액의 pH를 11.2로 조절하는 단계
    (g) 농축된 콜레스테롤 용액을 탄산나트륨과 물에 대하여 연속적으로 투석하는 단계
    (h) 투석시킨 콜레스테롤 용액을 한외여과로 더욱 농축시켜 콜레스테롤의 농도를 1000 내지 2000mg/dl로 만드는 단계
    (i) 농축된 콜레스테롤 용액의 pH를 7.6으로 조절하는 단계
    (j) 농축된 콜레스테롤 용액을 80℃에서 30분 내지 60분 동안 가열하는 단계 , 및
    (k) 콜레스테롤이 풍부한 정제된 소의 분취물을 회수하는 단계를 포함하는 공정으로 제조된 콜레스테롤이 풍부한 소의 분취물 1 내지 2.5용량%를 함유하는 방법.
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