JP2019030241A

JP2019030241A - ブタノールの製造方法

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Publication number: JP2019030241A
Application number: JP2017152686A
Authority: JP
Inventors: 園元　謙二; Kenji Sonomoto; 謙二園元; 掌道上; Sho Michiue; 小川　健一; Kenichi Ogawa; 健一小川; 修若村; Osamu Wakamura
Original assignee: Kyushu University NUC; Nippon Steel and Sumikin Engineering Co Ltd
Current assignee: Kyushu University NUC; Nippon Steel Engineering Co Ltd
Priority date: 2017-08-07
Filing date: 2017-08-07
Publication date: 2019-02-28
Anticipated expiration: 2037-08-07
Also published as: JP7010426B2

Abstract

【課題】効率よくブタノールを製造することが可能なブタノールの製造方法を提供すること。【解決手段】オレイルアルコールとトリブチリンとを含有する抽出剤と、ゲル状ビーズに固定化された微生物によって生成したブタノールを含む培養液と、を接触させて、ブタノールを抽出剤中に抽出する抽出工程を有する、ブタノールの製造方法を提供する。【選択図】なし

Description

本開示は、ブタノールの製造方法に関する。

グルコース原料から微生物を用いた発酵法によってブタノールを製造する技術が知られている（例えば、特許文献１参照）。このような製造方法では、ブタノール自体の微生物に対する毒性が高いことから、効率よくブタノールを生産する為に、微生物が生産活動を行う培養液中のブタノール濃度を低く抑える技術が検討されている。そのような技術として、培養液中で発酵生産されたブタノールを連続的に抽出剤に吸着させながら発酵生産を行う抽出発酵法がある。これによって、培養液中のブタノール濃度を低く抑えながら効率よくブタノールを発酵生産することが試みられている。特許文献１では、抽出剤として、平均炭素数１６〜１８の不飽和アルコール及び平均炭素数１６〜２０で側鎖を有するアルコールを用いることが提案されている。

特開昭６０−１７２２９０号公報

発酵法によるブタノールの製造に用いられる抽出剤は、その特性として、ブタノールの吸着性が培養液よりも高いこと、微生物に対する毒性が低いこと、及び、培養液との分離性に優れることが求められる。特許文献１に挙げられている抽出剤は、これらの特性をある程度満たし得るものの、更なる改善が求められている。そこで、本発明は、効率よくブタノールを製造することが可能なブタノールの製造方法を提供する。

本発明は、一つの側面において、オレイルアルコールとトリブチリンを含有する抽出剤と、ゲル状ビーズに固定化された微生物によって生成したブタノールを含む培養液と、を接触させて、ブタノールを抽出剤中に抽出する抽出工程を有する、ブタノールの製造方法を提供する。

このブタノールの製造方法は、オレイルアルコールとトリブチリンを含有する抽出剤を用いている。この抽出剤は、ブタノールとアセトンの両方の抽出性能に優れる。このため、ゲル状ビーズに微生物を固定しても、発酵生成したブタノール及びアセトンによる微生物の発酵阻害を抑制することができる。また、微生物がゲル状ビーズに固定されていることから、微生物と抽出剤との接触が低減され、抽出剤による発酵阻害を抑制することができる。このような要因によって、ブタノールを効率よく製造することができるものと考えられる。

上述のブタノールの製造方法において、培養液に対する抽出剤の体積比が２以上であることが好ましい。このように抽出剤の体積比を大きくすることによって、ブタノール及びアセトンの抽出効率が向上し、ブタノール及びアセトンによる微生物の発酵阻害を一層抑制することができる。したがって、ブタノールを一層効率よく製造することができる。

上述のブタノールの製造方法は、培養液に糖分を混合して糖分をブタノールに変換する発酵工程を有していてもよい。このような発酵工程を行うことによって、例えば、ブタノールを連続的又は断続的に製造することができる。

上記発酵工程と上記抽出工程とを並行して行うことによって、少なくとも４８時間の間、培養液におけるブタノール濃度（Ｂ_ｂ）とゲル状ビーズにおけるブタノール濃度（Ｂ_ｇ）の差異（Ｂ_ｂ−Ｂ_ｇ）を０．４ｇ／Ｌ以上に維持することが好ましい。これによって、ゲル状ビーズにおけるブタノール濃度を低減して発酵阻害を抑制しつつ、抽出剤にブタノールを効率よく抽出させることができる。したがって、ブタノールをより一層効率よく製造することができる。

上記発酵工程と上記抽出工程を並行して行うことによって、少なくとも４８時間の間、ゲル状ビーズにおけるブタノール濃度（Ｂ_ｇ）とアセトン濃度（Ａ_ｇ）の合計値を５ｇ／Ｌ以下に維持することが好ましい。通常ブタノールを発酵生産する微生物を用いると、併せてアセトンも生成される。したがって、ブタノール濃度（Ｂ_ｇ）とアセトン濃度（Ａ_ｇ）の合計値を低減すれば、微生物の発酵阻害を一層抑制することができる。

培養液に対するオレイルアルコール及びトリブチリンの体積比はそれぞれ１以上であることが好ましい。オレイルアルコールはブタノールの抽出性能に優れ、トリブチリンはアセトンの抽出性能に優れる。このため、それぞれの体積比を高くすることによって、ブタノールとアセトンの両者による発酵阻害を十分に抑制することができる。したがって、ブタノールを十分に効率よく製造することができる。

上述のブタノールの製造方法は、微生物とアルギン酸ナトリウムとを含む溶液を塩化カルシウム溶液中に滴下して、微生物を固定化するゲル状ビーズを形成する固定化工程を有していてもよい。このようなゲル状ビーズは、糖分のゲル状ビーズ内部への浸透と、ブタノール及びアセトン等の生成物のゲル状ビーズ外部への排出とを高水準で両立することができる。

一つの側面において、効率よくブタノールを製造することが可能なブタノールの製造方法を提供することができる。

図１（Ａ）及び図１（Ｂ）は、実施例１のブタノールに関する結果を示すグラフである。図２（Ａ）及び図２（Ｂ）は、実施例１のグルコース濃度及び菌体乾燥重量に関する結果を示すグラフである。図３（Ａ）及び図３（Ｂ）は、実施例２のブタノールに関する結果を示すグラフである。図４（Ａ）及び図４（Ｂ）は、実施例２のグルコース濃度及び菌体乾燥重量に関する結果を示すグラフである。図５（Ａ）及び図５（Ｂ）は、比較例１のブタノールに関する結果を示すグラフである。図６（Ａ）及び図６（Ｂ）は、比較例１のグルコース濃度及び菌体乾燥重量に関する結果を示すグラフである。

以下、場合により図面を参照して、本発明の一実施形態について説明する。ただし、以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。

一実施形態に係るブタノールの製造方法は、オレイルアルコールとトリブチリンを含有する抽出剤と、ゲル状ビーズに固定化された微生物によって生成したブタノールを含む培養液と、を接触させて、ブタノールを抽出剤中に抽出する抽出工程を有する。

本開示におけるブタノールは、１−ブタノール、イソブチルアルコール、２−ブタノール、及び２−メチル−２−プロパノールからなる群より選ばれる少なくとも一種を含む。

抽出剤は、オレイルアルコールとトリブチリンとを含有する。抽出剤は、これら以外の他の成分を含有していてもよい。ブタノールとアセトンの抽出性能向上の観点から、抽出剤におけるオレイルアルコールとトリブチリンの合計含有量は９０体積％以上であることが好ましく、９５体積％以上であることがより好ましく、９８体積％以上であることがさらに好ましい。この体積比率は、大気圧及び常温（２０℃）基準の値である。

培養液（Ｖｂ）に対する抽出剤（Ｖｅ）の体積比（Ｖｅ／Ｖｂ）は、好ましくは２以上であり、より好ましくは５以上であり、さらに好ましくは１０以上である。当該比率を高くすることによって、培養液に含まれるブタノール及びアセトンの抽出効率が向上し、ブタノール及びアセトンによる微生物の発酵阻害を一層抑制することができる。当該体積比は、大気圧及び常温（２０℃）基準の値である。

オレイルアルコールに対するトリブチリンの体積比は、例えば、０．５〜１．５であってもよいし、０．７〜１．３であってもよい。ブタノールとアセトンの両者をバランスよく抽出する観点から、培養液に対するオレイルアルコール及びトリブチリンの体積比は、それぞれ２以上であることが好ましく、３以上であることがより好ましく、４以上であることがさらに好ましい。当該体積比は、大気圧及び常温（２０℃）基準の値である。

抽出工程は、例えばリアクタにおいて、大気圧下、２０〜４０℃又は２５〜３５℃の温度条件下で行ってもよい。抽出工程は攪拌しながら行ってもよい。

微生物としては、ブタノールを発酵生産する種々のブタノール生産菌を用いることができる。ブタノール生産菌としては、アセトン−ブタノール−エタノール発酵に用いられる菌が挙げられる。具体的には、クロストリジウム属の菌が挙げられ、より具体的には、クロストリジウム・アセトブチリクム、及び、クロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニクム等が挙げられる。

ゲル状ビーズとしては、アルギン酸カルシウムゲル、ポリアクリルアミドゲル、コラーゲン、フィブリン、寒天、カラギーナン、セルロース等が挙げられる。微生物は、このようなゲル状ビーズの内部に固定される。微生物をゲル状ビーズに固定することによって、微生物が抽出剤と接触することによる発酵阻害を抑制できる。ゲル状ビーズは、糖分の取り込みと、ブタノール及びアセトンの排出を一層円滑にする観点から、アルギン酸カルシウムゲルが好ましい。

本実施形態のブタノールの製造方法によれば、発酵阻害が抑制され、効率よくブタノールを製造することができる。また、ブタノールとともに、アセトンを製造することもできる。

別の実施形態に係るブタノールの製造方法は、微生物が固定化されたゲル状ビーズを形成する固定化工程と、微生物が固定化されたゲル状ビーズと培養液と糖分とを混合して糖分をブタノールに変換する発酵工程と、ブタノールを含む培養液とオレイルアルコールとトリブチリンとを含有する抽出剤とを接触させて、ブタノールを抽出剤中に抽出する抽出工程とを有する。抽出工程の内容は、上述の実施形態で説明したとおりである。本実施形態においても、上記実施形態で挙げた内容を適宜採用することができる。

ゲル状ビーズとしてアルギン酸カルシウムゲルを用いる場合、固定化工程は、例えば以下の手順で行う。アルギン酸ナトリウムの水溶液に微生物を加えて混合物を調製する。アルギン酸ナトリウムの濃度は、例えば１〜１０質量％であってもよく、１〜６質量％であってもよい。混合物には培養液及び／又は水を加えてもよい。この混合物中に、ゲル化剤である塩化カルシウムの水溶液を滴下する。これによって、微生物が固定化されたゲル状ビーズが形成される。ゲル状ビーズの形成方法はこれに限定されず、公知の方法で形成することができる。得られたゲル状ビーズは、必要に応じて、水又は培養液から分離する。

発酵工程では、ゲル状ビーズと培養液と糖分とを含む混合液を、例えば２０〜４０℃で嫌気性発酵させてブタノールを生成させる。このとき、ブタノールとともに、アセトン及び／又はエタノールが発酵生成してもよい。発酵工程は、抽出工程と並行して行ってもよい。すなわち、発酵工程で培養液中に生成するブタノール、又はブタノール及びアセトンを、抽出剤を用いて抽出することによって、発酵生成したブタノールを抽出剤によって連続的に培養液から抽出することができる。この場合、リアクタ中において、培養液への糖分の供給と、培養液から抽出剤へのブタノール、又はブタノール及びアセトンの抽出を並行して行ってもよい。

糖分は水溶性糖類であることが好ましい。水溶性糖類としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、ソルボース、アロース、タロース、グロース、アルトロース、イドース、キシロース、アラビノース、リボース、及びリキソース等の単糖、並びに、これらの単糖を最小単位とするスクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース、セロビオース、ラフィノース、及びセロトリオース等の多糖類が挙げられる。また、糖分は、セルロース含有原料の糖化液であってもよい。セルロース含有原料としては、セルロースを含有するものであれば特に限定されず、例えば、草本系バイオマスであってもよく、木質系バイオマスであってもよく、その他のセルロースを含有するバイオマスであってもよい。

上記発酵工程と上記抽出工程とは並行して行うことが好ましい。これによって、発酵工程において、培養液におけるブタノール濃度（Ｂ_ｂ）とゲル状ビーズにおけるブタノール濃度（Ｂ_ｇ）の差異（Ｂ_ｂ−Ｂ_ｇ）を大きくすることができる。差異（Ｂ_ｂ−Ｂ_ｇ）は、少なくとも４８時間の間、０．４ｇ／Ｌ以上に維持することが好ましく、０．６ｇ／Ｌ以上に維持することがより好ましく、０．８ｇ／Ｌ以上に維持することがさらに好ましい。この差異を十分に大きくすることによって、ゲル状ビーズにおけるブタノール濃度を低減して発酵阻害を抑制しつつ、抽出剤にブタノールを効率よく抽出させることができる。したがって、ブタノールをより一層効率よく製造することができる。なお、差異（Ｂ_ｂ−Ｂ_ｇ）の上限に特に制限はなく、例えば、３ｇ／Ｌであってもよいし、２ｇ／Ｌであってもよい。

ブタノール濃度（Ｂ_ｇ）は、少なくとも４８時間の間、発酵阻害を抑制する観点から、２ｇ／Ｌ以下であることが好ましく、１ｇ／Ｌ以下であることがより好ましい。

発酵阻害を抑制する観点から、培養液におけるアセトン濃度（Ａ_ｂ）とゲル状ビーズにおけるアセトン濃度（Ａ_ｇ）の差異（Ａ_ｂ−Ａ_ｇ）も大きい方が好ましい。差異（Ａ_ｂ−Ａ_ｇ）は、例えば、少なくとも４８時間の間、０．４ｇ／Ｌ以上に維持することが好ましく、０．６ｇ／Ｌ以上に維持することがより好ましく、０．８ｇ／Ｌ以上に維持することがさらに好ましい。

アセトン濃度（Ａ_ｇ）は、少なくとも４８時間の間、発酵阻害を抑制する観点から、３ｇ／Ｌ以下に維持することが好ましく、２ｇ／Ｌ以下に維持することがより好ましい。同様の観点から、ブタノール濃度（Ｂ_ｇ）とアセトン濃度（Ａ_ｇ）の合計値を、少なくとも４８時間の間、５ｇ／Ｌ以下に維持することが好ましく、４ｇ／Ｌ以下であることがより好ましい。

以上、本発明の幾つかの実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に何ら限定されるものではない。

実施例及び比較例を参照して本発明の内容をより詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
＜ＰＧ培地の調製＞
以下の手順でＰＧ培地を調製した。まず、以下の原材料を配合して、水を加えて１Ｌの溶液を得た。溶液中の各原材料の濃度は以下のとおりとした。

・すりおろしたメークイン：１５０［ｇ／Ｌ］
・グルコース：１０［ｇ／Ｌ］
・硫安：０．５［ｇ／Ｌ］
・ＣａＣＯ_３：３［ｇ／Ｌ］

調製した溶液を１時間煮込んだ後、ガーゼを用いて濾過した。得られた濾液を試験管に９ｍｌ採取し、オートクレーブを用いて、大気中、１２０℃の条件で６０分間加熱した。このようにしてＰＧ培地を調製した。

＜種菌の調製＞
九州大学が所有するクロストリディウム・サッカロペルブチルアセトニクムＮ１−４株（ＡＴＣＣ２７０２１）をサンドストックで入手し、本実施例において用いた。上述のとおり調製したＰＧ培地（９ｍｌ）を試験管に入れて脱気し、これに、薬さじ（小）を用いてサンドストックを５匙分投入した。そして、１００℃で１分間加熱してヒートショックを与えた。プラスチック製の袋に試験管とアネロパック（三菱ガス化学株式会社製）を入れて密封し、嫌気性雰囲気下、インキュベータにて３０℃で２４時間培養した。このようにして種菌を調製した。

＜ＴＹＡ培地の調製＞
以下の原材料を用いて２００ｍｌフラスコ中にＴＹＡ培地を調製した。ＴＹＡ培地における各原材料の濃度は以下のとおりである。
・酢酸アンモニウム：３．０［ｇ／Ｌ］
・硫酸マグネシウム（７水和物）：０．３［ｇ／Ｌ］
・酵母エキス：２．０［ｇ／Ｌ］
・トリプトン：６．０［ｇ／Ｌ］
・硫酸鉄七水和物：０．０１［ｇ／Ｌ］
・リン酸二水素カリウム：０．５［ｇ／Ｌ］
・グルコース：２０．０［ｇ／Ｌ］

＜培養液の調製＞
調製したＴＹＡ培地、及び種菌をフラスコに入れて混合液を調製した。混合比率は、混合液１００ｍｌ中に、ＴＹＡ培地９０ｍｌ、及び種菌１０ｍｌが含まれるように調整した。この混合液を、プラスチック製の袋とアネロパックを用いて、嫌気性雰囲気下、インキュベータにて３０℃で１５時間培養して培養液を得た。濁度法による培養液の５６２ｎｍにおけるＯＤ値は０．１５程度であった。

＜固定化工程＞
調製した培養液を滅菌した遠沈管に分画し、６０００ｐｍ、１５分間、５℃の条件で遠心分離を行った。上澄み液を除去し、スラリー状の沈殿物（微生物）を得た。このようにして、滅菌水と、４％（ｗ／ｖ）のアルギン酸ナトリウム水溶液を混合して混合物を調製した。混合物中の微生物の含有量は１０％（ｖ／ｖ）であり、アルギン酸ナトリウムの含有量は２％（ｗ／ｖ）であった。

殺菌済みのＣａＣｌ_２水溶液（ＣａＣｌ_２濃度：３質量％）に上記混合物を滴下し、直径が約５ｍｍのビーズを形成した。形成されたビーズを１５分間溶液中に漬け込んだ後、濾過して微生物が固定されたゲル状ビーズを得た。

＜発酵・抽出工程＞
ベント、サンプリング、窒素パージ及び原料投入を行うためノズルを備えたリアクタを準備した。リアクタに抽出剤を導入して各ノズルを密閉し、１１５℃で１５分間滅菌を行った。抽出剤としては、オレイルアルコールとトリブチリンとを１：１（体積基準）で混合したものを用いた。リアクタに、さらにゲル状ビーズとＴＹＡ培地（培養液）を導入して、嫌気性雰囲気下、３０℃で９６時間、発酵と抽出を並行して行った。原材料として用いた、抽出剤（Ｖｅ）、培養液（Ｖｂ）、及びゲル状ビーズ（Ｖｃ）の体積は、それぞれ、３００ｍｌ、３０ｍｌ、及び９０ｍｌであった。発酵中、培養液及びゲル状ビーズの合計体積を基準とするグルコースの濃度を１２時間毎に測定し、測定値が２０ｇ／Ｌ以下になったら粉末のグルコースをリアクタに１ｇ追加した。

発酵中、定期的にサンプルを採取し、培養液、ゲル状ビーズ、及び抽出剤におけるそれぞれの成分の濃度を以下の手順で測定した。

＜培養液の分析＞
リアクタから採取した培養液１５ｍｌを遠沈管に入れて遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分間、１５℃）を行った。遠心分離して得られた上部の液体を、エッペンを用いて１ｍｌ採取し、残部はリアクタに戻した。採取したサンプルをフィルタで濾過して、以下のとおり、ＧＣ（ガスクロマトグラフ）分析及びＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフ）分析を行った。

＜ＧＣ分析＞
ＧＣ分析には、Agilent Technologies社製の６８９０Ａ（装置名）を用い、アセトン、及びブタノールの定量分析を行った。キャピラリーカラムは、Agilent Technologies社製のINNOWAX（長さ：１５ｍ、内径：０．５３ｍｍ、品名：１９０９５Ｎ−１２１）を用いた。キャリアガスにはヘリウムガス（６．５ｍｌ／ｍｉｎ）を用い、５０〜１７０℃の温度範囲で行った。

フィルタで濾過したサンプルを、イソブチルアルコール水溶液（２ｇ／Ｌ）で６倍に希釈して測定用サンプルとした。また、アセトン及びブタノールのそれぞれ成分を１０ｇ／Ｌの濃度で含有する標準液を調製した。そして、内部標準法で、測定サンプルに含まれる、アセトン及びブタノールの濃度を測定した。

＜ＨＰＬＣ分析＞
ＨＰＬＣ分析装置である、Ｊａｓｃｏ製のＵＳＨＰＬＣ−１２１０（装置名）を用い、グルコースの定量分析を行った。カラムはショーデックス（登録商標）のＳＨ１０１１を用いた。カラム温度を５０℃とし、移動相として２８μｌ／ＬのＨ_２ＳＯ_４を、１．０ｍｌ／Ｌの流速で２０μｌ注入した。

フィルタで濾過したサンプルを、イソブチルアルコール水溶液（２ｇ／Ｌ）で１０倍に希釈して測定用サンプルとした。また、グルコースを０，２．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ及び１０ｇ／Ｌの濃度で含有する標準水溶液を調製した。そして、外部標準法で、測定サンプルに含まれる、グルコースの濃度を測定した。

＜ゲル状ビーズの分析＞
リアクタから採取したゲル状ビーズを、クエン酸ナトリウム水溶液に溶解した。そして、培養液と同様にして分析して、アセトン及びブタノールの濃度を測定した。

＜抽出剤の分析＞
リアクタから採取した抽出剤を、メタノールで１０倍に希釈して測定用サンプルとした。また、アセトン及びブタノールをメタノールで希釈して、それぞれの成分を１０ｇ／Ｌの濃度で含有する標準液を調製した。そして、内部標準法で、測定サンプルに含まれる、アセトン及びブタノールの濃度を上述のＧＣ分析装置を用いて測定した。

＜菌体乾燥重量の分析＞
リアクタ中の培養液を採取し、固液分離で固形物を採取した。採取した固形物は純水で洗浄して乾燥し、乾燥重量を測定した。乾燥重量を、採取した培養液の体積で割って培養液に含まれる菌体乾燥重量ＤＣＷ（ｇ／Ｌ）を求めた。また、リアクタからゲル状ビーズを採取した。このゲル状ビーズを０．２Ｍのクエン酸ナトリウム水溶液に溶解した。溶解液を乾燥させて乾燥重量を測定した。乾燥重量を、採取したゲル状ビーズの体積で割ってゲル状ビーズに含まれる菌体乾燥重量ＤＣＷ（ｇ／Ｌ）を求めた。

＜分析結果＞
表１に、発酵工程における培養液、ゲル状ビーズ、及び抽出剤におけるブタノールの濃度の経時変化と、リアクタに投入した培養液に対するブタノールの生産量の経時変化を示す。表２に、発酵工程における培養液、ゲル状ビーズ、及び抽出剤におけるアセトンの濃度の経時変化と、リアクタに投入した培養液に対するアセトンの生産量の経時変化を示す。ブタノール及びアセトンの生産量は、培養液、ゲル状ビーズ及び抽出剤の各体積と、各ブタノール濃度及び各アセトン濃度の積を、培養液の体積で割って算出した。

図１（Ａ）及び図１（Ｂ）は、表１のブタノールの結果をプロットしたグラフである。図１（Ａ）は、ブタノール濃度の測定結果を示し、図１（Ｂ）はブタノールの生産量の結果を示している。図１（Ａ）において、培養液、ゲル状ビーズ及び抽出剤におけるブタノールの濃度は、それぞれ、丸（塗りつぶし無し）、丸（塗りつぶし有り）及び四角（塗りつぶし有り）で示されている。

表１、図１（Ａ）及び図１（Ｂ）に示すとおり、ゲル状ビーズ中のブタノールの濃度が低く抑制されていること、及び、ブタノールの生産量が時間の経過とともに順調に増加していることが確認された。このことから、発酵阻害が抑制され、ブタノールが十分に効率的に生産されていることが確認された。

表１には、培養液におけるブタノール濃度（Ｂ_ｂ）とゲル状ビーズにおけるブタノール濃度（Ｂ_ｇ）の差異（Ｂ_ｂ−Ｂ_ｇ）を示した。実施例１では、３６時間時点から９６時間時点の６０時間の間、ブタノール濃度の差異（Ｂ_ｂ−Ｂ_ｇ）が０．８ｇ／Ｌ以上に維持されていた。

表２に示すとおり、ゲル状ビーズ中のアセトンの濃度も低く抑制されていること、及び、アセトンの生産量が時間の経過とともに増加していることが確認された。このことから、ゲル状ビーズ中のアセトンの濃度の低減が、アセトンによる発酵阻害を抑制し、ブタノールの効率的な生産に寄与していることが確認された。また、アセトンは、培養液中にブタノールよりも高濃度で蓄積される傾向にあることが確認された。

表２には、培養液におけるアセトン濃度（Ａ_ｂ）とゲル状ビーズにおけるアセトン濃度（Ａ_ｇ）の差異（Ａ_ｂ−Ａ_ｇ）を示した。実施例１では、３６時間時点から９６時間時点の６０時間の間、ブタノール濃度の差異（Ａ_ｂ−Ａ_ｇ）が１．４ｇ／Ｌ以上に維持されていた。

図２（Ａ）は、培養液とゲル状ビーズの合計を基準として、発酵・抽出工程におけるグルコースの濃度をプロットしたグラフである。発酵・抽出工程では、図２（Ａ）に示すように、微生物によるグルコースの消費に伴うグルコース濃度の低下を補うようにグルコースを追加した。図２（Ａ）において、同時刻に２つプロットがあるのは、一方がグルコース追加前の濃度を、他方が追加後の濃度を示している。

図２（Ｂ）の四角形（塗りつぶし有り）のプロットは、ゲル状ビーズの菌体乾燥重量（ＤＣＷ）の経時変化を示し、図２（Ｂ）の四角形（塗りつぶし無し）のプロットは、培養液の菌体乾燥重量（ＤＣＷ）の経時変化を示している。図２（Ｂ）に示すとおり、ゲル状ビーズ中の菌体乾燥重量（ＤＣＷ）は時間の経過に伴って増加していることから、微生物の活性が良好に維持されていたことが確認された。

（実施例２）
発酵・抽出工程において、抽出剤（Ｖｅ）、培養液（Ｖｂ）、及びゲル状ビーズ（Ｖｃ）の体積を、それぞれ、３００ｍｌ、６０ｍｌ、及び６０ｍｌとしたこと以外は実施例１と同様にしてブタノールの製造及び分析を行った。

表３に、発酵工程における培養液、ゲル状ビーズ、及び抽出剤におけるブタノールの濃度の経時変化と、リアクタに投入した培養液に対するブタノールの生産量の経時変化を示す。表４に、発酵工程における培養液、ゲル状ビーズ、及び抽出剤におけるアセトンの濃度の経時変化と、リアクタに投入した培養液に対するアセトンの生産量の経時変化を示す。ブタノール及びアセトンの生産量は、培養液、ゲル状ビーズ及び抽出剤の各体積と、各ブタノール濃度及び各アセトン濃度の積を、培養液の体積で割って算出した。

図３（Ａ）及び図３（Ｂ）は、表３のブタノールの結果をプロットしたグラフである。図３（Ａ）は、ブタノール濃度の測定結果を示し、図３（Ｂ）はブタノールの生産量の結果を示している。図３（Ａ）において、培養液、ゲル状ビーズ及び抽出剤におけるブタノールの濃度は、それぞれ、丸（塗りつぶし無し）、丸（塗りつぶし有り）及び三角（塗りつぶし無し）で示されている。

表３、図３（Ａ）及び図３（Ｂ）に示すとおり、ゲル状ビーズ中のブタノールの濃度が低く抑制されていること、及び、ブタノールの生産量が時間の経過とともに増加していることが確認された。ただし、実施例２のブタノール濃度及びブタノール生産量は、実施例１よりも、４８時間以降の増加度合いが低くなっていた。

表３には、培養液におけるブタノール濃度（Ｂ_ｂ）とゲル状ビーズにおけるブタノール濃度（Ｂ_ｇ）の差異（Ｂ_ｂ−Ｂ_ｇ）を示した。実施例３では、２４時間時点から７２時間時点の４８時間の間、ブタノール濃度の差異（Ｂ_ｂ−Ｂ_ｇ）が０．４ｇ／Ｌ以上に維持されていた。

表３に示すとおり、ゲル状ビーズ中のアセトンの濃度は、発酵当初において低く抑制されていた。また、発酵当初においてブタノールの生産量が時間の経過とともに増加していることが確認された。

表４には、培養液におけるアセトン濃度（Ａ_ｂ）とゲル状ビーズにおけるアセトン濃度（Ａ_ｇ）の差異（Ａ_ｂ−Ａ_ｇ）を示した。実施例３では、２４時間時点から７２時間時点の４８時間の間、アセトン濃度の差異（Ａ_ｂ−Ａ_ｇ）が０．９ｇ／Ｌ以上に維持されていた。

図４（Ａ）は、培養液とゲル状ビーズの合計を基準として、発酵・抽出工程におけるグルコースの濃度をプロットしたグラフである。発酵・抽出工程では、図４（Ａ）に示すように、微生物によるグルコースの消費に伴うグルコース濃度の低下を補うようにグルコースを追加した。図４（Ａ）において、同時刻に２つプロットがあるのは、一方がグルコース追加前の濃度を、他方が追加後の濃度を示している。

図４（Ｂ）の四角形（塗りつぶし有り）のプロットは、ゲル状ビーズの菌体乾燥重量（ＤＣＷ）の経時変化を示し、図４（Ｂ）の四角形（塗りつぶし無し）のプロットは、培養液の菌体乾燥重量（ＤＣＷ）の経時変化を示している。図４（Ｂ）に示すとおり、ゲル状ビーズ及び培養液の菌体乾燥重量（ＤＣＷ）は、４８時間以降は、あまり増加せず、培養液の場合は、減少する時間帯もあった。この傾向は、図３（Ａ）及び図３（Ｂ）のブタノール濃度及びブタノール生産量の傾向と同様であった。

（比較例１）
固定化工程を行わずに、発酵・抽出工程を行ったこと以外は、実施例２と同様にしてブタノールの製造及び分析を行った。すなわち、実施例１と同様にして調製した培養液を、滅菌した遠沈管に分画し、６０００ｐｍ、１５分間、５℃の条件で遠心分離を行った。上澄み液を除去し、スラリー状の沈殿物（微生物）を得た。このようにして得られた微生物と、ＴＹＡ培地（培養液）とを、オレイルアルコールとトリブチリンとを１：１（体積基準）で混合した抽出剤とリアクタに投入して、嫌気性雰囲気下、３０℃で９６時間、発酵を行った。微生物の使用量は、実施例１，２と同一量とした。

表５に、発酵・抽出工程における培養液、及び抽出剤におけるブタノールの濃度の経時変化と、リアクタに投入した培養液に対するブタノールの生産量の経時変化を示す。表６に、発酵・抽出工程における培養液、及び抽出剤におけるアセトンの濃度の経時変化と、リアクタに投入した培養液に対するアセトンの生産量の経時変化を示す。ブタノール及びアセトンの生産量は、培養液及び抽出剤の各体積と、各ブタノール濃度及び各アセトン濃度の積を、培養液の体積で割って算出した。

図５（Ａ）及び図５（Ｂ）は、表５のブタノールの結果をプロットしたグラフである。図５（Ａ）は、ブタノール濃度の測定結果を示し、図５（Ｂ）はブタノールの生産量の結果を示している。図５（Ａ）において、培養液及び抽出剤におけるブタノールの濃度は、それぞれ、丸（塗りつぶし無し）のプロット及び四角（塗りつぶし有り）のプロットで示されている。ブタノールは、培養液よりも抽出剤中に高濃度で含まれていた。一方、アセトンは、抽出剤よりも培養液中に高濃度で含まれていた。

表５及び表６に示すとおり、比較例１のブタノール生産量及びアセトン生産量は、実施例１，２よりも少なかった。

図６（Ａ）は、培養液を基準として、発酵・抽出工程におけるグルコースの濃度をプロットしたグラフである。発酵工程では、図６（Ａ）に示すように、微生物によるグルコースの消費に伴うグルコース濃度の低下を補うようにグルコースを追加した。図６（Ａ）において、同時刻に２つプロットがあるのは、一方がグルコース追加前の濃度を、他方が追加後の濃度を示している。

図６（Ｂ）は、培養液の菌体乾燥重量（ＤＣＷ）の経時変化を示している。図６（Ｂ）に示すとおり、培養液の菌体乾燥重量（ＤＣＷ）は、３６時間まで殆ど増加しなかった。このような傾向は、図５（Ａ）及び図５（Ｂ）のブタノール濃度及びブタノール生産量の傾向と同様であった。このようにゲル状ビーズ化しない場合には、初期のブタノールの生産が促進されないことが確認された。

（比較例２）
抽出剤（Ｖｅ）及びＴＹＡ培地（Ｖｂ）の使用量を、それぞれ、３００ｍｌ及び６０ｍｌから、６０ｍｌ及び６０ｍｌに変更したこと以外は、比較例１と同様にしてブタノールの製造及び分析を行った。

表７に、実施例１，２及び比較例１，２における、原材料の組成、９６時間経過後のブタノール及びアセトンの生産量及びグルコースの消費量を纏めて示した。

表７に示すとおり、微生物を固定化したゲル状ビーズを用いることによって、ブタノールの生産量を選択的に向上することができた。また、Ｖｅ／Ｖｂを大きくすることによって、ブタノールの生産量をさらに向上することができた。

（参考例１）
抽出剤の種類による抽出性能を比較するため、以下のモデル実験を行った。発酵液と同様の組成を有する３種類の混合物（１）〜（３）を準備した。これらの混合物（１）〜（３）は、ブタノール、アセトン、エタノール、酢酸及び酪酸を、表８の「混合物の組成」に示す比率で含有し、残部は水を含有していた。混合物（１）〜（３）と、抽出剤であるオレイルアルコール、トリブチリン、又はこれらの混合溶媒（混合比率は体積基準で１：１）とを、１：１の体積比率で配合した。配合後、３０℃で２４時間放置した後、水相と抽出剤相における各成分の濃度を測定した。そして、これらの測定値に基づいて分配係数Ｋｄを算出した。これらの結果は、表８に示すとおりであった。

表８に示すとおり、オレイルアルコールとトリブチリンの混合溶媒は、ブタノールとアセトンの分配係数Ｋｄが、オレイルアルコール単体及びトリブチリン単体よりも高いことが確認された。したがって、混合溶媒は、微生物の発酵阻害を十分に抑制するとともに、ブタノールを高い分配係数で抽出することができることが確認された。

効率よくブタノールを製造することが可能なブタノールの製造方法が提供される。

Claims

オレイルアルコールとトリブチリンとを含有する抽出剤と、ゲル状ビーズに固定化された微生物によって生成したブタノールを含む培養液と、を接触させて、前記ブタノールを前記抽出剤中に抽出する抽出工程を有する、ブタノールの製造方法。
前記培養液に対する前記抽出剤の体積比が２以上である、請求項１に記載のブタノールの製造方法。
前記培養液に糖分を混合して前記糖分を前記ブタノールに変換する発酵工程を有する、請求項１又は２に記載のブタノールの製造方法。
前記発酵工程と前記抽出工程を並行して行うことによって、少なくとも４８時間の間、前記培養液におけるブタノール濃度（Ｂ_ｂ）と前記ゲル状ビーズにおけるブタノール濃度（Ｂ_ｇ）の差異（Ｂ_ｂ−Ｂ_ｇ）を０．４ｇ／Ｌ以上に維持する、請求項３に記載のブタノールの製造方法。
前記発酵工程と前記抽出工程を並行して行うことによって、少なくとも４８時間の間、前記ゲル状ビーズにおけるブタノール濃度（Ｂ_ｇ）とアセトン濃度（Ａ_ｇ）の合計値を５ｇ／Ｌ以下に維持する、請求項３又は４に記載のブタノールの製造方法。
前記培養液に対する前記オレイルアルコール及び前記トリブチリンの体積比がそれぞれ１以上である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のブタノールの製造方法。
前記微生物とアルギン酸ナトリウムとを含む溶液を塩化カルシウム溶液中に滴下して、前記微生物を固定化する前記ゲル状ビーズを形成する固定化工程を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のブタノールの製造方法。