CN111855775B - 一种氨基酸脱氢酶电极及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种氨基酸脱氢酶电极及其制备方法和应用。本发明涉及生物传感器技术领域，尤其涉及酶电极、酶生物传感器及其制备方法和应用。该氨基酸脱氢酶电极包括基底电极、电子传导体、电子中介体、离子型辅酶和氨基酸脱氢酶，可实现酶分子的有效固定和酶与电极之间的电子转移，提高酶分子催化活性和传感器的灵敏度。本发明的氨基酸脱氢酶电极以具有良好生物相容性的导电高分子聚多巴胺修饰还原氧化石墨烯或碳纳米管作为电极材料，具有制作方法简单、检测灵敏度高、快捷准确、稳定性和重复性好的优点，具有良好的应用前景。

Description

一种氨基酸脱氢酶电极及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，涉及一种酶电极、酶生物传感器及其制备方法和应用，尤其涉及一种氨基酸脱氢酶电极及其制备方法和应用。
背景技术
生物传感器在生物医学检验、疾病诊断与治疗、食品分析、环境监测、工业过程检测与控制、毒物检测及战争生化预警等领域具有广阔的应用前景。生物传感技术产业化的瓶颈是关键器件和分析系统制造技术。以酶分子器件为重点，在分子设计、器件组装、分析模型构建等方面进行创新设计并在医疗、环境、工业等重点领域进行应用示范是生物传感器的研究热点。
目前，氨基酸化合物的分析方法主要有毛细管电泳法、高效液相色谱法和气相色谱法。这些方法由于需要复杂的样品前处理过程及庞大的仪器，难以满足有机胺物质的小型化、快速化和现场化的检测要求。酶电极则具有准确、快速、简便、灵敏和选择性好等优点，为氨基酸物质的测定提供了一种有效的手段。
氨基酸脱氢酶可高效催化氨基酸氧化生成相应的酮酸，同时将NAD+还原为NADH(图1)。反应过程简洁高效，在氨基酸的酶检测等方面具有广阔的应用潜力。
聚多巴胺上的大量氨基，不仅可以与碳纳米材料结合，也可以和蛋白酶氨基酸侧链氨基酸(组氨酸、天冬氨酸和精氨酸等)上的功能基团(咪唑基、吲哚基和酚羟基等)进行反应。并且聚多巴胺提供生物相容性的微环境，酶与载体的多层次相互作用使胺脱氢酶紧密地结合在电极上，且二者之间也存在范德华力、氢键和静电作用力，可用于高度敏感和选择性的生物传感器。但截至目前还未有将聚多巴胺用于制备氨基酸脱氢酶电极的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种氨基酸脱氢酶电极及其制备方法和应用，基于碳纳米材料与聚多巴胺(PDA)复合材料的设计，构建基于氢键、疏水、静电和配位作用力等多层次的相互作用力定向组装酶，有利于提高酶的稳定性及生物敏感膜的固定，为生物分子的电化学反应提供了一个良好的微环境，构建得到新型氨基酸脱氢酶电极；同时，本发明利用氨基酸脱氢酶电极制备检测氨基酸的生物传感器，并以聚多巴胺高分子材料作为电极辅助材料，具有良好生物相容性且能在酶和电极之间的直接电子转移方面起促进作用，实现酶分子的有效固定和酶与电极之间的电子转移，提高酶分子催化活性和传感器的灵敏度，从而实现对氨基酸的高灵敏检测。本发明的氨基酸脱氢酶电极与传统的酶电极比较，具有检测灵敏度高、快捷准确、稳定性和重复性好等优势。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
一种氨基酸脱氢酶电极，包括基底电极、电子传导体、电子中介体、离子型辅酶(NADH-IL)和氨基酸脱氢酶(AaDH)；所述电子传导体包括还原氧化石墨烯(rGO)或碳纳米管，还包括聚多巴胺(PDA)和纳米金(AuNPs)；所述氨基酸脱氢酶的基因序列如SEQ ID No.1所示；所述氨基酸脱氢酶包埋固定于所述电子传导体。
一实施例中：所述基底电极为玻碳电极、热解石墨电极、碳糊电极或金属电极；优选为玻碳电极。
一实施例中：所述电子中介体为5-甲基吩嗪硫酸甲酯(PMS)、甲苯胺蓝、麦尔多拉蓝或亚甲基蓝中的至少一种。
一实施例中：所述离子型辅酶NADH-IL以烟酰胺辅酶NADH为阴离子，以咪唑作为阳离子；作为阳离子的所述咪唑例如为1-丁基-3-甲基咪唑。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
一种氨基酸脱氢酶电极的制备方法，包括：将还原氧化石墨烯或碳纳米管、多巴胺单体或聚多巴胺、纳米金前体或纳米金与氨基酸脱氢酶混合反应以包埋固定化所述氨基酸脱氢酶，得到包括还原氧化石墨烯或碳纳米管、聚多巴胺、纳米金的氨基酸脱氢酶固定化混合物；将所述氨基酸脱氢酶固定化混合物与电子中介体、离子型辅酶NADH-IL复合于基底电极表面，得到氨基酸脱氢酶电极。
例如，将还原氧化石墨烯、多巴胺单体、纳米金前体与所述氨基酸脱氢酶混合反应以包埋固定所述氨基酸脱氢酶，得到包括还原氧化石墨烯、聚多巴胺、纳米金的氨基酸脱氢酶固定化混合物；将所述氨基酸脱氢酶固定化混合物与电子中介体、离子型辅酶NADH-IL复合于所述基底电极表面，得到所述氨基酸脱氢酶电极。具体地，所述氨基酸脱氢酶固定化混合物的制备方法包括：在还原氧化石墨烯溶液中加入多巴胺单体、氨基酸脱氢酶，缓慢搅拌下加入纳米金前体进行化学氧化聚合并固定化氨基酸脱氢酶，得到所述氨基酸脱氢酶固定化混合物。
其中，所述还原氧化石墨烯、多巴胺单体、氨基酸脱氢酶与纳米金前体的配方比例为5～10mg：20～300mg：10～20mg：1.0～5.0mM。
其中，化学氧化聚合的反应时间为5～7小时。
其中，所述还原氧化石墨烯的浓度为0.5～1mg/mL。
其中，所述氨基酸脱氢酶的浓度为2～3mg/mL。
其中，所述还原氧化石墨烯的制备方法包括：将0.05～1g抗坏血酸(L-AA)加入到4～10mL 1～6mg/mL的分散均匀的GO溶液中，搅拌反应6～12h，得到还原氧化石墨烯。
又如，将碳纳米管、聚多巴胺、纳米金或纳米金前体，与所述氨基酸脱氢酶混合反应以包埋固定所述氨基酸脱氢酶，得到包括碳纳米管、聚多巴胺、纳米金的氨基酸脱氢酶固定化混合物；将所述氨基酸脱氢酶固定化混合物与电子中介体、离子型辅酶NADH-IL复合于所述基底电极表面，得到所述氨基酸脱氢酶电极。具体地，所述氨基酸脱氢酶固定化混合物的制备方法包括：在碳纳米管溶液中加入聚多巴胺，得到碳纳米管-聚多巴胺的溶液，再将碳纳米管-聚多巴胺的溶液与纳米金-氨基酸脱氢酶混合，得到所述氨基酸脱氢酶固定化混合物；或者，在碳纳米管溶液中加入聚多巴胺，得到碳纳米管-聚多巴胺的溶液，碳纳米管-聚多巴胺的溶液与纳米金前体反应制得含有纳米金的碳纳米管-聚多巴胺的溶液，将氨基酸脱氢酶与含有纳米金的碳纳米管-聚多巴胺的溶液混合，得到所述氨基酸脱氢酶固定化混合物。
其中，所述碳纳米管为单壁碳纳米管(SWCNT，SWNT)或多壁碳纳米管(MWNTs)。
其中，碳纳米管与聚多巴胺的质量比为1：1～3。
其中，所述碳纳米管-聚多巴胺的浓度为0.5～2mg/mL。
其中，所述氨基酸脱氢酶的浓度为4～6mg/mL。
在本发明的氨基酸脱氢酶电极的制备方法中，进一步地：
一实施例中：所述多巴胺单体为多巴胺(DA)、左旋多巴(L-DOPA)中的至少一种。
一实施例中：所述纳米金前体为NaAuCl4、HAuCl4中的至少一种。
一实施例中：所述基底电极为玻碳电极或热解石墨电极时预先经过表面预处理，表面预处理方法包括：将玻碳电极或热解石墨电极依次用直径1.0μm、0.3μm、0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗，用氮气吹干；再将玻碳电极或热解石墨电极置于含有1～5mM K3Fe(CN)6和10～200mM KCl的溶液中进行电极活化，取出用蒸馏水冲洗，室温下晾干得到预处理的基底电极。
一实施例中：所述氨基酸脱氢酶的制备方法包括：利用如SEQ ID No.1所示的氨基酸脱氢酶基因制备可表达氨基酸脱氢酶的工程菌；将上述工程菌接种，加入诱导剂，培养所得发酵液离心获得细胞；细胞超声破碎，离心，得到含有氨基酸脱氢酶的粗酶液；将上述含有氨基酸脱氢酶的粗酶液进行纯化除盐，得到氨基酸脱氢酶。
一实施例中：所述电子中介体与离子型辅酶NADH-IL形成凝胶，或者所述电子中介体、离子型辅酶NADH-IL与离子液体(用于溶解离子型辅酶NADH-IL)形成凝胶；所述氨基酸脱氢酶固定化混合物与所述凝胶复合于所述基底电极表面，得到所述氨基酸脱氢酶电极。
一实施例中：所述凝胶的制备方法包括：将所述离子型辅酶NADH-IL与所述离子液体(离子液体的用量以能充分溶解离子型辅酶NADH-IL为宜)混合均匀后，以离子型辅酶NADH-IL与电子中介体的质量比为0.1～1:1的比例加入所述电子中介体，在溶剂中超声分散，挥发溶剂后得到所述凝胶。所述溶剂例如为乙醇。
一实施例中：所述离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐[EMIM]BF4、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐[BMIM]BF4、1-丁基-3-甲基咪唑氯盐[BMIM]Cl、N,N'-(亚甲基)双(1-(3-乙烯基咪唑))溴中的至少一种。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：
一种利用氨基酸脱氢酶电极在测定溶液中的氨基酸浓度的方法，所述氨基酸浓度的测定采用三电极体系，以所述的氨基酸脱氢酶电极为工作电极，或以根据所述的制备方法所制备的氨基酸脱氢酶电极为工作电极；参比电极为饱和甘汞电极、氢电极、银|氯化银电极或汞|氧化汞电极，更优选为饱和甘汞电极；对电极为铂丝电极或碳电极。
一实施例中：以循环伏安和/或计时电流的方式测定溶液中的氨基酸浓度；所述循环伏安方式的测试电位扫描速率为1～400mV/s，例如25～200mV/s；在加入1～20mg辅酶NADH的缓冲液中进行，测试之前通入N2，所述氨基酸为L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-叔亮氨酸和L-谷氨酸等；所述氨基酸的浓度范围为50ppm～5mM；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液中的至少一种。
本发明的有益效果如下：
1.本发明选用石墨烯、碳纳米管等碳纳米材料及导电高分子聚多巴胺作为电子传递材料进行酶电极制备，所制备的复合材料因其优越的电子性能、可化学修饰性能和良好的生物相容性等实现酶的稳定固定化以及高效电子传递。本发明的酶电极以具有良好生物相容性的导电高分子聚多巴胺修饰石墨烯、碳纳米管等作为电极材料，具有制作方法简单、成本低廉，检测灵敏度高、快捷准确、稳定性和重复性好的优点。
2.在制备氨基酸脱氢酶电极时，还原氧化石墨烯、多巴胺单体、氨基酸脱氢酶与纳米金前体共同进行氧化聚合，使氨基酸脱氢酶与还原氧化石墨烯、聚多巴胺及纳米金结合在一起，氨基酸脱氢酶得以包埋固定化，得到的物质再与电子中介体、NADH-IL共同复合于基底电极形成氨基酸脱氢酶电极。这种电极中氨基酸脱氢酶包埋固定化于其中，优点在于氨基酸脱氢酶可以牢固的固定在电极上，不易脱落。
3.NADH-IL的作用在于可以在电极上迅速的实现辅酶NADH的原位再生。
4.纳米金的作用在于均匀分布在还原氧化石墨烯和聚多巴胺等导电材料之中，与酶结合促进电子传递。
5.还原氧化石墨烯/碳纳米管、聚多巴胺、纳米金、NADH-IL具有协同作用，提高电子传递效率。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为本发明的酶电极检测氨基酸的原理图。
图2为本发明实施例1的氨基酸脱氢酶电极在不同浓度L-苯丙氨酸的条件下的循环伏安图。
图3为本发明实施例5的氨基酸脱氢酶电极在不同浓度L-亮氨酸的条件下的循环伏安图。
图4为本发明实施例6中的MWNTs-PDA的扫描电子显微镜(SEM)图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做详细说明。
实施例1
(1)氨基酸脱氢酶粗酶制备：根据如SEQ ID No.1所示的氨基酸脱氢酶(AaDH)原始序列，设计如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的引物，由商业化公司(上海生物工程有限公司)采用PCR法合成氨基酸脱氢酶的基因序列，用于与载体pET28a连接，构建质粒。
SEQ ID No. 名称 序列(下划线为NdeI和XhoI酶切位点)
SEQ ID No.2 AaDH-F 5’-GGAATTC<u>CATATG</u>TTTGAAAAAATATCACAGCATG-3’
SEQ ID No.3 AaDH-R 5’-CCG<u>CTCGAG</u>ATGTCTAACCTGCCATTTTG-3’
PCR产物(氨基酸脱氢酶的基因序列)与载体pET28a的连接：使用NdeI与XhoI将PCR产物及载体pET28a双酶切，经纯化后在T4 DNA Ligase作用下4℃过夜反应，得到转化用质粒。采用Competent Cel Preparation Kit试剂盒完成制备感受态细胞。向感受态细胞中加入10ng的转化用质粒，轻轻混匀后冰上放置30分钟，42℃水浴放置45秒，立即于冰上放置1～2分钟。加入37℃预温的LB培养基，37℃震荡培养1小时，取适量菌液涂带有卡那霉素抗性的LB固体平板，37℃过夜培养后挑去单菌落，即为重组大肠杆菌(E.coli BL21(DE3)/pET28a)。
重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a的培养：以1％的接种量，将菌种接入200mL LB培养基中。LB培养基的组成为10.0g/L胰蛋白胨，5.0g/L酵母粉，10g/L NaCl。培养条件为：起始pH 7.0，装液量体积分数为10％，培养温度37℃，摇床转速200rpm，培养时间6小时。加入诱导剂IPTG，使其终浓度为10mg/mL，继续在30℃、200rpm条件下培养12h。
粗酶液的制备：培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4℃，8000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次获得细胞。利用超声破碎仪对细胞液进行处理，细胞破碎仪探头置于液面下1cm，破碎条件为超声2秒，间隔4秒，超声40次，功率200W。然后4℃、12,000rpm离心15min去除不溶性细胞碎片，上清即为氨基酸脱氢酶粗酶液。
(2)氨基酸脱氢酶纯酶制备：采用GE公司的His Trap镍柱对氨基酸脱氢酶粗酶液进行分离纯化，并用PALL公司的10K的超滤离心管进行超滤除盐。所述的纯化过程采用的纯化柱为能够特异性纯化带有His-tagged标签的蛋白质的HisTrap HP柱，其步骤包括平衡、上样、平衡、洗脱、柱子再生；收集洗脱的部分并利用超滤离心管进行除盐；除盐后获得的液体即为氨基酸脱氢酶纯酶液体。并向其中加入以Tris-HCl(0.05M，pH 7.0)缓冲液，制备成含有氨基酸脱氢酶的水溶液，并根据需要调节其中的氨基酸脱氢酶浓度为0.05～50mg/mL备用。
(3)将直径为3mm的玻碳电极(GCE)依次用直径1.0μm、0.3μm、0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗3min，用氮气吹干。再将玻碳电极置于10mL铁氰化钾溶液中(1mM K3Fe(CN)6+10mM KCl)进行电极活化，取出用蒸馏水冲洗，室温下晾干得到预处理的玻碳电极。
(4)酶电极rGO-PDA-AuNPs-AaDH的制备：Hummer法制备氧化石墨烯，超声分散3h后得到分散均匀的GO溶液。在1mg/mL GO加入抗坏血酸0.5g还原12h，12000rpm离心，除去上清液，加入10mL超纯水洗涤一次，再离心，再加10mL的0.1M柠檬酸缓冲溶液(pH7.0)制备成1mg/mL的rGO溶液。在含10mL 1mg/mL的rGO溶液中加入20mg多巴胺(DA)和5mL 2mg/mLAaDH，室温下缓慢搅拌下加入3.0mM NaAuCl4进行化学氧化聚合并固定化氨基酸脱氢酶，反应5小时后，得到的分散液进行10000rpm离心处理，弃上清液，将沉淀物(即氨基酸脱氢酶固定化混合物rGO-PDA-AuNPs-AaDH)分散到10mL PBS中。
(5)离子型辅酶NADH-IL的合成。设计合成了以烟酰胺辅酶NADH为阴离子、不同咪唑为阳离子的离子液体形式的离子型辅酶。加入N-甲基咪唑(33mL，0.31M)和氯代正丁烷(20mL，0.25M)，其摩尔比大约为1.2：1，氮气保护、磁力搅拌条件下于90℃，回流24h制备氯化1-丁基-3-甲基咪唑，提纯。氯化1-丁基-3-甲基咪唑离子液体溶于水中，缓慢通过装有717型阴离子交换树脂的柱子(717型阴离子交换树脂使用前阴离子为Cl-)，加入等体积等摩尔的NAD+水溶液，室温搅拌48h，提纯真空干燥获得离子型辅酶NADH-IL。NADH-IL核磁表征：1H NMR(400Hz,D2O)δ＝0.85(t,3H),1.27(m,2H),1.76(m,2H),3.84(s,3H),4.12(t,2H),4.21_4.71(m,15H),5.92(d,1H),5.99(d,1H),7.26(s,1H),7.31(s,1H),8.05(s,1H),8.12(m,1H),8.34(s,1H),8.55(s,1H),8.73(s,1H),8.76(s,1H),9.09(d,1H),9.24(s,1H)。
(6)取步骤4中获得的10μL分散的沉淀物和包含亚甲基绿、NADH-IL和[EMIM]BF4的凝胶滴在玻碳电极表面，4℃下晾干，得到修饰电极，记作rGO-PDA-AuNPs-AaDH-GCE。作为对照，用滴涂法制备rGO修饰电极，记作rGO-GCE。
(7)酶电极性能测试采用标准三电极体系：得到的氨基酸脱氢酶电极rGO-PDA-AuNPs-AaDH-GCE为工作电极，铂电极为对电极，甘汞电极为参比电极，室温下进行电化学实验。修饰电极rGO-PDA-AuNPs-AaDH-GCE的测试均在加入NADH-IL的10mL磷酸缓冲液(0.02mM、pH 7.4)中进行，测试之前通入N2，测试过程中采用循环伏安法，其中空白对照未滴加底物氨基酸。循环伏安测试的扫描速率为50mV/s，扫描范围-0.8V～0.8V，于pH为7.0的缓冲溶液中进行，计时安培电流测试的时间为0～1200s，每间隔30s进行一次氨基酸加样，L-苯丙氨酸加入浓度为1μM～5mM。
本实施例在氨基酸浓度为1mM时，测定的氧化峰电流值为12μA。
所得酶电极的性能测试所得循环伏安图如图2所示。其中氧化曲线右端从低到高依次对应的L-苯丙氨酸浓度为2mM、4mM、6mM、8mM，可以看出：本实施例的酶电极rGO-PDA-AaDH-GCE可较好检测氨基酸的浓度，随着L-苯丙氨酸浓度的增加，氧化峰出现增高的趋势，催化电流较小。表明本实施例的酶电极可以对溶液中的氨基酸产生灵敏的电流响应。
实施例2
(1)～(3)实验步骤如实施例1的步骤(1)～(3)。
(4)酶电极rGO-PDA-AuNPs-AaDH的制备：Hummer法制备氧化石墨烯，超声分散3h后得到分散均匀的GO溶液。在10mL 1mg/mL GO加入抗坏血酸0.5g还原12h，12000rpm离心，除去上清液，加入10mL超纯水洗涤一次，再离心，再加20mL的0.1M磷酸缓冲溶液(pH 7.0)制备成0.5mg/mL的rGO溶液。在含10mL 0.5mg/mL的rGO溶液中加入25mg多巴胺(DA)和5mL 2mg/mL AaDH，室温下缓慢搅拌下加入3.5mM NaAuCl4进行化学氧化聚合并固定化氨基酸脱氢酶，反应5小时后，得到的分散液进行10000rpm离心处理，弃上清，将沉淀物(rGO-PDA-AuNPs-AaDH)分散到10mL磷酸缓冲液中。
(5)取步骤(4)中获得的10μL分散的沉淀物和包含甲苯胺蓝、NADH-IL和[BMIM]BF4的凝胶滴在玻碳电极表面，4℃下晾干，得到修饰电极，记作rGO-PDA-AuNPs-AaDH-GCE。作为对照，用滴涂法制备rGO修饰电极，记作rGO-GCE。
(6)酶电极性能测试采用标准三电极体系：得到的氨基酸脱氢酶电极rGO-PDA-AuNPs-AaDH-GCE为工作电极，铂电极为对电极，甘汞电极为参比电极，室温下进行电化学实验。修饰电极rGO-PDA-AuNPs-AaDH-GCE的测试均在加入20mg辅酶NADH的10mL磷酸缓冲液(0.02mM、pH 7.4)中进行，测试之前通入N2，测试过程中采用循环伏安法，其中空白对照未滴加底物氨基酸。循环伏安测试的扫描速率为50mV/s，扫描范围-0.8V～0.8V，于pH为7.0的缓冲溶液中进行，计时安培电流测试的时间为0～1200s，每间隔30s进行一次氨基酸加样，L-苯丙氨酸加入浓度为1μM～5mM。
本实施例在氨基酸浓度为2mM时，测定的氧化峰电流值为12μA。
实施例3
(1)～(3)实验步骤如实施例1的步骤(1)～(3)。
(4)酶电极rGO-L-DOPA-AuNPs-AaDH的制备：Hummer法制备氧化石墨烯，超声分散3h后得到分散均匀的GO溶液。在1mg/mL GO加入抗坏血酸0.5g还原12h，12000rpm离心，除去上清液，加入10mL超纯水洗涤一次，再离心，再加10mL的0.1M Tris-HCl缓冲溶液(p H 7.5)制备成1mg/mL的rGO溶液。在含10mL 1mg/mL的rGO溶液中加入25mg左旋多巴(L-DOPA)+5mL3mg/mL AaDH，室温下缓慢搅拌下加入2.0mM NaAuCl4进行化学氧化聚合并固定化氨基酸脱氢酶，反应7小时后，得到的分散液进行10000rpm离心处理，弃上清，将沉淀物(rGO-L-DOPA-AuNPs-AaDH)分散到10mL磷酸缓冲液中。
(5)取步骤(4)中获得的10μL分散的沉淀物和包含5-甲基吩嗪硫酸甲酯(PMS)、NADH-IL和[BMIM]Cl的凝胶滴在玻碳电极表面，4℃下晾干，得到修饰电极，记作rGO-L-DOPA-AuNPs-AaDH-GCE。作为对照，用滴涂法制备rGO修饰电极，记作rGO-GCE。
(6)酶电极性能测试采用标准三电极体系：得到的氨基酸脱氢酶电极rGO-L-DOPA-AuNPs-AaDH-GCE为工作电极，铂电极为对电极，甘汞电极为参比电极，室温下进行电化学实验。修饰电极rGO-L-DOPA-AuNPs-AaDH-GCE的测试均在加入10mg辅酶NADH的10mL磷酸缓冲液(0.1M、pH 7.5)中进行，测试之前通入N2，测试过程中采用循环伏安法，其中空白对照未滴加底物氨基酸。循环伏安测试的扫描速率为50mV/s，扫描范围-0.8V～0.8V，于pH为7.0的缓冲溶液中进行，计时安培电流测试的时间为0～1200s，每间隔30s进行一次氨基酸加样，L-谷氨酸加入浓度为1μM～5mM。
本实施例在氨基酸浓度为2mM时，测定的氧化峰电流值为15μA。
实施例4
(1)～(3)实验步骤如实施例1的步骤(1)～(3)。
(4)酶电极rGO-PDA-AuNPs-AaDH的制备：Hummer法制备氧化石墨烯，超声分散3h后得到分散均匀的GO溶液。在1mg/mL GO加入抗坏血酸0.5g还原12h，12000rpm离心，除去上清液，加入10mL超纯水洗涤一次，再离心，再加10mL的0.1M磷酸缓冲溶液(pH 7.0)制备成1mg/mL的rGO溶液。在含10mL 1mg/mL的rGO溶液中加入20mg多巴胺(DA)+5mL 2mg/mL AaDH，室温下缓慢搅拌下加入2.0mM NaAuCl4进行化学氧化聚合并固定化氨基酸脱氢酶，反应5小时后，得到的分散液进行10000rpm离心处理，弃上清，将沉淀物(rGO-PDA-AuNPs-AaDH)分散到10mL磷酸缓冲液中。
(5)取步骤(4)中获得的10μL分散的沉淀物和包含麦尔多拉蓝、NADH-IL和[BMIM]Cl的凝胶滴在玻碳电极表面，4℃下晾干，得到修饰电极，记作rGO-PDA-AuNPs-AaDH-GCE。作为对照，用滴涂法制备rGO修饰电极，记作rGO-GCE。
(6)酶电极性能测试采用标准三电极体系：得到的氨基酸脱氢酶电极rGO-PDA-AuNPs-AaDH-GCE为工作电极，铂电极为对电极，甘汞电极为参比电极，室温下进行电化学实验。修饰电极rGO-PDA-AuNPs-AaDH-GCE的测试均在加入20mg辅酶NADH的10mL磷酸缓冲液(0.02mM、pH 7.4)中进行，测试之前通入N2，测试过程中采用循环伏安法，其中空白对照未滴加底物氨基酸。循环伏安测试的扫描速率为50mV/s，扫描范围-0.8V～0.8V，于pH为7.0的缓冲溶液中进行，计时安培电流测试的时间为0～1200s，每间隔30s进行一次氨基酸加样，L-叔亮氨酸加入浓度为1μM～5mM。
本实施例在氨基酸浓度为1mM时，测定的氧化峰电流值为12μA。
实施例5
(1)～(3)实验步骤如实施例1的步骤(1)～(3)。
(4)酶电极rGO-L-DOPA-AuNPs-AaDH的制备：Hummer法制备氧化石墨烯，超声分散3h后得到分散均匀的GO溶液。在1mg/mL GO加入抗坏血酸0.5g还原12h，12000rpm离心，除去上清液，加入10mL超纯水洗涤一次，再离心，再加10mL的0.1M Tris-HCl缓冲溶液(p H 7.5)制备成1mg/mL的rGO溶液。在含10mL 1mg/mL的rGO溶液中加入25mg左旋多巴(L-DOPA)+5mL3mg/mL AaDH，室温下缓慢搅拌下加入2.0mM NaAuCl4进行化学氧化聚合并固定化氨基酸脱氢酶，反应7小时后，得到的分散液进行10000rpm离心处理，弃上清，将沉淀物(rGO-L-DOPA-AuNPs-AaDH)分散到10mL磷酸缓冲液中。
(5)取步骤(4)中获得的10μL分散的沉淀物和包含亚甲基蓝、[BMIM]BF4和NADH-IL的凝胶滴在玻碳电极表面，4℃下晾干，得到修饰电极，记作rGO-L-DOPA-AuNPs-AaDH-GCE。作为对照，用滴涂法制备rGO修饰电极，记作rGO-GCE。
(6)酶电极性能测试采用标准三电极体系：得到的氨基酸脱氢酶电极rGO-L-DOPA-AuNPs-AaDH-GCE为工作电极，铂电极为对电极，甘汞电极为参比电极，室温下进行电化学实验。修饰电极rGO-L-DOPA-AuNPs-AaDH-GCE的测试均在加入20mg辅酶NADH的10mL Tris-HCl缓冲液(0.1M、pH 8.5)中进行，测试之前通入N2，测试过程中采用循环伏安法，其中空白对照未滴加底物氨基酸。循环伏安测试的扫描速率为50mV/s，扫描范围-0.8V～0.8V，于pH为7.0的缓冲溶液中进行，计时安培电流测试的时间为0～1200s，每间隔30s进行一次氨基酸加样，L-亮氨酸加入浓度为1μM～5mM。
本实施例在氨基酸浓度为2mM时，测定的氧化峰电流值为8μA。所得酶电极的性能测试所得循环伏安图如图3所示。其中氧化曲线右端从低到高依次对应的L-亮氨酸浓度为0mM、1mM、2mM，可以看出：本实施例的酶电极rGO-L-DOPA-AuNPs-AaDH可较好检测氨基酸的浓度，随着L-亮氨酸浓度的增加，在-0.45V处的氧化峰出现增高的趋势，催化电流较小。表明本实施例的酶电极可以对溶液中的氨基酸产生灵敏的电流响应。
实施例6
(1)～(3)实验步骤如实施例1的步骤(1)～(3)。
(4)酶电极修饰材料碳纳米管MWNTs-PDA的制备：20mg多壁碳纳米管(MWNTs)(南京吉仓纳米科技有限公司，多壁碳纳米管JCMT-95-11-10)加入20mL水超声分散3h后得到分散均匀的1mg/mL MWNTs溶液，在搅拌下，加入40mg PDA，室温下搅拌12h经过离心、重悬，制备成1mg/mL的MWNTs-PDA溶液，MWNTs-PDA的SEM图如图4。MWNTs-PDA溶液与NaAuCl4溶液混合反应得到含有AuNPs的MWNTs-PDA溶液。
(5)MWNTs-PDA-AuNPs-AaDH制备：将步骤(2)中得到的酶浓度为5mg/mL的氨基酸脱氢酶溶液在4℃下以2:1:1的比例与含有AuNPs的MWNTs-PDA溶液混合，8000rpm离心弃上清液，沉淀为氨基酸脱氢酶固定化混合物MWNTs-PDA-AuNPs-AaDH；然后将混合物以8000rpm下离心15分钟，冲洗，重悬于0.08M的pH9.0的氨水-氯化铵缓冲液中，制备含1mg/mL氨基酸脱氢酶的MWNTs-PDA-AuNPs-AaDH分散液。
(6)取步骤(5)中获得的10μL MWNTs-PDA-AuNPs-AaDH分散液和包含亚甲基绿、NADH-IL和[BMIM]Cl的凝胶滴在玻碳电极表面，4℃下晾干，得到修饰电极，记作MWNTs-PDA-AuNPs-AaDH-GCE。作为对照，用滴涂法制备MWNTs修饰电极，记作MWNTs-GCE。
(7)酶电极性能测试采用标准三电极体系：得到的氨基酸脱氢酶电极MWNTs-PDA-AuNPs-AaDH-GCE为工作电极，铂电极为对电极，甘汞电极为参比电极，室温下进行电化学实验。修饰电极MWNTs-PDA-AuNPs-AaDH-GCE的测试均在加入电子中介体甲苯胺蓝、20mg辅酶NADH的10ml磷酸缓冲液(0.02mM、pH 7.0)中进行，测试之前通入N2，测试过程中采用循环伏安法，其中空白对照未滴加底物氨基酸。循环伏安测试的扫描速率为100mV/s，扫描范围-1.0V～1.0V，在pH为7.0的缓冲溶液中进行，计时安培电流测试的时间为0～1200s，每间隔30s进行一次氨基酸加样，L-谷氨酸加入浓度为1μM～5mM。
本实施例在氨基酸浓度为1mM时，测定的氧化峰电流值为7μA。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 一种氨基酸脱氢酶电极及其制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1101
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtttgaaa aaatatcaca gcatgagcaa gttgtgtttt gtaacgatcc atcaacaggt 60
ctcaaggcaa ttatcgctat acataacaca acattaggcc cagcactcgg cggatgcaga 120
atgagaccgt atggatcggt tgatgaggca cttgaggatg tgctgagatt gtcaaaaggt 180
atgacataca aatgcgctgg tgcagatgtt gacttcggtg gaggtaaatc ggtcatcatc 240
ggggatccga tgacggatcg tacaccagag ttgttccgag cattcggaca gtttgtagat 300
tcattaaacg gtcgctttta tacaggaaca gatatgggaa caacacctga tgattttatg 360
cacgcgttaa aagaaacgaa ttgtatcgtc ggggtacccg aagaatatgg cggcagcggc 420
gattcttctg ttccaacagc acaaggagtt atatacggac ttcaagctac cattcagacg 480
cttgaaggaa cagatgaact ttcaggtaag tcatactcta tacaaggttt aggaaaagta 540
ggttttaagg tcgcagagca actgctcgca gccggtacac aaatctatgt tactgatatt 600
aatgaaaaag cattaaagat gattcaagaa cgagcagaac tcctacctgg aaatgtggaa 660
gtagttgaag gaagcgacat ctacggggtg gatgctgata ttttcattcc ttgcgcactc 720
ggcggaatca ttcacgatga aacaattgaa caactaaaag taaaagcgat cgtaggaagt 780
gccaacaatc agctcttaga agataagcac ggactttatt tgcagcaaaa aggaatttta 840
tacggacccg attatatcgt gaacgcagga gggcttattc aggtagctga tgagctttat 900
ggaccgaata aagcccgtgt attaacgaaa acgagagcga tctatgacag tctgatacag 960
atttatagcg agagtacaaa gaaccagata tctacgatgg aagcagcaaa tcttttctgt 1020
gaggagaagc ttttggcccg ctcaaaacga aacagctttt tcgctcacaa ccgaagacca 1080
aaatggcagg ttagacatta a 1101
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggaattccat atgtttgaaa aaatatcaca gcatg 35
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgctcgaga tgtctaacct gccattttg 29

Claims (8)

1.一种氨基酸脱氢酶电极，其特征在于：包括基底电极、电子传导体、电子中介体、离子型辅酶和氨基酸脱氢酶；所述电子传导体包括还原氧化石墨烯或碳纳米管，还包括聚多巴胺和纳米金；所述氨基酸脱氢酶的基因序列如SEQ ID No. 1所示；所述氨基酸脱氢酶包埋固定于所述电子传导体；所述氨基酸脱氢酶电极通过以下方法制备得到：将还原氧化石墨烯或碳纳米管、多巴胺单体或聚多巴胺、纳米金前体或纳米金与所述氨基酸脱氢酶混合反应以包埋固定所述氨基酸脱氢酶，得到包括还原氧化石墨烯或碳纳米管、聚多巴胺、纳米金的氨基酸脱氢酶固定化混合物；将所述氨基酸脱氢酶固定化混合物与电子中介体、离子型辅酶NADH-IL复合于所述基底电极表面，得到所述氨基酸脱氢酶电极；
其中，所述氨基酸脱氢酶固定化混合物的制备方法包括：在还原氧化石墨烯溶液中加入多巴胺单体、氨基酸脱氢酶，搅拌下加入纳米金前体进行化学氧化聚合并固定化氨基酸脱氢酶，得到所述氨基酸脱氢酶固定化混合物；所述还原氧化石墨烯、多巴胺单体、氨基酸脱氢酶与纳米金前体的配方比例为5～10 mg：20～300 mg：10～20 mg：1.0～5.0 mM；化学氧化聚合的反应时间为5～7小时；所述还原氧化石墨烯的浓度为0.5～1 mg/mL；所述氨基酸脱氢酶的浓度为2～3 mg/mL；
或者，所述氨基酸脱氢酶固定化混合物的制备方法包括：在碳纳米管溶液中加入聚多巴胺，得到碳纳米管-聚多巴胺的溶液，再将碳纳米管-聚多巴胺的溶液与纳米金-氨基酸脱氢酶混合，得到所述氨基酸脱氢酶固定化混合物；或者，在碳纳米管溶液中加入聚多巴胺，得到碳纳米管-聚多巴胺的溶液，碳纳米管-聚多巴胺的溶液与纳米金前体反应制得含有纳米金的碳纳米管-聚多巴胺的溶液，将氨基酸脱氢酶与含有纳米金的碳纳米管-聚多巴胺的溶液混合，得到所述氨基酸脱氢酶固定化混合物；碳纳米管与聚多巴胺的质量比为1：1～3；所述碳纳米管-聚多巴胺的浓度为0.5～2 mg/mL；所述氨基酸脱氢酶的浓度为4～6 mg/mL。
2.根据权利要求1所述的氨基酸脱氢酶电极，其特征在于：所述基底电极为玻碳电极、热解石墨电极、碳糊电极或金属电极。
3.根据权利要求1所述的氨基酸脱氢酶电极，其特征在于：所述电子中介体为5-甲基吩嗪硫酸甲酯、甲苯胺蓝、麦尔多拉蓝或亚甲基蓝中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的氨基酸脱氢酶电极，其特征在于：所述多巴胺单体为多巴胺、左旋多巴中的至少一种；所述纳米金前体为NaAuCl4、HAuCl4中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的氨基酸脱氢酶电极，其特征在于：所述氨基酸脱氢酶固定化混合物与离子型辅酶NADH-IL、电子中介体形成的凝胶，复合于所述基底电极表面，得到所述氨基酸脱氢酶电极。
6.根据权利要求5所述的氨基酸脱氢酶电极，其特征在于：所述电子中介体、离子型辅酶NADH-IL与离子液体形成所述凝胶，所述离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑氯盐、N,N'-（亚甲基）双（1-（3-乙烯基咪唑））溴中的至少一种。
7.一种利用氨基酸脱氢酶电极测定溶液中的氨基酸浓度的方法，其特征在于：所述氨基酸浓度的测定采用三电极体系，以权利要求1至6中任一项所述的氨基酸脱氢酶电极为工作电极；参比电极为饱和甘汞电极、氢电极、银|氯化银电极或汞|氧化汞电极；对电极为铂丝电极或碳电极。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：以循环伏安法和/或计时电流法的方式测定溶液中的氨基酸浓度；所述循环伏安法的测试电位扫描速率为1～400 mV/s；在加入1～20 mg辅酶NADH的缓冲液中进行，测试之前通入N2，所述氨基酸为L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-叔亮氨酸和L-谷氨酸；所述氨基酸的浓度范围为50 ppm～5 mM；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液中的至少一种。
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