JP7010426B2 - ブタノールの製造方法 - Google Patents
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Description
<PG培地の調製>
以下の手順でPG培地を調製した。まず、以下の原材料を配合して、水を加えて1Lの溶液を得た。溶液中の各原材料の濃度は以下のとおりとした。
・グルコース :10[g/L]
・硫安 :0.5[g/L]
・CaCO3 :3[g/L]
九州大学が所有するクロストリディウム・サッカロペルブチルアセトニクムN1-4株(ATCC 27021)をサンドストックで入手し、本実施例において用いた。上述のとおり調製したPG培地(9ml)を試験管に入れて脱気し、これに、薬さじ(小)を用いてサンドストックを5匙分投入した。そして、100℃で1分間加熱してヒートショックを与えた。プラスチック製の袋に試験管とアネロパック(三菱ガス化学株式会社製)を入れて密封し、嫌気性雰囲気下、インキュベータにて30℃で24時間培養した。このようにして種菌を調製した。
以下の原材料を用いて200mlフラスコ中にTYA培地を調製した。TYA培地における各原材料の濃度は以下のとおりである。
・酢酸アンモニウム :3.0[g/L]
・硫酸マグネシウム(7水和物) :0.3[g/L]
・酵母エキス :2.0[g/L]
・トリプトン :6.0[g/L]
・硫酸鉄七水和物 :0.01[g/L]
・リン酸二水素カリウム :0.5[g/L]
・グルコース :20.0[g/L]
調製したTYA培地、及び種菌をフラスコに入れて混合液を調製した。混合比率は、混合液100ml中に、TYA培地90ml、及び種菌10mlが含まれるように調整した。この混合液を、プラスチック製の袋とアネロパックを用いて、嫌気性雰囲気下、インキュベータにて30℃で15時間培養して培養液を得た。濁度法による培養液の562nmにおけるOD値は0.15程度であった。
調製した培養液を滅菌した遠沈管に分画し、6000pm、15分間、5℃の条件で遠心分離を行った。上澄み液を除去し、スラリー状の沈殿物(微生物)を得た。このようにして、滅菌水と、4%(w/v)のアルギン酸ナトリウム水溶液を混合して混合物を調製した。混合物中の微生物の含有量は10%(v/v)であり、アルギン酸ナトリウムの含有量は2%(w/v)であった。
ベント、サンプリング、窒素パージ及び原料投入を行うためノズルを備えたリアクタを準備した。リアクタに抽出剤を導入して各ノズルを密閉し、115℃で15分間滅菌を行った。抽出剤としては、オレイルアルコールとトリブチリンとを1:1(体積基準)で混合したものを用いた。リアクタに、さらにゲル状ビーズとTYA培地(培養液)を導入して、嫌気性雰囲気下、30℃で96時間、発酵と抽出を並行して行った。原材料として用いた、抽出剤(Ve)、培養液(Vb)、及びゲル状ビーズ(Vc)の体積は、それぞれ、300ml、30ml、及び90mlであった。発酵中、培養液及びゲル状ビーズの合計体積を基準とするグルコースの濃度を12時間毎に測定し、測定値が20g/L以下になったら粉末のグルコースをリアクタに1g追加した。
リアクタから採取した培養液15mlを遠沈管に入れて遠心分離(12000rpm、10分間、15℃)を行った。遠心分離して得られた上部の液体を、エッペンを用いて1ml採取し、残部はリアクタに戻した。採取したサンプルをフィルタで濾過して、以下のとおり、GC(ガスクロマトグラフ)分析及びHPLC(高速液体クロマトグラフ)分析を行った。
GC分析には、Agilent Technologies社製の6890A(装置名)を用い、アセトン、及びブタノールの定量分析を行った。キャピラリーカラムは、Agilent Technologies社製のINNOWAX(長さ:15m、内径:0.53mm、品名:19095N-121)を用いた。キャリアガスにはヘリウムガス(6.5ml/min)を用い、50~170℃の温度範囲で行った。
HPLC分析装置である、Jasco製のUS HPLC-1210(装置名)を用い、グルコースの定量分析を行った。カラムはショーデックス(登録商標)のSH1011を用いた。カラム温度を50℃とし、移動相として28μl/LのH2SO4を、1.0ml/Lの流速で20μl注入した。
リアクタから採取したゲル状ビーズを、クエン酸ナトリウム水溶液に溶解した。そして、培養液と同様にして分析して、アセトン及びブタノールの濃度を測定した。
リアクタから採取した抽出剤を、メタノールで10倍に希釈して測定用サンプルとした。また、アセトン及びブタノールをメタノールで希釈して、それぞれの成分を10g/Lの濃度で含有する標準液を調製した。そして、内部標準法で、測定サンプルに含まれる、アセトン及びブタノールの濃度を上述のGC分析装置を用いて測定した。
リアクタ中の培養液を採取し、固液分離で固形物を採取した。採取した固形物は純水で洗浄して乾燥し、乾燥重量を測定した。乾燥重量を、採取した培養液の体積で割って培養液に含まれる菌体乾燥重量DCW(g/L)を求めた。また、リアクタからゲル状ビーズを採取した。このゲル状ビーズを0.2Mのクエン酸ナトリウム水溶液に溶解した。溶解液を乾燥させて乾燥重量を測定した。乾燥重量を、採取したゲル状ビーズの体積で割ってゲル状ビーズに含まれる菌体乾燥重量DCW(g/L)を求めた。
表1に、発酵工程における培養液、ゲル状ビーズ、及び抽出剤におけるブタノールの濃度の経時変化と、リアクタに投入した培養液に対するブタノールの生産量の経時変化を示す。表2に、発酵工程における培養液、ゲル状ビーズ、及び抽出剤におけるアセトンの濃度の経時変化と、リアクタに投入した培養液に対するアセトンの生産量の経時変化を示す。ブタノール及びアセトンの生産量は、培養液、ゲル状ビーズ及び抽出剤の各体積と、各ブタノール濃度及び各アセトン濃度の積を、培養液の体積で割って算出した。
発酵・抽出工程において、抽出剤(Ve)、培養液(Vb)、及びゲル状ビーズ(Vc)の体積を、それぞれ、300ml、60ml、及び60mlとしたこと以外は実施例1と同様にしてブタノールの製造及び分析を行った。
固定化工程を行わずに、発酵・抽出工程を行ったこと以外は、実施例2と同様にしてブタノールの製造及び分析を行った。すなわち、実施例1と同様にして調製した培養液を、滅菌した遠沈管に分画し、6000pm、15分間、5℃の条件で遠心分離を行った。上澄み液を除去し、スラリー状の沈殿物(微生物)を得た。このようにして得られた微生物と、TYA培地(培養液)とを、オレイルアルコールとトリブチリンとを1:1(体積基準)で混合した抽出剤とリアクタに投入して、嫌気性雰囲気下、30℃で96時間、発酵を行った。微生物の使用量は、実施例1,2と同一量とした。
抽出剤(Ve)及びTYA培地(Vb)の使用量を、それぞれ、300ml及び60mlから、60ml及び60mlに変更したこと以外は、比較例1と同様にしてブタノールの製造及び分析を行った。
抽出剤の種類による抽出性能を比較するため、以下のモデル実験を行った。発酵液と同様の組成を有する3種類の混合物(1)~(3)を準備した。これらの混合物(1)~(3)は、ブタノール、アセトン、エタノール、酢酸及び酪酸を、表8の「混合物の組成」に示す比率で含有し、残部は水を含有していた。混合物(1)~(3)と、抽出剤であるオレイルアルコール、トリブチリン、又はこれらの混合溶媒(混合比率は体積基準で1:1)とを、1:1の体積比率で配合した。配合後、30℃で24時間放置した後、水相と抽出剤相における各成分の濃度を測定した。そして、これらの測定値に基づいて分配係数Kdを算出した。これらの結果は、表8に示すとおりであった。
Claims (6)
- オレイルアルコールとトリブチリンとを含有する抽出剤と、ゲル状ビーズに固定化されたクロストリジウム属菌を含む微生物によって生成したブタノールを含む培養液と、を接触させて、前記ブタノールを前記抽出剤中に抽出する抽出工程と、
前記培養液に糖分を混合して前記糖分を前記ブタノールに変換する発酵工程と、を有し、
前記培養液に対する前記オレイルアルコール及び前記トリブチリンの体積比がそれぞれ2以上であり、
前記発酵工程と前記抽出工程とを並行して行うことによって、少なくとも48時間の間、前記培養液におけるブタノール濃度(B b )と前記ゲル状ビーズにおけるブタノール濃度(B g )の差異(B b -B g )を0.4g/L以上に維持する、ブタノールの製造方法。 - 前記培養液に対する前記抽出剤の体積比が5以上である、請求項1に記載のブタノールの製造方法。
- 前記発酵工程と前記抽出工程とを並行して行うことによって、少なくとも48時間の間、前記ゲル状ビーズにおけるブタノール濃度(Bg)とアセトン濃度(Ag)の合計値を5g/L以下に維持する、請求項1又は2に記載のブタノールの製造方法。
- 前記培養液に対する前記オレイルアルコール及び前記トリブチリンの体積比がそれぞれ4以上である、請求項1~3のいずれか一項に記載のブタノールの製造方法。
- 前記微生物とアルギン酸ナトリウムとを含む溶液を塩化カルシウム溶液中に滴下して、前記微生物を固定化する前記ゲル状ビーズを形成する固定化工程を有する、請求項1~4のいずれか一項に記載のブタノールの製造方法。
- 前記発酵工程の際に、前記培養液、前記ゲル状ビーズ及び前記抽出剤のそれぞれのサンプルを採取し、それぞれのブタノール濃度及びアセトン濃度の少なくとも一方を測定する、請求項1~5のいずれか一項に記載のブタノールの製造方法。
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Davison B et al,Continuous direct solvent extraction of butanol in a fermenting fluidized-bed bioreactor with immobilized Clostridium acetobutylicum,Appl Biochem Biotechnol,1993年,39,415-426 |
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