CN107573312A - 利用红麸杨提取黄颜木素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种红麸杨果实中提取纯化黄颜木素的方法，经粉碎红麸杨果实、加入纤维素酶和黑曲霉发酵降解，碱处理和醇水回流提取，过滤、滤液减压浓缩至干，乙醇溶解上大孔树脂柱、洗脱，得洗脱液减压浓缩至得浓缩液，结晶与重结晶得黄颜木素纯品。通过酶法与碱提取，大大提高了黄颜木素的提取率，降低了红麸杨中纤维素对提取的影响。通过柱层析和结晶相结合进行分离，大大提高了黄颜木素的纯度，简化了纯化的操作步骤，降低了黄颜木素的生产成本。
Description
技术领域
本发明属于天然产物技术领域，涉及了一种黄颜木素的制备方法，更具体地说是涉及了从红麸杨果实中提取纯化黄颜木素的方法。
背景技术
红麸杨(Rhus punjabensis var.sinica Rehd.)为漆树科盐肤木属落叶小乔木，其根、茎、叶、皮、花和果实均入药，且勿需与其它中药配伍，单独使用效果就很好，具有祛风化湿，收敛解毒，生津润肺，降火化痰等功效。该植物幼枝叶上形成的虫瘿俗称五倍子，可作为重要的工业原料。黄颜木素(3，7，3，4-四羟基双氢黄酮)是具有多种生物活性与药用价值的黄酮类物质。
近年来黄颜木素在欧、美、日、奥和新西兰等国作为防癌、防治心血管等疾病药物的主要药效成分和安全无毒新型氧化酶抑制剂得到了广泛应用。使得国内外对其需求量越来越大，但国内外现仅依赖皂角刺及松柏等单一资源开发黄颜木素，已远远不能满足市场对黄颜木素的需求，因此寻找新的黄颜木素含量高，又适合于工业化生产的植物资源已成研究热点。武陵山片区红麸杨资源极其丰富，但仅仅开发其幼枝叶上形成的五倍子，其产量极高的果实还处于自生自灭状态。
目前国内外主要从豆科植物皂荚的皂角刺及松柏中提取黄颜木素，而红麸杨果实中黄颜木素的研究国内外还未见报道。目前黄酮类化合物的提取方法主要有水提取、加热回流提取、碱提酸沉、乙醇提取、微波辅助提取、超声波辅助提取、超临界萃取等方法。酶解法为植物性中药材药效成分提取非常有效的技术，因为酶制剂能有效的降解植物细胞壁，使存在于胞内药效成分最大限度溶出，同时酶解反应条件温和，产物不易变性，保证了提取物的性质和结构的稳定。同时提取率也能较大的提高，并能大大缩短提取时间，是绿色高效的植物提取技术，可利用相关的酶制剂来提高提取物的极性，从而减少有机溶剂的使用，降低成本。
发明内容
针对红麸杨果实含有大量的纤维素和半纤维素、黄颜木素极性小等问题，提出一种酶法提取黄颜木素的方法，并采用柱层析和结晶进行分离出高纯度的黄颜木素产品。
本发明采用的微生物菌种为黑曲霉(Aspergillus niger)来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号分别为CGMCC No.3.316。
本发明提供一种红麸杨果实中提取纯化黄颜木素的方法，其具体步骤包括如下：
(1)粉碎红麸杨果实，加入纤维素酶终浓度为100～400U/kg，再加入5～10％黑曲霉菌液3.316在25～30℃下发酵2～3天，得发酵液；
(2)将发酵液用氢氧化钠调pH值至8.5±0.5，室温放置4～6h，加入70％～80％乙醇水溶液，加热至85～90℃进行回流提取4～8h；
(3)将提取液陶瓷膜过滤一次，滤液在50～65℃条件下减压回收乙醇，浓缩至稠膏状，置真空干燥箱干燥至恒定质量，得粗提取物；
(4)将粗提取物用等重量的75％～85％乙醇水溶液溶解，上大孔树脂柱，用两倍柱体积至三倍柱体积的20％乙醇水溶液，用四倍柱体积至六倍柱体积的60％～70％乙醇水溶液进行洗脱，得洗脱液，在50～65℃条件下减压回收乙醇，浓缩至原有体积的1/5～1/10，得浓缩液；
(5)将浓缩液置入-80℃冰箱冷冻结冰后，取出放入真空干燥机抽真空结晶，陶瓷膜过滤一次，滤渣Ⅰ加入45％乙醇水溶液溶解，再次置入冰箱0～5℃中进行重结晶，陶瓷膜过滤一次，所得滤渣进行25～35℃下真空干燥得黄颜木素纯品。
上述黑曲霉菌液都可以通过常规黑曲霉培养方法发酵获得，纤维素酶可从市场购买获得，酶活性在1000U/g以上。
上述陶瓷膜过滤的孔径为0.22μm。
上述70％乙醇水溶液的配制方法为80mL乙醇与20mL水混合即可。
在一个具体实施方案中，步骤(2)中所述氢氧化钠是指0.01～0.05mol/L氢氧化钠水溶液。
在一个具体实施方案中，步骤(2)中所述70％～80％乙醇水溶液的量L与红麸杨的重量kg比为2～5：1。
在一个具体实施方案中，步骤(4)中所述大孔树脂为XDA-8、LsA-21等树脂。
在一个具体实施方案中，步骤(5)中所述45％乙醇水溶液的量L与滤渣Ⅰ的重量kg比为0.5～2：1。
技术效果
1、通过酶法与碱提取，大大提高了黄颜木素的提取率，降低了红麸杨中纤维素对提取的影响。
2、通过柱层析和结晶相结合进行分离，大大提高了黄颜木素的纯度，简化了纯化的操作步骤，降低了黄颜木素的生产成本。
具体实施方式
下面用本发明的实施实例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限制本发明。
实施例1
粉碎红麸杨果实，称取100kg，加入纤维素酶终浓度为200U/kg，再加入10％黑曲霉菌液3.316在28℃下发酵3天，得发酵液。用0.05mol/L氢氧化钠水溶液将发酵液调pH值至8.5，室温放置5h，加入70％乙醇水溶液300L，加热至85℃进行回流提取5h。将提取液陶瓷膜过滤一次，滤液在50℃条件下减压回收乙醇，浓缩至稠膏状，置真空干燥箱干燥至恒定质量，得4.67kg粗提取物。将粗提取物用85％乙醇水溶液4.67kg溶解，上XDA-8柱，用两倍柱体积至三倍柱体积的20％乙醇水溶液，用四倍柱体积至六倍柱体积的60％～70％乙醇水溶液进行洗脱，得36L洗脱液，在50～65℃条件下减压回收乙醇，浓缩至4L，得浓缩液。将浓缩液置入-80℃冰箱冷冻结冰后，取出放入真空干燥机抽真空结晶，陶瓷膜过滤一次，得滤渣2.35kg，再加入45％乙醇水溶液3L溶解，再次置入冰箱0～5℃中进行重结晶，陶瓷膜过滤一次，所得滤渣进行25～35℃下真空干燥得1.45kg黄颜木素纯品。黄颜木素的HPLC检测条件：色谱柱:C18(4.6×250mm，5μm)；流动相乙腈-0.4％磷酸(19:81)；紫外检测器检测；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量:10μL。测定所得样品的含量为96.75％。
实施例2
粉碎红麸杨果实，称取200kg，加入纤维素酶终浓度为400U/kg，再加入8％黑曲霉菌液3.316在30℃下发酵3天，得发酵液。用0.04mol/L氢氧化钠将发酵液调pH值至8.5，室温放置5h，加入5％乙醇水溶液700L，加热至85℃进行回流提取6h。将提取液陶瓷膜过滤一次，滤液在50～65℃条件下减压回收乙醇，浓缩至稠膏状，置真空干燥箱干燥至恒定质量，得9.76kg粗提取物。将粗提取物用80％乙醇水溶液9.76kg溶解，上LsA-21柱，用两倍柱体积至三倍柱体积的20％乙醇水溶液，用四倍柱体积至六倍柱体积的60％～70％乙醇水溶液进行洗脱，得75L洗脱液，在50～65℃条件下减压回收乙醇，浓缩至9L，得浓缩液。将浓缩液置入-80℃冰箱冷冻结冰后，取出放入真空干燥机抽真空结晶，陶瓷膜过滤一次，得滤渣5.02kg，再加入45％乙醇水溶液5L溶解，再次置入冰箱0～5℃中进行重结晶，陶瓷膜过滤一次，所得滤渣进行25～35℃下真空干燥得2.93kg黄颜木素纯品。按实施例1的检测条件进行测定所得样品的含量为96.84％。
Claims (5)
1.本发明提供一种红麸杨果实中提取纯化黄颜木素的方法，其具体步骤包括如下：
(1)粉碎红麸杨果实，加入纤维素酶终浓度为100～400U/kg，再加入5～10％黑曲霉菌液3.316在25～30℃下发酵2～3天，得发酵液；
(2)将发酵液用氢氧化钠调pH值至8.5±0.5，室温放置4～6h，加入70％～80％乙醇水溶液，加热至85～90℃进行回流提取4～8h；
(3)将提取液陶瓷膜过滤一次，滤液在50～65℃条件下减压回收乙醇，浓缩至稠膏状，置真空干燥箱干燥至恒定质量，得粗提取物；
(4)将粗提取物用等重量的75％～85％乙醇水溶液溶解，上大孔树脂柱，用两倍柱体积至三倍柱体积的20％乙醇水溶液，用四倍柱体积至六倍柱体积的60％～70％乙醇水溶液进行洗脱，得洗脱液，在50～65℃条件下减压回收乙醇，浓缩至原有体积的1/5～1/10，得浓缩液；
(5)将浓缩液置入‐80℃冰箱冷冻结冰后，取出放入真空干燥机抽真空结晶，陶瓷膜过滤一次，滤渣Ⅰ加入45％乙醇水溶液溶解，再次置入冰箱0～5℃中进行重结晶，陶瓷膜过滤一次，所得滤渣进行25～35℃下真空干燥得黄颜木素纯品。
2.根据权利要求1的方法，步骤(2)中所述氢氧化钠是指0.01～0.05mol/L氢氧化钠水溶液。
3.根据权利要求1的方法，步骤(2)中所述70％～80％乙醇水溶液的量L与红麸杨的重量kg比为2～5：1。
4.根据权利要求1的方法，步骤(4)中所述大孔树脂为XDA‐8、LsA‐21等树脂。
5.根据权利要求1的方法，步骤(5)中所述45％乙醇水溶液的量L与滤渣Ⅰ的重量kg比为0.5～2：1。
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| CN113754626A (zh) * | 2021-07-12 | 2021-12-07 | 雅安职业技术学院 | 一种酶法制备漆黄素的方法 |
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Non-Patent Citations (1)
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| 董爱文等: "酶辅助提取协同大孔树脂纯化红麸杨果实黄颜木素", 《林产化学与工业》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113754626A (zh) * | 2021-07-12 | 2021-12-07 | 雅安职业技术学院 | 一种酶法制备漆黄素的方法 |
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