CN108486076A - 一种米曲霉果糖基转移酶及其用于制备蔗糖四酯的方法 - Google Patents

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黄申
白冰
贾春晓
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王珊
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Abstract

本发明涉及一种米曲霉果糖基转移酶及其应用于制备蔗糖四酯的方法。本发明的米曲霉果糖基转移酶具有良好的催化活性，可以高效催化合成蔗糖四酯，适用于蔗糖四酯生物酶法制备，具有较好的工业应用前景。

Description

一种米曲霉果糖基转移酶及其用于制备蔗糖四酯的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是一种米曲霉果糖基转移酶及其应用。
背景技术
蔗糖四酯是一类重要的香料物质，广泛应用食品、化妆品和医药工业等领域中。此外，已有研究表明，蔗糖四酯具有重要的杀虫抗菌活性，可以作为开发为具有应用价值前景的无害杀虫剂和杀菌剂，对工农业可持续发展具有重要意义。蔗糖四酯由六个较大的基团组成：(一)都是四元酯；(二)四个酰基化的基团都在蔗糖的葡萄糖结构单元上，果糖上没有一个羟基被酯化；(三)葡萄糖结构中6位碳原子上的羟基是乙酯化的；(四)其余C3、C4、C5上的羟基的酰基碳数为3-9。
蔗糖四酯作为植物次级代谢产物，要从复杂天然体系中分离出微量成分是非常困难的，因此从天然体系分离微量成分具有研究价值，而不具有广泛应用价值。另一方面，化学方法合成该类物质涉及到选择性合成问题，要实现目标物的合成，必须采用保护和去保护策略，这样导致合成步骤冗长，并且产率较低。1998年，瑞典斯德哥尔摩大学化学系的教授Garegg和Oscarson等人研究了该类物质的合成技术(Carbohydrate Research，1988，181：89-96)，采用17步化学反应，最终得到了目标产物，但是产率只有0.3％。由此可见，利用传统化学合成技术不能解决该类物质合成技术所存在的问题，该类物质的合成已成为长期悬而未决的科技难题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种米曲霉果糖基转移酶，并利用这种米曲霉果糖基转移酶制备蔗糖四酯。为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
一种米曲霉果糖基转移酶，其由SEQ ID NO.1的氨基酸序列表示。
一种SEQ ID NO.1的氨基酸序列表示的米曲霉果糖基转移酶的编码基因，其由SEQID NO.2的核苷酸序列表示。
一种SEQ ID NO.2的核苷酸序列表示的编码基因的上游引物和下游引物，分别由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的核苷酸序列表示。
一种重组质粒，其包括SEQ ID NO.2的核苷酸序列所表示的编码基因。
一种重组大肠杆菌，其包含有SEQ ID NO.2的核苷酸序列所表示的编码基因。
一种使用上述米曲霉果糖基转移酶催化蔗糖与葡萄糖四酯制备蔗糖四酯的方法，包括以下步骤：在去离子水中加入以下浓度的物质，
保持45℃的温度，酶解20h，获得蔗糖四酯。
一种蔗糖四脂，其使用权利要求6所述米曲霉果糖基转移酶合成蔗糖四酯的方法制成。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明得到了一种米曲霉果糖基转移酶的基因序列和氨基酸序列，该酶是在米曲霉Aspergillus oryzae(保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.3.9544)中发现并制备获得的第一个具有催化合成蔗糖四酯的果糖基转移酶，具有不同的氨基酸序列和酶学特性。利用上述米曲霉果糖基转移酶制备蔗糖四酯，蔗糖四酯的产率达到了14.2％。
附图说明
图1是纯化后米曲霉果糖基转移酶SDS-PAGE分析图。
图2是米曲霉果糖基转移酶催化反应物蔗糖与葡萄糖四酯的HPLC检测结果图。
图3是米曲霉果糖基转移酶催化反应产物的HPLC检测结果图。
具体实施方式
以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。
大肠杆菌Escherichia coli DH5α、限制性内切酶NdeI和SalI、pfu DNA聚合酶、DNA连接酶、质粒DNA提取试剂盒购自上海生工公司；大肠杆菌Escherichia coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL购自Novagen公司；LB培养基：每升含Tryptone 10g，Yeast extract5g，NaCl 10g；氨苄青霉素浓度为100mg/L，氯霉素浓度为34mg/L；克隆与表达质粒载体为pET15b-SM。
米曲霉Aspergillus oryza果糖基转移酶的编码基因由SEQ ID NO.2的核苷酸序列表示。
米曲霉Aspergillus oryzae果糖基转移酶的氨基酸序列由SEQ ID NO.1的氨基酸序列表示。
参照米曲霉Aspergillus oryza果糖基转移酶基因设计的上游引物由SEQ IDNO.3的核苷酸序列表示，添加8个保护碱基CCATTTGA，增加限制性内切酶NdeI酶切效率；下游引物由SEQ ID NO.4的核苷酸序列表示，添加8个保护碱基CTCGACGG，调整下游引物GC含量，提高退火温度Tm，进而提高目的基因PCR扩增效率。
以米曲霉Aspergillus oryza果糖基转移酶的编码基因序列为模板进行果糖基转移酶基因扩增，PCR反应体系(50μL)如下：模板0.5μL(30ng)，dNTP(25mmol/L)0.5μl，引物(100μmol/L)各0.5μL，10×缓冲液5μL，pfu DNA聚合酶(5U/μL)1μL，超纯水42μL。PCR反应条件：94℃ 5min；94℃ 60s，55℃45s，72℃90s，30个循环。果糖基转移酶基因片段经内切酶NdeI和SalI双酶切后连接到高效表达载体的pET15b-SM上，连接产物转化大肠杆菌E.coliDH5α，筛选重组质粒，并进行双酶切及测序验证。pET15b-SM是在Novogen原核表达载体pET15b基础上改造而成，在原多克隆位点添加了SalI和NsiI酶切位点，便于基因克隆以及提高蛋白表达量。
将重组质粒转化到E.coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL感受态细胞中，涂布至加入氨苄霉素(Amp，100mg/L)和氯霉素(Chl，34mg/L)的LB平板上，37℃培养12h。挑取阳性转化子单菌落于5mL含Amp和Chl的LB液体培养基中，培养12h；按2％接种量接种到含Amp的300mLLB液体培养基中，培养2h，使OD600在0.5；加入诱导剂IPTG至终浓度为0.3mmol/L，诱导表达蛋白；离心收集菌体，加入20mL破壁buffer(20mmol/L Tris-HCl，pH8.0，100mmol/L NaCl)，超声波破碎菌体后，4℃，12，000×g离心10min，上清即为蛋白粗酶液。进一步采用镍柱亲和层析(洗脱缓冲液：20mM Tris-HCl，pH 8.0，300mM NaCl，500mM imidazole)和分子筛Superdex 200(16/60)column(洗脱缓冲液：20mM Tris-HCl，pH 8.0，200mM NaCl；洗脱速度为：0.5ml/min)纯化后，得到纯化的酶蛋白，并利用SDS-PAGE凝胶电泳来检测纯化效果。
得到纯化的米曲霉果糖基转移酶蛋白电泳图如图1所示。经IPTG诱导表达目的蛋白，经镍柱亲和层析和分子筛Superdex 200(16/60)column纯化，得到纯化米曲霉果糖基转移酶，分子量是58.0KD。图中，M为蛋白质Marker；1和2道为纯化后米曲霉果糖基转移酶。
米曲霉果糖基转移酶催化葡萄糖四酯合成蔗糖四酯的反应式为：
米曲霉果糖基转移酶酶活性检测的标准反应体系如下：25mmol/L蔗糖，75mmol/L葡萄糖四酯(6-O-乙酰基-2，3，4-三-O-丙酰基-D-吡喃葡萄糖)，50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)，2.5mmol/L DTT、0.5％(w/v)Tween 80和4U/mL果糖基转移酶酶液。以不含有酶液的上述反应体系作对照组，45℃酶解20h，反应结束后，反应液100℃煮沸10min灭活酶终止反应。酶活力单位定义为：在一定条件下，每小时生成1微摩尔的蔗糖四酯(6-O-乙酰基-2，3，4-三-O-3-丙酰基-α-D-葡萄糖-β-D-呋喃果糖)所需要的酶量为一个活力单位(U)。
高效液相色谱HPLC检测反应产物蔗糖四酯(6-O-乙酰基-2，3，4-三-O-3-丙酰基-α-D-葡萄糖-β-D-呋喃果糖)，所用色谱柱为Carbohydrate ES柱(美国Waters公司，25cm×4.6cm)，采用美国Waters 2424 ELS蒸发光散射色谱检测器，流动相为乙腈∶水(75∶25，v/v)，洗脱速度为1.0mL/min。蔗糖四酯产率计算公式如下：
注：SE为蔗糖四酯生成的物质的量；GE为葡萄糖四酯起始的物质的量。
HPLC检测结果如图2-3所示，图2中，反应物蔗糖四酯和蔗糖的保留时间分别为0.589min和1.678min，图3中，反应物蔗糖四酯和蔗糖的保留时间分别为0.589min和1.678min，反应产物蔗糖四酯和葡萄糖保留时间分别为1.082min和2.223min。米曲霉果糖基转移酶具有催化合成蔗糖四酯的活性，按照催化反应式和蔗糖四酯产率计算公式1，得到米曲霉果糖基转移酶催化葡萄糖四酯合成蔗糖四酯的产率为14.2％，远高于化学合成蔗糖四酯的产率(0.3％)。以上实验结果表明米曲霉果糖基转移酶可以高效催化合成蔗糖四酯，具有较好的工业应用价值。
上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。

Claims (7)

1.一种米曲霉果糖基转移酶，其由SEQ ID NO.1的氨基酸序列表示。
2.一种SEQ ID NO.1的氨基酸序列表示的米曲霉果糖基转移酶的编码基因，其由SEQID NO.2的核苷酸序列表示。
3.一种SEQ ID NO.2的核苷酸序列表示的编码基因的上游引物和下游引物，分别由SEQID NO.3和SEQ ID NO.4的核苷酸序列表示。
4.一种重组质粒，其包括SEQ ID NO.2的核苷酸序列所表示的编码基因。
5.一种重组大肠杆菌，其包含有SEQ ID NO.2的核苷酸序列所表示的编码基因。
6.一种使用权利要求1所述米曲霉果糖基转移酶催化蔗糖与葡萄糖四酯制备蔗糖四酯的方法，包括以下步骤：在去离子水中加入以下浓度的物质，
保持45℃的温度，酶解20h，获得蔗糖四酯。
7.一种蔗糖四脂，其使用权利要求6所述米曲霉果糖基转移酶合成蔗糖四酯的方法制成。
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