CN111808839A - 一种基于疏水修饰明胶微球的脂肪酶界面固定化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于疏水修饰明胶微球的脂肪酶界面固定化的方法，采用乳液模板法制备包埋脂肪酶的明胶微球，利用脂肪醛疏水改性的交联壳聚糖纳米颗粒修饰明胶微球，增强明胶微球的界面活性，明胶微球能够稳定油水界面形成Pickering乳液，明胶微球包埋的脂肪酶在两相界面可高效催化己酸和己醇合成己酸己酯反应，解决了采用的脂肪酶的生物大分子包埋载体界面活性不足，无法稳定油水界面形成Pickering乳液的问题。

Description

一种基于疏水修饰明胶微球的脂肪酶界面固定化的方法
技术领域：
本发明涉及脂肪酶界面固定化的方法，具体涉及一种基于疏水修饰明胶微球的脂肪酶界面固定化的方法。
背景技术：
由于脂肪酶的脂质底物不溶于水，通常需要用有机溶剂增溶底物。为减轻溶剂和极性底物导致的酶变性及失活，许多固定化技术被用于改善脂肪酶在非水环境下的稳定性。
由颗粒稳定的Pickering乳液是一种新型的脂肪酶反应体系。乳液是动力学稳定的两相体系。理论上脂肪酶在水相环境下更有利于保持构象和活性。Pickering乳液可以创造极大的两相界面面积，非常适合作为脂肪酶催化平台。一种较为简单的乳液制备策略是采用界面活性颗粒构建油(有机溶剂)包水型乳液，将脂肪酶封装于水相中，催化有机相中底物反应，并通过调节界面微结构兼顾乳液的界面稳定性(维持大面积两相界面)及界面渗透性(维持高底物/产物传质效率)。但是这种方式下脂肪酶在界面的动态吸附降低了脂肪酶与底物的接触机会，也对脂肪酶构象及活性产生不利影响。另一个乳液制备策略则是借鉴酶固定化理念，将脂肪酶连接于界面活性颗粒，利用颗粒在油水界面的不可逆吸附实现酶的界面富集与固定，具有界面活性的载酶颗粒借助高比表面积的乳液界面平台扩大与底物的接触面积来增强界面催化能力。
在酶的固定化方法中，包埋和包封提供了对酶的微环境的更多保护。蛋白质和多糖等生物大分子包埋酶分子后，对酶具有笼效应(cageeffect)和拥挤效应(crowdingeffect)。笼效应可以控制酶的泄漏，拥挤效应能减少酶构象变化。此外，蛋白质具有大量的-COOH和-NH2，多糖具有大量的-OH和-COOH，对环境变化都能起到一定的缓冲作用。但是目前用于固定化酶的生物大分子载体亲水性较强，界面活性弱。例如中国发明专利(2014107493334)公开了一种可用于高酸值餐厨废弃油脂转化生物柴油的壳聚糖修饰生物炭基固定化酶的制备方法。采用花生壳制成的多孔结构的生物炭，壳聚糖修饰生物炭的孔隙结构，相反电荷的静电吸附促进脂肪酶分子在基质载体上的固定。该专利利用壳聚糖与酶的静电相互作用增强脂肪酶在有机溶剂中的稳定性，但其载体整体是不具有界面活性的。中国发明专利CN1110577利用凝固油相作为内核，脂肪酶和未疏水改性的壳聚糖颗粒共吸附在内核表面，构成核壳结构的微球。脂肪酶位于微球表面，所以对有机酸，有机醇等极性底物的耐受力不强。目前尚未有专利公开对蛋白质或多糖等生物大分子包埋载体的界面活性进行设计与操控，使其能吸附于两相界面。
发明内容：
本发明的目的是提供一种基于疏水修饰明胶微球的脂肪酶界面固定化的方法，采用乳液模板法制备包埋脂肪酶的明胶微球，利用脂肪醛疏水改性的交联壳聚糖纳米颗粒修饰明胶微球，增强明胶微球的界面活性，使明胶微球成为颗粒乳化剂稳定油水界面形成Pickering乳液，明胶微球包埋的脂肪酶在两相界面可高效催化己酸和己醇合成己酸己酯反应，解决了采用的脂肪酶的生物大分子包埋载体界面活性不足，无法稳定油水界面形成Pickering乳液的问题。
本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种基于疏水修饰明胶微球的脂肪酶界面固定化的方法，该方法包括以下步骤：
1)脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒：将交联壳聚糖纳米颗粒加入脂肪醛浓度为5-15wt.％脂肪醛溶液中，该溶液以正己烷为溶剂，磁力搅拌下反应3-6h，反应结束后离心、清洗得脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒；其中交联壳聚糖纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：壳聚糖粉末溶解在乙酸水溶液中，搅拌使其完全水合，调节pH值到4-7，然后用分散机和高压微射流纳米均质机分散均质，添加0.001-1wt.％京尼平(genipin)在35-45℃下共价交联24-48h，再经高压微射流均质得到均匀的交联壳聚糖纳米胶分散体，然后160℃喷雾干燥获得；
2)脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰明胶微球的制备及其相应Pickering乳液的制备：步骤1)制备的脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒、司盘80(span80)超声分散于矿物油中获得均匀分散的悬浊油相；5-10wt％的脂肪酶溶液离心去除杂质，取上清液溶解10-20wt.％的B型明胶，并调节pH为6.5，作为水相；将油相置于30-40℃水浴中，搅拌下往油相中逐滴加入水相，继续乳化20-30min，获得醛改性交联壳聚糖纳米颗粒稳定的W/O型Pickering乳液，冷却至室温，按体积比1：2在得到的W/O型Pickering乳液中加入正己烷，震荡破乳，析出油相，获得下层的脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰明胶微球；以获得的脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰明胶微球为粒子乳化剂，制备稳定的Pickering乳液，油相为正己烷，水相为含脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰明胶微球的去离子水。
所述脂肪醛优选为十一醛。
本发明还保护上述方法获得脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰明胶微球的应用，用于酶促反应。
特别地，包括以下步骤：以获得的脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰明胶微球为粒子乳化剂，制备稳定的Pickering乳液，油相为正己烷，水相为含脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰明胶微球的去离子水，在正己烷的油相中添加底物己酸和己醇，在离心管中按油水比例3：1震荡乳化制备Pickering乳液，进行酶促反应。
本发明的有益效果如下：
1)本发明构建包埋脂肪酶的明胶微球及使用明胶微球稳定的Pickering乳液，将脂肪酶包埋进明胶基质中，并使疏水改性的交联壳聚糖颗粒吸附在明胶微球表面，增强明胶微球的界面活性，从而使明胶微球可做为颗粒乳化剂稳定Pickering乳液，明胶球内脂肪酶对有机酸，有机醇等极性底物耐受能力增强，在Pickering体系下可用来催化己酸己醇的酯化反应，用于脂肪酶的双相催化反应，在两相界面处吸附有包埋脂肪酶的明胶微球的乳液系统具有明显更高的催化活性，高效催化己酸和己醇酯化生成己酸己酯，这归因于明胶微球包埋脂肪酶的温和包埋条件和生物相容的微环境，以及改性交联壳聚糖颗粒修饰的明胶微球稳定的Pickering乳液产生的较大的油水界面面积以及短扩散距离。而且含有有机相的产物/底物可通过重力沉降而容易地分离，使得Pickering乳液可被回收并重复使用多次。
2)本发明通过调节脂肪醛接枝的交联壳聚糖纳米颗粒的碳链长度来调节亲水的明胶微球使其具有适当的润湿性，从而稳定水-己烷Pickering乳液。
附图说明：
图1是实施例1得到的交联壳聚糖纳米颗粒的SEM图；
图2为改性前后的交联壳聚糖纳米颗粒的电位对比图；
图3为不同碳链长度的脂肪醛改性交联壳聚糖纳米颗粒的接触角对比图；
图2、图3中，CS_hep为正庚醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒，CS_non为正壬醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒，CS_und为十一醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒，CS_0C为醛改性前的交联壳聚糖颗粒；
图4为不同碳链长度的脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰的明胶微球的接触角对比图；
其中，CS_hep为正庚醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰的明胶微球，CS_non为正壬醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰的明胶微球，CS_und为十一醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰的明胶微球，CS_0C为醛改性前的交联壳聚糖颗粒粉末修饰的明胶微球；
图5为十一醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰明胶微球稳定的Pickering乳液外观图和白光显微镜图；
图6为十一醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰明胶微球稳定的Pickering乳液CLSM图；
图7为十一醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰明胶微球稳定的Pickering乳液酶促变化率图；
图8为批次反应对酶促反应转化率的影响。
具体实施方式：
以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒：将交联壳聚糖纳米颗粒加入脂肪醛浓度为5-15wt.％脂肪醛溶液中，该溶液以正己烷为溶剂，500rpm磁力搅拌下反应3-6h，反应结束后5000rpm离心10min，正己烷清洗残留脂肪醛，沉淀自然挥发干燥得脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒；本实施例脂肪醛选自正庚醛、正壬醛或十一醛中任一种，其中交联壳聚糖纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：壳聚糖粉末溶解在1％(v/v)乙酸水溶液中，并用磁力搅拌器以500转/分的速度搅拌4h，然后储存一夜，使其完全水合得到0.5wt.％壳聚糖溶液。用NaOH溶液将壳聚糖溶液(0.5wt.％)的pH值缓慢调节到4-7。用分散机以5000-10000转/分的速度破碎和分散产生的絮体，持续5分钟，用高压微射流纳米均质机按100MPa操作2次均质，然后添加京尼平(genipin)(0.001-1wt.％)在35-45℃下共价交联24-48h，交联反应结束后，再经高压微射流50-150Mpa均质两次,得到均匀的壳聚糖纳米胶分散体，然后160℃喷雾干燥获得均一的交联壳聚糖颗粒粉末(记为CS_0C)；其SEM图如图1所示，颗粒粒径为30-100nm，ζ-电位20-50mV。图2显示与未改性的交联壳聚糖C_0C对比，脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒的电位没有较大差别，都带正电。图3显示随着醛的碳链长度增加，脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒的接触角逐渐增加。
脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰明胶微球：步骤1)制备的脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒(0.006g-0.06g)、司盘80(span80)(0.24g-0.6g)超声5min分散于矿物油(6g)中获得均匀分散的悬浊油相；5-10wt％的脂肪酶溶液8000rpm离心10min去除杂质，取上清液(4g)水浴35℃，磁力搅拌500rpm下溶解10-20wt.％的B型明胶，并调节pH为6.5，作为水相；将油相置于30-40℃水浴中，1000rpm磁力搅拌下往油相中逐滴加入水相，保持30-40℃水浴2500rpm磁力搅拌下继续乳化20-30min，获得醛改性交联壳聚糖纳米颗粒稳定的W/O型Pickering乳液，冷却至室温(25℃)，按体积比1：2在得到的W/O型Pickering乳液中加入正己烷，震荡破乳，析出正己烷溶解的油相，重复4次获得下层的脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰明胶微球。
图4显示脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰明胶微球疏水性和润湿性得到增强。以获得的脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰明胶微球为粒子乳化剂，制备稳定的Pickering乳液，油相为正己烷，水相为含脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰明胶微球的去离子水，在离心管中按油水比例3：1震荡乳化制备Pickering乳液。图5显示十一醛改性交联壳聚糖颗粒修饰的明胶微球(CS_und-gel)稳定的Pickering乳液，外观均一且稳定，乳化层绵密细腻，说明醛改性交联壳聚糖颗粒修饰的明胶微球乳化效果好，能够稳定Pickering乳液。白光显微镜观测显示乳液液滴尺寸不等，约30-150μm之间，明胶微球能够有效地吸附在乳液油滴表面，明胶微球界面活性高，具备出色的乳化效果。
图6显示十一醛改性交联壳聚糖颗粒修饰的明胶微球稳定的Pickering乳液的CLSM图像，图像显示醛改性交联壳聚糖颗粒吸附在明胶微球表面，从而导致明胶微球润湿性的变化；脂肪酶位于明胶微球内部，说明脂肪酶能够包封在明胶微球内部，具有较好的稳定性。
激光共聚焦(CLSM)实验方法
使用荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的脂肪酶，罗丹明B异硫氰酸酯(RITC)标记改性交联壳聚糖，双激发波长分别为488nm和513nm,取样品乳液滴在带凹槽的玻片上，置于激光共聚焦显微镜下观测，选取乳液滴分布均一且具代表性的荧光区拍照记录图像。
荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的脂肪酶原料，在100毫升去离子水中加入10克脂肪酶粉末。搅拌2小时后，将脂肪酶完全分散，加入250μL的FITC(溶解在二甲基亚砜中的2wt％，DMSO)，再在黑暗中搅拌1.5小时。标记的脂肪酶溶液在4℃下进一步透析48小时以去除多余的荧光染料。同理，RITC标记改性后的交联壳聚糖。
实施例2：脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰明胶微球稳定的Pickering乳液的酶促合成反应
以获得的脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰明胶微球为粒子乳化剂，制备稳定的Pickering乳液，油相为正己烷，在正己烷的油相中添加底物己酸(0.2-0.8mol/L)和己醇(0.2-0.8mol/L)，水相为含脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰明胶微球的去离子水，在离心管中按油水比例3：1手摇震荡乳化制备Pickering乳液，进行酶促反应。间隔取出乳液，10000rpm离心1min，取上清液过膜(尼龙0.22μm)，进行GC分析，计算酶促反应转化率。
图7显示十一醛改性交联壳聚糖颗粒修饰的明胶微球稳定的Pickering乳液酶促转化率变化，随着反应时间增加，酶促转化率也逐步提高，与游离酶相比转化速度也增加，在8h后转化率达到90％。这是因为载酶乳液能够为脂肪酶提供较大的两相界面作为反应位点，缩短传质阻力，强化界面反应效果，大大提高酶促反应效率。
明胶微球经过醛改性交联壳聚糖修饰后，亲水性减弱，且能够较好地包裹脂肪酶，免受有机试剂影响，利于脂肪酶的回收使用。图8显示批次反应对酶促反应转化率的影响。第4次回收后乳液的酶促转化率逐步降低，直至第8次时转化率依然保持为初次反应的52％左右。这说明明胶微球负载的脂肪酶具有高比表面积，保护脂肪酶免于界面失活，利于回收应用，提高酶的稳定性。
气相色谱GC检测条件：
色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)石英毛细管柱，载气为高纯He(99.999％)，载气量1.0mL·min-1，进样口稳定为250℃，进样量1uL，不分流进样，升温程序：初始温度为45℃，保留2min，以10℃·min-1升温至280℃，保持10min。

Claims (4)

1.一种基于疏水修饰明胶微球的脂肪酶界面固定化的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒：将交联壳聚糖纳米颗粒加入脂肪醛浓度为5-15wt.％脂肪醛溶液中，以正己烷为溶剂，磁力搅拌下反应，反应结束后离心、清洗得脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒；其中交联壳聚糖纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：壳聚糖粉末溶解在乙酸水溶液中，搅拌使其完全水合，调节pH值到4-7，然后用分散机和高压微射流纳米均质机分散均质，添加0.001-1wt.％京尼平在35-45℃下共价交联24-48h，再经高压微射流均质得到均匀的交联壳聚糖纳米胶分散体，然后160℃喷雾干燥获得；
2)脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰明胶微球的制备及其相应Pickering乳液的制备：步骤1)制备的脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒、司盘80超声分散于矿物油中获得均匀分散的悬浊油相；5-10wt％的脂肪酶溶液离心去除杂质，取上清液溶解10-20wt.％的B型明胶，并调节pH为6.5，作为水相；将油相置于30-40℃水浴中，搅拌下往油相中逐滴加入水相，继续乳化20-30min，获得醛改性交联壳聚糖纳米颗粒稳定的W/O型Pickering乳液，冷却至室温，按体积比1：2在得到的W/O型Pickering乳液中加入正己烷，震荡破乳，析出油相，获得下层的脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰明胶微球；以获得的脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰明胶微球为粒子乳化剂，制备稳定的Pickering乳液，油相为正己烷，水相为含脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰明胶微球的去离子水。
2.根据权利要求1所述的基于疏水修饰明胶微球的脂肪酶界面固定化的方法，其特征在于，所述脂肪醛为十一醛。
3.权利要求1或2所述的基于疏水修饰明胶微球的脂肪酶界面固定化的方法获得的脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰明胶微球的应用，其特征在于，用于酶促反应。
4.根据权利要求3所述的脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰明胶微球的应用，其特征在于，包括以下步骤：以获得的脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰明胶微球为粒子乳化剂，制备稳定的Pickering乳液，油相为正己烷，水相为含脂肪醛疏水改性交联壳聚糖纳米颗粒修饰明胶微球的去离子水，在正己烷的油相中添加底物己酸和己醇，在离心管中按油水比例3：1震荡乳化制备Pickering乳液，进行酶促反应。
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