CN113308506B - 一种生物催化合成二氢杨梅素-7-葡萄糖苷的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生物催化合成二氢杨梅素‑7‑葡萄糖苷的方法。该方法包括：向含糖类物质的诱导培养基中接种真菌，第一次培养后，离心取沉淀，得到第一次培养后的真菌，再接种至含酚苷类化合物的诱导培养基中进行第二次培养，离心取沉淀，得到全细胞催化剂；将全细胞催化剂加入到含有二氢杨梅素和淀粉的缓冲溶液混合液中，进行糖基化反应，可生成所述二氢杨梅素‑7‑葡萄糖苷。该方法能够高效、高选择性合成二氢杨梅素葡萄糖苷衍生物，解决目前糖基转移酶种类较少价格昂贵以及难以反应等问题，且该方法操作简单，成本较低，适合于工业化生产。

Description

一种生物催化合成二氢杨梅素-7-葡萄糖苷的方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种生物催化合成二氢杨梅素-7-葡萄糖苷的方法。
背景技术
二氢杨梅素是一种天然黄酮类化合物，多提取自葡萄科蛇葡萄属的藤茶植物。二氢杨梅素具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抑菌、降血脂和护肝等作用。二氢杨梅素虽然在热水中的溶解性较好，但是在室温中水溶性不高的问题限制了研究其研究发展。在25℃时，在水中的溶解度仅为0.67mM。同时由于二氢杨梅素是多酚羟基化合物，稳定性较差，在应用过程中，特别是暴露于光下时，易氧化分解，形成彩色的光解产物，影响了功效的发挥。
目前已经有各种技术来改善二氢杨梅素的水溶性差的问题，比如固体分散技术、环糊精包埋技术和糖基化。二氢杨梅素-7-葡萄糖苷是二氢杨梅素的糖基化产物，比二氢杨梅素有着更好的水溶性和药理作用。目前对于二氢杨梅素糖基化的方法比较少。杨悟新以葡萄糖、乳糖为原料进行溴代乙酰化修饰分别得到溴代四乙酰化葡萄糖、溴代七乙酰化乳糖，再将其与二氢杨梅素发生糖苷化和去乙酰化，生成二氢杨梅素-2-葡萄糖苷和二氢杨梅素-2-乳糖苷。整个反应由于溴代衍生物在常温下极易分解，故对于反应温度要求严格；另外还存在对环境不友好且纯化难度高等问题。Hye-Jin Woo等利用肠膜肠球菌B-1299CB4所制得的葡聚糖转移酶催化合成了二氢杨梅素-4’-O-α-D-葡萄糖，但是需要进一步合成和纯化葡聚糖转移酶，可能不利于工业化生产(Synthesis and characterization ofampelopsinglucosides using dextransucrase from Leuconostocmesenteroides B-1299CB4:Glucosylation enhancing physicochemical properties)。因此，亟待开发一种低成本、低污染的制备高纯度二氢杨梅素葡萄糖苷的新方法。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种生物催化合成二氢杨梅素-7-葡萄糖苷的方法。
本发明提供的方法，是通过加入特异性诱导剂制备全细胞催化剂，制备二氢杨梅素葡萄糖苷。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提供的生物催化合成二氢杨梅素-7-葡萄糖苷的方法，是通过添加特异性糖类和酚苷类作为诱导剂，通过二次诱导培养微生物细胞，制备具有催化二氢杨梅素糖苷化活性的全细胞催化剂，然后将全细胞催化剂加入到含二氢杨梅和可溶性淀粉的混合液中，混合均匀后，进行糖基化反应，得到所述二氢杨梅素-7-葡萄糖苷。
本发明提供的生物催化合成二氢杨梅素-7-葡萄糖苷的方法，包括如下步骤：
(1)向含糖类物质的诱导培养基中接种真菌，进行第一次培养处理，离心取沉淀，得到第一次培养后的真菌，然后再将所述第一次培养后的真菌接种至含酚苷类化合物的诱导培养基中，进行第二次培养处理，离心取沉淀，得到全细胞催化剂；
(2)将二氢杨梅素、淀粉与缓冲溶液混合均匀，得到混合液，往所述混合液中加入步骤(1)所述全细胞催化剂，进行糖基化反应，得到所述二氢杨梅素-7-葡萄糖苷。
进一步地，步骤(1)所述糖类物质为葡萄糖、蔗糖、果糖中的一种以上；
进一步地，在步骤(1)所述含糖类物质的诱导培养基中，糖类物质的浓度为5.0～15.0g/L；
进一步地，步骤(1)所述含酚苷类化合物为二氢杨梅素和杨梅素中的一种以上；
进一步地，在步骤(1)所述含酚苷类化合物的诱导培养基中，含酚苷类化合物的浓度为5.0～15.0g/L。
进一步地，步骤(1)所述含糖类物质的诱导培养基与含酚苷类化合物的诱导培养基的pH值均为4.0～8.0。
进一步地，所述诱导培养基，按照体积为1升计，包括：5.0～15.0g/L的糖类或酚苷类、2.5～10g/L的硫酸镁、5～25g/L的酵母浸膏、2.5～10g/L的磷酸氢二钠、2.5～10g/L的磷酸二氢钾、2.5～10g/L的无水氯化钙，余者为水；
优选地，步骤(1)所述发酵培养基，按照体积为1升计，包括：5.0g/L的蔗糖或二氢杨梅素、5g/L的硫酸镁、10g/L的酵母浸膏、5g/L的磷酸氢二钠、5g/L的磷酸二氢钾、5g/L的无水氯化钙，余者为水。
进一步地，步骤(1)所述真菌为曲霉、根霉、酵母中的一种以上；
优选地，所述曲霉为黑曲霉(Aspergllusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)等中的一种以上；所述根霉为米根霉(Rhizopusoryzae Went et Pr.Geerl.)、黑根霉(Rhizopusnigricans)等中的一种及以上；所述酵母为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、假丝酵母(Moniliaalbican)等中的一种及以上。
进一步地，步骤(1)所述向含糖类物质的诱导培养基中接种真菌，包括：将真菌分散均匀于无菌水中，得到真菌悬浮液，然后将真菌悬浮液接种至含糖类物质的诱导培养基中；
优选地，所述真菌悬浮液的细胞密度为1.0×106～1.0×108CFU/mL；
优选地，所述真菌悬浮液的体积为含糖类物质的诱导培养基体积的1～20％；
进一步地，步骤(1)所述第一次培养后的真菌接种至含酚苷类化合物的诱导培养基中，包括：将第一次培养后的真菌分散均匀于无菌水中，得到第一次培养后的真菌悬浮液，然后将第一次培养后的真菌悬浮液接种至含酚苷类化合物的诱导培养基中；
优选地，所述第一次培养后的真菌悬浮液的细胞密度为1.0×106～1.0×108CFU/mL；
优选地，所述第一次培养后的真菌悬浮液的体积为含酚苷类化合物的诱导培养基体积的1～20％。
进一步地，步骤(1)所述第一次培养处理的转速为100～1000r/min，第一次培养处理的温度为20～45℃，第一次培养处理的的时间为12～72h；
进一步地，步骤(1)所述第二次培养处理的转速为100～1000r/min，第二次培养处理的温度为20～45℃，第二次培养处理的的时间为12～72h。
进一步地，步骤(1)所述离心的转速均为3000～12000rpm，离心的时间均为5～40min。
本发明步骤(1)所述全细胞催化剂可以通过真空冷冻干燥，制备得到干燥的催化剂后参与步骤(2)的糖基化反应，也可以不干燥，直接采用湿菌体的状态进行步骤(2)的反应。其中冷冻干燥方式更易保存和操作。
进一步地，步骤(2)所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液中的一种；
优选地，步骤(2)所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液。
进一步地，步骤(2)所述缓冲溶液的pH值为4.0～8.0；
优选地，步骤(2)所述缓冲溶液的pH值为7.4。
进一步地，步骤(2)所述淀粉为可溶性淀粉；
进一步地，步骤(2)所述二氢杨梅素与淀粉的质量比为1:5～1:30；
进一步地，步骤(2)所述二氢杨梅素与缓冲溶液的质量体积比为0.04:2.4～0.04:6g/ml。
优选地，步骤(2)所述二氢杨梅素与缓冲溶液的质量体积比为0.04:1.2-2.4g/ml。
进一步优选地，步骤(2)所述二氢杨梅素与缓冲溶液的质量体积比为0.04:2.4g/mL。
进一步地，步骤(2)所述二氢杨梅素与全细胞催化剂的质量比为1:1～1:4；
进一步地，步骤(2)所述糖基化反应的温度为30～65℃，糖基化反应的间为1～72h。
优选地，步骤(2)所述糖基化反应是在摇床柜中进行的。
进一步优选地，步骤(2)所述糖基化反应是在转速为160rpm的摇床柜中进行的。
进一步地，步骤(2)中，往混合液加入有机溶剂，再加入所述全细胞催化剂，进行糖基化反应，得到所述二氢杨梅素-7-葡萄糖苷；
优选地，所述有机溶剂为四氢呋喃、乙腈、乙醇中的一种以上；
优选地，所述有机溶剂与缓冲溶液的体积比为1:1～1:4(v/v)。
优选地，步骤(2)进行糖基化反应以后，离心去除菌体细胞，然后对糖基化反应的产物进行分离纯化，得到所述二氢杨梅素-7-葡萄糖苷；所述离心的转速为8000rpm，离心的时间为10min。
进一步优选地，在步骤(2)中，糖基化的产物可通过TLC、制备型液相色谱等方式进行分离纯化。
上述全细胞催化剂处理二氢杨梅素后，生成二氢杨梅素-7-O-葡萄糖苷，选择性达到90％以上，底物转化率90％以上。
本发明通过建立全细胞催化体系，将二氢杨梅素溶于有机溶剂中，将可溶性淀粉溶于缓冲溶液中，再加入全细胞催化剂，进行糖基化反应，接着通过分离纯化即可得到所述二氢杨梅素-7-葡萄糖苷。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明提供的生物催化合成二氢杨梅素-7-葡萄糖苷的方法，利用全细胞催化二氢杨梅素糖基化，制备出有着更好的水溶性和药理作用的糖苷，该方法中底物转化率可达90％以上。产物专一性达90％，底物转化率高于90％。
(2)与化学法相比，本发明提供的生物催化合成二氢杨梅素-7-葡萄糖苷的方法具有底物转化率高，反应选择性好，条件温和，环境友好，制备简单且稳定性好，可重复利用且价格低廉等优点。
附图说明
图1为实施例1步骤(3)所述糖基化反应的时间为0h时，反应体系底物检测液相色谱图；
图2为实施例1步骤(3)所述糖基化反应的时间为24h时，反应体系产物检测液相色谱图；
图3为实施例2步骤(3)所述糖基化反应的时间为24h时，反应体系产物检测液相色谱图；
图4为实施例3步骤(3)所述糖基化反应的时间为24h时，反应体系产物检测液相色谱图；
图5为实施例1中反应体系产物的LC-MS图；
图6为实施例1中得到的二氢杨梅素-7-O-葡萄糖苷的结构示意图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
以下实施例中所采用的检测方法为HPLC测定方法。
所述HPLC测定方法采用的色谱柱：Agilent C18(250mm×4.6mm)；
流动相：体积百分比浓度为35％甲醇溶液，流动相的流速为0.9mL/min，
检测波长：290nm，进样量20μL，柱温30℃的条件下，进行等度洗脱。
实施例1
一种生物催化合成二氢杨梅素-7-葡萄糖苷的方法，包括如下步骤：
(1)含糖类物质的诱导培养基及含酚苷类化合物的诱导培养基的制备
将糖类(选用蔗糖)加入诱导培养基中，混合均匀，得到含糖类物质的诱导培养基，所述含糖类物质的诱导培养基包括：5.0g/L的蔗糖、5.0g/L的硫酸镁、10.0g/L的酵母浸膏、5.0g/L的磷酸氢二钠、5.0g/L的磷酸二氢钾、5.0g/L的无水氯化钙，余者为水，所述含糖类物质的诱导培养基的pH为6.0；
将酚苷类化合物(选用二氢杨梅素)加入诱导培养基中，混合均匀，得到含酚苷类化合物的诱导培养基，所述含酚苷类化合物的诱导培养基包括：15.0的二氢杨梅素、5.0g/L的硫酸镁、10.0g/L的酵母浸膏、5.0g/L的磷酸氢二钠、5.0g/L的磷酸二氢钾、5.0g/L的无水氯化钙，余者为水，所述含糖类物质的诱导培养基的pH为6.0；
(2)全细胞催化剂的制备
将黑曲霉(Aspergllusniger)进行活化后，用无菌水分散黑曲霉的孢子，得到黑曲霉悬浮液，其细胞密度为1.0×106CFU/mL，然后往步骤(1)所述诱导培养基中接种黑曲霉悬浮液，黑曲霉悬浮液的体积为含糖类物质的诱导培养基体积的2％，进行第一次培养处理(摇瓶培养)，第一次培养处理的温度为35℃，第一次培养处理的时间为48h，第一次培养处理的转速为160rpm，然后进行离心处理(转速为8000rpm的条件下离心30min)取沉淀，用磷酸缓冲液(pH7.4)洗涤沉淀3次，以去除菌体残留的培养基，得到第一次培养后的真菌；
接着用无菌水分散所述第一次培养后的真菌，得到第一次培养后的真菌悬浮液(细胞密度为1.0×106CFU/mL)，然后往步骤(1)所述含酚苷类化合物的诱导培养基中接种第一次培养后的真菌悬浮液，第一次培养后的真菌悬浮液的体积为含酚苷类化合物的诱导培养基体积的2％，进行第二次培养处理(摇瓶培养)，第二次培养处理的温度为35℃，第二次培养处理的时间为48h，第二次培养处理的转速为160rpm，然后进行离心处理(转速为8000rpm的条件下离心30min)取沉淀，用磷酸缓冲液(pH7.4)洗涤沉淀3次，以去除菌体残留的培养基，在温度为-45℃的条件下真空冷冻干燥24h，得到所述全细胞催化剂；
(3)糖基化反应
在锥形瓶中加入40mg的二氢杨梅素、180mg的可溶性淀粉与2.4mL的缓冲溶液(乙酸钠缓冲液，pH为7.4)及1.2mL的四氢呋喃，在旋涡振荡仪上振荡溶解以混合均匀，得到混合液，往所述混合液中加入45mg的步骤(1)所述全细胞催化剂，置于摇床柜中进行糖基化反应(摇床的转速为160rpm)，糖基化反应的温度为50℃，糖基化反应的时间为48h，得到反应液，所述反应液中含有所述二氢杨梅素-7-葡萄糖苷。
得到的二氢杨梅素-7-葡萄糖苷结构式如图6所示。
效果验证
在不同的糖基化反应时间段(0,6,9,12,24,36,48h)取反应液20μL，用色谱级甲醇稀释50倍，8000rpm离心10min后取上清液，过0.22μm有机相滤膜，进行HPLC分析(色谱柱：Agilent C18(250mm×4.6mm)；流动相：35％甲醇，以流速为0.9mL/min，检测波长：290nm，进样量20μL，柱温30℃的条件下，进行等度洗脱)。在反应前0h取样的HPLC分析如图1所示，仅可以发现唯一的二氢杨梅素峰，在反应时间24h取样的HPLC分析如图2所示，可发现原二氢杨梅素的峰面积减少，在6分钟有新的二氢杨梅素-7-葡萄糖苷峰生成，可知该全细胞催化剂对于二氢杨梅素具有较高的转化率(90％以上)。由图5可鉴定产物为二氢杨梅素-7-葡萄糖苷(M:482)。
实施例2
一种生物催化合成二氢杨梅素-7-葡萄糖苷的方法，包括如下步骤：
(1)含糖类物质的诱导培养基及含酚苷类化合物的诱导培养基的制备
将糖类(选用葡萄糖)加入诱导培养基中，混合均匀，得到含糖类物质的诱导培养基，所述含糖类物质的诱导培养基包括：10.0g/L的葡萄糖、5.0g/L的硫酸镁、10.0g/L的酵母浸膏、5.0g/L的磷酸氢二钠、5.0g/L的磷酸二氢钾、5.0g/L的无水氯化钙，余者为水，所述含糖类物质的诱导培养基的pH为7.4；
将酚苷类化合物(选用二氢杨梅素)加入诱导培养基中，混合均匀，得到含酚苷类化合物的诱导培养基，所述含酚苷类化合物的诱导培养基包括：10.0g/L的二氢杨梅素、5.0g/L的硫酸镁、10.0g/L的酵母浸膏、5.0g/L的磷酸氢二钠、5.0g/L的磷酸二氢钾、5.0g/L的无水氯化钙，余者为水，所述含酚苷类化合物的诱导培养基的pH为7.4；
(2)将假丝酵母(C.parapsilosis)进行活化后，用无菌水分散假丝酵母的孢子，得到假丝酵母悬浮液，其细胞密度为1.0×106CFU/mL，然后往步骤(1)所述含糖类物质的诱导培养基中接种假丝酵母悬浮液，假丝酵母悬浮液的体积为含糖类物质的诱导培养基体积的3％，进行第一次培养处理(摇瓶培养)，第一次培养处理的温度为40℃，第一次培养处理的时间为40h，第一次培养处理的转速为160rpm，离心处理(转速为10000rpm的条件下离心30min)取沉淀，用磷酸缓冲液(pH7.4)洗涤沉淀3次，以去除菌体残留的培养基，得到第一次培养后的真菌；
接着用无菌水分散所述第一次培养后的真菌，得到第一次培养后的真菌悬浮液(细胞密度为1.0×106CFU/mL)，然后往步骤(1)所述含酚苷类化合物的诱导培养基中接种第一次培养后的真菌悬浮液，第一次培养后的真菌悬浮液的体积为含酚苷类化合物的诱导培养基体积的3％，进行第二次培养处理(摇瓶培养)，第二次培养处理的温度为40℃，第二次培养处理的时间为40h，第二次培养处理的转速为160rpm，然后进行离心处理(转速为10000rpm的条件下离心30min)取沉淀，用磷酸缓冲液(pH7.4)洗涤沉淀3次，以去除菌体残留的培养基，在温度为-45℃的条件下真空冷冻干燥24h，得到所述全细胞催化剂；
(3)糖基化反应
在锥形瓶中加入40mg的二氢杨梅素、360mg的可溶性淀粉、3.6mL的缓冲溶液(乙酸钠缓冲液，pH为7.4)及1.2mL的四氢呋喃，在旋涡振荡仪上振荡溶解以混合均匀，得到混合液，往所述混合液中加入80mg的步骤(1)所述全细胞催化剂，置于摇床柜中进行糖基化反应(摇床的转速为160rpm)，糖基化反应的温度为50℃，糖基化反应的时间为48h，得到反应液，所述反应液中含有所述二氢杨梅素-7-葡萄糖苷。
得到的二氢杨梅素-7-葡萄糖苷结构式如图6所示。
效果验证
在不同的糖基化反应时间段(0,6,9,12,24,36,48h)取反应液20μL，用色谱级甲醇稀释50倍，8000rpm离心10min后取上清液，过0.22μm有机相滤膜，进行HPLC分析(色谱柱：Agilent C18(250mm×4.6mm)；流动相：35％甲醇，以流速为0.9mL/min，检测波长：290nm，进样量20μL，柱温30℃的条件下，进行等度洗脱)。参照图1所示，在反应前0h取样的HPLC分析中仅可以发现唯一的二氢杨梅素峰，在反应时间24h取样的HPLC分析可参照图3所示，发现原二氢杨梅素的峰面积减少，有新的二氢杨梅素-7-葡萄糖苷峰生成，可计算得到底物转化率可达到90％以上。鉴定产物为二氢杨梅素-7-葡萄糖苷(M:482)，可参照图5所示。
实施例3
一种生物催化合成二氢杨梅素-7-葡萄糖苷的方法，包括如下步骤：
(1)含糖类物质的诱导培养基及含酚苷类化合物的诱导培养基的制备
将糖类(选用果糖)加入诱导培养基中，混合均匀，得到含糖类物质的诱导培养基，所述含糖类物质的诱导培养基包括：5.0g/L的果糖、2.5g/L的硫酸镁、25.0g/L的酵母浸膏、25.0g/L的磷酸氢二钠、2.5g/L的磷酸二氢钾、2.5g/L的无水氯化钙，余者为水，所述含糖类物质的诱导培养基的pH为6.0；
将酚苷类化合物(选用杨梅素)加入诱导培养基中，混合均匀，得到含酚苷类化合物的诱导培养基，所述含酚苷类化合物的诱导培养基包括：5.0g/L的杨梅素、2.5g/L的硫酸镁、25.0g/L的酵母浸膏、2.5g/L的磷酸氢二钠、2.5g/L的磷酸二氢钾、2.5g/L的无水氯化钙，余者为水，所述含酚苷类化合物的诱导培养基的pH为6.0；
(2)全细胞催化剂的制备
将黑曲霉(Aspergllusniger)进行活化后，用无菌水分散黑曲霉的孢子，得到黑曲霉悬浮液，其细胞密度为1.0×106CFU/mL，然后往步骤(1)所述诱导培养基中接种黑曲霉悬浮液，黑曲霉悬浮液的体积为含糖类物质的诱导培养基体积的5％，进行第一次培养处理(摇瓶培养)，第一次培养处理的温度为37℃，第一次培养处理的时间为24h，第一次培养处理的转速为160rpm，然后进行离心处理(转速为8000rpm的条件下离心30min)取沉淀，用磷酸缓冲液(pH7.4)洗涤沉淀3次，以去除菌体残留的培养基，得到第一次培养后的真菌；
接着用无菌水分散所述第一次培养后的真菌，得到第一次培养后的真菌悬浮液(细胞密度为1.0×106CFU/mL)，然后往步骤(1)所述含酚苷类化合物的诱导培养基中接种第一次培养后的真菌悬浮液，第一次培养后的真菌悬浮液的体积为含酚苷类化合物的诱导培养基体积的5％，进行第二次培养处理(摇瓶培养)，第二次培养处理的温度为37℃，第二次培养处理的时间为24h，第二次培养处理的转速为160rpm，然后进行离心处理(转速为8000rpm的条件下离心30min)取沉淀，用磷酸缓冲液(pH7.4)洗涤沉淀3次，以去除菌体残留的培养基，在温度为-45℃的条件下真空冷冻干燥24h，得到所述全细胞催化剂；
(3)糖基化反应
在锥形瓶中加入40mg的二氢杨梅素、180mg的可溶性淀粉、2.4mL的缓冲溶液(乙酸钠缓冲液，pH为7.4)及1.2mL的四氢呋喃，在旋涡振荡仪上振荡溶解以混合均匀，得到混合液，往所述混合液中加入120mg的步骤(1)所述全细胞催化剂，置于摇床柜中进行糖基化反应(摇床的转速为160rpm)，糖基化反应的温度为50℃，糖基化反应的时间为48h，得到反应液，所述反应液中含有所述二氢杨梅素-7-葡萄糖苷。
得到的二氢杨梅素-7-葡萄糖苷结构式如图6所示。
效果验证
在不同的糖基化反应时间段(0,6,9,12,24,36,48h)取反应液20μL，用色谱级甲醇稀释50倍，8000rpm离心10min后取上清液，过0.22μm有机相滤膜，进行HPLC分析(色谱柱：Agilent C18(250mm×4.6mm)；流动相：35％甲醇，以流速为0.9mL/min，检测波长：290nm，进样量20μL，柱温30℃的条件下，进行等度洗脱)。参照图1所示，在反应前0h取样的HPLC分析中仅可以发现唯一的二氢杨梅素峰，在反应时间24h取样的HPLC分析可参照图4所示，可发现原二氢杨梅素的峰面积减少，有新的二氢杨梅素-7-葡萄糖苷峰生成，可知该全细胞催化剂对于二氢杨梅素具有较高的转化率(90％以上)。鉴定产物为二氢杨梅素-7-葡萄糖苷(M:482)，可参照图5所示。
对比例1
一种生物催化合成二氢杨梅素-7-葡萄糖苷的方法，包括如下步骤：
(1)诱导培养基的制备
配置诱导培养基，所述诱导培养基包括：5.0g/L的硫酸镁、10.0g/L的酵母浸膏、5.0g/L的磷酸氢二钠、5.0g/L的磷酸二氢钾、5.0g/L的无水氯化钙，余者为水，所述诱导培养基的pH为6.0；所述诱导培养基中不加入糖类；
(2)将黑曲霉(Aspergllusniger)进行活化后，用无菌水分散黑曲霉的孢子，得到黑曲霉悬浮液，其细胞密度为1.0×106CFU/mL，然后往步骤(1)所述诱导培养基中接种黑曲霉悬浮液，黑曲霉悬浮液的体积为诱导培养基体积的2％，进行摇瓶培养，摇瓶培养的温度为35℃，摇瓶培养的时间为48h，摇瓶培养的转速为160rpm，离心处理(转速为8000rpm的条件下离心30min)取沉淀，用磷酸缓冲液(pH7.4)洗涤沉淀3次，以去除菌体残留的培养基，接着在温度为-45℃的条件下真空冷冻干燥24h，得到全细胞催化剂；
(3)糖基化反应
在锥形瓶中加入40mg的二氢杨梅素、180mg的可溶性淀粉、2.4mL的缓冲溶液(乙酸钠缓冲液，pH为7.4)及1.2mL的四氢呋喃，在旋涡振荡仪上振荡溶解以混合均匀，得到混合液，往所述混合液中加入80mg的步骤(1)所述全细胞催化剂，置于摇床柜中进行糖基化反应(摇床的转速为160rpm)，糖基化反应的温度为50℃，糖基化反应的时间为48h，得到反应液。
效果验证
在不同的糖基化反应时间段(0,6,9,12,24,36,48h)取反应液20μL，用色谱级甲醇稀释50倍，8000rpm离心10min后取上清液，过0.22μm有机相滤膜，进行HPLC分析(色谱柱：Agilent C18(250mm×4.6mm)；流动相：35％甲醇，以流速为0.9mL/min，检测波长：290nm，进样量20μL，柱温30℃的条件下，进行等度洗脱)。在反应前后未发现如图2所示的二氢杨梅素-7-葡萄糖苷峰，可知未加糖类和酚苷类诱导的培养基所制备的全细胞催化剂对于二氢杨梅素几乎没有催化能力。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种生物催化合成二氢杨梅素-7-葡萄糖苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)向含糖类物质的诱导培养基中接种真菌，进行第一次培养处理，离心取沉淀，得到第一次培养后的真菌，然后再将所述第一次培养后的真菌接种至含酚苷类化合物的诱导培养基中，进行第二次培养处理，离心取沉淀，得到全细胞催化剂；
(2)将二氢杨梅素、淀粉与缓冲溶液混合均匀，得到混合液，往所述混合液中加入步骤(1)所述全细胞催化剂，进行糖基化反应，得到所述二氢杨梅素-7-葡萄糖苷；
步骤(1)所述糖类物质为葡萄糖、蔗糖或果糖，在步骤(1)所述含糖类物质的诱导培养基中，糖类物质的浓度为5.0～15.0g/L；所述含酚苷类化合物为二氢杨梅素或杨梅素；在步骤(1)所述含酚苷类化合物的诱导培养基中，含酚苷类化合物的浓度为5.0～15.0g/L；
步骤(1)所述真菌为黑曲霉或假丝酵母；
步骤(1)所述向含糖类物质的诱导培养基中接种真菌，包括：将真菌分散均匀于无菌水中，得到真菌悬浮液，然后将真菌悬浮液接种至含糖类物质的诱导培养基中，所述真菌悬浮液的细胞密度为1.0×106～1.0×108CFU/mL，所述真菌悬浮液的体积为含糖类物质的诱导培养基体积的1～20％；步骤(1)所述第一次培养后的真菌接种至含酚苷类化合物的诱导培养基中，包括：将第一次培养后的真菌分散均匀于无菌水中，得到第一次培养后的真菌悬浮液，然后将第一次培养后的真菌悬浮液接种至含酚苷类化合物的诱导培养基中，所述第一次培养后的真菌悬浮液的细胞密度为1.0×106～1.0×108CFU/mL，所述第一次培养后的真菌悬浮液的体积为含酚苷类化合物的诱导培养基体积的1～20％；
步骤(2)中，往混合液加入有机溶剂，再加入所述全细胞催化剂，进行糖基化反应，得到所述二氢杨梅素-7-葡萄糖苷；所述有机溶剂为四氢呋喃；所述有机溶剂与缓冲溶液的体积比为1:1～1:4。
2.根据权利要求1所述的生物催化合成二氢杨梅素-7-葡萄糖苷的方法，其特征在于，步骤(1)所述含糖类物质的诱导培养基与含酚苷类化合物的诱导培养基的pH值均为4.0～8.0。
3.根据权利要求2所述的生物催化合成二氢杨梅素-7-葡萄糖苷的方法，其特征在于，所述诱导培养基，按照体积为1升计，包括：5.0～15.0g/L的糖类或酚苷类、2.5～10g/L的硫酸镁、5～25g/L的酵母浸膏、2.5～10g/L的磷酸氢二钠、2.5～10g/L的磷酸二氢钾、2.5～10g/L的无水氯化钙，余者为水。
4.根据权利要求1所述的生物催化合成二氢杨梅素-7-葡萄糖苷的方法，其特征在于，步骤(1)所述第一次培养处理的转速为100～1000r/min，第一次培养处理的温度为20～45℃，第一次培养处理的的时间为12～72h；所述第二次培养处理的转速为100～1000r/min，第二次培养处理的温度为20～45℃，第二次培养处理的的时间为12～72h。
5.根据权利要求1所述的生物催化合成二氢杨梅素-7-葡萄糖苷的方法，其特征在于，步骤(1)所述离心的转速均为3000～12000rpm，离心的时间均为5～40min。
6.根据权利要求1所述的生物催化合成二氢杨梅素-7-葡萄糖苷的方法，其特征在于，步骤(2)所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液中的一种；所述缓冲溶液的pH值为4.0～8.0；所述淀粉为可溶性淀粉；所述二氢杨梅素与淀粉的质量比为1:5～1:30；所述二氢杨梅素与缓冲溶液的质量体积比为0.04:2.4～0.04:6g/ml。
7.根据权利要求1-6任一项所述的生物催化合成二氢杨梅素-7-葡萄糖苷的方法，其特征在于，步骤(2)所述二氢杨梅素与全细胞催化剂的质量比为1:1～1:4；所述糖基化反应的温度为30～65℃，糖基化反应的时间为1～72h。
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