CN114196664B - 甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种甲烷氧化菌‑多孔吸附剂复合物及其应用。该复合物制备方法包括：将甲烷氧化菌与多孔吸附剂在缓冲溶液中耦合得包含所述甲烷氧化菌‑多孔吸附剂复合物的混合溶液；所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液，生理盐水，离子液体中一种或多种组合；所述多孔吸附剂选自无定形金属有机骨架化合物、活性炭、分子筛中的一种或多种组合。该复合物甲烷吸附和降解速度快，与现有的瓦斯治理方法相比，该复合物可以反复的运用，甲烷降解效率高，操作方便，可以很好的运用于瓦斯治理过程中；而且制备方法条件温和、操作简单、成本低廉。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物及其应用。
背景技术
煤矿瓦斯爆炸对生命造成了严重的威胁，降低瓦斯中甲烷的浓度显得尤其的重要。甲烷氧化菌由于自身能够消耗甲烷的特性，在促进全球碳循环，减少大气中甲烷积累量方面具有极其重要的地位。正是由于甲烷氧化菌具有这种特性，人们试着利用甲烷氧化菌缓解温室气体效应、治理煤矿瓦斯等问题。甲烷氧化菌，可在常温常压条件下实现甲烷到甲醇的无污染专一性转化，并且其广泛地分于泥土、沼泽、稻田、河流、湖泊、森林和海洋中。甲烷氧化菌这一特殊性质已受到国内外的广泛关注。
马强、陶秀祥等对从胜利油田土壤中筛选出的一株甲烷氧化菌进行培养，并通过气相色谱对该菌株氧化甲烷的能力进行测定，发现甲烷气体的消耗率达到27～70％，证明了该菌可以利用甲烷进行生长，生成二氧化碳。由于瓦斯的主要成分为CH4，所以此研究为利用微生物治理瓦斯气体开辟了一条新的途径。虽然甲烷氧化菌可以在温和的条件下降解甲烷，但是由于其氧化机制复杂，不能快速吸附甲烷，限制了它的进一步应用。
除了生物方法外，还可以运用吸附剂吸附空气中的甲烷，目前许多高具有超高比表面积的多孔材料，如分子筛、活性炭、碳纳米管、有机与无机多孔树脂、金属有机框架材料(MOFs)与共价有机框架材料等己被研宄用于甲烷吸附，其中有些已经工业化。受吸附剂比表面积和孔径的影响，吸附剂的吸附性能不稳定，并且解附和吸附都需要在高温高压下操作，成本较高。将甲烷氧化菌和多孔材料结合在一起，可以克服单独使用一种材料的效果，多孔吸附剂材料通过快速吸附甲烷，可以把甲烷快速传递给甲烷氧化菌实现降解。同时也防止了吸附剂材料的团聚，可实现系统活性提升和瓦斯深度高效分解。
甲烷氧化菌耦合多孔吸附剂得到的复合物用于降解甲烷目前未见文献报道。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物用于降解甲烷，该复合物是物涉及生物与化学的体系，即甲烷氧化菌和多孔吸附材料耦合得该复合物。
所述甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物的制备方法包括：将甲烷氧化菌与多孔吸附剂在缓冲溶液中耦合得包含所述甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物的混合溶液；所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液，生理盐水，离子液体中一种或多种组合；所述多孔吸附剂选自无定形金属有机骨架化合物、活性炭、分子筛中的一种或多种组合。
进一步，所述磷酸盐缓冲液的pH值为5.8-8.0，优选为6.8、7、6.5、5.8。
进一步，所述磷酸盐缓冲液的浓度为1-1000mmol。
在某些具体实施例中，所述磷酸盐缓冲液为磷酸氢根溶液，pH值为6.8时，其浓度为9.8mmol；所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢根溶液，pH值为6.8时，其浓度为10.2mmol。
进一步，所述甲烷氧化菌选自甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基杆菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲基球形属(Methylosphaera)、甲基热菌属(Methylocaldum)、甲基八叠球菌属(Methylosarcina)、甲基弯曲菌属(Methylosinus)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、甲基细胞菌属(Methylocella)和甲基帽菌属(Methylocapsa)中的一种或多种组合。
进一步，所述甲烷氧化菌的粒径在2-2.5μm。
进一步，所述甲烷氧化菌细胞质量-体积浓度可为0.5-20mg/mL。
进一步，步骤(1)中，所述甲烷氧化菌的OD600为0.5-0.8，即耦合时的甲烷氧化菌的OD600值保持在0.5-0.8。
进一步，所述甲烷氧化菌在未耦合之前，放在-20到-80℃保存备用，然后在30-37℃的热水里快速震荡在1-2s内进行活化后与多孔吸附剂进行耦合。
进一步，所述多孔吸附剂选自金属有机骨架化合物、活性炭、分子筛中的一种或多种组合，可以选择其他纳米微孔材料。
具体地，多孔金属有机骨架材料包括RMOM系列、MIL系列、ZIF系列、UIO系列、PCN系列以及CPL系列,为由粒径为80-120nm小纳米颗粒组成的堆积体，比表面积为2500-4000m2/g，除原始孔径外，还存在20-50nm、40-100nm、80-500nm等一系列孔径。分子筛多孔材料是以SiO2和Al2O3为主要成份的结晶铝硅酸盐，例如纳米氧化铝、纳米二氧化硅、沸石分子筛等等，尺寸在2um以下的分子筛材料。活性炭材料主要是多孔吸附材料，例如活性炭纤维吸附剂、包括以无烟煤和泥炭烧制而成的吸附剂。
在某些具体实施例中，所述多孔吸附剂选择MOFs材料MIL-101(Cr)，γ-纳米氧化铝、椰壳活性炭或介孔二氧化硅。
进一步，所述多孔吸附剂在与所述甲烷氧化菌耦合之前，先运用微波进行活化再耦合，微波功率200-500W，微波时间2-7min。
进一步，所述多孔吸附剂的加入量为5-30mg/mL，优选为20mg/mL、5mg/mL、8mg/mL。
进一步，所述甲烷氧化菌与所述多孔吸附剂的质量比为0.01-5：1。优选为035：1、0.15：1、2：1。
进一步，所述助耦剂选择柠檬酸，用量为0.01mol-0.1mol/L。
优选地，在耦合的过程中进行机械搅拌，机械搅拌速度为50-1400r/min。
进一步，将包含所述甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物的混合溶液加入冻干保护剂，采用冷冻真空干燥法，制作成甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物冻干粉。
进一步，所述冻干保护剂可为葡萄糖、甘油、脱脂乳粉、海藻糖、甘露糖，二氧化硅其中的一种或几种组合。
进一步，所述冻干保护剂与所述包含所述甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物的混合溶液比例为5.5-50mg/mL:0.1-2mol/mL。
需要说明的是：所述甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物冻干粉在具体使用时，在培养基进行活化后便可使用。
在某些具体实施例中，制备得到的甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物的粒径在3-5uM左右。
本发明目的在于还提供一种前任一所述的甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物在制备甲烷检测器中的应用。所述甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物可以降解甲烷，即能侧面检测某环境中的甲烷浓度变化，可以结合一些软硬件制备成甲烷传感器，检测甲烷的含量变化。
本发明马目的在于还提供一种前任一所述的甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物在制备甲醇脱氢酶抑制剂中的应用。
具体地，通过在所述甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物中添加抑制剂制备所述甲醇脱氢酶抑制剂，所述抑制剂选自环氧丙醇、甲酸钠、氯化镁中的一种或几种组合。
本发明有益效果在于
本发明提供的甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物，生物-化学的方法来治理和降解甲烷，甲烷吸附速度快和降解快，与现有的瓦斯治理方法相比，该复合物可以反复运用，甲烷降解效率高，操作方便，所制备的复合物冻干粉便于携带，无需活化即可使用等优点，可以很好的运用于瓦斯治理过程中；而且其制备方法条件温和、操作简单、成本低廉。
本发明提供的甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物，除了可以运用于煤矿瓦斯治理方面，还可以通过添加某些抑制剂来抑制甲醇脱氢酶(MDH)使甲烷生成甲醇、甲酸等产品，可广泛应用于食品，医疗，化工领域。
附图说明
图1为本发明实施例1中MIL-101(Cr)红外光谱图。
图2为本发明实施例1制备的甲烷氧化菌(Methylophilus methylotrophus)-MIL-101(Cr)甲烷降解情况。
图3为本发明实施例2制备的甲烷氧化菌(Methylophilus sp)-MIL-101(Cr)甲烷降解情况。
图4为本发明实施例3制备的甲烷氧化菌(Methylophilus sp)-纳米氧化铝甲烷降解情况。
图5为本发明实施例4制备的甲基杆菌(Methylobacterium aquaticum)-椰壳活性炭复合物甲烷降解情况。
图6为本发明实施例5制备的甲基杆菌(Methylobacterium sp.)-介孔二氧化硅复合物甲烷降解情况。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本发明实施例中，MOFs材料MIL-101(Cr)的制备方法为：
(1)取4.0g硝酸铬和1.66g对苯二甲酸，0.5ML40％的氢氟酸在50ML去离子水中超声搅拌10-20min。
(2)取步骤(1)的溶液加入反应釜，在220℃反应8小时后冷却。
(3)取步骤(2)的溶液用DMF清洗三次，再用无水乙醇清洗两次，最后使用真空干燥箱在150°干燥12小时。
(4)取步骤(3)中的离心样品，在100℃干燥2小时，最后在真空干燥箱中用150℃干燥112小时即得MOFs材料MIL-101(Cr)，将其进行红外光谱图分析，结果如图1所示。
本发明实施例中，食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)、嗜甲基菌(Methylophilus sp)均为本实验室培养所得，具体方法为：
(1)通过稻田取样，富集、纯化筛选得到；
(2)将上述菌体通过在30-37℃的热水里快速震荡在1-2s进行活化；
(3)然后用无机盐培养基在30℃的摇床培养，冲入体积浓度为10％甲烷培养一段时间后测定OD600为0.75，备用。
(4)将细胞通过离心，倒掉培养液即得。
本发明实施例中，甲基杆菌(Methylobacterium aquaticum)、甲基杆菌(Methylobacterium sp.)的培养方法为：
(1)通过稻田取样，富集、纯化筛选得到；
(2)将上述菌体通过在30-37℃的热水里快速震荡在1-2s进行活化；
(3)将上述菌体通过在30℃的热水里快速震荡在1-2s进行活化；
(3)用无机盐培养基在30℃的摇床培养，向培养液里面滴加5％甲醇培养一段时间后测定OD600为0.75，备用。
本发明实施例中，为了方便简洁，是直接使用制备得到的含有甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物的混合溶液验证甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物的甲烷降解效率，其降解效果与甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物冻干粉活化后的使用效果一致。
实施例1食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)-MIL-101(Cr)复合物的制备
(1)将MIL-101(Cr)多孔吸附材料，进行微波活化，微波功率200W，微波时间5min；
(2)取培养后的甲基嗜甲基菌10g(Methylophilus methylotrophus)，加入磷酸缓冲溶液(pH为6.8,磷酸氢二钠49mL和磷酸二氢钠52mL，浓度均为0.2mol/L)，形成细胞悬浮液；
(3)然后向细菌悬浮液中加入步骤(1)中活化后的MIL-101(Cr)25g，机械搅拌速度为800r/min，搅拌5min,加入柠檬酸0.052g进行耦合，甲烷氧化菌和MIL-101(Cr)的质量比为1：2.5，搅拌使MIL-101(Cr)与细菌充分混合；
(4)将步骤(3)制备的混合物溶液再放入密封的混合气体容器中，200mL混合气体中甲烷和氧气的浓度体积比为8：2，在30℃条件下进行反应，然后抽取反应后密封气体，运用气相色谱测定其中甲烷的含量，用以验证食甲基嗜甲基菌(Methylophilusmethylotrophus)-MIL-101(Cr)复合物对甲烷的降解效果，结果如图2所示。
(5)将步骤(3)制备的甲烷氧化菌-MIL-101(Cr)复合物加入甘油保护剂，使得在最终的混合体系中制备的复合物与甘油的最终比为1mg/mL：0.014mol/mL，采用冷冻真空干燥制备成冻干粉。
实施例2嗜甲基菌(Methylophilus sp)-MIL-101(Cr)复合物的制备
(1)将MIL-101(Cr)多孔吸附材料，进行微波活化，微波功率500W，微波时间7min；
(2)取甲烷氧化菌10g(Methylophilus sp)，加入磷酸缓冲溶液(pH为6.8,具体为磷酸氢二钠49mL和磷酸二氢钠52mL，浓度均为0.2mol/L)，形成细胞悬浮液。
(3)在细胞悬浮液中加入步骤(1)中活化后的MIL-101(Cr)20g，机械搅拌5min速度为800r/min，加入柠檬酸0.05g进行耦合，甲烷氧化菌和多孔吸附剂的质量比为1：2，搅拌使吸附剂与细菌充分混合。
(4)将步骤(3)制备的混合物溶液放入密封的混合气体容器中，200mL混合气体中甲烷和氧气的浓度体积比为8：2，在30℃条件下进行反应，抽取反应后密封气体，运用气相色谱测定其中甲烷的含量，验证所制备复合物对甲烷的降解效率，结果如图3所示。
(5)将步骤(3)制备的甲烷氧化菌-MIL-101(Cr)复合物加入甘油保护剂，采用冷冻真空干燥制备成冻干粉。
实施例3食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)-纳米氧化铝复合物的制备
(1)将γ-纳米氧化铝采用微波进行活化，微波功率500W，微波时间5min；
(2)取100mg食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)，加入10ml磷酸盐缓冲溶液(0.2mol/L，pH为7)，搅拌10min,形成细胞悬浮液；
(3)向步骤(2)中的细胞悬浮液加入步骤(1)中活化后的250mgγ-纳米氧化铝，通过机械搅拌搅拌10分钟，速度为500r/min，得到最终的反应体系。在最终混合溶液的反应体系中，甲烷氧化菌浓度为10mg/mL，纳米氧化铝浓度为25mg/mL。
(4)将步骤(3)制备的混合物溶液放入密封的20mL混合气体容器中，甲烷和氧气的浓度体积比为8：2，在30℃条件下进行反应，抽取反应后密封气体，运用气相色谱测定其中甲烷的含量，验证所制备复合物对甲烷的降解效率，结果如图4所示。
(5)将步骤(3)制备的甲烷氧化菌-纳米氧化铝复合物加入脱脂乳粉保护剂，采用冷冻真空干燥制备成冻干粉。
实施例4甲基杆菌(Methylobacterium aquaticum)-椰壳活性炭复合物的制备
(1)将椰壳活性炭采用微波进行活化，微波功率200-500W，微波时间2-7min；
(2)取甲基杆菌(Methylobacterium aquaticum)200mg加入10ml磷酸盐缓冲溶液(0.2mol/L，pH为6.8)搅拌8min,形成细胞悬浮液；
(3)向细胞悬浮液加入步骤(1)中活化后的椰壳活性炭300mg，通过机械搅拌10分钟，速度为(750r/min)得到最终的反应体系。在最终的反应体系中，在最终的反应体系中，甲烷氧化菌浓度为20mg/mL，椰壳活性炭的浓度为30mg/mL。
(4)将步骤(3)制备的混合物溶液放入密封的20mL混合气体容器中,甲烷和氧气的体积浓度比为7：3，在37℃条件下进行反应，抽取反应后密封气体，运用气相色谱测定其中甲烷的含量，验证所制备复合物的甲烷降解效率，结果如图5所示。
(5)将步骤(3)制备的甲基杆菌-椰壳活性炭复合物加入甘油保护剂，采用冷冻真空干燥制备成冻干粉。
实施例5甲基杆菌(Methylobacterium sp.)-介孔二氧化硅复合物的制备
(1)将介孔二氧化硅(林粤顺,周红军,周新华,等.化工学报,2016,67(10):4500-4507.)采用微波进行活化，微波功率200-500W，微波时间2-7min；
(2)取甲基杆菌(Methylobacterium sp.)200mg加入10ml磷酸盐缓冲溶液(0.02mol/L)pH为6.5)搅拌10min,形成细胞悬浮液；
(3)向细胞悬浮液加入步骤(1)中活化后的介孔二氧化硅450mg，通过机械搅拌10分钟(500r/min)得到最终的反应体系。在最终的反应体系中，甲基杆菌浓度为20mg/mL，椰壳活性炭的浓度为45mg/mL；
(4)将步骤(3)制备的混合物溶液放入密封的20mL混合气体容器中,甲烷和氧气的浓度体积比为7：3,在30℃条件下进行反应，抽取反应后密封气体，运用气相色谱测定其中甲烷的含量,验证所制备复合物的甲烷降解效率，结果如图6所示。
(5)将步骤(3)制备的甲基杆菌-介孔二氧化硅复合物加入甘油保护剂，采用冷冻真空干燥制备成冻干粉。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。
Claims (8)
1.甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物，其特征在于，其制备方法包括：将甲烷氧化菌与多孔吸附剂在缓冲溶液中耦合得包含所述甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物的混合溶液；所述缓冲溶液选自pH值为6.5-8.0磷酸盐缓冲溶液；所述多孔吸附剂选自无定形金属有机骨架化合物、活性炭、分子筛中的一种或多种组合；所述多孔吸附剂的加入量为5-30mg/mL，所述甲烷氧化菌与所述孔吸附剂的质量比为0.01-5：1；所述甲烷氧化菌的OD600为0.5-0.8。
2.根据权利要求1所述的甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物，其特征在于，所述甲烷氧化菌选自甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基杆菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲基球形属(Methylosphaera)、甲基热菌属(Methylocaldum)、甲基八叠球菌属(Methylosarcina)、甲基弯曲菌属(Methylosinus)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、甲基细胞菌属(Methylocella)和甲基帽菌属(Methylocapsa)中的一种或多种组合。
3.根据权利要求1所述的甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物，其特征在于，所述甲烷氧化菌在未耦合之前，先在30-37℃的热水里快速震荡在1-2s内进行活化；所述多孔吸附剂在未耦合之前，先运用微波进行活化，微波功率200-500W，微波时间2-7min。
4.根据权利要求1所述的甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物，其特征在于，在反应中加入助耦剂。
5.根据权利要求4所述的甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物，其特征在于，所述助耦剂选择柠檬酸，用量为0.01mol-0.1mol/L。
6.根据权利要求1-5任一所述的甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物，其特征在于，将所述包含所述甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物的混合溶液加入冻干保护剂，采用冷冻真空干燥法，制作成甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物冻干粉。
7.权利要求1所述的甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物在制备瓦斯中的甲烷降解剂中的应用。
8.权利要求1所述的甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物在制备甲醇脱氢酶抑制剂中的应用，其特征在于，通过在所述甲烷氧化菌-多孔吸附剂复合物中添加抑制剂制备所述甲醇脱氢酶抑制剂，所述抑制剂选自环氧丙醇、甲酸钠、氯化镁中的一种或几种组合。
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2021
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