CN112007174B - 一种肿瘤靶向探针及其制备方法以及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种肿瘤靶向探针及其制备方法以及应用，该方法包括以下步骤：1)将一定大小的成像纳米材料进行水溶性修饰，制得成像探针；2)将成像探针与阳离子材料连接，获得一种表面带正电的成像探针；以及3)在步骤2)中表面带正电的成像探针外层修饰连接可被DNA酶降解的阴离子材料，即得。根据本发明提供的肿瘤靶向探针，其阴离子表面在血液循环中能高效阻断血清蛋白的吸附，从而显著降低肝脏内吞噬细胞对探针的摄取，使其能够在肝脏内快速代谢，进一步地，该探针的阴离子壳层经体内DNA酶降解露出阳离子表面，从而显著提高肿瘤细胞对探针的摄取，提供了一种能显著提高实体肿瘤成像中肿瘤/肝脏信噪比的方法，具有良好的医学应用前景。

Description

一种肿瘤靶向探针及其制备方法以及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种肿瘤靶向探针及其制备方法以及应用。

背景技术

在肿瘤治疗中，肿瘤靶向探针指被特异性地限定在肿瘤组织/细胞，不影响周围其他细胞/组织的功能，从而达到指示或治疗功用的一类探针。生物体具有复杂的内环境，在活体治疗中，探针的理化性质例如几何构象、表面化学性质等常常需要随时空变化而变化，从而达到减少肝脏等主要脏器的体内滞留并提高肿瘤组织/细胞摄取的效果。

但是，现有的探针大多是理化性质恒定不变的，难以满足上述要求。例如，阳离子材料如阳离子脂类或聚合物等能高效进入肿瘤细胞，但在到达肿瘤组织前常常被肝脏吞噬细胞迅速摄取，导致在肝脏组织内大量滞留，引起毒副作用。与之相反的是，阴离子材料(例如DNA包裹的纳米颗粒，DNA纳米结构)被吞噬细胞摄取的较少，但肿瘤的摄取也相对较差。有文献报道了能够在肿瘤组织内改变其理化性质的探针，从而实现对肿瘤组织的特异性成像或治疗。但是，这些探针仅能响应肿瘤组织的微环境。

迄今，尚未见到能在生物体复杂内环境中随时空变换而变化理化性质的靶向探针，因此，有必要研究一种新的“可变形”的肿瘤靶向探针，降低其在正常组织的滞留并提高肿瘤摄取效率，从而达到实体瘤特异性成像的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种肿瘤靶向探针及其制备方法以及应用，从而解决现有技术中纳米材料肝脏滞留高，肿瘤/肝脏信号比较低的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种肿瘤靶向探针的制备方法，包括以下步骤：1)将一定大小的成像纳米材料进行水溶性修饰，制得成像探针；2)将所述成像探针与阳离子材料连接，获得一种表面带正电的成像探针；以及3)在步骤2)中所述表面带正电的成像探针外层修饰连接可被DNA酶降解的阴离子材料，制得一种肿瘤靶向探针。

根据本发明所提供的一种肿瘤靶向探针的制备方法，其工作原理为：探针外层的阴离子材料导致血清蛋白对其吸附低，吞噬细胞摄取量少，肝脏滞留低；随着阴离子材料被DNA酶降解，暴露出的内层阳离子材料有利于提高肿瘤细胞的摄取效率，从而获得较高的肿瘤/肝脏信号比。

其中，所述成像纳米材料为在可见光或近红外波长有发射光的常规纳米颗粒，包括：量子点、金纳米颗粒、硅球或上转换纳米颗粒，所述成像纳米材料的尺寸为5～100纳米。

优选地，纳米颗粒为近红外二区成像试剂硫化银(Ag2S)，尺寸约为5纳米，激发波长808纳米，发射波长为1200纳米，市售可得。应当理解，该纳米颗粒仅作为优选实施例举例说明，并非用于限制，实际上，尺寸5～100纳米，且具有发光性质的常规纳米颗粒均适用于本发明。

步骤1)中，所述水溶性修饰包括在所述成像纳米材料的表面修饰选自以下基团：羧基、氨基、巯基、叠氮基、炔基中的至少一种。

所述将纳米颗粒进行水溶性修饰为常规方法，较佳地为：将疏水性Ag2S颗粒表面的十二硫醇置换为11-巯基十一烷酸，即可制得羧基修饰的水溶性Ag2S。所述置换方法为本领域常规方法，较佳地为在等比例环乙烷和乙醇溶液中震荡48小时即可。

其中，步骤2)所述阳离子材料包括：氨基、L-多聚赖氨酸、D-多聚赖氨酸、聚丙基三甲氧基硅烷、聚丙基三乙氧基硅烷或壳聚糖修饰的聚乙二醇(PEG)。优选地为六臂氨基修饰的PEG。

其中，步骤2)和步骤3)中的连接包括共价键连接和非共价键连接，共价键包括Au-S键、酰胺键、咪唑键，非共价键包括氢键、疏水键。

步骤2)中的连接方法为本领域常规技术手段。优选地为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应偶联羧基Ag2S与六臂氨基PEG形成酰胺键。

步骤3)中可被DNA酶降解的阴离子材料包括功能化修饰的单链DNA、双链DNA以及由DNA形成的二级结构。优选地为羧基修饰的单链DNA。

步骤3)中，所述功能化修饰选自以下修饰中的至少一种：羧基、氨基、巯基、叠氮基、炔基、或硫代磷酸化。

步骤3)中的修饰方法为本领域常规技术手段。优选地为EDC/NHS反应偶联六臂氨基PEG与羧基DNA形成酰胺键。

根据本发明的第二方面，还提供一种根据上述制备方法制得的肿瘤靶向探针，也可称作一种“可变形”的肿瘤靶向探针，所述肿瘤靶向探针以成像纳米材料为核心，外层依次修饰有阳离子材料和阴离子材料，其中，所述阴离子材料可被DNA酶降解以露出阳离子材料形成的表面，从而显著提高肿瘤细胞对所述肿瘤靶向探针的摄取。

根据本发明，通过对成像纳米材料以及阳离子材料和阴离子材料选择的不同，可以提供多种“可变形”的肿瘤靶向探针。根据本发明的一个优选方案，所述“可变形”的肿瘤靶向探针可选为以Ag2S纳米颗粒为核心，六臂氨基PEG为阳离子载体，羧基修饰的单链DNA为阴离子材料。但是应当理解，上述肿瘤靶向探针仅作为优选实施例用于说明本发明，并非用于限制。

根据本发明所提供的“可变形”的肿瘤靶向探针，结果显示修饰阴离子材料能有效降低血清蛋白的吸附，抑制吞噬细胞的摄取，减少肝滞留；经DNA酶降解转化为阳离子材料后，肿瘤细胞的摄取量显著提高。

根据本发明的第三方面，还提供一种肿瘤靶向探针在实体瘤成像中的应用。

所述应用包括在肝癌、乳腺癌、肺癌成像中的应用。应当理解，本发明所提供的肿瘤靶向探针并不局限于上述三种肿瘤的成像，实际上可用于多种类似的实体瘤成像。

本发明相对现有技术的积极进步效果在于：本发明制备的“可变形”的肿瘤靶向探针在实体瘤成像中能有效降低肝脏背景，并提高肿瘤靶向效率，达到提升肿瘤/肝脏信号比的效果，有利于实现特异性的肿瘤成像。在实际应用中，最优地，该肿瘤靶向探针对三种实体瘤均有较高的肿瘤/肝脏信号比，甚至高达4.9，远远超过当前文献中的平均水平(～0.28)。

综上所述，根据本发明提供的“可变形”肿瘤靶向探针的阴离子表面在血液循环中能高效阻断血清蛋白的吸附，从而显著降低肝脏内吞噬细胞对探针的摄取，使其能够在肝脏内快速代谢；更重要地，该探针的阴离子壳层经体内DNA酶降解露出阳离子表面，从而显著提高肿瘤细胞对探针的摄取。本发明提供了一种能显著提高实体肿瘤成像中肿瘤/肝脏信噪比的方法，具有良好的医学应用前景。总之，本发明提供了一种能显著提高纳米颗粒在实体瘤中特异性成像的方法，具有良好的临床应用前景。

附图说明

图1示出了琼脂糖凝胶电泳表征阳离子探针(fAg2S)和阴离子探针(fAg2S@DNA)的结果；

图2A、图2B、图2C分别示出了透射电镜表征Ag2S、fAg2S和fAg2S@DNA的结果；

图3示出了Ag2S、fAg2S和fAg2S@DNA三种材料的粒径和电位；

图4A示出了电泳表征fAg2S@DNA在体外发生DNA酶介导的转化；图4B示出了定量分析转化结果；

图5A示出了定量分析DNA在肝脏内的转化，图5B示出了对Ag2S在肝脏部位荧光信号的定量统计；

图6示出了以PLL为阳离子层的肿瘤靶向探针的体外转化；

图7示出了以双链DNA为阴离子层的肿瘤靶向探针的体外转化；

图8示出了以Ag2Se为核心的肿瘤靶向探针的体外转化；

图9A示出了fAg2S@DNA在肝癌移植瘤小鼠模型中的成像结果，其中实线为肿瘤，虚线为肝脏，灰色代表fAg2S@DNA的荧光；图9B示出了对肿瘤和肝脏部位平均荧光强度的统计；

图10A示出了fAg2S@DNA在乳腺癌移植瘤小鼠模型中的成像结果，其中实线为肿瘤，虚线为肝脏，灰色代表fAg2S@DNA的荧光；图10B示出了对fAg2S@DNA在肝癌和乳腺癌肿瘤-肝脏信号比的统计。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

在以下具体实施方式中，本发明主要选择近红外二区成像颗粒硫化银(Ag2S，发射波长900-1300纳米)为核心，阳离子层以六臂氨基聚乙二醇(6PEG)和聚-L-赖氨酸(PLL)为代表，阴离子层以单链和双链DNA为代表，构建“可变形”的肿瘤靶向探针并用于实体瘤成像研究，以下实施例具体说明本发明的实施效果。

其中，所用DNA序列(5’-3’)如下：

S1-COOH：COOH-TTTTTGTGCTTAGGATTTGC

S2：GCAAATCCTAAGCAC

S1-COOH-Cy5.5：COOH-TTTTTGTGCTTAGGATTTGC-Cy5.5

S1的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，S2的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。

实施例一 肿瘤靶向探针的制备

本实施例以Ag2S为核心，阳离子层以6PEG，阴离子层以单链DNA为例说明肿瘤靶向探针的制备过程。

Ag2S的功能化修饰。疏水性Ag2S纳米颗粒购自苏州影睿光学科技有限公司，平均粒径5.4纳米，表面覆盖十二硫醇，并分散于二氯甲烷中。将0.05mmolAg2S纳米颗粒与15mL环己烷、15mL乙醇和0.15g11-巯基十一烷酸混合，室温震荡48小时，随后以26916g离心20分钟，收集产物。并用纯水洗三次，获得羧基修饰的水溶性Ag2S颗粒。

阳离子层的修饰。将24mg 6PEG与上述Ag2S混合，加入120μL EDC/NHS(20mg/mL)，超声30分钟。随后加入360μL EDC/NHS(20mg/mL)，室温震荡8小时。随后将产物离心收集，并用1×PBS缓冲液洗涤三次，最终重悬在该缓冲液中，获得带阳离子层的成像探针(fAg2S)。

阴离子层的修饰。取30μL 8μMfAg2S(按照1.5mg/mL相当于4μM换算)与120μL 100μM DNA-COOH(S1)混合，随后加入240μL 1mM EDC/NHS，室温震荡8小时。离心收集产物，用1×PBS缓冲液洗涤三次，最终重悬在该缓冲液中，获得可变形的靶向探针(fAg2S@DNA)。

结果：如图1所示，琼脂糖凝胶电泳表明，修饰DNA后，带正电的fAg2S成像探针变为带负电的fAg2S@DNA；并且透射电镜结果体现了在Ag2S界面逐层增加6PEG和DNA的效果，如图2A、图2B、图2C所示；此外分别对三种材料的粒径和电位进行分析，也证实了“可变形”肿瘤靶向探针的成功制备，如图3所示。

实施例二 肿瘤靶向探针的体外转化研究

脱氧核糖核酸酶I(DNase I)购自碧云天生物工程有限公司(货号D7073)。DNA的3’末端标记Cy5.5荧光分子(生工生物工程有限公司)，制得fAg2S@DNA-Cy5.5。用以监测DNA的体外转化。体外转化实验在反应缓冲液(10mM Tris，2.5mM MgCl2，0.5mM CaCl2，pH＝7.5)中进行。取20μL上述fAg2S@DNA加入10μLDNA酶I(20Units/L)和70μL反应缓冲液，充分混匀后在37℃中分别反应0，1，2，3，4，6小时。随后用1％的琼脂糖凝胶电泳表征DNA的转化。

结果：将反应后的产物用琼脂糖凝胶电泳20分钟，分别在OdysseyCLx近红外双色图像分析系统和近红外二区活体影像仪中对Cy5.5和Ag2S的信号进行表征，如图4A所示，Ag2S的信号没有发生改变，而Cy5.5的信号随降解时间延长而逐渐降低。根据希尔方程Y＝Vmax*x^n/(Kd^n+x^n)，对Cy5.5的信号定量分析，表明DNA的降解半衰期为2.3±0.8小时，如图4B所示。

实施例三 “可变形”的肿瘤靶向探针的体内转化研究

在阴离子层DNA上标记Cy5.5荧光分子，通过监测裸鼠体内Cy5.5的信号来研究DNA层在体内的转化情况。取18-20克裸鼠(雄性，上海千全生物科技有限公司)，尾静脉注射240nmolfAg2S@DNA-Cy5.5。在注射1，3，6，12小时后，取出肝组织，分别在伯托小动物活体成像仪(德国)监测DNA转化情况，在近红外二区活体影像仪中监测Ag2S的代谢，成像条件为2w，50ms。

结果：肝组织中DNA-Cy5.5的一区荧光信号明显比二区的荧光信号下降快的多，说明DNA壳层在富含DNA酶的肝脏微环境中随着时间的推移发生降解，如图5A、图5B所示。

实施例四 修饰6PEG和PLL阳离子层的肿瘤靶向探针的体外转化效应比较

以PLL为阳离子层的肿瘤靶向探针的制备。将16mg PLL与Ag2S混合，加入80μLEDC/NHS(20mg/mL)，超声30分钟。随后加入240μL EDC/NHS(20mg/mL)，室温震荡8小时。随后将产物离心收集，并用1×PBS缓冲液洗涤三次，最终重悬在该缓冲液中，获得带PLL阳离子层的成像探针。随后按照实施例1中所述方法与DNA反应，即可制得以PLL为阳离子层的肿瘤靶向探针。

根据实施例2中所述方法对这一靶向探针的体外转化效应进行分析。结果表明，转化时间为2.5±1.0小时，与以6PEG为阳离子层的探针转化效率没有显著性差异，如图6所示。

实施例五 修饰单链和双链DNA阴离子层的肿瘤靶向探针的体外转化效应比较

以双链DNA为阴离子层的肿瘤靶向探针的制备。将S1与S2以等比例在1×PBS缓冲液中混合，37℃反应10分钟后即可获得双链DNA。随后将双链DNA与fAg2S混合，加入EDC/NHS反应8小时后，即可制得双链DNA为阴离子层的肿瘤靶向探针。

根据实施例2中所述方法对这一靶向探针的体外转化效应进行分析。结果表明，转化时间为1.9±0.3小时，与以单链DNA为阴离子层的探针转化效率相比略微加快，如图7所示。

实施例六 Ag2S@DNA和Ag2Se@DNA肿瘤靶向探针的体外转化效应比较

以Ag2Se为核心的肿瘤靶向探针的制备。疏水性Ag2Se购自苏州影睿光学科技有限公司，表面覆盖1-十二硫醇，分散于氯仿中，平均粒径4.3纳米。将30mg磷脂氨基PEG(DSPE-PEG)与15mL Ag2Se混合，真空旋转蒸发去除氯仿，加入PBS超声30分钟即可制得水溶性DSPE-PEG-NH2修饰的Ag2Se，最后根据实施例1中所述方法修饰阴离子层，即可制得以Ag2Se为核心的肿瘤靶向探针。

根据实施例2中所述方法对这一靶向探针的体外转化效应进行分析。结果表明，转化时间为2.1±0.4小时，与以Ag2S为核心的探针转化效率没有差异，如图8所示。

实施例七 “可变形”的肿瘤靶向探针对肝癌的成像

肝癌皮下瘤模型的构建。HepG2细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。RPMI1640(含10％FBS)培养基，37℃，5％CO2，饱和湿度培养。将90μL细胞(约100万个)与10μL基质胶混合，注入裸鼠右大腿后侧，约4-5天可见明显肿瘤块。

结果：如图9A和图9B所示，对肝癌肿瘤模型鼠进行成像结果表明，fAg2S@DNA在注射12小时后，肝脏部位基本无荧光信号，而肿瘤部位有明显的荧光信号，通过计算可得此时肿瘤-肝脏信号比达到4.9。

实施例八 “可变形”的肿瘤靶向探针对肝癌、乳腺癌的成像比较

乳腺癌皮下瘤模型的构建。4T-1细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，培养方式和肿瘤构建方式同实施例七。注射fAg2S@DNA12小时后，对乳腺癌皮下瘤模型鼠进行近红外二区荧光成像。

如图10A和图10B所示，结果表明在乳腺癌模型鼠中，获得了与肝癌模型相近的肿瘤成像效果，肿瘤-肝脏信号比达到3.8，说明“可变形”的肿瘤靶向探针对多种肿瘤模型均可获得高特异性成像效果。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院上海高等研究院

<120> 一种肿瘤靶向探针及其制备方法以及应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tttttgtgct taggatttgc 20

<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcaaatccta agcac 15

Claims (2)

1.一种肿瘤靶向探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将一定大小的成像纳米材料进行水溶性修饰，制得成像探针，所述成像纳米材料为Ag₂S纳米颗粒或Ag₂Se纳米颗粒，尺寸为5~100纳米；

2）将所述成像探针与阳离子材料连接，获得一种表面带正电的成像探针，所述阳离子材料为六臂氨基聚乙二醇或聚-L-赖氨酸；以及

3）在步骤2）中所述表面带正电的成像探针外层修饰连接可被DNA酶降解的阴离子材料，制得一种肿瘤靶向探针，所述阴离子材料为双链DNA。

2.一种根据权利要求1所述的制备方法制得的肿瘤靶向探针，其特征在于，所述肿瘤靶向探针以成像纳米材料为核心，外层依次修饰有阳离子材料和阴离子材料，所述成像纳米材料为尺寸为5~100纳米的Ag₂S纳米颗粒或Ag₂Se纳米颗粒，所述阳离子材料为六臂氨基聚乙二醇或聚-L-赖氨酸，所述阴离子材料为双链DNA，其中，所述阴离子材料可被DNA酶降解露出阳离子材料形成的表面，从而显著提高肿瘤细胞对所述肿瘤靶向探针的摄取。

Images