JP5442624B2 - エマルジョン由来(emulsion−derived)粒子 - Google Patents
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Description
「修飾(modified)タンパク質」は、化学的手段(例えばジアルデヒドの追加)によって修飾されたタンパク質、あるいは、遺伝子レベルで(例えばhisタグを用いて)修飾されたタンパク質を意味する。
タンパク質または修飾タンパク質をポリマーにイオン結合する場合、これは、ポリマー上で正または負に帯電した官能基を、タンパク質または修飾タンパク質上で前記官能基と反対に帯電されたアミノ酸残基とイオン結合させることで達成される。
タンパク質をポリマーに親和性結合する場合、これは、二価金属またはアビディンといった親和性タグが、ヒスチジンまたはビオチン化タンパク質を結合することで達成される。
鎖状または繊維状のポリマーは、ホモポリマーとしてよいし、ポリエチレンイミンとしてもよい。
架橋剤は、グルタルアルデヒドまたは他のアルデヒド、エポキシド、あるいは、複数の官能基を有する他の適当な化合物とすればよい。
また、本発明の第3の様態として、第1の液相の液滴が第2の液相内に分散した第1のエマルジョンを、一方の液相は水相であり、他方の液相は油相であり、水相中に溶解したポリマーが含まれているという状態で製造する処理と、第1の液相の液滴が第2の液相内に分散した第2のエマルジョンを、一方の液相は水相であり、他方の液相は油相であり、水相中に溶解した架橋剤が含まれるという状態で、第1のエマルジョンと併せる処理と、架橋剤にポリマーの鎖を架橋させて粒子を形成する処理と、を有し、当該粒子の各々は、架橋剤によって架橋されたポリマーの鎖で成る格子と、前記格子を成すポリマーの鎖に隣接および囲まれる形で存在する開口領域と、格子上に配された官能基とを有し、タンパク質または修飾タンパク質が当該粒子と反応し、それによって格子に結合され、固定化されること、を特徴とする粒子生成方法を提供する。
これまでに述べた通り、ポリマーはポリエチレンイミン(PEI)であり、架橋剤は、二官能基または多官能基のアルデヒド(グルタルアルデヒド、スクシンアルデヒド、デキストランアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、グリオキサールなど)である。他の適当な架橋剤を、PEIまたは誘導化PEI、あるいは他のポリマーに対して使用する場合もある。イソシアネート(ヘキサメチレンジイソシアネートまたはトルエンジイソシアネート、またはイソチオシアネートを含む);エポキシド(2-クロロメチルオキシランなど);無水物;エピクロルヒドリン,1-エチル-3,3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド;エチルクロロアセテート、または、それに類するものが挙げられる。タンパク質または修飾タンパク質の固定化には未反応の官能基が用いられるので、架橋剤は、ポリマー修飾または架橋後(post cross-linking)修飾のための誘導(derivitization)剤とも見なされるであろう。他のポリマーまたはコポリマーを用いることもでき、そうしてものとしては、ポリビニルアルコール、ナイロン、アルギネート、その他タンパク質(アルブミン、コラーゲン、それに類するもの)、およびそれに類するもの(修飾されたもの、修飾されていないもの)がある。
また、本方法には、粒子を油相から回収する処理が含まれる場合がある。具体的には、粒子の回収は物理的な分離手段(遠心分離や濾過)で実行する。
なお、上述したとおり、本方法は、回収した粒子に乾燥処理に先立って補助剤を加える処理を含む場合があり、そうすると、補助剤は粒子の格子の内部に捕捉されることになる。
(例1:ポリマー鎖/繊維の網目または格子からなる粒子の製造方法)
本方法で形成される油中水分散エマルジョンは、その内部で、ポリアミンポリマー(ポリエチレンイミン)を含むエマルジョンと別の主要なアミン架橋剤(グルタルアルデヒド)とが組み合わされる。2つの試薬が反応して、微細な粒子または粒の形をしたポリマーを形成する。
(使用化学物質)
グルタルアルデヒド(25%の水溶液)は、Acros Organics社(Geel West Zone 2, Jansen Pharmaceuticalaan 3a, 2440 ゲール, ベルギー)から入手した。ポリエチレンイミン(PEI)(50%の水溶液、カタログ番号P−3143、Mw750,000およびMn60,000)は、Sigma-Aldrich社(セントルイス、ミズーリ州 63178)から取得した。鉱物油(医薬用ホワイトオイル、48031)は、Castrol社(8 ジャンクションアベニュー、パークタウン、2193 ヨハネスバーグ、南アフリカ)から購入した。
(粒子の製造方法)
(エマルジョンAの組成)
・10mlの鉱物油(油相)
・0.05mlのノノキシノール−4(界面活性剤)
・0.5mlのポリエチレンイミン(ポリアミン)、(10%m/v水溶液)、pH11
700rpmで30分間、電磁撹拌器を用いて撹拌した。
(エマルジョンBの組成)
・10mlの鉱物油(油相)
・0.05mlのノノキシノール−4(界面活性剤)
・0.5mlのグルタルアルデヒド、(25%m/v、等級(grade)II)
700rpmで30分間、電磁撹拌器を用いて撹拌した。
(結果)
全てのエマルジョン調製で得られる材料を、遠心分離によって回収し、光学顕微鏡検査によって視覚化した。図1に示すのは格子形成の結果であり、おおよそ球状の粒子が形成されたことを示している。
(PEI対グルタルアルデヒドの濃度比が粒子形成に与える影響)
グルタルアルデヒドに対するPEIの比率が粒子形成に与える影響を調査した。サンプルは表1に従って調製した。
表1:繊維ポリマー主鎖の製造評価に使用するPEIおよびグルタルアルデヒドの量
(例2:ポリマー鎖/繊維のPEI支持体格子または網目主鎖へのラッカーゼの結合)
(酵素)
DeniLite(登録商標)(ラッカーゼ)は、Novozymes社(Novozymes A/S、Krogshoejvej 36、2880 バウスベア、デンマーク)から取得した。
(酵素洗浄)
ラッカーゼは、DeniLiteから部分的に精製した。その方法は、2回蒸留した100mlのH2Oに5gのDeniLite II Baseを溶かしながら、4℃で1時間、200rpmで撹拌するというものであった。懸濁物質は、Beckman-Coulter J2-21ME遠心分離機のJA14ロータを用い、4℃で1時間、10000rpmで遠心分離を行って除去した。上澄みを取り除き、10kDaカットオフ機能を備えたSnakeSkin(登録商標)(Pierce社)透析管を用いて、4℃の水5Lを3回交換して透析した。最初の2回の交換までの透析は2時間継続し、最後の透析は12時間継続した。酵素は、液体窒素の中で凍結させて凍結乾燥した。その後、このラッカーゼは、必要になるまで4℃で保管した。
(ラッカーゼの分析評価)
ラッカーゼの分析評価は、ラッカーゼを支持体に結合した後の遠心分離による上澄みと、支持体に固定化されたラッカーゼとを対象に実施し、結合時の活性度の維持状態を測定した。ラッカーゼ試薬は、基質としての1mMのグアヤコールを、100mMのサクシネートラクテート緩衝液(pH4.5)の中に含むものとした(Jordaan J,Pletschke B,Leukes W(著)、2004年、(題名)“Purification and partial characterization of a thermostable laccase from an unidentified basidiomycete.”(掲載誌)Enz. Microb. Technol. 34:635-641)。分析評価は、5 200M−1.cm−1の減衰係数で、450nmにおいて3回繰り返して実施した。分析評価の実施には、PowerWave HT Microtitreプレートリーダを用いた。酵素の単位は、1分につき1μmolの基質を酸化させるのに必要な酵素量を1単位として定めた。
(タンパク質の測定)
タンパク質担持(protein loading)後に、ラッカーゼを基準タンパク質とし、280nmでの光吸光を利用して溶液中のタンパク質濃度を測定した。溶液中の残留タンパク質をタンパク質全体から差し引いたものを、結合されたタンパク質と見なした。
(酵素固定化)
室温で30分間緩やかに揺動して、酵素(ラッカーゼ)(10mg.ml−1溶液で1ml)を支持体に結合させた。このとき、酵素は、表2に示す乾燥重量を持つ主鎖と結合した。ラッカーゼと結合した粒子は、700×gで5分間遠心分離を行って回収した。固定化された酵素は、50mlの水で5回洗浄し、上述したような遠心分離を行って回収した。
(結果)
表2:主鎖支持体へのラッカーゼの結合効率
別の実験用セットを表1に示す通りに調製した。しかし、本例での粒子はグルタルアルデヒドで後処理してあり、数字の2で区別している(すなわち、A2−J2)。調製に続き、上述した方法に従ってラッカーゼを粒子に結合した。ラッカーゼが結合した粒子を、700×gで5分間遠心分離して回収した。
本調査が示しているのは、繊維格子または網目をタンパク質固定化の支持体として用いた場合、タンパク質結合容量が大きいと同時に、タンパク質の機能活性は保たれる、ということである。
(例3:各種の油を用いたポリマー鎖/繊維のPEI支持体格子または網目主鎖の製造方法)
エマルジョンの油相の違いが与える影響を調査した。粒子の製造にあたって、先ず2種類の異なるエマルジョンA,Bを調製した。
(エマルジョンAの組成)
・10mlの鉱物油、パラフィン油またはイソオクタン(油相)
・0.1mlのノノキシノール-4(界面活性剤)
・0.5mlのポリエチレンイミン(ポリアミン)、(10%m/v水溶液)、pH11
25℃において、500rpmで30分間、電磁撹拌器を用いて撹拌した。
(エマルジョンBの組成)
・上述したのと同じ油相10ml
・0.1mlのノノキシノール-4(界面活性剤)
・0.5mlのグルタルアルデヒド、(25%m/v、等級II)
25℃において、500rpmで30分間、電磁撹拌器を用いて撹拌した。
(結果)
異なる油相で製造した粒子(各々の総量は20ml)の質量での回収量は、鉱物油、パラフィン油、イソオクタンでそれぞれ111mg、90mg、79mgと測定された。異なる油相で製造し、超音波処理を行わなかった湿潤粒子と乾燥粒子とを比較した結果、鉱物油およびパラフィン油のサンプルについては、乾燥後に粒径の平均値が大きくなったことが分かった(図3)。イソオクタンで製造された粒子は、乾燥処理にもかかわらず比較的変化がなかった。インライン超音波処理およびプレ超音波処理(pre-sonication)では、鉱物油およびパラフィン油で製造し乾燥した粒子の粒径分布に大幅な低下が見られた。それは、乾燥処理した粒子には凝塊が生じるが(図3)、超音波処理によって分解することができた、ということを示している。また、鉱物油およびパラフィン油で作られた湿潤粒子の粒径の分析でも、粒子の超音波処理に伴って粒径の平均値が下がることが示されたが、その幅は乾燥した粒子の場合(図3)に比べれば小さい。イソオクタンで製造した粒子は、乾燥処理や超音波処理にかかわりなく、比較的変化がなかった。
(例4:各種の界面活性剤を用いたポリマー鎖/繊維のPEI支持体格子または網目主鎖の製造方法)
粒子の合成では、界面活性剤の種類が影響を与える場合がある。これを調査した。
(結果)
鉱物油に各種の界面活性剤を用いて製造した粒子(総量20ml)の質量での回収量は、ノノキシノール-4、CHAPS、Triton X-100のそれぞれについて、111mg、72mg、92mgと測定された。CHAPSやTriton X100を用いた場合、異なる界面活性剤で製造した粒子を乾燥処理しても、粒径に実際的な差は表れなかった(図4)。ノノキシノール-4を界面活性剤として製造した粒子を乾燥処理すると、粒径は約50%大きくなった(図4)。さらに、超音波処理後の粒径分析は、テスト対象の全ての界面活性剤で製造した粒子で、そろって粒径が小さくなったことを示した。超音波処理した粒子の粒径を乾燥処理の前後で分析すると、結果は類似したものとなった。
(例5:ポリマー架橋剤として各種ポリアルデヒドを用いた粒子合成)
粒子の合成に用いる架橋剤アルデヒドは、様々に変更することができる。架橋剤としては、グルタルアルデヒド、デキストランアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネートが挙げられる。
5mlの粒子懸濁液に、Tris-Cl緩衝液(0.05M、pH8.0)に入れた5mg.ml−1の精製カンジダアンタークティカリパーゼB(CALB)を6ml加え、25℃で1時間緩やかに撹拌した。その後、懸濁液を遠心分離し、4℃の緩衝液10mlを用いて2度洗浄した。それから、懸濁液を遠心分離し、ペレットを10mlのTris-Cl緩衝液に再懸濁した。そして、p-ニトロフェニルブチラートを使って懸濁液(10μl)を分析評価した。また、比較のために、Tris-Cl緩衝液(0.05M、pH8.0)に0.5mg-per-mlの精製カンジダアンタークティカリパーゼBを10μl入れた場合についても分析したが、これには、p-ニトロフェニルブチラートの加水分解に基づく分析評価と、それに続く分光測光法による分析とを用いた(表3)。
(リパーゼ活性の分析評価)
リパーゼの活性により、p-ニトロフェニルエステル(p-ニトロフェニルブチラート(PNPB))はp-ニトロフェノールおよびブチル酸へと加水分解された。p-ニトロフェノールの放出によって黄色が生じ、この黄色は、UV/Vis分光光度計を用いれば410nmで測定される。活性度の測定は3回繰り返した。溶液の調製は以下のように行う。すなわち、溶液Aは、8mlのプロパン-2-オールに溶けた形で酵素基質を含むものとした。一方、溶液Bは、50mMのTris-緩衝液(pH8.0)にデオキシコール酸ナトリウム267mgを溶かした後に、66.7mgのアラビアゴムを溶解させたものとした。動的(Kinetic)分析評価を、PowerWave microtitreプレートリーダ(BioTek Instruments社)を用いて25℃で実行し、上述した溶液の1対10(A:B)の混合物240μlと固定化リパーゼ懸濁溶液または自由酵素10μlとを用いた。
(結果)
(表3:各種のアルデヒド架橋剤を用いて作った粒子の比較−CALBの活性度)
類似の実験を、蛍光菌(PFL:Pseudomonas fluorescens)由来のリパーゼを用いて実施した。酵素活性度の分析評価には、基質として、ブチル酸のp-ニトロフェニルエステル(PNPB)とパルミチン酸のそれ(PNPP)とを用いた。
(表4:各種のアルデヒド架橋剤で作られた粒子の比較−PFLの活性度)
各種のアルデヒドを用いることで、粒子形成のための効果的な架橋の実現と、タンパク質を粒子に架橋するための官能基の提供との両方が可能となった。架橋剤の選択は、酵素変性の程度や基質および生成物に対する粒子の接触可能性(accessibility)の程度によって、酵素の活性度に影響を与える可能性がある。最適な架橋剤は、酵素および反応基質に基づいて選択すればよい。
(例6:2官能基エポキシド架橋剤を用いた粒子製造)
粒子の合成に使用する架橋剤アルデヒドは、ジエポキシド(例:1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル)などの他の架橋剤と置き換えることができる。これを(グルタルアルデヒドの代わりに)、50%v/v、25%v/v、12.5%v/vの薄めていない(neat)0.5mlの溶液の形で、架橋剤エマルジョン(B)に加え、そして、40℃で2時間反応させた(例3の場合と同様)。エマルジョンからの粒子の回収には、3000×gの遠心分離(Sorvall RT7 benchtop遠心分離機使用)を10分間行い、その後、10mlの量の脱イオン水で6回洗浄した。洗浄後、最終的に得られた粒子を脱イオン水で20mlに再懸濁した。12.5%v/vまたは25%v/vのエポキシド溶液を用いて上記のやり方で調製したものは、形状の点で最も均一であったのに対し、50%のエポキシドを薄めずに用いて形成したものは、大きく、しかもばらつきがあった。
(結果)
ブタンジオールジグリシジルエーテルを架橋剤として使用した結果、直径が約0.1mmの白色粒子が形成された。しかしながら、この粒子は形状がいくぶん不規則であり、これは、架橋または後続のクリーニングの手順で粒子の凝塊が生じたことを示す。
(例7:単一のエマルジョンで製造したポリマー鎖/繊維のPEI支持体格子または網目主鎖)
粒子の形成方法は、必要に応じて調整することができる。例えば、単一のエマルジョンを用いて粒子を形成することもできる。
(結果)
単一のエマルジョンを用いて製造した粒子の回収量(質量)は152±12mgと算出されたが、その値は、2エマルジョン方式(例3を参照)を用いて得られるものに比べて約1.4倍大きかった。
(例8:ポリマー鎖/繊維のPEI支持体網目または格子の拡大規模での製造)
ここでの目的は、粒子製造の規模を線形的に10倍に拡大して粒径を評価することであった。別個の2バッチの粒子を、例3で概説した標準的製造方法にほぼ従って調製したが、異なる点として、第2のバッチは必要な構成成分の各々について10倍の量を含むものとした。両バッチに対しては、規模に応じた形で、例3と同様の粒子回収処理を行った。
(結果)
20ml、200mlの鉱物油量で製造した粒子の回収量は、質量でそれぞれ0.111g、1.11gと算出され、ちょうど10倍の差があった。鉱物油量が20mlでも200mlでも粒子を製造することは可能であり、より大きな規模で製造した粒子の粒径は、20mlの規模で得られるものに比べ、一貫してわずかに小さいだけであった(図6)。興味深い点は、より大きい規模で製造し、超音波処理していない乾燥粒子のサイズが、より小さい規模で製造した乾燥粒子と比べて約50%小さかったことである(図6)。
(例9:ポリマー鎖/繊維のPEI支持体網目または格子を用いた広範囲の酵素群の固定化)
ここでの目的は、異なる酵素を粒子主鎖に結合し、それらの結合率(%)と酵素活性度の維持の程度とを算出することであった。
(総タンパク質)
総タンパク質分析評価は、Bio-Rad Total Protein Assay kit(カタログ番号:500-0006)というキットを用い、個別の酵素を各々基準として用いて実施した。
(グルコースオキシダーゼ)
グルコースオキシダーゼ(GOX)の活性度は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)によるo-ジアニシジンの間接酸化を利用して計測した。分析評価は、Bergmeyer(その他)による方法(1988年)に従って実施した。調剤した試薬は以下の通り:(試薬A)o-ジアニシジン-2HCL(0.006%)を含む0.1Mのリン酸カリウム緩衝液(pH7);(試薬B)D−グルコースの10%の水溶液(使用前に1時間変旋光(mutarotate)を生じさせたもの);(試薬C)60Uml−1HRP水溶液。試薬A、B、Cは、それぞれを24:5:1の割合で、グルコースオキシダーゼの分析評価の直前に混合した。反応試薬0.3mlを入れて反応させており、サンプルを10μl加えることで反応が開始された。反応結果は、25℃において、436nmで動力学的に計測した(Powerwave HT microtitreプレートリーダ使用)。グルコースオキシダーゼの活性度の単位は、25℃およびpH7で、1分につきに1μmoleのβ-D-グルコースをD-グルコノラクトンとH2O2とに転換するだけの触媒作用を生じる酵素の量を1単位と定めた。
(リパーゼ)
リパーゼの活性により、p-ニトロフェニルエステルはp-ニトロフェノールおよび脂肪族カルボン酸に加水分解される。p-ニトロフェノールの放出によって黄色が生じ、この黄色はUV/Vis光度計では410nmで計測される。2種のp-ニトロフェノールエステル(p-ニトロフェニルアセテート(PNPA)およびp-ニトロフェニルブチレート(PNPB))を使用し、活性度の測定は3回繰り返した。溶液は以下のように調製した:溶液Aは、酵素基質(11.6mgのPNPAまたは24mgのPNPP)を8mlのプロパン-2-オールに溶かされた状態で含むものであり;一方の溶液Bは、267mgのデオキシコール酸ナトリウムを含み、これを50mMのTris-緩衝液(pH8.0)に溶かした後に、66.7mgのアラビアゴムを加えたものである。動力学的分析評価を、25℃で、PowerWave microtitreプレートリーダ(BioTek社)を使って実施し、上述した複数の溶液の混合物240μlと球体(sphere)酵素または自由リパーゼの溶液10μlとを用いた。
(結果)
粒子への結合について検査した全ての酵素で、タンパク質担持の率は30〜36%の範囲となった(表5)。
(表5:粒子主鎖支持体への各種酵素の結合効率)
(*)活性部位の保護のため酵素の固定化中に基質を追加した(上述の方法を参照)。
PNPAに対するCALBの活性度の維持には、メントール基質を含ませることが効果的であり、約30%高い活性度(83%)が保たれた(図7)。
(例10:ポリマー鎖/繊維のPEI支持体網目または格子;複数の酵素が結合した粒子)
本調査は、複数の酵素を、両酵素に対する活性度を保った状態で粒子主鎖に結合できることを示す意図で行った。グルコースオキシダーゼとホースラディッシュペルオキシダーゼ系とを選択した。
(結果)
グルコースオキシダーゼおよびホースラディッシュペルオキシダーゼの粒子主鎖への結合は成功し、3μmole.min−1の率でグルコースを変換することができた(表6)。このことは、分析評価で検出した活性度と同様、グルコースオキシダーゼとホースラディッシュペルオキシダーゼとが結合され、活性度を維持していたことを示す。すなわち、粒子を用いれば、複数の酵素を、両方の酵素が活性度を保った状態で結合することができる。
(表6:グルコースオキシダーゼおよびホースラディッシュペルオキシダーゼの2種酵素粒子に関する結合効率および活性度)
(例11:各種乾燥方法を用いて製造したポリマー鎖/繊維のPEI支持体格子または網目)
ここでの目的は、粒子を製造した後に、様々な方法(凍結乾燥、真空乾燥、アセトン乾燥など)を用いて粒子を乾燥させることであった。
(結果)
(表7:各種乾燥処置後の平均粒径)
本例が示すのは、乾燥処理、特に凍結乾燥した場合、酵素と結合した粒子が大きく凝塊することはない、ということである。
(例12:様々なpHでPEIから調製したポリマー鎖/繊維の支持体網目または格子へのラッカーゼ結合の特性評価)
乾燥処理が、結合後のラッカーゼ結合粒子の特性、酵素の性質に与える影響を判定した。
(結果)
凍結乾燥によるラッカーゼ結合粒子の乾燥処理では、粒子製造の際にPEIがpH8であった場合の方が、粒子に結合されるラッカーゼタンパク質は多いものの、粒子製造の際にPEIがpH11であった場合の方が、回収できる量(質量)は大きいことが分かった(表8)。ABTSに対しての活性度を最も高く保つことができたのは、pH8のPEIを用いて製造し、凍結乾燥しなかった粒子であったが(16%)、凍結乾燥後の同じサンプルはラッカーゼ活性度を3%しか保持していなかった。注目すべき点として、pH8のPEIを用いて製造された粒子は乾燥後に再懸濁するのが難しく、そのため凝塊する可能性があるが、凝塊すれば表面対面積(surface to area)の比率が下がり、従って、基質および生成物への分散制約(diffusional constraint)が原因で活性度が下がることになる。pH11のPEIを用いて生成された粒子については、活性度に関して同様の影響は観察されなかった(表8)。
この実験が示すのは、粒子はPEIのpHを変えて調製することができ、これによって酵素に対する粒子の結合特性が変わる、ということである。
(例13:pH8またはpH11で製造および凍結乾燥し、ポリマー鎖/繊維のPEI支持体網目または格子に結合されたラッカーゼの安定性)
pH8またはpH11で製造および凍結乾燥され、ポリマー鎖/繊維のPEI支持体網目または格子に結合されたラッカーゼの熱安定性およびpH安定性を測定した(ラッカーゼ結合粒子は例12に記述した形で製造した)。
(温度最適条件)
自由ラッカーゼおよび粒子結合ラッカーゼ(タンパク質担持は均等)の温度最適条件の解析(profile)を、100mMのサクシネートラクテート緩衝液(pH4.5)に基質として入れた1mMのABTSを用いて実行した。ウォーターバス内で、正確な温度に前平衡(pre-equilibrated)しておいた1.9mlの基質に、サンプル(100μl)を加えた。分析評価は、ペルティエ温度コントローラを備えたDU800分光光度計(Beckman-Coulter社、420nm)を用いて実施した。分光光度計を対象の温度に設定し、キュベットは、ウォーターバス内の平衡化した試薬を追加する前に、5分間平衡化させた。
(pH安定性)
自由ラッカーゼおよび粒子結合ラッカーゼ(タンパク質担持は均等)のpH安定化は、100mMのサクシネートラクテート緩衝液(pH4.5)に入れたABTS(1mM)を用いて行った。各ラッカーゼサンプルは、pH2.5、pH3、pHにおいて、Britton-Robinson汎用緩衝液内でインキュベートした。サンプル(20μl)を、定期的に取り出し、25℃でインキュベートすると共に、PowerWave HT(Biotek Instruments社)を用いて420nmで分析評価した(230μlの分析評価試薬)。6時間の時点での本実験の結果を図9に示す。
(結果)
結果を図8(A)、(B)、図9に示す。
(例14:ポリマー鎖/繊維のPEI支持体網目または格子への固定化に伴う酵素最適pHのシフト)
酵素は活性に最適のpHを有する。いくつかの場合、酵素の最適pHは、他の反応にとっての最適pHと一致しない。たとえば、酵素基質/反応物は別のpH値で最も溶解しやすい、という場合がある。もう1つの例として、複数の酵素を複数ステップのワンポット(one-pot)反応に用いる場合、それらの最適pHは一致しないことがある。それゆえ、固定化処理中に酵素の最適pHを変化させることができれば、これによって経済的および技術的な効果が得られるだろう。そこで、ラッカーゼの最適pHを、粒子上に固定化する場合と固定化しない場合とで測定した。
(酵素分析評価)
ラッカーゼ試薬は、50mMのBritton-Robinson汎用緩衝液の中に1mMのグアヤコールを含んでおり、当該緩衝液は目標とするpH値に調整してあった(Davies TJ, Banks CE, Nuthakki B, Rusling JF, France RR, Wadhawana JD, Compton RG(著)、2002年。(題名)“Surfactant-free emulsion electrosynthesis via power ultrasound: electrocatalytic formation of carbon-carbon bonds”、(誌名)Green Chem. 4:570-577)。汎用緩衝液を用いたのは、同じ緩衝液系が存在すること、そして広範囲のpHにわたって効果的に緩衝できることを確実にするためである。分析評価は、5 200M−1.cm−1の吸光係数で、450nmにおいて3回繰り返した。自由酵素ならびに支持体網目または格子の粒子に固定化されたラッカーゼについて、pH値プロフィールを実験で測定した。分析評価の実施には、PowerWave HT Microtitreプレートリーダを用いた。酵素の単位については、1分につき1μmolの基質を酸化させるのに必要な酵素の量を1単位とした。
(pH値プロフィールのシフト)
pHプロフィールのシフトは固定化処理中に起こることは公知であるため、繊維格子または網目主鎖支持体に結合されたラッカーゼについて、pHプロフィールを測定した。粒子は例3に従って作った。グルタルアルデヒドおよびPEIの濃度の変化が最適pHのシフトに与える影響についても、グルタルアルデヒド後処置(例2、A2−J2)の影響と同様に調査した。
(結果)
結果を図10(A)、(B)、図11(A)、(B)に示す。
(例15:ポリマー鎖/繊維のPEI網目または支持体格子の官能性)
粒子主鎖の官能性を変えることで、タンパク質の疎水性結合、イオン結合、そして親和性をベースとした結合を示すものにすることができる。
(イオン結合)
イオン性基は、上記の修飾されていない粒子で生成され、その方法は、グルタルアルデヒドを用いて官能化し(25%の水溶液200μl、20mlの脱イオン水で3回洗浄)、その後、エチレンジアミン(0.33Mを1ml)を用いた処理を行うことで、自由なアルデヒド残基と反応させる(定期的にひっくり返しながら室温で1時間)、というものであった。粒子は、充分な量の脱イオン水で繰り返し洗浄し、2000×gで10分間遠心分離を行って回収した。ラッカーゼ(2.5mg)を5mgの修飾された粒子と、充分な混合が確実に行われるように定期的にひっくり返しながら、4℃で30分間インキュベートした。イオン結合を促進するために、1.0MのNaClを(対イオンとして)ラッカーゼ結合粒子に加え、ひっくり返して5分間混合した。粒子は、上述したのと同様に遠心分離によって回収し、活性度を測定した。
(疎水性結合)
修飾されていない粒子(5mg)をエポキシオクタン(0.1ml)と共に25℃で4時間インキュベートするやり方で、疎水基を粒子に追加した。その後、これらを充分な量の水で繰り返し洗浄し、上述したように遠心分離によって回収した。疎水結合されたタンパク質(蛍光菌リパーゼ、5mg)は、界面活性剤(1%、デオキシコレート)の追加によって取り出すことができた。280nmでのタンパク質吸光度を測るやり方で測定を行った。
(親和性結合)
タンパク質の親和性結合については例17に示す。
(結果)
(イオン結合)
修飾された粒子には、追加したラッカーゼの45%が結合された(Bio-Rad protein assay dye reagent method(500-0006)によって求めた値、メーカ側の記録による)。この45%のラッカーゼのうち76.9%は、対イオンとして塩(1.0M、NaCl)を追加することで取り出すことができた。これに対し、修飾されていない粒子はラッカーゼの14%としか結合せず、塩溶液によって取り出せたのは、その52.6%だけであった。
(疎水性結合)
修飾された粒子にタンパク質を結合した。修飾された粒子に結合されたタンパク質の約28%は、デオキシコレートを追加することで取り出されたが、これは、結合された酵素のうちの疎水性結合部分である。
(例16:化学伝達物質および補因子の共捕捉(co-entrapment))
補因子(または修飾された補因子や化学伝達物質)を含ませることで、架橋後、酵素と補因子との共補足が可能になる。処理条件を選択することにより、反応体(例:酵素基質、共基質、生成物、共生成物)などの小分子の出入りを許す一方で補因子を保持するよう、粒子の多孔度を決めることができる。
(試薬の再利用)
バリン生成を目的としたPEG-20000-NADHの再利用のための試薬は、50mMのギ酸塩(ナトリウムギ酸塩1M株(stock)から出たもの、pH8.0)、50mMのTris-Cl緩衝液(pH8.0)、50mMの酒石酸アンモニウム、そして10mMの2-ケトバリンから成るものとした。この試薬の組成を、PEG NADHが再利用された場合に確実にバリンのみが生成されるように公式化(formulated)した。
(分析法)
アミノ酸TLCを、F254シリカゲルプレート(Merck社)で実施した。使用した移動相は、氷酢酸に対してエタノール9:1であった。アミノ酸(バリン)は、アセトン中にニンヒドリン2%の溶液を用いて染色した。バリン(Rf0.49)とアンモニア(Rf0.31)とが適当に分離したことが明らかに見て取れるまで、プレートを120℃で加熱した。
(結果)
反応および再利用は、TLCデータによれば成功であり、連続的な粒子触媒反応の全てについてバリンスポット(valine spot)が形成された。6回の連続的な16時間反応サイクルのそれぞれにおいて、粒子として、10mMのケトバリンを48、35、59、43、33、29%のいずれかの割合でバリンに変換したものを用いた。これによって肯定的なTLC結果が確認され、HPLC OPA法を用いて定量化できた。
(例17:ポリマー鎖/繊維のPEI支持体網目または格子を有する粒子による抗体の結合)
本例で示すのは、粒子への抗体や抗原の結合である。抗体や抗原が結合された場合には、固定化された抗体または抗原を介したタンパク質の親和性結合に対する粒子の適合性が示される。さらに、診断用途(例:ELISA)に対する粒子の信頼性が示される。
(粒子の調製)
架橋ポリエチレンイミン粒子は、例2(サンプルG)に従って調製した。試薬に対して唯一行った調整は、ポリエチレンイミン溶液を10%に希薄する前にHCIでpH9にしたことである。実験は4倍に直接拡大して行った。従って、乳化した反応体それぞれ800μlと共に溶解したNP4を200μl含んだ20mlの鉱物油が必要であった。結果として生じる架橋ポリエチレンイミン粒子を、50mlの脱イオン水で6回洗浄し、洗浄と洗浄との合間に5000×gで5分間遠心分離する、というやり方で鉱物油から回収した。粒子ペレットは、その後、脱イオン水で10mlの量に再懸濁し、実験A〜Fに500μlずつ使用した。
(タンパク質の固定化)
各実験には、下の表9に示すように文字を割り当てた。各種のタンパク質の追加は、表9で実験の下側の欄に示す手順で実行した。各実験について、第1のタンパク質成分の固定化は、10分毎にサンプルを逆さまにして充分な混合が行われることを確実にしつつ、4℃の脱イオン水で1時間かけて実施した(表9の順次追加ステップの1)。粒子は、1mlの脱イオン水で3回洗浄し、上述したやり方で回収した。
(表9:実験A〜Fのタンパク質結合の手順)
(分析評価)
ペルオキシダーゼ分析評価試薬は、150mM塩化ナトリウムを含む10mMリン酸塩緩衝液(pH6.8)に、2mMのABTSと2mMの過酸化水素とを含んで成るものとした。分析評価値は3回繰り返して測定し、1ウェル(well)につき200μlの試薬と50μlの粒子懸濁液とを用い、30℃において、Powerwave HT マイクロプレート分光光度計(Biotek Instruments社)で420nmの値を計測した。
(結果)
抗原に対する抗体の結合は、実験B(図12)で評価した。この実験では、粒子表面への主要な抗体(A-IL2-MA)の結合、それに続く抗原(IL-2)の結合、粒子への補助的な抗体(B-A-IL2-MA)およびストレプトアビジン−ペロキシダーゼの結合について、結合が成功したと解釈しうる肯定的な反応が示された。これは、マイクロプレートのウェルなどの表面で実行されるsandwich-ELISAに類似している。実験Cは、抗原が粒子の表面に結合され、その後、抗体結合のための認識要素(recognition element)として用いられることを示す。これらの実験は、各種の対照例(control)と比較して見た場合、粒子を抗体または抗原の結合に用いることが可能であることを示している。
(例18:ポリマー鎖/繊維のPEI支持体網目または格子の粒子への磁鉄鉱の組み入れ)
化学伝達物質および補因子を粒子に含ませる処理についてはすでに示した。本例では、粒子に磁性粒子を含ませる処理について示す。
(粒子の調製)
粒子は、上記の例17に従って調製し、各エマルジョンについて鉱物油が25mlになるよう線形的に数値を大きくした。乳化の前に、10%のポリエチレンイミン溶液(pH9.0)に磁鉄鉱(250mg)を含ませた。架橋したポリエチレンイミン粒子を、50mlの量の脱イオン水で6回洗浄し、洗浄ステップの合間に、5000×gで5分間遠心分離して鉱物油から回収した。続いて、粒子ペレットを脱イオン水で10mlの量に再懸濁し、500μlのエチレンジアミンと30分間反応させることで、陰イオン交換のために官能化した。次いで、球体を、50mlに3等分した脱イオン水で洗浄し、上述したように遠心分離を行って回収した。最終的に得られたペレットは、脱イオン水で10mlに再懸濁し、後述するアルブミン結合実験に使用した。粒子の乾燥重量は、10mlの粒子懸濁液を1mlずつに等分したものを凍結乾燥および重量測定するやり方で、3回繰り返して測定した。
(タンパク質の結合および定量化)
上記の等分した懸濁液から得た粒子を、磁気スタンド(Magnetic Separation Stand (Promega社; Z5332))で磁気分離して回収し、液体は除去した。その粒子を2mlのTris-Cl緩衝液(pH7.4)(50mM)で2回洗浄して平衡化した。そして、粒子にウシ血清アルブミン(BSA)を加えて、最終的な濃度を20mg.ml-1とした。タンパク質のイオン結合を、室温において30分間、回転混合することで生じさせた。混合物は磁気スタンド内に配置して、磁化された樹脂を反応管の側壁に保持させた状態で、サンプルからの液体が除去されるようにした。樹脂は、50mMの Tris-Cl(pH7.4)1ml で5回洗浄し、前述した磁気保持器(retainer)によって回収した。50mM のTris-Cl(pH7.4)に入れた1MのNaCl500μlを2回追加することで、イオン結合されたBSAを樹脂から抽出した。
(タンパク質定量化)
溶出した分のタンパク質は、メーカの指示に従って、Qubit Fluorometer(Invitrogen社)で、Quant-iT分析評価を用いて定量化した(表10)。
(結果)
(表10:磁鉄鉱含有粒子へのアルブミンの結合(3回分データの平均))
この結果が示すのは、磁鉄鉱を粒子に取り込めば、粒子の磁気特性を利用して粒子を懸濁液から効果的に分離できる、ということである。更に、上記の結果は、本支持体が効率の良いイオン交換樹脂として使用できることを示している。ここで提示する例では、アミン(エチレンジアミン)などの正荷電分子で粒子マトリックスを修飾することで、粒子を陰イオン交換樹脂として使用することができる。また、カルボキシル含有分子などの負荷電分子を用いれば、陽イオン交換樹脂としての使用が可能である。
本発明の粒子は、架橋剤によって架橋されたポリマー鎖または繊維の格子と、隣接して繊維を囲む格子間の開口領域または空間とを有する。言い換えると、本発明が提供するのは、繊維相互貫入網目粒子であり、好ましい構成として、グルタルアルデヒド架橋したポリエチレンイミンから構成または製造されている。この粒子は、酵素固定化マトリックスとして利用できる。
Claims (13)
- 架橋剤によって架橋されたポリエチレンイミンから成るポリマー鎖で成る格子と、前記格子を成すポリマー鎖に隣接および囲まれる形で存在する開口領域と、格子上に配された官能基とを有するエマルジョン由来粒子であって、
タンパク質または修飾タンパク質と反応することで、当該タンパク質または修飾タンパク質を格子に結合させ、固定化すること、
を特徴とするエマルジョン由来粒子。 - 官能基は、前記ポリエチレンイミンに存在しており、タンパク質または修飾タンパク質の前記ポリエチレンイミンの結合を、格子修飾を通して官能基を付与するように実現することができる共有結合、イオン結合、疎水結合、親和結合のうち1または複数で成されるように選択されたものであること、
を特徴とする請求項1に記載のエマルジョン由来粒子。 - 官能基によって格子に結合され、それによって固定化されたタンパク質または修飾タンパク質を少なくとも1つ含むこと、
を特徴とする請求項1または2に記載のエマルジョン由来粒子。 - 複数の異なるタンパク質または複数の異なる修飾タンパク質が内部で固定化されていること、
を特徴とする請求項3に記載のエマルジョン由来粒子。 - 格子内に捕捉された補助剤を含むこと、
を特徴とする請求項1乃至4のいずれかに記載のエマルジョン由来粒子。 - 補助剤は、補因子、修飾補因子、化学伝達物質、磁鉄鉱または磁性物質から選択されること、
を特徴とする請求項5に記載のエマルジョン由来粒子。 - 第1の液相の液滴が第2の液相内に分散したエマルジョンを、一方の液相は水相であり、他方の液相は油相であり、水相中には溶解したポリエチレンイミンから成るポリマーおよび架橋剤が含まれるという状態で製造する処理と、
架橋剤にポリマーの鎖を架橋させて粒子を形成する処理と、を有し、
当該粒子の各々は、架橋剤によって架橋されたポリマーの鎖の格子と、隣接して鎖を囲んだ状態の格子間の開口と、格子上の官能基とを有し、タンパク質または修飾タンパク質が当該粒子と反応し、それによって格子に結合され、固定化されること、
を特徴とする粒子生成方法。 - 第1の液相の液滴が第2の液相内に分散した第1のエマルジョンを、一方の液相は水相であり、他方の液相は油相であり、水相中に溶解したポリエチレンイミンから成るポリマーが含まれているという状態で製造する処理と、
第1の液相の液滴が第2の液相内に分散した第2のエマルジョンを、一方の液相は水相であり、他方の液相は油相であり、水相中に溶解した架橋剤が含まれるという状態で、第1のエマルジョンと併せる処理と、
架橋剤にポリマーの鎖を架橋させて粒子を形成する処理と、を有し、
当該粒子の各々は、架橋剤によって架橋されたポリマーの鎖の格子と、隣接して鎖を囲んだ格子間の開口と、格子上の官能基とを有し、タンパク質または修飾タンパク質が当該粒子と反応し、それによって格子に結合され、固定化されること、
を特徴とする粒子生成方法。 - 液相の少なくとも1つに補助剤を加え、当該補助剤が粒子の格子内に捕捉された状態に
する処理を有すること、
を特徴とする請求項7又は8に記載の粒子生成方法。 - 補助剤は、補因子、修飾補因子、化学伝達物質、磁鉄鉱または磁性物質から選択されること、
を特徴とする請求項9に記載の粒子生成方法。 - 粒子を回収し、回収した粒子を乾燥させる処理を有すること、
を特徴とする請求項7乃至10のいずれかに記載の粒子生成方法。 - 回収された粒子に対し、当該粒子の乾燥処理の前に補助剤を加え、当該補助剤が粒子の格子内に捕捉された状態にする処理を有すること、
を特徴とする請求項11に記載の粒子生成方法。 - 補助剤は、補因子、修飾補因子、化学伝達物質、磁鉄鉱または磁性物質から選択されること、
を特徴とする請求項12に記載の粒子生成方法。
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