CN109423488B - 固定化漆酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种固定化漆酶及其制备方法，该固定化漆酶是以介孔化膨润土为载体，介孔化膨润土上固定有漆酶，介孔化膨润土是以膨润土为原料经酸碱刻蚀后制备得到。其制备方法为将介孔化膨润土与漆酶溶液混合进行振荡吸附，离心，得到固定化漆酶。本发明的固定化漆酶具有操作稳定性好、热稳定性好、酶吸附量大、酶活力强、环境友好型等优点，其制备方法具有操作简便、易于控制、制备成本低、对漆酶固定化效果好、适合大规模制备等优点。

Description

固定化漆酶及其制备方法

技术领域

本发明属于漆酶的固定化领域，涉及一种固定化漆酶及其制备方法，具体涉及一种以介孔化膨润土为载体的固定化漆酶及其制备方法。

背景技术

随着全球对环境中资源、能源以及环境保护需求的日益增加，有着高效性以及高选择性的生物酶催化技术成为解决全球的能源、资源以及环境保护问题的新解决途径。生物酶是由生物所分泌的一种具有高效性、专一性(立体及区域、化学专一性)的蛋白质类生物催化剂。在整个人类历史中，酶的应用起源很早，随着科学技术发展，它的应用范围日益广泛深入，在工农业加工生产、医药治疗、分析化验等方面有着应用，在环境能源领域方面，包括生物传感器、生物燃料电池、废水处理等方面都有着酶的应用，在这些领域内的应用都有着很好的前景，在基础科学研究中占据着非常重要的地位。

生物酶中的漆酶是由紫胶漆树分泌物中发现提取的一种蛋白质，是一种含铜的多酚氧化酶，包括有4个铜离子，是铜蓝氧化酶蛋白的一种。漆酶在有机污染物的催化氧化降解中有着很好的效果，得到了广泛研究。漆酶的氧化底物广泛、能耗低、高效率等优点使得对它的关注越来越多。

漆酶有着很多优点，但仍有些不足。传统应用方法中漆酶催化反应均是在溶液中进行，在上述环境中：(1)游离漆酶不容易回收，会造成酶的浪费；(2)反应物与产物两者之间不易分离；(3)产品回收不好，纯度不高，需要经过纯化；(4)对于高温、pH、有机溶剂等环境因素反应敏感。上述缺点限制了漆酶的大范围的应用。为了克服上述缺点，研究人员尝试用载体负载固定漆酶来提高漆酶的性能以及可适用范围。到目前为止，研究人员已经能合成不同孔径的多孔材料对漆酶进行固定，其中作为固定化漆酶的载体的多孔材料均为有序介孔材料，然而现有有序介孔材料对制备工艺有着很高的依赖性，同时有序介孔材料的制备工艺存在成本高、对环境潜在危害大、耗能高、生产周期相对长、使用有毒有害试剂多等缺点。可见，现有以有序介孔材料为载体的固定化漆酶中也就存在一系列制备成本高、耗能高、使用有毒有害试剂多等问题。另外，现有无序介孔材料制备工艺中，与有序介孔材料类似，也会用到一定量的昂贵有害的模板剂、前驱体剂等，存在成本高、对环境潜在危害大、耗能高、生产周期相对长、使用有毒有害试剂多等缺点。虽然现有以陶瓷材料、自然矿物高岭土为原料制备无序介孔材料的工艺能够降低成本、减少对环境的潜在危害，然而以它们为原料的制备工艺中仍存在不足，如以高岭土为原料的制备工艺分离步骤中由于颗粒细小、较易团聚，不易分离，因而在制备过程中高岭土不能够稳定的分散在水溶液中，这会影响刻蚀介孔化效率，从而无法保证孔径分布的均匀性，由此制得的介孔材料作为载体时适用范围相对小，且固定化性能不理想；同样的，以陶瓷材料为原料制得的介孔材料作为载体时也存在固定化性能并不理想的问题。因此，如何全面改善现有介孔材料中存在的问题和不足，获得一种适用广、制作方法简便、性能优异、成本低廉的介孔材料作为固定漆酶的载体，对于提供一种操作稳定性好、热稳定性好、酶吸附量大、酶活力强、环境友好型的固定化漆酶具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种操作稳定性好、热稳定性好、酶吸附量大、酶活力强、环境友好型的固定化漆酶，还提供了一种操作简便、易于控制、制备成本低、对漆酶固定化效果好、适合大规模制备的固定化漆酶的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种固定化漆酶，所述固定化漆酶是以介孔化膨润土为载体，所述介孔化膨润土上固定有漆酶；所述介孔化膨润土是以膨润土为原料经酸碱刻蚀后制备得到。

上述的固定化漆酶中，优选的，所述介孔化膨润土包括硅氧化物、铝氧化物、镁氧化物。

上述的固定化漆酶中，优选的，所述介孔化膨润土为层状粘土矿物。

上述的固定化漆酶中，优选的，所述介孔化膨润土的粒径为1μm～20μm。

上述的固定化漆酶中，优选的，所述介孔化膨润土的平均孔径为2nm～10nm。

上述的固定化漆酶中，优选的，所述介孔化膨润土的比表面积为244.622m²/g。

上述的固定化漆酶中，优选的，所述固定化漆酶中所述漆酶的固定量为16.073mg/g。

上述的固定化漆酶中，优选的，所述漆酶的尺寸为6.5nm×5.5nm×4.5nm。

作为一个总的发明构思，本发明还提供了一种上述的固定化漆酶的制备方法，包括以下步骤：将介孔化膨润土与漆酶溶液混合进行振荡吸附，离心，得到固定化漆酶。

上述的制备方法中，优选的，所述介孔化膨润土与所述漆酶溶液的质量体积比为400mg∶100mL。

上述的制备方法中，优选的，所述漆酶溶液由漆酶粉末溶于pH值为3～7的缓冲溶液中制备得到；所述漆酶溶液的初始浓度为0.1mg/mL～4mg/mL。

上述的制备方法中，优选的，所述缓冲溶液为柠檬酸缓冲液或磷酸盐缓冲溶液；所述磷酸盐缓冲溶液由磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液混合后制备得到；所述柠檬酸缓冲液由柠檬酸溶液和柠檬酸钠溶液混合后配制得到。

上述的制备方法中，优选的，所述介孔化膨润土的制备方法包括以下步骤：

S1、将膨润土与碱溶液混合，在转速为5r/min～60r/min、温度为50℃～120℃进行碱刻蚀，洗涤至中性，在温度为80℃～120℃下烘干，得到碱刻蚀膨润土；

S2、将碱刻蚀膨润土与酸溶液混合，在转速为5r/min～60r/min、温度为50℃～100℃进行酸刻蚀，洗涤至中性，在温度为80℃～120℃下烘干，研磨，过100目～200目筛，得到介孔化膨润土。

上述的制备方法中，优选的，所述步骤S1中：所述膨润土与碱溶液的质量体积比为4g～10g∶100mL；所述碱溶液为NaOH溶液；所述碱溶液的浓度为5M～10M；所述碱刻蚀的时间为5h～12h；所述烘干的时间为5h～12h；

和/或，所述步骤S2中：所述碱刻蚀膨润土与酸溶液的质量体积比为4g～10g∶100mL；所述酸溶液为HCl溶液；所述酸溶液的浓度为2M～8M；所述酸刻蚀的时间为5h～10h；所述烘干的时间为5h～12h。

上述的制备方法中，优选的，所述振荡吸附的转速为150r/min～300r/min；所述振荡吸附的温度为20℃～40℃；所述振荡吸附的时间为5min～120min；

和/或，所述离心的转速为4000r/min～10000r/min；所述离心的时间为5min～15min。

本发明中，漆酶固定量的测定方法，如下：

漆酶的固定量是固定前加入的酶量减去固定后上清液中的剩余酶量的差值。漆酶与介孔化膨润土经振荡吸附后，进行离心分离，取离心所得上清液，用紫外分光光度计测定上清液在275nm处的吸光度，得到上清液中剩余漆酶的浓度，根据公式(1)计算得到不同情况下漆酶在介孔化膨润土上的固定量。

式(1)中：q_t—漆酶的吸附量，(mg/g)；

C₀—漆酶的初始浓度，(mg/mL)；

C_t—固定化后上清液中漆酶剩余浓度，(mg/mL)；

V—固定化体系的总体积，(mL)；

m—载体介孔化膨润土的质量，(g)。

本发明中，固定化漆酶与游离漆酶活性的测定方法，如下：

(1)固定化漆酶：取1mg固定化漆酶，加入到2mL pH为7的PBS缓冲溶液与0.9mL1mmol/L的ABTS溶液的混合溶液中，于25℃环境中反应5min，冰浴终止反应，离心分离，取离心所得上清液，测定上清液在420nm处吸光度的变化值。以2mL pH为7的PBS缓冲溶液与0.9mL蒸馏水的混合溶液为背底溶液。固定化漆酶活性用每克载体的酶活单位(U/g)表示，酶活计算用公式(2)。

(2)游离漆酶：取0.1mL游离漆酶，加入到2mL pH为7的PBS缓冲溶液与0.9mL1mmol/L的ABTS溶液的混合溶液中，于25℃环境中反应5min，冰浴终止反应，离心分离，取离心所得上清液，测定上清液在420nm处吸光度的变化值。以2mL pH为7的PBS缓冲溶液与0.9mL蒸馏水的混合溶液为背底溶液。游离漆酶活性用酶活单位(U/L)表示，酶活计算用公式(2)。

(3)酶活的计算公式：

式(2)中：V为反应体系体积(mL)、ε为摩尔消光系数(cm²·mol^-1)、v(m)为液体(固体)样品量(mL/mg)、L为比色杯光径(cm)、ΔA为吸光度变化、10⁶为将mol换算成μmol、Δt为反应时间(min)。

本发明的创新点在于：

本发明以介孔化膨润土为载体，该载体以膨润土为原料，通过利用膨润土本身的孔道(微孔、介孔、大孔)、结构及其好的分散性、膨胀性、阳离子交换性能等特点，采用酸碱刻蚀法进行改性，以简便的方法增加膨润土内部的介孔孔道，从而制备得到一种比表面积高、孔体积高、孔径分布更均匀、环境友好型的介孔化膨润土，是一种适用广、制作方法简便、性能优异、成本低廉的介孔材料。本发明中通过将漆酶固定在介孔化膨润土上(具体为漆酶固定在介孔化膨润土的表面和固定在介孔化膨润土的孔道中)，获得了一种操作稳定性好、热稳定性好、酶吸附量大、酶活力强、环境友好型的固定化漆酶。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、本发明提供了一种固定化漆酶，以介孔化膨润土为载体，其中介孔化膨润土是以膨润土为原料经酸碱刻蚀后制备得到。本发明中，通过采用碱处理和酸处理对膨润土进行刻蚀，实现了对膨润土的介孔化，减小了膨润土的孔径尺寸，极大地增加了膨润土的比表面积，得到了一种比表面积高、孔体积高、孔径分布更均匀、环境友好型的介孔化膨润土材料；同时，相比于其他粘土矿物材料，本发明的介孔化膨润土能够更好地在溶液中分散均匀，从而能够更容易实现对漆酶的固定化以及显著提高对漆酶的固定效率，为漆酶的固定化提供一种新的载体和途径。本发明中，介孔化膨润土具有与漆酶分子尺寸相适应的孔径大小使得以介孔化膨润土为载体的固定化漆酶具有更好的操作稳定性；介孔化膨润土具有高的耐热性能也使得固定化漆酶具有更好的热稳定性能；介孔化膨润土具有高比表面积使得其能够固定化更多的漆酶；同时，介孔化膨润土具有环境友好特性不会对漆酶产生毒害作用，且不会造成二次污染。因此，本发明以介孔化膨润土为载体的固定化漆酶具有操作稳定性好、热稳定性好、酶吸附量大、酶活力强、清洁无污染，对环境无毒害作用等优点，在有机污染物的催化氧化降解中有着很好的应用前景。

2、本发明还提供了一种固定化漆酶的制备方法，通过将介孔化膨润土和漆酶溶液混合利用物理吸附进行固定成功制备得到固定化漆酶，具有操作简便、易于控制、制备成本低、对漆酶固定化效果好、适合大规模制备等优点。

3、本发明的制备方法中，以膨润土为原料制备介孔化膨润土，其中膨润土是一种环境友好、廉价的环境矿物材料，其来源广泛，成本低廉，且清洁无污染，对环境无毒害作用，具有比表面积高、多孔、颗粒细小等优点。相比其他粘土材料(如高岭土)，本发明中采用的膨润土能够稳定分散在水溶液中，通过更好地在水溶液中进行分散从而提高其刻蚀介孔化效率，并最终得到高比表面积、高孔隙率、孔径更加均匀的介孔化膨润土，同时，制备得到的介孔化膨润土作为载体时有着更好的固定化性能。

4、本发明的制备方法中，采用酸碱刻蚀法制备介孔化膨润土，其所用的试剂易于取得，可重复使用，具有制备成本低的优点，同时该制备方法具有制备工艺简单、反应条件温和、易于操作、适合大规模制备的优点。

附图说明

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

图1为本发明实施例1中制备的介孔化膨润土、固定化漆酶和对比例1中制备的未介孔化膨润土的SEM图，其中(a)为未介孔化膨润土，(b)为介孔化膨润土，(c)为固定化漆酶。

图2为本发明实施例1中制备的介孔化膨润土、固定化漆酶和对比例1中制备的未介孔化膨润土的EDS图，其中(a)为未介孔化膨润土，(b)为介孔化膨润土，(c)为固定化漆酶。

图3为本发明实施例2中不同固定化时间对固定化漆酶的影响图。

图4为本发明实施例3中不同初始浓度漆酶溶液对固定化漆酶的影响图。

图5为本发明实施例4中不同pH值漆酶溶液对固定化漆酶的影响图。

图6为本发明实施例5中固定化漆酶的操作稳定性效果图。

图7为本发明实施例6中不同温度条件下固定化漆酶和游离漆酶热稳定性效果的对比图。

图8为本发明实施例7中不同介孔化材料对漆酶的固定化效果对比图。

图9为本发明实施例8中固定化漆酶对盐酸四环素废水的降解效果。

图10为本发明实施例8中固定化漆酶降解抗生素前后的SEM对比图，其中(a)为降解前的固定化漆酶，(b)为降解后的固定化漆酶。

图11为本发明实施例8中固定化漆酶降解抗生素前后的EDS对比图，其中(a)为降解前的固定化漆酶，(b)为降解后的固定化漆酶。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。以下实施例中，若无特别说明，所得数据均是三次以上重复实验的平均值。

实施例1

一种固定化漆酶，该固定化漆酶是以介孔化膨润土为载体，介孔化膨润土上固定有漆酶(具体为漆酶固定在介孔化膨润土的表面和固定在介孔化膨润土的孔道中)，其中介孔化膨润土是以膨润土为原料经酸碱刻蚀后制备得到。

本实施例中，介孔化膨润土包括硅氧化物、铝氧化物、镁氧化物，是层状粘土矿物，其粒径为1μm～20μm，平均孔径为5.531nm，比表面积为244.622m²/g。

本实施例中，固定化漆酶中漆酶的固定量为16.073mg/g。漆酶是一种尺寸为6.5nm×5.5nm×4.5nm的生物酶，是一种易得且具有优良特性的氧化酶类。

一种上述本实施例中的固定化漆酶的制备方法，包括以下步骤：

以介孔化膨润土为载体，按照400mg∶100mL的固液比例(即载体与漆酶溶液的质量体积比为400mg∶100mL)，将介孔化膨润土加入到初始浓度为2mg/mL的漆酶溶液中，采用物理吸附的方法，利用摇床在转速为200r/min、温度为30℃的条件下振荡吸附30min，然后将振荡吸附后的混合液在转速为8000r/min下离心分离5min，所得沉淀物即为固定化漆酶，用缓冲液清洗数次，再在-100℃下冷冻干燥24h，于4℃下储存。经测试，在此条件下制得的固定化漆酶的酶活为33kU/g。

上述的介孔化膨润土由以下方法制备得到：以膨润土为原料，按照固液比例为5g/100mL(即膨润土与NaOH溶液的质量体积比为5g∶100mL)，将膨润土加入到浓度为6M的NaOH溶液中，在转速为30r/min、温度为100℃下进行碱刻蚀6h；刻蚀完成后，过滤，将过滤所得固体物质用超纯水洗涤至中性，在110℃(干燥温度为80℃～120℃均可实施)下烘干12h(烘干时间为5h～12h均可实施)，得到碱刻蚀膨润土。按照固液比例为5g/100mL(即碱刻蚀膨润土与HCl溶液的质量体积比为5g∶100mL)，将上述的碱刻蚀膨润土加入到浓度为5M的HCl溶液中，在转速为30r/min、温度为80℃的条件下酸刻蚀6h；刻蚀完成后，过滤，将过滤所得固体物质用超纯水洗涤至中性，在110℃(干燥温度为80℃～120℃均可实施)下烘干12h(烘干时间为5h～12h均可实施)，研磨，过100目筛，得到介孔化膨润土。

上述的漆酶溶液由以下方法制备得到：按体积比为8.2∶11.8，将浓度为0.1M的柠檬酸溶液和浓度为0.1M的柠檬酸钠溶液混合，配制得到pH值为5.0的柠檬酸缓冲溶液。称取200mg漆酶粉末溶解于pH值为5.0的柠檬酸酸盐缓冲溶液中，并用100mL的容量瓶定容，得到浓度为2mg/mL的漆酶溶液。

对比例1

一种未介孔化膨润土的制备方法，包括以下步骤：将膨润土置于陶瓷坩埚中于110℃下烘干，时间为12h，直至恒重，得到未介孔化膨润土。

对本发明实施例1中制备的介孔化膨润土、固定化漆酶和对比例1中制备的未介孔化膨润土进行SEM检测分析，结果如图1所示。图1为本发明实施例1中制备的介孔化膨润土、固定化漆酶和对比例1中制备的未介孔化膨润土的SEM图，其中(a)为未介孔化膨润土，(b)为介孔化膨润土，(c)为固定化漆酶。由图1(a)和图1(b)可知，本发明中，膨润土经碱刻蚀和酸刻蚀后所得介孔化膨润土为层状粘土矿物，其粒径为1μm～20μm，且产生了更多的孔隙，具有更高的孔隙率。由图1(b)和图1(c)可知，本发明的固定化漆酶以介孔化膨润土为载体，漆酶固定在介孔化膨润土上和固定在介孔化膨润土中，且漆酶经固定化后所得固定化漆酶的结构无变化。

对本发明实施例1中制备的介孔化膨润土、固定化漆酶和对比例1中制备的未介孔化膨润土分别进行EDS检测分析，结果如图2所示。图2为本发明实施例1中制备的介孔化膨润土、固定化漆酶和对比例1中制备的未介孔化膨润土的EDS图，其中(a)为未介孔化膨润土，(b)为介孔化膨润土，(c)为固定化漆酶。由图2可知，膨润土经碱刻蚀和酸刻蚀后所得介孔化膨润土中含有Al、Mg、Na、Ti、Si、O等元素，即该介孔化膨润土中包含有硅氧化物、铝氧化物、镁氧化物等物质。虽然碱酸刻蚀会使一些离子发生交换流失，导致介孔化膨润土中Al、Mg、Na、Ti、O等元素的含量有一定变化，但变化不大，而Si元素的含量在介孔化及固定化后均无变化。另外，从图2中也可以确定，将漆酶固定到介孔化膨润土后所得固定化漆酶中的元素组成并没有很大的变化，但是出现了C元素，而漆酶作为蛋白质含有C，即固定化漆酶中的C元素来源于漆酶，这也说明漆酶已经成功的固定在介孔化膨润土的表面和固定在介孔化膨润土的孔道中。

表1为本发明实施例1中制备的介孔化膨润土与对比例1中制备的未介孔化膨润土在比表面积、孔体积、平均孔径和最可几孔径方面的对比数据。由表1可知，对膨润土进行碱刻蚀和酸刻蚀，显著的提高了材料的比表面积、孔体积，同时降低了材料的平均孔径，其中比表面积由3.297m²/g增加到244.622m²/g，增加了74倍；孔体积由0.02246cm³/g增加到0.33830cm³/g，增加了15倍；平均孔径由27.26nm减少到5.531nm，分布在2nm～10nm之间；最可几孔径孔由4.074nm增加到4.770nm，分布在2nm～10nm之间。由此可见，经过碱酸刻蚀后，本发明的介孔化膨润土具有更高的比表面积、更高的孔隙率、更高的孔体积，且孔径分布更加均匀，最可几孔径分布在2nm～10nm之间。

表1本发明实施例1中制备的介孔化膨润土与对比例1中制备的未介孔化膨润土在比表面积、孔体积、平均孔径和最可几孔径方面的对比数据

实施例2

一种固定化漆酶的制备方法，包括以下步骤：

以实施例1制得的介孔化膨润土为载体，按照400mg∶100mL的固液比例(即载体与漆酶溶液的质量体积比为400mg∶100mL)，将介孔化膨润土加入到初始浓度为1mg/mL的漆酶溶液中，采用物理吸附的方法，利用摇床在转速为200rpm、温度为30℃的条件下进行振荡吸附；振荡吸附的时间为15min、30min、60min、120min和180min时，取振荡吸附后的混合液，在转速为4000r/min下离心分离5min，得到沉淀物和上清液，其中离心所得沉淀物即为固定化漆酶，用缓冲液清洗数次，再在-100℃下冷冻干燥24h，于4℃下储存。取离心所得上清液，利用紫外分光光度计测定其中剩余酶的含量及酶活，得到固定化漆酶的酶活和相对活性，结果如图3所示。

上述的漆酶溶液由以下方法制备得到：称取100mg漆酶粉末溶解于浓度为0.1M、pH值为5的柠檬酸缓冲溶液中，并用100mL的容量瓶定容，得到浓度为1mg/mL的漆酶溶液。

图3为本发明实施例2中不同固定化时间对固定化漆酶的影响图。由图3可知，在固定化时间达到30min时，固定化漆酶的活性及相对活性基本达到最大值，其中固定化漆酶的活性及相对活性分别为794.44U/g、100％。直到120min，固定化漆酶的活性及相对活性基本维持不变，即固定化时间为30min～120min，介孔膨润土对漆酶的固定量达到饱和状态。而在120min后固定化漆酶的活性及相对活性反而开始下降，其可能的原因是长时间的振荡吸附使得载体的结构产生了一定的变化，致使漆酶脱落，漆酶的损失量增加，从而使得固定化漆酶活性及相对活性下降。由此可见，固定化时间为30min～120min时，固定化漆酶中漆酶的固定量和活性达到最佳状态，即在该优选的固定化时间内，本发明能够制备具有较好的活性和相对活性的固定化漆酶。

实施例3

一种固定化漆酶的制备方法，包括以下步骤：

以实施例1中制得的介孔化膨润土为载体，按照400mg∶100mL的固液比例(即载体与漆酶溶液的质量体积比为400mg∶100mL)，将六份介孔化膨润土分别加入到初始浓度为0.1mg/mL、0.5mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL和4.0mg/mL的漆酶溶液中，采用物理吸附的方法，利用摇床在转速为200rpm、温度为30℃的条件下振荡吸附30min，取振荡吸附后的混合液在转速为8000r/min下离心分离5min，所得沉淀物即为固定化漆酶，用缓冲液清洗数次，再在-100℃下冷冻干燥24h，于4℃下储存。分别测定不同初始浓度漆酶溶液的条件下，固定化漆酶的相对活性(以最佳酶活性值为100％)，结果如图4所示。

上述的漆酶溶液由以下方法制备得到：称取10mg、50mg、80mg、100mg、200mg、400mg漆酶粉末分别溶解于浓度为0.1M、pH值为5的柠檬酸缓冲溶液中，并分别用100mL的容量瓶定容，得到初始浓度分别为0.1mg/mL、0.5mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL和4.0mg/mL的漆酶溶液。

图4为本发明实施例3中不同初始浓度漆酶溶液对固定化漆酶的影响图。由图4可知，随着漆酶溶液初始浓度的增加，固定化漆酶的相对活性不断增加；漆酶溶液初始浓度增加到2mg/mL时，固定化漆酶的相对活性达到最大，为100％。

实施例4

一种固定化漆酶的制备方法，包括以下步骤：

以实施例1中制得的介孔化膨润土为载体，按照400mg∶100mL的固液比例(即载体与漆酶溶液的质量体积比为400mg∶100mL)，将六份介孔化膨润土分别加入到pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的漆酶溶液(该漆酶溶液的初始浓度为2.0mg/mL)中，采用物理吸附的方法，利用摇床在转速为200rpm、温度为30℃的条件下振荡吸附30min，取振荡吸附后的混合液在转速为8000r/min下离心分离5min，所得沉淀物即为固定化漆酶，用缓冲液清洗数次，再在-100℃下冷冻干燥24h，于4℃下储存。用紫外分光光度计测定固定化漆酶氧化2,2-连氮-二(3-乙基并噻-6-磺酸，ABTS)后所得溶液在420nm处的吸光度变化，得到固定化漆酶的相对活性情况，结果如图5所示。

上述采用的漆酶溶液由以下方法制备得到：称取三份漆酶粉末，每份200mg，分别溶解于pH值为3.0、4.0、5.0的柠檬酸缓冲液(浓度为0.1M)中，并用100mL的容量瓶定容，得到pH值分别为3.0、4.0、5.0的漆酶溶液。

称取三份漆酶粉末，每份200mg，分别溶解于pH值为6.0、7.0、8.0的磷酸盐缓冲溶液(浓度为0.1M)中，并分别用100mL的容量瓶定容，分别得到pH值分别为6.0、7.0、8.0的漆酶溶液。

同时，以游离漆酶作为对照组，测定不同pH值对游离漆酶活性的影响，结果如图5所示。

图5为本发明实施例4中不同pH值漆酶溶液对固定化漆酶的影响图。由图5可知，在pH值为4时，游离漆酶的相对活性达到最大，而本发明固定化漆酶的相对活性在pH值为5时达到最大，为100％。

由图3、4、5可知，采用本发明制备方法制备固定化漆酶的过程中，固定化时间、漆酶溶液的初始浓度、漆酶溶液的pH均会影响漆酶的固定化效果，其中固定化时间为30min、漆酶溶液的初始浓度为2mg/mL、漆酶溶液的pH值为5的条件下能够制备最为理想的固定化漆酶，因此本发明制备固定化漆酶的最佳条件为固定化时间为30min、漆酶溶液的初始浓度为2mg/mL、漆酶溶液的pH值为5。

实施例5

考察本发明固定化漆酶的操作稳定性，利用实施例1中制备的固定化漆酶进行操作稳定性实验，具体操作过程如下：

在30℃下，将固定化漆酶与0.5mM ABTS反应，用柠檬酸缓冲液(浓度为0.1M、pH值为5)冲洗三次，离心分离，得到反应后的固定化漆酶，测定固定化漆酶的酶活；将上述操作重复10次，以测定固定化漆酶的操作稳定性，其结果如图6所示。

图6为本发明实施例5中固定化漆酶的操作稳定性效果图。由图6可知，在第5次操作后，酶活降低相对较大，这可能是因为在缓冲液洗涤过程中，部分固定在介孔材料上的漆酶被较大量洗脱，导致酶活下降幅度大，之后基本保持不变，可能是因为此漆酶固定于材料内部，不易被洗脱。在经过10次重复操作后，本发明固定化漆酶的相对活性仍能达到27.34044％。可见，本发明固定化漆酶有一定的操作稳定性。

实施例6

考察本发明固定化漆酶的热稳定性，利用实施例1中制备的固定化漆酶进行热稳定性实验，具体操作过程如下：

将固定化漆酶置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的柠檬酸缓冲溶液(该柠檬酸缓冲溶液的浓度为0.1M、pH值为5)中热处理1h，然后置于室温下1h以测定固定化漆酶的活性，从而衡量酶在热处理失活后，失活是否具有可逆性，并研究固定化对可逆性是否有影响，检测其氧化ABTS的活性，得到不同温度下固定化漆酶的相对活性(以开始时固定化漆酶为100％)，结果如图7所示。

同时，以游离漆酶作为对照组，测定不同温度下游离漆酶的相对活性(以开始时游离酶活性为100％)，结果如图7所示。

图7为本发明实施例6中不同温度条件下固定化漆酶和游离漆酶热稳定性效果的对比图。由图7可知，随着温度的升高，固定化漆酶的活性基本无变化，当温度达到80℃时，固定化漆酶的相对活性仍有96.61272％；而游离漆酶则极易受到温度的影响，随着温度升高到60℃(即温度高于50℃)时，游离漆酶的相对活性由99.76527％降低到75.51794％，特别地当温度达到70℃及以上时，游离漆酶基本失去活性(相对活性降至0.53686％)。由此可见，本发明固定化漆酶的热稳定性较强，温度对固定化漆酶的不可逆损伤较小，这可能是由于本发明中制得的介孔化膨润土本身具有较好的热耐受性，同时漆酶有效的固定于介孔化膨润土上，使得漆酶受温度的影响更小。

结合图3、4、5、6、7中的结果可知，本发明固定化漆酶具有较好的固定化效果，同时相对游离漆酶有着更好的操作稳定性及热稳定性，可重复利用率高，环境适应力强。

实施例7

考察不同介孔化材料对漆酶的固定化效果，具体包括以下步骤：

(1)介孔化材料的制备：

(1.1)介孔化膨润土B1的制备：与实施例1相同。

(1.2)介孔化膨润土B2的制备：称取40g NaOH至烧杯中，加适量超纯水溶解转移到500mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度线，摇匀，即可得到浓度为2M的NaOH溶液。将膨润土在1000℃下煅烧2h，待其自然冷却至室温后取出，得到煅烧后的膨润土。以固液比例为5g/100mL(即煅烧后的膨润土与NaOH溶液的质量体积比为5g∶100mL)，将煅烧后的膨润土加入到浓度为2M的NaOH溶液中，在转速为30r/min、温度为80℃下进行碱刻蚀6h，刻蚀完成后，过滤，将过滤所得固体物质用超纯水洗涤至中性，在110℃下烘干，得到介孔化膨润土，编号为B2。

(1.3)介孔化高岭土K1的制备：称取40g NaOH至烧杯中，加适量超纯水溶解转移到500mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度线，摇匀，即可得到浓度为2M的NaOH溶液。将高岭土在1000℃下煅烧2h，待其自然冷却至室温后取出，得到煅烧后的高岭土。以固液比例为5g/100mL(即煅烧后的高岭土与NaOH溶液的质量体积比为5g∶100mL)，将煅烧后的高岭土加入到浓度为2M的NaOH溶液中，在转速为30r/min、温度为80℃下进行碱刻蚀6h，刻蚀完成后，过滤，将过滤所得固体物质用超纯水洗涤至中性，在110℃下烘干，得到介孔化高岭土，编号为K1。

(1.4)介孔化高岭土K2的制备：以固液比为5g/100ml，将高岭土加入到6mol/L的NaOH溶液中进行反应，反应温度为100℃，反应时间为6h，反应完成后，将超纯水进行洗涤，在110℃下烘干。以固液比为5g/100ml，将上述碱处理后的高岭土加入到5mol/L的HCl溶液中进行反应，反应温度为80℃，反应时间为6h，反应完成后，用超纯水进行洗涤，在110℃下烘干即得到介孔材料，编号为K2。

(2)溶液的配制：

(2.1)配制pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS)：称取35.814g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)，用去离子水溶解后移入500ml容量瓶中定容备用，得到浓度为0.2M的磷酸氢二钠溶液。称取15.601g磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)，用去离子水溶解后移入500ml容量瓶中定容备用，得到浓度为0.2M的磷酸二氢钠溶液。取上述的磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液按一定的配比混合，直至混合溶液的pH为7.0，得到磷酸盐缓冲溶液，在4℃下保存备用。

(2.2)配制漆酶溶液：称取10mg漆酶粉末溶解于pH为7.0的PBS溶液中，并用100mL的容量瓶定容，得到浓度为0.1mg/mL的漆酶溶液。

(3)漆酶的固定

以介孔化膨润土(B1)、介孔化膨润土(B2)、介孔化高岭土(K1)、介孔化高岭土(K2)作为载体，按照400mg∶100mL的固液比例(即载体与漆酶溶液的质量体积比为400mg∶100mL)，将上述载体分别加入到上述步骤(2)的漆酶溶液中，采用物理吸附的方法，利用摇床在转速为200r/min、温度为30℃的条件下振荡吸附30min，然后将振荡吸附后的混合液在转速为5000r/min下离心分离8min，所得沉淀物即为固定化漆酶，用缓冲液清洗数次，再在-100℃下冷冻干燥24h，于4℃下储存。

图8为本发明实施例7中不同介孔化材料对漆酶的固定化效果对比图。从图8可知，以本发明介孔化膨润土(B1)为载体，对漆酶的固定化效果最好，在振荡30min后对游离漆酶的固定效果基本达到最佳，此时固定化漆酶的酶活力达到780.56U/g，直到120min后开始下降，即振荡30min-120min实现了对漆酶的有效固定。而以介孔化膨润土(B2)为载体的固定化漆酶，在振荡30min时酶活力达到最大，为447.12U/g，随后对漆酶的固定化效果出现拐点，酶活力下降明显，即以对比文件2中介孔化膨润土(B2)为载体对漆酶的固定化稳定效果较差。以介孔化高岭土(K1)为载体的固定化漆酶，其酶活力随着振荡时间的增加而增加，在振荡120min时酶活力达到最大，为552.37U/g，然后对漆酶的固定化效果出现拐点，酶活力下降明显，即以介孔化高岭土(K1)为载体对漆酶的固定化效果也较差。另外，以介孔化高岭土(K2)为载体的固定化漆酶，其酶活力随着振荡时间的增加而增加，在振荡60min时酶活力达到最大，为237.64U/g，然后对漆酶的固定化效果在120min后出现拐点，酶活力下降明显，即以介孔化高岭土(K2)为载体对漆酶的固定化效果也较差。造成上述现象的原因可能是介孔化膨润土(B2)、介孔化高岭土(K1)分别为膨润土及高岭土经煅烧、碱刻蚀后制备得到，介孔化高岭土(K2)则为高岭土经碱刻蚀、酸刻蚀后制备得到，这三种材料经过高温煅烧以及酸碱刻蚀过程后，降低了材料的孔隙率、孔径以及比表面积，破坏了材料原有利于固定化漆酶的结构。由此可见，本发明的介孔化膨润土作为载体，更容易实现对漆酶的固定化，取得了更好的固定化效果。

实施例8

为考察本发明的固定化漆酶对盐酸四环素废水的处理效果，将实施例1中制备的固定化漆酶用于处理抗生素废水，具体步骤如下：

按照添加量为0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、10mg/mL(即每毫升盐酸四环素废水中分别添加固定化漆酶0.5mg、1mg、2mg、4mg、6mg、10mg)，将固定化漆酶与初始浓度为10mg/L的盐酸四环素废水混合，同时加入介体物质(该介体物质为1-羟基苯并三氮唑溶液，简称HBT，作用是作为反应介体，起着氧化耦合作用；该介体物质在反应体系中的浓度为0.5mmol/L)和柠檬酸缓冲溶液(其作用是提供定值pH的反应环境，具体为通过加入柠檬酸溶液使反应体系中的pH值为5)，混合均匀后，在转速为200r/min、温度为30℃降解处理30min，完成对废水中盐酸四环素的降解处理。

图9为本发明实施例8中固定化漆酶对盐酸四环素废水的降解效果。由图9可知，添加量为4mg/mL时，本发明固定化漆酶对盐酸四环素的降解率达到最大，为50.81％。另外，添加量为2mg/mL时，本发明固定化漆酶对盐酸四环素的单位降解量(去除量)达到最大，为1.82mg/g。由此可见，本发明固定化漆酶对抗生素废水具有较好的处理能力。

对实施例8中降解盐酸四环素后的固定化漆酶(即为添加量为2mg/mL时的固定化漆酶)进行SEM检测分析，结果如图10所示。图10为本发明实施例8中固定化漆酶降解抗生素前后的SEM对比图，其中(a)为降解前的固定化漆酶，(b)为降解后的固定化漆酶。由图10可知，本发明的固定化漆酶在降解盐酸四环素前后，结构上没有发生变化，这说明本发明的固定化漆酶有着更好环境适应性，具有很好的实际应用潜能。

对实施例8中降解盐酸四环素后的固定化漆酶(即为添加量为2mg/mL时的固定化漆酶)进行EDS检测分析，结果如图11所示。图11为本发明实施例8中固定化漆酶降解抗生素前后的EDS对比图，其中(a)为降解前的固定化漆酶，(b)为降解后的固定化漆酶。由图11可知，本发明的固定化漆酶在降解盐酸四环素前后，在组成成分上没有发生变化，这同样也说明本发明的固定化漆酶有着更好环境适应性。

以上实施例仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种固定化漆酶，其特征在于，所述固定化漆酶是以介孔化膨润土为载体，所述介孔化膨润土上固定有漆酶；所述介孔化膨润土是以膨润土为原料经酸碱刻蚀后制备得到；所述介孔化膨润土包括硅氧化物、铝氧化物、镁氧化物；所述介孔化膨润土为层状粘土矿物；所述介孔化膨润土的粒径为1μm～20μm；所述介孔化膨润土的平均孔径为2nm～10nm；所述介孔化膨润土的比表面积为244.622m²/g；所述介孔化膨润土的最可几孔径孔为4.770nm；

所述介孔化膨润土的制备方法包括以下步骤：

（1）将膨润土与碱溶液混合，在转速为5r/min～60r/min、温度为50℃～120℃进行碱刻蚀，洗涤至中性，在温度为80℃～120℃下烘干，得到碱刻蚀膨润土；

（2）将碱刻蚀膨润土与酸溶液混合，在转速为5r/min～60r/min、温度为50℃～100℃进行酸刻蚀，洗涤至中性，在温度为80℃～120℃下烘干，研磨，过100目～200目筛，得到介孔化膨润土。

2.根据权利要求1所述的固定化漆酶，其特征在于，所述固定化漆酶中所述漆酶的固定量为16.073mg/g；所述漆酶的尺寸为6.5 nm×5.5 nm×4.5nm。

3.一种如权利要求1或2所述的固定化漆酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将介孔化膨润土与漆酶溶液混合进行振荡吸附，离心，得到固定化漆酶。

4.根据权利要求3中所述的制备方法，其特征在于，所述介孔化膨润土与所述漆酶溶液的质量体积比为400mg∶100mL。

5.根据权利要求4中所述的制备方法，其特征在于，所述漆酶溶液由漆酶粉末溶于pH值为3～7的缓冲溶液中制备得到；所述漆酶溶液的初始浓度为0.1 mg/mL～4mg/mL。

6.根据权利要求5中所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液为柠檬酸缓冲液或磷酸盐缓冲溶液；所述磷酸盐缓冲溶液由磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液混合后制备得到；所述柠檬酸缓冲液由柠檬酸溶液和柠檬酸钠溶液混合后配制得到。

7.根据权利要求3～6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述介孔化膨润土的制备方法包括以下步骤：

S1、将膨润土与碱溶液混合，在转速为5r/min～60r/min、温度为50℃～120℃进行碱刻蚀，洗涤至中性，在温度为80℃～120℃下烘干，得到碱刻蚀膨润土；

S2、将碱刻蚀膨润土与酸溶液混合，在转速为5r/min～60r/min、温度为50℃～100℃进行酸刻蚀，洗涤至中性，在温度为80℃～120℃下烘干，研磨，过100目～200目筛，得到介孔化膨润土。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中：所述膨润土与碱溶液的质量体积比为4g～10g∶100mL；所述碱溶液为NaOH溶液；所述碱溶液的浓度为5M～10M；所述碱刻蚀的时间为5h～12h；所述烘干的时间为5h～12h；

和/或，所述步骤S2中：所述碱刻蚀膨润土与酸溶液的质量体积比为4g～10g∶100mL；所述酸溶液为HCl溶液；所述酸溶液的浓度为2M～8M；所述酸刻蚀的时间为5h～10h；所述烘干的时间为5h～12h。

9.根据权利要求3～6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述振荡吸附的转速为150r/min～300r/min；所述振荡吸附的温度为20℃～40℃；所述振荡吸附的时间为5min～120min；

和/或，所述离心的转速为4000r/min～10000r/min；所述离心的时间为5min～15min。

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