JPWO2006134917A1 - 抗体の作製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
Michael Steward, Chapter 27. Immunological Techniques, pp. 417-434, in Immunology, 6th edition (Ivan M. Roitt, Jonathan Brostoff, David K. Male, Editors), 2001, C.V. Mosby
〔1〕抗体または抗体産生細胞の製造方法であって、
(a)抗原としたい外来ポリペプチドをコードする核酸を搭載するマイナス鎖RNAウイルスベクター、該ウイルスベクターを生成する核酸、該ベクターまたは該ベクターを生成する核酸が導入された細胞、または該細胞の溶解物を、非ヒト動物に接種する工程、
(b)該動物から、抗体または抗体産生細胞を回収する工程、を含む方法、
〔2〕工程(a)の接種が、筋注、皮下投与、点鼻投与、手掌または足蹠皮内投与、脾臓投与、および腹腔内投与からなる群より選択される投与経路により行われる、〔1〕に記載の方法、
〔3〕該マイナス鎖RNAウイルスベクター、該ウイルスベクターを生成する核酸、該ベクターまたは該ベクターを生成する核酸が導入された細胞、該細胞の溶解物、または該細胞の溶解物から精製された抗原の接種によりブーストを行う工程をさらに含む、〔1〕または〔2〕に記載の方法、
〔4〕該ポリペプチドまたはその断片を含むポリペプチドによりブーストを行う工程をさらに含む、〔1〕から〔3〕のいずれかに記載の方法、
〔5〕回収した抗体と該抗原とを接触させ、該抗原に結合する抗体を選択する工程をさらに含む、〔1〕から〔4〕のいずれかに記載の方法、
〔6〕回収した抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合させ、ハイブリドーマを調製する工程をさらに含む、〔1〕から〔4〕のいずれかに記載の方法、
〔7〕ハイブリドーマが産生する抗体と該抗原とを接触させ、該抗原に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程をさらに含む、〔6〕に記載の方法、
〔8〕ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を回収する工程をさらに含む、〔6〕または〔7〕に記載の方法、
〔9〕マイナス鎖RNAウイルスが複製欠損型である、〔1〕から〔8〕のいずれかに記載の方法、
〔10〕マイナス鎖RNAウイルスが、パラミクソウイルスである、〔1〕から〔9〕のいずれかに記載の方法、
〔11〕パラミクソウイルスが少なくともF遺伝子を欠損する、〔10〕に記載の方法、
〔12〕パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、〔10〕または〔11〕に記載の方法、
〔13〕回収した抗体を含む溶液と、該外来ポリペプチドをコードしない該マイナス鎖RNAウイルスベクター、該ウイルスベクターが導入された細胞、該細胞の溶解物、または該ウイルスのウイルス蛋白質とを共存させる工程、および、それらと結合しない抗体を選択する工程、をさらに含む、〔1〕から〔12〕のいずれかに記載の方法、
〔14〕ハイブリドーマが産生する抗体を含む溶液と、該外来ポリペプチドをコードしない該マイナス鎖RNAウイルスベクター、該ウイルスベクターが導入された細胞、該細胞の溶解物、または該ウイルスのウイルス蛋白質とを共存させる工程、および、それらと結合しない抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程、をさらに含む、〔1〕から〔12〕のいずれかに記載の方法、
〔15〕Th2サイトカインまたはその活性部分ペプチド、あるいはそれらをコードするベクターを投与する工程をさらに含む、〔1〕から〔14〕のいずれかに記載の方法、
〔16〕該サイトカインまたはその活性部分ペプチドが、抗原としたい外来ポリペプチドをコードする該マイナス鎖RNAウイルスベクターにコードされている、〔15〕に記載の方法、
〔17〕Th2サイトカインがIL-4、IL-10、およびIL-13からなる群から選択される、〔15〕または〔16〕に記載の方法、を含むものである。
レスピロウイルス属 NP P/C/V M F HN - L
ルブラウイルス属 NP P/V M F HN (SH) L
モービリウイルス属 NP P/C/V M F H - L
( a )に関しては、動物に直接接種せず、あらかじめ該ウイルスベクターを生成する核酸が導入された細胞を調製後、その細胞、該細胞の溶解物、または該細胞の溶解物から生成された抗原を接種してもよい。マイナス鎖RNAウイルスベクターを生成する核酸の詳細については、以下の文献を参照することができる(WO97/16539; WO97/16538; WO00/70055; WO00/70070; WO01/18223; WO03/025570; Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404; Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997; Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587; Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466; Tokusumi, T. et al. Virus Res. 2002: 86; 33-38、Li, H.-O. et al., J. Virol. 2000: 74; 6564-6569)。
また、経口投与、経肛門(直腸)投与、経子宮(泌尿器または生殖器官)投与であってもよく、標的器官としては、口腔、腸管、泌尿生殖器または上気道粘膜等を含む。経口投与の場合は、酸性度の強い胃液に晒されても運搬能力を保持するために、徐放性マイクロカプセル化ベクター等に加工することによって、標的器官への感染が可能となる。
接種部位は、一箇所または複数箇所(例えば2〜15箇所)であってよく、また、接種量は、接種対象動物、接種部位、接種回数などに応じて適宜調整してよい。例えば、一箇所当たりの接種量は、ウイルス力価に換算して、1×104 CIU〜 5×1011 CIU (cell infectious unit)、好ましくは1×106 CIU 〜 1×1010 CIU とするとよい。細胞を介して接種(ex vivo投与)する場合は、例えば同種の培養細胞株(例えばサルコーマ細胞株)にマイナス鎖RNAウイルスベクターを感染させ、104〜109細胞、好ましくは105〜108細胞、またはそのライセートを動物に接種することができる。初回免疫だけでも有意な抗体価を誘導できるが、2回以上の接種によりブーストを行えば、抗体価をより上昇させることができる。
1.免疫
6週齢オスのBALB/cAマウス6頭の腓腹筋に生理食塩水で2x108CIU/mlに調製した、LacZを発現するF遺伝子欠損型センダイウイルスベクター SeV18+LacZ/ΔF(WO00/70070)を投与した。筋肉内注射により片側の2ケ所に1ケ所当たり100μlずつ接種した。ベクター接種5週後に眼窩静脈叢より採血し、血漿を分離した。
2.抗体の検出
抗体アッセイのため、市販の大腸菌由来βガラクトシダーゼ(シグマ G5635)を用いレーン当たり4μgになるようSDS電気泳動を行った。泳動した蛋白質はセミドライブロッターにてPVDF膜に転写し、5%スキムミルクによりブロッキングを行った。免疫したマウスの血漿は4%ウシ血清アルブミン入りPBSにて200倍に希釈し一次抗体反応に用いた。陽性対照には抗LacZ抗体(プロメガ社 Z378A)を4%ウシ血清アルブミン入りPBSにて5000倍に希釈したものを用いた。二次抗体として、HRP-標識抗マウスIgs(Biosource AMI4704)を5%スキムミルク、0.1%Tween20添加TBSにて希釈したものを用いた。ECL plus(アマシャム)を用いた化学発光によりLAS1000装置(FUJI FILM)を用いてシグナルを検出した。
[結果]
SeV18+LacZ/ΔFを用いたプライミング1回のみで、5週後に抗LacZ抗体の産生をマウス血中に確認することができた(図1)。
1.免疫
(1) プライミング
A: 6週齢メスのBALB/cAマウス16頭(各投与経路につき4頭ずつ)に、点鼻、筋注、脾臓直接注、足蹠注により、生理食塩水で希釈調製した、GFP発現F遺伝子欠損型センダイウイルスベクターSeV18+GFP/ΔF(WO00/70070)を1頭あたり5 x 106 CIU投与した。点鼻投与ではセボフレンによる軽微な麻酔下においたマウスに100μlのベクター懸濁液を少量ずつ経鼻的に自然呼吸により吸引させた。筋注は片脚腓腹筋内に50μlずつ2箇所に、脾臓直接注射では50μlのベクター懸濁液をそのまま注射した。足蹠注では片足25μlずつ両足計50μlを注射した。
B: 6週齢メスのBALB/cAマウス2頭ずつに、腹腔、あるいは腰部皮下に生理食塩水で 1 x108 CIU/ml に調製したウイルスベクターSeV18+GFP/ΔFを投与した。腹腔には100μlのベクター懸濁液をそのまま、皮下投与は腰部2箇所にそれぞれ50μlずつ注射を行った。
(2) ブースト
A: プライミング2週後、全てのマウスに腹腔内に5x107 CIU/mlに調製したウイルスベクター SeV18+GFP/ΔFを100μl投与した。対照の非ブーストマウスには100μlの生理食塩水を同様の方法で投与した。
B: プライミング16日後、全てのマウスの腹腔内に生理食塩水で 1 x108 CIU/mlに調製したウイルスベクター SeV18+GFP/ΔFを100μl投与した。
(3) 採血
A: プライミング前(非免疫対照)、プライミング後28日目に眼窩静脈よりヘパリン塗布キャピラリーを用いて約100μl採血し、血漿を分離した。
B: プライミング後19日目(ブースト3日後)に眼窩静脈より同様に約100μl採血し、血清を分離した。
(4) 抗体の検出
A: 血漿中の抗GFP抗体価をSDS-PAGEにて電気泳動後PVDF膜に転写・固定した市販精製GFPタンパクに対するウエスタンブロッティングにて検出した。対照として市販抗GFP抗体および非免疫マウス血漿を用いた。
B: 血漿中の抗GFP抗体価をSDS-PAGEにて電気泳動後PVDF膜に転写・固定したGFP遺伝子搭載センダイウイルスベクター感染LLC-MK2細胞ライセートタンパクに対するウエスタンブロッティングにて検出した。
10cmシャーレにてLLC-MK2細胞にmoi 10になるようにSeV18+ GFP/ΔFを感染させ、2日後に細胞を4℃のPBSにて2回洗浄した。細胞溶解バッファー(10mM CHAPS、2mM EDTA、2mM PMSFを添加したPBS)を5 ml加え4℃で20分静置した後、セルスクレーパにて可溶物を回収した。回収物は9000rpmで遠心した後、上清を回収し、透析チューブ、Slide-A-Lyzer 2000MW(Piarce社)に入れ、4℃のPBSに対し透析を行い、CHAPSを除去した。可溶蛋白質はブラッドフォード法(Bio-Rad社DC Protein Assay kit)にて定量、1レーン当たり5μgになるようにアプライし、SDS-PAGEを行った。
3.ウエスタンブロット
蛋白質はセミドライブロッターにてPVDF膜に転写し、5%スキムミルクあるいは4%ウシ血清アルブミンによりブロッキングを行った。血漿は4%ウシ血清アルブミン入りPBSにて200倍に希釈し一次抗体反応に用いた。陽性対照には抗GFP抗体(Invitrogen社)を4%ウシ血清アルブミン入りPBSにて5000倍に希釈したものを用いた。二次抗体HRP-標識抗マウスIgs(Biosource AMI4704)を5%スキムミルクあるいは4%ウシ血清アルブミン、0.1%Tween20添加TBSにて希釈したものを用いた。検出はECL plus(アマシャム)を用いた化学発光によりLAS1000装置(FUJI FILM)を用いて検出した。
SeV18+GFP/ΔFによるプライミングで、ブーストのあるなしにかかわらず4週後に抗GFP抗体の産生をマウス血中に確認することができた(図2)。抗体価の上昇は特に点鼻投与のマウスで顕著であった。
1.免疫
(1) プライミング
6週齢メスのBALB/cAマウス2頭の腹腔に、センダイウイルスベクター SeV18+GFP/ΔF感染マウス サルコーマ細胞 Meth-A(RIKEN RCB0464; Old, L. et al. (1962) Ann. N.Y. Acad. Sci. 101, 80-106)のライセートを1頭あたり5 x 106 細胞相当量投与した。Meth-A細胞にmoi=1,000でセンダイウイルスベクターSeV18+GFP/ΔFを感染させ、3日後に遠心で集めた細胞をDPBS(-)で洗浄後、凍結融解を5回くり返した後に細胞破片を遠心で除去した後の上清分画をライセートとして用いた。
(2) ブースト
プライミング2週後、全てのマウスの腹腔内に5x107CIU/mlに調製したウイルスベクターSeV18+GFP/ΔFを100μl投与した。対照の非ブーストマウスには100μlの生理食塩水を同様の方法で投与した。
(1) 採血
プライミング前(非免疫対照)、プライミング後14日目(ブースト前)、28日目に眼窩静脈よりヘパリン塗布キャピラリーを用いて約100μl採血し、血漿を分離した。
(2) ウエスタンブロット
血漿中の抗GFP抗体価を実施例2同様SDS-PAGEにて電気泳動後PVDF膜に転写・固定した市販精製GFPタンパク(Wako chemicals)に対するウエスタンブロッティングにて検出した。対照として市販抗GFP抗体(Invitrogen社)および非免疫マウス血漿を用いた。
SeV18+GFP/ΔF感染細胞ライセートによるプライミングで、ブーストのあるなしにかかわらず4週後に抗GFP抗体の産生をマウス血中に確認することができた(図3)。
1.免疫
(1) プライミング
6週齢メスのBALB/cAマウス計8頭(各投与経路につき2頭)に、実施例2と同様の方法で点鼻、筋注、脾臓直接注、足蹠注により生理食塩水で希釈調製したセンダイウイルスベクター SeV18+GFP/ΔFを1頭あたり5 x 106 CIU投与した。
(2) ブースト
プライミング2週後、全てのマウスの腹腔内にセンダイウイルスベクター SeV18+GFP/ΔF感染マウス サルコーマ細胞Meth-A(RIKEN RCB0464)のライセートを、1頭あたり5 x 106細胞相当量投与した。ライセートは実施例3と同様の方法で作製した。
2.抗体の検出
(1) 採血
プライミング前(非免疫対照)、プライミング後14日目(ブースト前)、28日目に眼窩静脈よりヘパリン塗布キャピラリーを用いて約100μl採血し、血漿を分離した。
(2) ウエスタンブロット
血漿中の抗GFP抗体価をSDS-PAGEにて電気泳動後PVDF膜に転写・固定した市販精製GFPタンパクに対するウエスタンブロッティングにて検出した。対照として市販抗GFP抗体(Invitrogen社)および非免疫マウス血漿を用いた(図4)。
[結果]
SeV18+GFP/ΔFベクターでプライム後、同ベクターの感染細胞によるブーストで、抗GFP抗体の産生増強をマウスの血中に確認することができた(図4)。
1.免疫
(1) プライミング
6週齢メスのBALB/cAマウス1頭の腹腔内に、生理食塩水で1 x108 CIU/ml に調製したウイルスベクターSeV18+GFP/ΔFを100μl投与した。
(2) ブースト
プライミング16日後、腹腔内に生理食塩水で1 x108 CIU/ml に調製したウイルスベクター SeV18+GFP/ΔFを100μl投与した。
ミエローマ(P3-X63-Ag8.653)(RIKEN RCB0146) は10%牛胎児血清(FBS)を含むRPMI1640培地で培養を行ない、融合当日に対数増殖期になるように用意した。ブースト後3日目にマウスを頚椎脱臼により屠殺し、脾臓を摘出した。無血清のRPMI1640培地中で滅菌したステンレス網を用い、脾臓細胞を濾し単離した。脾細胞を3回、ミエローマを2回無血清RPMI1640培地で洗浄後、両者を数比1:1で混合し、遠心した。上清除去後、50%ポリエチレングリコールPEG(Sigma Hybri-Max mw3000-3700)にて脾細胞とミエローマの細胞融合を行った。融合細胞は無血清培地で洗浄、遠心を2回繰り返したのち、20%FBS/10mM HEPES/1mM sodium pyruvate添加RPMI1640培地40mlに懸濁し、wellあたり約105細胞になるように96wellプレートに播種した。融合の翌日、HAT選択培地を100μlずつwellに添加し、翌日より培地上清を半量除去後100μlずつHAT培地(20%FBS/1xHAT supplement Hybri-Max (Sigma H0262) 添加RPMI1640)を添加した。半量ずつの培地交換は、細胞融合後1週間後までは毎日HAT選択培地にて行い、それ以降はHT培地(20%FBS/1xHT supplement Hybri-Max (Sigma H0137) 添加RPMI1640)にて2日ごとあるいは生細胞の密度に合わせて行った。HAT選択培地によって選択された融合細胞がwellの底をだいたい半分以上覆うくらいの大きさになったら、培養上清を回収し、ウエスタンブロットを行い融合細胞のうち抗GFP抗体を産生するものを選択した。増殖してきた融合細胞は、BALB/cAマウスの胸腺細胞をフィーダーとした96 wellプレートを用いて限界希釈法にてクローニングを行った。得られたクローンが増幅し、wellの約半分を覆う位の大きさになったら、培養上清を回収し、ウエスタンブロットにより、抗GFP抗体の産生するクローンを回収した。その結果、GFP搭載センダイウイルスベクターにより免疫したマウスの脾細胞を用い、GFPを認識するモノクローナル抗体の作製に成功した(図5)。
1.免疫
(1) プライミング
セボフレン麻酔下に7週齢メスのBALB/cAマウス計8頭に、生理食塩水で5 x108 CIU/ml に調製した、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)のエンベロープタンパクgp160遺伝子を搭載するF遺伝子欠損型センダイウイルスベクターSeV18+GP160/ΔFを1頭あたり100μl点鼻投与した。
(2) ブースト
プライミング後14、28、42、56日目に凍結・融解法で作製したSeV18+GP160/ΔF感染7T1細胞ライセート(5x106 個細胞相当/100μl)を1頭当たり100μl腹腔内投与した。
2.ハイブリドーマの作製
ミエローマ(P3-X63-Ag8.653)は実施例5に記載された方法で用意した。最終ブースト後4日目に、最終ブースト時に採取した血漿中の抗gp160抗体価が高かった4頭を頚椎脱臼により屠殺し、脾臓を摘出した。無血清のRPMI1640培地中のナイロンメッシュ上で脾臓をすり潰すことにより脾臓細胞を分離、回収した。脾細胞とミエローマの細胞融合と融合細胞の培養は実施例5に記載された方法で行った。
1.免疫
(1) プライミング
実施例6と同様に行なった。
(2) ブースト
gp160蛋白質のアミノ酸配列の一部をなすペプチド3種類を人工合成し、キャリア蛋白質KLH (keyhole limpet hemocyanin) に常法を用いて結合した。合成したペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである。括弧内の番号はGenbank(accession number NP_057856)に登録されているgp160のアミノ酸配列上の相当する部分のアミノ酸番号である。ただし、#493と#495のアミノ末端のシステインおよび#494のカルボキシ末端のシステインは、KLHとの結合のために付加されたもので、gp160の配列には含まれない。
#493 CTRKRIRIQRGPGRAFV (303-318)(配列番号:10)
#494 SELYKYKVVKIEPLGVC (481-496)(配列番号:11)
#495 CPRGPDRPEGIEEEGGER (724-740)(配列番号:12)
上記3種のペプチドを等重量(1頭あたり各50μg)混合した溶液とFreund's incomplete adjuvantとのエマルジョンをブースト直前に作製し、プライミング後14、28、42、56日目に1頭当たり200μlを背部皮内注射した。
実施例6と同様に行ない、ペプチドでブーストしたマウスから作製した融合細胞中に抗gp160抗体を産生するハイブリドーマC1-182を検出した(図8)。C1-182のsubclassは実施例6同様に市販のキット(Mouse Immunoglobulin Screening/Isotyping Kit (Genzyme社、カタログ番号 97-6550))によりIgG1と決定された。よって、細胞ライセートだけでなく合成ペプチドによってもモノクローナル抗体作製に有効なブーストを行ない得ることが示された。
ハイブリドーマC1-182が産生する抗体がブーストに使用したペプチドのいずれをエピトープとして認識するかを結合阻害アッセイにて確認した。ウエスタンブロットは上記同様におこなったが、上清ハイブリドーマC1-182の上清と反応させる際、あらかじめ反応液に0.1, 1.0 あるいは10μg/mlになるように#493, #494, #495のうちのいずれかのペプチドを混合したものを用いた。上清中の抗体とメンブレン上のgp160の反応はペプチド#495が混合されている時のみ阻害され、C1-182が産生する抗体がペプチド#495のアミノ酸配列をエピトープとして認識することがわかった。これによりペプチドによるブーストが有効であったことが裏付けられた(図9)。
作製したハイブリドーマを安定して継代維持できるようにするため、6-76とC1-182の細胞クローニングを行なった。96ウェル組織培養プレートに1ウェルあたり0.3, 1, 3個の細胞が入るように希釈して播種し、約2週間後に細胞コロニーが1ウェルあたり1個のみ出現したウェルを顕微鏡下に確認後、その上清を採取して抗gp160抗体の存在をELISA法で検出した。クローニングにあたっては10%FBS含有RPMI1640培地にさらにBM Condimed H1 (Roche Diagnostics社カタログ番号1 088 947)を10%加えて用いた。クローニングは2回行なった。2回目には1回目で陽性を示したハイブリドーマ株6-76-14, 6-76-17, C1-182-40, C1-182-48を用いた。2回目クローニングの陽性率は、それぞれ35/36 (97%), 26/26 (100%), 20/29 (69%), 29/29 (100%) で、#6-76、C1-182はいずれもクローン化に成功したと結論した(図10)。
さらに、2回目陽性の細胞6-76-14-21, 6-76-14-29, C1-182-48-5, C1-182-48-35の培養上清を用いて実施例6同様のウエスタンブロットを行なったところ、もとになったハイブリドーマおよび1回目クローニング陽性細胞とまったく同様にgp160とgp41を検出することができた(図11)。
ハイブリドーマ6-76-14-29の培養上清中の抗体タンパクをイムノグロブリン結合タンパクLを固定化したカラム(Pierce社 ImmunoPure Immobilized Protein L,カタログ番号 20510)を用いて精製した。プロトコルは添付説明書に従った。精製した抗体はSypro Orange蛍光染色(BioRad社 カタログ番号 170-3120)、抗マウスIgG(L+H)抗体(MP Biomedicals社 カタログ番号 67428)によるウエスタンブロットのいずれにおいてもコントロールとして用いた市販抗Ovalbumin抗体(AntibodyShop社 カタログ番号 HYB094-07)同様H鎖、L鎖それぞれ1本のバンドを示し、ハイブリドーマ6-76-14-29がクローンであること、産生される抗体タンパクが単一種であることを示した(図12)。さらに、この精製抗体を用いてウエスタンブロットを行なったところ、精製前の上清と同様にgp160, gp41を検出することができた(図13)。
免疫、ハイブリドーマの作製、選択およびウエスタンブロットは実施例6にならって行なった。ただし、免疫部位として足蹠注を用い、Priming時のベクターは2x109 CIU/mouse を用いた。gp41を認識するもの(D1-518, A2-12, B2-39, B2-103)だけではなくgp120を認識するもの(D1-106, D1-137, D1-526, D2-26)も含む複数の抗gp160抗体産生ハイブリドーマの取得に成功した(図14)。
F遺伝子欠損型センダイウイルスベクター SeV18+LacZ/ΔF(WO00/70070)に、CTL抑制と同時に抗体産生刺激効果があることが知られているサイトカインinterleukin (IL)-10をコードする核酸と、gp160をコードする核酸とを同時搭載したベクターを作製し、これを用いてマウスを免疫し、56日後の血漿中に産生される抗体を調べた。免疫およびウエスタンブロットは実施例7にならって行なった。IL-10が同時搭載されたセンダイウイルスベクターで抗gp160抗体が有効に誘導されることが示された。(図15)
Claims (17)
- 抗体または抗体産生細胞の製造方法であって、
(a)抗原としたい外来ポリペプチドをコードする核酸を搭載するマイナス鎖RNAウイルスベクター、該ウイルスベクターを生成する核酸、該ベクターまたは該ベクターを生成する核酸が導入された細胞、または該細胞の溶解物を、非ヒト動物に接種する工程、
(b)該動物から、抗体または抗体産生細胞を回収する工程、
を含む方法。 - 工程(a)の接種が、筋注、皮下投与、点鼻投与、手掌または足蹠皮内投与、脾臓投与、および腹腔内投与からなる群より選択される投与経路により行われる、請求項1に記載の方法。
- 該マイナス鎖RNAウイルスベクター、該ウイルスベクターを生成する核酸、該ベクターまたは該ベクターを生成する核酸が導入された細胞、該細胞の溶解物、または該細胞の溶解物から精製された抗原の接種によりブーストを行う工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 該ポリペプチドまたはその断片を含むポリペプチドによりブーストを行う工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 回収した抗体と該抗原とを接触させ、該抗原に結合する抗体を選択する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 回収した抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合させ、ハイブリドーマを調製する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- ハイブリドーマが産生する抗体と該抗原とを接触させ、該抗原に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程をさらに含む、請求項6に記載の方法。
- ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を回収する工程をさらに含む、請求項6に記載の方法。
- マイナス鎖RNAウイルスが複製欠損型である、請求項1に記載の方法。
- マイナス鎖RNAウイルスが、パラミクソウイルスである、請求項1に記載の方法。
- パラミクソウイルスが少なくともF遺伝子を欠損する、請求項10に記載の方法。
- パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、請求項10に記載の方法。
- 回収した抗体を含む溶液と、該外来ポリペプチドをコードしない該マイナス鎖RNAウイルスベクター、該ウイルスベクターが導入された細胞、該細胞の溶解物、または該ウイルスのウイルス蛋白質とを共存させる工程、および、それらと結合しない抗体を選択する工程、をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- ハイブリドーマが産生する抗体を含む溶液と、該外来ポリペプチドをコードしない該マイナス鎖RNAウイルスベクター、該ウイルスベクターが導入された細胞、該細胞の溶解物、または該ウイルスのウイルス蛋白質とを共存させる工程、および、それらと結合しない抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程、をさらに含む、請求項6に記載の方法。
- Th2サイトカインまたはその活性部分ペプチド、あるいはそれらをコードするベクターを投与する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 該サイトカインまたはその活性部分ペプチドが、抗原としたい外来ポリペプチドをコードする該マイナス鎖RNAウイルスベクターにコードされている、請求項15に記載の方法。
- Th2サイトカインがIL-4、IL-10、およびIL-13からなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
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