CN1063970C - 用鳞翅目粘虫卵巢细胞制备流行性乙脑疫苗的方法及疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备流行性乙脑疫苗的方法，它包括在培养基中静止或悬浮培养鳞翅目粘虫(Spodoptera frugiperda)的卵巢细胞，将该细胞感染乙脑病毒继续培养得培养悬液，可部分补充培养液连续培养，得到的病毒灭活或不灭活制备疫苗。
本方法中可使用无血清培养基。
Description
本发明涉及一种制备流行性乙型脑炎疫苗的方法及由此方法制得的疫苗。尤其涉及一种利用鳞翅目粘虫(Spodoptera frugiperda)的卵巢细胞制备流行性乙型脑炎疫苗的方法及由此方法制得的疫苗。
流行性脑炎病毒又称日本乙型脑炎病毒(JEV)，可引起流行性乙型脑炎。自1935年日本学者从病死者脑组织分离并确定乙脑病毒以来，各国学者一直在致力于JEV疫苗的研究制备工作，先后经历了用鼠脑、鸡胚、地鼠肾等生产基质制备灭活疫苗、减毒活疫苗等阶段。目前我国使用的是用原代地鼠肾细胞制备的灭活疫苗和减毒活疫苗，日本、美国、台湾等地使用的是鼠脑提纯疫苗。此外，重组基因工程疫苗正处于研究之中，但至今尚无重大突破。
现有技术中生产JEV疫苗主要存在的问题是，疫苗生产方法中因使用原代细胞或动物组织培养使得动物的饲养、繁殖、无菌条件的控制及解剖均存在着诸多不便，从而限制了生产规模。因此使用一种既对乙脑病毒敏感又可用于悬浮培养的传代细胞基质是解决问题的途径之一。vero细胞被证明可作为疫苗生产的基质(WHO Tech．Rep．Ser．，1987，7：1)，同时也是乙脑病毒的敏感细胞，用其制备乙脑疫苗的研究工作也正在进行，但该细胞为锚着依赖性细胞，培养时需借助于微载体，培养条件复杂；由于培养液中含有血清，须经纯化彻底去除以避免临床中出现副反应；此外，所有来源于啮齿类动物的传代细胞都存在致肿中瘤性的危险，而vero细胞属哺乳类动物，较高代次的vero细胞已被证明存在致肿瘤性。
近年来，一种属鳞翅目粘虫(Spodopterafrugiperda)的卵巢细胞，例如Sf9细胞已被广泛应用于重组杆状病毒的表达系统上表达各种外源蛋白，Sf9细胞由IPL41-SF21AE细胞系中克隆筛选而来(Vaughn，J．L．et al，In Vitro 13：213-217)，为非锚着依赖性细胞，其培养条件为28℃无需二氧化碳。
因此，本发明的目的在于提供一种制备流行性乙型脑炎疫苗的方法，该方法利用鳞翅目粘虫(Spodopterafrugiperda)的卵巢细胞工业化大规模生产流行性乙型脑炎疫苗，培养过程中可不必借助于微载体等附着物，培养条件简单，因而降低生产成本，简化工艺，而且用WHO规程规定的细胞致肿瘤检测方法证明Sf9细胞无致肿瘤原性。
本发明的另一目的在于提供一种利用本发明的方法制成的流行性乙型脑炎疫苗。
为克服现有技术的不足，完成上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
本发明涉及一种制备流行性乙型脑炎疫苗的方法，其特征是包括下述步骤：
在pH为6．1-7．6的培养液中悬浮或静止培养细胞基质鳞翅目粘虫(Spodoptera frugiperda)的卵巢细胞，使细胞浓度达到105-107／ml；
以感染剂量(M．O．I．)为0．01-1．0将流行性乙型脑炎病毒接种到具有上述细胞浓度的细胞基质培养液中，培养3-5天后得细胞培养悬液；
低速离心部分细胞培养悬液，取上清过滤收获病毒；
可用新鲜培养液补足剩余的细胞培养悬液继续传代培养，3-5天后离心收获病毒；
超速离心去除残余小牛血清；
用福尔马林灭活收获的病毒制备灭活疫苗或不经灭活病毒制备减毒活疫苗。
按照本发明方法，感染病毒后的细胞基质培养液为有血清培养液。
本发明涉及一种利用上述本发明方法制得的流行性乙型脑炎疫苗。
另外，本发明还涉及一种制备流行性乙型脑炎疫苗的方法，其特征是包括下述步骤：
在pH为6．1-7．6的培养液中悬浮或静止培养细胞基质鳞翅目粘虫(Spodoptera frugiperda)的卵巢细胞，使细胞浓度达到105-107／ml；
以感染剂量(M．O．I．)为0．01-1．0将流行性乙型脑炎病毒接种到具有上述细胞浓度的细胞基质培养液中，培养3-5天后得细胞悬液；
将上述感染病毒后的细胞悬液在无血清培养液中经逐步适应传代至其培养液中的血清含量低于0．1％；
低速离心部分适应后的无血清培养细胞悬液，取上清液过滤收获病毒；
用新鲜无血清培养液补足剩余的细胞培养悬液继续传代培养，3-5天后离心收获病毒；
用福尔马林灭活收获的病毒制备灭活疫苗或不经灭活病毒制备减毒活疫苗。
本发明还涉及一种利用上述本发明方法制得的流行性乙型脑炎疫苗。
本发明与现有技术相比其优点在于：
首先，本发明细胞基质具有传代细胞的优点，即可以事先被检定不带任何可查出的细菌、病毒、致癌物质等外源致病因子。
其次，本发明所采用的细胞基质为非锚着依赖性细胞，其可以不需要载体大量悬浮培养，且培养条件要求较低，这就简化了锚着依赖性细胞(如vero细胞)深层培养所必不可少的微载体带来的诸多不便。
再者，目前认为哺乳动物传代细胞都存在致肿瘤性的危险，传代次数越高其危险性越大，而对昆虫细胞，一般认为人源性远，致肿瘤的危险性小，且用WHO规程规定的细胞致癌检测方法证明72代Sf9细胞无致肿瘤原性。
另外，利用乙脑病毒对Sf9细胞持续性感染的特性，一次种毒后细胞可连续产毒、连续收获病毒，而且感染乙脑病毒后的细胞可在液氮中冷冻保存。
本发明的最重要的优点在于，持续感染JEV的本发明的细胞基质在无血清培养液中可利用发酵罐大规模繁殖病毒，因此既解决了现有技术中纯化病毒时难以去除残余牛血清的问题，又避免了临床接种带来的副反应。
附图的简要说明
图1、图2及图3分别示出了实验例1中用P3、SA14、SA14-14-2分别感染Sf9细胞10-12周内培养物上清液和细胞溶解物的病毒滴度和传代时间之间的曲线。
为了进一步理解本发明的技术方案，以下详细描述之。
本发明实质上涉及一种制备流行性乙型脑炎疫苗的方法，其特征是包括下述步骤：
1)在pH为6．1-7．6的培养液中静止或悬浮培养细胞基质鳞翅目粘虫(Spodoptera frugiperda)的卵巢细胞，使细胞浓度达到105-107／ml；
其中，所述的鳞翅目粘虫(Spodoptera frugiperda)的卵巢细胞可以是例如Sf9细胞(ATCC CRL1711)，它由IPL41-SF21AE细胞系中克隆筛选而来，为非锚着依赖性细胞，可以不需载体大量悬浮培养。本发明采用的Sf9细胞仅为所述的鳞翅目粘虫的卵巢细胞的一株，本文中仅作为实施例而用之，并非有限定本发明之意。另外，本发明采用的培养液可以为市售的有血清培养液，如GIBCO的IPL-41。培养温度为本领域技术人员所熟知，通常为28℃。
2)以感染剂量(M．O．I)为0．01-1．0将流行性乙型脑炎病毒接种到具有上述细胞浓度的细胞基质培养液中，培养3-5天后得细胞培养悬液；
按照本发明，所述的JEV病毒可以是野毒株，例如P3株和SA14株；也可以是减毒株，例如SA14-14-2株。其中野毒株感染后3-5天，细胞出现以一定数量细胞增大3-5倍为特征的细胞病变(CPE)，减毒株感染细胞后无此病变，但两种病毒均可造成Sf9细胞的持续感染。
3)低速离心部分上述细胞培养悬液，取上清液过滤收获病毒；
按照本发明，此步骤中对用于离心的培养悬液量无特殊的限制，只要剩余的细胞量足以在经补充新鲜培养液培养3-5天后细胞培养悬液又能达到可以收获的病毒滴度即可，例如实施例1中用于离心的培养悬液量为50-75％。
4)可用新鲜培养液补足剩余的培养悬液继续传代培养，3-5天后离心收获病毒；
此步骤中补加的新鲜培养液量与步骤3)中用于离心的培养悬液量相等。所述的培养液可以是市售的有血清培养液，例如本发明所采用的GIBCO的IPL-41。根据本发明，细胞的传代培养时间可多达26周而保持所制得的疫苗的效力实验符合中华人民共和国《生物制品规程》中规定的标准。
5)超速离心去除残余小牛血清；
6)用福尔马林灭活收获的病毒或不经灭活病毒制得疫苗。
根据本发明生产JEV灭活疫苗时所采用的福尔马林灭活病毒的技术为公知技术，生产减毒活疫苗时不需此灭活步骤。灭活前后均需按常规方法取样进行无菌实验、测定病毒滴度以及灭活后需进行病毒灭活实验。
本发明实质上还涉及一种制备流行性乙型脑炎疫苗的方法，其特征是包括下述步骤：
1)在pH为6．1-7．6的培养液中静止或悬浮培养细胞基质鳞翅目粘虫(Spodoptera frugiperda)的卵巢细胞，使细胞浓度达到105-107／ml；
其中，所述的鳞翅目粘虫(Spodoptera frugiperda)的卵巢细胞可以是例如Sf9细胞(ATCC CRL1711)，它由IPL41-SF21AE细胞系中克隆筛选而来，为非锚着依赖性细胞，可以不需载体大量悬浮培养。本发明采用的Sf9细胞仅为所述的鳞翅目粘虫的卵巢细胞的一株，本文中仅作为实施例而用之，并非有限定本发明之意。另外，本发明采用的培养液可以为市售的有血清培养液，如GIBCO的IPL-41。培养温度为本领域技术人员所熟知，通常为28℃。
2)以感染剂量(M．O．I．)为0．01-1．0将流行性乙型脑炎病毒接种到具有上述细胞浓度的细胞基质培养液中，培养3-5天后得细胞培养悬液；
按照本发明，所述的JEV病毒可以是野毒株，例如P3株和SA14株；也可以是减毒株，例如SA14-14-2株。其中野毒株感染后3-5天，细胞出现以一定数量细胞增大3-5倍为特征的细胞病变(CPE)，减毒株感染细胞后无此病变，但两种病毒均可造成Sf9细胞的持续感染。
3)将上述感染病毒后的细胞悬液在无血清培养液中经逐步适应传代至其培养液中的血清含量低于0．1％；
按照本发明，在每次传代时需按一定比例(细胞悬液／新鲜培养液)逐步加入无血清培养液，直至细胞培养液中的血清含量低于0．1％，此时则视为细胞在无血清培养液中完全适应，此后传代时可使用无血清培养液。所述的细胞悬液与培养液的比例可以为本领域人员常用的比例，例如本发明实施例2中采用的1∶1的比例。
4)低速离心部分适应后的无血清培养细胞悬液，取上清液过滤收获病毒；
按照本发明，此步骤中对用于离心的培养悬液量无特殊的限制，只要剩余的细胞量足以在经补充新鲜培养液培养3-5天后细胞培养悬液又能达到可以收获的病毒滴度即可，例如实施例1中用于离心的培养悬液量为50-75％。
5)用新鲜无血清培养液补足剩余的细胞培养悬液继续传代培养，3-5天后离心收获病毒；
此步骤中补加的新鲜培养液量与步骤3)中用于离心的培养悬液量相等。所述的培养液可以是市售的无血清培养液，例如本发明所采用的GIBCO的SF900Ⅱ。细胞需经过传代逐步在无血清培养液中适应生长。由无血清培养液培养收获的病毒的滴度比有血清培养的病毒的滴度略低，纯化病毒时不需经超速离心去除牛血清的步骤，从而既简化了生产疫苗的工艺又避免了疫苗中残余牛血清易引起临床副反应。
6)用福尔马林灭活收获的病毒制备灭活疫苗或不经灭活病毒制备减毒活疫苗。
根据本发明生产JEV灭活疫苗时所采用的福尔马林灭活病毒的技术为公知技术，生产减毒活疫苗时不需此灭活步骤。灭活前后均需按常规方法取样进行无菌实验、测定病毒滴度以及灭活后需进行病毒灭活实验。
本发明采用的细胞基质例如Sf9细胞是一类昆虫细胞，其人源性比现行生产JEV疫苗用的地鼠肾细胞远，其致肿瘤的危险性也较小。另外免疫荧光实验及电镜观察均表明该细胞被JEV病毒感染后不出现致死病变，而是能够继续传代并繁殖病毒，造成细胞的持续感染，如图1-3所示，Sf9细胞在感染病毒后仍可传代培养，并且病毒滴度基本保持不变。其中由野毒株P3或SA14感染的细胞出现以细胞增大3-5倍为特征的CPE，这种大细胞的数量在全部传代过程中始终保持在10-20％。由减毒株SA14-14-2感染的细胞在感染和传代的全部过程中末见明显的CPE。
根据本发明方法制得的疫苗经哺乳动物实验证明各项检定均能达到和超过生产规程要求的标准。其中无血清培养液繁殖JEV制备的疫苗其病毒量虽低于现行原代地鼠肾疫苗，但疫苗同样能达到原代地鼠肾疫苗的效力实验标准。
以下结合实施例和实验例进一步描述本发明。实施例1 有血清培养生产JEV疫苗
在0．5L悬浮培养瓶中以400ml有血清培养液IPL-41(GIBCO)加入适量牛血清等成分，调pH为6．2于28℃培养Sf9细胞达5×105／ml，用鼠脑来源的JEVP3株以M．O．I．为0．01接种感染Sf9细胞，培养4天后出现CPE，第五天收集50-75％的培养悬液，1000rpm离心该培养悬液5分钟后取上清过滤收获病毒，密度梯度离心除去残余的牛血清，同时补充50-75％的新鲜的IPL-41培养液到剩余的细胞悬液中，每隔3-4天传代一次并收获病毒。按常规方法取样进行无菌实验、检测病毒滴度，用福尔马林灭活病毒制得疫苗。实施例2 无血清培养生产JEV疫苗
采用如实施例1所述的方法，只是在感染病毒后第五天将Sf9细胞传代，传代时按1∶1(细胞培养悬液／新鲜培养无血清培养液)加入无血清培养液SF900Ⅱ(GIBCO)，此后每3天按上述方法传代一次，经8次传代后使牛血清含量低于0．1％，在以后的传代中使用无血清培养液。随后按实施例1的方法在SF900Ⅱ中传代培养细胞收获病毒。实验例1
JEV感染S9细胞10-12周病毒滴度的测定。在15cm2组织培养小瓶中以IPL-41于28℃培养Sf9细胞达105／ml(5ml／瓶)，分别用P3、SA14、SA14-14-2三株JEV感染上述Sf9细胞，M．O．I为0．01，二个对照组为Sf9正常细胞及JEV感染IPL-41。每周传代一次，连续传代10-12周，蚀斑法测定每次传代时的病毒滴度，结果见图1、图2及图3。
实验例2 Sf9细胞致肿瘤原性实验
实验动物为3-5克三日龄的昆明鼠，每组十只，设定的阳性细胞对照为Hela细胞(来源于北京生物制品研究所小儿麻痹室，71代，细胞浓度为106／ml)，实验组为Sf9细胞(来源于ATCC，72代，细胞浓度为107／ml)。
按照Van Steenis，G．等人的方法(Use of ATG-treated ne wborn rat for in vivo tumorigenicity，1982)，于0天分别在各组乳鼠背部皮下注射上述各种细胞，注射剂量为0．1ml，于0、2、7、14天四次分别腹腔注射兔抗小鼠胸腺血清(ATS)(来源于北京生物制品研究所小儿麻痹室，94-4批，2单位／ml)，注射剂量为每克乳鼠0．04ml。连续观察三周。实验结果为，三周后Hela细胞组的乳鼠背部注射部位出现结节，组织切片显示Hela细胞瘤节有骨质化生现象并可见核分裂像，肝、肺组织也见异常；而Sf9细胞组的乳鼠三周内始终未触摸到结节，注射部位及肝、肺组织切片未见异常。由此可证明72代Sf9细胞无致肿瘤原性。比较实验例
来源于鼠脑或原代地鼠肾细胞和Sf9细胞的JEV蚀斑的比较。其中实验用病毒为分别来源于鼠脑和感染病毒的Sf9细胞培养7周后上清液的P3株、SA14株以及来源于原代地鼠肾细胞的SA14-14-2株。按照公知方法测定上述来源的病毒在BHK21细胞上形成的蚀斑，其结果为：
来源于鼠脑和感染后的Sf9细胞培养物七周上清液的P3、SA14株JEV所形成的蚀斑直径均为3-6mm，两者无本质区别。
来源于原代地鼠肾细胞和感染后的Sf9细胞培养物七周上清液的SA14-14-2株JEV所形成的蚀斑直径均为1-2mm，两者无本质区别。
Claims (11)
1、一种制备流行性乙型脑炎疫苗的方法，其特征是包括下述步骤：
1)在pH为6．1-7．6的培养液中悬浮培养细胞基质鳞翅目粘虫(Spodoptera frugiperda)的卵巢细胞，使细胞浓度达到105-107／ml；
2)以感染剂量(M．O．I．)为0．01-1．0将流行性乙型脑炎病毒接种到具有上述细胞浓度的细胞基质培养液中，培养3-5天后得细胞培养悬液；
3)低速离心部分细胞培养悬液，取上清液过滤收获病毒；
4)用新鲜培养液补足剩余的细胞培养悬液继续传代培养，3-5天后离心收获病毒；
5)用福尔马林灭活收获的病毒制备灭活疫苗或不经灭活病毒制备减毒活疫苗。
2、根据权利要求1所述的制备流行性乙型脑炎疫苗的方法，其中所述的鳞翅目粘虫的卵巢细胞为Sf9细胞(ATCC CRL 1711)。
3、根据权利要求1或2所述的制备流行性乙型脑炎疫苗的方法，其中流行性乙型脑炎病毒株为P3株或SA14株。
4、根据权利要求1或2所述的制备流行性乙型脑炎疫苗的方法，其中流行性乙型脑炎病毒株为SA14-14-2株。
5、根据权利要求1或2所述的制备流行性乙型脑炎疫苗的方法，其中所述的培养液为有血清培养液，且在步骤4)后附加一超速离心去除残余小牛血清的步骤。
6、根据权利要求1或2所述的方法制备的流行性乙型脑炎疫苗。
7、一种制备流行性乙型脑炎疫苗的方法，其特征是包括下述步骤：
1)在pH为6．1-7．6的有血清培养液中悬浮培养细胞基质鳞翅目粘虫(Spodoptera frugiperda)的卵巢细胞，使细胞浓度达到105-107／ml；
2)以感染剂量(M．O．I．)为0．01-1．0将流行性乙型脑炎病毒接种到具有上述细胞浓度的细胞基质培养液中，培养3-5天后得细胞悬液；
3)将上述感染病毒后的细胞悬液在无血清培养液中经逐步适应传代至其培养液中的血清含量低于0．1％；
4)低速离心部分适应后的无血清培养细胞悬液，取上清液过滤收获病毒；
5)用新鲜无血清培养液补足剩余的细胞培养悬液继续传代培养，3-5天后离心收获病毒；
6)用福尔马林灭活收获的病毒制备灭活疫苗或不经灭活病毒制备减毒活疫苗。
8、根据权利要求7所述的制备流行性乙型脑炎疫苗的方法，其中所述的鳞翅目粘虫的卵巢细胞为Sf9细胞(ATCC CRL 1711)。
9、根据权利要求7或8所述的制备流行性乙型脑炎疫苗的方法，其中流行性乙型脑炎病毒株为P3株或SA14株。
10、根据权利要求7或8所述的制备流行性乙型脑炎疫苗的方法，其中流行性乙型脑炎病毒株为SA14-14-2株。
11、根据权利要求7或8所述的方法制备的流行性乙型脑炎疫苗。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: YUNNAN LVZHOU PHARMACEUTICAL CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: BEIJING INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS Effective date: 20011016 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| C56 | Change in the name or address of the patentee |
Owner name: BEIJING INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS Free format text: FORMER NAME OR ADDRESS: BEIJING BIOLOGICAL PRODUCT INST., MINISTRY OF PUBLIC HEALTH |
|
| CP03 | Change of name, title or address |
Patentee after: Beijing Institute of Biological Products Patentee before: BEIJING BIOLOG PRODUCT I MINIS |
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20011016 Address after: 650000 Yunnan Province, Kunming City West Road under the Su Village No. 152 Patentee after: Yunnan Luzhou Pharmaceutical Co.,Ltd. Address before: 100024 Beijing city Chaoyang District three Patentee before: Beijing Institute of Biological Products |
|
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: DALIAN HANXIN BIOLOGY PHARMACY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: KUNMING YUNDA SCIENCE MEDICINE CO., LTD. Effective date: 20090807 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| C56 | Change in the name or address of the patentee |
Owner name: KUNMING YUNDA SCIENCE MEDICINE CO., LTD. Free format text: FORMER NAME: YUNNAN PROVINCE LVZHOU MEDICINE INDUSTRY CO., LTD. |
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| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: No. 59, medical Road, hi tech Development Zone, Xishan District, Yunnan, Kunming Patentee after: Kunming Unida Pharmaceutical Co.,Ltd. Address before: Yunnan province Kunming City West Road under the Su Village No. 152 Patentee before: Yunnan Luzhou Pharmaceutical Co.,Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20090807 Address after: No. 17 West Tieshan Road, Dalian economic and Technological Development Zone, Liaoning Patentee after: DALIAN HISSEN BIO-PHARM Co.,Ltd. Address before: No. 59, medical Road, hi tech Development Zone, Xishan District, Yunnan, Kunming Patentee before: Kunming Unida Pharmaceutical Co.,Ltd. |
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| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20010404 Termination date: 20121206 |