CN109234252B - 一种印迹脂肪酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种印迹脂肪酶及其应用，所述印迹脂肪酶按如下方法制备：将印迹分子加入脂肪酶酶液中，搅拌溶解，调节pH为7.2‑7.8，搅拌印迹反应完全后，加入大孔树脂，搅拌吸附完全后，将反应液过滤，滤饼洗涤干燥，即获得印迹脂肪酶；本发明以麦芽糖或蔗糖为印迹分子，与有机酸和酯类化合物为印迹分子比较，印迹体系不需要表面活性剂与醇类助溶剂，印迹分子在水溶液中与脂肪酶分子的结合更优。麦芽糖印迹的脂肪酶，催化低聚糖酯化的应用面较广，以蔗糖为例，催化其乙酯合成，酯化率与酯化选择性均优于未印迹的脂肪酶，本发明酯化率高达86.6％，酯化选择性高达85.4％。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种印迹脂肪酶及在催化低聚糖酯化中的应用。
(二)背景技术
以底物或底物类似物印迹脂肪酶，提高酶的催化酯化效果，是当前脂肪酶研究的热点技术。目前，对催化糖酯化的脂肪酶进行印迹，根据已公开报道的印迹技术，均选用有机酸或酯类化合物作为印迹分子，尚未有用低聚糖类物质印迹脂肪酶的报道。低聚糖类物质作为印迹分子与有机化合物有较明显的区别，其水溶性明显优于有机化合物，可完全溶于水，无需添加表面活性剂与助溶剂，简化了酶的印迹体系。分子结构与有机酸和酯类化合物差别较大，因而在印迹溶液体系中与脂肪酶分子的结合形态有所不同，所得到的印迹酶催化性能有自身优势，在催化低聚糖酯化反应上有重要的应用价值。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种印迹脂肪酶及其应用，该印迹脂肪酶催化低聚糖酯化效果比较突出，特别是用于催化蔗糖的酯化，有良好的酯化率与酯化选择性，较现有国内外脂肪酶的印迹技术均有优势。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种印迹脂肪酶，所述印迹脂肪酶按如下方法制备：将印迹分子加入脂肪酶酶液中，搅拌溶解，调节pH为7.2-7.8，在25-50℃(优选30-40℃)、100-160转/分钟条件下搅拌印迹反应完全后(优选10-30min)，加入大孔树脂，在20-40℃(优选25-35℃)、60-120转/分钟条件下搅拌吸附(优选3-6h，更优选4h)，吸附完全后，将反应液过滤，滤饼洗涤(优选蒸馏水洗涤3次)干燥，即获得印迹脂肪酶；所述脂肪酶酶液为脂肪酶溶于pH7.4的缓冲液制成，溶解过程中采用超声(优选40KHz)助溶，若有不溶成分则过滤去除(脂肪酶溶解，过滤去除杂质，对脂肪酶的含量基本没有影响)，得到澄清的酶液；所述印迹分子为麦芽糖或蔗糖；所述脂肪酶酶液用量以脂肪酶重量计，所述印迹分子与脂肪酶重量比为0.1-0.4:1，所述大孔树脂与脂肪酶重量比为10-60:1。
进一步，所述大孔树脂优选D4006型大孔树脂(天津浩聚树脂科技有限公司)、D3520型大孔树脂(南开大学化工厂)、D1300型大孔树脂(天津浩聚树脂科技有限公司)，所述大孔树脂先进行预处理，方法：将大孔树脂以0.1g/ml的量加入体积浓度95％乙醇水溶液中，于室温(25-30℃)、150r/min的条件下震荡洗涤24小时，并于中途两次更换等量95％乙醇水溶液，震荡结束后，每次用树脂质量两倍的蒸馏水洗涤，洗五次，抽滤，即为预处理后的大孔树脂，洗涤用乙醇蒸馏回收。
进一步，所述脂肪酶的酶活10-30万单位/克，优选黑曲霉脂肪酶或假丝酵母脂肪酶；所述脂肪酶酶液中缓冲液体积用量以脂肪酶质量计为15-30ml/g，所述缓冲液优选0.05mol/L、pH7.4的磷酸钠缓冲液。
进一步，所述干燥是在0.1大气压真空度45℃的真空干燥箱中干燥12h。
本发明还提供一种所述印迹脂肪酶在催化低聚糖酯化中的应用，优选所述应用为催化蔗糖制备蔗糖-6-乙酯，具体所述的应用为：将蔗糖、乙酸乙烯酯、印迹脂肪酶、4A分子筛、叔戊醇和二甲基亚砜混匀，40℃和180r/min条件下振荡反应16h后，反应液分离纯化后，获得蔗糖-6-乙酯；所述4A分子筛180℃干燥6小时后使用；所述蔗糖与乙酸乙烯酯物质的量之比为1:10，所述蔗糖与印迹脂肪酶重量比为1:9-15，所述蔗糖与4A分子筛重量比为1:9-10，所述叔戊醇和二甲基亚砜体积用量以蔗糖重量计分别为70-80ml/g和15-20ml/g。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明以麦芽糖或蔗糖为印迹分子，与有机酸和酯类化合物为印迹分子比较，印迹体系不需要表面活性剂与醇类助溶剂，印迹分子在水溶液中与脂肪酶分子的结合更优。麦芽糖印迹的脂肪酶，催化低聚糖酯化的应用面较广，以蔗糖为例，催化其乙酯合成，酯化率与酯化选择性均优于未印迹的脂肪酶，本发明酯化率高达86.6％，酯化选择性高达85.4％。
(四)附图说明
图1牛血清蛋白的标准曲线。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：本发明室温是指25-30℃。
实施例1：
1、印迹脂肪酶
(1)酶液：将黑曲霉脂肪酶(Aspergillus niger lipase，深圳绿微康生物工程有限公司生产，30万单位/克)1.0克溶解在30ml磷酸钠缓冲液(0.05mol/L、pH7.4)中，超声(40KHz)助溶，使脂肪酶充分溶解，有不溶成分则过滤去除(酶溶解，过滤是为了除去杂质，不影响酶的浓度)，得到澄清的脂肪酶磷酸钠缓冲液溶液，即酶液30ml。
(2)大孔树脂预处理：称取D4006型大孔树脂(天津浩聚树脂科技有限公司)150g置于2500mL的烧杯中，加入1500ml体积浓度95％乙醇水溶液，于室温(25-30℃)、150r/min的条件下震荡洗涤24小时，并于中途两次更换等量95％乙醇水溶液。震荡结束后，每次用300ml蒸馏水洗涤，共洗涤五次，抽滤，即为预处理后的D4006型大孔树脂，质量含水量控制为40％，备用。洗涤用乙醇蒸馏回收。
(3)印迹脂肪酶：称取0.3克印迹分子麦芽糖加入步骤(1)30ml酶液中，搅拌使麦芽糖完全溶解，用0.5M的NaOH水溶液调节酶液的pH为7.5，保持40℃，以160转/分钟搅拌下印迹10分钟。印迹完毕立刻加入步骤(2)预处理后的D4006型大孔树脂40克，在30℃保温，90转/分钟搅拌下吸附固定化酶，吸附4h，过滤，滤液检测残余的酶量，滤饼用树脂质量六倍的蒸馏水分三次洗涤后，在0.1大气压真空度45℃的真空干燥箱中干燥12h，干燥完毕，即得印迹脂肪酶27.6g。
(4)脂肪酶的固定化率：脂肪酶含量的测定采用考马斯亮兰分光光度法，以考马斯亮兰试剂与酶蛋白溶液显色，在595nm处测定吸光值，具体为：以牛血清白蛋白为标准品作标准曲线(参见表1)，检测滤液在595nm处吸光值，根据标准曲线，得到滤液中酶蛋白含量，根据公式1，获得脂肪酶的固定化率，固定化率为94.6％。
固定化率％＝(1-滤液中酶蛋白量/印迹酶液中酶蛋白量)×100％公式1
标准曲线制备方法：准确称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL体积浓度95％乙醇水溶液中，加入100mL体积浓度85％磷酸水溶液，用蒸馏水稀释至1000mL，配制得到考马斯亮蓝试剂。用蒸馏水配制100μg/mL牛血清蛋白(BSA)标准溶液，在595nm处测定吸光度，并制作标准曲线，结果见图1。
表1牛血清蛋白标准曲线制作
BSA标准曲线的制作见表1，各试管配制完毕，摇匀，室温下显色2min。在595nm处测定溶液的吸光度，并以吸光度A为纵坐标，蛋白含量为纵坐标作图，标准曲线如图1所示。
2、印迹脂肪酶催化蔗糖-6-乙酯的合成：
称取0.3mmol(0.103g)蔗糖(广东省化学试剂工程技术研究开发中心生产，化学纯)，3mmol(0.258g)乙酸乙烯酯(江苏永华精细化学品有限公司生产，化学纯)，1.0g印迹脂肪酶、1g 4A分子筛(江西凯莱化工填料有限公司生产，180℃干燥6小时后使用)，再加入8ml叔戊醇(国药集团化学试剂有限公生产，化学纯)和2ml二甲基亚砜(无锡海硕生物有限公司生产，化学纯)于50mL具塞三角瓶中，混匀置于恒温摇床中，40℃和180r/min条件下振荡开始反应16h后，反应液在4000r/min的条件下离心10min，取上层清液100μL用叔戊醇稀释至1.1ml后，进液相色谱分析，每组实验三个平行样。
蔗糖-6-乙酯液相色谱分析检测方法：安捷伦1200液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)，色谱条件：ZORBAX SB-Aq色谱柱(5μm4.6*250mm，美国Agilent)，流动相：去离子水，流速0.8mL/min，柱温30℃，进样量5μL。蒸发光检测器(美国Alltech 3300)，检测条件：温度85℃，氮气流速1.5L/min。记录色谱图，根据计算式：酯化率＝生成的蔗糖酯量/初始蔗糖量×100％。蔗糖6位酯化选择率＝蔗糖-6-乙酯的量/蔗糖总酯的量×100％，计算酯化率与蔗糖6位酯化选择率。
印迹脂肪酶催化蔗糖-6-乙酯的结果：酯化率86.6％，蔗糖6位酯化选择率85.4％。
实施例2：
(1)酶液：将黑曲霉脂肪酶(Aspergillus niger lipase，南宁庞博生物工程有限公司生产，30万单位/克)1.0克溶解在30ml磷酸钠缓冲液(0.05mol/L、pH7.4)中，超声(40KHz)助溶，使脂肪酶充分溶解，有不溶成分则过滤去除，得到澄清的脂肪酶磷酸钠缓冲液溶液，即酶液30ml。
(2)树脂预处理：D3520型大孔树脂(南开大学化工厂)采用实施例1方法预处理。
(3)印迹脂肪酶：称取0.4克印迹分子麦芽糖(山东寿光市鲁科化工有限责任公司生产，化学纯)加入步骤(1)获得的30ml酶液中，搅拌使麦芽糖完全溶解，用0.5M的磷酸水溶液调节酶液的pH为7.2，保持35℃，以130转/分钟搅拌下印迹20分钟。印迹完毕立刻加入步骤(2)预处理后的D3520型大孔树脂60克，在25℃保温，60转/分钟搅拌下吸附固定化酶，吸附6h，过滤，滤液按实施例1方法计算固定化率为96.2％，滤饼用树脂质量六倍的蒸馏水分三次洗涤后，在0.1大气压真空度45℃的真空干燥箱中干燥12h，干燥完毕，即得印迹脂肪酶40.9g。
(4)应用：将实施例1步骤2中印迹脂肪酶替换为本实施例制备的印迹脂肪酶1.5g，其他同实施例1进行印迹脂肪酶催化蔗糖-6-乙酯的合成，结果：酯化率85.8％，蔗糖6位酯化选择率85.1％。
实施例3：
(1)酶液：将假丝酵母脂肪酶(Candida rugosa lipase，北京凯泰新世纪生物技术有限公司生产，13万单位/克)2.0克溶解在30ml磷酸钠缓冲液(0.05mol/L、pH7.4)中，超声(40KHz)助溶，使脂肪酶充分溶解，有不溶成分则过滤去除，得到澄清的脂肪酶磷酸钠缓冲液溶液，即酶液30ml。
(2)树脂预处理：采用实施例1方法预处理D1300型大孔树脂(天津浩聚树脂科技有限公司)。
(3)印迹脂肪酶：称取0.2克印迹物麦芽糖(成都万信化工有限公司生产，化学纯)加入步骤(1)30ml酶液中，搅拌使麦芽糖完全溶解，用0.5M的NaOH水溶液调节酶液的pH为7.8，保持30℃，以100转/分钟搅拌下印迹30分钟。印迹完毕立刻加入步骤(2)预处理的D1300型大孔树脂20克，在35℃保温，120转/分钟搅拌下吸附固定化酶，吸附3h，过滤，滤液按实施例1方法计算固定化率为94.5％，滤饼用树脂质量六倍的蒸馏水分三次洗涤后，在0.1大气压真空度45℃的真空干燥箱中干燥12h，干燥完毕，即得印迹脂肪酶23.1g。
(4)应用：将实施例1步骤2中印迹脂肪酶替换为本实施例制备的印迹脂肪酶1.2g，其他同实施例1，进行印迹脂肪酶催化蔗糖-6-乙酯的合成，结果：酯化率86.2％，蔗糖6位酯化选择率84.7％。
实施例4：
(1)酶液：将黑曲霉脂肪酶(Aspergillus niger lipase，南宁庞博生物工程有限公司生产，30万单位/克)1.0克溶解在30ml磷酸钠缓冲液(0.05mol/L、pH7.4)中，超声(40KHz)助溶，使脂肪酶充分溶解，有不溶成分则过滤去除，得到澄清的脂肪酶磷酸钠缓冲液溶液，即酶液30ml。
(2)树脂预处理：采用实施例1方法预处理D3520型大孔树脂(南开大学化工厂)。
(3)印迹脂肪酶：称取0.3克印迹分子蔗糖(广东省化学试剂工程技术研究开发中心生产，化学纯)加入步骤(1)获得的30ml酶液中，搅拌使蔗糖完全溶解，用0.5M的磷酸水溶液调节酶液的pH为7.2，保持35℃，以130转/分钟搅拌下印迹20分钟。印迹完毕立刻加入步骤(2)预处理后的D3520型大孔树脂50克，在30℃保温，90转/分钟搅拌下吸附固定化酶，吸附5h，过滤，滤液按实施例1方法计算固定化率为95.8％，滤饼用树脂质量六倍的蒸馏水分三次洗涤后，在0.1大气压真空度45℃的真空干燥箱中干燥12h，干燥完毕，即得印迹脂肪酶34.2g。
(4)应用：将实施例1步骤2中印迹脂肪酶替换为本实施例制备的印迹脂肪酶1.5g，其他同实施例1进行印迹脂肪酶催化蔗糖-6-乙酯的合成，结果：酯化率82.4％，蔗糖6位酯化选择率83.7％。
对比例1：
(1)酶液：将黑曲霉脂肪酶(Aspergillus niger lipase，南宁庞博生物工程有限公司生产，30万单位/克)1.0克溶解在30ml磷酸钠缓冲液(0.05mol/L、pH7.4)中，超声(40KHz)助溶，使脂肪酶充分溶解，有不溶成分则过滤去除，得到澄清的脂肪酶磷酸钠缓冲液溶液，即酶液30ml。
(2)树脂预处理：采用实施例1方法预处理D3520型大孔树脂(南开大学化工厂)。
(3)印迹脂肪酶：称取0.3克印迹分子橄榄油(国药集团化学试剂有限公司生产，化学纯)加入步骤(1)30ml酶液中，加入0.3g吐温20(国药集团化学试剂有限公司生产，化学纯)和3mL无水乙醇(杭州双林化工试剂厂生产，化学纯)，搅拌使橄榄油完全溶解，用0.5M的NaOH水溶液调节酶液的pH为7.8，保持35℃，以130转/分钟搅拌下印迹20分钟。印迹完毕立刻加入步骤(2)预处理后的D3520型大孔树脂40克，在25℃保温，60转/分钟搅拌下吸附固定化酶，吸附6h，过滤，滤液按实施例1方法计算固定化率为95.7％，滤饼用树脂质量六倍的蒸馏水分三次洗涤后，在0.1大气压真空度45℃的真空干燥箱中干燥12h，干燥完毕，即得印迹脂肪酶27.8g。
(4)应用：将实施例1步骤2中印迹脂肪酶替换为本实施例制备的印迹脂肪酶1.5g，其他同实施例1进行印迹脂肪酶催化蔗糖-6-乙酯的合成，结果：酯化率63.7％，蔗糖6位酯化选择率84.6％。
对比例2：
(1)酶液：将黑曲霉脂肪酶(Aspergillus niger lipase，深圳绿微康生物工程有限公司生产，30万单位/克)1.0克溶解在30ml磷酸钠缓冲液(0.05mol/L、pH7.4)中，超声(40KHz)助溶，使脂肪酶充分溶解，有不溶成分则过滤去除，得到澄清的脂肪酶磷酸钠缓冲液溶液，即酶液30ml。
(2)树脂预处理：采用实施例1方法预处理D4006型大孔树脂(天津浩聚树脂科技有限公司)。
(3)印迹脂肪酶：称取0.3克印迹分子乙酸乙烯酯(江苏永华精细化学品有限公司生产，化学纯)加入30ml酶液中，加入0.3g吐温20(国药集团化学试剂有限公司生产，化学纯)和2mL无水乙醇(杭州双林化工试剂厂生产，化学纯)，搅拌使乙酸乙烯酯完全溶解，用0.5M的NaOH水溶液调节酶液的pH为7.6，保持40℃，以160转/分钟搅拌下印迹20分钟。印迹完毕立刻加入步骤(2)预处理后的D4006型大孔树脂40克，在30℃保温，90转/分钟搅拌下吸附固定化酶，吸附4h，过滤，滤液按实施例1方法计算固定化率为95.8％，滤饼用树脂质量六倍的蒸馏水分三次洗涤后，在0.1大气压真空度45℃的真空干燥箱中干燥12h，干燥完毕，即得印迹脂肪酶27.7g。
(4)应用：将实施例1步骤2中印迹脂肪酶替换为本实施例制备的印迹脂肪酶1.5g，其他同实施例1进行印迹脂肪酶催化蔗糖-6-乙酯的合成，结果：酯化率72.3％，蔗糖6位酯化选择率81.9％。
对比例3：
(1)酶液：将黑曲霉脂肪酶(Aspergillus niger lipase，深圳绿微康生物工程有限公司生产，30万单位/克)1.0克溶解在30ml磷酸钠缓冲液(0.05mol/L、pH7.4)中，超声(40KHz)助溶，使脂肪酶充分溶解，有不溶成分则过滤去除，得到澄清的脂肪酶磷酸钠缓冲液溶液，得酶液30ml。
(2)树脂预处理：采用实施例1方法预处理D3520型大孔树脂(南开大学化工厂)。
(3)印迹脂肪酶：称取0.3克印迹分子正辛酸(上海凌峰化学试剂有限公司生产，化学纯)加入步骤(1)30ml酶液中，加入0.3g吐温20(国药集团化学试剂有限公司生产，化学纯)和3mL无水乙醇(杭州双林化工试剂厂生产，化学纯)，搅拌使正辛酸完全溶解，用0.5M的磷酸水溶液调节酶液的pH为7.2，保持40℃，以150转/分钟搅拌下印迹20分钟。印迹完毕立刻加入步骤(2)预处理后的D3520型大孔树脂50克，在30℃保温，90转/分钟搅拌下吸附固定化酶，吸附5h，过滤，滤液按实施例1方法计算固定化率为95.5％，滤饼用树脂质量六倍的蒸馏水分三次洗涤后，在0.1大气压真空度45℃的真空干燥箱中干燥12h，干燥完毕，即得印迹脂肪酶35.1g。
(4)应用：将实施例1步骤2中印迹脂肪酶替换为本实施例制备的印迹脂肪酶1.5g，其他同实施例1进行印迹脂肪酶催化蔗糖-6-乙酯的合成，结果：酯化率62.6％，蔗糖6位酯化选择率83.4％。
对比例4：
(1)酶液：将黑曲霉脂肪酶(Aspergillus niger lipase，南宁庞博生物工程有限公司生产，30万单位/克)1.0克溶解在30ml磷酸钠缓冲液(0.05mol/L、pH7.4)中，超声(40KHz)助溶，使脂肪酶充分溶解，有不溶成分则过滤去除，得到澄清的脂肪酶磷酸钠缓冲液溶液，即酶液30ml。
(2)树脂预处理：采用实施例1方法预处理D3520型大孔树脂(南开大学化工厂)。
(3)无印迹的脂肪酶固定化：向步骤(1)30ml酶液中立刻加入步骤(2)预处理后的D3520型大孔树脂40克，在30℃保温，90转/分钟搅拌下吸附固定化酶，吸附5h，过滤，滤液按实施例1方法计算固定化率为96.3％，滤饼用树脂质量六倍的蒸馏水分三次洗涤后，在0.1大气压真空度45℃的真空干燥箱中干燥12h，干燥完毕，即得印迹脂肪酶27.7g。
(4)应用：将实施例1步骤2中印迹脂肪酶替换为本实施例制备的印迹脂肪酶1.5g，其他同实施例1进行印迹脂肪酶催化蔗糖-6-乙酯的合成，结果：酯化率26.5％，蔗糖6位酯化选择率84.8％。
Claims (4)
1.一种印迹脂肪酶，其特征在于所述印迹脂肪酶按如下方法制备：将印迹分子加入脂肪酶酶液中，搅拌溶解，调节pH为7.2-7.8，在25-50℃、100-160转/分钟条件下搅拌印迹反应完全后，加入大孔树脂，在20-40℃、60-120转/分钟条件下搅拌吸附完全后，将反应液过滤，滤饼洗涤后在0.1大气压真空度45℃的真空干燥箱中干燥12h，即获得印迹脂肪酶；所述脂肪酶酶液为脂肪酶溶于pH7.4的缓冲液制成；所述印迹分子为麦芽糖；所述大孔树脂为D4006型大孔树脂、D3520型大孔树脂或D1300型大孔树脂；所述脂肪酶为黑曲霉脂肪酶或假丝酵母脂肪酶；所述印迹分子与脂肪酶重量比为0.1-0.4:1，所述大孔树脂与脂肪酶重量比为10-60:1；所述脂肪酶酶液中缓冲液体积用量以脂肪酶质量计为15-30ml/g，所述缓冲液为0.05mol/L、pH7.4的磷酸钠缓冲液。
2.如权利要求1所述印迹脂肪酶，其特征在于所述大孔树脂先进行预处理，方法：将大孔树脂以0.1g/ml的量加入体积浓度95％乙醇水溶液中，于室温、150r/min的条件下震荡洗涤24小时，并于中途两次更换等体积95％乙醇水溶液，震荡结束后，每次用树脂质量两倍的蒸馏水洗涤，洗五次，抽滤，即为预处理后的大孔树脂，洗涤用乙醇蒸馏回收。
3.一种权利要求1所述印迹脂肪酶在催化蔗糖制备蔗糖-6-乙酯中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的应用为：将蔗糖、乙酸乙烯酯、印迹脂肪酶、4A分子筛、叔戊醇和二甲基亚砜混匀，40℃和180r/min条件下振荡反应16h后，反应液分离纯化后，获得蔗糖-6-乙酯；所述蔗糖与乙酸乙烯酯物质的量之比为1:10，所述蔗糖与印迹脂肪酶重量比为1:9-15，所述蔗糖与4A分子筛重量比为1:9-10，所述叔戊醇和二甲基亚砜体积用量以蔗糖重量计分别为70-80ml/g和15-20ml/g。
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