CN104774889A - 一种利用果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法 - Google Patents

一种利用果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104774889A
CN104774889A CN201510131874.5A CN201510131874A CN104774889A CN 104774889 A CN104774889 A CN 104774889A CN 201510131874 A CN201510131874 A CN 201510131874A CN 104774889 A CN104774889 A CN 104774889A
Authority
CN
China
Prior art keywords
acetic ester
fructosyl transferase
cane sugar
sucrose
glucose
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201510131874.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104774889B (zh
Inventor
毛多斌
魏涛
张改红
白冰
黄申
贾春晓
杨靖
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhengzhou University of Light Industry
Original Assignee
Zhengzhou University of Light Industry
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhengzhou University of Light Industry filed Critical Zhengzhou University of Light Industry
Priority to CN201510131874.5A priority Critical patent/CN104774889B/zh
Publication of CN104774889A publication Critical patent/CN104774889A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104774889B publication Critical patent/CN104774889B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/54—Improvements relating to the production of bulk chemicals using solvents, e.g. supercritical solvents or ionic liquids

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

一种利用果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法，其包括如下步骤：S1、果糖基转移酶的制备；S2、固定化果糖基转移酶的制备；S3、非水相反应体系中果糖基转移酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯；S4、蔗糖-6-乙酸酯的分离纯化；本发明具有技术特点如下：本发明建立了分离纯化果糖基转移酶的方法；本发明建立了果糖基转移酶固定化酶的方法，以磁性壳聚糖微球为载体，京尼平为交联剂；本发明建立了利用固定化果糖基转移酶以离子液体[Dmim][PF6]与叔丁醇混合溶剂为反应介质，以蔗糖和葡萄糖-6-乙酸酯为底物，催化合成蔗糖-6-乙酸酯的方法，产量和产率分别达到57.2g/L和86.2％；本发明建立了产物蔗糖-6-乙酸酯分离纯化的方法，纯度达到99.3％，回收率达到96.2％。

Description

一种利用果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法
技术领域
本发明涉及一种蔗糖-6-乙酸酯的制备方法技术领域，特别涉及一种利用果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法。
背景技术
三氯蔗糖是迄今为止人类开发的一种最完美的强力甜味剂，蔗糖-6-乙酸酯是三氯蔗糖合成的关键中间体。此外，蔗糖酯由于其卓越的应用性能和良好的生物降解性能及毒理学性质已被广泛应用于食品、医药、化妆品和洗涤剂中，蔗糖-6-乙酸酯属于一种重要蔗糖酯。本发明的非水相反应体系中催化合成蔗糖-6-乙酸酯，在生物工程和医药领域具有重要的工业应用价值。
目前，蔗糖-6-乙酸酯的合成方法包括化学法和生物酶法。化学法主要有直接酯化法和二丁基氧化锡法合成蔗糖-6-乙酸酯。Mufi等(美国专利no.4380476)用乙酸酐在吡啶催化下将蔗糖进行6位羟基的单酯化，生成蔗糖-6-乙酸酯；王小强等(中国专利200710074157.9)将在蔗糖极性非质子溶剂中，加入乙酰化试剂乙酰腈进行酯化生成蔗糖-6-乙酸酯。这两种直接酯化法易产生多乙酰化的蔗糖衍生物，且蔗糖-6-乙酸酯难以分离、收率较低。Navia等在US4950746中将二丁基氧化锡用于蔗糖-6-乙酸酯的制备中，该方法缺点是收率不高，含量偏低，对反应条件和分离设备要求高。
生物酶法相对于化学合成法最大优势是其高效专一性，具有广阔的应用前景。专利200680034904.X利用固定化Aureobasidium pullulans全细胞催化蔗糖和葡萄糖-6-乙酸酯形成蔗糖-6-乙酸酯，但转化率较低，仅为32％；魏远安等(中国专利201210112625.8)利用巨大芽孢杆菌固定增值细胞和固定化果糖基转移酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯，产率达到80％，但操作步骤较多，需多个菌株和酶参与反应，且成本较高。
鉴于目前蔗糖-6-乙酸酯合成方法的不足，提出一种在非水相反应体系中利用米曲霉果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的新方法。
发明内容
针对目前合成技术的不足，本发明提供一种利用米曲霉果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法。本发明包括果糖基转移酶制备、固定化酶技术、在非水相反应体系中催化合成蔗糖-6-乙酸酯以及蔗糖-6-乙酸酯分离纯化。
一种利用果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法，其包括如下步骤：
S1、果糖基转移酶的制备；
S2、固定化果糖基转移酶的制备；
S3、非水相反应体系中果糖基转移酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯；
S4、蔗糖-6-乙酸酯的分离纯化。
在本发明所述的利用果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法中，所述步骤S1包括如下子步骤：
S11、选择菌种及培养基
其中菌株为：米曲霉Aspergillus oryzae ZZ-01；
培养基的制作如下，在1L的培养基中：土豆200g，葡萄糖20g，加水1000mL，在加热器上加热至沸腾，沸腾时间为20min，并且用3层纱布过滤，滤渣弃取；在滤液中加入NaNO3为2g，K2HPO4为1g，KCl为1g，MgSO4为0.5g，补充水分至1000mL，将pH值调节至7.0；28℃恒温振荡培养48h，其中转速200rpm/min，获得菌液；
S12、果糖基转移酶制备
菌液培养48h后，将培养物在14,000rpm/min的条件下离心20min，收集上层清液；使用85％硫酸铵对收集上层清液进行分级沉淀，经14,000rpm/min离心20min后，将沉淀重悬于0.02M的磷酸盐缓冲液，其中磷酸盐缓冲液pH值为7.2，为下一步离子交换层析做准备；
将DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，磷酸盐缓冲液(pH 7.2)充分平衡后，将蛋白样品上样；两倍柱体积的起始缓冲液将未吸附成分洗脱后，采用线性梯度0.01-1.0M的NaCl进行洗脱，收集活性成分；
将葡聚糖凝胶Superdex 200装柱(1.6×70cm2)，0.02M磷酸盐缓冲液(pH7.2)充分平衡后，将离子交换层析得到的蛋白样品上样；上样量为1-2mL，流速8mL/h；收集洗脱成分进行活性测定及蛋白电泳。
SDS-PAGE凝胶电泳显示纯化后的果糖基转移酶为单一条带，分子量约为70KD左右，如图1所示；
在本发明所述的利用果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法中，所述步骤S2包括如下子步骤：
采用反相悬浮法与溶胶凝胶法结合制备磁性壳聚糖微球，并以此为载体，京尼平为交联剂，对纯化的果糖基转移酶进行固定化。
磁性壳聚糖微球的制备：在容量为1000mL三口烧瓶中，加入油相(150mL煤油+3.5g Tween 80)，开动搅拌器(搅拌速度600r/min)，缓慢加入90g磁性壳聚糖溶液(醋酸浓度为2％，壳聚糖浓度为4％，Fe3O4含量为5％)，连续搅拌1h，形成均匀的油包水乳化液，再迅速加入凝结液(V(2mol/L NaOH)∶V(乙醇)＝4∶1)中，保持磁力搅拌30min，停止搅拌，放置过夜，备用。
京尼平交联磁性壳聚糖微球的制备：称取多孔磁性壳聚糖微球4g于100mL具塞锥形瓶中，加入16mL 0.6g/L京尼平水溶液，55℃交联8h，二次蒸馏水洗净残余京尼平，放入4℃冰箱中冷藏待用。
果糖基转移酶的固定化：称取京尼平交联多孔磁性壳聚糖微球2g于100mL具塞锥形瓶中，再加入40mL 50mg/L果糖基转移酶溶液，在25℃下静止固定16h，以0.1mol/L硼酸缓冲溶液(pH 8.0)洗至使考马斯亮蓝溶液不变蓝为止，得到的固定化酶放入4℃冰箱中冷藏待用。
在本发明所述的利用果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法中，所述步骤S3包括：
果糖基转移酶是一类能够将蔗糖或多聚果糖中的果糖基转移到不同受体底物的糖苷转移酶。本发明以葡萄糖-6-乙酸酯和蔗糖作为反应底物，经果糖基转移酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯和葡萄糖，如图2所示。
近年来，离子液体正被开成成为一种新型的非水生物催化反应的绿色介质。本发明涉及在离子液体与有机溶剂混合反应介质中，利用果糖基转移酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯。反应体系如下：蔗糖与葡萄糖-6-乙酸酯摩尔比4∶1，固定化果糖基转移酶40mg/mL，反应介质离子液体[Dmim][PF6]与叔丁醇体积比为1∶1，5mM磷酸缓冲液(pH 6.0)，55℃水浴反应20h。在该条件下，蔗糖-6-乙酸酯产量达到57.2g/L，且产率可达到86.2％，固定化酶可以反复使用4-6次。
通过LC-MS检测酶催化反应产物蔗糖-6-乙酸酯，其中LC-MC条件为：
液相色谱条件：色谱柱UPLC HSS T3柱，其中色谱柱UPLC HSS T3柱10cm×2.1mm，1.8μm，waters；柱温40℃；流动相乙腈A和0.1％甲酸B，上样前先用50％流动相B平衡柱子6min，上样后再用流动相30％A和70％B洗脱，流速0.2mL/min；
质谱条件：检测模式为ESI+；喷雾电压5kV；锥孔电压30V；源温100℃；脱溶剂温度300℃；全扫描范围m/z 50～1000。
果糖基转移酶催化合成产物蔗糖-6-乙酸酯分析鉴定。以蔗糖和葡萄糖-6-乙酸酯为底物，果糖基转移酶催化反应产物蔗糖-6-乙酸酯，一级与二级质谱表明蔗糖-6-乙酸酯母离子[M+Na，m/z 407]通过断裂糖苷键生成质荷比(m/z)为245(葡萄糖-6-乙酰基)和185(果糖基)的特征碎片离子(如图3和4所示)。结果表明，在固定化的果糖基转移酶作用下，蔗糖分子中的果糖基转移到葡萄糖-6-乙酸酯，生成产物蔗糖6-乙酸酯和葡萄糖，表明固定化果糖基转移酶具有较高果糖基转移酶活性。
离子液体的回收及重复利用：反应结束后，反应瓶中形成上下两相，上层有机相叔丁醇中主要含有反应物(蔗糖与葡萄糖-6-乙酸酯)及反应产物(蔗糖-6-乙酸酯)，下层则是离子液体[Dmim][PF6]。将反应瓶倾斜，用吸管将上层有机相吸出，下层的离子液体可以进行再次反应，循环使用4-6次。
在本发明所述的利用果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法中，所述步骤S4包括：
将得到的粗产物中加入3.5倍体积复合溶剂(正己烷与乙醇体积比为1∶1)溶解产物蔗糖-6-乙酸酯，得到澄清溶液，再用0.5mol/L NaHCO3中和至pH值为7.2，下层为乙醇与水溶液相，溶有蔗糖、葡萄糖-6-乙酸酯和葡萄糖，上层为溶解了蔗糖-6-乙酸酯，收集上层溶液旋转蒸发即可得到葡萄糖-6-乙酸酯，纯度达到99.3％，回收率达到96.2％。
三氯蔗糖是迄今为止人类开发的一种最完美的强力甜味剂，蔗糖-6-乙酸酯是三氯蔗糖合成的关键中间体。此外，蔗糖醋由于其卓越的应用性能和良好的生物降解性能及毒理学性质已被广泛应用于食品、医药、化妆品和洗涤剂中，蔗糖-6-乙酸酯属于一种重要蔗糖酯。本发明的在非水相离子液体体系中催化合成蔗糖-6-乙酸酯，在生物工程和医药领域具有重要的工业应用价值。
目前，在非水相反应介质中利用果糖基转移酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯的方法，国内外还未建立。本发明以离子液体[Dmim][PF6]与叔丁醇混合溶剂(体积比为1∶1)作为反应介质，利用固定化果糖基转移酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯，蔗糖-6-乙酸酯产量与产率都高于目前已有技术方法，且固定化酶和离子液体都可多次利用。本发明建立的蔗糖-6-乙酸酯分离纯化方法，成本低廉、操作简便及分离高效。
本发明具有技术特点如下：
本发明建立了分离纯化果糖基转移酶的方法；
本发明建立了果糖基转移酶固定化酶的方法，以磁性壳聚糖微球为载体，京尼平为交联剂；
本发明建立了利用固定化果糖基转移酶以离子液体[Dmim][PF6]与叔丁醇混合溶剂为反应介质，以蔗糖和葡萄糖-6-乙酸酯为底物，催化合成蔗糖-6-乙酸酯的方法，产量和产率分别达到57.2g/L和86.2％；
本发明建立了产物蔗糖-6-乙酸酯分离纯化的方法，纯度达到99.3％，回收率达到96.2％。
附图说明
图1是果糖基转移酶分离纯化的电泳照片，其中：1.标准蛋白质分子量；2和3.纯化后的酶蛋白。
图2是果糖基转移酶催化葡萄糖-6-乙酸酯和蔗糖合成蔗糖-6-乙酸酯反应式。
图3LC-MS分析果糖基转移酶转糖基合成蔗糖-6-乙酸酯(一级质谱)。
图4LC-MS分析果糖基转移酶转糖基合成蔗糖-6-乙酸酯(二级质谱)。
具体实施方式
实施例1、建立了分离纯化果糖基转移酶的方法：
菌株为：米曲霉Aspergillus oryzae ZZ-01
培养基的制作如下，在1L的培养基中：土豆200g，葡萄糖20g，加水1000mL，在加热器上加热至沸腾，沸腾时间为20min，并且用3层纱布过滤，滤渣弃取；在滤液中加入NaNO3为2g，K2HPO4为1g，KCl为1g，MgSO4为0.5g，补充水分至1000mL，将pH值调节至7.0；28℃恒温振荡培养48h，其中转速200rpm/min，获得菌液；
菌液培养48h后，将培养物14,000rpm离心20min，收集上清。使用85％硫酸铵对收集上清进行分级沉淀(过夜)，经14,000rpm离心20min后，将沉淀重悬于0.02M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)，为下一步离子交换层析做准备。
将DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱(柱体积5mL，美国GE公司)，磷酸盐缓冲液(pH 7.2)充分平衡后，将蛋白样品上样。两倍柱体积的起始缓冲液将未吸附成分洗脱后，采用线性梯度0.01-1.0M NaCl进行洗脱，收集活性成分。
将一定量葡聚糖凝胶Superdex 200装柱(1.6×70cm2，美国GE公司)，0.02M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)充分平衡后，将离子交换层析得到的蛋白样品上样。上样量为1-2mL，流速8mL/h。收集洗脱成分进行活性测定及蛋白电泳。
SDS-PAGE凝胶电泳显示纯化后的果糖基转移酶为单一条带，分子量约为70KD左右。
实施例2、果糖基转移酶的固定化酶的方法：
采用反相悬浮法与溶胶凝胶法结合制备磁性壳聚糖微球，并以此为载体，京尼平为交联剂，对纯化的果糖基转移酶进行固定化，具体方法如下：
磁性壳聚糖微球的制备：在容量为1000mL三口烧瓶中，加入油相(150mL煤油+3.5g Tween 80)，开动搅拌器(搅拌速度600r/min)，缓慢加入90g磁性壳聚糖溶液(醋酸浓度为2％，壳聚糖(脱乙酰度85-90％，国药集团化学试剂有限公司)浓度为4％，Fe3O4含量为5％)，连续搅拌1h，形成均匀的油包水乳化液，再迅速加入凝结液(V(2mol/L NaOH)∶V(乙醇)＝4∶1)中，保持磁力搅拌30min，停止搅拌，放置过夜，备用。
京尼平交联磁性壳聚糖微球的制备：称取多孔磁性壳聚糖微球4g于100mL具塞锥形瓶中，加入16mL 0.6g/L京尼平(97％，抚州临川之信生物科技有限公司)水溶液，55℃交联8h，二次蒸馏水洗净残余京尼平，放入4℃冰箱中冷藏待用。
果糖基转移酶的固定化：称取京尼平交联多孔磁性壳聚糖微球2g于100mL具塞锥形瓶中，再加入40mL 50mg/L果糖基转移酶溶液，在25℃下静止固定16h，以0.1mol/L硼酸缓冲溶液(pH 8.0)洗至使考马斯亮蓝溶液不变蓝为止，得到的固定化酶放入4℃冰箱中冷藏待用。
实施例3：利用固定化果糖基转移酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯的方法，以离子液体[Dmim][PF6](99.9％，上海成捷化学有限公司)与叔丁醇(无水，淄博德弘化工科技有限公司)混合溶剂为反应介质，以蔗糖和葡萄糖-6-乙酸酯为底物，如图2所示。
固定化果糖基转移酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯的反应体系如下：蔗糖(99.5％，上海生物工程股份有限公司)与葡萄糖-6-乙酸酯(99.9％，郑州奥利实业公司)摩尔比4∶1，固定化果糖基转移酶40mg/mL，反应介质离子液体[Dmim][PF6]与有机溶剂叔丁醇体积比为1∶1，5mM磷酸缓冲液(pH 6.0)，55℃水浴反应20h。在该条件下，蔗糖-6-乙酸酯产量达到57.2g/L，且产率可达到86.2％，固定化酶可以反复使用4-6次。
通过LC-MS检测酶催化反应产物蔗糖-6-乙酸酯，其中LC-MC条件为：液相色谱条件：色谱柱UPLC HSS T3柱(10cm×2.1mm，1.8μm，美国waters公司)，柱温40℃；流动相乙腈A和0.1％甲酸B，上样前先用50％流动相B平衡柱子6min，上样后再用流动相30％A和70％B洗脱，流速0.2mL/min；
质谱条件：检测模式为ESI+；喷雾电压5kV；锥孔电压30V；源温100℃；脱溶剂温度300℃；全扫描范围m/z 50～1 000。
果糖基转移酶催化合成产物蔗糖-6-乙酸酯分析鉴定。以蔗糖和葡萄糖-6-乙酸酯为底物，果糖基转移酶催化反应产物蔗糖-6-乙酸酯，一级与二级质谱表明蔗糖-6-乙酸酯母离子[M+Na，m/z 407]通过断裂糖苷键生成质荷比(m/z)为245(葡萄糖-6-乙酰基)和185(果糖基)的特征碎片离子(如图3和4所示)。结果表明，在纯化的果糖基转移酶作用下，蔗糖分子中的果糖基转移到葡萄糖-6-乙酸酯，生成产物蔗糖6-乙酸酯和葡萄糖，表明分离纯化的果糖基转移酶具有较高果糖基转移酶活性。
实施例4：蔗糖-6-乙酸酯分离纯化的方法：
将得到的粗产物中加入3.5倍体积复合溶剂(正己烷与乙醇体积比为1∶1)溶解产物蔗糖-6-乙酸酯，得到澄清溶液，再用0.5mol/L NaHCO3中和至pH值为7.2，下层为乙醇与水溶液相，溶有蔗糖、葡萄糖-6-乙酸酯和葡萄糖，上层为溶解了蔗糖-6-乙酸酯，收集上层溶液旋转蒸发即可得到葡萄糖-6-乙酸酯，纯度达到99.3％，回收率达到96.2％。
实施例5：蔗糖-6-乙酸酯的应用
米曲霉果糖基转移酶在离子液体[Dmim][PF6]和叔丁醇反应体系中催化合成蔗糖-6-乙酸酯，在生物工程和医药领域具有重要的工业应用价值。采用酶法合成蔗糖-6-乙酸酯，具有催化专一性强、产率高，可以提高反应速率并消除化学合成反应可能带来的污染物等负面影响。
可以理解的是，对于本领域的普通技术人员来说，可以根据本发明的技术构思做出其它各种相应的改变与变形，而所有这些改变与变形都应属于本发明权利要求的保护范围。

Claims (6)

1.一种利用果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
S1、果糖基转移酶的制备；
S2、固定化果糖基转移酶的制备；
S3、非水相反应体系中果糖基转移酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯；
S4、蔗糖-6-乙酸酯的分离纯化。
2.如权利要求1所述的利用果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法，其特征在于，所述步骤S1包括如下子步骤：
S11、选择菌种及培养基
其中菌株为：米曲霉Aspergillus oryzae ZZ-01；
培养基的制作如下，在1L的培育基中：土豆200g，葡萄糖20g，加水1000mL，在加热器上加热至沸腾，沸腾时间为20min，并且用3层纱布过滤，滤渣弃取；在滤液中加入NaNO3为2g，K2HPO4为1g，KCl为1g，MgSO4为0.5g，补充水分至1000mL，将pH值调节至7.0；28℃恒温振荡培养48h，其中转速200rpm/min，获得菌液；
S12、果糖基转移酶制备
菌液培养48h后，将培养物在14,000rpm/min的条件下离心20min，收集上层清液；使用85％硫酸铵对收集上层清液进行分级沉淀，经14,000rpm/min离心20min后，将沉淀重悬于0.02M的磷酸盐缓冲液，其中磷酸盐缓冲液pH值为7.2，为下一步离子交换层析做准备；
将DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，pH值为7.2的磷酸盐缓冲液充分平衡后，将蛋白样品上样；两倍柱体积的起始缓冲液将未吸附成分洗脱后，采用线性梯度0.01-1.0M的NaCl进行洗脱，收集活性成分；
将葡聚糖凝胶Superdex 200装柱，尺寸为1.6×70cm2，0.02M磷酸盐缓冲液充分平衡后，将离子交换层析得到的蛋白样品上样，磷酸盐缓冲液的pH值为7.2；上样量为1-2mL，流速8mL/h；收集洗脱成分进行活性测定及蛋白电泳。
SDS-PAGE凝胶电泳显示纯化后的果糖基转移酶为单一条带，分子量约为70KD左右。
3.如权利要求2所述的利用果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法，其特征在于，所述步骤S2包括：
磁性壳聚糖微球的制备：在容量为1000mL三口烧瓶中，加入油相，油相包括150mL煤油和3.5g Tween 80，开动搅拌器，搅拌速度600r/min，缓慢加入90g磁性壳聚糖溶液，醋酸浓度为2％，壳聚糖浓度为4％，Fe3O4含量为5％，连续搅拌1h，形成均匀的油包水乳化液，再迅速加入凝结液中，凝结液由2mol/L的NaOH和乙醇组成，NaOH与乙醇的体积比为4∶1，保持磁力搅拌30min，停止搅拌，放置过夜，备用。
京尼平交联磁性壳聚糖微球的制备：称取多孔磁性壳聚糖微球4g于100mL具塞锥形瓶中，加入16mL 0.6g/L京尼平水溶液，55℃交联8h，二次蒸馏水洗净残余京尼平，放入4℃冰箱中冷藏待用。
果糖基转移酶的固定化：称取京尼平交联多孔磁性壳聚糖微球2g于100mL具塞锥形瓶中，再加入40mL 50mg/L果糖基转移酶溶液，在25℃下静止固定16h，以0.1mol/L、pH值为8.0的硼酸缓冲溶液洗至使考马斯亮蓝溶液不变蓝为止，得到的固定化酶放入4℃冰箱中冷藏待用。
4.如权利要求3所述的利用果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法，其特征在于，所述步骤S3包括：
利用固定化果糖基转移酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯的方法，以离子液体[Dmim][PF6]与叔丁醇混合溶剂为反应介质，以蔗糖和葡萄糖-6-乙酸酯为底物，如图2所示。固定化果糖基转移酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯的反应体系如下：蔗糖与葡萄糖-6-乙酸酯摩尔比4∶1，固定化果糖基转移酶40mg/mL，反应介质离子液体[Dmim][PF6]与有机溶剂叔丁醇体积比为1∶1，5mM磷酸缓冲液，磷酸缓冲液的pH值为6.0，55℃水浴反应20h。
5.如权利要求3所述的利用果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法，其特征在于，还包括利用LC-MS检测酶催化反应产物蔗糖-6-乙酸酯，其中LC-MC条件为：
液相色谱条件：色谱柱UPLC HSS T3柱，其中色谱柱UPLC HSS T3柱10cm×2.1mm，1.8μm，waters；柱温40℃；流动相乙腈A和0.1％甲酸B，上样前先用50％流动相B平衡柱子6min，上样后再用流动相30％A和70％B洗脱，流速0.2mL/min；
质谱条件：检测模式为ESI+；喷雾电压5kV；锥孔电压30V；源温100℃；脱溶剂温度300℃；全扫描范围m/z 50～1 000。
6.如权利要求4所述的利用果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法，其特征在于，所述步骤S4包括如下子步骤：
将得到的粗产物中加入3.5倍体积复合溶剂，正己烷与乙醇体积比为1∶1，溶解产物蔗糖-6-乙酸酯，得到澄清溶液，再用0.5mol/L NaHCO3中和至pH值为7.2，下层为乙醇与水溶液相，溶有蔗糖、葡萄糖-6-乙酸酯和葡萄糖，上层为溶解了蔗糖-6-乙酸酯，收集上层溶液旋转蒸发即可得到葡萄糖-6-乙酸酯，纯度达到99.3％，回收率达到96.2％。
CN201510131874.5A 2015-03-25 2015-03-25 一种利用果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法 Expired - Fee Related CN104774889B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510131874.5A CN104774889B (zh) 2015-03-25 2015-03-25 一种利用果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510131874.5A CN104774889B (zh) 2015-03-25 2015-03-25 一种利用果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104774889A true CN104774889A (zh) 2015-07-15
CN104774889B CN104774889B (zh) 2018-08-17

Family

ID=53616658

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510131874.5A Expired - Fee Related CN104774889B (zh) 2015-03-25 2015-03-25 一种利用果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104774889B (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108486076A (zh) * 2017-01-05 2018-09-04 郑州轻工业学院 一种米曲霉果糖基转移酶及其用于制备蔗糖四酯的方法
CN109321559A (zh) * 2018-10-16 2019-02-12 山东星光首创生物科技有限公司 一种以磁性Fe3O4-多糖微球为载体固定化果糖基转移酶的方法
CN111763703A (zh) * 2020-07-02 2020-10-13 浙江工业大学 一种有机溶剂中酶法合成蔗糖-6-乙酯的方法
CN111808839A (zh) * 2020-06-10 2020-10-23 广东省测试分析研究所（中国广州分析测试中心） 一种基于疏水修饰明胶微球的脂肪酶界面固定化的方法
WO2021114199A1 (zh) * 2019-12-13 2021-06-17 广州嘉德乐生化科技有限公司 一种分析蔗糖酯样品的方法
WO2022151828A1 (zh) * 2021-01-15 2022-07-21 百瑞全球有限公司 膜状固定化细胞、多肽、寡肽或蛋白质及其制备方法
CN115058440A (zh) * 2022-06-08 2022-09-16 郑州轻工业大学 催化合成天然蔗糖酯的工程菌及其构建方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101886100A (zh) * 2010-07-12 2010-11-17 江南大学 一种酶法制备蔗糖-6-乙酸酯的方法
CN102618601A (zh) * 2012-04-17 2012-08-01 广西大学 利用生物发酵和固定化酶法制备蔗糖-6-乙酯的方法
CN102899256A (zh) * 2012-09-27 2013-01-30 量子高科(中国)生物股份有限公司 一种产果糖基转移酶的菌株及其制备方法
CN105112306A (zh) * 2015-09-21 2015-12-02 山东百龙创园生物科技有限公司 一株米曲霉及其培养方法与应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101886100A (zh) * 2010-07-12 2010-11-17 江南大学 一种酶法制备蔗糖-6-乙酸酯的方法
CN102618601A (zh) * 2012-04-17 2012-08-01 广西大学 利用生物发酵和固定化酶法制备蔗糖-6-乙酯的方法
CN102899256A (zh) * 2012-09-27 2013-01-30 量子高科(中国)生物股份有限公司 一种产果糖基转移酶的菌株及其制备方法
CN105112306A (zh) * 2015-09-21 2015-12-02 山东百龙创园生物科技有限公司 一株米曲霉及其培养方法与应用

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108486076A (zh) * 2017-01-05 2018-09-04 郑州轻工业学院 一种米曲霉果糖基转移酶及其用于制备蔗糖四酯的方法
CN109321559A (zh) * 2018-10-16 2019-02-12 山东星光首创生物科技有限公司 一种以磁性Fe3O4-多糖微球为载体固定化果糖基转移酶的方法
WO2021114199A1 (zh) * 2019-12-13 2021-06-17 广州嘉德乐生化科技有限公司 一种分析蔗糖酯样品的方法
CN111808839A (zh) * 2020-06-10 2020-10-23 广东省测试分析研究所（中国广州分析测试中心） 一种基于疏水修饰明胶微球的脂肪酶界面固定化的方法
CN111808839B (zh) * 2020-06-10 2021-05-11 广东省测试分析研究所（中国广州分析测试中心） 一种基于疏水修饰明胶微球的脂肪酶界面固定化的方法
CN111763703A (zh) * 2020-07-02 2020-10-13 浙江工业大学 一种有机溶剂中酶法合成蔗糖-6-乙酯的方法
CN111763703B (zh) * 2020-07-02 2022-07-19 浙江工业大学 一种有机溶剂中酶法合成蔗糖-6-乙酯的方法
WO2022151828A1 (zh) * 2021-01-15 2022-07-21 百瑞全球有限公司 膜状固定化细胞、多肽、寡肽或蛋白质及其制备方法
CN115058440A (zh) * 2022-06-08 2022-09-16 郑州轻工业大学 催化合成天然蔗糖酯的工程菌及其构建方法和应用
CN115058440B (zh) * 2022-06-08 2023-08-15 郑州轻工业大学 催化合成天然蔗糖酯的工程菌及其构建方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN104774889B (zh) 2018-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104774889A (zh) 一种利用果糖基转移酶制备蔗糖-6-乙酸酯的方法
Alvaro-Benito et al. Characterization of a β-fructofuranosidase from Schwanniomyces occidentalis with transfructosylating activity yielding the prebiotic 6-kestose
Van Tilbeurgh et al. Fluorogenic and chromogenic glycosides as substrates and ligands of carbohydrases
Honda et al. Analysis of carbohydrates as 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone derivatives by capillary/microchip electrophoresis and capillary electrochromatography
Williams et al. Glycosynthases: mutant glycosidases for glycoside synthesis
Koizumi et al. Further studies on the separation of cyclic (1→ 2)-β-d-glucans (cyclosophoraoses) produced by Rhizobium meliloti IFO 13336, and determination of their degrees of polymerization by high-performance liquid chromatography
Paleček Polarographic behaviour of native and denatured deoxyribonucleic acids
CN102559520A (zh) 一种利用微生物催化制备(s)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的方法
CN105274081A (zh) 一种d-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基酶的异源表达及其应用
Liu et al. Isolation of α-arbutin from Xanthomonas CGMCC 1243 fermentation broth by macroporous resin adsorption chromatography
Seo et al. Highly selective biotransformation of arbutin to arbutin-α-glucoside using amylosucrase from Deinococcus geothermalis DSM 11300
CN106543243A (zh) 一种红景天苷衍生物及其制备方法
Kosary et al. Reverse hydrolytic process for O-alkylation of glucose catalysed by immobilized α-and β-glucosidases
Liu et al. Efficient production of α-arbutin by whole-cell biocatalysis using immobilized hydroquinone as a glucosyl acceptor
Zhang et al. Naringinase-catalyzed hydrolysis of naringin adsorbed on macroporous resin
Antov et al. Cultivation of Polyporus squamosus for pectinase production in aqueous two-phase system containing sugar beet extraction waste
Yoshigi et al. Characterization of a maltopentaose-producing bacterium and its cultural conditions
CN104673862A (zh) 利用α-L-鼠李糖苷酶催化柚皮苷合成普鲁宁的方法
Chiba et al. A new trisaccharide, 2-α-maltosyl-glucose, synthesized by the transglycosylation reaction of cyclodextrin glycosyltransferase
Zhang et al. Biosynthesis of radiolabeled cellodextrins by the Clostridium thermocellum cellobiose and cellodextrin phosphorylases for measurement of intracellular sugars
Tatsumi et al. Kinetic analysis of enzymatic hydrolysis of crystalline cellulose by cellobiohydrolase using an amperometric biosensor
CN108715875A (zh) 酶化学法合成结构明确的硫酸肝素寡糖的方法
CN105969826B (zh) 一种微反应器专用纳米粒子固定化酶合成异槲皮苷的方法
Ducret et al. Comparison between various commercial sources of almond β-glucosidase for the production of alkyl glucosides
Park et al. Production of a new sucrose derivative by transglycosylation of recombinant Sulfolobus shibatae β-glycosidase

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20180817

Termination date: 20210325

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee