CN113666974A - 一种靛苷的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靛苷的制备方法，包括以下步骤：将蓝草叶片在‑15℃～0℃的有机溶剂中浸泡10～30min；②将水加热至80℃～100℃，将步骤①浸泡后的蓝草叶片加入热水中浸取10～30min，去除叶片，得浸取液；③向步骤②得到的浸取液中投加新鲜的有机溶剂低温浸泡处理的蓝草叶片，在80℃～100℃下浸取10～30min，得靛苷浓度更高的浸取液；④重复步骤③的操作2～5次，得到高浓度的靛苷浸取液；⑤提纯得到靛苷纯品。本申请设置的提取条件，能够从含靛苷的植物中提取到以靛苷为主体的生物活性物质，产率高，本发明方法可推广至其它含靛苷中草药中活性成分靛苷的提取，有利于提高相关中药资源的利用。

Description

一种靛苷的制备方法

技术领域

本发明涉及植物中活性物质的提取方法，具体涉及一种靛苷的制备方法。

背景技术

靛苷(indoxyl-β-D-glucoside，又称吲哚苷) 存在于菘蓝、木蓝、马蓝等叶子中，由吲哚和葡萄糖组成，是一种可溶于水的无色透明化合物，结构式如下：

。

当菘蓝、木蓝、马蓝等植物的叶片受到破坏时，靛苷从细胞液泡中释放出来，经酶解反应水解成吲哚和葡萄糖；吲哚继而生成吲哚酚，吲哚酚在空气中发生自我氧化反应产生靛蓝，同时在碱性条件下吲哚酚会发生缩合发应形成靛蓝。因此靛苷是靛蓝生产的前体物质。此外靛苷对病毒、病原菌也有很强的抑制作用，是板蓝根等中药的重要成分。但是以目前板蓝根的萃取方法及条件，从板蓝根中提取的主要成分为靛蓝及靛玉红，靛苷并不是板蓝根相关药品的主要成分。

中国专利文献CN 101701028B（申请号 200910113500.5）公开了一种吲哚苷的制备方法，按下列步骤进行：a、将大青叶加8倍量的水提取3次，每次0.5小时，合并提取液，静置过夜，取上清液；b、加水稀释，用中空纤维膜在压力0.1MPa、室温进行超滤，重复3 次，合并超滤液，再用纳滤膜浓缩；c、将浓缩液用旋转蒸发器在70℃继续浓缩，加入大孔树脂中用水和乙醇进行梯度洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇浓缩至流浸膏，用50毫升蒸馏水稀释后以等量的乙醚萃取3次，分离出水层；所述的梯度洗脱为先用 水洗脱，然后再用浓度为20％的乙醇洗脱；所述的大孔树脂为AB-8、X-5、 DM301、DM130型的大孔树脂；d、加2倍的乙酸乙酯热回流5-6小时，收集乙酸乙酯层，减压浓缩至 十分之一体积，室温下静置析晶，滤过，得到吲哚苷粗品；e、加热水溶解，趁热滤过，放冷析晶，反复5次，即可得到吲哚苷晶品，为灰白色无定型结晶粉末。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种提取成本低、产率高的靛苷的制备方法。

实现本发明目的的技术方案是一种靛苷的制备方法，包括以下步骤：

①将含有靛苷的蓝草叶片在-15℃～0℃的有机溶剂中浸泡10～30min，然后取出。

②将水加热至80℃～100℃，将步骤①浸泡后的蓝草叶片加入热水中，在80℃～100℃下浸取10～30min，浸取结束后固液分离去除叶片，得浸取液。

③向步骤②得到的浸取液中投加新鲜的有机溶剂低温浸泡处理的蓝草叶片，在80℃～100℃下浸取10～30min，浸取结束后固液分离去除叶片，得靛苷浓度更高的浸取液。

④重复步骤③的操作2～5次，得到高浓度的靛苷浸取液。

⑤将步骤④得到的靛苷浸取液提纯得到靛苷纯品。

所述有机溶剂为甲醇、乙醇或丙酮。

所述含有靛苷的蓝草叶片为蓼蓝、菘蓝、木蓝或马蓝。

进一步的，步骤②中将水加热至90℃～100℃，步骤②、③、④中在90℃～100℃下浸取靛苷。

步骤②、③、④中，投加蓝草叶片时，每1L水中加入蓝草叶片10g～50g。

步骤⑤中，向步骤④得到的高浓度的靛苷浸取液中添加大孔树脂，然后收集吸附好的大孔树脂，分别用10%，30%，50%，75%的乙醇依次洗脱，收集洗脱液，将乙醇旋干后冷冻干燥，得到靛苷粉末。

本发明具有积极的效果：

（1）本申请设置的提取条件，能够从含靛苷的植物中提取到以靛苷为主体的生物活性物质，本发明方法可推广至其它含靛苷的中草药中活性成分靛苷的提取，有利于提高相关中药资源的利用。

（2）在本发明的研发过程中，研究、发现、提出利用靛苷与葡萄糖苷酶的热稳定性的差异，先钝化酶活再将水温提前控制在80℃以上然后添加钝化处理后的蓝草叶片，成功采用水煮叶片的方式将靛苷从蓝草叶片中提取出来，在提取靛苷的同时有效抑制、破坏葡萄糖苷酶的活性，减少或避免副产物如吲哚酚的生成。

（3）为了避免添加叶片后水温剧烈变化导致副产物的大量生成，本发明用预冷的有机溶剂钝化酶活，在水温提前控制在80℃后少量添加蓝草叶片提取靛苷并固液分离，重复少量添加叶片提取并固液分离的步骤，最终得到含有高浓度靛苷的液体。

（4）本发明的制备方法步骤简单，对设备要求低，大大降低了靛苷的提取成本；最终提取得到的靛苷的产率达1.2% （g/g 叶湿重）以上。

附图说明

图1为实施例1制备的靛苷的HPLC图谱。

图2为实施例2制备的靛苷的HPLC图谱。

图3为靛苷标准品的HPLC图谱。

图4为靛苷的标准曲线。

图5为乙醇钝化酶活实验。

图6为乙醇钝化后糖苷提取实验。

具体实施方式

（实施例1）

本实施例的靛苷的制备方法包括以下步骤：

①将有机溶剂冷却至-15℃，将蓝草叶片浸没在有机溶剂中，浸泡30min后取出蓝草叶片待处理。

所述有机溶剂是能够与水互溶的有机溶剂，例如甲醇、乙醇、丙酮等，本实施例中为乙醇。

②将水加热至80℃～100℃（本实施例中将水加热至80℃），将步骤①浸泡后的蓝草叶片加入热水中，每1L水中加入蓝草叶片10g～50g（以新鲜蓝草叶片重量计算，本实施例中为50g）；

在80℃下浸取10～30min（本实施例中浸取30min）。浸取结束后固液分离去除叶片，得浸取液。

所述蓝草叶片是含有靛苷的叶片，如蓼蓝、菘蓝、木蓝和马蓝等，本实施例中所述的蓝草叶片是蓼蓝。

③向步骤②得到的浸取液中投加新鲜的有机溶剂低温浸泡处理的蓼蓝叶片，投加量同步骤②；在80℃下浸取10～30min（本实施例中浸取30min）。浸取结束后固液分离去除叶片，得靛苷浓度更高的浸取液。

④重复步骤③的操作2～5次（本实施例中重复4次），得到高浓度的靛苷浸取液，待提纯处理。

⑤将步骤④得到的靛苷浸取液，按1：10，1:5，1:3的比例添加预处理好的大孔树脂；例如对于50mL高浓度的靛苷浸取液，按1：10，1:5，1:3的比例添加预处理好的大孔树脂5、10、15g（湿重）。收集吸附好的大孔树脂，分别用10%，30%，50%，75%的乙醇依次洗脱，收集洗脱液，将乙醇旋干后冷冻干燥，得到靛苷粉末。

将本实施例得到的靛苷粉末进行HPLC检测，HPLC图谱见图1， 本实施例靛苷产率为1.28 % （g/g 叶湿重）。

（实施例2）

本实施例的靛苷的制备方法其余与实施例1相同，不同之处在于：

步骤①中使用的有机溶剂是甲醇，冷却至-10℃，将蓝草叶片浸没在有机溶剂中，浸泡15min。

步骤②中将水加热至90℃。

步骤②中，向90℃水中投加蓝草叶片菘蓝，每1L水中加入蓝草叶片40g；蓝草叶片在90℃下浸取15min。

步骤③中，向步骤②得到的浸取液中投加新鲜的有机溶剂低温浸泡处理的菘蓝叶片，每1L水中加入蓝草叶片40g；在90℃下浸取15min。

步骤④中，重复步骤③的操作2次，得到高浓度的靛苷浸取液，待提纯处理。

将本实施例得到的靛苷粉末进行HPLC检测，HPLC图谱见图2， 本实施例靛苷产率为1.40 % （g/g 叶湿重）。

（试验例1、靛苷标准品的分析）

HPLC检测条件：C18柱，采用A相：水，B相：乙腈梯度洗脱；检测波长240 nm , 柱温30 ℃ , 进样量10uL。洗脱条件：80%A-20%B 0-15min 1mL/min。

在上述检测条件下，靛苷标准品的HPLC图谱见图3，由图3可见，靛苷标准品在4.7min处有特征峰。

另外，靛苷标准曲线见图4，在靛苷浓度为0.02g/L至0.1g/L的范围内有非常好的线性关系，R²=0.9984，说明在该条件下分析靛苷具有准确性。

（试验例2、热稳定性试验）

一、蓝草叶片中的葡萄糖苷酶的热稳定性试验

实验方法：取1g蓼蓝叶片，加入放有10 mL 预冷磷酸盐缓冲液(50 mM, pH 7.8)、1% (w/w)聚乙烯吡咯烷酮溶液20mL和少量石英砂的研钵中，冰浴条件下进行研磨。待研磨均匀后在8000rpm下离心10min，得到的上层酶液待测。分别在常温（23℃）、45℃、60℃、80℃条件下测定酶活标曲，同时测定上清液的酶活。

分析方法：向0.2 mL pH 5、0.5 M的醋酸缓冲液加入0.65 mL 水和0.05 mL待测酶液，在45 ℃下预热5 min，加入0.1 mL 10 mmol/L的pNPG-Glu溶液，在45 ℃下反应10 min，加入500 μL 、1 mol/L的 Na₂CO₃ 终止反应。每分钟产生1 μmol 对硝基苯酚定义为一个酶活力单位，即1 U。

对硝基苯酚标准曲线的制作：

配制2 mM的对硝基苯酚溶液，分别取0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mL加入6个试管中，补加水至0.7 mL，加入0.2 mL pH 5、0.5 M的醋酸缓冲液，加入0.1 mL 10 mmol/L的pNPG-Glu溶液，最后加入500 μL 1 mol/L的 Na₂CO₃，在420 nm处测定其吸光度值。

酶活的定义：单位时间单位体积内产生1 μmol的对硝基苯酚所需酶量为一个酶活力。

N表示稀释倍数，V表示样品体积（mL），t表示反应时间（min）。

实验结果见下表：

在室温条件下（23 ℃），葡萄糖苷酶活为650.3U；当温度上升到45℃时，酶活也随之上升到1024.5U。但是，随着温度的进一步上升，酶活呈下降趋势。在80℃时，酶活下降到76.1U。这个结果说明酶活最适温度在45℃左右，温度过高会破坏酶的活性，超过80℃基本失活。

二、靛苷的热稳定性试验

实验方法：取靛苷标准品溶于10mL UP水（超纯水）中配制成浓度为0.1g/L的靛苷溶液，取1mL待测。剩余溶液置于100℃的沸水中10min，取出后置于冰浴中迅速冷却，补足液体总体积为9mL，取1mL样品待测。

分析方法：C18柱，采用A相：水，B相：乙腈梯度洗脱；检测波长240 nm , 柱温30 ℃, 进样量10uL。洗脱条件：80%A-20%B 0-15min 1mL/min。

实验结果：

未水煮的靛苷溶液浓度为0.1g/L。

水煮10分钟后，靛苷的浓度为0.1g/L，含量没有变化，说明靛苷在100℃的条件下具有很好的稳定性。

（实施例5、酶活钝化实验）

实验方法：取新鲜蓼蓝叶片1 g，在 100 mL、-15℃、pH=2的60%乙醇溶液中浸泡30min，取出后将叶片置于研钵中的冰上，加入1 g PVP粉末，一定量pH=5的0.5 M醋酸缓冲液，在研钵中研磨至匀浆后取出，定容至20 mL；将混合液于4℃、8000 rpm条件下离心20min，离心分离后取上清得到粗酶液。

取试管加入0.2 mL pH=5的0.5 M醋酸缓冲液，0.65 mL水以及0.05 mL待测酶液，在25℃下预热5 min，加入0.1 mol/L的pNPG-Glu溶液，在25℃下反应10 min，加入0.5 ml的1 mol/L的Na₂CO₃溶液终止反应，于420 nm处测定吸光值，计算得出β-葡萄糖苷酶酶活。

另取新鲜叶片1g，不进行低温乙醇预冷处理，直接进行同样操作测定酶活作为对照，比较两者酶活差异。

分析方法：向0.2 mL pH=5的0.5 M的醋酸缓冲液加入0.65 mL 水和0.05 mL待测酶液，在45 ℃下预热5 min，加入0.1 mL 10 mmol/L的pNPG-Glu溶液，在45 ℃下反应10min，加入500 μL 、1 mol/L的 Na₂CO₃ 终止反应。每分钟产生1 μmol 对硝基苯酚定义为一个酶活力单位，即1 U。

实验结果：如图5所示，未经处理的叶片的酶活超过了600U/g。而经过乙醇预冷处理的叶片的酶活下降至30U/g一下。说明乙醇预冷能够有效钝化酶活。

（实施例6、乙醇钝化后糖苷提取实验）

实验方法：取新鲜叶片5 g*2，在100 mL、-15℃、pH=2的60 %乙醇溶液中浸泡30min，将两组叶片分别加入沸水中预热5 min的100 mL水与60%乙醇溶液中，水煮10 min后冷却，测定上清糖苷、吲哚酚含量。

另取新鲜叶5 g，加入沸水中预热5 min的100 mL水中，水煮10 min后冷却，测定上清糖苷、吲哚酚含量。

分析方法：C18柱，采用A相：水，B相：乙腈梯度洗脱；检测波长240 nm , 柱温30 ℃, 进样量10uL。洗脱条件：80%A-20%B 0-15min 1mL/min。

实验结果：如图6所示，对照组在水煮过程就已产生了一定量的吲哚酚。这是叶片升温过程中β葡萄糖苷酶失活较慢照成的。而经过乙醇预冷处理后不论是利用水或者乙醇提取靛苷，吲哚酚的产率都非常低，从而靛苷的产率得到了很大提升，证明了酶活的钝化效果。

Claims (6)

1.一种靛苷的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

①将含有靛苷的蓝草叶片在-15℃～0℃的有机溶剂中浸泡10～30min，然后取出；

②将水加热至80℃～100℃，将步骤①浸泡后的蓝草叶片加入热水中，在80℃～100℃下浸取10～30min，浸取结束后固液分离去除叶片，得浸取液；

③向步骤②得到的浸取液中投加新鲜的有机溶剂低温浸泡处理的蓝草叶片，在80℃～100℃下浸取10～30min，浸取结束后固液分离去除叶片，得靛苷浓度更高的浸取液；

④重复步骤③的操作2～5次，得到高浓度的靛苷浸取液；

⑤将步骤④得到的靛苷浸取液提纯得到靛苷纯品。

2.权利要求1所述的靛苷的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂为甲醇、乙醇或丙酮。

3.根据权利要求1所述的靛苷的制备方法，其特征在于：所述含有靛苷的蓝草叶片为蓼蓝、菘蓝、木蓝或马蓝。

4.根据权利要求1所述的靛苷的制备方法，其特征在于：步骤②中将水加热至90℃～100℃，步骤②、③、④中在90℃～100℃下浸取靛苷。

5.根据权利要求1所述的靛苷的制备方法，其特征在于：步骤②、③、④中，投加蓝草叶片时，每1L水中加入蓝草叶片10g～50g。

6.根据权利要求1所述的靛苷的制备方法，其特征在于：步骤⑤中，向步骤④得到的高浓度的靛苷浸取液中添加大孔树脂，然后收集吸附好的大孔树脂，分别用10%，30%，50%，75%的乙醇依次洗脱，收集洗脱液，将乙醇旋干后冷冻干燥，得到靛苷粉末。

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