CN102344915B - 具有肉桂醇脱氢酶活性的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有肉桂醇脱氢酶活性的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的具有肉桂醇脱氢酶活性的蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有肉桂醇脱氢酶活性的由a)衍生的蛋白质。本发明所提供的具有肉桂醇脱氢酶活性的蛋白，在体外酶促反应体系中，除了能高效催化松柏醛、芥子醛和香叶醛向其醇的形式转化之外，还能催化青蒿素生物合成的前体青蒿醛向青蒿醇的转化，而后者可以应用于从分子水平对青蒿素生物合成代谢过程进行调控，从而为生产高产青蒿素株系奠定基础。

Description

具有肉桂醇脱氢酶活性的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中具有肉桂醇脱氢酶活性的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

木质素(lignin)是仅次于纤维素，属于世界上第二丰富的有机物。它主要是由三种木质醇单体，即对香豆醇(p-coumaroyl alcohol)、松柏醇(coniferyl alcohol)、芥子醇(sinapyl alcohol)形成的一种复杂酚类聚合物。木质素作为细胞壁中主要的聚合物之一，填充于纤维素构架中，能增强植物体的机械强度使植物不会倒伏，利于输导组织的水分运输。同时，木质素及许多相关产物在植物生物的或非生物的抗性中具有许多功能，可以抵抗不良外界环境的侵袭。此外，木质素还对人类健康十分有益，木质素一般存在于豆类、麦麸、可可、草莓及山莓的种子部分之中，可以吸附胆汁的主要成分胆汁酸，并将其排除体外。除去对植物体本身以及人体健康方面的重要作用之外，由于木质素储量丰富，在化石能源的日益枯竭的今天，对于木质素生物合成与有效降解的认识决定木质素的经济效益的可持续发展性。而且木质素成本较低，木质素及其衍生物具有多种功能性，可作为分散剂、吸附剂、解吸剂、石油回收助剂、沥青乳化剂等等，由此可见木质素对人类可持续发展能够提供稳定、持续的有机物质来源，毫无疑问，其应用前景是十分广阔的。总之，研究木质素性能和结构的关系，利用木质素制造可降解、可再生的聚合物都具有广阔的前景和重要的意义。

肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD)催化三种木质醇单体形成过程的第二步还原反应，在NADPH存在的情况下CAD能以不同效率还原肉桂醛及其衍生物从而产生各种木质醇单体。而后者是合成木质素的主要构件分子。此外，肉桂醇脱氢酶也是木质素合成途径中研究最早的酶类之一。

青蒿，分类学上称为黄花蒿(Artemisia annua L.)，一年生草本植物，是一种传统的药用植物。青蒿素是从中药青蒿中提取的有过氧基团的倍半萜内酯抗疟新药，是我国发现的第一个被国际公认的天然药物，也是目前世界上最有效的治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的药物，被世界卫生组织称为“治疗疟疾的最大希望”，具有快速、高效、无抗药性、低毒副作用的特征。然而，青蒿素的生物合成具有特殊性，只有在特殊分化的细胞——叶片和花蕾上的分泌腺毛(glandular secretory trichome，GST)中合成，这样导致青蒿中青蒿素的含量极低，约为0.1％-0.8％，因而提取物的产量极低，难以满足市场需求。目前人工合成青蒿素由于其工艺复杂、毒副作用大、成本高而不能投入生产。世界上青蒿素药物的生产仍然主要依靠从野生和栽培青蒿中直接提取。因此利用植物基因工程来高效产生青蒿素或者或利用青蒿素前体生物合成青蒿素的技术，成为大规模生产青蒿素的最有希望的手段。近些年来青蒿素生物合成途径的一些关键酶基因相继被克隆和鉴定，这给青蒿素代谢工程以及青蒿素的生物合成调控研究提供了基础。

发明内容

本发明的一个目的是提供具有肉桂醇脱氢酶活性的蛋白及其编码基因。

本发明所提供的具有肉桂醇脱氢酶活性的蛋白，名称为AaCAD，来源于青蒿(Artemisia annua L.)，是如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有肉桂醇脱氢酶活性的由a)衍生的蛋白质。

本发明所提供的具有肉桂醇脱氢酶活性的蛋白的编码基因，为如下1)或2)或3)或4)所示：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1自5′末端起第72位-第1257位核苷酸所示DNA分子；

2)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列表中序列1由1359个碱基组成，自5’端第72位-第1157位为其编码序列，编码具有序列表中序列2所示的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中序列2由361个氨基酸残基组成。

含有所述具有肉桂醇脱氢酶活性的蛋白编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体为在表达载体pET30a的多克隆位点插入所述编码基因得到的重组表达载体。

扩增所述具有肉桂醇脱氢酶活性的蛋白编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。

所述具有肉桂醇脱氢酶活性的蛋白在作为肉桂醇脱氢酶中的应用也属于本发明的保护范围。

所述具有肉桂醇脱氢酶活性的蛋白、所述编码基因、所述重组表达载体或所述表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下1)或2)或3)或4)中的应用也属于本发明的保护范围：

1)催化芥子醛形成芥子醇；

2)催化松柏醛形成松柏醇；

3)催化香叶醛形成香叶醇；

4)催化青蒿醛形成青蒿醇。

所述具有肉桂醇脱氢酶活性的蛋白、所述编码基因、所述重组表达载体或所述表达盒、转基因细胞系或重组菌在体外合成青蒿醇、芥子醇、松柏醇和香叶醇中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明从青蒿中克隆了一个具有肉桂醇脱氢酶活性的基因，该基因编码的蛋白在体外酶促反应体系中，除了作为一个经典的肉桂醇脱氢酶能高效催化松柏醛、芥子醛和香叶醛向其醇的形式(包括松柏醇，芥子醇和香叶醇)转化之外，还能催化青蒿素生物合成的前体青蒿醛向青蒿醇的转化，而后者可以应用于从分子水平对青蒿素生物合成代谢过程进行调控，从而为生产高产青蒿素株系奠定基础。

附图说明

图1为重组表达载体pETCAD示意图。

图2为AaCAD蛋白SDS-PAGE电泳图。

图3为重组蛋白以芥子醛为底物进行酶促反应后反应产物的HPLC检测结果。

图4为重组蛋白以松柏醛为底物进行酶促反应后反应产物的HPLC检测结果。

图5为重组蛋白以香叶醛为底物进行酶促反应后反应产物的GC检测结果。

图6为重组蛋白以青蒿醛为底物进行酶促反应后反应产物的GC检测结果。

图7为AaCAD基因在青蒿植株不同组织部位的RT-PCR检测。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、酶的制备及功能验证

一、青蒿肉桂醇脱氢酶的编码基因AaCAD全长cDNA序列的获得

(一)青蒿肉桂醇脱氢酶基因AaCAD 3’端序列的克隆

使用百泰克生物技术有限公司通用植物总RNA提取试剂盒提取青蒿(ArtemisiaannHa L.)(青蒿种子采集自中国重庆市酉阳地区)植株的叶片的总RNA，采用普洛麦格生物技术公司反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，反转录时所用引物为OligodT-adaptor 5′-CTG ATC TAG AGG TAC CGG ATC CAT ATT TTT TTT TTT TTTTTT-3′。

根据从青蒿腺毛文库中获得的肉桂醇脱氢酶基因部分序列的ORF设计引物，具体引物的序列如下：

Aa1：5′-GGA CCT TCA TAG GTA GCA TGAAGG AGA CTC-3′；

以获得的第一链cDNA为模板，引物Aa 1与引物adaptor 5′-CTG ATC TAG AGGTAC CGGATC CATA-3′配对进行PCR扩增；PCR反应体系为：cDNA模板，1μl；引物Aa 1，1μl；引物adaptor，1μl；10×Extaq Buffer 5μl；dNTP Mixture(各2.5mmol/l)4μl，ExTaq酶0.5μl(北京全式金生物技术有限公司)，ddH₂O 37.5μl。

反应条件为：95℃预变性5min；94℃40s，56℃30s，72℃1min30s，30个循环；72℃延伸10min。

反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。回收并纯化PCR产物，将其连接到pMD 18-T载体(购自Takara公司)上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序验证。

(二)青蒿肉桂醇脱氢酶酶基因AaCAD 5’端序列的克隆

以上述步骤(一)提取的青蒿叶片的总RNA经反转录合成的第一链cDNA为模板，根据RACE 5’接头引物和AaCAD基因的ORF设计两条特异引物(GSP)进行巢式PCR，具体引物的序列如下：

接头引物：5′-AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT-3′；

GSP1：5′-GAA CTG GCA CCG TGT CAA TAA TG′，

GSP2：5′-CAT CAG CTC CGA GGA CAT CCA GT-3′。

第一轮PCR反应用标准PCR反应程序，1μl加尾的cDNA作为模板，用5’接头引物作为正义引物，GSP 1引物作为反义引物。50μl PCR反应体系为：cDNA模板，1μl；5’接头引物，1μl；GSPl，1μl；10×Extaq Buffer 5μl；dNTP Mixture(各2.5mmol/1)2μl，ExTaq酶0.5μl(购自北京全式金生物技术有限公司)，ddH₂O 39.5μl。

第二轮PCR的程序同上，以1μl第一轮PCR的产物作为模板，5’接头引物和GSP2作为PCR的引物。50μl PCR反应体系为：cDNA模板，1μl；5’接头引物，1μl；GSP2，1μl；10×Extaq Buffer 5μl；dNTP Mixture(各2.5mmol/1)2μl，ExTaq酶0.5μl(北京全式金生物技术有限公司)，ddH₂O 39.5μl。

PCR参数为：94℃5min，1循环；94℃40s，55℃30s，72℃2min，30循环；72℃10min，1循环。。

反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。回收并纯化PCR产物，将其连接到pMD18-T载体(购自Takara公司)上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序验证。

(三)青蒿肉桂醇脱氢酶基因AaCAD全长cDNA序列的获得及PCR扩增

利用上述步骤(一)和步骤(二)获得片段之间的重叠区拼接获得AaCAD基因的全长cDNA序列，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示。序列表中序列1由1359个碱基组成，自5’端第72位-第1157位为其编码序列，编码具有序列表中序列2所示的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中序列2由361个氨基酸残基组成。将该基因命名为AaCAD，将其编码的蛋白命名为AaCAD。

二、青蒿肉桂醇脱氢酶AaCAD蛋白的获得

根据AaCAD基因全长cDNA序列设计如下引物：

AaCAD F：5’-GAT GGA TCC ATG GGAAGC ATGAAA GAA GAA-3’(下划线表示BamH I识别位点)(序列表中序列3)；

AaCAD R：5’-GTA CTC GAG ATT TGT TGT TTC CTC TTC CAA-3’(下划线表示Xho I识别位点)(序列表中序列4)。

以步骤(一)中获得的第一链cDNA为模板，用引物AaCAD F和引物AaCAD R进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。

PCR反应条件为：95℃变性5分钟；94℃30秒、56℃30秒、72℃90秒，30个循环；72℃延伸10分钟。

将PCR扩增片段回收后用BamH I和Xho I双酶切后连接到经BamH I和Xho I双酶切的pET30a载体(购自Novagen公司，产品目录号为69909-3)上，得到目的质粒。将目的质粒转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，以引物AaCAD F和引物AaCAD R为引物对进行PCR鉴定阳性克隆，扩增出1100bp左右片段的克隆为阳性克隆。提取阳性克隆的质粒进行测序，测序结果表明，在载体pET30a载体的BamH I和Xho I酶切位点间插入了序列表中序列1自5’端第72位-第1157位所示的AaCAD基因片段，证明质粒构建正确，将重组载体命名为pETCAD(图1)。

LB培养基(1L)：称取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g置于烧杯中，用去离子水定容至1L。

将重组质粒pETCAD转化大肠杆菌BL21(购自全式金公司，产品目录号为CD601)，卡那霉素(终浓度为100mg/L)筛选培养，挑取单克隆，以AaCAD F和AaCAD R为引物PCR鉴定阳性克隆后，接种到200ml含有卡那霉素(100mg/L)LB培养基中，37℃200转/分钟培养至OD₆₀₀＝0.6，加入IPTG使其终浓度为1mmol/L，28℃诱导培养9小时。诱导培养结束后12000转/分钟离心2分钟收集菌体，适量Binding buffer重悬菌体，冰浴中超声破碎，然后12000转/分钟离心20分钟，将上清液转移至用Binding buffer平衡好的Ni-琼脂糖柱(购于Novogen公司)中，用5×柱体积Binding buffer洗柱，再用5×柱体积Washing buffer洗柱，最后用2.5ml Elution buffer洗脱目的蛋白，收集洗脱液。收集到的洗脱液经PD-10柱脱盐后，通过SDS-PAGE和Bradford法对蛋白纯度和浓度进行分析。实验设三次重复，结果取平均值。SDS-PAGE电泳图谱如图2所示(图2中，泳道1为未诱导的大肠杆菌BL21总蛋白；泳道2为未诱导的大肠杆菌BL21上清液；泳道3为IPTG诱导的含pETCAD质粒的大肠杆菌BL21总蛋白；泳道4为诱导的含pETCAD质粒的大肠杆菌BL21上清液；泳道5为纯化后的AaCAD蛋白；Marker：蛋白分子量标准)，从图2可见，重组蛋白AaCAD的分子量大小约为47kD。Bradford法测定的蛋白AaCAD的浓度约为0.2mg/ml。

同时以转入空载体pET30a的大肠杆菌作为对照，结果对照菌中没有得到目的蛋白。

Binding buffer的制备：将250mmol氯化钾、5mmol咪唑、2mmol巯基乙醇和pH 8.0的25mM Tris-HCL混合，用pH 8.0的25mM Tris-HCL定容至1L，得到binding buffer。

Washing buffer的制备：将250mmol氯化钾、20mmol咪唑、2mmol巯基乙醇和pH 8.0的25mM Tris-HCL混合，用pH 8.0的25mM Tris-HCL定容至1L，得到washing buffer。

Elution buffer的制备：将250mmol氯化钾、500mmol咪唑、2mmol巯基乙醇和pH 8.0的25mM Tris-HCL混合，用pH 8.0的25mM Tris-HCL定容至1L，得到elution buffer。

三、青蒿肉桂醇脱氢酶AaCAD蛋白功能验证

300μL标准酶促反应体系含0.1mM底物、0.5mM NADPH、2mM DTT和2.0μg纯化后的AaCAD蛋白，用0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)定容至300μL，得到酶反应体系。

0.1M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)的制备：称取1.21g Tris base，用去离子水溶解至大约100ml，用HCl调节pH至7.5，后用去离子水定容至100ml。

将上述反应体系置于30℃下反应5分钟后，加入终浓度为5％(体积百分含量)的乙酸，之后用150μL的正己烷抽提，涡旋振荡，并于10000g下离心20分钟。取上层液直接进行GC或HPLC分析。HPLC使用配有Agilent C18 reversecolumn(3.9×150mm)的安捷伦1200高效液相色谱系统(HPLC)来分析酶促反应产物。流动相为水(A)和甲醇(B)，A∶B为50∶50，流速为1.0ml/min，检测波长为260nm和340nm。将收集的物质进行质谱检测。质谱检测条件为：波谱范围设定在120-350；干燥气体流速，1.5L min^-1，CDL温度250℃，block温度200℃，probe电压+4.5kV。

GC检测条件为：DB-5(30m×0.25mm×0.25μm)柱，载气为氦气，恒流(1.0ml/min)，进样口温度290℃，进样量1μl，分流比10∶1。程序升温条件为：起始温度80℃，5℃/min，升至240℃，20℃/min，升至280℃，保持5min。GC-MS分析条件：DB-5(30m×0.25mm×0.25μm)柱，载气为氦气，恒流(1.0ml/min)，进样口温度290℃，进样量1μl，分流比10∶1。四级杆质谱离子化方式：EI离子源电压70eV，离子源温度200℃，扫描间歇0.5s，扫描速度1000AMU/s。

以芥子醛为底物进行酶促反应后反应产物的HPLC检测，标准品为芥子醇(纯度为80％，购自sigma公司，产品目录号为404586)和芥子醛(纯度为98％，购自sigma公司，产品目录号为382159)。检测结果如图3所示，图3中A1为芥子醛和芥子醇标准品的HPLC检测图谱，从图中可见，标准品中芥子醛的保留时间为3.5min，标准品中芥子醇的保留时间为2.Imin；图3中A2为反应产物的HPLC检测图谱，从图中可见，反应产物中芥子醛的保留时间为3.5min；芥子醇的保留时间为2.1min，与标准品中一致。

以松柏醛为底物进行酶促反应后反应产物的HPLC检测，标准品为松柏醛(纯度为98％，购自sigma公司，产品目录号为382051)和松柏醇(纯度为98％，购自sigma公司，产品目录号为223735)。检测结果如图4所示，图4中B 1为标准品的HPLC检测图谱，从图中可见，标准品中松柏醇的保留时间为2.9min，标准品中松柏醛的保留时间为3.7min；图4中B2为反应产物的HPLC检测图谱，从图中可见，反应产物中松柏醇的保留时间为2.8min；松柏醛的保留时间为3.7min，与标准品中一致。

以香叶醛为底物进行酶促反应后反应产物的GC检测，标准品为柠檬醛(包含香叶醛和橙花醛两种同分异构体的混合物，纯度为95％，购自sigma公司，产品目录号为c83007)和香叶醇(纯度为98，购自sigma公司，产品目录号为163333)。检测结果如图5所示，图5中A为标准品香叶醇的GC检测图谱，从图中可见，标准品中香叶醇的保留时间为5.6min；图5中B为标准品香叶醛的GC检测图谱，从图中可见，标准品中香叶醛和橙花醛两种同分异构体的保留时间分别为5.8min和5.2min；图5中C为反应产物中橙花醛和香叶醛的保留时间分别为5.2min和5.8min；香叶醇的保留时间为5.6min，与标准品中一致。

以青蒿醛为底物进行酶促反应后反应产物的GC检测，标准品为青蒿醛和青蒿醇(青蒿醛标准品和青蒿醇标准品均按照下述文献中的方法制备得到：Bertea CM，Freije JR，van der Woude H，Verstappen FW，Perk L，Marquez V，De Kraker JW，PosthumusMA，Jansen BJ，de Groot A，Franssen MC，Bouwmeester HJ.Identification of intermediatesand enzymes involved in the early steps of artemisinin biosynthesis in Artemisia annua.Planta Med 2005；71：40-47)。检测结果如图6所示，图6中A为标准品的HPLC检测图谱，从图中可见，标准品中青蒿醛的保留时间为14.1min，标准品中青蒿醇的保留时间为16min；图6中B为反应产物的GC检测图谱，从图中可见，反应产物中青蒿醛的保留时间为14.1min；青蒿醇的保留时间为16min，与标准品中一致。

上述结果表明，AaCAD蛋白具有典型的肉桂醇脱氢酶活性，在体外酶促反应体系中能够催化芥子醛、松柏醛和香叶醛形成芥子醇、松柏醇和香叶醇。同时，AaCAD蛋白还能体外催化青蒿醛还原为青蒿醇。

将转入空载体pET30a的大肠杆菌表达得到的产物进行上述酶活检测实验，结果未检测到任何酶活性。

四、青蒿肉桂醇脱氢酶酶基因AaCAD表达模式分析

用通用植物总RNA提取试剂盒(购自百泰克公司)提青蒿根(Root)、茎(Stem)、叶(Leaf)和花(Flower)总RNA。紫外定量后取1μg总RNA，用Promega第一链合成试剂盒进行反转录，以逆转录产物为模板，分别用Actin基因正义引物5′-AACTGG GAT GAC ATG GAG AAG ATA T-3’和反义引物5′-TCA CAC TTC ATG ATG GAGTTG TAG G-3’，AaCAD基因的正义引物5′-GAT GGA TCC ATG GGAAGC ATG AAAGAA GAA-3′和反义引物5′-GTA CTC GAG ATT TGT TGT TTC CTC TTC CAA-3’进行PCR，PCR条件为：94℃5min，1循环；94℃30s，56℃30s，72℃45s(Actin)或1min30S(AaCAD)，27循环；72℃10min，1循环。结果如图7所示，从图中可见，AaCAD基因在青蒿根和叶中大量表达，在花中表达居中，而在茎中表达量最低。

Claims (4)

1.由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质在催化青蒿醛形成青蒿醇中的应用。

2.序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因在催化青蒿醛形成青蒿醇中的应用；

所述编码基因为如下1）或2）所示：

1）其核苷酸序列是序列表中序列1自5′末端起第72位-第1257位核苷酸所示DNA分子；

2）其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子。

3.由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质在体外合成青蒿醇中的应用。

4.序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因在体外合成青蒿醇中的应用；

所述编码基因为如下1）或2）所示：

1）其核苷酸序列是序列表中序列1自5′末端起第72位-第1257位核苷酸所示DNA分子；

2）其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子。

Images