CN111763703A - 一种有机溶剂中酶法合成蔗糖-6-乙酯的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种有机溶剂中酶法合成蔗糖‑6‑乙酯的方法，所述方法为：将蔗糖加入有机溶剂中，再加入固定化脂肪酶和乙酸乙烯酯，混合均匀，在30‑40℃水浴摇床转速120‑180r/min，反应时间12‑20h，过滤，滤饼是回收的固定化脂肪酶，滤液真空蒸馏回收溶剂，得到蔗糖‑6‑乙酯产品。本发明采用N，N‑二甲基甲酰胺(DMF)作为酶法合成蔗糖‑6‑乙酯的主要溶剂，与叔戊醇或叔丁醇复合，与其他有机溶剂比，具有酶活保持较好，蔗糖溶解度可达10％，蔗糖酯化率高达85％以上，蔗糖‑6‑乙酯占总酯的比例85％以上，合成反应溶剂体系粘度较小，易回收的优点。

Description

一种有机溶剂中酶法合成蔗糖-6-乙酯的方法
(一)技术领域
本发明涉及一种有机溶剂中酶法合成蔗糖-6-乙酯的方法。
(二)背景技术
国内外在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中进行化学法合成蔗糖-6-乙酯，蔗糖溶解于DMF溶剂，与原乙酸三甲酯发生酯化反应，也可以在二丁基氧化锡催化下发生酯化反应。化学法对环境影响较大，而脂肪酶催化蔗糖酯化属绿色制造，发展前景理想。
蔗糖-6-乙酯为无热量高倍甜味剂三氯蔗糖生产的关键中间体，因而绿色安全的脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酯技术，国内外开展了大量的研究开发。为使蔗糖能较好的溶解，同时脂肪酶又能发挥催化活性，已报道的研究采用有机溶剂与水混合作为反应溶剂，或者以离子液体为反应溶剂，但蔗糖酯化率均在70％以下。采用二甲基亚砜复合中链醇作为蔗糖酯化反应溶剂，脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酯的效果较好。但二甲基亚砜对酶活影响比较严重，蔗糖在二甲基亚砜中溶解度不够大，二甲基亚砜粘度较大，增加了反应过程的操作难度。为此，研究较理想的有机溶剂进行酶法合成蔗糖-6-乙酯，目前成为国内外技术发明的热点。
(三)发明内容
本发明目的是为提高有机溶剂中酶法合成蔗糖-6-乙酯的酯化效率，提供一种有机溶剂中酶法合成蔗糖-6-乙酯的方法，替代目前化学法合成蔗糖-6-乙酯工艺，应用于无热量高倍甜味剂三氯蔗糖的生产，可以大幅减轻生产工艺对环境的影响，实现三氯蔗糖生产绿色改造。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种有机溶剂中酶法合成蔗糖-6-乙酯的方法，所述方法为：将蔗糖加入有机溶剂中，再加入固定化脂肪酶和乙酸乙烯酯，混合均匀，在30-40℃水浴、摇床转速120-180r/min下反应12-20h(优选30℃、160r/min反应16h)，过滤，滤饼是回收的固定化脂肪酶，滤液真空蒸馏回收溶剂，得到蔗糖-6-乙酯产品(蔗糖酯含量85％以上，蔗糖-6-乙酯占总酯85％以上)；所述有机溶剂是由N,N-二甲基甲酰胺与叔戊醇或叔丁醇以体积浓度55～30％:45～70％混合而成，总量100％；所述固定化脂肪酶是将脂肪酶采用大孔树脂吸附固定而成。
进一步，所述有机溶剂是由N,N-二甲基甲酰胺与叔戊醇以体积浓度55～30％:45～70％混合而成，总量100％。
进一步，所述有机溶剂体积加入量以蔗糖重量计为125-330ml/g(优选160-250ml/g)；所述蔗糖与固定化脂肪酶质量比为1：0.2-1.0(优选1：0.5-0.7)；所述蔗糖与乙酸乙烯酯质量比为1：1-5(优选1:2-4)。
进一步，所述固定化脂肪酶按如下方法制备：将脂肪酶溶解在去离子水中(搅拌使酶溶解，有不溶成分则离心去除，酶液中酶浓度控制在2-4mg/ml，加入十二水合磷酸氢二钠与磷酸二氢钠，搅拌均匀，形成0.05mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液的酶液，加入大孔树脂，在20-35℃保温，80-100转/分钟搅拌下，吸附1-3h(优选30℃、90转/分钟，吸附2h)，过滤，滤饼真空干燥(优选40℃)至含水量3～5％(优选4.0％)，得到固定化脂肪酶；所述去离子水体积用量以脂肪酶重量计为150-500ml/g(优选160-250ml/g)；所述脂肪酶与十二水合磷酸氢二钠和磷酸二氢钠质量比分别为1:0.5-1.5(优选1:0.7-1.1)和1:0.5-1.0(优选1:0.5-0.8)；所述脂肪酶与大孔树脂重量比为1：2-4。所述大孔树脂型号包括D4006型、D3520型、D1300型。
所述大孔树脂在加入酶液前先进行预处理，所述预处理方法为：将大孔树脂加入10倍质量的体积浓度95％乙醇水溶液，于室温(25-30℃)、150r/min的条件下震荡洗涤24小时，并于中途两次更换95％乙醇水溶液，震荡洗涤结束后，每次用两倍质量蒸馏水洗涤五次，抽滤，滤饼即为完成预处理的大孔树脂。
所述脂肪酶酶活为10-30万单位/克，优选黑曲霉脂肪酶或假丝酵母脂肪酶。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明采用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)作为酶法合成蔗糖-6-乙酯的主要溶剂，与叔戊醇或叔丁醇复合，与其他有机溶剂比，具有酶活保持较好，蔗糖溶解度可达10％，蔗糖酯化率高达85％以上，蔗糖-6-乙酯占总酯的比例85％以上，合成反应溶剂体系粘度较小，易回收的优点。溶剂对酶活影响较小，有适宜的粘度与沸点，适合酶法合成蔗糖-6-乙酯的反应操作。
(四)附图说明
图1牛血清蛋白的标准曲线。
图2为实施例1制备的蔗糖-6-乙酯液相色谱图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例中蔗糖购自广东省化学试剂工程技术研究开发中心(化学纯)，N，N-二甲基甲酰胺与叔戊醇均购自国药集团化学试剂有限公司(化学纯)；乙酸乙烯酯购自江苏永华精细化学品有限公司(化学纯)；本发明所述室温是指25-30℃。
实施例1：
1、脂肪酶的固定化
0.05mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液的配制：十二水合磷酸氢二钠8.7克与磷酸二氢钠6.1克，溶于去离子水2000毫升配成。
大孔树脂预处理：将D4006型大孔树脂(购自天津浩聚树脂科技有限公司)，加入10倍质量的体积浓度95％乙醇水溶液，于室温、150r/min的条件下震荡洗涤24小时，并于中途两次更换95％乙醇水溶液，震荡结束后，每次用两倍质量蒸馏水洗涤五次，抽滤，滤饼即为预处理的D4006型大孔树脂，备用。
将黑曲霉脂肪酶(Aspergillus niger lipase，深圳绿微康生物工程有限公司生产，30万单位/克)20克溶解在5000ml去离子水中，搅拌使酶溶解，有不溶成分则过滤去除。再加入十二水合磷酸氢二钠21.8克与磷酸二氢钠15.3克，搅拌均匀，形成0.05mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液的酶液。加入预处理的D4006型大孔树脂80克，在30℃保温，90转/分钟搅拌下，吸附2h，过滤，检测滤液中脂肪酶含量，计算得到固定化率94.3％；滤饼在40℃真空干燥至含水量4.7％，得到固定化脂肪酶57.8g。
脂肪酶含量的测定采用考马斯亮兰分光光度法，以考马斯亮兰试剂与酶蛋白溶液显色，在595nm处测定吸光度。以牛血清白蛋白为标准品作标准曲线，以标准曲线法得到酶蛋白含量。在大孔树脂吸附脂肪酶后，测定过滤分离出树脂后的滤液中酶蛋白的量，按：固定化率％＝(1-滤液中酶蛋白量/酶液中酶蛋白量)×100％，计算树脂固定化脂肪酶的固定化率，具体方法如下：
准确称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL体积浓度95％乙醇水溶液中，加入100mL体积浓度85％磷酸水溶液，用蒸馏水稀释至1000mL，配制得到考马斯亮蓝试剂。配制牛血清蛋白(BSA)标准溶液，在595nm处测定吸光度，根据表1制作标准曲线(图1)，各试管配制完毕，摇匀，室温下显色2min。在595nm处测定溶液的吸光度，并以吸光度A为纵坐标，蛋白含量为横坐标作图，标准曲线如图1所示。
由图1可知，其标准曲线方程为Y＝6.3014X-0.0062，R2＝0.9948。
表1牛血清蛋白标准曲线制作
Figure BDA0002566982840000031
Figure BDA0002566982840000041
固定化率的计算：测定初始酶液和树脂吸附后酶液的吸光值A1和A2，根据标准曲线分别计算蛋白含量X1和X2，继而算出总蛋白含量b1和b2。
b(mg)＝蛋白含量(X)/取样体积(ml)×酶液体积(mL)
固定化率计算公式如下：固定化率％＝(b1-b2)/b1×100％
2、蔗糖-6-乙酯的合成
N,N-二甲基甲酰胺与叔戊醇以体积浓度55％:45％的比例混合成复合溶剂1000ml，加入蔗糖100克，充分搅拌使蔗糖在复合溶剂中完全溶解，加入步骤1制备的固定化脂肪酶60克，再加入乙酸乙烯酯250克，混合均匀，35℃水浴摇床转速160r/min，反应时间20h，过滤分离出固定化脂肪酶，真空蒸馏回收溶剂，得到蔗糖乙酯化产品98.7g。进液相色谱分析，每组三个平行样。液相色谱检测结果，酯化率85.5％，蔗糖6位酯化选择率85.2％。
液相色谱检测方法：高效液相色谱HPLC(Agilent 1200Series)；色谱柱为ZORBAXSB-Aq(5μm，4.6×250mm)，检测器为蒸发光散射检测器Alltech-ELSD3300。流动相为7.0％甲醇水溶液，流速0.8mL/min，柱温30℃，进样量5μL；蒸发光检测器温度85℃，氮气流速1.5L/min。样品用叔戊醇适当稀释后，经45μm有机尼龙微孔滤膜过滤后进样分析，记录液相色谱图，利用归一法计算蔗糖酯化率和蔗糖-6-乙酯的质量含量。
酯化率％＝生成产物蔗糖酯的蔗糖量/初始蔗糖的量×100％
蔗糖-6-乙酯的质量含量(即选择率)％＝(蔗糖-6-乙酸酯的量/蔗糖总酯的量)×100％。
实施例2：
1、脂肪酶的固定化
将黑曲霉脂肪酶(Aspergillus niger lipase，购自南宁庞博生物工程有限公司，30万单位/克)20克溶解在5000ml去离子水中，搅拌使酶溶解，有不溶成分则过滤去除。加入十二水合磷酸氢二钠21.8克与磷酸二氢钠15.3克，搅拌均匀，形成0.05mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液的酶液。再加入预处理的D3520型大孔树脂(购自南开大学化工厂，预处理方法同实施例1)40克，在30℃保温，90转/分钟搅拌下，吸附3h，过滤，采用实施例1方法检测滤液脂肪酶含量，计算得到固定化率91.7％；滤饼40℃真空干燥至含水量3.2％，得到固定化脂肪酶36.9g。
2、蔗糖-6-乙酯的合成
将N,N-二甲基甲酰胺与叔戊醇以体积浓度40％:60％混合成复合溶剂1000ml，加入蔗糖65克，充分搅拌使蔗糖在复合溶剂中完全溶解，加入步骤1制备的固定化脂肪酶35克，再加入乙酸乙烯酯200克，混合均匀，30℃水浴摇床转速160r/min，反应时间16h，过滤分离出固定化脂肪酶，真空蒸馏回收溶剂，得到蔗糖乙酯产品66.8g。采用实施例1方法进液相色谱分析，每组三个平行样，酯化率88.3％，蔗糖6位酯化选择率87.6％。
实施例3：
1、脂肪酶的固定化
将假丝酵母脂肪酶(Candida rugosa lipase，北京凯泰新世纪生物技术有限公司生产，13万单位/克)30克溶解在5000ml去离子水中，搅拌使酶溶解，有不溶成分则过滤去除。加入十二水合磷酸氢二钠21.8克与磷酸二氢钠15.3克，搅拌均匀，形成0.05mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液的酶液。再加入实施例1方法预处理的D1300型大孔树脂(天津浩聚树脂科技有限公司)90克，在30℃保温，90转/分钟搅拌下，吸附2h，过滤，采用实施例1方法检测滤液脂肪酶含量，计算得到固定化率93.2％；滤饼40℃真空干燥至含水量4.1％，得到固定化脂肪酶73.6g。
2、蔗糖-6-乙酯的合成
将N,N-二甲基甲酰胺与叔戊醇以体积浓度30％:70％混合成复合溶剂1000ml，加入蔗糖30克，充分搅拌使蔗糖在复合溶剂中完全溶解；加入步骤1制备的固定化脂肪酶20克，再加入乙酸乙烯酯100克，混合均匀，40℃水浴摇床转速160r/min，反应时间12h，过滤分离出固定化脂肪酶，真空蒸馏回收溶剂，得到蔗糖乙酯产品26.6g。采用实施例1方法进液相色谱分析，每组三个平行样，酯化率85.1％，蔗糖6位酯化选择率85.2％。
实施例4：
1、脂肪酶的固定化
将黑曲霉脂肪酶(Aspergillus niger lipase，南宁庞博生物工程有限公司生产，30万单位/克)20克溶解在5000ml去离子水中，搅拌使酶溶解，有不溶成分则过滤去除。加入十二水合磷酸氢二钠21.8克与磷酸二氢钠15.3克，搅拌均匀，形成0.05mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液的酶液。加入实施例1方法预处理的D3520型大孔树脂(南开大学化工厂)50克，在30℃保温，90转/分钟搅拌下，吸附3h，过滤，采用实施例1方法检测滤液脂肪酶含量，计算得到固定化率92.4％；滤饼40℃真空干燥至含水量3.1％，得到固定化脂肪酶41.2g。
2、蔗糖-6-乙酯的合成
N,N-二甲基甲酰胺与叔丁醇以体积浓度40％:60％混合成复合溶剂1000ml，加入蔗糖65克，充分搅拌使蔗糖在复合溶剂中完全溶解，加入步骤1制备的固定化脂肪酶35克，再加入乙酸乙烯酯250克，混合均匀，30℃水浴摇床转速160r/min，反应时间16h，过滤分离出固定化酶，真空蒸馏回收溶剂，得到蔗糖-乙酯产品65.7g。采用实施例1方法进液相色谱分析，每组三个平行样，酯化率85.7％，蔗糖6位酯化选择率85.2％。
对比例1：
1、脂肪酶的固定化
将黑曲霉脂肪酶(Aspergillus niger lipase，南宁庞博生物工程有限公司生产，30万单位/克)20克溶解在5000ml去离子水中，搅拌使酶溶解，有不溶成分则过滤去除。加入十二水合磷酸氢二钠21.8克与磷酸二氢钠15.3克，搅拌均匀，形成0.05mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液的酶液。再加入实施例1方法预处理的D3520型大孔树脂(南开大学化工厂)50克，在30℃保温，90转/分钟搅拌下，吸附3h，过滤，采用实施例1方法检测滤液脂肪酶含量，计算得到固定化率92.4％；滤饼40℃真空干燥至含水量3.1％，得到固定化脂肪酶41.2g。
2、蔗糖-6-乙酯的合成
二甲基亚砜与叔戊醇以体积浓度40％:60％混合成复合溶剂1000ml，加入蔗糖65克，充分搅拌使蔗糖在复合溶剂中完全溶解，加入步骤1制备的固定化脂肪酶40克，再加入乙酸乙烯酯250克，混合均匀，35℃水浴摇床转速160r/min，反应时间16h，过滤分离出固定化酶，真空蒸馏回收溶剂，得到蔗糖乙酯化产品31.7g。采用实施例1方法进液相色谱分析，每组三个平行样，酯化率46.7％，蔗糖6位酯化选择率88.3％。
对比例2：
1、脂肪酶的固定化
将黑曲霉脂肪酶(Aspergillus niger lipase，南宁庞博生物工程有限公司生产，30万单位/克)20克溶解在5000ml去离子水中，搅拌使酶溶解，有不溶成分则过滤去除。加入十二水合磷酸氢二钠21.8克与磷酸二氢钠15.3克，搅拌均匀，形成0.05mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液的酶液。加入实施例1方法预处理的D3520型大孔树脂(南开大学化工厂)50克，在30℃保温，90转/分钟搅拌下，吸附3h，过滤，采用实施例1方法检测滤液脂肪酶含量，计算得到固定化率92.4％；滤饼40℃真空干燥至含水量3.1％，得到固定化脂肪酶41.2g。
2、蔗糖-6-乙酯的合成
二甲亚砜与叔戊醇以体积浓度30％:70％混合成复合溶剂1000ml，加入蔗糖35克，充分搅拌使蔗糖在复合溶剂中完全溶解，加入步骤1制备的固定化脂肪酶30克，再加入乙酸乙烯酯250克，混合均匀，30℃水浴摇床转速160r/min，反应时间16h，过滤分离出固定化酶，真空蒸馏回收溶剂，得到蔗糖乙酯产品18.7g。采用实施例1方法进液相色谱分析，每组三个平行样，酯化率51.4％，蔗糖6位酯化选择率86.8％。
对比例3：
1、脂肪酶的固定化
将黑曲霉脂肪酶(Aspergillus niger lipase，南宁庞博生物工程有限公司生产，30万单位/克)20克溶解在5000ml去离子水中，搅拌使酶溶解，有不溶成分则过滤去除。加入十二水合磷酸氢二钠21.8克与磷酸二氢钠15.3克，搅拌均匀，形成0.05mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液的酶液。加入实施例1方法预处理的D3520型大孔树脂(南开大学化工厂)50克，在30℃保温，90转/分钟搅拌下，吸附3h，过滤，采用实施例1方法检测滤液脂肪酶含量，计算得到固定化率92.4％；滤饼40℃真空干燥至含水量3.1％，得到固定化脂肪酶41.2g。
2、蔗糖-6-乙酯的合成
四氢呋喃与叔戊醇以体积浓度30％:70％混合成复合溶剂1000ml，加入蔗糖25克，充分搅拌使蔗糖在复合溶剂中完全溶解，加入步骤1制备的固定化脂肪酶25克，再加入乙酸乙烯酯250克，混合均匀，30℃水浴摇床转速160r/min，反应时间16h，过滤分离出固定化酶，真空蒸馏回收溶剂，得到蔗糖乙酯产品9.6g。采用实施例1方法进液相色谱分析，每组三个平行样，酯化率36.8％，蔗糖6位酯化选择率65.7％。

Claims (9)

1.一种有机溶剂中酶法合成蔗糖-6-乙酯的方法，其特征在于所述方法为：将蔗糖加入有机溶剂中，再加入固定化脂肪酶和乙酸乙烯酯，混合均匀，在30-40℃水浴、摇床转速120-180r/min下反应12-20h，过滤，滤饼回收固定化脂肪酶，滤液真空蒸馏回收溶剂，得到蔗糖-6-乙酯产品；所述有机溶剂是由N,N-二甲基甲酰胺与叔戊醇或叔丁醇以体积浓度55～30％:45～70％混合而成，总量100％；所述固定化脂肪酶是将脂肪酶采用大孔树脂吸附固定而成。
2.如权利要求1所述有机溶剂中酶法合成蔗糖-6-乙酯的方法，其特征在于所述有机溶剂是由N,N-二甲基甲酰胺与叔戊醇以体积浓度55～30％:45～70％混合而成，总量100％。
3.如权利要求1所述有机溶剂中酶法合成蔗糖-6-乙酯的方法，其特征在于所述有机溶剂体积加入量以蔗糖重量计为125-330ml/g；所述蔗糖与固定化脂肪酶质量比为1：0.2-1.0；所述蔗糖与乙酸乙烯酯质量比为1：1-5。
4.如权利要求1所述有机溶剂中酶法合成蔗糖-6-乙酯的方法，其特征在于所述脂肪酶酶活为10-30万单位/克。
5.如权利要求4所述有机溶剂中酶法合成蔗糖-6-乙酯的方法，其特征在于脂肪酶为黑曲霉脂肪酶或假丝酵母脂肪酶。
6.如权利要求1所述有机溶剂中酶法合成蔗糖-6-乙酯的方法，其特征在于所述大孔树脂型号包括D4006型、D3520型、D1300型。
7.如权利要求1所述有机溶剂中酶法合成蔗糖-6-乙酯的方法，其特征在于所述固定化脂肪酶按如下方法制备：将脂肪酶溶解在去离子水中，加入十二水合磷酸氢二钠与磷酸二氢钠，搅拌均匀，形成0.05mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液的酶液，加入大孔树脂，在20-35℃保温，80-100转/分钟搅拌下，吸附1-3h，过滤，滤饼真空干燥至含水量3～5％，得到固定化脂肪酶。
8.如权利要求7所述有机溶剂中酶法合成蔗糖-6-乙酯的方法，其特征在于所述去离子水体积用量以脂肪酶重量计为150-500ml/g；所述脂肪酶与十二水合磷酸氢二钠和磷酸二氢钠质量比分别为1:0.5-1.5和1：1:0.5-1.0；所述脂肪酶与大孔树脂重量比为1：2-4。
9.如权利要求7所述有机溶剂中酶法合成蔗糖-6-乙酯的方法，其特征在于所述大孔树脂在加入酶液前先进行预处理，所述预处理方法为：将大孔树脂加入10倍质量的体积浓度95％乙醇水溶液，于室温、150r/min的条件下震荡洗涤24小时，并于中途两次更换95％乙醇水溶液，震荡洗涤结束后，每次用两倍质量蒸馏水洗涤五次，抽滤，滤饼即为完成预处理的大孔树脂。
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