CN113072458B - 具有抗衰老活性的玫烟色菌素a及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有抗衰老活性的玫烟色菌素A及制备方法，属于生物制品的提取制备技术领域。所述玫烟色菌素A为无色油状物，是一个新型化合物，尚无文献报道。本发明化合物可通过培养玫烟色虫草菌，然后提取分离得到。玫烟色菌素A的活性测定结果显示具有较强的抗衰老活性：在200 mg/mL的浓度时玫烟色菌素A可延长实验线虫寿命11.3%；增加线虫产卵率73.1%；在35℃热击处理7天后，200 mg/mL玫烟色菌素A处理组的存活率是对照的2倍以上；用200 mg/mL玫烟色菌素A处理线虫15天后，处理组高活动力的线虫是对照的3倍以上。该化合物具有制备抗衰老保健品和药品的潜力。
Description
技术领域
本发明属于生物制品的提取制备技术领域，涉及具有抗衰老活性的玫烟色菌素A（fumosoroseain A）的提取、纯化、结构鉴定和活性测定。
背景技术
玫烟色菌素A是从一株玫烟色虫草菌（Cordyceps fumosorosea）培养物中分离制备得到的新化合物型生物碱类化合物，具有抗衰老等生物活性。
玫烟色虫草的无性型存在于土壤中和寄生在昆虫上，以前被称为玫烟色棒束孢（Isaria fumosorosea）或玫烟色拟青霉（Paecilomyces fumosorosea）。该菌寄主广泛，易感染蚜虫、粉虱、甲虫、白蚁、黄蜂以及各种鳞翅目害虫，因此玫烟色虫草菌是一种重要的生物防治真菌。该类真菌由于长期与昆虫协同进化，能产生大量新型生物活性化合物，然而，目前对该类真菌代谢物的研究仍较少，尚未见有关其玫烟色苷类化合物的制备鉴定和生物活性研究报道。
初步研究发现玫烟色虫草菌提取物具有明显的抗衰老活性。近年来，世界人口老化越来越严重，2019年中国65岁以上人口占全国人口的比重为12.6%，60岁以上人口占比为18.1%，目前中国已经是世界人口严重老龄化国家之一，因此开发抗衰老活性物质具有广阔的市场前景和重要社会意义。
发明内容
本发明的目的是提供具有抗衰老活性的玫烟色菌素A及制备方法。
具有抗衰老活性的玫烟色菌素A为无色油状，结构式如下：
生物活性测定显示玫烟色菌素A具有明显的抗衰老活性：在200 mg/mL的浓度时玫烟色菌素A可延长实验线虫寿命11.3%；增加线虫产卵率73.1%；在35℃热击处理7天，200mg/mL玫烟色菌素A处理组的存活率是对照的2倍以上；用200 mg/mL玫烟色菌素A处理线虫15天，处理组高活动力的线虫是对照的3倍以上。
具有抗衰老活性的玫烟色菌素A的制备操作步骤如下：
（1）制备固体培养物
将玫烟色虫草菌（Cordyceps fumosorosea）经过斜面菌种培养、二级固体种子培养和三级固体扩大培养，得到固体培养物；
（2）制备玫烟色菌素A
用提取剂提取固体培养物中的有效成分，采用硅胶柱色谱和反相色谱方法纯化，得到浅黄棕色粉末状的玫烟色菌素A。
具体制备操作步骤如下：
（1）制备固体培养物
（1.1）一级菌种培养
将玫烟色虫草菌的水液菌种接种于土豆琼脂（PDA）斜面培养基，每个斜面接种10～30μL，于温度20～30℃、培养5～10d，收集孢子得到一级菌种；
（1.2）二级菌种培养
将一级菌种用水配成浓度105～107个孢子/mL的孢悬液，按每平皿200～400μL接种至事先配好的PDA平板上（PDA板的规格为9×100mm），于20～30℃、恒温培养6～12天，收集孢子，得到二级菌种；
（1.3）三级固体扩大培养
将二级菌种用水配成浓度105～107个孢子/mL的孢悬液，按每平方厘米平板表面涂布1.5～5 μL孢悬液接种至事先配好的PDA平板上，于20～30℃、恒温培养6～15天，收集培养物，得到固体培养物；
（2）制备玫烟色菌素A
（2.1）固体培养物中有效成分的提取
将固体培养物在−50～130℃干燥，按重量体积比1g：0.5～5 mL在固体培养物中加入提取剂，40KHz超声提取20～200分钟，经0.20～2.5μm滤膜过滤或4000-15000转/分钟条件下离心，得滤液或离心上清；滤液或离心上清在真空度-0.1～-0.08 MP、温度10～80℃条件下减压蒸去提取剂，得到有效成分提取物；
（2.2）硅胶柱色谱初步分离纯化
按重量比1：1～10，将有效成分提取物与规格为100-200目的硅胶进行拌样；用规格为200-300目的硅胶填充柱子，利用湿法装柱，干法上样；以石油醚和乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，使乙酸乙酯浓度由0逐渐升到100%，总洗脱体积为2～6个柱体积；接着用乙酸乙酯和甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，使甲醇浓度由0逐渐升到40%，总洗脱体积为2～6个柱体积；收集乙酸乙酯：甲醇=50～30：1～20的洗脱液，在真空度-0.1～-0.08 MP、温度10～80℃条件下减压蒸去提取剂，得到初步纯化的有效成分；
（2.3）精制
采用反相高效液相色谱进行精制；色谱分离制备条件为：流动相A为超纯水，流动相B为甲醇；洗脱条件：0到30 min用30～100%流动相 B洗脱；进样体积30～300 μL、柱温10～40℃、流速2～50 mL/min、检测波长为250～270 nm、色谱柱为反相C-18柱；收集第二个主峰对应的洗脱液，在真空度-0.1～-0.08 MP、温度1080℃条件下减压蒸去提取剂，在低于170℃条件下干燥，得到无色油状的玫烟色菌素A。
进一步地，步骤（1）中，所述PDA培养基即马铃薯葡萄糖培养基，配方为：6g马铃薯干粉，20g葡萄糖，15g琼脂，加水至1000mL。
进一步地，步骤（2）中，所述提取剂为甲醇：乙酸乙酯为0～5：5～0。
本发明的分析研究说明如下：
1、筛选研究发现玫烟色虫草菌（Cordyceps fumosorosea）提取物具有较强的的抗衰老活性：在200 mg/mL的浓度时可延长实验线虫寿命7.9%；增加线虫产卵率48.5%；在35℃热击处理7天后，200 mg/mL玫烟色虫草提取物处理组的存活率比对照组高出56.4%；用200mg/mL玫烟色虫草提取物处理线虫15天后，处理组高活动力的线虫是对照的1倍以上。
由于提取物中有效成分含量较低，因此需要进行有效成分的进一步提取和分离纯化。
2、用硅胶柱色谱和反相高效液相色谱的方法对提取物进行了进一步分离纯化，得到玫烟色菌素A纯品，生物活性测定显示玫烟色菌素A具有明显的抗衰老活性：在200 mg/mL的浓度时玫烟色菌素A可延长实验线虫寿命11.3%；增加线虫产卵率73.1%；在35℃热击处理7天后，200 mg/mL玫烟色菌素A处理组的存活率是对照的2倍以上；用200 mg/mL玫烟色菌素A处理线虫15天后，处理组高活动力的线虫是对照的3倍以上。
3、玫烟色菌素A的化学结构鉴定
高分辨液质联用分析显示玫烟色菌素A的离子质荷比为498.4034 [M＋H]＋，对应的分子式为C28H52NO6。
核磁共振分析数据见下表：
综合液质联用分析和核磁共振分析得出分离纯化出的活性化合物是一新化合物，申请者将其命名为玫烟色菌素A（fumosoroseain A），其结构式如下：
本发明的有益技术效果体现在下述几个方面：
1、本发明方法制备的玫烟色菌素A具有较强的抗衰老活性：在200 mg/mL的浓度时玫烟色菌素A可延长实验线虫寿命11.3%；增加线虫产卵率73.1%；在35℃热击处理7天后，200 mg/mL玫烟色菌素A处理组的存活率是对照的2倍以上；用200 mg/mL玫烟色菌素A处理线虫15天后，处理组高活动力的线虫是对照的3倍以上。
2、本发明首次发现玫烟色虫草菌（Cordyceps fumosorosea）具有代谢上述活性物质的功能。在此发明基础上可望进一步克隆出相关基因，构建高产量菌株。
3、本发明的玫烟色菌素A可用于制备抗衰老药品和保健品。
4、本发明由于采取微生物发酵生产，不受自然环境和资源影响，易实现工业化、自动化、连续化生产，不破坏自然环境和自然资源。
5、按本发明工艺方法生产的产品成本低，工艺简便、工艺稳定、易调控、成功率高。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。
实施例1
具有抗衰老活性的玫烟色菌素A的制备操作步骤如下：
（1）制备固体培养物
（1.1）一级菌种培养
将保存的玫烟色虫草菌（Cordyceps fumosorosea）水液菌种接种于土豆琼脂（PDA）斜面培养基，每个斜面接种10μL，于温度20℃、培养5d，收集孢子得到一级菌种；
PDA培养基即马铃薯葡萄糖培养基，其配方为：6g马铃薯干粉，20g葡萄糖，15g琼脂，加水至1000mL。
（1.2）二级菌种培养
将一级菌种用水配成浓度105～107个孢子/mL的孢悬液，按每平皿200μL接种至事先配好的PDA平板上（PDA板的规格为9×100mm），于20℃、恒温培养6天，收集孢子，得到二级菌种。PDA培养基组成同步骤（1）。
（1.3）三级固体扩大培养
将二级菌种用水配成浓度105个孢子/mL的孢悬液，按每平方厘米平板表面涂布1.5 μL孢悬液接种至事先配好的PDA平板上，于20℃、恒温培养6天，收集培养物，得到固体培养物。PDA培养基组成同步骤（1）。
（2）制备玫烟色菌素A
（2.1）固体培养物中有效成分的提取
将固体培养物在−50℃干燥，按重量体积比1g：0.5mL在固体培养物中加入提取剂乙酸乙酯，40KHz超声提取20分钟，经0.20μm滤膜过滤，得滤液。滤液在真空度-0.1MP、温度10℃条件下减压蒸去提取剂，得到有效成分提取物。
（2.2）硅胶柱色谱初步分离纯化
按重量比1：1，将上述有效成分提取物与规格为100-200目的硅胶进行拌样；然后用规格为200-300目的硅胶填充柱子，利用湿法装柱，干法上样；然后以石油醚和乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，使乙酸乙酯浓度由0逐渐升到100%，总洗脱体积为2个柱体积；接着用乙酸乙酯和甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，使甲醇浓度由0逐渐升到40%，总洗脱体积为2个柱体积；收集乙酸乙酯：甲醇为50：1的洗脱液，在真空度-0.1MP、温度10℃条件下减压蒸去提取剂，得到初步纯化的有效成分。
（2.3）精制
采用反相高效液相色谱进行精制。色谱分离制备条件为：流动相A为超纯水，流动相B为色谱甲醇；洗脱条件：0到30 min用30% 流动相B洗脱；进样体积30 μL、柱温10℃、流速2 mL/min、检测波长为250 nm、色谱柱为反相C-18柱。收集第二个主峰对应的洗脱液，在真空度-0.1 MP、温度10℃条件下减压蒸去提取剂，在低于170℃条件下干燥，得到无色油状的玫烟色菌素A，其结构式如下：
活性测定结果显示玫烟色菌素A具有较强的抗衰老活性：在200 mg/mL的浓度时玫烟色菌素A可延长实验线虫寿命11.3%；增加线虫产卵率73.1%；在35℃热击处理7天后，200mg/mL玫烟色菌素A处理组的存活率是对照的2倍以上；用200 mg/mL玫烟色菌素A处理线虫15天后，处理组高活动力的线虫是对照的3倍以上。
实施例2
具有抗衰老活性的玫烟色菌素A的制备操作步骤如下：
（1）制备固体培养物
（1.1）一级菌种培养
将保存的玫烟色虫草菌（Cordyceps fumosorosea）水液菌种接种于土豆琼脂（PDA）斜面培养基，每个斜面接种30μL，于温度30℃、培养10d，收集孢子，得到一级菌种；
PDA培养基即马铃薯葡萄糖培养基，其配方为：6g马铃薯干粉，20g葡萄糖，15g琼脂，加水至1000mL。
（1.2）二级菌种培养
将一级菌种用水配成浓度107个孢子/mL的孢悬液，按每平皿400μL接种至事先配好的PDA平板上（PDA板的规格为9×100mm），于30℃、恒温培养12天，收集孢子，得二级菌种。PDA培养基组成同步骤（1）。
（1.3）三级固体扩大培养
将二级菌种水配成浓度107个孢子/mL的孢悬液，按每平方厘米平板表面涂布5 μL孢悬液接种至事先配好的PDA平板上，于30℃、恒温培养15天，收集培养物，得到固体培养物。PDA培养基组成同步骤（1）。
（2）制备玫烟色菌素A
（2.1）固体培养物中有效成分的提取
将固体培养物在130℃干燥，按重量体积比1g：5 mL在固体培养物中加入提取剂甲醇，40KHz超声提取200分钟，经15000转/分钟条件下离心，得离心上清。离心上清在真空度-0.08 MP、温度80℃条件下减压蒸去提取剂，得到有效成分提取物。
（2.2）硅胶柱色谱初步分离纯化
按重量比1：10，将有效成分提取物与规格为100-200目的硅胶进行拌样；然后用规格为200-300目的硅胶填充柱子，利用湿法装柱，干法上样；然后以石油醚和乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，使乙酸乙酯浓度由0逐渐升到100%，总洗脱体积为6个柱体积；接着用乙酸乙酯和甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，使甲醇浓度由0逐渐升到40%，总洗脱体积为6个柱体积；收集乙酸乙酯：甲醇为30：20的洗脱液，在真空度-0.08 MP、温度80℃条件下减压蒸去提取剂，得到初步纯化的有效成分。
（2.3）精制
采用反相高效液相色谱进行精制。色谱分离制备条件为：流动相A为超纯水，流动相B为色谱甲醇；洗脱条件：0到30 min用100% 流动相B洗脱；进样体积300 μL、柱温40℃、流速50 mL/min、检测波长为260 nm、色谱柱为反相C-18柱。收集第二个主峰对应的洗脱液，在真空度-0.08 MP、温度10～80℃条件下减压蒸去提取剂，在低于170℃条件下干燥，得到无色油状的玫烟色菌素A，其结构式如下：
活性测定结果显示玫烟色菌素A具有较强的抗衰老活性：在200 mg/mL的浓度时玫烟色菌素A可延长实验线虫寿命11.3%；增加线虫产卵率73.1%；在35℃热击处理7天后，200mg/mL玫烟色菌素A处理组的存活率是对照的2倍以上；用200 mg/mL玫烟色菌素A处理线虫15天后，处理组高活动力的线虫是对照的3倍以上。
实施例3
具有抗衰老活性的玫烟色菌素A及制备方法的操作步骤如下：
（1）制备固体培养物
（1.1）一级菌种培养
将保存的玫烟色虫草菌（Cordyceps fumosorosea）水液菌种接种于土豆琼脂（PDA）斜面培养基，每个斜面接种20μL，于温度25℃、培养8d，收集孢子得到一级菌种；
PDA培养基即马铃薯葡萄糖培养基，其配方为：6g马铃薯干粉，20g葡萄糖，15g琼脂，加水至1000mL。
（1.2）二级菌种培养
将一级菌种用水配成浓度106个孢子/mL的孢悬液，按每平皿300μL接种至事先配好的PDA平板上（PDA板的规格为9×100mm），在25℃、恒温培养10天，收集孢子，得到二级菌种。PDA培养基组成同步骤（1）。
（1.3）三级固体扩大培养
将二级菌种用水配成浓度106个孢子/mL的孢悬液，按每平方厘米平板表面涂布3μL孢悬液接种至事先配好的PDA平板上，在25℃、恒温培养10天，收集培养物，得到固体培养物。PDA培养基组成同步骤（1）。
（2）制备玫烟色菌素A
（2.1）固体培养物中有效成分的提取
将固体培养物在30℃干燥，按重量体积比1g：3 mL在固体培养物中加入提取剂甲醇：乙酸乙酯为2.5～2.5，40KHz超声提取110分钟，经10000转/分钟条件下离心，得离心上清。离心上清在真空度-0.09MP、温度40℃条件下减压蒸去提取剂，得到有效成分提取物。
（2.2）硅胶柱色谱初步分离纯化
按重量比1：6，将有效成分提取物与规格为100-200目的硅胶进行拌样；然后用规格为200-300目的硅胶填充柱子，利用湿法装柱，干法上样；然后以石油醚和乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，使乙酸乙酯浓度由0逐渐升到100%，总洗脱体积为4个柱体积；接着用乙酸乙酯和甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，使甲醇浓度由0逐渐升到40%，总洗脱体积为4个柱体积；收集乙酸乙酯：甲醇为40：10的洗脱液，在真空度-0.09MP、温度45℃条件下减压蒸去提取剂，得到初步纯化的有效成分。
（2.3）精制
采用反相高效液相色谱进行精制。色谱分离制备条件为：流动相A为超纯水，流动相B为色谱甲醇；洗脱条件：0到30 min用65%流动相 B洗脱；进样体积200 μL、柱温30℃、流速25 mL/min、检测波长为260 nm、色谱柱为反相C-18柱。收集第二个主峰对应的洗脱液，在真空度-0.09MP、温度40℃条件下减压蒸去提取剂，在低于170℃条件下干燥，得到无色油状的玫烟色菌素A，其结构式如下：
活性测定结果显示玫烟色菌素A具有较强的抗衰老活性：在200 mg/mL的浓度时玫烟色菌素A可延长实验线虫寿命11.3%；增加线虫产卵率73.1%；在35℃热击处理7天后，200mg/mL玫烟色菌素A处理组的存活率是对照的2倍以上；用200 mg/mL玫烟色菌素A处理线虫15天后，处理组高活动力的线虫是对照的3倍以上。
Claims (5)
1.具有抗衰老活性的玫烟色菌素A，其特征在于：所述玫烟色菌素A为无色油状，结构式如下：
2. 根据权利要求1所述的具有抗衰老活性的玫烟色菌素A的制备方法，其特征在于操作步骤如下：
（1）制备固体培养物
将玫烟色虫草菌（Cordyceps fumosorosea）经过斜面菌种培养、二级固体种子培养和三级固体扩大培养，得到固体培养物；
（2）制备玫烟色菌素A
用提取剂提取固体培养物中的有效成分，采用硅胶柱色谱和反相色谱方法纯化，得到玫烟色菌素A。
3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于具体操作步骤如下：
（1）制备固体培养物
（1.1）一级菌种培养
将玫烟色虫草菌的水液菌种接种于土豆琼脂斜面培养基，每个斜面接种10～30μL，于温度20～30℃、培养5～10d，收集孢子得到一级菌种；
（1.2）二级菌种培养
将一级菌种用水配成浓度105～107个孢子/mL的孢悬液，按每培养皿200～400μL接种至事先配好的土豆琼脂平板上，于20～30℃、恒温培养6～12天，收集孢子，得到二级菌种；
（1.3）三级固体扩大培养
将二级菌种用水配成浓度105～107个孢子/mL的孢悬液，按每平方厘米平板表面涂布1.5～5 μL孢悬液接种至事先配好的土豆琼脂平板上，于20～30℃、恒温培养6～15天，收集培养物，得到固体培养物；
（2）制备玫烟色菌素A
（2.1）固体培养物中有效成分的提取
将固体培养物在−50～130℃干燥，按重量体积比1g：0.5～5 mL在固体培养物中加入提取剂，40KHz超声提取20～200分钟，经0.20～2.5μm滤膜过滤或4000-15000转/分钟条件下离心，得滤液或离心上清；滤液或离心上清在真空度-0.1～-0.08 MPa、温度10～80℃条件下减压蒸去提取剂，得到有效成分提取物；
（2.2）硅胶柱色谱初步分离纯化
按重量比1：1～10，将有效成分提取物与规格为100-200目的硅胶进行拌样；用规格为200-300目的硅胶填充柱子，利用湿法装柱，干法上样；以石油醚和乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，使乙酸乙酯浓度由0逐渐升到100%，总洗脱体积为2～6个柱体积；接着用乙酸乙酯和甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，使甲醇浓度由0逐渐升到40%，总洗脱体积为2～6个柱体积；收集乙酸乙酯：甲醇=50～30：1～20的洗脱液，在真空度-0.1～-0.08 MPa、温度10～80℃条件下减压蒸去提取剂，得到初步纯化的有效成分；
（2.3）精制
采用反相高效液相色谱进行精制；色谱分离制备条件为：流动相A为超纯水，流动相B为甲醇；洗脱条件：0到30 min用30～100%流动相 B洗脱；进样体积30～300 μL、柱温10～40℃、流速2～50 mL/min、检测波长为250～270 nm、色谱柱为反相C-18柱；收集第二个主峰对应的洗脱液，在真空度-0.1～-0.08 MPa、温度10～80℃条件下减压蒸去提取剂，在低于170℃条件下干燥，得到无色油状的玫烟色菌素A。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述土豆琼脂培养基即马铃薯葡萄糖培养基，配方为：6g马铃薯干粉，20g葡萄糖，15g琼脂，加水至1000mL。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述提取剂为甲醇：乙酸乙酯为0～5：5～0。
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