ES2595104T3 - Partículas derivadas de emulsión - Google Patents

Abstract

Una partícula derivada de una emulsión, la cual comprende un enrejado de hebras de polietilenimina reticuladas por medio de un agente de reticulación, aperturas intersticiales adyacentes y alrededor de las hebras, y grupos funcionales sobre el enrejado y con los cuales pueden reaccionar proteínas y/o proteínas modificadas, para de este modo enlazarse al enrejado y quedar por tanto inmovilizadas.

Description

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DESCRIPCION

Partroulas derivadas de emulsion

Esta invencion se refiere a partroulas derivadas de emulsion. Tambien se refiere a un procedimiento para producir tales partroulas.

Las partroulas que contienen enzimas inmovilizados se usan rtpicamente para biocatalisis y para diagnostico, entre otras aplicaciones. Sin embargo, las partroulas de las que el Solicitante es consciente padecen de inconvenientes tales como un area superficial inadecuada para inmovilizar suficiente enzima. Es por tanto un objeto de esta invencion proporcionar partroulas mediante las cuales este inconveniente sea al menos aliviado, y un procedimiento para producir tales partroulas que tengan una alta capacidad enlazante por las protemas y puedan inmovilizar a las protemas.

Por tanto, segun un primer aspecto de la invencion, se proporciona una partroula derivada de emulsion, la cual comprende un enrejado de hebras polimericas reticuladas por medio de un agente de reticulacion, aperturas intersticiales adyacentes y alrededor de las hebras, y grupos funcionales sobre el enrejado con los que las protemas y/o las protemas modificadas puedan reaccionar, enlazandose de este modo al enrejado y quedando por lo tanto inmovilizadas.

Por “derivadas de emulsion” se quiere decir que las partroulas han sido producidas o formadas usando tecnicas de emulsion tales como, pero no limitadas a, los procedimientos basados en emulsiones del segundo y tercer aspectos de la invencion.

Por "protemas modificadas" se quiere decir protemas modificadas por medios qmmicos tales como mediante la adicion de di-aldefndos, o protemas modificadas a un nivel genetico, tal como por medio de etiquetas his.

Por tanto, la partroula incluye grupos funcionales sobre las hebras o fibras polimericas y/o sobre el agente de reticulacion con los cuales las protemas y/o las protemas modificadas pueden reaccionar. Mas espedficamente, los grupos funcionales pueden estar presentes sobre el polfmero de las hebras o fibras, y pueden seleccionarse para que el enlace de las protemas y/o las protemas modificadas al polfmero pueda efectuarse a traves de uno o mas enlaces covalentes, ionicos y de afinidad, modificando los grupos funcionales sobre el polfmero.

La partroula puede por tanto incluir al menos una protema y/o protema modificada enlazada al polfmero por medio de los grupos funcionales, siendo de este modo inmovilizada. La protema puede ser una enzima o una mezcla de enzimas; un anticuerpo o una mezcla de anticuerpos; o un anrtgeno o una mezcla de anrtgenos o cualquier otra protema la cual posea propiedades funcionales o estructurales. Por tanto, si se desea, dentro de la partroula pueden inmovilizarse una pluralidad de diferentes protemas y/o una pluralidad de diferentes protemas modificadas. Cuando la protema es una enzima, la partroula proporciona un medio mediante el cual el pH optimo de la enzima puede desplazarse a la region acida o alcalina, por inmovilizacion de la enzima en la partroula.

Cuando la protema y/o la protema modificada estan covalentemente enlazadas al polfmero, esto puede conseguirse, por ejemplo, por interaccion de un epoxido o un aldehfdo con grupos amina de la protema y/o de la protema modificada.

Cuando la protema y/o la protema modificada estan ionicamente enlazadas al porimero, esto puede conseguirse mediante grupos funcionales positiva o negativamente cargados sobre el polfmero, mediante enlace ionico con residuos aminoacidos opuestamente cargados sobre la protema y/o la protema modificada.

Cuando la protema esta hidrofobamente enlazada al porimero, esto puede conseguirse mediante grupos hidrofobos aromaticos o alcanos de cadena larga sobre el polfmero que se enlazan con el aminoacido hidrofobo de la protema.

Cuando la protema esta enlazada al polfmero por afinidad, esto puede conseguirse mediante etiquetas de afinidad, tales como metales divalentes y/o avidina, que se enlazan a una histidina o a una protema biotinilada.

Para un enlace mas eficiente de la protema, la partroula puede contener de manera natural, si se desea, mas que uno de los tipos o categorias anteriores de grupos funcionales.

El polfmero de las hebras o fibras puede ser un homopolfmero, y puede ser polietilenimina.

El agente de reticulacion puede ser glutaraldehfdo u otro aldehfdo; un epoxido; o cualquier otro compuesto adecuado que tenga grupos bi o multifuncionales.

La partroula puede incluir un adjunto atrapado dentro de las aperturas intersticiales o espacios de la red. El adjunto puede seleccionarse de un cofactor, un cofactor modificado, o un mediador qrnmico, magnetita y/o una sustancia magnetica. Incluyendo en la partroula una enzima y/o un sustrato adecuados como un adjunto puede conseguirse la regeneracion continua de los cofactores usados en una reaccion, permitiendo de este modo que la reaccion alcance el equilibrio o finalice. Incluyendo magnetita o una sustancia magnetica como un adjunto, puede efectuarse facilmente la recuperacion de las partroulas del medio lfquido de formacion usando una separacion magnetica.

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Segun un segundo aspecto de la invencion, se proporciona un procedimiento para producir partmulas, el cual incluye proporcionar una emulsion de gotitas de una primera fase lfquida dispersada en una segunda fase Kquida, siendo una fase Kquida una fase acuosa y la otra una fase oleosa, y conteniendo la fase acuosa un polfmero disuelto en la misma asf como un agente de reticulacion disuelto en la misma; permitir que el agente de reticulacion reticule las hebras del polfmero, para de este modo formar partmulas, cada una de las cuales incluye un enrejado de hebras del polfmero, reticuladas por medio del agente de reticulacion, aperturas intersticiales adyacentes y alrededor de las hebras, y grupos funcionales sobre el enrejado y con los cuales pueden reaccionar las protemas y/o las protemas modificadas, para de este modo quedar enlazadas al enrejado y, por lo tanto, inmovilizadas.

La primera fase lfquida puede ser la fase acuosa, siendo por tanto la segunda fase lfquida la fase oleosa, de modo que la emulsion sea una emulsion agua (w) en aceite (o), es decir una emulsion w/o. Sin embargo, en otras realizaciones de la invencion, la emulsion puede ser una emulsion aceite en agua (o/w), una emulsion agua en aceite en agua (w/o/w), o una emulsion aceite en agua en aceite (o/w/o).

La emulsion puede formarse mezclando una primera emulsion que comprende gotitas acuosas, que contienen el polfmero disuelto en las mismas, dispersadas en una fase oleosa, con una segunda emulsion que comprende gotitas acuosas, que contienen el agente de reticulacion disuelto en las mismas, dispersadas en una fase oleosa.

Segun un tercer aspecto de la invencion, se proporciona un procedimiento para producir partmulas, el cual incluye proporcionar una primera emulsion de gotitas de una primera fase lfquida dispersada en una segunda fase lfquida, siendo una fase lfquida una fase acuosa y la otra una fase oleosa, y conteniendo la fase acuosa un polfmero disuelto en la misma; combinar con la primera emulsion una segunda emulsion de gotitas de una primera fase lfquida dispersada en una segunda fase lfquida, siendo una fase lfquida una fase acuosa y la otra una fase oleosa, conteniendo la fase acuosa un agente de reticulacion disuelto en la misma; permitir que el agente de reticulacion reticule las hebras del polfmero, para de este modo formar partmulas, cada una de las cuales incluye un enrejado de hebras del polfmero, reticuladas por medio del agente de reticulacion, aperturas intersticiales adyacentes y alrededor de las hebras, y grupos funcionales sobre el enrejado y con los cuales pueden reaccionar las protemas y/o las protemas modificadas, para de este modo quedar enlazadas al enrejado y por lo tanto inmovilizadas.

Al menos una de las fases puede incluir un detergente o tensioactivo. El tensioactivo puede seleccionarse de un tensioactivo zwiterionico, un tensioactivo neutro, un tensioactivo cargado y/o un tensioactivo polimerico. Los tensioactivos anionicos incluyen un sulfato de alquilo tal como lauril-sulfato de sodio o laureth sulfato de sodio, y un alquil-eter-sulfato. Los tensioactivos cationicos incluyen cloruro de centrimonio. Los tensioactivos no ionicos incluyen alquil-fenol etoxilado tales como polioxietileno (10) iso-octilciclohexil eter (Triton X100) o polioxietileno(9) nonilfenil eter (Nonoxynol-9). Los tensioactivos zwiterionicos o anfifflicos incluyen decil betama. Los tensioactivos polimericos incluyen sorbitol-(oxido de etileno) 80, copolfmero de tribloques oxido de etileno-oxido de propileno-oxido de etileno, tambien conocido como poloxamero, tal como el disponible con el nombre comercial de Pluronic en BASF, y un copolfmero de tribloques oxido de propileno-oxido de etileno-oxido de propileno, tambien conocido como meroxapol.

El aceite de la o las fases oleosas puede, al menos en principal, ser cualquier disolvente organico inmiscible con agua, un aceite vegetal, un aceite mineral, un componente oleoso derivado de aceite de carbon o petroleo, o un aceite sintetico; sin embargo, preferiblemente se selecciona de un aceite mineral, parafina, y un disolvente tal como iso-octano.

Como se describio anteriormente en la presente memoria, el polfmero puede ser polietilenimina (PEI), mientras que el agente de reticulacion puede ser un aldetudo difuncional o multifuncional tales como glutaraldetudo, succinaldetudo, dextrano-aldetudo, hexametileno diisocianato y glioxal. Otros agentes de reticulacion adecuados pueden usarse para PEI o PEI derivatizado, u otros polfmeros, tales como isocianatos (incluyendo hexametileno diisocianato o tolueno diisocianato, o isotiocianato); un epoxido (tal como 2-clorometil-oxirano); un anhfdrido; epiclorhidrina, 1-etil-3,3-dimetilaminopropil carbodiimida; cloroacetato de etilo o similares. Cuando para la inmovilizacion de la protema y/o de la protema modificada se usan grupos funcionales sin reaccionar, los agentes de reticulacion tambien pueden considerarse que son agentes de derivatizacion para la modificacion del polfmero o modificacion despues de la reticulacion. Pueden usarse otros polfmeros o co-polfmeros, tales como poli(alcohol vimlico), nilon, alginato, otras protemas (tales como albumina, colageno y semejantes) y similares, modificados o de cualquier otra manera.

El procedimiento puede incluir introducir una protema, tales como una enzima, un anticuerpo o un antfgeno y/o una protema modificada, en o sobre las partmulas, de modo que la protema y/o la protema modificada reaccione con grupos funcionales sobre las hebras o fibras polimericas y/o sobre el agente de reticulacion como se describio anteriormente en la presente memoria, para de este modo enlazarse al polfmero de las hebras o fibras y/o a los agentes de reticulacion, y por tanto quedar inmovilizadas.

El procedimiento puede incluir anadir un adjunto a una de las fases, de modo que el adjunto quede atrapado dentro de los enrejados de las partmulas. Ademas, el adjunto puede anadirse antes o despues de que la protema se una al enrejado. Como se indico anteriormente en la presente memoria, el adjunto puede seleccionarse a partir de un cofactor, un co-factor modificado, un mediador qrnmico, magnetita y/o una sustancia magnetica.

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El procedimiento puede incluir recuperar las partmulas de la fase oleosa. En particular, la recuperacion de las paiimulas puede efectuarse por medios de separacion ffsica, tales como centrifugacion o filtracion.

El procedimiento puede incluir secar las partmulas recuperadas. El secado de las partmulas puede incluir deshidratacion con acetona, secado con aire, atomizacion, o, preferiblemente, liofilizacion o secado al vado.

El procedimiento puede incluir anadir un adjunto, como se describio anteriormente en la presente memoria, a las partmulas recuperadas antes del secado de las partmulas, de modo que el adjunto quede atrapado dentro de las redes de las partmulas.

El secado de las partmulas recuperadas puede efectuarse antes o despues de la inmovilizacion de la protema, para conseguir una mayor estabilizacion de la protema y las partmulas, y/o para atrapar aditivos tales como cofactores naturales o modificados. El secado tambien puede dar lugar a una mejor reticulacion de las protemas o protemas modificadas, por medio de una union multipunto. Esto a su vez puede aumentar la estabilidad de protemas tales como enzimas.

Se preve que las partmulas de la invencion pueden tener diversos usos o aplicaciones, tales como para biocatalisis, biorremediacion basada en enzimas, diagnosticos, y para enlace a una superficie de un soporte solido tal como un reactor de membrana o una matriz de inmovilizacion de protemas, para aumentar su area espedfica.

La invencion se describira con mas detalle con referencia a los siguientes ejemplos, y los dibujos acompanantes.

En los dibujos,

LA FIGURA 1 es una fotograffa microscopica de las partmulas polimericas de PEI reticuladas con glutaraldefudo, de acuerdo con el Ejemplo 1, que muestra el enrejado soporte de hebras/fibras polimericas o red troncal de PEI;

LA FIGURA 2 es un grafico que ilustra los resultados obtenidos para el enlace de lacasas a redes fibrosas, de acuerdo con el Ejemplo 2, con eficiencias de enlace corregidas para el desplazamiento del perfil de pH;

LA FIGURA 3 muestra los analisis de distribucion de tamanos de partmula (tamano medio) de partmulas fabricadas usando varias fases oleosas, donde las partmulas no habfan sido secadas (humedas), habfan sido secadas (usando liofilizacion), con ultrasonicacion en lmea (US) o medidas despues de un pretratamiento con ultrasonicacion;

LA FIGURA 4 muestra los analisis de la distribucion de tamanos de partmula de partmulas fabricadas usando varios tensioactivos; determinados por difusion de luz como tales, o analisis despues de ultrasonicacion (despues US);

LA FIGURA 5 muestra la distribucion de tamanos de partmula de partmulas humedas y secas fabricadas usando una unica emulsion; los resultados muestran la desviacion estandar de experimentos triplicados; determinadas por difusion de luz como estan, con ultrasonicacion en lmea (con US), o analisis despues de la pre-ultrasonicacion (despues US) de las muestras;

LA FIGURA 6 muestra la distribucion de tamanos de partmula de partmulas humedas y secas fabricadas con un volumen de 20 mL de aceite mineral y un volumen de 2O0 mL de aceite mineral;

LA FIGURA 7 muestra el mantenimiento de la actividad de varias enzimas enlazadas a partmulas, con y sin sustratos como protectores potenciales;

LA FIGURA 8 muestra las temperaturas optimas para lacasa libre y partmulas humedas y secas enlazadas a lacasa fabricadas a un pH de PEI de 8 (FIGURA 8A) y 11 (FIGURA 8B);

LA FIGURA 9 muestra la estabilidad con el pH (6 horas) de lacasa libre y partmulas humedas y secas enlazadas a lacasa fabricadas a pHs de 8 y 11;

LA FIGURA 10A muestra los perfiles de pH de lacasa de enzimas inmovilizadas y libres sobre redes fibrosas no postratadas, de acuerdo con el Ejemplo 14, que indican el efecto de la concentracion variable de polietilenimina (“PEI”) sobre el desplazamiento del perfil de pH;

LA FIGURA 10B muestra los perfiles de pH de lacasa de enzimas inmovilizadas y libres sobre redes fibrosas no postratadas, de acuerdo con el Ejemplo 14, que indican el efecto de la concentracion variable de glutaraldefudo sobre el desplazamiento del perfil de pH;

LA FIGURA 11A muestra los perfiles de pH de lacasa de enzimas inmovilizadas y libres sobre redes fibrosas postratadas con glutaraldefudo, de acuerdo con el Ejemplo 14, que indican el efecto de la concentracion variable de PEI sobre el desplazamiento del perfil de pH;

LA FIGURA 11B muestra los perfiles de pH de lacasa de enzimas inmovilizadas y libres sobre redes fibrosas postratadas con glutaraldefudo, de acuerdo con el Ejemplo 14, que indican el efecto de la concentracion variable de glutaraldefudo sobre el desplazamiento del perfil de pH;

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LA FIGURA 12 muestra los resultados obtenidos de la actividad de partfculas con peroxidasa para los experimentos A a F.

Ejemplo 1: Fabricacion de una particula que consiste en una red o enrejado de hebras/flbras polimericas.

Este metodo implica la formacion de una emulsion agua en aceite en el cual se combinan una emulsion que contiene un polfmero tipo poliamlna (polietilenimina) y otro agente de reticulacion tipio amina primaria (glutaraldehndo). Los dos reactivos reaccionan para formar polfmeros en forma de partfculas o perlas microscopicas.

Productos qrnmicos

El glutaraldehndo (disolucion acuosa al 25%) se obtuvo de Acros Organlcs (Geel West Zona 2, Janssen Pharmaceuticalaan 3a, 2440 Geel, Belgica). Polietilenimina (PEI) (disolucion acuosa al 50%, No. Cat. P-3143, Mw 750.000 y Mn 60.000) se obtuvo de Sigma-Aldrich (St Louis, Missouri 63178). Aceite mineral (aceite blanco medicinal, 48031) se compro en Castrol (8 Junction Avenue, Parktown, 2193 Johannesburg, Sudafrica).

Metodo para fabricar partfculas

Composicion de la emulsion A

10 mL de aceite mineral (fase oleosa)

0,05 mL de nonoxyol-4 (tensioactivo)

0,5 mL de polietilenimina (poliamina), (disolucion acuosa al 10% m/v), pH 11

Se agito a 700 rpm, 30 min, usando un agitador magnetico.

Composicion de la emulsion B

10 mL de aceite mineral (fase oleosa)

0,05 mL de nonoxyol-4 (tensioactivo)

0,5 mL de glutaraldehndo, (25% m/v, grado II)

Se agito a 700 rpm, 30 min, usando un agitador magnetico.

Las dos emulsiones (A y B) se combinaron para permitir la reaccion de reticulacion del polfmero y se agito usando una barra agitadora magnetica a 700 rpm durante 30 minutos a 1 hora para asegurar el mantenimiento de la emulsion. A continuacion, la emulsion se centrifugo a 3000 rpm (10 minutos en una centnfuga Beckman-Coulter J2- 21 ME equipado con un rotor JA20.1) para recuperar las partfculas formadas. El pelet se resuspendio en agua desionizada, se diluyo hasta 10 a 40 mL, y a continuacion se centrifugo de nuevo. Este procedimiento de lavado se repitio dos veces mas. El sobrenadante final fue transparente. El pelet final se suspendio en 10 mL de tampon Tris- CI (0,05 M, pH 8,0).

Resultados

El material de todas las preparaciones en emulsion se recupero por centrifugacion y se visualizo por microscopia optica. El resultado de formacion de un enrejado se muestra en la figura 1, que indica que se formaron partfculas aproximadamente esfericas.

Influencia de la relacion de concentraciones de PEI:Glutaraldehndo sobre la formacion de partfculas

Se investigo la influencia de la relacion de PEI a glutaraldehfdo sobre la formacion de partfculas. Las muestras se prepararon segun la Tabla 1.

La determinacion del peso seco se realizo por liofilizacion del enrejado o soporte troncal fibroso y pesada. Los resultados de este experimento se tabulan en la Tabla 1, e indican que una amplia gama de combinaciones de reactivos forman partfculas.

Tabla 1: Cantidades de PEI y glutaraldehfdo usadas para la evaluacion de la fabricacion de troncos polimericos fibrosos.

Muestra

PEI (% de disolucion acuosa) Glutaraldehfdo (% de disolucion acuosa) Peso seco del tronco (mg)

A

5 12,5 36

B

4,5 12,5 43,4

5

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C

4 12,5 40,2

D

3,5 12,5 38,2

E

3 12,5 27,2

F

2,5 12,5 20,4

G

5 10 40,8

H

5 7,5 37,8

I

5 5 36,6

J

5 2,5 35,4

Ejemplo 2: Enlace de lacasa a un enrejado soporte de hebras/fibras polimericas o red troncal de PEI

Enzimas

Se obtuvo DeniLite™, una lacasa, de Novozymes (Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, 2880 Bagsvaerd, Dinamarca). Lavado de la enzima

La lacasa se purifico parcialmente a partir de DeniLite™ disolviendo 5 g de DeniLite II Base en 100 mL de agua doblemente destilada, mientras se agitaba a 200 rpm durante 1 hora a 4°C. Los solidos suspendidos se separaron por centrifugacion a 10000 rpm durante 1 hora a 4°C usando un rotor JA14 en una centnfuga Beckman-Coulter J2- 21 ME. El sobrenadante se separo y se dializo frente a 3 cambios de 5 L de agua a 4°C usando tubos de dialisis SnakeSkin™ (Pierce) con un peso molecular de corte de 10 kDa. Los primeros dos cambios duraron 2 horas y la dialisis final 12 horas. La enzima se congelo en nitrogeno lfquido y se liofilizo. Esta lacasa se almaceno a continuacion a 4°C hasta que se requirio.

Analisis de lacasa

Los analisis de lacasa se realizaron en los sobrenadantes de centrifugacion despues del enlace de lacasa al soporte y de la lacasa inmovilizada en el soporte para determinar el mantenimiento de la actividad tras el enlace. El reactivo de lacasa contema guaiacol 1 mM como sustrato en tampon succinato-lactato 100 mM (pH 4,5) (Jordaan J, Pletschke B, Leukes W. 2004 Purification and partial characterization of a thermostable laccasa from an unidentified basidiomycete. Enz. Microb. Technol. 34:635-641). Los analisis se realizaron por triplicado a 450 nm con un coeficiente de extincion de 5200 M'1.cm'1. Los analisis se realizaron usando un lector de placas PowerWave HT Microtitre. Una unidad de enzima se definio como la cantidad de enzima requerida para oxidar 1 pmol de sustrato por minuto.

Determinacion de protemas

La carga de protema se siguio determinando la concentracion de protema en disolucion por medio de absorbancia de luz a 280 nm con lacasa como protema patron. La protema enlazada se definio como la protema total menos la protema residual en disolucion.

Inmovilizacion de la enzima

La enzima, lacasa (1 mL de una disolucion 10 mg.mL'1) se enlazo al soporte por suave agitacion durante 30 minutos a temperatura ambiente. La enzima se enlazo al peso seco del tronco indicado en la Tabla 2. Las partmulas con lacasa enlazada se recuperaron por centrifugacion a 700 x g durante 5 minutos. La enzima inmovilizada se lavo 5 veces with 50 mL de agua y se recupero por medio de la centrifugacion anteriormente mencionada.

La protema, en este caso la enzima lacasa, se anadio a las partmulas de PEI-glutaraldetndo (derivatizada o de cualquier otra forma) en forma de una disolucion tampon. Las partmulas se prepararon como se describio en el Ejemplo 1. Se permitio que las partmulas reaccionaran con la protema para permitir la inmovilizacion de la protema al polfmero como se menciono anteriormente. Las partmulas no se habfan secado despues de la recuperacion por centrifugacion y antes del uso.

Los resultados del enlace de la protema a varios soportes de protema fabricados se tabulan a continuacion (Tabla 2), mientras que los resultados de la actividad de lacasa se indican en la figura 2.

Resultados

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Tabla 2: Eficiencia del enlace de lacasa sobre el soporte troncal

Muestra

PEI (mg) Glutaraldehndo (mg) Peso seco del tronco (mg) Protema enlazada (mg) Carga de protema (mg.g"1)

A

5 12,5 36 3,24 89,89

B

4,5 12,5 43,4 4,95 137,43

C

4 12,5 40,2 5,50 152,83

D

3,5 12,5 38,2 5,96 165,45

E

3 12,5 27,2 6,62 183,85

F

2,5 12,5 20,4 6,34 176,05

G

5 10 40,8 6,22 172,67

H

5 7,5 37,8 5,66 157,27

I

5 5 36,6 5,03 139,70

J

5 2,5 35,4 9,43 261,93

Se preparo otro conjunto experimental como en la Tabla 1; sin embargo, en este ejemplo las partmulas se trataron posteriormente con glutaraldehndo y se designaron mediante el numero dos (es decir, A2-J2). Subsiguientemente, la lacasa se enlazo a la partmula segun el metodo descrito anteriormente. Las partmulas con lacasa enlazada se recuperaron por centrifugacion a 700 x g durante 5 minutos.

Los resultados de la actividad de la enzima cargada sobre el soporte polimerico se indican en la figura 2.

Esta investigacion indica que el enrejado o red fibrosa puede usarse como un soporte para la inmovilizacion de la protema con una alta capacidad enlazante de la protema a la vez que se retiene la actividad funcional de la protema.

Ejemplo 3: Fabricacion de un enrejado soporte de hebras/fibras polimericas o red troncal de PEI usando varios aceites

Se investigo la influencia de la variacion en la fase oleosa de la emulsion. Las partmulas se fabricaron preparando inicialmente 2 emulsiones A y B separadas.

Composicion de la emulsion A

10 mL de aceite mineral, aceite de parafina, o isooctano (fase oleosa)

0,1 mL de nonoxyol-4 (tensioactivo)

0,5 mL de polietilenimina (poliamina), (disolucion acuosa al 10% m/v), pH 11

Se agito a 500 rpm, 25°C, 30 min, usando un agitador magnetico.

Composicion de la emulsion B

10 mL de la misma fase oleosa que antes

0,1 mL de nonoxyol-4 (tensioactivo)

0,5 mL de glutaraldehndo, (25% m/v, grado II)

Se agito a 500 rpm, 25°C, 30 min, usando un agitador magnetico.

Seguidamente, la emulsion A se anadio rapidamente a la emulsion B y se agito durante una hora adicional (700 rpm). Las partmulas se recuperaron de las emulsiones por centrifugacion (3000 x g, centnfuga de sobremesa Sorvall) durante 10 minutos seguido por lavado 6 veces con volumenes de 10 mL de agua desionizada. Despues de lavar, las partmulas finales se resuspendieron hasta 20 mL con agua desionizada, la mitad de los cuales se secaron por liofilizacion. Tanto las partmulas humedas como las secadas se analizaron respecto a la distribucion de los tamanos de partmula (Malvern Mastersizer 2000). Los tamanos de partmula se determinaron antes, con y despues de la sonicacion en lmea para investigar la presencia de aglomeracion. Tambien se determino la recuperacion de masa despues de la liofilizacion.

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Se determino que la recuperacion de masa de las partmulas fabricadas con diferentes fases oleosas (volumen total de 20 mL para cada una) fue 111 mg, 90 mg y 79 mg para el aceite mineral, el aceite de parafina y el isooctano, respectivamente. La comparacion de las partmulas humedas y secas no sonicadas fabricadas en varias fases oleosas revelo que despues de secar el tamano medio de partmula aumento en las muestras de aceite mineral y aceite de parafina (Figura 3). Las partmulas fabricadas en isooctano permanecieron relativamente inalteradas a pesar de la etapa de secado. La sonicacion en lmea y la pre-sonlcacion mostraron grandes disminuciones de la distribucion de los tamanos de partmula de las partmulas secadas fabricadas en aceite mineral y de parafina, indicando que las partfculas se aglomeraron despues del secado (Figura 3), pero que podfan separarse por sonicacion. El analisis del tamano de partfcula de las partfculas humedas fabricadas en aceite mineral y aceite de parafina tambien indico una disminucion del tamano medio de partmula con tratamiento de sonicacion de las partfculas, aunque en menor extension que con las partmulas secadas (Figura 3). Las partmulas fabricadas en isooctano permanecieron relativamente inalteradas independientemente de los tratamientos de secado o sonicacion.

Concluyendo, pueden usarse varias fases oleosas para fabricar partmulas. El uso de diferentes fases oleosas (que presumiblemente influye en el tamano de las gotitas de la emulsion) asf como de diferentes tecnicas de postratamiento tales como secado o sonlcacion pueden emplearse para manipular su tamano.

Ejemplo 4: Fabricacion de un enrejado soporte de hebras/fibras polimericas o red troncal de PEI usando varios tensioactivos

En la smtesis de las partfculas el tipo de tensioactivo puede tener influencia. Esto fue investigado.

Las partfculas se prepararon segun el Ejemplo 3 con las siguientes excepciones - como la fase oleosa solo se uso aceite mineral y el tipo de tensioactivo se vario.

Resultados

Se determino que la recuperacion de masa de las partmulas fabricadas con varios tensioactivos en aceite mineral (volumen total 20 mL) fue 111 mg, 72 mg y 92 mg para nonoxynol-4, GHAPS y Triton X-100, respectivamente. El secado de las partmulas fabricadas con diferentes tensioactivos no revelo ninguna diferencia real de tamano cuando se usaron GHAPS y Triton X-100 (Figura 4). El secado de las partfculas fabricadas con nonoxynol-4 como el tensioactivo aumentaba el tamano de partmula en aproximadamente 50% (Figura 4). Ademas, el analisis del tamano despues de sonicar mostro una disminucion constante de los tamanos de partfcula de las partmulas fabricadas con todos los tensioactivos ensayados. Los analisis del tamano de partfcula de las partfculas antes y despues del secado despues de que habfan sido sonicadas fueron similares.

En conclusion, el uso de varios tensioactivos para fabricar partfculas fue posible. Por otra parte, el tamano de partmula pudo manipularse con varios tensioactivos y postratamientos.

Ejemplo 5: Smtesis de particulas con varios polialdehdos como agentes de reticulacion tipo polimero

El aldetudo reticulante usado en la smtesis de las particulas puede variarse. Por tanto, como agentes reticulantes se compararon glutaraldetudo, dextrano-aldetudo, y hexametilen diisocianato.

El metodo para fabricar particulas fue con el Ejemplo 3, con las siguientes excepciones: en un caso el glutaraldetudo fue reemplazado con dextrano-aldetudo (1 mL de 15 mg/mL). En otro, se reemplazo con 0,5 mL de hexametilen diisocianato (25% v/v).

A 5 mL de la suspension de particulas se anadieron 6 mL de una disolucion de 5 mg.mL"1 en tampon Tris-CI (0,05 M, pH 8,0) de lipasa B de Candida antarctica (CALB) purificada, la cual se agito suavemente durante 1 hora a 25°C. A continuacion, la suspension se centrifugo y se lavo dos veces con 10 mL de tampon a 4°C. A continuacion, la suspension se centrifugo y el pelet se resuspendio en 10 mL de Tris-CI. La suspension (10 |jL) se ensayo usando butirato de p-nitrofenilo. Por comparacion, tambien se ensayaron 10 jL de 0,5 mg por mL en tampon Tris-Cl (0,05 M, pH 8,0) de lipasa B de Candida antarctica purificada, usando un ensayo basado en la hidrolisis de butirato de p- nitrofenilo y su subsiguiente analisis por espectrometna (Tabla 3).

Ensayo de actividad de la lipasa

La actividad de la lipasa implicada en la hidrolisis de un ester de p-nitrofenilo (butirato de p-nitrofenilo (PNPB)) a p- nitrofenol y acido butmco. La liberacion de p-nitrofenol da un color amarillo el cual se mide con un espectrofotometro UV a 410 nm. Las actividades se determinaron por triplicado. Las disoluciones se prepararon como sigue: la disolucion A contema el sustrato de la enzima disuelto en 8 mL de propan-2-ol; mientras que la disolucion B contema 267 mg de desoxicolato de sodio disuelto en tampon Tris 50 mM (pH 8,0) seguido por disolucion de 66,7 mg de goma arabiga. Los ensayos cineticos se realizaron a 25°C usando un lector de placas de microtitulacion PowerWave (BioTek lnstruments) con 240 jL de una mezcla 1:10 (A:B) de las disoluciones anteriormente mencionadas y 10 jL de las disoluciones de la suspension de lipasa inmovilizada o de la enzima libre.

Tabla 3: Comparacion de partfculas fabricadas con varios agentes reticulantes tipo aldehndo - actividad de CALB.

Agente reticulante

Enzima libre (0,5 mg.mL'1) Glutaraldehfdo Dextrano-aldehfdo Hexametilen diisocianato

Color del pelet

No aplicable Naranja Amarillo Blanco

Actividad de la lipasa

U.mL'1 U.mL-1 U.mL-1 U.mL-1

Muestra 1

8,74 9,45 2,31 6,13

Muestra 2

5,72 9,10 2,10 6,13

Muestra 3

5,99 7,50 2,52 7,56

Media

6,81 8,68 2,31 6,61

Aunque este procedimiento no esta optimizado, demuestra que las partfculas pueden generarse usando una gama 5 de compuestos tipo poli-aldehndo.

Este material pudo recuperarse sobre un filtro de 0,45 pm (Sartorius) y reusarse, dando una media de 7,05 U.mL"1 para la partfcula de glutaraldehndo, u 81% de la actividad original en 5 reciclados.

Se realizo un experimento similar usando la lipasa de Pseudomonas fluorescens (PFL). El ensayo de la actividad enzimatica uso los esteres de p-nitrofenilo del acido butmco (PNPB) y el acido palmftico (PNPP) como sustratos.

10 Tabla 4: Comparacion de partfculas fabricadas con varios agentes reticulantes tipo aldehfdo - actividad de PFL

Aldehfdo

Actividad total (U)

PNPB

PNPP

Enzima libre

9,51 58,5

Hexametilen diisocianato

1,04 0,7

Glutaraldehfdo

0,08 0

Dextrano-aldehfdo

0,9 2

Por tanto, se pudieron usar varios aldehfdos para proporcionar tanto una reticulacion efectiva para la formacion de partfculas como de grupos funcionales para reticular protemas a las partfculas. La seleccion del agente reticulante puede influir en la actividad de la enzima a traves del grado de desnaturalizacion de la enzima, o del grado de 15 accesibilidad de la partfcula a sustratos y productos. El agente optimo puede seleccionarse sobre la base de la enzima y el sustrato de reaccion.

Ejemplo 6: Fabricacion de particulas usando un agente reticulante tipo epoxido bifuncional.

El agente reticulante tipo aldehfdo usado en la smtesis de las particulas puede reemplazarse por otros agentes reticulantes, tales como di-epoxidos, por ejemplo 1,4-butanediol diglicidil eter. Este se anadio (en lugar de 20 glutaraldehfdo) a la emulsion (B) reticulante como 0,5 mL de una disolucion pura, 50%, 25% o 12,5% v/v y se hizo reaccionar (como en el Ejemplo 3) a 40°C durante 2 horas. Las particulas se recuperaron de las emulsiones por centrifugacion (3000 x g, centrifuga de sobremesa Sorvall RT7) durante 10 minutos seguido por lavado 6 veces con volumenes de 10 mL de agua desionizada. Despues de lavar las particulas finales se resuspendieron en 20 mL de agua desionizada. Las preparadas como anteriormente con la disolucion de epoxido al 12,5% o 25% v/v fueron las 25 de forma mas uniforme mientras que las formadas usando disolucion pura de epoxido al 50% fueron grandes y difusas.

El enlace de la protema se investigo usando CALB (como en el ejemplo previo), la cual se dializo durante toda la noche y se hizo reaccionar con las particulas basadas en el epoxido (preparadas como anteriormente con la disolucion de epoxido al 12,5% v/v) durante una hora con suave agitacion. La actividad enzimatica se analizo 30 despues la recuperacion y el lavado de las particulas enlazadas a la lipasa como se describio en el Ejemplo 5. Todos los analisis se realizaron con PNPB como sustrato

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

El uso de butanodiol diglicidil eter como un agente reticulante dio lugar a la formacion de partfculas blancas de aproximadamente 0,1 mm de diametro. Las partfculas tuvieron sin embargo una forma algo irregular, lo que indico agregacion de partfculas con reticulacion o subsiguientes procedimientos de limpieza.

Las partfculas producidas con una disolucion de epoxido al 12,5% v/v se incubaron durante toda la noche en presencia de la enzima. Estas partfculas dieron una actividad de 0,28 U.mL-1. Esto demuestra que las partfculas pueden fabricarse usando un agente reticulante tipo epoxido.

Ejemplo 7: Enrejado soporte de hebras/fibras polimericas o red troncal de PEI fabricada en una unica emulsion

El metodo para la formacion de las partfculas puede ajustarse segun se necesite. Por ejemplo, las partfculas pueden formarse por medio de la aplicacion de una unica emulsion.

El polfmero y el agente reticulante pueden entonces mezclarse instantaneamente en la fase acuosa en una camara de mezclado por medio de un dispositivo de inyeccion dual. La version mas simple podna consistir en dos jeringas que inyectan en una lmea comun en el mismo punto. Esto puede inyectarse directamente en la fase acuosa. Por ejemplo, usando 20 mL de aceite mineral en el cual se disolvieron 0,2 mL de nonoxynol-4 durante aproximadamente 5 minutos y usando agitacion magnetica a 500 rpm; se evaluo tal configuracion. Una jeringa contema 0,5 mL de PEI (10%) y la otra contema 0,5 mL de glutaraldelmdo (20%, grado II). Las jeringas se descargaron simultanea y directamente en el aceite mineral. La emulsion resultante se agito durante 1 hora y a continuacion las partfculas se recuperaron como en el ejemplo 3. El experimento se realizo por triplicado. Las partfculas se dividieron en 2 fracciones iguales, una de las cuales se liofilizo (Virtis) y se resuspendio hasta el volumen original antes de analizar la distribucion del tamano de partfcula (Malvern Masterslzer 2000). Se analizo la recuperacion de masa de las muestras despues de secar.

Resultados

Se calculo que la recuperacion de masa en las partfculas fabricadas usando una unica emulsion fue 152 ± 12 mg, la cual fue aproximadamente 1,4 veces mayor que la obtenida usando la estrategia de 2 emulsiones (referida al Ejemplo 3).

La formacion de partfculas usando una unica emulsion fue posible y reproducible usando la actual tecnica de fabricacion (Figura 5). Se encontro que las partfculas tuvieron una distribucion de tamanos de partfcula mayor que las formadas usando una emulsion dual (Figura 5). Se mostro que la distribucion de tamanos en estado humedo y seco obtenida para las partfculas obtenidas mediante una unica emulsion fue entre 50 y 70% mayor que las obtenidas en el experimento de doble emulsion (Figura 3).

Ejemplo 8: Escalado de la fabricacion de la red soporte o enrejado de hebras/fibras polimericas de PEI

El objetivo fue aumentar linealmente la escala de fabricacion de partfculas 10 veces y evaluar el tamano de partfcula. Se prepararon dos lotes separados de partfculas segun el metodo de fabricacion estandar perfilado en el Ejemplo 3, excepto que el segundo lote contema 10 veces mas de cada uno de los respectivos constituyentes requeridos. Los lotes se procesaron respecto a la recuperacion de partfculas como en el Ejemplo 3 segun la escala.

Resultados

Se calculo que la recuperacion de masa de las partfculas fabricadas con volumenes de aceite mineral de 20 mL y 200 mL fue 0,111 g y 1,11 g respectivamente, lo cual fue exactamente 10 veces la diferencia. La fabricacion de partfculas en los volumenes de aceite mineral de 20 y 200 mL fue posible, siendo las partfculas fabricadas a mayor escala consistentemente solo ligeramente de menor tamano que las obtenidas a la escala de 20 mL (Figura 6). Interesantemente, las partfculas secadas no sonicadas fabricadas a mayor escala tuvieron un tamano alrededor de 50% mas pequeno cuando se compararon con las partfculas secadas a la menor escala (Figura 6).

La fabricacion de partfculas en condiciones estandar es escalable en al menos 10 veces sobre la base de la recuperacion de masa y el analisis del tamano de partfcula.

Ejemplo 9: Aplicacion de una red soporte o enrejado de hebras/fibras polimericas de PEI para inmovilizar una gama de clases de enzimas

El objetivo fue enlazar diferentes enzimas al tronco de las partfculas y calcular sus porcentajes de enlace asf como la actividad enzimatica retenida.

Se usaron las partfculas fabricadas segun el ejemplo 3. Las enzimas investigadas fueron Lacasa (Novozymes 51009, Myceliopthora thermophilia), glucosa oxidasa (Seravac Pty Ud, Aspergillus niger) y Lipasa (CALB, Novozymes Candida antarctica). Para cada experimento se enlazaron 5 mg (0,5 mL en una concentracion de 10 mg.mL-1) de la enzima respectiva a 14 mg (0,5 mL en una concentracion de 28 mg.mL-1) de partfculas con suave

5

10

15

20

25

30

35

40

agitacion durante 2 horas (25°C). Cada muestra se centrifugo durante 10 minutos usando una centrifuga Allegra X22R (2000 x g). Las partteulas se lavaron 6 veces consecutivamente, cada vez con 2 mL de agua desionizada. Las fracciones combinadas de sobrenadante se analizaron para determinar la protema total. Cada uno de los experimented de enlace a la enzima respectiva se realizo con y sin la inclusion de un sustrato particular como un protector potencial. El protector potencial (50 pL de 100 mg.mL-1 ajustados a pH 6,8) para lacasa fue el mediador comercial Denillite II Assist (Novozymes), para la glucosa oxidasa el protector potencial fue glucosa (50 pL de glucosa monohidrato al 10% m/v) y para CALB se uso una mezcla de 8 diastereomeros de 2-isopropil-5- metilciclohexanol (mentol) (50 pL). Las partteulas se resuspendieron hasta 2 mL en agua desionizada. Se ensayo la actividad enzimatica de las partteulas. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

Protema total

Los analisis de protema total se realizaron usando el kit Bio-Rad Total Protein Assay (No. Cat.: 500-0006) usando como patrones cada una de las respectivas enzimas usadas.

La actividad de lacasa se determino usando la sal de diamonio del acido 2,2-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6- sulfonico (ABTS)1 mM como sustrato en tampon succinato-lactato 100 pH 4,5. La densidad optica de la disolucion se midio a 420 nm. Estos ensayos se realizaron anadiendo 20 pL de las muestras a 180 pL de reactivo ABTS. La actividad se siguio espectrofotometricamente a 420 nm usando un equipo PowerWave HT (Biotek lnstruments) con incubacion a 25°C.

Glucosa oxidasa

La actividad de la glucosa oxidasa (GOX) se midio usando la oxidacion indirecta de o-dianisidina por peroxidasa de rabano (HRP). Los ensayos se realizaron segun Bergmeyer et al., 1988. Se prepararon los siguientes reactivos: reactivo A, tampon de fosfato de potasio 0,1 M, pH 7, que contema o-dianisidlna-2HCl (0,006%); reactivo B, disolucion acuosa al 10% de O-glucosa (que se permitio mutarrotar durante 1 h antes de su uso); reactivo C, disolucion acuosa de 60 U.mL-1 de HRP. Los reactivos A, B y C se mezclaron inmediatamente antes de ensayar la glucosa oxidasa en la relacion 24:5:1, respectivamente. La reaccion contema 0,3 mL del reactivo de reaccion y se inicio mediante la adicion de 10 pL de muestra. La reaccion se midio cineticamente a 436 nm (lector de placas de microtitulacion Powerwave HT) a 25°C. Una unidad de actividad de glucosa oxidasa se define como la cantidad de enzima que cataliza la conversion de 1 pmol de p-D-glucosa a D-gluconolactona y H2O2 por minuto a 25°C y pH 7.

Lipasa

La actividad de la lipasa implicada en la hidrolisis de esteres de p-nitrofenilo a p-nitrofenol y un acido carboxflico alifatico. La liberacion de p-nitrofenol da un color amarillo el cual se mide con un espectrofotometro UV/VIS a 410 nm. Se usaron dos esteres de p-nitrofenol, acetato de p-nitrofenilo (PNPA) y butirato de p-nitrofenilo (PNPB) y las actividades se determinaron por triplicado. Las disoluciones se prepararon como sigue: la disolucion A contema el sustrato de la enzima (11,6 mg de PNPA o 24 mg de PNPP) disuelto en 8 mL de propan-2-ol; mientras que la disolucion B contema 267 mg de desoxicolato de sodio disuelto en tampon Tris 50 mM (pH 8,0) seguido por 66,7 mg de goma arabiga. Los ensayos cineticos se realizaron a 25°C usando un lector de placas de microtitulacion PowerWave (BioTek) con 240 pL de una mezcla de las disoluciones anteriormente mencionadas y 10 pL de las esferoenzimas o disoluciones de lipasa libre.

Resultados

La carga de protema para todas las enzimas ensayadas respecto a su enlace a partteulas vario entre 30% y 36% (Tabla 5).

Tabla 5: Eficiencia de enlace de varias enzimas al soporte troncal de partteulas

Muestra

Peso seco de partteulas (mg) Protema enlazada (mg) Carga de protema (mg.g-1) Carga de protema (% m/m)

Lacasa

14 4,77 341 34,06

Lacasa - Sustrato*

14 5 357 35,71

Glucosa oxidasa

14 5 357 35,71

Glucosa oxidasa - Sustrato*

14 5 357 35,71

CALB

14 4,27 305 30,5

CALB - Sustrato*

14 4,6 329 32,89

* Se anadio sustrato durante la inmovilizacion de la enzima para proteger el sitio activo (vease el metodo anterior)

5

10

15

20

25

30

35

40

La inclusion del sustrato mentol para el mantenimiento de la actividad de CALB hacia PNPA fue ventajosa reteniendo aproximadamente 30% mas de actividad (83%) (Figura 7).

Lacasa, glucosa oxidasa y CALB se enlazaron todas con exito a partmulas con retencion de la actividad, lo que indica que una gama de protemas puede enlazarse efectivamente a las partmulas a elevadas cargas de protema. Ademas, tambien se demostro que otras enzimas, tales como peroxidasa de rabano, proteasas y deshidrogenasas, se enlazaban a las partmulas (veanse los ejemplos de mas adelante).

Ejemplo 10: Red soporte o enrejado de hebras/fibras polimericas de PEI; particulas con multiples enzimas enlazadas

La investigacion se diseno para demostrar que pod^a enlazarse mas de 1 enzima al tronco de las particulas con retencion de la actividad hacia ambas. Se escogio el sistema de glucosa oxidasa y peroxidasa de rabano.

Las particulas se fabricaron segun el Ejemplo 3. Las enzimas investigadas fueron glucosa oxidasa (Seravac Pty Ltd, Aspergillus niger) y peroxidasa de rabano (Serevac Pty Ltd). Para el ejemplo 5 mg (0,5 mL a una concentracion de 10 mg.mL-1) de glucosa oxidasa y 10 mg de peroxidasa de rabano (1 mL a una concentracion de 10 mg.mL-1) se enlazaron a 28 mg (1 mL a una concentracion de 28 mg.mL-1) de tronco de partmulas con suave agitacion por sacudidas durante 2 horas (25°C). Cada muestra se centrifugo durante 10 minutos usando una centnfuga Allegra X22 (200 x g). Las partmulas se lavaron 6 veces consecutivamente cada una con 2 mL de agua desionizada. Las fracciones combinadas de los sobrenadantes se analizaron respecto a la protema total. La actividad de las partmulas se determino segun el metodo de ensayo para la glucosa oxidasa del Ejemplo 9, pero sin la inclusion de peroxidasa de rabano en el reactivo de ensayo.

Resultados

La glucosa oxidasa y la peroxidasa de rabano se enlazaron con exito al tronco de las partmulas y fueron capaces de convertir la glucosa a una velocidad de 3 pmol.min-1 (Tabla 6). Como el ensayo detecto actividad, esto indica que tanto la glucosa oxidasa como la peroxidasa de rabano estaban enlazadas y activas. Por tanto, las particulas pueden usarse para enlazar mas que una enzima y ambas enzimas retienen actividad.

Tabla 6: Eficiencia de enlace y actividad para particulas de enzimas dobles de glucosa oxidasa y peroxidasa de rabano.

Muestra

Peso seco de particulas (mg) Protema enlazada (mg) Carga de , protema (mg.g ) Carga de protema (% m/m) Actividad de la glucosa oxidasa (pmol.min-1)

Glucosa oxidasa y peroxidasa de rabano

28 6,7 240,7 24,1 3

Ejemplo 11: Red soporte o enrejado de hebras/fibras polimericas de PEI fabricadas usando varios metodos de secado

El objetivo fue fabricar particulas y subsiguientemente secarlas usando diferentes metodos, tales como liofilizacion, vacm y secado con acetona.

Las particulas se fabricaron en las condiciones estandar que se esbozaron en el Ejemplo 1. Una vez lavadas, las partmulas se secaron por liofilizacion (liofilizador Virtis Genesis), secado al vacm usando un concentrador a vacm (Savant SpeedVac SC110, equipado con una trampa de vapores Savant RVT100), o por deshidratacion con acetona seguido por secado al aire a 25°C durante 12 horas. Las particulas secadas con acetona no pudieron resuspenderse en medio acuoso debido a la aglomeracion, y por tanto no se consideraron mas.

Sin embargo, el secado al vacm y la liofilizacion fueron ambas tecnicas exitosas para secar las particulas y pudieron usarse subsiguientemente para la union de una gama de enzimas o protemas (Tabla 7). A 5 mL de la suspension de particulas se anadieron 6 mL de una disolucion de 5 mg por mL de enzima purificada en tampon Tris-Cl (0,05 M, pH 8,0), la cual se agito suavemente durante 1 hora a 25°C. A continuacion, la suspension se centrifugo y se lavo dos veces con 10 mL de tampon a 4°C. A continuacion, la suspension se centrifugo y el pelet se resuspendio en 10 mL de tampon Tris-CI (0,05 M, pH 8,0). Los tamanos de partmula se determinaron usando un equipo Malvern Mastersizer.

Tabla 7: Tamano medio de partmula despues de varios tratamientos de secado

Tamano de partroula pm (volumen medio ponderado)

Muestra

Metodo de secado Tratamiento Partroulas humedas Partroulas secadas resuspendidas

Partroulas - protema no inmovilizada

Liofilizacion Ninguno 22,432 17,662

Sonicacion 13,141 14,556

Partroulas - CALB

Liofilizacion Ninguno 21,958 26,262

Sonicacion 14,199 13,734

Partroulas - BSA

Liofilizacion Ninguno 24,114 32,092

Sonicacion 20,071 21,129

Partroulas - Lipasa de Pseudomonas fluorescens

Liofilizacion Ninguno 18,705 21,648

Sonicacion 14,169 15,258

Partroulas - protema no inmovilizada

Secado al vacro Ninguno 17,662 66,613

Sonicacion 14,556 18,979

Partroulas - Lipasa de Pseudomonas fluorescens

Secado al vacro Ninguno 18,705 71,776

Sonicacion 14,169 18,84

Partroulas - Lacasa

Liofilizacion Ninguno 38,081 34,491

Sonicacion 22,498 18,948

Partroulas - Proteasa Alcalasa (Novozymes)

Liofilizacion Ninguno 30,737 32,884

Sonicacion 20,297 22,698

Este ejemplo demuestra que con el secado, particularmente con la liofilizacion, las partmulas con enzima enlazada 5 no se aglomeran en una gran extension.

Ejemplo 12: Caracterizacion de lacasa enlazada a una red soporte de o a un enrejado de hebras/fibras polimericas preparadas a partir de PEI a varios pHs

Se determino el efecto del secado sobre las propiedades de partroulas enlazadas a lacasa despues del enlace, sobre las caractensticas de las enzimas.

10 Las partroulas se fabricaron segun el metodo de fabricacion estandar esbozado en el Ejemplo 3, excepto que ademas de la preparacion a pH 11 del PEI (10%) tambien se evaluo una preparacion ajustada a pH 8. Seguidamente, la lacasa se inmovilizo al tronco como se describio en el Ejemplo 9 con las siguientes excepciones: se hizo reaccionar 1 mL de lacasa (Novozyme 51004, 50 mg.mL"1) con 6,25 mL de partroulas (16 mg.mL"1), por lo tanto se enlazaron 50 mg de lacasa por 100 mg de partroulas. Las partroulas enlazadas con lacasa se lavaron con 15 12,5 mL de agua desionizada y se resuspendieron hasta 20 mL usando agua desionizada. Las partroulas se

dividieron en 2 fracciones iguales de 10 mL cada uno, de los cuales una muestra se liofilizo para la determinacion de la recuperacion de masa, y para investigar las caractensticas de las partroulas enlazadas a lacasa tanto humedas como secas. Las muestras secadas se resuspendieron en sus volumenes originales con agua desionizada. Todos los ensayos fueron por triplicado.

20 Se determino la protema total de las muestras de sobrenadante de lacasa usando el kit Bio-Rad Total Protema Assay (No. Cat.: 500-0006) con lacasa como la protema patron. La actividad de lacasa se determino segun el Ejemplo 9.

5

10

15

20

25

30

35

40

El secado de partmulas enlazadas a lacasa por liofilizacion mostro que la mayor recuperacion de masa se consiguio cuando las partmulas se fabricaron con PEI al pH 11 (Tabla 8), aunque mas protema lacasa se enlazo a las partroulas usando en la fabricacion PEI a pH 8. El mantenimiento de la actividad optima hacia ABTS se consiguio con partroulas no liofilizadas fabricadas usando PEI (16%) a pH 8, pero despues de la liofilizacion la misma muestra solo retuvo 3% de la actividad de lacasa. No se aprecio que las partroulas fabricadas usando PEI a pH 8 fueran difroiles de resuspender despues del secado, y por lo tanto probablemente se aglomeraran, reduciendo de este modo la relacion superficie a area, y reduciendo por tanto la actividad debido a restricciones difusionales sobre el sustrato y el producto. No se observo el mismo efecto sobre la actividad en partroulas generadas usando PEI a pH 11 (Tabla 8).

Tabla 8: Eficiencia de enlace y mantenimiento de la actividad de partroulas enlazadas a lacasa fabricadas a varios valores de pH con PEI con y sin liofilizacion.

Condiciones de preparacion de partroulas de lacasa

Peso seco de partroulas (mg) Protema (mg) Carga de protema (mg.g-1) Carga de protema (%) Actividad de lacasa mantenida (%)

Partroulas humedas pH 8

NA 25 383 38 16

Partroulas secas pH 8

65 25 383 38 3

Partroulas humedas pH 11

NA 25 295 30 8

Partroulas secas pH 11

83 25 295 30 11

Este experimento demuestra que las partroulas pueden prepararse con PEI de pH variable y que esto cambia las propiedades enlazantes de las partroulas con las enzimas.

Ejemplo 13: Estabilidad de lacasa enlazada a una red soporte o enrejado de hebras/flbras polimericas de PEI fabricada a pH 8 u 11 y liofilizada.

Se determino la termoestabilidad y la estabilidad al pH de lacasa enlazada a una red soporte o red de hebras/fibras polimericas de PEI fabricadas a pH 8 y 11 y liofilizadas (lacasa enlazada a partroulas producidas como se describio en el Ejemplo 12).

Temperatura optima

Los perfiles de temperatura optima de lacasa libre y lacasa enlazada a partroulas (a la carga de protema equivalente) se realizaron usando ABTS 1 mM como el sustrato en tampon succinato-lactato 100 mM (pH 4,5). Las muestras (100 jL) se anadieron a 1,9 mL de sustrato pre-equilibrado a la temperatura correcta en un bano de agua. Los ensayos se realizaron usando un espectrofotometro DU800 (Beckman-Coulter, 420 nm) equipado con un controlador de temperatura Peltier. El espectrofotometro se ajusto a la temperatura de interes y se dejo que las cubetas se equilibraran durante 5 minutos antes de la adicion del reactivo equilibrado en un bano de agua.

Estabilidad al pH

La estabilidad al pH de lacasa libre y lacasa enlazada a partroulas (a la carga de protema equivalente) se hizo con ABTS (1 mM) en tampon succinato-lactato 100 mM (pH 4,5). Las muestras respectivas de lacasa se incubaron en un tampon universal Britton-Robinson a pH 2,5, 3 y 6. Las muestras (20 jL) se separaron periodicamente y se analizaron (230 jL de reactivo de ensayo) a 420 nm usando un equipo PowerWave HT (Biotek lnstruments) con incubacion a 25°C. Los puntos al tiempo de 6 horas de este experimento se ilustran mas adelante en la Figura 9.

Resultados

Los resultados se muestran en las Figuras 8A, 8B y 9.

Tanto la lacasa enlazada a partroulas como la lacasa libre (no inmovilizada) fueron optimamente activas a 70°C (Figura 8). Sin embargo, la lacasa enlazada a partroulas tuvo una mejor termoestabilidad a 90°C (55-65% de actividad) en comparacion con la lacasa libre (0% de actividad) en el tiempo transcurrido para preparar las muestras para analizar. Tambien hubo una mejora menor cuando se usaron las partroulas secadas, lo que sugirio que hay una ventaja con el secado. Esto puede ser debido a que se forman mas uniones protema-partroula cuando se elimina el agua. Esto, a su vez, aumentana el enlace covalente multipuntos de la protema o enzima, lo cual se sabe que proporciona una mayor estabilidad, tal como una mejor termoestabilidad (mejora de la actividad, estabilidad y selectividad de la enzima via tecnicas de inmovilizacion. [Mateo, C., Palomo, J.M., Fernandez-Lorente, G., Guisan, J.M., Fernandez-Lafuente, R. 2007 Enzyme and Microbial Technology 40 (6), pp. 1451-1463].

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Tambien se determino la estabilidad al pH de lacasa enlazada a partfculas y de la enzima libre a pH 2,5, 3 y 6. A pH 2,5 y pH 3 toda las muestras de lacasa enlazada a partfculas retuvieron 80-110% de actividad mientras que la enzima libre habfa perdido aproximadamente 70 y 40% de actlvldad, respectivamente (Figura 9). Por tanto, la inmovilizacion proporciona una mejor estabilidad al pH. Todas las muestras, incluyendo la enzima libre, fueron estables a pH 6 despues de 6 horas.

Por tanto, la inmovilizacion de enzimas sobre partfculas de una red soporte o red de hebras polimericas/fibras de PEI puede proporcionar estabilidad adicional a pH extremos.

Ejemplo 14: Desplazamiento del pH optimo de la enzima con inmovilizacion a una red soporte o enrejado de hebras polimericas/fibras de PEI.

Las enzimas tienen un pH optimo para la actividad, en algunos casos el pH optimo de una enzima no coincide con el pH optimo para otros aspectos de una reaccion. Por ejemplo, el sustrato/reaccionante de la enzima puede ser optimamente soluble a otro pH.

Otro ejemplo es cuando se usa mas que una enzima en una reaccion de multiples etapas en un unico reactor, y sus pHs optimos pueden no coincidir. Por tanto, durante la inmovilizacion puede cambiar el pH optimo de una enzima, y esto proporcionana ventajas comerciales y tecnicas. Por tanto, el pH optlmo de una lacasa se determino con y sin inmovilizacion sobre las partfculas.

Ensayos enzimaticos

El reactivo de lacasa contema guaiacol 1 mM en tampon universal Britton-Robinson 50 mM (Davies TJ, Banks CE, Nuthakki B, Rusling JF, Franca RR, Wadhawana JD, Compton RG. 2002. Surfactant-free emulsion electrosynthesis via power ultrasound: electrocatalytlc formation of carbon-carbon bonds. Green Chem. 4:570-577) ajustado a los valores de pH de interes. El tampon universal se uso para asegurar que el mismo sistema tampon estaba presente y podfa tamponar efectivamente a lo largo de un amplio intervalo de pH. Los ensayos se realizaron por triplicado a 450 nm con un coeficiente de extincion de 5200 M'1.cm'1. Los perfiles de pH de lacasa inmovilizada a las partfculas de red o enrejado soporte asf como de la enzima libre se determinaron experimentalmente. Los ensayos se realizaron usando un lector de placas de microtitulacion PowerWave HT. Una unidad de enzima se definio como la cantidad de enzima requerida para oxidar 1 jLmol de sustrato por minuto.

Desplazamiento del perfil de pH

Se determinaron los perfiles de pH de lacasa enlazada al enrejado fibroso o al soporte troncal de la red ya que se sabe que el desplazamiento del perfil de pH se produce durante la inmovilizacion. Las partfculas fueron fabricadas como en el Ejemplo 3. Tambien se investigo el efecto de las concentraciones variables de glutaraldehndo y PEI sobre el desplazamiento del pH optimo como lo fue el efecto del postratamiento con glutaraldehndo (Ejemplo 2, A2-J2).

Resultados

Los resultados se muestran en las Figuras 10A, 10B, 11A y 11B.

La tendencia general con respecto al desplazamiento del perfil de pH es hacia un pH neutro a ligeramente alcalino. Este ejemplo demuestra que el perfil de pH de enzimas puede desplazarse por inmovilizacion a las partfculas.

Ejemplo 15: Varias funcionalidades de red o enrejado soporte de hebras/flbras de polimero de PEI.

La funcionalidad del tronco de partfculas puede cambiarse para demostrar el enlace de protema basado en la hidrofobia, ionicidad y afinidad.

Las partfculas se fabricaron mezclando una emulsion de 10 mL de aceite mineral que contema 0,1 mL de nonoxynol- 4 y 0,5 mL de disolucion de polietilenimina, pH 11, y una emulsion de 10 mL de aceite mineral que contema 0,1 mL de nonoxynol-4 y 0,5 mL de glutaraldehndo (Sigma grado II). Ambas emulsiones se habfan agitado a 500 rpm durante 30 min antes de mezclar. La emulsion combinada se agito a 500 rpm durante 30 min. Esto proporciono partfculas no modificadas que se recuperaron por centrifugacion como se describio previamente.

Enlace ionico

Se generaron grupos ionicos en las partfculas no modificadas anteriores por funcionalizacion con glutaraldehndo (200 |jL de disolucion acuosa al 25% - lavado con 3 x 20 mL de agua desionizada) seguido por tratamiento con etilendiamina (1 mL de 0,33 M) para que reaccionara con los residuos de aldehndo libres (1 hora a temperatura ambiente con inversion periodica). Las partfculas se lavaron repetidamente con un exceso de agua desionizada y se recuperaron por centrifugacion a 2000 x g durante 10 minutos. La lacasa (2,5 mg) se incubo con 5 mg de partfculas modificadas durante 30 minutos a 4°C con inversion periodica para asegurar un mezclado adecuado. Para determinar el enlace ionico se anadio NaCl 1,0 M (como contraion) a la lacasa enlazada a partfculas y se mezclo por inversion durante 5 minutos. Las partfculas se recuperaron por centrifugacion (como se menciono anteriormente) y se determino la actividad.

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Enlace hidrofobo

Se anadieron grupos hidrofobos a las partmulas incubando partmulas no modificadas (5 mg) con epoxioctano (0,1 mL) a 25°C durante 4 horas. Estas se lavaron a continuacion repetidamente con agua en exceso y se recuperaron por centrifugacion (como se menciono anteriormente). La protema (lipasa de Pseudomonas fluorescens, 5 mg) enlazada hidrofobamente pudo separarse por adicion de un tensioactivo (desoxicolato al 1%), como se determino midiendo la absorbancia de la protema a 280 nm.

Enlace de afinidad

El enlace de afinidad de las protemas esta demostrado en el Ejemplo 17.

Resultados Enlace ionico

El 45% de la lacasa anadida se enlazo a las partmulas modificadas (como se determino mediante el metodo del reactivo colorante del ensayo de protemas Bio-Rad, 500-0006, mediante el protocolo de los fabricantes). De este 45%, el 76,9% de la lacasa pudo separarse por medio de sales de adicion (NaCI 1,0 M) como contraion. En comparacion, las partmulas no modificadas solo enlazaron 14% de la lacasa, y solo 52,6% de esta pudo separarse mediante la disolucion salina.

Enlace hidrofobo

La protema se enlazo a las partmulas modificadas. Aproximadamente, se separo el 28% de la protema enlazada por las partmulas modificadas mediante la adicion de desoxicolato, siendo esta la porcion hidrofobamente enlazada de la enzima enlazada.

Este ejemplo demuestra que la funcionalidad de la matriz de las partmulas puede modificarse para efectuar mecanismos alternativos de enlace de la protema a la matriz de las partmulas.

Ejemplo 16: Co-atrapamiento de mediadores y cofactores

La inclusion de un cofactor (o cofactor modificado, o mediador) permite co-atrapar el cofactor con la enzima despues de la reticulacion. Por medio de la seleccion de las condiciones del procedimiento, la porosidad de la partmula puede disponerse para retener el cofactor mientras que se permite la entrada y salida de pequenas moleculas, tales como reaccionantes, por ej., sustratos de la enzima, co-sustratos, productos y co-productos.

La aminoacido deshidrogenasa (AADH), formiato deshidrogenasa (liofilizada) se adquirieron en Biocatalytics (USA). El PEG 20000-NADH se obtuvo de Julich Fine Chemicals (Alemania). El aceite mineral se obtuvo de Castrol (Alemania). El nonoxynol-4 se obtuvo de ICI (Reino Unido). El Glutaraldehfdo (Glut) (disolucion acuosa al 25%) se obtuvo de Acros Organlcs (Belgica). El acido formico se obtuvo de Merck (Alemania). La etilendiamina (EDA), polietilenimina (PEI), el acido 3-metil-2-oxobutmco (2-cetovalina), la DL-valina, NADH y NAO+ se obtuvieron de Slgma-Aidrlch.

Se produjeron partmulas polimericas reticulando polietilenimina (PEI) con glutaraldelmdo. Se preparo una emulsion de agua en aceite de la polietilenimina emulsionando 800 pL de PEI al 10% en 40 mL de aceite mineral que contema 200 pL de nonoxynol-4 predisuelto (20 minutos de agitacion magnetica en un vaso de precipitados de 100 mL con un agitador magnetico de 20 mm agitando a 500 rpm). Se preparo una segunda emulsion de agua en aceite similarmente usando una disolucion de glutaraldehfdo al 20%. Las dos emulsiones se mezclaron anadiendo la emulsion de glutaraldelmdo a una emulsion de polietilenimina rapidamente agitada (700 rpm). Se dejo que estas reaccionaran durante 30 minutos con agitacion continua.

Las partmulas polimericas se recuperaron por centrifugacion a 2000 x g durante 10 minutos (Sorvall, RT7). Las partmulas de polfmero se lavaron 4 veces con 45 mL de agua desionizada. La recuperacion durante el lavado se realizo por centrifugacion como en los ejemplos previos. El producto se resuspendio hasta un volumen de 10 mL. Esta disolucion (1 mL) se dividio en partes almuotas en tubos eppendorf y se uso en los experimentos subsiguientes.

Se prepararon disoluciones de protema de cada protema (formiato deshidrogenasa y valina deshidrogenasa) que conteman 10 mg.mL-1. Estas dos disoluciones se mezclaron subsiguientemente (200 pL de cada disolucion) y se incubaron con el material polimerico. Esta disolucion se mezclo por inversion y se dejo que reaccionara durante 30 min con suave agitacion. Se determino la actividad de las partmulas que conteman enzima inmovilizada usando los metodos descritos mas adelante.

Las partmulas se lavaron con agua desionizada, y se recuperaron como se menciono anteriormente. Las partmulas se mezclaron con 100 pL de PEG20000-NADH (obtenida de Julich Fine Chemlcals de Julich, Alemania) y se incubaron a temperatura ambiente con suave agitacion durante 2 horas. Esta disolucion se liofilizo subsiguientemente. El producto liofilizado se lavo dos veces con 2 mL de agua y se recupero por centrifugacion. Las partfculas se resuspendieron en 1 mL de tampon Tris-CI 100 mM pH 8,0 que contema 100 mg de lisina para eliminar

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el exceso de funcionalidad aldetudo de las partmulas, y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las partmulas se lavaron 5 veces con 2 mL de tampon Tris-CI buffer (20 mM pH 8,0). A continuacion, se analizo la capacidad de esta muestra para ser reciclada usando 1 mL del reactivo de reciclado. Las muestras se lavaron 3 veces con volumenes de agua de 2 mL entre cada ciclo. Se analizo la produccion de valina de las muestras por TLC y HPLC de aminoacidos como se menciona mas adelante.

Estas partmulas se hicieron reaccionar y se reciclaron en un medio de reaccion recien preparado para las reacciones subsiguientes.

Reactivo de reciclado

El reactivo para el reciclado de PEG-20000-NADH para la produccion de valina consistio en formiato 50 mM (de una disolucion madre 1 M de formiato de sodio pH 8,0), tampon Tris-CI 50 mM pH 8,0, tartrato de amonio 50 mM, y 2- cetovalina 10 mM. La composicion de este reactivo se formulo para asegurar que la valina solo se produjera si el PEG NADH se reciclaba.

Metodos analtticos

Se realizo TLC de aminoacidos en placas de gel de sflice F254 (Merck). La fase movil usada fue etanol a acido acetico glacial 9:1. El aminoacido (valina) se tino usando una disolucion de ninhidrina al 2% en acetona. Las placas se calentaron a 120°C hasta que la resolucion de valina (Rf 0,49) y amomaco (Rf 0,31) fue claramente visible.

Los analisis de HPLC se realizaron usando el metodo de derivatizacion OPA (reactivo o-ftalaldetudo) para la determinacion de aminoacidos. Las muestras se derivatizaron en lmea. Fueron incluidos patrones de valina.

Resultados

La reaccion y reciclado fue un exito segun los datos de TLC, con formacion de manchas de valina para todas las reacciones consecutivas catalizadas por partmulas. Los resultados positivos de TLC fueron confirmados y cuantificados usando el metodo OPA de HPLC, convirtiendo las partmulas 48, 35, 59, 43, 33, y 29% de cetovalina 10 mM a valina respectivamente en seis ciclos de reaccion consecutivos de 16 horas.

Este ejemplo demuestra que el atrapamiento de cofactores en la matriz enzima-partmula permite que las enzimas que usan cofactores mantengan la funcionalidad y permitan el reciclado de los cofactores atrapados.

Ejemplo 17: Enlace de anticuerpos mediante particulas de red soporte o enrejado de hebras/flbras polimericas de PEI.

Este ejemplo demuestra el enlace de anticuerpos y/o antfgenos sobre las particulas. El enlace de anticuerpos y antigenos demuestra la adecuacion de las particulas para el enlace de afinidad de protemas via anticuerpos o antigenos inmovilizados. Ademas, se demuestra la plausibilidad de las particulas para aplicaciones de diagnostico, tales como ELISA.

La polietilenimina (P3143; disolucion acuosa al 50%), el glutaraldetudo grado II (G6257; disolucion acuosa al 25%), el aceite mineral (MB410), el antfgeno interleuquina 2 de raton (I0523-20UG; SL06092) y la enzima marcadora estreptavidina-peroxidasa de Streptomyces avidinii (S5512-250UG; SL05181) fueron de Sigma-Aldrich. El anticuerpo primario, interleuquina 2 anti-raton de rata (IL-2) MAB (I7663-27K1; L6080801) y el anticuerpo secundario, interleuquina 2 anti-raton de rata (IL-2) Biotlna MaB (I7663-27M5; L6080803) fueron de USBiologicals. El cloruro de sodio (57653), fosfato de sodio dibasico (S0876), fosfato de sodio monobasico (S0757), el peroxido de hidrogeno (21676-3), el Tween 20 (P9416) y el acido clortudrico (H 1758) fueron de Sigma-Aldrich. 2,2'-Azlno-bls(acido 3- etilbenztiazolina-6-sulfonico) (101102946001) fue de Rocha.

Preparacion de partmulas

Se prepararon partmulas de polietilenimina reticuladas segun el Ejemplo 2, muestra G. El unico ajuste de un reactivo fue que la disolucion de polietilenimina se ajusto a pH 9 con HCI antes de la dilucion a 10%. El experimento se escalo directamente por un factor de 4, requiriendo por tanto 20 mL de aceite mineral que contema 200 |jL de NP4 disuelto con 800 jL de cada uno de los reaccionantes emulsionados. Las partmulas de polietilenimina reticuladas resultantes se lavaron con 6 x 50 mL de agua desionizada y se recuperaron por centrifugacion a 5000 x g durante 5 mln del aceite mineral y entre cada etapa de lavado. El pelet de partmulas se resuspendio subsiguientemente hasta un volumen de 10 mL con agua desionizada y se usaron partes aifcuotas de 500 jL para los experimentos A a F.

Inmovilizacion de protemas

A los experimentos se les asigno letras segun la Tabla 9 de mas adelante. La adicion de las diversas protemas se llevo a cabo en la secuencia indicada en la columna debajo del experimento (Tabla 9). La inmovilizacion del primer componente protema para cada experimento se realizo en agua desionizada (etapa 1 de adicion secuencial, Tabla 9) a 4°C durante 1 hora con inversion de las muestras cada 10 minutos para asegurar un mezclado adecuado. Las partmulas se lavaron con 3 x 1 mL de agua desionizada y se recuperaron como se menciono anteriormente.

El enlace subsiguiente de la protema, los tratamientos con protema (Tabla 9, filas 2 a 5), se realizaron en un tampon de fosfatos 10 mM pH 6,8 que contema cloruro de sodio 150 mM (tampon enlazante). Este enlace se llevo a cabo a 37°C durante 30 minutos con inversion cada 5 minutos para asegurar un mezclado adecuado. Despues de cada enlace de protema las muestras se lavaron con 2 x 1 mL de tampon enlazante que contema Tween 20 al 0,05% para 5 limitar las interacciones no espedficas de la protema usando agitacion suave (IKA Vortex Genius, ajuste 2) durante 10 minutos. La recuperacion de las partmulas entre cada etapa sucesiva se consiguio por centrifugacion a 5000 x g durante 5 minutos. La cantidad de protema anadida para cada una de las etapas de tratamiento con la protema (Tabla 9) fueron como sigue: albumina - 5 mg; interleuquina 2 MAB anti-raton de rata (A-IL2-MA) - 50 |jg; IL2 MAB Biotina anti-raton de rata (B-A-IL2-MA) - 25 jg; interleuquina 2 (IL-2) - 2 jg; estreptavidina-peroxidasa (estrep-perox) 10 10 jg. Estas cantidades de protemas se prepararon en 1 mL de tampon enlazante.

Tabla 9: Secuencia de enlace de protemas de los experimentos A a F.

Etapa de adicion secuencial

A B C D E F

1

A-IL2-MA A-IL2-MA IL-2 Albumina Albumina Ningun tratamiento

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Albumina Albumina Albumina - IL-2 -

3

- IL2 - - - -

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B-A-IL2-MA B-A-IL2-MA B-A-IL2-MA B-A-IL2-MA B-A-IL2-MA -

5

Estrep-Perox Estrep-Perox Estrep-Perox Estrep-Perox Estrep-Perox -

Ensayo

El reactivo del ensayo de la peroxidasa contema ABTS 2 mM y peroxido de hidrogeno 2 mM en tampon de fosfatos 15 10 mM pH 6,8 con cloruro de sodio 150 mM. Se midieron ensayos por triplicado a 420 nm y 30°C usando un

espectrofotometro de microplacas Powerwave HT (Biotek lnstruments) con 200 jL de reactivo y 50 jL de suspension de partmulas por pocillo.

Resultados

El enlace del anticuerpo al antfgeno se evaluo en el Experimento B (Figura 12). Este experimento indica una 20 respuesta positiva la cual se interpreta como enlace exitoso del anticuerpo primario (A-IL2-MA) a la superficie de las partmulas, con sucesivos enlaces del antfgeno (IL-2), anticuerpo secundario (B-A-IL2-MA) y estreptavidina- peroxidasa a las partmulas. Esto es analogo a un ELISA de emparedado realizado en una superficie, tal como el pocillo de una placa de microtitulacion. El Experimento C indica que puede enlazarse un antfgeno a la superficie de las partmulas y usarse subsiguientemente como un elemento de reconocimiento del enlace a anticuerpos. Cuando 25 estos experimentos se ven en comparacion con los diversos controles indican que las partmulas pueden usarse para enlazar anticuerpos o antfgenos.

El Experimento A es un control para indicar el enlace no espedfico del anticuerpo secundario (B-A-IL2-MA) o de estreptavidina-peroxidasa a las partmulas con anticuerpo primario inmovilizado. La menor respuesta cuando se compara con B indica que el antfgeno (IL-2) aumenta el enlace del anticuerpo secundario a las partmulas. Los 30 Experimentos D y E son controles para indicar el enlace no espedfico de anticuerpo primario (A-IL2-MA) o secundario (B-A-IL2-MA) a la partmula despues de la inactivacion de la albumina. El Experimento F contema partmulas reticuladas de polietilenimina sin tratar y se uso como un control de ensayo.

Este ejemplo indica que las partmulas son un soporte adecuado para inmovilizar antfgenos o anticuerpos. Los presentes inventores demuestran ademas que la inmovilizacion del anticuerpo al antfgeno y vice-versa por medio de 35 interaccion de afinidad. De este modo, este ejemplo indica la viabilidad de aplicaciones del soporte para cromatograffa de afinidad y diagnosticos tales como el ensayo con sustancias inmunoabsorbentes unidas a enzimas.

Ejemplo 18: Incorporacion de magnetita en particulas de red soporte o enrejado de hebras/flbras polimericas de PEI

La inclusion de mediadores y cofactores en las particulas ha sido demostrada. En este ejemplo se demuestra la 40 inclusion de particulas magneticas en las particulas.

Preparacion de particulas

Las particulas se prepararon segun el Ejemplo 17 anterior, se escalaron linealmente hasta 25 mL de aceite mineral por emulsion. Se incorporo magnetita (250 mg) a la disolucion lfquida de polietilenimina al 10% (pH 9,0) antes de emulsionar. Las particulas reticuladas de polietilenimina se lavaron con 6 volumenes de 50 mL de agua desionizada

y se recuperaron del aceite mineral por centrifugacion a 5000 x g durante 5 mln y entre cada etapa de lavado. El pelet de partmulas se resuspendio subsiguientemente hasta un volumen de 10 mL con agua desionizada y se funcionalizo para intercambio de aniones por reaccion con 500 pL de etilendiamina durante 30 minutos. Las esferas se lavaron subsiguientemente con 3 x 50 mL partes almuotas de agua desionizada y se recuperaron por 5 centrifugacion como se menciono anteriormente. El pelet final se resuspendio en 10 mL de agua desionizada y se uso mas adelante para la experimentacion del enlace a albumina. El peso seco de las partmulas se determino por triplicado por liofilizacion y pesando partes almuotas de 1 mL de los 10 mL de suspension de partmulas.

Enlace y cuantificacion de protemas

Las partmulas de las partes almuotas anteriores se recuperaron mediante separacion magnetica en un soporte 10 magnetico (Magnetic Separation Stand - Promega; Z5332) y el lfquido se separo. Las partmulas se equilibraron con 2 x 2 mL lavados de tampon Tris-Cl, pH 7,4 (50 mM). Se anadio albumina de suero de bovino (BSA) a las partmulas hasta una concentracion final de 20 mg.mL'1. Se dejo que ocurriera el enlace ionico de la protema durante 30 min a temperatura ambiente con mezclado desde el inicio al final. La mezcla se coloco en un soporte magnetico para retener la resina magnetizada sobre la pared lateral del tubo de reaccion y permitir la separacion del lfquido de la 15 muestra. La resina se lavo 5 veces con 1 mL de Tris-CI 50 mM, pH 7,4, y se recuperaron por medio del retenedor magnetico. La BSA enlazada ionicamente se eluyo de la reslna mediante la adicion de 2 volumenes de 500 pL de NaCl 1 M en Tris-CI 50 mM, pH 7,4.

Cuantificacion de la protema:

La cuantificacion de la protema de la fraccion eluida se realizo con un fluonmetro Qubit (lnvitrogen) usando el 20 ensayo Quant-iT segun las instrucciones del fabricante (Tabla 10).

Resultados

Tabla 10: Enlace de albumina a partmulas que conteman magnetita (medias de datos triplicados).

Peso seco de partmulas (mg)

Enlace de protema Eficiencia de enlace (% m/m)

31,58 ± 0,90

1,07 ± 0,01 3,39

Los resultados indican que la magnetita puede incorporarse a las partmulas y que las propiedades magneticas de las 25 partmulas pueden usarse para la separacion efectiva de estas de una suspension en un lfquido. Ademas, estos

resultados indican que el soporte puede usarse como una resina de intercambio de iones eficiente. En el ejemplo proporcionado en la presente memoria la modificacion de la matriz de partmulas con una molecula positivamente cargada, tal como una amina (etilendiamina), permite el uso de las partmulas como una resina de intercambio de aniones. El uso de moleculas negativamente cargadas tales como moleculas que contienen grupos carboxilo 30 permitina el uso como una resina de intercambio de cationes.

Este ejemplo proporciona ademas un ejemplo de un metodo de recuperacion alternativo por inclusion de partmulas magneticas en la red, lo cual permitina atraerlas por medio de la aplicacion de un campo magnetico.

Las partmulas de la invencion incluyen por tanto enrejados de hebras o fibras polimericas reticuladas por medio de un agente de reticulacion, y aperturas o espacios intersticiales adyacentes y alrededor de las fibras. En otras 35 palabras, la invencion proporciona una partmula fibrosa de red interpenetrante, preferiblemente construida o constituida de polietilenimina reticulada con glutaraldehfdo. La partmula puede aplicarse como una matriz para la inmovilizacion de enzimas.

Las partmulas se producen preferiblemente usando tecnologfa o tecnicas basadas en emulsiones del segundo y tercer aspecto de la invencion. El uso de una tecnologfa basada en emulsiones permite obtener beneficios del 40 control del tamano, tales como el control de la relacion del area espedfica de la partmula al volumen de la misma y una distribucion de tamano definida, y tambien permite ventajosamente una unica etapa de smtesis de las partmulas. Las partmulas ofrecen una gran superficie espedfica para la inmovilizacion y son aplicables, pero no limitadas a, biocatalisis de sustratos grandes y pequenos. Esta matriz para la inmovilizacion de enzimas exhibe una alta eficiencia de inmovilizacion y un alto mantenimiento de la actividad de la enzima despues de la inmovilizacion.

45 La naturaleza fibrosa de las partmulas dendnticas proporciona una gran superficie especffica interna para enlazar a la enzima. Asimismo, el gran numero de puntos de union disponibles por subunidad de enzima proporciona la oportunidad de mejorar significativamente la estabilizacion de la protema, cuando se compara con el material soporte troncal, por ej. PEI, por sf mismo. Esto, combinado con el enrejado o red flexible, permite una alta relacion actividad a peso despues de la adicion del biocatalizador debido a la gran superficie especffica expuesta para la 50 inmovilizacion y a las restricciones difusionales limitadas para sustratos pequenos y grandes. Ademas, el control del tamano de las partmulas permite una mayor reduccion de las restricciones difusionales de los sustratos y esto debe ser un impedimento esterico de esta matriz de inmovilizacion.

El procedimiento de preparacion de las partmulas incluye el emulsionamiento del soporte o enrejado troncal con o sin el agente de reticulacion en la misma fase. Preferiblemente, para la fabricacion se usa un sistema de dos emulsiones, como se describio anteriormente en la presente memoria. En el caso en el que el agente de reticulacion no este incluido en la primera emulsion, puede disolverse en la fase oleosa, o incorporarse mezclando una segunda 5 emulsion que contenga dicho agente de reticulacion.

El procedimiento de fabricacion preferido es el emulsionamiento separado del polfmero troncal (polietilenimina) en una emulsion con al menos un compuesto qmmico bifuncional reticulante (glutaraldehndo) en una segunda emulsion. La reaccion espontanea entre el polfmero y el agente de reticulacion da lugar a un enrejado o red fibrosa, que en este caso contiene un exceso de grupos funcionales aldehndo, los cuales se usan subsiguientemente para unir 10 espontanea y covalentemente protemas al enrejado o soporte por medio de la reactividad cruzada amina-aldehndo. Esta funcionalidad aldehndo puede ademas extrapolarse para unir compuestos alternativos, o impartir otras propiedades tales como hidrofobia, expandiendo de este modo su aplicacion para enlazar una gama mas amplia de protemas, tales como protemas hidrofobas.

La inmovilizacion de protemas a matrices aumenta la estabilidad termica, a los disolventes y al pH de las enzimas. 15 Esta estabilizacion puede ademas potenciarse secando el soporte despues de la inmovilizacion de la protema al soporte dendntico. Se cree que este secado reduce la proximidad de los grupos qrnmicos funcionales con reactividad cruzada, provocando de este modo una condensacion qrnmica espontanea adicional de protema-tronco y tronco-tronco. Ademas, los aditivos pueden ser atrapados en la matriz durante el secado, lo cual podna ser util para el control del tamano de poro o para atrapar moleculas funcionales o el adjunto. Con las partmulas de la invencion 20 son posibles altas cargas de protema, es decir, pueden cargarse cantidades relativamente grandes de protema en un pequeno volumen de partmula.

Claims (13)

1. 5

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   REIVINDICACIONES

   1. Una partmula derivada de una emulsion, la cual comprende un enrejado de hebras de polietilenimina reticuladas por medio de un agente de reticulacion, aperturas intersticiales adyacentes y alrededor de las hebras, y grupos funcionales sobre el enrejado y con los cuales pueden reaccionar protemas y/o protemas modificadas, para de este modo enlazarse al enrejado y quedar por tanto inmovilizadas.
2. 2. Una partmula segun la reivindicacion 1, donde los grupos funcionales estan presentes sobre la polietilenimina, y se seleccionan de modo que pueda efectuarse el enlace de las protemas y/o las protemas modificadas a la polietilenimina por medio de uno o mas de un enlace covalente, enlace ionico, enlace hidrofobo y enlace de afinidad, los cuales pueden efectuarse por medio de la modificacion del enrejado para proporcionar esta funcionalidad.
3. 3. Una partmula segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, la cual incluye al menos una protema y/o protema modificada enlazada al enrejado por medio de los grupos funcionales, siendo de este modo inmovilizadas.
4. 4. Una partmula segun la reivindicacion 3, donde una pluralidad de diferentes protemas y/o una pluralidad de diferentes protemas modificadas, estan inmovilizadas en la misma.
5. 5. Una partmula segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 inclusive, la cual incluye un adjunto atrapado dentro del enrejado.
6. 6. Una partmula segun la reivindicacion 5, donde el adjunto se selecciona de un cofactor, un cofactor modificado, un mediador qrnmico, magnetita y una sustancia magnetica.
7. 7. Un procedimiento para producir partmulas, que incluye

   proporcionar una emulsion de gotitas de una primera fase lfquida dispersada en una segunda fase lfquida, siendo una fase lfquida una fase acuosa y la otra una fase oleosa, y conteniendo la fase acuosa polietilenimina disuelta en la misma asf como un agente de reticulacion disuelto en la misma;

   dejar que el agente de reticulacion reticule las hebras de la polietilenimina, para de este modo formar partmulas, cada una de las cuales incluye un enrejado de hebras de la polietilenimina, reticuladas por medio del agente de reticulacion, aperturas intersticiales adyacentes y alrededor de las hebras, y grupos funcionales en el enrejado y con los cuales pueden reaccionar las protemas y/o las protemas modificadas, para de este modo enlazarse al enrejado y quedar por tanto inmovilizadas.
8. 8. Un procedimiento segun la reivindicacion 7, donde la emulsion se forma mezclando una primera emulsion que comprende gotitas acuosas que contienen polietilenimina disuelta en las mismas, dispersadas en una fase oleosa, con una segunda emulsion que comprende gotitas acuosas que contienen el agente de reticulacion disuelto en las mismas, dispersadas en una fase oleosa.
9. 9. Un procedimiento segun la reivindicacion 7 o la reivindicacion 8, el cual incluye anadir un adjunto a al menos una de las fases, de modo que el adjunto este atrapado dentro de los enrejados de las partmulas.
10. 10. Un procedimiento segun la reivindicacion 9, donde el adjunto se selecciona de un cofactor, un cofactor modificado, un mediador qrnmico, magnetita y una sustancia magnetica.
11. 11. Un procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 inclusive, el cual incluye recuperar las partmulas, y secar las partmulas recuperadas.
12. 12. Un procedimiento segun la reivindicacion 11, el cual incluye anadir un adjunto a las partmulas recuperadas antes del secado de las partmulas, de modo que el adjunto llegue a quedar atrapado dentro de los enrejados de las partmulas.
13. 13. Un procedimiento segun la reivindicacion 12, donde el adjunto se selecciona de un cofactor, un cofactor modificado, un mediador qrnmico, magnetita y una sustancia magnetica.