CN114292280A - 一种具有抑制糖苷酶活性和免疫调节活性的红曲素b及制备方法 - Google Patents
一种具有抑制糖苷酶活性和免疫调节活性的红曲素b及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种具有抑制糖苷酶活性和免疫调节活性的红曲素B及制备方法，属于生物制品的提取制备技术领域。红曲素B为红色粉末状，分子式为C23H30O6；具有抑制糖苷酶活性，对α‑糖苷酶(α‑glycosidase)的半数抑制浓度(IC50)为174μg/mL，且对体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7的IL‑1β、TNF‑α、和TGF‑β的转录水平具有显著下调的作用：IL‑1β(0.01±0.01)、TNF‑α(0.02±0.01)、和TGF‑β(0.03±0.01)相对于DMSO对照组变化显著(P＜0.05)。本发明的红曲素B通过培养红曲霉，然后提取分离得到。本发明所用得红曲霉为食用真菌，安全可靠，制备方法采取微生物发酵生产，环境友好，不受自然环境和资源影响，易实现工业化、自动化、连续化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物制品的提取制备技术领域，具体涉及具有糖苷酶抑制活性的红曲素B、(Monascuskaolin B)的提取、纯化、结构鉴定和活性测定。
背景技术
红曲霉(Monascus sp.)是一类小型丝状腐生真菌，属于真菌门(Eumycophyta)、子囊菌亚门(Ascomycotina)、不整囊菌纲(Plectomycetes)、散囊菌目(Eurotiales)、红曲菌科(Monascaceae)，红曲霉属(Monascus)，包括的种类有紫红曲霉(Monascus purpureus)、安卡红曲霉(Monascus anka)和红色红曲霉(Monascus ruber)。红曲霉可产生糖化酶、酯化酶、蛋白酶等多种酶类物质，在这些酶的协同作用下，能够生成单糖、氨基酸、核苷酸等呈味物质和挥发性酸类、醇类和酯类等香气物质，对发酵食品的风味贡献卓著。
近年来，由于生活水平提高和运动量减少，糖尿病患者人数逐年升高，目前世界糖尿病患者已达4.4亿人，并且每年以5％的比例增加，而目前降糖药种类较少，选择余地小，亟需研发新高效降糖药物。开发相关药物具有巨大的社会效益和经济效益。
当今社会快速发展，生活和工作节奏快、压力大，同时由于缺乏运动锻炼以及熬夜看手机等不良习惯，使得免疫紊乱的亚健康人群逐年增多，因此有必要开发免疫调节相关药物。红曲霉作为一种食品微生物，具有安全可靠的优点，因此相关免疫制剂及降糖制剂更具有应用潜力和巨大的经济价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抑制糖苷酶活性和免疫调节活性的红曲素B，同时提供红曲素B的制备方法。
一种具有抑制糖苷酶活性和免疫调节活性的红曲素B是从红曲霉(Monascus sp.)培养物中分离制备得到的红曲素B，结构式如下：
所述红曲霉为紫红曲霉(Monascus purpureus)、安卡红曲霉(Monascus anka)或红色红曲霉(Monascus ruber)；
红曲素B为红色粉末，分子式为C23H30O6，具有抑制糖苷酶活性，对α-糖苷酶(α-glycosidase)的半数抑制浓度(IC50)为174μg/mL，且对体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7的IL-1β、TNF-α、和TGF-β的转录水平具有显著下调的作用：IL-1β(0.01±0.01)、TNF-α(0.02±0.01)、和TGF-β(0.03±0.01)相对于DMSO对照组变化显著(P＜0.05)。
一种具有抑制糖苷酶活性和免疫调节活性的红曲素B的制备操作步骤如下：
(1)制备固体培养物
将红曲霉(Monascus sp.)的菌种经过一级菌种培养、二级种子培养和三级液体扩大培养，得到液体培养物；
(1.1)一级菌种培养
将红曲霉的孢悬液接种在土豆琼脂(PDA)斜面培养基上，每个斜面接种孢悬液10～30μL，于温度32～35℃、转速220～250r/min条件下，培养7～9天，得到一级菌种；
(1.2)二级种子培养
将一级菌种用无菌水配成浓度105～107个孢子/mL的孢悬液，按每瓶200～250μL接种至250mL的PDB培养基中，于温度32～35℃、转速220～250r/min条件下、摇瓶培养3～5天，得到液体二级菌种；
(1.3)三级液体扩大培养
取1～3mL液体二级菌种接种至250mL的PDB培养基中，于温度32～35℃、转速220～250r/min、摇瓶培养7～9天，收集培养物，得到液体培养物；
(2)液体培养物中有效成分的提取和精制
具体操作如下：
(2.1)液体培养物中有效成分的提取
液体培养物经减压浓缩干燥；用提取剂进行超声提取、滤膜过滤或离心分离、真空减压去除溶剂，得到有效成分提取物；
所述提取剂由甲醇和乙酸乙酯按体积比0～1：1～0混合均匀制成
(2.2)提取物的初步纯化
采用制备型反相高效液相色谱对有效成分提取物初步纯化，得到红色的初步纯化物；
(2.3)初步纯化物的精制
采用半制备型反相高效液相色谱对初步纯化物进行精制，在乙腈溶液洗脱条件下，收集最高的峰值对应的化合物，为红曲素B洗脱液，得到红色粉末状的红曲素B。
进一步的制备技术要求如下：
步骤(1.1)中，所述PDA培养基为马铃薯葡萄糖培养基，配方为：200g去皮马铃薯、20g葡萄糖和15g琼脂，加水至1000mL。
步骤(1.2)和步骤(1.3)中，PDB培养基配方为：200g去皮马铃薯、20g葡萄糖，加水至1000mL。
步骤(2.1)中，将液体培养物在真空度-0.1～-0.08MP、温度10～60℃条件下减压浓缩到原体积的3/10～1/10，在温度-50～130℃条件下干燥，粉碎；按重量体积比1g：0.5～5mL加入提取剂，40KHz超声提取20～200分钟；转速4000～15000转/分钟条件下离心或0.1～2.5μm膜过滤，得滤液或离心上清；滤液或离心上清在真空度-0.1～-0.08MP、温度10～60℃条件下减压蒸去提取剂，得到有效成分提取物。
步骤(2.2)中，采用制备型反相高效液相色谱进行精制；色谱分离操作如下：流动相A为超纯水，流动相B为乙腈；洗脱条件：0到30min 50％～70％流动相B梯度洗脱；进样体积30～300μL、柱温20～40℃、流速5～50mL/min；检测波长为358nm；色谱柱：制备型反相C-18柱；收集第二最高峰对应的洗脱液，在真空度-0.1～-0.08MP、温度10～60℃条件下减压蒸去提取剂，在小于等于130℃条件下干燥，得到红色的初步纯化物。
步骤(2.3)中，色谱分离操作如下：流动相A为超纯水，流动相B为乙腈；洗脱条件：0到30min用50％～70％流动相A洗脱；进样体积20～200μL；柱温20～40℃；流速2～20mL/min；检测波长为358nm；色谱柱：半制备型反相C-18柱；收集最高的峰值对应的化合物，为红曲素B洗脱液；在真空度-0.1～-0.08MP、温度10～60℃条件下减压蒸去除提取剂；在小于等于130℃条件下干燥，得到红色粉末状的红曲素B。
本发明的分析研究说明如下：
1、研究采用制备型反相高效液相色谱和半制备型反相高效液相色谱的方法对提取物进行了分离纯化，从一种红曲霉(Monascus sp.)中得到1个新化合物，并命名为红曲素B。
2、红曲素B具有抑制糖苷酶活性，对α-糖苷酶(α-glycosidase)的半数抑制浓度(IC50)为174μg/mL，且对体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7的IL-1β、TNF-α、和TGF-β的转录水平具有显著下调的作用：IL-1β(0.01±0.01)、TNF-α(0.02±0.01)、和TGF-β(0.03±0.01)相对于DMSO对照组变化显著(P＜0.05)。
3、红曲素B的化学结构鉴定数据
高分辨液质联用分析显示红曲素B的离子质荷比为403.2199，[M+H]+对应的分子式为C23H30O6，具体核磁数据见下表1。
表1.红曲素B的核磁共振碳氢归属表
本发明的有益技术效果体现在下述几个方面：
1、为了寻找新型天然高效的具有抑制糖苷酶活性和抗炎免疫活性的物质，发明人首先对大量红曲霉菌株进行了培养，然后对培养物有效成分进行了提取和活性测定，发现一株红曲霉(Monascus sp.)培养物提取物具有抑制糖苷酶活性和抑制RAW264.7细胞炎症和免疫活性。在大量培养和提取的基础上反向制备及半制备色谱分离纯化出红曲素B(Monascuskaolin B)，该化合物是红色粉末，经一维和二维核磁共振、精确质谱鉴定得到红曲素B的结构式。红曲素B具有较强的α-糖苷酶抑制活性和RAW264.7细胞免疫抑制活性，具有糖尿病药物和抗炎免疫相关方面的开发潜力。
2、本发明首次发现一株红曲霉(Monascus sp.)具有代谢上述活性物质的功能。在此发明基础上可望进一步克隆出相关基因，构建高产量菌株。
3、红曲霉作为一种食品微生物，具有安全可靠得优点，因此相关免疫制剂以及降糖制剂更具有巨大的应用潜力和经济价值。
4、本发明由于采取微生物发酵生产，不受自然环境和资源影响，易实现工业化、自动化、连续化生产，不破坏自然环境和自然资源。按本发明工艺方法生产的红曲素产品成本低，工艺简便、工艺稳定、易调控、成功率高。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。
实施例1
一种具有抑制糖苷酶活性和免疫调节活性的红曲素B的操作步骤如下：
(1)制备固体培养物
将紫红曲霉(Monascus purpureus)的菌种经过一级菌种培养、二级种子培养和三级液体扩大培养，得到液体培养物；
(1.1)一级菌种培养
将107个孢子/mL紫红曲霉(Monascus purpureus)的孢悬液接种在土豆琼脂(PDA)斜面培养基上，每个斜面接种孢悬液10μL，于温度32℃、转速220r/min，培养7天，得到一级菌种。
PDA培养基为马铃薯葡萄糖培养基，配方为：200g去皮马铃薯、20g葡萄糖和15g琼脂，加水至1000mL。
(1.2)二级种子培养
将一级菌种用无菌水配成浓度105个孢子/mL的孢悬液，按每瓶200μL接种至事先配好的250mL的PDB培养基中，于温度32℃、转速220r/min条件下，摇瓶培养3天，得到液体二级菌种。
PDB培养基的配方为：200g去皮马铃薯、20g葡萄糖加水至1000mL。
(1.3)三级液体扩大培养
取1mL液体二级菌种接种至事先灭菌好的250mL的PDB培养基中，于温度32℃、转速220r/min条件下，摇瓶培养7天，收集培养物，得到液体培养物。
(2)液体培养物中有效成分的提取和精制
具体操作如下：
(2.1)液体培养物中有效成分的提取
培养物经减压浓缩和冷冻干燥后用乙酸乙酯提取，得到有效成分提取物。
具体操作为：将液体培养物在真空度-0.1MP、温度10℃条件下减压蒸发至原体积3/10，在温度-50℃条件下干燥，粉碎；按重量体积比1g：0.5mL加入乙酸乙酯，40KHz超声提取20分钟。然后在转速4000转/分钟条件下离心，离心上清在真空度-0.1MP、温度10℃条件下减压蒸去提取剂，得到有效成分提取物。
(2.2)有效成分提取物的初步纯化
采用制备型反相高效液相色谱对有效成分提取物进行初步纯化，得到红色初步纯化物。
具体操作为：采用制备型反相高效液相色谱进行精制；色谱分离制备条件为：流动相A为超纯水，流动相B为乙腈；洗脱条件：0到30min 50％～70％流动相B梯度洗脱；进样体积30μL、柱温20℃、流速5mL/min；检测波长为358nm；色谱柱：制备型反相C-18柱；收集第二最高峰对应的洗脱液，在真空度-0.1MP、温度10℃条件下减压蒸去提取剂，在-40℃条件下干燥，得到红色初步纯化物。
(2.3)初步纯化物的精制
采用半制备型反相高效液相色谱对红色初步纯化物进行精制，在乙腈溶液洗脱条件下，收集最高的峰值对应的化合物，为红曲素B洗脱液，得到红色的红曲素B。
具体操作为：色谱流动相A为超纯水，流动相B为乙腈；洗脱条件：0到30min用50％～70％流动相B洗脱；进样体积20μL、柱温20℃、流速2mL/min；检测波长为358nm；色谱柱：半制备型反相C-18柱；收集最高的峰值对应的化合物，为红曲素B洗脱液；在真空度-0.1MP、温度10℃条件下减压蒸去除提取剂；在-40℃条件下干燥，得到红色粉末状的红曲素B。
波谱解析出红曲素B的结构式如下：
红曲素B具有抑制糖苷酶活性，对α-糖苷酶(α-glycosidase)的半数抑制浓度(IC50)为174μg/mL，且对体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7的IL-1β、TNF-α、和TGF-β的转录水平具有显著下调的作用：IL-1β(0.01±0.01)、TNF-α(0.02±0.01)、和TGF-β(0.03±0.01)相对于DMSO对照组变化显著(P＜0.05)。
实施例2
一种具有抑制糖苷酶活性和免疫调节活性的红曲素B的操作步骤如下：
(1)制备固体培养物
将106个孢子/mL安卡红曲霉(Monascus anka)的液体菌种经过一级菌种培养、二级种子培养和三级液体扩大培养，得到液体培养物；
(1.1)一级菌种培养
将安卡红曲霉(Monascus anka)的孢悬液接种在土豆琼脂(PDA)斜面培养基上，每个斜面接种孢悬液30μL，于温度35℃、转速250r/min条件下，培养9天，得到一级菌种。
PDA培养基为马铃薯葡萄糖培养基，配方为：200g去皮马铃薯、20g葡萄糖和15g琼脂，加水至1000mL。
(1.2)二级种子培养
将一级菌种用无菌水配成浓度107个孢子/mL的孢悬液，按每瓶250μL接种至事先配好的250mL的PDB培养基中，于温度35℃、转速250r/min条件下，摇瓶培养5天，得液体二级菌种。
PDB培养基的配方为：200g去皮马铃薯、20g葡萄糖加水至1000mL。
(1.3)三级液体扩大培养
取3mL液体二级菌种接种至事先灭菌好的250mL的PDB培养基中，于温度35℃、转速250r/min条件下，摇瓶培养9天，收集培养物，得到液体培养物。
(2)液体培养物中有效成分的提取和精制
具体操作如下：
(2.1)液体培养物中有效成分的提取
液体培养物经减压浓缩和冷冻干燥后用甲醇提取，得到有效成分提取物。
具体操作为：将液体培养物在真空度-0.08MP、温度60℃条件下减压蒸发至原体积1/10，在温度130℃条件下干燥，粉碎；按重量体积比1g：5mL加入甲醇，40KHz超声提取200分钟。然后在15000转/分钟条件下离心，离心上清在真空度-0.08MP、温度60℃条件下减压蒸去提取剂，得到有效成分提取物。
(2.2)有效成分提取物的初步纯化
采用制备型反相高效液相色谱对有效成分提取物进行初步纯化，得到红色初步纯化物。
具体操作为：采用制备型反相高效液相色谱进行精制；色谱分离操作为：流动相A为超纯水，流动相B为乙腈；洗脱条件：0到30min 50％～70％流动相B梯度洗脱；进样体积300μL、柱温40℃、流速50mL/min；检测波长为358nm；色谱柱：制备型反相C-18柱；收集第二最高峰对应的洗脱液，在真空度-0.08MP、温度60℃条件下减压蒸去提取剂，在130℃条件下干燥，得到红色初步纯化物。
(2.3)红色初步纯化物的精制
采用半制备型反相高效液相色谱对红色初步纯化物进行精制，在乙腈溶液洗脱条件下，收集最高的峰值对应的化合物，为红曲素B洗脱液，得到红色的红曲素B。
具体操作为：色谱流动相A为超纯水，流动相B为乙腈；洗脱条件：0到30min用50％～70％流动相A洗脱；进样体积200μL、柱温40℃、流速20mL/min；检测波长为358nm；色谱柱：半制备型反相C-18柱；收集最高的峰值对应的化合物，为红曲素B洗脱液；在真空度-0.08MP、温度60℃条件下减压蒸去除提取剂；在130℃条件下干燥，得到红色粉末状的红曲素B。
波谱解析出红曲素B的结构式如下：
红曲素B具有抑制糖苷酶活性，对α-糖苷酶(α-glycosidase)的半数抑制浓度(IC50)为174μg/mL，且对体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7的IL-1β、TNF-α、和TGF-β的转录水平具有显著下调的作用：IL-1β(0.01±0.01)、TNF-α(0.02±0.01)、和TGF-β(0.03±0.01)相对于DMSO对照组变化显著(P＜0.05)。
实施例3
一种具有抑制糖苷酶活性和免疫调节活性的红曲素B的操作步骤如下：
(1)制备固体培养物
将107个孢子/mL红色红曲霉(Monascus ruber)的菌种经过一级菌种培养、二级种子培养和三级液体扩大培养，得到液体培养物；
(1.1)一级菌种培养
将红色红曲霉的孢悬液接种在土豆琼脂(PDA)斜面培养基上，每个斜面接种孢悬液20μL，于温度33.5℃、转速235r/min条件下，培养8天，得到一级菌种。
PDA培养基为马铃薯葡萄糖培养基，配方为：200g去皮马铃薯、20g葡萄糖和15g琼脂，加水至1000mL。
(1.2)二级种子培养
将一级菌种用无菌水配成浓度106个孢子/mL的孢悬液，按每瓶225μL接种至事先配好的PDB培养基摇瓶，于温度33.5℃、转速240r/min条件下，培养4天，得液体二级菌种。
PDB培养基配方为：200g去皮马铃薯、20g葡萄糖，加水至1000mL。
(1.3)三级液体扩大培养
取2mL液体二级菌种接种至事先灭菌好的250mL的PDB培养基中，于温度33.5℃、转速240r/min条件下，摇瓶培养8天，收集培养物，得到液体培养物。
(2)液体培养物中有效成分的提取和精制
具体操作如下：
(2.1)液体培养物中有效成分的提取
液体培养物经减压浓缩和冷冻干燥，用甲醇：乙酸乙酯＝1：1(v/v)的提取剂提取，得到有效成分提取物。
具体操作为：将液体培养物在真空度-0.09MP、温度40℃条件下减压蒸发至原体积2/10，在温度70℃条件下干燥，粉碎；按重量体积比1g：2.5mL加入甲醇：乙酸乙酯＝1：1(v/v)的甲醇和乙酸乙酯混合物，40KHz超声提取100分钟。然后在转速10000转/分钟条件下离心，离心上清在真空度-0.09MP、温度40℃条件下减压蒸去提取剂，得到有效成分提取物。
(2.2)有效成分提取物的初步纯化
采用制备型反相高效液相色谱对有效成分提取物进行初步纯化，得到红色初步纯化物。
具体操作为：采用制备型反相高效液相色谱进行精制；色谱分离制备条件为：流动相A为超纯水，流动相B为乙腈；洗脱条件：0到30min 50％～70％流动相B梯度洗脱；进样体积180μL、柱温30℃、流速25mL/min；检测波长为358nm；色谱柱：制备型反相C-18柱；收集第二最高峰对应的洗脱液，在真空度-0.09MP、温度40℃条件下减压蒸去提取剂，在70℃条件下干燥，得到红色初步纯化物。
(2.3)初步纯化物的精制
采用半制备型反相高效液相色谱对红色初步纯化物进行精制，在乙腈溶液洗脱条件下，收集最高的峰值对应的化合物，为红曲素B洗脱液，得到红色的红曲素B。
具体操作为：色谱流动相A为超纯水，流动相B为乙腈；洗脱条件：0到30min用50％～70％流动相B洗脱；进样体积100μL、柱温30℃、流速10mL/min；检测波长为358nm；色谱柱：半制备型反相C-18柱；收集最高的峰值对应的化合物，为红曲素B洗脱液；在真空度-0.09MP、温度40℃条件下减压蒸去除提取剂；在70℃条件下干燥，得到红色粉末状的红曲素B。
波谱解析出红曲素B的结构式如下：
红曲素B具有抑制糖苷酶活性，对α-糖苷酶(α-glycosidase)的半数抑制浓度(IC50)为174μg/mL，且对体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7的IL-1β、TNF-α、和TGF-β的转录水平具有显著下调的作用：IL-1β(0.01±0.01)、TNF-α(0.02±0.01)、和TGF-β(0.03±0.01)相对于DMSO对照组变化显著(P＜0.05)。
实施例4
一种具有抑制糖苷酶活性和免疫调节活性的红曲素B的操作步骤如下：
(1)制备固体培养物
将106个孢子/mL红色红曲霉(Monascus ruber)的菌种经过一级菌种培养、二级种子培养和三级液体扩大培养，得到液体培养物；
(1.1)一级菌种培养
将红色红曲霉的孢悬液接种在土豆琼脂(PDA)斜面培养基上，每个斜面接种孢悬液20μL，于温度33.5℃、转速240r/min条件下，培养8天，得到一级菌种。
PDA培养基为马铃薯葡萄糖培养基，配方为：200g去皮马铃薯、20g葡萄糖和15g琼脂，加水至1000mL。
(1.2)二级种子培养
将一级菌种用无菌水配成浓度106个孢子/mL的孢悬液，按每瓶220μL接种至事先配好的250mL PDB培养基中，于温度33℃、转速240r/min条件下，培养4天，得液体二级菌种。
PDB培养基配方为：200g去皮马铃薯、20g葡萄糖，加水至1000mL。
(1.3)三级液体扩大培养
取2mL液体二级菌种接种至事先灭菌好的250mL的PDB培养基中，于温度33.5℃、转速235r/min条件下，摇瓶培养8天，收集培养物，得到液体培养物。
(2)液体培养物中有效成分的提取和精制
具体操作如下：
(2.1)液体培养物中有效成分的提取
液体培养物经减压浓缩，然后匀浆后用甲醇：乙酸乙酯＝0.5：1(v/v)提取，得到有效成分提取物。
具体操作为：将液体培养物在真空度-0.1MP、温度10℃条件下减压蒸发至原体积3/10，直接用提取剂提取20分钟。然后用0.1μm膜过滤，滤液在真空度-0.1MP、温度10℃条件下减压蒸去提取剂，得到有效成分提取物。
(2.2)有效成分提取物的初步纯化
采用制备型反相高效液相色谱对有效成分提取物进行初步纯化，得到红色初步纯化物。具体操作为：采用制备型反相高效液相色谱进行精制；色谱分离制备条件为：流动相A为超纯水，流动相B为乙腈；洗脱条件：0到30min 50％～70％流动相B梯度洗脱；进样体积200μL、柱温30℃、流速20mL/min；检测波长为358nm；色谱柱：制备型反相C-18柱；收集第二最高峰对应的洗脱液，在真空度-0.1MP、温度30℃条件下减压蒸去提取剂，在-40℃条件下干燥，得到红色初步纯化物。
(2.3)初步纯化物的精制
采用半制备型反相高效液相色谱对红色初步纯化物进行精制，在乙腈溶液洗脱条件下，收集最高的峰值对应的化合物，为红曲素B洗脱液，得到红色的红曲素B。
具体操作为：色谱分离制备条件为：流动相A为超纯水，流动相B为乙腈；洗脱条件：0到30min用50％～70％流动相B洗脱；进样体积30μL、柱温30℃、流速5mL/min；检测波长为358nm；色谱柱：半制备型反相C-18柱；收集最高的峰值对应的化合物，为红曲素B洗脱液；在真空度-0.1MP、温度30℃条件下减压蒸去除提取剂；在-40℃条件下干燥，得到红色粉末状的红曲素B。
波谱解析出红曲素B的结构式如下：
红曲素B具有抑制糖苷酶活性，对α-糖苷酶(α-glycosidase)的半数抑制浓度(IC50)为174μg/mL，且对体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7的IL-1β、TNF-α、和TGF-β的转录水平具有显著下调的作用：IL-1β(0.01±0.01)、TNF-α(0.02±0.01)、和TGF-β(0.03±0.01)相对于DMSO对照组变化显著(P＜0.05)。
实施例5
一种具有抑制糖苷酶活性和免疫调节活性的红曲素B的操作步骤如下：
(1)制备固体培养物
将107个孢子/mL红色红曲霉(Monascus ruber)的菌种经过一级菌种培养、二级种子培养和三级液体扩大培养，得到液体培养物；
(1.1)一级菌种培养
将红色红曲霉的孢悬液接种在土豆琼脂(PDA)斜面培养基上，每个斜面接种孢悬液20μL，于温度33.5℃、转速240r/min条件下，培养8天，得到一级菌种。
PDA培养基为马铃薯葡萄糖培养基，配方为：200g去皮马铃薯、20g葡萄糖和15g琼脂，加水至1000mL。
(1.2)二级种子培养
将一级菌种用无菌水配成浓度106个孢子/mL的孢悬液，按每瓶220μL接种至事先配好的250mL PDB培养基中，于温度33℃、转速240r/min条件下，培养4天，得液体二级菌种。
PDB培养基配方为：200g去皮马铃薯、20g葡萄糖，加水至1000mL。
(1.3)三级液体扩大培养
取2mL液体二级菌种接种至事先灭菌好250mL的PDB培养基中，于温度33.5℃、转速235r/min条件下，培养8天，收集培养物，得到液体培养物。
(2)液体培养物中有效成分的提取和精制
具体操作如下：
(2.1)液体培养物中有效成分的提取
液体培养物经减压浓缩干燥，然后用甲醇：乙酸乙酯＝1：0.5(v/v)提取，得到有效成分提取物。
具体操作为：将液体培养物在真空度-0.1～-0.08MP、温度10～60℃条件下减压蒸发至原体积2/10，直接用乙酸乙酯提取20～200分钟。然后用2.5μm膜过滤，滤液在真空度-0.08MP、温度60℃条件下减压蒸去提取剂，得到有效成分提取物。
(2.2)有效成分提取物的初步纯化
采用制备型反相高效液相色谱对提取物进行初步纯化，得到红色初步纯化物。
具体操作为：采用制备型反相高效液相色谱进行精制；色谱分离制备条件为：流动相A为超纯水，流动相B为乙腈；洗脱条件：0到30min 50％～70％流动相B梯度洗脱；进样体积200μL、柱温30℃、流速20mL/min；检测波长为358nm；色谱柱：制备型反相C-18柱；收集第二最高峰对应的洗脱液，在真空度-0.1MP、温度30℃条件下减压蒸去提取剂，在-40℃条件下干燥，得到红色初步纯化物。
(2.3)红色初步纯化物的精制
采用半制备型反相高效液相色谱对红色初步纯化物进行精制，在乙腈溶液洗脱条件下，收集最高的峰值对应的化合物，为红曲素B洗脱液，得到红色的红曲素B。
具体操作为：色谱分离制备条件为：流动相A为超纯水，流动相B为乙腈；洗脱条件：0到30min用50％～70％流动相B洗脱；进样体积30μL、柱温30℃、流速5mL/min；检测波长为358nm；色谱柱：半制备型反相C-18柱；收集最高的峰值对应的化合物，为红曲素B洗脱液；在真空度-0.1MP、温度30℃条件下减压蒸去除提取剂；在-40℃条件下干燥，得到红色粉末状的红曲素B。
波谱解析出红曲素B的结构式如下：
红曲素B具有抑制糖苷酶活性，对α-糖苷酶(α-glycosidase)的半数抑制浓度(IC50)为174μg/mL，且对体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7的IL-1β、TNF-α、和TGF-β的转录水平具有显著下调的作用：IL-1β(0.01±0.01)、TNF-α(0.02±0.01)、和TGF-β(0.03±0.01)相对于DMSO对照组变化显著(P＜0.05)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种具有抑制糖苷酶活性和免疫调节活性的红曲素B，其特征在于：是从红曲霉(Monascus sp.)培养物中分离制备得到的红曲素B，结构式如下：
所述红曲霉为紫红曲霉(Monascus purpureus)、安卡红曲霉(Monascus anka)或红色红曲霉(Monascus ruber)；
红曲素B为红色粉末，分子式为C23H30O6，具有抑制糖苷酶活性，对α-糖苷酶(α-glycosidase)的半数抑制浓度(IC50)为174μg/mL，且对体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7的IL-1β、TNF-α、和TGF-β的转录水平具有显著下调的作用：IL-1β(0.01±0.01)、TNF-α(0.02±0.01)、和TGF-β(0.03±0.01)相对于DMSO对照组变化显著(P＜0.05)。
2.根据权利要求1所述一种具有抑制糖苷酶活性和免疫调节活性的红曲素B的制备方法，其特征在于，操作步骤如下：
(1)制备固体培养物
将红曲霉(Monascus sp.)的菌种经过一级菌种培养、二级种子培养和三级液体扩大培养，得到液体培养物；
(1.1)一级菌种培养
将红曲霉的孢悬液接种在土豆琼脂(PDA)斜面培养基上，每个斜面接种孢悬液10～30μL，于温度32～35℃、转速220～250r/min条件下，培养7～9天，得到一级菌种；
(1.2)二级种子培养
将一级菌种用无菌水配成浓度105～107个孢子/mL的孢悬液，按每瓶200～250μL接种至250mL的PDB培养基中，于温度32～35℃、转速220～250r/min条件下、摇瓶培养3～5天，得到液体二级菌种；
(1.3)三级液体扩大培养
取1～3mL液体二级菌种接种至250mL的PDB培养基中，于温度32～35℃、转速220～250r/min、摇瓶培养7～9天，收集培养物，得到液体培养物；
(2)液体培养物中有效成分的提取和精制
具体操作如下：
(2.1)液体培养物中有效成分的提取
液体培养物经减压浓缩干燥；用提取剂进行超声提取、滤膜过滤或离心分离、真空减压去除溶剂，得到有效成分提取物；
所述提取剂由甲醇和乙酸乙酯按体积比0～1：1～0混合均匀制成；
(2.2)提取物的初步纯化
采用制备型反相高效液相色谱对有效成分提取物初步纯化，得到红色的初步纯化物；
(2.3)初步纯化物的精制
采用半制备型反相高效液相色谱对初步纯化物进行精制，在乙腈溶液洗脱条件下，收集最高的峰值对应的化合物，为红曲素B洗脱液，得到红色粉末状的红曲素B。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1.1)中，所述PDA培养基为马铃薯葡萄糖培养基，配方为：200g去皮马铃薯、20g葡萄糖和15g琼脂，加水至1000mL。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1.2)和步骤(1.3)中，PDB培养基配方为：200g去皮马铃薯、20g葡萄糖，加水至1000mL。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2.1)中，将液体培养物在真空度-0.1～-0.08MP、温度10～60℃条件下减压浓缩到原体积的3/10～1/10，在温度-50～130℃条件下干燥，粉碎；按重量体积比1g：0.5～5mL加入提取剂，40KHz超声提取20～200分钟；转速4000～15000转/分钟条件下离心或0.1～2.5μm膜过滤，得滤液或离心上清；滤液或离心上清在真空度-0.1～-0.08MP、温度10～60℃条件下减压蒸去提取剂，得到有效成分提取物。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2.2)中，采用制备型反相高效液相色谱进行精制；色谱分离操作如下：流动相A为超纯水，流动相B为乙腈；洗脱条件：0到30min 50％～70％流动相B梯度洗脱；进样体积30～300μL、柱温20～40℃、流速5～50mL/min；检测波长为358nm；色谱柱：制备型反相C-18柱；收集第二最高峰对应的洗脱液，在真空度-0.1～-0.08MP、温度10～60℃条件下减压蒸去提取剂，在小于等于130℃条件下干燥，得到红色的初步纯化物。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2.3)中，色谱分离操作如下：流动相A为超纯水，流动相B为乙腈；洗脱条件：0到30min用50％～70％流动相A洗脱；进样体积20～200μL；柱温20～40℃；流速2～20mL/min；检测波长为358nm；色谱柱：半制备型反相C-18柱；收集最高的峰值对应的化合物，为红曲素B洗脱液；在真空度-0.1～-0.08MP、温度10～60℃条件下减压蒸去除提取剂；在小于等于130℃条件下干燥，得到红色粉末状的红曲素B。
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| CN202210101505.1A Pending CN114292280A (zh) | 2021-12-08 | 2022-01-27 | 一种具有抑制糖苷酶活性和免疫调节活性的红曲素b及制备方法 |
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Cited By (1)
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2022
- 2022-01-27 CN CN202210101505.1A patent/CN114292280A/zh active Pending
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|---|
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| CN115611914A (zh) * | 2022-10-20 | 2023-01-17 | 安徽农业大学 | 具有抑制糖苷酶活性和免疫调节活性及抗衰老活性的红曲素a、b和c及制备方法 |
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