CN114990101B - 一种磁性纳米颗粒复合载体固定化脂肪酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种磁性纳米颗粒复合载体固定化脂肪酶及其制备方法，制备方法包括：将壳聚糖溶解于乙酸溶液中，加入制备得到的Fe3O4磁性纳米颗粒，得到经壳聚糖修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒；将脂肪酶溶于磷酸缓冲溶液中，加入明胶搅拌至完全溶解，于室温下震荡，将明胶分子包覆于所述脂肪酶表面；继续加入所述经壳聚糖修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒，加入交联剂，震荡反应，制备得到所述磁性纳米颗粒复合载体固定化脂肪酶。本发明的所述磁性纳米颗粒复合载体固定化脂肪酶的活性高，稳定性强，用于生物柴油制备时的催化活性好、反应产率高，便于回收和重复使用，重复利用仍能保持较强的催化活性，催化寿命长。
Description
技术领域
本发明属于生物柴油的技术领域，具体地讲，是涉及一种磁性纳米颗粒复合载体固定化脂肪酶及其制备方法。
背景技术
生物柴油作为最具代表性的可再生绿色能源，是一种无毒、可降解、可持续再生的新能源，受到广泛的关注。生物柴油通常是由动植物油、餐厨废弃油脂等为原料油脂，与短链醇经酯化、酯交换反应制取的脂肪酸烷基酯，如脂肪酸甲酯。
目前通常利用化学催化法或生物酶法制备生物柴油，其中环境友好的生物酶法工艺具有反应条件温和、油脂原料适用性广、过程中不引入金属离子、反应产物不需水洗，后续产物分离方便等优点，绿色环保，具有广泛的应用前景。但用于生物酶法的脂肪酶生产成本高，底物对脂肪酶的抑制作用会降低其活性，且脂肪酶对周围环境比较敏感，稳定性差，因此一般可利用固定化技术将游离的脂肪酶固定化后用于催化合成生物柴油。
因此，开发一种新型的用于生物柴油制备的固定化脂肪酶，提高脂肪酶的使用活性和使用寿命，具有重要的意义。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种磁性纳米颗粒复合载体固定化脂肪酶及其制备方法。
本发明的第一个目的，在于提供了一种磁性纳米颗粒复合载体固定化脂肪酶的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)通过化学共沉淀法或溶剂热法制备Fe3O4磁性纳米颗粒。
(2)将壳聚糖溶解于乙酸溶液中，形成均一的胶体溶液，并加入所述Fe3O4磁性纳米颗粒，搅拌，固液分离，水洗并干燥，制得壳聚糖-Fe3O4磁性纳米颗粒，即表面经壳聚糖修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒。
(3)将脂肪酶溶于磷酸缓冲溶液中，加入明胶搅拌至完全溶解，于室温下震荡，利用明胶对脂肪酶优越的亲和性和生物相容性使得明胶分子包覆于脂肪酶表面。
(4)向步骤(3)的反应体系中加入所述壳聚糖-Fe3O4磁性纳米颗粒，继续震荡，明胶共价连接于壳聚糖表面，形成由内至外Fe3O4磁性纳米颗粒-壳聚糖-明胶-脂肪酶的四层空间结构，加入交联剂并继续震荡，固液分离，水洗并干燥，制备得到所述磁性纳米颗粒复合载体固定化脂肪酶。
进一步的，所述步骤(1)中通过化学共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米颗粒时，在氮气的保护下，将可溶性Fe2+和Fe3+盐溶解于水中，升温至60～90℃，搅拌并滴加碱液至pH为9～11，固液分离，水洗并干燥，制得Fe3O4磁性纳米颗粒。
其中，Fe2+和Fe3+的摩尔比为(0.5～2)：1，铁离子的总浓度为0.1～1mol/L；所述可溶性Fe2+盐为氯化亚铁或硫酸亚铁，所述可溶性Fe3+盐为氯化铁、硫酸铁或硝酸铁；所述碱液为氨水或NaOH溶液。
进一步的，所述步骤(1)中通过溶剂热法制备Fe3O4磁性纳米颗粒时，将可溶性Fe3+盐溶解于乙二醇中，搅拌至完全溶解至澄清的溶液，加入聚乙二醇和乙酸钠混合均匀，于120～180℃加热反应，自然冷却至室温后固液分离，通过水洗和无水乙醇洗涤并干燥，制得Fe3O4磁性纳米颗粒。
其中，所述可溶性Fe3+盐为氯化铁、硫酸铁或硝酸铁，铁离子的浓度为0.1～1mol/L；所述聚乙二醇、乙酸钠和可溶性Fe3+盐的质量比为(0.1～0.5)：(0.5～2)：1；反应可在聚四氟乙烯为衬底的反应釜中进行。
进一步的，所述步骤(2)中的所述乙酸溶液的浓度为1％～10％，所述Fe3O4磁性纳米颗粒与壳聚糖的质量比为(2～5)：1。
进一步的，所述步骤(2)中的所述搅拌优选为超声搅拌，搅拌时间优选为20～40min。
进一步的，所述步骤(3)中优选为在100～300r/min震荡，震荡时间优选为30～60min。
进一步的，所述步骤(3)中的所述脂肪酶和明胶的质量比为1：(1～4)。
进一步的，所述步骤(4)中加入所述壳聚糖-Fe3O4磁性纳米颗粒后震荡时间为40～60min，再加入所述交联剂后震荡时间为20～40min。
进一步的，所述步骤(4)中的所述脂肪酶和壳聚糖-Fe3O4磁性纳米颗粒的质量比为1：(2～6)。
进一步的，步骤(4)中的所述交联剂为戊二醛、丁二醛、对苯二醛、聚乙烯亚胺，碳化二亚胺、聚丙烯亚胺、聚乙烯胺中的一种。
进一步的，步骤(4)中的所述交联剂的加入量为所述脂肪酶质量的0.5％～3％。
本发明的第二个目的，在于提供了利用上述磁性纳米颗粒复合载体固定化脂肪酶的制备方法制备得到的固定化脂肪酶。
本发明的第三个目的，在于提供了上述固定化脂肪酶在生物柴油制备中的应用，具体包括以下步骤：
(1)将原料油脂和甲醇以质量比为1：(12％～15％)加入反应釜中，搅拌并升温至38～42℃；
(2)反应釜中加入所述固定化脂肪酶，所述固定化脂肪酶与所述原料油脂的质量比为2.0‰～3.0‰，反应12～30h，制备得到生物柴油。
本发明的有益效果在于：
(1)明胶具有低毒性、亲和性和良好的生物相容性等优点，作为空间间隔臂用于脂肪酶的柔性固定化，脂肪酶通过被明胶包覆后结合于壳聚糖-Fe3O4磁性纳米颗粒表面，一方面起到保护脂肪酶的作用，保持酶的天然构象，避免受交联剂以及反应底物的影响引起的酶活损失；另一方面，能够提高固定化脂肪酶的柔性，能够有效避免酶和载体之间的刚性碰撞引起的酶活损失，同时降低空间位阻，使得脂肪酶拥有足够的空间来伸展其三维构象，提高脂肪酶的催化效率。
(2)壳聚糖修饰磁性纳米颗粒后使得所述壳聚糖-Fe3O4磁性纳米颗粒兼具磁性纳米颗粒和天然高分子的双重特性，一方面以磁性纳米颗粒为载体基质材料，具有粒径小，比表面积大的优点，同时具有超顺磁性，在外加磁场的作用下能快速简单地分离；另一方面，表面具有良好的吸附性、成膜性以及生物相容性，分子链上丰富的羟基和氨基使其易于进一步的修饰和结合。
(3)将壳聚糖修饰磁性纳米颗粒以及明胶修饰脂肪酶，然后将二者结合形成磁性纳米颗粒-壳聚糖-明胶-脂肪酶的四层空间结构后再加入交联剂组分，能够有效避免交联剂，如戊二醛导致的过度交联以及非定向共价结合过程中对酶活性位点的破坏。
(4)所述固定化脂肪酶具有优异的稳定性，便于回收和重复使用，且重复利用30次后仍能保持较强的催化活性，催化寿命长。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。应理解，以下实施例仅用于对本发明作进一步说明，不应理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
以下实施例中脂肪酶均为市售的液体脂肪酶，酶活为6000U/g，酶活根据国家标准GB/T23535-2009测定，定义在40℃、pH7.5的条件下，每分钟催化脂肪水解生成1μmol可滴定的脂肪酸所需的脂肪酶量为一个酶活单位U。将所述游离的液体脂肪酶于室温储存，5天后测定其酶活降至5050U/g，酶活回收率约为84％。
实施例1
(1)通过化学共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米颗粒：在氮气的保护下，将可溶性氯化亚铁和氯化铁溶解于水中，Fe2+和Fe3+的摩尔比为2：1，总浓度为1mol/L，升温至90℃，搅拌并滴加氨水至pH为9～11，固液分离，水洗并干燥，制得Fe3O4磁性纳米颗粒。
(2)取2g壳聚糖溶解于3％的乙酸溶液中，形成均一的胶体溶液，并加入所述Fe3O4磁性纳米颗粒4g，超声搅拌30min，固液分离，水洗并干燥，得到壳聚糖-Fe3O4磁性纳米颗粒。
(3)取脂肪酶3g溶于磷酸缓冲溶液中，加入明胶6g搅拌至完全溶解，于室温在100～300r/min震荡30min，使得明胶分子包覆于脂肪酶表面。
(4)向步骤(3)的反应体系中加入所述壳聚糖-Fe3O4磁性纳米颗粒，继续震荡40min，明胶共价连接于壳聚糖表面，形成由内至外Fe3O4磁性纳米颗粒-壳聚糖-明胶-脂肪酶的四层空间结构，加入0.06g戊二醛并继续震荡60min，固液分离，水洗并干燥，制备得到所述磁性纳米颗粒复合载体固定化脂肪酶。
测定得到固定化脂肪酶的酶活为5750U/g，酶活回收率约为96％；将所述固定化脂肪酶于室温储存，5天后测定其酶活降至5710U/g，酶活回收率约为95％。
实施例2
(1)通过化学共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米颗粒：在氮气的保护下，将可溶性氯化亚铁和氯化铁溶解于水中，Fe2+和Fe3+的摩尔比为1：1，总浓度为1mol/L，升温至90℃，搅拌并滴加氨水至pH为9～11，固液分离，水洗并干燥，制得Fe3O4磁性纳米颗粒。
(2)取2g壳聚糖溶解于3％的乙酸溶液中，形成均一的胶体溶液，并加入所述Fe3O4磁性纳米颗粒4g，超声搅拌40min，固液分离，水洗并干燥，得到壳聚糖-Fe3O4磁性纳米颗粒。
(3)取脂肪酶2g溶于磷酸缓冲溶液中，加入明胶8g搅拌至完全溶解，于室温在100～300r/min震荡60min，使得明胶分子包覆于脂肪酶表面。
(4)向步骤(3)的反应体系中加入所述壳聚糖-Fe3O4磁性纳米颗粒，继续震荡20min，明胶共价连接于壳聚糖表面，形成由内至外Fe3O4磁性纳米颗粒-壳聚糖-明胶-脂肪酶的四层空间结构，加入0.06g戊二醛并继续震荡60min，固液分离，水洗并干燥，制备得到所述磁性纳米颗粒复合载体固定化脂肪酶。
测定得到固定化脂肪酶的酶活为5830U/g，酶活回收率约为97％；将所述固定化脂肪酶于室温储存，5天后测定其酶活降至5790U/g，酶活回收率约为96.5％。
实施例3
(1)通过化学共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米颗粒：在氮气的保护下，将可溶性氯化亚铁和氯化铁溶解于水中，Fe2+和Fe3+的摩尔比为2：1，总浓度为0.5mol/L，升温至60℃，搅拌并滴加氨水至pH为9～11，固液分离，水洗并干燥，制得Fe3O4磁性纳米颗粒。
(2)取2g壳聚糖溶解于1％的乙酸溶液中，形成均一的胶体溶液，并加入所述Fe3O4磁性纳米颗粒10g，超声搅拌30min，固液分离，水洗并干燥，得到壳聚糖-Fe3O4磁性纳米颗粒。
(3)取脂肪酶2g溶于磷酸缓冲溶液中，加入明胶4g搅拌至完全溶解，于室温在100～300r/min震荡60min，使得明胶分子包覆于脂肪酶表面。
(4)向步骤(3)的反应体系中加入所述壳聚糖-Fe3O4磁性纳米颗粒，继续震荡40min，明胶共价连接于壳聚糖表面，形成由内至外Fe3O4磁性纳米颗粒-壳聚糖-明胶-脂肪酶的四层空间结构，加入0.01g丁二醛并继续震荡60min，固液分离，水洗并干燥，制备得到所述磁性纳米颗粒复合载体固定化脂肪酶。
测定得到固定化脂肪酶的酶活为5780U/g，酶活回收率约为96％；将所述固定化脂肪酶于室温储存，5天后测定其酶活降至5720U/g，酶活回收率约为95％。
实施例4
(1)通过化学共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米颗粒：在氮气的保护下，将可溶性氯化亚铁和氯化铁溶解于水中，Fe2+和Fe3+的摩尔比为1：2，总浓度为0.1mol/L，升温至80℃，搅拌并滴加NaOH溶液至pH为9～11，固液分离，水洗并干燥，制得Fe3O4磁性纳米颗粒。
(2)取2g壳聚糖溶解于3％的乙酸溶液中，形成均一的胶体溶液，并加入所述Fe3O4磁性纳米颗粒4g，超声搅拌30min，固液分离，水洗并干燥，得到壳聚糖-Fe3O4磁性纳米颗粒。
(3)取脂肪酶2g溶于磷酸缓冲溶液中，加入明胶8g搅拌至完全溶解，于室温在100～300r/min震荡50min，使得明胶分子包覆于脂肪酶表面。
(4)向步骤(3)的反应体系中加入所述壳聚糖-Fe3O4磁性纳米颗粒，继续震荡40min，明胶共价连接于壳聚糖表面，形成由内至外Fe3O4磁性纳米颗粒-壳聚糖-明胶-脂肪酶的四层空间结构，加入0.06g聚乙烯亚胺并继续震荡60min，固液分离，水洗并干燥，制备得到所述磁性纳米颗粒复合载体固定化脂肪酶。
测定得到固定化脂肪酶的酶活为5730U/g，酶活回收率约为95.5％；将所述固定化脂肪酶于室温储存，5天后测定其酶活降至5650U/g，酶活回收率约为94％。
实施例5
(1)通过溶剂热法制备Fe3O4磁性纳米颗粒时：将可溶性硫酸铁溶解于乙二醇中，Fe3+的浓度为1mol/L，搅拌至完全溶解至澄清的溶液，加入聚乙二醇和乙酸钠混合均匀，所述聚乙二醇、乙酸钠和硫酸铁的质量比为0.5：1：1，于120～180℃下，在聚四氟乙烯为衬底的反应釜中加热反应2h，自然冷却至室温后固液分离，通过水洗和无水乙醇洗涤并干燥，制得Fe3O4磁性纳米颗粒。
(2)取2g壳聚糖溶解于10％的乙酸溶液中，形成均一的胶体溶液，并加入所述Fe3O4磁性纳米颗粒8g，超声搅拌20min，固液分离，水洗并干燥，得到壳聚糖-Fe3O4磁性纳米颗粒。
(3)取脂肪酶2g溶于磷酸缓冲溶液中，加入明胶2g搅拌至完全溶解，于室温在100～300r/min震荡50min，使得明胶分子包覆于脂肪酶表面。
(4)向步骤(3)的反应体系中加入所述壳聚糖-Fe3O4磁性纳米颗粒，继续震荡30min，明胶共价连接于壳聚糖表面，形成由内至外Fe3O4磁性纳米颗粒-壳聚糖-明胶-脂肪酶的四层空间结构，加入0.04g聚乙烯亚胺并继续震荡60min，固液分离，水洗并干燥，制备得到所述磁性纳米颗粒复合载体固定化脂肪酶。
测定得到固定化脂肪酶的酶活为5690U/g，酶活回收率约为95％；将所述固定化脂肪酶于室温储存，5天后测定其酶活降至5630U/g，酶活回收率约为94％。
对比例1
(1)通过化学共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米颗粒：在氮气的保护下，将可溶性氯化亚铁和氯化铁溶解于水中，Fe2+和Fe3+的摩尔比为2：1，总浓度为1mol/L，升温至90℃，搅拌并滴加氨水至pH为9～11，固液分离，水洗并干燥，制得Fe3O4磁性纳米颗粒。
(2)取脂肪酶3g溶于磷酸缓冲溶液中，加入明胶6g搅拌至完全溶解，于室温在100～300r/min震荡30min，使得明胶分子包覆于脂肪酶表面。
(3)向步骤(2)的反应体系中加入所述Fe3O4磁性纳米颗粒，继续震荡40min，形成Fe3O4磁性纳米颗粒-明胶-脂肪酶的空间结构，加入0.06g戊二醛并继续震荡60min，固液分离，水洗并干燥，制备得到固定化脂肪酶。
本对比例载体中没有加入壳聚糖组分，于Fe3O4磁性纳米颗粒表面形成壳层，测定得到固定化脂肪酶的酶活为5520U/g，酶活回收率约为92％；将所述固定化脂肪酶于室温储存，5天后测定其酶活降至5410U/g，酶活回收率约为90％。
对比例2
(1)通过化学共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米颗粒：在氮气的保护下，将可溶性氯化亚铁和氯化铁溶解于水中，Fe2+和Fe3+的摩尔比为2：1，总浓度为1mol/L，升温至90℃，搅拌并滴加氨水至pH为9～11，固液分离，水洗并干燥，制得Fe3O4磁性纳米颗粒。
(2)取2g壳聚糖溶解于3％的乙酸溶液中，形成均一的胶体溶液，并加入所述Fe3O4磁性纳米颗粒4g，超声搅拌30min，固液分离，水洗并干燥，得到壳聚糖-Fe3O4磁性纳米颗粒。
(3)取脂肪酶3g溶于磷酸缓冲溶液中，加入所述壳聚糖-Fe3O4磁性纳米颗粒，继续震荡40min，加入0.06g戊二醛并继续震荡60min，固液分离，水洗并干燥，制备得固定化脂肪酶。
本对比例载体中没有加入明胶组分，脂肪酶直接交联于壳聚糖表面，测定得到固定化脂肪酶的酶活为5510U/g，酶活回收率约为92％；将所述固定化脂肪酶于室温储存，5天后测定其酶活降至5290U/g，酶活回收率约为88％。
实施例6脂肪酶应用性能评估
将实施例1-5及对比例1-2得到的固定化脂肪酶用于生物柴油的制备。具体步骤如下：
(1)将原料油脂和甲醇以质量比为1：(12％～15％)加入反应釜中，搅拌并升温至38～42℃；
(2)反应釜中加入所述固定化脂肪酶，所述固定化脂肪酶与所述原料油脂的质量比为2.0‰～3.0‰，反应12～30h，制备得到生物柴油。
反应结束后回收过量甲醇，并分离回收所述固定化脂肪酶，得到生物柴油产品，分析检测其生物柴油产率，各催化剂性能评估的反应条件及产品收率如下表1所示。
表1实施例和对比例的催化剂性能评估反应条件及收率
| 原料油脂和甲醇质量比 | 脂肪酶用量 | 反应温度 | 反应时间 | 收率 | |
| 实施例1 | 1:15％ | 3.0‰ | 40.5℃ | 30h | 98.2％ |
| 实施例2 | 1:15％ | 3.0‰ | 41.5℃ | 24h | 97.7％ |
| 实施例3 | 1:15％ | 3.0‰ | 39.5℃ | 30h | 98.0％ |
| 实施例4 | 1:14％ | 2.5‰ | 38.5℃ | 12h | 96.8％ |
| 实施例5 | 1:12％ | 2.0‰ | 42.0℃ | 18h | 96.5％ |
| 对比例1 | 1:15％ | 3.0‰ | 40.5℃ | 30h | 92.3％ |
| 对比例2 | 1:15％ | 3.0‰ | 40.5℃ | 30h | 89.1％ |
由上表数据可得，本发明提供的固定化脂肪酶用于生物柴油制备的反应中的收率均高于96.5％。在相同生物柴油制备反应条件下，与对比例相比，收率更高，说明本发明的固定化脂肪酶用于生物柴油制备的反应中能提供更高的催化活性。
对比例1中没有添加壳聚糖组分使之在磁性纳米颗粒表面形成壳层，作为间隔臂的明胶与未经壳聚糖修饰的磁性纳米颗粒表面的结合位点减少，负载力减弱，使得未经壳聚糖修饰的磁性纳米颗粒直接负载明胶和脂肪酶后的催化活性较低；对比例2中没有添加明胶组分柔性固定化脂肪酶，空间位阻较高，使得脂肪酶直接负载于壳聚糖修饰的磁性纳米颗粒表面的催化活性较低。
本发明提供的固定化脂肪酶通过壳聚糖修饰磁性纳米颗粒，具有大比表面积的同时为表面提供了丰富的结合位点；利用明胶包覆脂肪酶后以间隔臂的形式柔性固定化于壳聚糖修饰磁性纳米颗粒表面，保证了酶的活性，为生物柴油制备的反应中提供优异的催化活性。
实施例7催化寿命评估
将实施例1和对比例1、2制备的固定化脂肪酶在实施例6记载的反应条件下生产生物柴油后，将分离回收的固定化脂肪酶洗涤、干燥，并循环使用，用于进行下一批次反应，以生物柴油的收率为指标，所得催化寿命的性能如表2所示。
表2批次循环使用的生物柴油收率
| 实施例1 | 对比例1 | 对比例2 | |
| 批次1 | 98.2％ | 92.3％ | 89.1％ |
| 批次5 | 97.9％ | 89.5％ | 88.0％ |
| 批次10 | 97.0％ | 86.2％ | 86.1％ |
| 批次15 | 96.1％ | 83.7％ | 84.5％ |
| 批次20 | 95.3％ | 80.4％ | 83.7％ |
| 批次25 | 94.0％ | 75.0％ | 82.4％ |
| 批次30 | 92.1％ | 69.6％ | 80.2％ |
随反应批次的增加，根据收率数据的不断降低可知，固定化脂肪酶的催化活性不断降低，但本发明提供的磁性纳米颗粒复合载体固定化脂肪酶在重复利用30次反应后，收率仍能达到92.0％以上，具有优异的稳定性和重复使用性能，使用寿命长；而当复合载体中缺少壳聚糖或明胶组分时，收率明显降低，重复30次反应后收率分别降至69.6％和80.2％。本发明的所述固定化脂肪酶在催化剂重复利用和使用寿命方面，具有显著优势。
Claims (7)
1.一种磁性纳米颗粒复合载体固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)制备Fe3O4磁性纳米颗粒；
(2)将壳聚糖溶解于乙酸溶液中，形成均一的胶体溶液，加入所述Fe3O4磁性纳米颗粒，搅拌，固液分离，水洗并干燥，制得壳聚糖-Fe3O4磁性纳米颗粒；
(3)将脂肪酶溶于磷酸缓冲溶液中，加入明胶搅拌至完全溶解，于室温下震荡；
(4)向步骤(3)的反应体系中加入所述壳聚糖-Fe3O4磁性纳米颗粒，继续震荡，加入交联剂并继续震荡，固液分离，水洗并干燥，制备得到所述磁性纳米颗粒复合载体固定化脂肪酶；
所述步骤(2)中的所述乙酸溶液的浓度为1％～10％，所述Fe3O4磁性纳米颗粒与壳聚糖的质量比为(2～5)：1；所述步骤(3)中的所述脂肪酶和明胶的质量比为1：(1～4)；所述步骤(4)中的所述脂肪酶和所述壳聚糖-Fe3O4磁性纳米颗粒的质量比为1：(2～6)；所述交联剂为戊二醛、丁二醛、聚乙烯亚胺中的一种。
2.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述交联剂的加入量为所述脂肪酶质量的0.5％～3％。
3.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中通过化学共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米颗粒，在氮气的保护下，将可溶性Fe2+和Fe3+盐溶解于水中，升温至60～90℃，搅拌并滴加碱液至pH为9～11，固液分离，水洗并干燥，制得所述Fe3O4磁性纳米颗粒。
4.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中通过溶剂热法制备Fe3O4磁性纳米颗粒，将可溶性Fe3+盐溶解于乙二醇中，搅拌至完全溶解至澄清的溶液，加入聚乙二醇和乙酸钠混合均匀，于120～180℃加热反应，自然冷却至室温后固液分离，洗涤并干燥，制得所述Fe3O4磁性纳米颗粒。
5.一种根据权利要求1-4中任一所述的制备方法制备得到的磁性纳米颗粒复合载体固定化脂肪酶。
6.权利要求5所述的固定化脂肪酶在生物柴油制备中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)将原料油脂和甲醇以质量比为1：(12％～15％)加入反应釜中，搅拌并升温至38～42℃；
(2)反应釜中加入所述固定化脂肪酶，所述固定化脂肪酶与所述原料油脂的质量比为2.0‰～3.0‰，反应12～30h，制备得到生物柴油。
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