JPS6233879B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、日本脳炎ウイルスの精製方法、さら
に詳しくは、日本脳炎ウイルス含有液を、不活化
処理または不活化することなく、セルロース硫酸
エステルゲルに接触せしめ、日本脳炎ウイルスを
吸着させた後、日本脳炎ウイルスを該ゲルから溶
出することにより日本脳炎ウイルスを精製する方
法に関する。 発明の技術的背景と産業上の利用分野 日本脳炎は日本脳炎ウイルスによつておこる人
畜共通の伝染病であり、北は日本、シベリア東部
海岸、西は中国大陸、インド、南はインドネシア
といつた限られた地域に、病原ウイルスの存在が
確かめられている。ヒトでは過去15年間に特に患
者数の多かつたのは日本、韓国、台湾であつた。
とくに、日本では法定伝染病として、その防疫に
力が注がれている。近年になつて、タイ、ベトナ
ム、インドでかなりの症例が発生し、大きな社会
問題となつた。本ウイルスによつて動物ではウマ
が比較的発症しやすく、ブタでは妊娠ブタが感染
すると死流産をおこすことが知られている。また
ブタはカからヒトへの伝播の過程でウイルスの増
幅動物として重要である。 日本脳炎の病原ウイルスは球型で直径約50n
ｍ、２種の蛋白と脂質からなるエンベロープに、
核蛋白（１分子のリポ核酸と１種の蛋白からな
る）のコアが含まれている。このウイルスは、節
足動物、鳥類、爬虫類、哺乳類に広い感染宿主域
をもち、アルボウイルス群に属し、コガタアカイ
エカやアカイエカをベクターとして伝播される。
日本脳炎は夏季に流行し、不顕性感染が多いが、
ヒトでは、一旦発病すれば40℃以上の高熱とな
り、意識障害、けいれんなどの脳症状に移行し、
致死率が高く、回復しても予後はきわめて悪い。 このような日本脳炎の発病の機構はまだ不明な
点もあるが、その実用的な予防手段としては、現
在のところワクチン注射しかない。ワクチンとし
ては、不活化ワクチンと生ワクチンが実用化され
ており、安全性を考慮して、前者はとくにヒト、
ウマに、後者は主としてブタに応用されている。 従来技術 日本脳炎ワクチンの製造には、原材料として、
主に日本脳炎ウイルス感染動物として感染発症マ
ウスの脳材料である脳乳剤または組織培養細胞を
用いて日本脳炎ウイルスを増殖させた培養物材料
が用いられる。不活化ワクチンにおいては、副作
用の要因となる不純物が除去され、且つ抗原濃度
の高い製剤を得るため、充分に濃縮精製したウイ
ルスを用いる必要がある。その濃縮精製方法とし
ては、従来、下記製法Ｉに示すようなアルコール
沈殿法と製法に示すような超遠心法またその併
用が知られている（予研学友会編、日本のワクチ
ン、丸善、東京、昭和52年を参照）。

【表】

【表】 精製ワクチン
しかしながら、このような従来法では、原材料
のマウス脳乳剤に含まれるマウスに由来するヘモ
グロビンの除去、すなわちマウスの放血操作が余
儀なくされ、多大の工程を要し操作が煩雑であ
り、目的物質の損失も多い欠点があるため、工業
的なワクチン製造には充分でない。 発明の目的 本発明者らは、従来法における煩雑な工程を避
け、マウスの放血処理と必要とせず、カラムクロ
マトグラフイまたはバツチ法にて、より簡単に且
つより安価に日本脳炎ウイルスを精製する方法を
見い出すべく種々研究を重ねた結果、セルロース
を硫酸エステル化して得られるセルロース硫酸エ
ステルゲルが日本脳炎ウイルスと特異的に親和性
を有することを知り、この知見にもとづき、日本
脳炎ウイルスの遊離液または濃縮液などの日本脳
炎ウイルス含有液を、不活化処理後、または不活
化しないで、セルロース硫酸エステルゲルに接触
せしめ、日本脳炎ウイルスを吸着させた後、該セ
ルロース硫酸エステルゲルから溶出することによ
り、高純度の日本脳炎ウイルスがきわめて簡単に
しかも非常に高い収率で得られることを発見し、
本発明を完成するに至つた。 すなわち本発明の目的は、日本脳炎ウイルス
を、高収率でかつきわめて高純度にまで精製する
方法を提供することにある。 発明の構成および効果 本発明は、日本脳炎ウイルス含有液を、セルロ
ース硫酸エステルゲルに接触せしめ、日本脳炎ウ
イルスを吸着させた後、該ゲルから日本脳炎ウイ
ルスを溶出することを特徴とする日本脳炎ウイル
スの精製方法である。 本発明において出発材料として用いられる日本
脳炎ウイルス含有液としては、日本脳炎ウイルス
感染マウス脳乳剤をプロタミンおよび炭末処理し
て得られる日本脳炎ウイルス浮遊液またはこれを
例えば限外過法などにより若干濃縮した溶液を
含む。この日本脳炎ウイルス含有液をそのまま、
またホルマリン添加などの常法により不活化処理
したのちに本発明の精製方法に供される。また、
組織培養法で得られた日本脳炎ウイルス培養材料
も同様に供される。さらに、日本脳炎ウイルス材
料が遺伝子組換え体を利用して得られたものであ
つてもよい。 本発明で用いられるセルロース硫酸エステルゲ
ルとは、セルロースを硫酸エステル化して得られ
るのであるが、好ましくは結晶セルロースあるい
は、結晶領域および非結晶領域からなるセルロー
スを硫酸エステル化したものが良い。この場合、
得られたセルロース硫酸エステルは原料の形状を
保持し、水性媒質に不溶性であり、物理的安定性
にすぐれ、クロマトグラフイ用ゲルとして好適で
ある。これらの原料セルロース類はすでに市販さ
れており例えば、セルロフアインGC−15、同GH
−25、同GC−100、同GC−200（チツソ社製）、
アビセル（旭化成工業社製）などがある。これら
のゲルを例えばビピリジンなどの有機溶媒の存在
下クロルスルホン酸、無水硫酸などを作用させる
ことにより所望のセルロース硫酸エステルゲルが
得られる。 本発明において、セルロース硫酸エステルゲル
を用いて、日本脳炎ウイルスを精製採取するにあ
たつては、たとえば、次のような方法で行われ
る。 原材料液溶液の日本脳炎ウイルス含有液を、所
望により蒸留水または緩衝液で比電導度が0.5〜
5.0ｍｓ／cmとなるように希釈した後、セルロー
ス硫酸エステルゲルによる吸着操作に付す。 セルロース硫酸エステルゲルへの日本脳炎ウイ
ルスの吸着、ゲルの洗浄、該ウイルスの溶出等一
連の精製操作は、バツチ法およびカラム法等の工
業的に通常よく用いられる操作方法で行なうこと
ができるが、カラム法の方が操作が簡単であり好
都合である。カラム法の場合、セルロース硫酸エ
ステルゲルをカラムに充填し、あらかじめ、温度
０〜30℃にて、例えば0.02Mマツキルベン
（Mcllvaine，ｓ）緩衝液（PH5.2）等の比電導度
5.0〜25.0ｍｓ／cmでPHが7.0〜8.0程度である適当
な緩衝液を通液して平衡化を行つた後に、日本脳
炎ウイルスの吸着操作に移る。 吸着に際しては、日本脳炎ウイルス含有液をPH
が7.0〜8.0、比電導度が5.0〜25.0ｍｓ／cmになる
ように適宜調整して、セルロース硫酸エステルゲ
ル充填カラムに通液し、日本脳炎ウイルスを吸着
させる。この後、比電導度0.5〜5.0ｍｓ／cmの緩
衝液を通液し、ゲルを洗浄し、夾雑物質を洗い出
す。 日本脳炎ウイルスの溶出に際しては、PHが5.0
〜9.0、比電導度が5.0以上である適当な緩衝液を
通液し溶出を行なうが、好ましくは段階溶出また
は塩濃度勾配溶出を行なう。 本発明の精製法によれば、日本脳炎ウイルスの
精製度は数十倍に達し、しかも日本脳炎ウイルス
の回収率は90％以上100％近くに達する。 上述のとおり本発明の方法によれば、出発材料
の日本脳炎ウイルス含有液から所望のウイルスを
高収率、高純度に採取することができ、その操作
もきわめて簡単で、またその精製用クロマトグラ
フイ吸着体は、安価に調製でき、しかもくり返し
使用しても劣化が全く無く、きわめて経済的にす
ぐれている。 したがつて、本発明方法は高純度日本脳炎ウイ
ルスの工業的精製法としてきわめてすぐれた方法
である。また本発明の法は従来の技術である蔗糖
密度勾配超遠心分離法［Chika Aizawa et al、
Applied and Environmental Microbiology、
39、54−57（1980）］等を組合わせることも可能
であり、その際は従来方法で得られる結果に比し
て非常にすぐれた結果を得ることができる。 本発明の方法で得られる日本脳炎ウイルスは高
純度で不純物としての他の蛋白質、脂質、糖類等
を含まず、日本脳炎ワクチン用抗原としてのみな
らず診断用抗原の調製に有用である。 実施例 以下、調製例、実施例を挙げて本発明をさらに
具体的に説明する。 調製例 １ ０℃以下の温度にてピリジン600mlにクロルス
ルホン酸117ｇを滴下し、混合する。滴下終了
後、混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中
にセルロフアインGC−15（チツソ社製）80ｇを
加え、撹拌下65〜70℃にて３時間反応させる。反
応終了後、冷却し、10％水酸化ナトリウム水溶液
を加えて中和する。ゲルを過分離し、0.01Mリ
ン酸緩衝食塩液で充分に洗浄してセルロース硫酸
エステルゲルを得る。 調製例 ２ ０℃以下の温度にてピリジン600mlにクロルス
ルホン酸117ｇを滴下し、混合する。滴下終了
後、混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中
に結晶セルロースであるクロマトグラフイー用ア
ビセル（旭化成工業社製）80ｇを加え、撹拌下65
〜70℃にて４時間保持する。反応終了後、冷却
し、10％水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和す
る。ゲルを過分離し、0.01Mリン酸緩衝食塩液
で充分に洗浄してセルロース硫酸エステルゲルを
得る。 実施例 １ 前記調製例１と同様にして調製したセルロフア
インGC−15の硫酸エステルゲル37.5mlをカラム
（25mmφ×400mm）に充填し、これに蒸留水375ml
を通液する。次に、0.14MNACl添加0.01Mリン酸
緩衝液375mlにてゲルを平衡化したのちこのカラ
ムにプロタミン−炭末処理して得られる不活化日
本脳炎ウイルス浮遊液50mlを通液する。
0.14MNaCl添加0.01Mリン酸緩衝液にて、ゲルを
十分洗浄した後、1.5MNaCl添加100Mリン酸緩衝
液（比電導度約120ｍｓ／cm、PH7.2）100mlを用
いて溶出を行ない、約５mlずつ分画して分取した
後、日本脳炎ウイルスを含有する画分約10mlをプ
ールする。 原材料液および精製日本脳炎ウイルス画分の分
析結果および実験成績を第１表に示す。

【表】 実施例 ２ 上記実施例１において、出発材料としてプロタ
ミン処理した日本脳炎生ウイルス浮遊液50mlを用
いる以外は同様にして、日本脳炎ウイルス含有分
画を得る。その結果を第２表に示す。

【表】 実施例 ３ 上記実施例１において、前記調製例１と同様に
して調製したセルロース硫酸エステルゲル140ml
を充填したカラム（500mmφ×2500mm）に、プロ
タミン処理後、0.45μメンブランフイルターに濃
縮した日本脳炎生ウイルス浮遊液1000mlを通す以
外は同様にして日本脳炎ウイルス含有画分を得
る。その結果を第３表に示す。

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 日本脳炎ウイルスを精製取得するに際し、日
   本脳炎ウイルス含有液を、セルロース硫酸エステ
   ルのゲルに接触せしめ、日本脳炎ウイルスを吸着
   させた後、該セルロース硫酸エステルゲルより日
   本脳炎ウイルスを溶出することを特徴とする日本
   脳炎ウイルスの精製方法。 ２ 日本脳炎ウイルスが日本脳炎感染動物の脳材
   料または感染組織培養細胞の培養物材料より得ら
   れたウイルスである前記第１項記載の方法。 ３ 日本脳炎ウイルスが遺伝子組換え体を利用し
   て培養されたウイルスである前記第１項記載の方
   法。 ４ 該日本脳炎ウイルス含有液を不活化処理した
   のちセルロース硫酸エステルゲルに接触させる前
   記第１項記載の方法。 ５ セルロース硫酸エステルゲルが結晶セルロー
   スまたは結晶領域および非結晶領域からなるセル
   ロースの硫酸エステルゲルである前記第１項〜第
   ４項のいずれか１つに記載の方法。 ６ 該吸着処理を、温度０〜30℃、比電導度5.0
   〜25.0ｍｓ／cmの緩衝液であらかじめ処理して平
   衡化したのち吸着処理に付す前記第１項〜第５項
   いずれか１つに記載の方法。 ７ 日本脳炎ウイルスを吸着したゲルからの溶出
   を、比電導度5.0〜25.0ｍｓ／cmの緩衝液を用い
   て行なう前記第１〜６項のいずれか１つに記載の
   方法。 ８ 該溶出処理に先だつて、吸着ゲルを、比電導
   度0.5〜5.0ｍｓ／cmの緩衝液で洗浄する前記第７
   項記載の方法。