CN109673393A - 一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的生产方法 - Google Patents
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Abstract
一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的生产方法，属于微生物发酵技术领域。其包括以下工艺步骤：1）斜面菌种制备；2）摇瓶菌种制备；3）一级种子罐培养；4）二级种子罐培养；5）发酵罐培养；6）板框过滤；7）滤液浓缩；8）滤饼烘干。本发明采用了特定的培养基以及特定的条件对蝙蝠蛾拟青霉进行培养发酵，其中培养基原料简单，原料来源广泛，制备成本低，采用特定条件培养，缩短了蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的生产周期，原料利用率高。同时与野生虫草相比，有效成分含量高、重金属含量低，滤液回收再利用，有效减少工业污染，能产生极大的社会经济效益，对民众的健康得到很好的保障。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的生产方法。
背景技术
蝙蝠蛾拟青霉菌丝体是青海产新鲜冬虫夏草（Cordyceps sinesis(Berkele)sacco）中分离所得的虫草菌——蝙蝠蛾拟青霉（Paecilomyces hepiali chen）经深层发酵培养，将发酵产物过滤干燥制成。虫草系冬虫夏草寄生在鳞翅目蝙蝠蛾昆虫幼虫上所形成的子座（即草部分）与菌核（即虫的部分）二部分组成的复合体，经干燥而得，故简称虫草。有关单位对冬虫夏草深层发酵进行了广泛研究，取得了一定的成果，其发酵物与青海产天然虫草比较，两者的化学成分和药理作用基本相同。化学成分：核苷类化合物、甾醇类、氨基酸、肽类、甘露醇、单糖和多糖、有机酸、无机元素、维生素类、蛋白质及多胺类物质。
蝙蝠蛾拟青霉菌丝体与冬虫夏草的指纹谱很相似。另外根据《蝙蝠蛾拟青霉菌与冬虫夏草关系的分子系统学研究》显示，冬虫夏草和僵虫基因组DNA模板与蝙蝠蛾拟青霉的rDNA-ITS序列具有100%的一致性。冬虫夏草具有重要的食用与药用价值，野生资源被极度采集致使资源越来越少,国内外市场货源紧缺,因此研究一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体及其发酵应用技术很有必要。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的生产方法的技术方案。
所述的一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的生产方法，其特征在于包括以下工艺步骤：
1）斜面菌种制备：在无菌条件下进行分离蝙蝠蛾拟青霉并接种于斜面培养基，放置于恒温条件25℃-26℃条件下进行培养10-15天，得到蝙蝠蛾拟青霉斜面菌种；所述斜面培养基由马铃薯1-3份、葡萄糖1-3份、磷酸二氢钾0.05-0.15份、硫酸镁0.01-0.05份、琼脂1-3份、水900-1100份配制而成；
2）摇瓶菌种制备：将蝙蝠蛾拟青霉斜面菌种接入摇瓶培养基中，置于摇床上以160-200r/min震荡培养，培养温度25±1℃，培养时间2-4天，得到蝙蝠蛾拟青霉摇瓶菌种；所述摇瓶培养基由麸皮3-7份、葡萄糖1-3份、蛋白胨0.2-0.8份、磷酸二氢钾0.05-0.15份、硫酸镁0.01-0.05份、豆油0.02-0.06份、水90-110份配制而成；
3）一级种子罐培养：将摇瓶菌种接入一级种子罐培养基中，温度控制25.5±1℃，通气量调节0.05v/v/min，保持罐压0.05Mpa，培养周期60-80小时，得到一级种子罐发酵液；所述一级种子罐培养基由豆粕粉1-3份、葡萄糖1-3份、蛋白胨0.2-0.8份、磷酸二氢钾0.05-0.15份、硫酸镁0.01-0.05份、消泡剂0.02-0.06份、豆油0.04-0.08份、水90-110份配制而成；
4）二级种子罐培养：将一级种子罐发酵液接种到二级种子罐培养基中，温度控制25.5±1℃，通气量调节0.05v/v/min，保持罐压0.05Mpa，培养周期50-65小时，得到二级种子罐发酵液；所述二级种子罐培养基由豆粕粉1-3份、葡萄糖1-3份、蛋白胨0.2-0.8份、磷酸二氢钾0.05-0.15份、硫酸镁0.01-0.05份、消泡剂0.02-0.06份、豆油0.04-0.08份、水90-110份配制而成；
5）发酵罐培养：将二级种子罐发酵液接入到发酵罐培养基中，温度控制25.5±1℃，通气量调节0.05v/v/min，接种率5%-20%，保持罐压0.05Mpa，培养周期40-60小时，还原糖显示低于0.5%，PH显示低于4时发酵成熟，得到蝙蝠蛾拟青霉菌丝体发酵液；所述发酵罐培养基由豆粕粉1-3份、白糖1-3份、葡萄糖1-3份、蛋白胨0.2-0.8份、磷酸二氢钾0.05-0.15份、硫酸镁0.01-0.05份、消泡剂0.02-0.06份、豆油0.04-0.08份、水90-110份配制而成；
6）板框过滤：将发酵完成的发酵液通过板框压滤机进行过滤，得到滤饼及滤液；
7）滤液浓缩：将过滤好的滤液进行双效浓缩得到浓缩液，浓缩液通过喷雾干燥得到虫草胞外多糖粉；
8）滤饼烘干：将滤饼烘干、粉碎、混合后获得虫草菌丝体。
所述的一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的生产方法，其特征在于所述步骤1）中斜面培养基由马铃薯2份、葡萄糖2份、磷酸二氢钾0.1份、硫酸镁0.03份、琼脂1.5-2份、水950-1000份配制而成。
所述的一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的生产方法，其特征在于所述步骤2）中摇瓶培养基由麸皮5份、葡萄糖2份、蛋白胨0.5份、磷酸二氢钾0.1份、硫酸镁0.03份、豆油0.04份、水95-100份配制而成。
所述的一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的生产方法，其特征在于所述步骤3）中一级种子罐培养基由豆粕粉2份、葡萄糖2份、蛋白胨0.5份、磷酸二氢钾0.1份、硫酸镁0.03份、消泡剂0.04份、豆油0.06份、水95-100份配制而成。
所述的一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的生产方法，其特征在于所述步骤4）中二级种子罐培养基由豆粕粉2份、葡萄糖2份、蛋白胨0.5份、磷酸二氢钾0.1份、硫酸镁0.03份、消泡剂0.04份、豆油0.06份、水95-100份配制而成。
所述的一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的生产方法，其特征在于所述步骤5）中发酵罐培养基由豆粕粉2份、白糖2份、葡萄糖2份、蛋白胨0.5份、磷酸二氢钾0.1份、硫酸镁0.03份、消泡剂0.04份、豆油0.06份、水95-100份配制而成。
所述的一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的生产方法，其特征在于所述步骤7）中双效浓缩至密度为1.0-1.1g/cm3。
所述的一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的生产方法，其特征在于所述步骤8）中烘箱温度80℃-100℃，烘干时间24-60h。
本发明采用了特定的培养基以及特定的条件对蝙蝠蛾拟青霉进行培养发酵，其中培养基原料简单，原料来源广泛，制备成本低，采用特定条件培养，缩短了蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的生产周期，原料利用率高。同时与野生虫草相比，有效成分含量高、重金属含量低，滤液回收再利用，有效减少工业污染，能产生极大的社会经济效益，对民众的健康得到很好的保障。
附图说明
图1为腺苷标准品的HPLC图谱；
图2为蝙蝠蛾拟青霉菌粉样品的HPLC图谱。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步说明本发明，本发明中涉及的份数均为重量份。
实施例1：一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的生产方法
1）斜面菌种制备：在无菌条件下进行分离蝙蝠蛾拟青霉并接种于斜面培养基，放置于恒温条件25℃-26℃条件下进行培养10-15天，得到蝙蝠蛾拟青霉斜面菌种；所述斜面培养基由马铃薯1-3份、葡萄糖1-3份、磷酸二氢钾0.05-0.15份、硫酸镁0.01-0.05份、琼脂1-3份、水900-1100份配制而成；
2）摇瓶菌种制备：将蝙蝠蛾拟青霉斜面菌种接入摇瓶培养基中，置于摇床上以160-200r/min震荡培养，培养温度25±1℃，培养时间2-4天，得到蝙蝠蛾拟青霉摇瓶菌种；所述摇瓶培养基由麸皮3-7份、葡萄糖1-3份、蛋白胨0.2-0.8份、磷酸二氢钾0.05-0.15份、硫酸镁0.01-0.05份、豆油0.02-0.06份、水90-110份配制而成；
3）一级种子罐培养：将摇瓶菌种接入一级种子罐培养基中，温度控制25.5±1℃，通气量调节0.05v/v/min，保持罐压0.05Mpa，培养周期60-80小时，得到一级种子罐发酵液；所述一级种子罐培养基由豆粕粉1-3份、葡萄糖1-3份、蛋白胨0.2-0.8份、磷酸二氢钾0.05-0.15份、硫酸镁0.01-0.05份、消泡剂0.02-0.06份、豆油0.04-0.08份、水90-110份配制而成；
4）二级种子罐培养：将一级种子罐发酵液接种到二级种子罐培养基中，温度控制25.5±1℃，通气量调节0.05v/v/min，保持罐压0.05Mpa，培养周期50-65小时，得到二级种子罐发酵液；所述二级种子罐培养基由豆粕粉1-3份、葡萄糖1-3份、蛋白胨0.2-0.8份、磷酸二氢钾0.05-0.15份、硫酸镁0.01-0.05份、消泡剂0.02-0.06份、豆油0.04-0.08份、水90-110份配制而成；
5）发酵罐培养：将二级种子罐发酵液接入到发酵罐培养基中，温度控制25.5±1℃，通气量调节0.05v/v/min，接种率5%-20%，保持罐压0.05Mpa，培养周期40-60小时，还原糖显示低于0.5%，PH显示低于4时发酵成熟，得到蝙蝠蛾拟青霉菌丝体发酵液；所述发酵罐培养基由豆粕粉1-3份、白糖1-3份、葡萄糖1-3份、蛋白胨0.2-0.8份、磷酸二氢钾0.05-0.15份、硫酸镁0.01-0.05份、消泡剂0.02-0.06份、豆油0.04-0.08份、水90-110份配制而成；
6）板框过滤：将发酵完成的发酵液通过板框压滤机进行过滤，得到滤饼及滤液；
7）滤液浓缩：将过滤好的滤液进行双效浓缩得到浓缩液，浓缩至密度为1.0-1.1g/cm3，浓缩液通过喷雾干燥得到虫草胞外多糖粉；
8）滤饼烘干：将滤饼烘干、粉碎、混合后获得虫草菌丝体，其中烘箱温度80℃-100℃，烘干时间24-60h。
实施例2：
1、斜面菌种制备：选取马铃薯2份、葡萄糖2份、磷酸二氢钾0.1份、硫酸镁0.03份、琼脂1.5-2份、水950-1000份配制斜面培养基，在无菌条件下进行分离，放置于恒温条件25℃-26℃条件下进行培养，得到蝙蝠蛾拟青霉斜面菌种。
2、摇瓶菌种制备：
选取麸皮5份（煮沸30min后过滤取滤液）、葡萄糖2份、蛋白胨0.5份、磷酸二氢钾0.1份、硫酸镁0.03份、豆油0.04份、水95-100份配制摇瓶培养基。在容量为500mL三角瓶中装入200-250mL摇瓶培养基，在容量为2000mL三角瓶中装入1000mL摇瓶培养基，PH调节为5.5-7，121℃下灭菌30min，冷却。将蝙蝠蛾拟青霉斜面菌种接入500mL三角瓶中，置于摇床上以160-200r/min震荡培养，培养温度24-26℃,培养时间3-4天。完成后再将500mL三角瓶中的摇瓶菌种以1:5的比例接入2000mL三角瓶中，置于摇床上以160-200r/min震荡培养，培养温度24-26℃，培养时间2-4天，获得蝙蝠蛾拟青霉摇瓶菌种。
3、一级种子罐培养
选取豆粕粉2份、葡萄糖2份、蛋白胨0.5份、磷酸二氢钾0.1份、硫酸镁0.03份、消泡剂0.04份、豆油0.06份、水95-100份配制一级种子罐培养基。将一级种子罐培养基接种于0.8T不锈钢一级种子罐中，121℃、0.1-0.12MPa下灭菌30min，冷却至24-28℃。通过摇瓶火焰接种接入一级种子罐中，通入无菌空气。保持培养温度控制25.5±1℃，通气量调节0.05v/v/min，保持罐压0.05Mpa，培养周期60-80小时，得到一级种子罐发酵液。
4、二级种子罐培养
选取豆粕粉2份、葡萄糖2份、蛋白胨0.5份、磷酸二氢钾0.1份、硫酸镁0.03份、消泡剂0.04份、豆油0.06份、水95-100份配制二级种子罐培养基。将二级种子罐培养基接种于5T不锈钢二级种子罐中，121℃、0.1-0.12MPa下灭菌30min，冷却至24-28℃。由一级种子罐发酵液通过不锈钢管道接种到二级种子罐中，通入无菌空气。保持培养温度控制24-28℃，通气量调节0.05v/v/min，保持罐压0.05Mpa，培养周期50-65小时，得到二级种子罐发酵液。
5、发酵罐培养
选取豆粕粉2份、白糖2份、葡萄糖2份、蛋白胨0.5份、磷酸二氢钾0.1份、硫酸镁0.03份、消泡剂0.04份、豆油0.06份、水95-100份配制发酵罐培养基。将发酵罐培养基接种于20T发酵罐中，121℃0.1MPa下灭菌30分钟，冷却。将二级种子罐发酵液通过不锈钢管道接种到发酵罐中，温度控制25.5±1℃，通气量调节0.05v/v/min，接种率15%。保持罐压0.05Mpa，培养周期40-60小时。当还原糖显示低于0.5%，PH显示低于4时发酵成熟，得到蝙蝠蛾拟青霉菌丝体发酵液。
6、板框过滤
将发酵完成的发酵液通过板框压滤机进行过滤，得到滤饼及滤液。
7、滤液浓缩
将过滤好的滤液进行双效浓缩，浓缩至密度为1.0-1.1g/cm3，浓缩液通过喷雾干燥得到虫草胞外多糖粉。
8、滤饼烘干
滤饼通过烘箱干燥处理，烘干温度80-100℃进行烘干，烘干后粉碎，获得虫草菌粉。
9、与野生虫草对比
。
实施例3： 蝙蝠蛾拟青霉有效成分分析
采用高效液相色谱法（HPLC）对实施例2获得的蝙蝠蛾拟青霉菌粉进行腺苷含量的测定。操作如下：
液相色谱条件：
色谱柱：C18柱，150mm*4.6mm，5um
流动相：甲醇：水=15:85,使用前0.45um滤膜过滤，超声脱气；
流速：1.0ml/min
柱温：30℃；
波长：260nm
进样量20uL
（1）腺苷标准溶液制备：
准确称取腺苷标准品100mg,用0.01M的磷酸三钠定容至100mL，摇匀，4℃冰箱保存，有效期3个月。准确吸取0.5mL配制好的腺苷标准品溶液，0.01M磷酸三钠定容至50mL，按上述液相色谱条件测定，实验重复三次，结果取平均值。
（2）样品制备：
准确称取实施例1获得的蝙蝠蛾拟青霉菌粉0.25g,加入0.01M磷酸三钠约40mL，超声提取20min,取出后，加0.01M磷酸三钠定容至50mL，过滤，滤液过0.45um微孔滤膜，按上述液相色谱条件测定，实验重复三次，结果取平均值。
腺苷标准品及蝙蝠蛾拟青霉菌粉样品的HPLC图谱如图1和2所示。其中，A(腺苷标准品)的保留时间为4.271min的峰为腺苷峰,B（蝙蝠蛾拟青霉菌粉样品）的保留时间为4.344的峰为腺苷峰。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的仁和修改，等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的生产方法，其特征在于包括以下工艺步骤：
1）斜面菌种制备：在无菌条件下进行分离蝙蝠蛾拟青霉并接种于斜面培养基，放置于恒温条件25℃-26℃条件下进行培养10-15天，得到蝙蝠蛾拟青霉斜面菌种；所述斜面培养基由马铃薯1-3份、葡萄糖1-3份、磷酸二氢钾0.05-0.15份、硫酸镁0.01-0.05份、琼脂1-3份、水900-1100份配制而成；
2）摇瓶菌种制备：将蝙蝠蛾拟青霉斜面菌种接入摇瓶培养基中，置于摇床上以160-200r/min震荡培养，培养温度25±1℃，培养时间2-4天，得到蝙蝠蛾拟青霉摇瓶菌种；所述摇瓶培养基由麸皮3-7份、葡萄糖1-3份、蛋白胨0.2-0.8份、磷酸二氢钾0.05-0.15份、硫酸镁0.01-0.05份、豆油0.02-0.06份、水90-110份配制而成；
3）一级种子罐培养：将摇瓶菌种接入一级种子罐培养基中，温度控制25.5±1℃，通气量调节0.05v/v/min，保持罐压0.05Mpa，培养周期60-80小时，得到一级种子罐发酵液；所述一级种子罐培养基由豆粕粉1-3份、葡萄糖1-3份、蛋白胨0.2-0.8份、磷酸二氢钾0.05-0.15份、硫酸镁0.01-0.05份、消泡剂0.02-0.06份、豆油0.04-0.08份、水90-110份配制而成；
4）二级种子罐培养：将一级种子罐发酵液接种到二级种子罐培养基中，温度控制25.5±1℃，通气量调节0.05v/v/min，保持罐压0.05Mpa，培养周期50-65小时，得到二级种子罐发酵液；所述二级种子罐培养基由豆粕粉1-3份、葡萄糖1-3份、蛋白胨0.2-0.8份、磷酸二氢钾0.05-0.15份、硫酸镁0.01-0.05份、消泡剂0.02-0.06份、豆油0.04-0.08份、水90-110份配制而成；
5）发酵罐培养：将二级种子罐发酵液接入到发酵罐培养基中，温度控制25.5±1℃，通气量调节0.05v/v/min，接种率5%-20%，保持罐压0.05Mpa，培养周期40-60小时，还原糖显示低于0.5%，PH显示低于4时发酵成熟，得到蝙蝠蛾拟青霉菌丝体发酵液；所述发酵罐培养基由豆粕粉1-3份、白糖1-3份、葡萄糖1-3份、蛋白胨0.2-0.8份、磷酸二氢钾0.05-0.15份、硫酸镁0.01-0.05份、消泡剂0.02-0.06份、豆油0.04-0.08份、水90-110份配制而成；
6）板框过滤：将发酵完成的发酵液通过板框压滤机进行过滤，得到滤饼及滤液；
7）滤液浓缩：将过滤好的滤液进行双效浓缩得到浓缩液，浓缩液通过喷雾干燥得到虫草胞外多糖粉；
8）滤饼烘干：将滤饼烘干、粉碎、混合后获得虫草菌丝体。
2.如权利要求1所述的一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的生产方法，其特征在于所述步骤1）中斜面培养基由马铃薯2份、葡萄糖2份、磷酸二氢钾0.1份、硫酸镁0.03份、琼脂1.5-2份、水950-1000份配制而成。
3.如权利要求1所述的一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的生产方法，其特征在于所述步骤2）中摇瓶培养基由麸皮5份、葡萄糖2份、蛋白胨0.5份、磷酸二氢钾0.1份、硫酸镁0.03份、豆油0.04份、水95-100份配制而成。
4.如权利要求1所述的一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的生产方法，其特征在于所述步骤3）中一级种子罐培养基由豆粕粉2份、葡萄糖2份、蛋白胨0.5份、磷酸二氢钾0.1份、硫酸镁0.03份、消泡剂0.04份、豆油0.06份、水95-100份配制而成。
5.如权利要求1所述的一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的生产方法，其特征在于所述步骤4）中二级种子罐培养基由豆粕粉2份、葡萄糖2份、蛋白胨0.5份、磷酸二氢钾0.1份、硫酸镁0.03份、消泡剂0.04份、豆油0.06份、水95-100份配制而成。
6.如权利要求1所述的一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的生产方法，其特征在于所述步骤5）中发酵罐培养基由豆粕粉2份、白糖2份、葡萄糖2份、蛋白胨0.5份、磷酸二氢钾0.1份、硫酸镁0.03份、消泡剂0.04份、豆油0.06份、水95-100份配制而成。
7.如权利要求1所述的一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的生产方法，其特征在于所述步骤7）中双效浓缩至密度为1.0-1.1g/cm3。
8.如权利要求1所述的一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的生产方法，其特征在于所述步骤8）中烘箱温度80℃-100℃，烘干时间24-60h。
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