BR102017001290A2 - Composição catalisadora, processo de produção de composição catalisadora, processo de obtenção de produtos com baixo teor de lactose e uso de composição catalisadora - Google Patents

Abstract

composição catalisadora, processo de produção de composição catalisadora, processo de obtenção de produtos com baixo teor de lactose e uso de composição catalisadora a presente invenção descreve um processo de produção de produtos com baixo teor de lactose utilizando um biocatalisador imobilizado, de modo a permitir sua aplicação industrial e reutilização. especificamente, a presente invenção compreende o uso da enzima ß-galactosidase imobilizada em um suporte de colágeno funcionalizado. a presente invenção se situa nos campos de engenharia de alimentos, químico e farmacêutico.

Description

(54) Título: COMPOSIÇÃO CATALISADORA, PROCESSO DE PRODUÇÃO DE COMPOSIÇÃO CATALISADORA, PROCESSO DE OBTENÇÃO DE PRODUTOS COM BAIXO TEOR DE LACTOSE E USO DE COMPOSIÇÃO CATALISADORA (51) Int. CL: C12N 11/02; C12N 9/96; A23C 9/12; C12N 9/38 (73) Titular(es): FUNDAÇÃO VALE DO TAQUARI DE EDUCAÇÃO E DESENVOLVIMENTO SOCIAL FUVATES (72) Inventor(es): CLAUCIA FERNANDA VOLKEN DE SOUZA; GIANDRA VOLPATO; ADRIANO GENNARI; MICHELE RAMOS DUTRA ROSOLEN (85) Data do Início da Fase Nacional:

20/01/2017 (57) Resumo: COMPOSIÇÃO CATALISADORA, PROCESSO DE PRODUÇÃO DE COMPOSIÇÃO CATALISADORA, PROCESSO DE OBTENÇÃO DE PRODUTOS COM BAIXO TEOR DE LACTOSE E USO DE COMPOSIÇÃO CATALISADORA A presente invenção descreve um processo de produção de produtos com baixo teor de lactose utilizando um biocatalisador imobilizado, de modo a permitir sua aplicação industrial e reutilização. Especificamente, a presente invenção compreende o uso da enzima B-galactosidase imobilizada em um suporte de colágeno funcionalizado. A presente invenção se situa nos campos de engenharia de alimentos, químico e

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Relatório Descritivo de Patente de Invenção

Composição Catalisadora, Processo de Produção de Composição Catalisadora, Processo de Obtenção de Produtos com Baixo Teor de Lactose e Uso de Composição Catalisadora

Campo da Invenção [0001] A invenção apresenta um biocatalisador, o processo de obtenção deste biocatalisador e sua aplicação na obtenção de produtos com baixo teor de lactose, sendo o dito biocatalisador composto de uma enzima imobilizada em um suporte, no caso a enzima β-galactosidase, conhecida comercialmente como lactase, imobilizada em um suporte de colágeno em pó.

[0002] A presente invenção pertence ao campo de engenharia de alimentos, química e farmacêutica.

Antecedentes da Invenção [0003] A imobilização de enzimas é uma alternativa para a aplicação eficiente desses biocatalisadores nas áreas alimentícia, química e farmacêutica. As enzimas são biocatalisadores altamente específicos, e por meio da imobilização suas características podem ser maximizadas e melhoradas. A tecnologia de imobilização possibilita que as enzimas possam ser reutilizadas diversas vezes, além disso, podem permitir que estas se tornem mais estáveis e resistentes às condições severas, principalmente de pH e temperatura. Em alguns casos de aplicações industriais de biocatalisadores, para prolongar a atividade enzimática ao longo do período do processo, é necessário imobilizá-los (Villeneuve et al., 2000; Pessela et al., 2007; Hanefeld et al., 2013).

[0004] Para aplicações economicamente viáveis de enzimas imobilizadas, deve-se considerar o tipo de suporte e o método de imobilização, pois esses fatores influenciam diretamente na atividade da enzima e subsequente reutilização do biocatalisador. A ligação de enzimas a suportes

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2/20 sólidos pode ocorrer por adsorção, ligação covalente, encapsulamento, bem como combinações entre esses métodos. O material escolhido para ser utilizado como suporte deve proporcionar um ambiente inerte e biocompatível, não interferindo na estrutura nativa da proteína (Villeneuve et al., 2000; Kim et al., 2006; Pessela et al., 2007).

[0005] Vários suportes têm sido relatados na literatura para a imobilização de enzimas. Os materiais sintéticos utilizados são adequados para essa tecnologia devido a sua forma física e estrutura química, por outro lado, apresentam como desvantagem o custo elevado. Já o colágeno em pó é um material natural, de baixo custo, e não apresenta impacto ambiental, ou seja, pode facilmente ser degradado pelo meio ambiente (Mendes et al., 2011). [0006] Na busca pelo estado da técnica em literaturas científica e patentária, foram encontrados os seguintes documentos que tratam sobre o tema:

[0007] O documento WO2008157624 revela um método capaz de hidrolisar a lactose e assim obter produtos com baixa concentração da mesma, porém sem ocorrer perda da enzima devido à dificuldade de recuperação da β-galactosidase. O método é composto por um suporte de polímero hidrofóbico ligado covalentemente a uma molécula hidrofílica que se liga covalentemente à β-galactosidase, gerando uma molécula insolúvel em água, possibilitando sua recuperação. Os polímeros hidrofílicos são poli(etileno), poliacetato de etileno vinil, copolímero de poliestireno/ácido acrílico, quitosana, com os grupos amino e carboxílicos modificados, assim como os grupos amino e carboxílicos presentes na lactase, que também são modificados para se apresentarem mais estáveis. Os materiais poliméricos apresentados nestes documentos são utilizados como suportes, os quais podem formar uma matriz de imobilização com boas características, por meio da combinação de sua forma física e de sua estrutura química. Por outro lado, as principais desvantagens destes materiais são o custo elevado para obtenção e, com exceção da quitosana, os demais

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3/20 suportes apresentados neste documento necessitam de um longo tempo para serem biodegradados.

[0008] O documento WO2002083885 A1 revela um material com enzimas imobilizadas, obtido através da pulverização de um revestimento proteico ativo com um agente de ligações cruzadas para um suporte orgânico fibroso, com o objetivo de remover a lactose do leite de vaca. Para este processo, é escolhido um suporte com grande área superficial e inerente ao processo químico, onde é pulverizada uma mistura de agente de ligações cruzadas com a enzima e uma proteína carregadora, que será reticulada com o suporte. Como suporte, são citados algodão, seda, lã, celulose ou polímeros sintéticos. Os agentes de modificação utilizados na funcionalização dos suportes são materiais que adicionam grupamentos aldeídicos, sendo que a utilização destes reagentes em produtos que serão destinados à alimentação humana não é adequada, devido aos aspectos de toxicidade.

[0009] O documento US4066512A revela um filtro catalítico composto por uma matriz polimérica microporosa que apresenta uma enzima ou anticorpo ligado a ela, de modo a realizar a catálise dos substratos quando estes entrarem em contato com a matriz seja por fluxo ou difusão. Este documento também apresenta uma solução para a dificuldade de recuperação das enzimas, visto que elas permanecem ligadas à matriz. A invenção apresentada neste documento se limita aos reatores em coluna.

[0010] A aplicação da β-galactosidase de modo a apresentar uma alta atividade enzimática, possibilitar sua recuperação para ser reutilizada posteriormente, em algum processo industrial, é um alvo de estudos devido ser um problema constante no estado da técnica. Também existe uma preocupação com o uso de materiais biodegradáveis que causem um menor impacto ao meio ambiente e um menor custo.

[0011] Assim, do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da

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4/20 presente invenção, de forma que a solução aqui proposta possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.

Sumário da Invenção [0012] Dessa forma, a presente invenção tem por objetivo resolver os problemas constantes no estado da técnica a partir do uso de uma técnica de imobilização de β-galactosidase em um suporte com colágeno em pó funcionalizado, tornando a enzima mais estável e possibilita que seja recuperada e reutilizada.

[0013] A presente invenção apresenta melhorias em relação ao estado da técnica.

[0014] O colágeno em pó modificado empregado na presente invenção, além de ser de baixo custo, é facilmente degradado pelo meio ambiente.

[0015] Entre os agentes de modificação do colágeno empregados na presente invenção está o sulfato de alumínio, o qual é utilizado no tratamento de potabilidade da água para o consumo humano e, sendo assim, sua aplicação não apresenta riscos à saúde dos consumidores.

[0016] Os tratamentos do suporte empregados na presente invenção proporcionam a ativação ou a modificação dos grupamentos químicos presentes na superfície do colágeno. Este processo permite que ocorra um aumento da afinidade da enzima com o suporte, de forma a melhorar a interação da mesma com o colágeno sem desnaturá-la. Esse efeito aumenta a força das ligações enzima-suporte, tornando o derivado mais resistente às condições operacionais e reacionais do processo de aplicação, e aumenta a capacidade de ligação da β-galactosidase por área do suporte.

[0017] A tecnologia de imobilização desenvolvida na presente invenção permite a utilização da enzima β-galactosidase imobilizada no colágeno no processo de hidrólise da lactose empregando diferentes reatores. O derivado obtido poderá ser utilizado em reatores de coluna, que podem ser de leito fixo ou de leito fluidizado, e também em tanques agitados. Ambos os tipos de reatores podem ser empregados tanto em processos contínuos quanto em

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5/20 batelada. Nesse contexto, o processo de hidrólise da lactose, presente em leite e derivados, empregando a presente invenção, pode ser realizado por diferentes tipos de reatores e formas de processos.

[0018] Em um primeiro objeto, a presente invenção apresenta uma composição catalisadora que compreende β-galactosidase imobilizada em um suporte de colágeno em pó funcionalizado.

[0019] Em um segundo objeto, a presente invenção apresenta um processo de produção de composição catalisadora que apresenta pelo menos uma etapa de funcionalização do colágeno com pelo menos um composto do grupo consistido em: sais de alumínio, sais de ferro (III), ácido acético, glutaraldeído, agentes quelantes ou uma combinação destes, e uma etapa de fixação da β-galactosidase no colágeno.

[0020] Em um terceiro objeto, a presente invenção apresenta um processo de obtenção de produtos com baixo teor de lactose que compreende pelo menos uma etapa de contato entre pelo menos uma composição catalisadora e pelo menos um produto alimentício compreendendo lactose. [0021] Em um quarto objeto, a presente invenção apresenta o uso de composição catalisadora para diminuir o teor de lactose de um produto.

[0022] Ainda, o conceito inventivo comum a todos os contextos de proteção reivindicados é a composição catalisadora compreendendo β-galactosidase imobilizada em colágeno funcionalizado.

[0023] Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.

Breve Descrição das Figuras [0024] São apresentadas as seguintes figuras:

[0025] A Figura 1 mostra os resultados dos ensaios de reuso na hidrólise da lactose presente em uma solução de lactose (5% m/v) empregando a

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6/20 β-galactosidase imobilizada em colágeno em pó funcionalizado com sulfato de alumínio (Col-Al), com sulfato de alumínio + glutaraldeído (Col-Al-Glu), ou com glutaraldeído (Col-Glu): percentuais de hidrólise e atividade relativa da enzima imobilizada após cada ciclo.

[0026] A Figura 2 mostra os resultados dos ensaios de reuso na hidrólise da lactose presente no permeado de soro de queijo, empregando a β-galactosidase imobilizada em colágeno em pó funcionalizado com sulfato de alumínio (Col-Al), com sulfato de alumínio + glutaraldeído (Col-Al-Glu), ou com glutaraldeído (Col-Glu): percentuais de hidrólise e atividade relativa da enzima imobilizada após cada ciclo.

[0027] A Figura 3 mostra os resultados dos ensaios de reuso na hidrólise da lactose presente no soro de queijo, empregando a β-galactosidase imobilizada em colágeno em pó funcionalizado com sulfato de alumínio (ColAl), com sulfato de alumínio + glutaraldeído (Col-Al-Glu), ou com glutaraldeído (Col-Glu): percentuais de hidrólise e atividade relativa da enzima imobilizada após cada ciclo.

[0028] A Figura 4 mostra ensaios de pH operacional na temperatura de 4 °C da β-galactosidase livre e imobilizada em colágeno funcionalizado por diferentes tratamentos (Col-Glu, Col-Al-Glu (120 mg) e Col-Al (120 mg)).

[0029] A Figura 5 mostra ensaios de pH operacional na temperatura de 37 °C da β-galactosidase livre e imobilizada em colágeno funcionalizado por diferentes tratamentos (Col-Glu, Col-Al-Glu (120 mg) e Col-Al (120 mg)).

[0030] A Figura 6 mostra ensaios de temperatura operacional da β-galactosidase livre e imobilizada em colágeno funcionalizado por diferentes tratamentos (Col-Glu, Col-Al-Glu (120 mg) e Col-Al (120 mg)).

[0031] A Figura 7 mostra ensaios de estabilidade ao armazenamento a 4 °C da β-galactosidase livre e imobilizada em colágeno modificado por diferentes tratamentos (Col-Glu, Col-Al-Glu (120 mg) e Col-Al (120 mg)).

Descrição Detalhada da Invenção

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7/20 [0032] O presente projeto tem como objeto um método de imobilização da enzima β-galactosidase, conhecida comercialmente como lactase, que compreende a utilização de colágeno em pó, associado a um suporte de baixo custo e de origem natural, na imobilização da enzima β-galactosidase, que poderá ser empregada e utilizada por diversas vezes em reações de hidrólise da lactose de leite e derivados, com vistas à obtenção de produtos com baixo teor de lactose. O uso do colágeno em pó como suporte reduz o custo do processo de imobilização da β-galactosidase, possibilitando a aplicação da enzima imobilizada em escala industrial nos laticínios.

[0033] A imobilização enzimática, ou seja, a ligação da enzima a um material sólido e insolúvel, denominado de suporte, vem sendo o método de maior sucesso proposto para superar limitações relacionadas ao custo elevado e recuperação das enzimas após a aplicação (se apresentam solúveis e em baixas concentrações), uma vez que estabiliza a estrutura da enzima e, consequentemente, sua atividade. Além disto, esta técnica viabiliza a utilização de biocatalisadores em escala industrial, pois possibilita a recuperação da enzima, reutilização do suporte, redução de custos, facilidade na interrupção da reação enzimática, e em alguns casos pode melhorar o desempenho do biocatalisador e reduzir significativamente a inativação da enzima por influência da temperatura e solventes orgânicos.

[0034] O suporte a ser utilizado para imobilização deve possuir grupos químicos que possam ser ativados ou modificados, permitindo a ligação da enzima sem desnaturá-la. Os materiais sintéticos utilizados para imobilização de enzimas são considerados suportes adequados devido as suas formas físicas e estruturas químicas, por outro lado, apresentam como desvantagem, para aplicação industrial, o custo elevado. Já o colágeno em pó é um material natural, de baixo custo, e não apresenta impacto ambiental, ou seja, pode facilmente ser degradado pelo meio ambiente.

[0035] A imobilização de enzimas é uma alternativa para a aplicação eficiente de biocatalisadores. As enzimas são biocatalisadores altamente

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8/20 específicos, e por meio da imobilização suas características podem ser maximizadas e melhoradas. A tecnologia de imobilização possibilita que as enzimas possam ser reutilizadas diversas vezes, além disso, podem permitir que estas se tornem mais estáveis e resistentes às condições severas, principalmente de pH e temperatura. Em alguns casos de aplicações industriais de biocatalisadores, para prolongar a atividade enzimática ao longo do período do processo, é necessário imobilizá-los.

[0036] O colágeno é uma proteína orgânica pouco solúvel, na sua forma natural organizada em fibras resistentes, tradicionalmente encontrado na pele, tendões, ligamentos e ossos. Os principais estudos com este material são voltados para a melhoria de suas propriedades físicas, físico-químicas, mecânicas e de processamento.

[0037] Por conter abundantes grupos funcionais, tais como -OH, -COOH, e -NH₂, a estrutura do colágeno pode ser modificada para ativar esses grupamentos, melhorando sua interação com outras proteínas. Além disso, o colágeno possui a capacidade de reagir com diversos íons metálicos, tais como Fe (III), Al (III) e Zr (IV). A ligação destes íons metálicos é a primeira etapa de uma das possíveis modificações do colágeno; essa reação é realizada para aumentar a estabilidade e a afinidade da enzima, que ocorre devido à interação quelante entre o íon ligado e a enzima.

[0038] Para o processo de modificação do suporte colágeno em pó são usados três métodos diferentes, bem como combinações entre esses, visando à funcionalização do colágeno. Os métodos envolvem a funcionalização do colágeno com sais de alumínio (podendo ser utilizado sais de ferro (III)), ácido acético (sendo uma alternativa para o uso do ácido a utilização de uma solução de ácido etileno diaminotetraacético (EDTA)), outros agentes quelantes e glutaraldeído.

[0039] Em um primeiro objeto, a presente invenção apresenta uma composição catalisadora que compreende β-galactosidase imobilizada em um suporte de colágeno em pó funcionalizado.

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9/20 [0040] Em uma concretização o suporte é de colágeno em pó funcionalizado por pelo menos um composto do grupo consistido em: sais de alumínio, sais de ferro (III), ácido acético, glutaraldeído, agentes quelantes ou uma combinação destes.

[0041] Em um segundo objeto, a presente invenção apresenta um processo de produção de composição catalisadora que apresenta pelo menos uma etapa de funcionalização do colágeno com pelo menos um composto do grupo consistido em: sais de alumínio, sais de ferro (III), ácido acético, glutaraldeído, agentes quelantes ou uma combinação destes, e uma de etapa de fixação da β-galactosidase no colágeno.

[0042] Em uma concretização o processo de produção de composição catalisadora compreende pelo menos uma etapa de:

a) funcionalização do colágeno, que compreende a adição de 1 g de colágeno em pó a cada 300 mL de água ultrapura com pH pré-ajustado para um faixa de 1,7 a 2,0 com ácido acético;

b) repouso em temperatura ambiente durante uma faixa de tempo entre 20 a 28 horas, preferencialmente 24 horas;

c) adição de 3,5 mmol de Al₂(SO₄)₃;

d) incubação, numa faixa de temperatura de 25 a 35°C, preferencialmente 30°C, com agitação constante durante uma faixa de 2 a 5 horas, preferencialmente 4 horas;

e) ajuste de pH da solução para uma faixa entre 4,0 a 4,5;

f) incubação da mistura em uma faixa de temperatura entre 35 a 45 °C, preferencialmente 40 °C durante uma faixa de tempo de 2 a 6 horas, preferencialmente 4 horas;

g) separação do colágeno por centrifugação (2510 xg, 5 min);

h) lavagem em água ultrapura.

[0043] Em uma concretização o processo de produção de composição catalisadora compreende pelo menos uma etapa de:

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a) funcionalização do colágeno pela adição de glutaraldeído numa concentração de 5% em peso durante uma faixa de 1 a 4 horas, preferencialmente 1 hora;

b) lavagem do colágeno usando água ultrapura seguido de lavagem com tampão fosfato 100 mM (pH 7,0);

c) armazenamento em solução tampão, preferencialmente solução tampão fosfato100 mM (pH 7,0);

[0044] Em uma concretização o processo de produção de composição catalisadora compreende pelo menos uma etapa de:

a) funcionalização do colágeno pela incubação do colágeno em uma solução a 10% (m/v) de ácido acético por uma faixa de tempo entre 1 a 5 horas, preferencialmente1 hora;

b) centrifugação do material obtido em (a) (2510 xg, 5 min);

c) repetição da etapa (a) e (b) por mais duas vezes;

d) lavagem com água ultrapura seguido de lavagem com solução tampão, preferencialmente solução tampão fosfato 100 mM (pH 7,0).

[0045] Em uma concretização o processo de produção de composição catalisadora compreende pelo menos uma etapa de:

a) adição de 1 g de colágeno funcionalizado a cada 30 mL de solução enzimática (50 U/mL) da β-galactosidase em tampão fosfato 100 mM (pH 7,0);

b) repouso da mistura em uma faixa de temperatura entre 2 a 6°C, preferencialmente 4 °C por uma faixa de tempo entre 10 e 14 horas, mais preferencialmente 12 horas,

c) centrifugação a 2370 xg durante 5 minutos;

d) centrifugação por mais três vezes com água ultrapura;

e) centrifugação em solução tampão, preferencialmente solução tampão fosfato 100 mM (pH 7,0).

[0046] Em um terceiro objeto, a presente invenção apresenta um processo de obtenção de produtos com baixo teor de lactose que compreende

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11/20 pelo menos uma etapa de contato entre pelo menos uma composição catalisadora e pelo menos um produto alimentício compreendendo lactose. [0047] Em uma concretização do processo de obtenção de produtos com baixo teor de lactose, a composição catalisadora é:

- adicionada na forma de grânulos ao produto contendo lactose; ou

- organizada em uma coluna, na qual passará o produto contendo lactose.

[0048] Em um quarto objeto, a presente invenção apresenta o uso de composição catalisadora para diminuir o teor de lactose de um produto.

[0049] Por biocatalisador, entende-se enzima. Por composição catalisadora, entende-se uma composição de enzima e um suporte, sendo que a enzima está imobilizada. Por enzima, entende-se substância orgânica de natureza proteica que tem a capacidade de catalisar reações químicas.

Exemplos - Concretizações [0050] Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo sem limitar, o escopo da mesma.

Processo de modificação do colágeno [0051] Inicialmente 1 g de colágeno foi funcionalizado seguindo a técnica de cada tratamento, que pode ser utilizando Al₂(SO₄)₃, Glutaraldeído, Ácido acético ou uma combinação destes.

[0052] Modificação por Al₂(SO₄)₃: 1 g de colágeno em pó foi adicionado em 300 mL de água ultrapura, a mistura permaneceu à temperatura ambiente durante 24 h. O pH da água ultrapura foi pré-ajustado para 1,7-2,0 com ácido acético. Após esse período, foi feita a adição de 3,5 mmol de Al₂(SO₄)₃ e o material foi incubado numa temperatura de 30 °C com agitação constante durante 4 h. Uma quantidade adequada de uma solução saturada de NaHCO3 foi gradualmente adicionada durante 2 h, a fim de aumentar o pH da solução para 4,0 - 4,5. Concluída esta etapa, a mistura foi incubada a 40 °C durante mais 4 h. Quando a reação se completou, o colágeno em pó foi separado por

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12/20 centrifugação (2510 xg, 5 min), lavado em água ultrapura e posteriormente lavado e armazenado em tampão fosfato 0,1 M pH 7,0.

[0053] Modificação por Glutaraldeído: O colágeno em pó também foi funcionalizado utilizando o agente de ligações cruzadas glutaraldeído numa concentração de 5% (v/v) durante 1 h, com posteriores lavagens com água ultrapura e tampão fosfato pH 7,0 e após foi armazenado em solução tampão. [0054] Modificação por Ácido acético: incubação do colágeno em uma solução a 10% (m/v) de ácido acético por 1 h, esse processo foi realizado durante 3 h (3 períodos de 1 h), após cada período foi realizada a separação do material por centrifugação (2510 xg, 5 min), e ao final, o colágeno foi lavado com água ultrapura e após com tampão fosfato.

[0055] Uma alternativa para o uso do ácido acético seria a utilização de uma solução de ácido etileno diaminotetraacético (EDTA) que é um agente quelante e vem sendo utilizado para desmineralização de compostos sólidos. Outros agentes quelantes também poderiam ser usados para fazer a remoção dos minerais.

[0056] Ferro (III) pode ser utilizado como substituinte ao uso de alumínio. Processo de imobilização da enzima [0057] Para o processo de imobilização 1 g de colágeno funcionalizado foi misturado com 30 mL de solução enzimática (50 U/mL) da β-galactosidase em tampão fosfato 100 mM (pH 7,0). A mistura foi mantida a 4 °C por 12 horas. Após esse período a β-galactosidase imobilizada foi separada por centrifugação 2370 xg durante 5 minutos e em seguida lavada três vezes com água ultrapura e uma vez com tampão fosfato 100 mM (pH 7,0). Ao final, o material foi armazenado em solução de tampão fosfato a 4 °C para posterior utilização.

[0058] Foram testados, além dos métodos que utilizam apenas o sulfato de alumínio, ou o glutaraldeído ou o ácido acético para tratamento do colágeno em pó, técnicas que combinam mais de um tratamento. Além disso, também foi estudado o comportamento do complexo quando adicionado de uma

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13/20 quantidade maior de sulfato de alumínio (de 120 para 800 mg). Os resultados dos experimentos realizados estão apresentados na Tabela 1, que mostra o rendimento e a eficiência atingidos após o processo de imobilização em colágeno tratado pelos diferentes métodos:

- sulfato de alumínio na quantidade de 120 mg (Col-Al (120 mg));

- sulfato de alumínio na quantidade de 800 mg (Col-Al (800 mg));

- sulfato de alumínio na quantidade de 120 mg + glutaraldeído (Col-Al-Glu (120 mg));

- sulfato de alumínio na quantidade de 800 mg + glutaraldeído (Col-Al-Glu (800 mg));

- ácido acético + sulfato de alumínio na quantidade de 120 mg (Col-HAc-Al (120 mg));

- ácido acético + sulfato de alumínio na quantidade de 800 mg (Col-HAc-Al (800 mg));

- ácido acético + sulfato de alumínio na quantidade de 120 mg + glutaraldeído (Col-HAc-Al-Glu (120 mg));

- ácido acético + sulfato de alumínio na quantidade de 800 mg + glutaraldeído (Col-HAc-Al-Glu (800 mg));

- ácido acético (Col-HAc);

- ácido acético + glutaraldeído (Col-HAc-Glu);

- glutaraldeído (Col-Glu).

[0059] Observou-se que nos complexos que receberam a maior quantidade (800 mg) de sulfato de alumínio, o rendimento de imobilização foi maior. Já em relação à eficiência de imobilização, que demonstra a percentagem da enzima que foi imobilizada e ainda permaneceu ativa, verificou-se comportamento oposto, ou seja, a eficiência de imobilização foi maior nos tratamentos que empregaram a menor quantidade (120 mg) de sulfato de alumínio. Outro fator observado foi que, com exceção dos testes ColHAc-Al-Glu com 120 e com 800 mg de sulfato de alumínio, a utilização do glutaraldeído resultou em um aumento da eficiência da imobilização, indicando

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14/20 que seu uso pode contribuir com a estabilidade da estrutura tridimensional da enzima, evitando que ocorram mudanças conformacionais durante o processo de imobilização.

Tabela 1. Resultados de rendimento e eficiência dos processos de imobilização da βgalactosidase nos diferentes tratamentos estudados com colágeno em pó.

T ratamento	Rendimento (%)	Eficiência (%)
Col-Al (120 mg)	26,90 ± 0,62 de	27,62 ± 2,53 d
Col-Al (800 mg)	44,17 ± 0,36 a	21,20 ± 1,38 ef
Col-Al-Glu (120 mg)	25,55 ± 1,86 de	51,67 ± 3,15 b
Col-Al-Glu (800 mg)	26,54 ± 0,24 de	43,03 ± 1,19 c
Col-HAc-Al (120 mg)	28,59 ± 0,77 cde	26,55 ± 0,65 de
Col-HAc-Al (800 mg)	35,54 ± 3,48 b	28,70 ± 1,64 d
Col-HAc-Al-Glu (120 mg)	24,05 ± 0,80 e	26,00 ± 1,14 de
Col-HAc-Al-Glu (800 mg)	25,08 ± 1,60 de	16,84 ± 0,45 f
Col-HAc	29,85 ± 0,47 cd	24,60 ± 1,01 de
Col-HAc-Glu	33,63 ± 2,13 bc	29,42 ± 1,86 d
Col-Glu	28,45 ± 1,69 cde	58,27 ± 1,74 a

* Cada valor representa a média ± desvio padrão de três experimentos independentes realizados em triplicata. Letras diferentes na mesma coluna representam diferença estatisticamente significativa (p<0,05).

[0060] A partir dos resultados obtidos em relação à eficiência dos complexos formados, os tratamentos Col-Glu, Col-Al-Glu (120 mg) e Col-Al (120 mg) foram escolhidos para serem submetidos aos ensaios de:

- estudo dos parâmetros cinéticos;

- estabilidade térmica;

- avaliação do pH operacional;

- avaliação da temperatura operacional;

- estabilidade ao armazenamento;

- reusabilidade para a hidrólise da lactose.

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15/20 [0061] Os parâmetros cinéticos (Km e Vmax) da enzima livre e imobilizada no colágeno tratado por diferentes métodos estão apresentados na Tabela 2.

Tabela 2. Resultados dos parâmetros cinéticos da β-galactosidase livre e imobilizada em colágeno funcionalizado por diferentes tratamentos (Col-Glu, Col-Al-Glu (120 mg) e Col-Al (120 mg)).

Tratamento	Km (mM)	Vmax (mM.min-1)
Col-Al (120 mg)	5,95 ± 0,71	21,02 ± 1,78
Col-Al-Glu (120 mg)	4,71 ± 0,45	20,42 ± 0,70
Col-Glu	4,63 ± 0,44	14,90 ± 1,16
Enzima Livre	4,35 ± 0,13	148,84 ± 10,34

[0062] Os dados encontrados nesse estudo indicaram um aumento da constante de Michaelis-Menten de 4,35 mM na enzima livre para até 5,95 mM no complexo Col-Al (120 mg). Em relação à velocidade máxima, uma expressiva redução foi observada após o processo de imobilização, essa redução pode ser atribuída a questões difusionais, e a dificuldade dos substratos em acessar o sítio da enzima imobilizada por possíveis alterações em sua estrutura tridimensional, o que resulta no bloqueio de alguns centros ativos após a imobilização, o que reduz a velocidade da reação, provocando a diminuição dos valores de Vmax (Zhou e Chen, 2001).

[0063] Os parâmetros termodinâmicos para as enzimas livre e imobilizadas, em Col-Al (120 mg), Col-Al-Glu (120 mg) e Col-Glu, nas temperaturas de 50, 55 e 60 °C são apresentados na Tabela 3. A determinação dos parâmetros termodinâmicos auxilia na compreensão do mecanismo de desnaturação da enzima, o qual é muito importante em processos enzimáticos, assim como o efeito da temperatura na taxa de desnaturação enzimática (Ortega et al., 2004).

Tabela 3. Parâmetros termodinâmicos da β-galactosidase na forma livre e imobilizada em colágeno funcionalizado por diferentes tratamentos (Col-Glu, Col-Al-Glu (120 mg) e Col-Al (120 mg)).

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T	k	^1/2	AG	ΔΗ	Δβ	Ea
(°C)	(min-1)	(min)	(kJ.mol-1)	(kJ.mol-1)	(J.mol-1.K-1)	(kJ.mol-1)
			Enzima livre
50	0,0242	28,64	89,31	6,05	-257,79	8,73
55	0,1297	5,34	90,74	6,01	-258,33
60	0,8144	0,85	92,16	5,96	-258,85

Col-Al (120 mg)

50	0,1846	3,75	83,86	1,26	-255,71	3,95
55	0,6822	1,02	85,20	1,22	-256,03
60	0,8744	0,79	86,54 1,18 Col-Al-Glu (120 mg)	-256,33
50	0,0515	13,46	89,63	5,30	-261,08	7,99
55	0,3734	1,86	91,06	5,26	-261,59
60	0,4934	1,40	92,49 Col-Glu	5,22	-262,08
50	0,0612	11,33	86,82	4,52	-254,80	7,21
55	0,8717	0,80	88,21	4,48	-255,27
60	1,0294	0,67	89,60	4,44	-255,72

[0064] Para a temperatura de 60 °C, os resultados do tempo de meia vida (t_1/2) e da constante de inativação (k) mostram que o processo de imobilização da β-galactosidase em colágeno tratado com sulfato de alumínio (na quantidade de 120 mg) + glutaraldeído aumentou a estabilidade térmica da enzima.

[0065] Os valores da E_a diminuíram após o processo de imobilização, indicando que uma menor quantidade de energia é necessária para desnaturar a enzima imobilizada. De acordo com Cobos e Estrada (2003), o valor de E_a é a energia necessária para alterar a conformação da enzima. O aumento dos valores de ÁG, com o aumento da temperatura de 50 até 60 °C, tanto para a enzima livre como para a enzima imobilizada nos diferentes suportes (Col-Glu, Col-Al-Glu (120 mg) e Col-Al (120 mg)), indica uma estabilização progressiva das moléculas com a temperatura. A desnaturação ocorre quando o ÁG

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17/20 assume um valor baixo, indicando que o estado assumido apresenta menos energia disponível, em função da desnaturação, quando comparado com o estado inicial (Modell e Reid, 1983). Após o processo de imobilização da β-galactosidase houve uma redução nos valores de ÁH em todos os complexos, indicando que este procedimento causou alguma modificação na estrutura tridimensional da enzima, o que a desestabilizou. De acordo com Ortega et al. (2004), a entalpia pode ser correlacionada com o número de ligações não-covalentes rompidas durante o processo de desnaturação das proteínas. Em relação ao valor de ÁS, nas temperaturas estudadas, não foi observada grande variação entre a enzima livre e a imobilizada nos diferentes tratamentos (Col-Glu, Col-Al-Glu (120 mg) e Col-Al (120 mg)), indicando que não houve alteração na desordem do sistema após a desnaturação.

[0066] As Figuras 4 e 5 mostram o efeito do pH na atividade catalítica da β-galactosidase. Comparando o comportamento das enzimas livre e imobilizada nos diferentes tratamentos (Col-Glu, Col-Al-Glu (120 mg) e Col-Al (120 mg)), observou-se que não houve grande alteração nas propriedades catalíticas após o processo de imobilização em nenhuma das temperaturas, isso evidencia que o microambiente do suporte não tem influência sobre a enzima. Para a temperatura de 4 °C (Figura 4), verifica-se que as enzimas apresentam uma maior sensibilidade ao pH 7,5; essa alteração pode ser explicada pelo fato de que baixas temperaturas acabam desfavorecendo a atividade da enzima e dessa forma tornam-se mais sensíveis a alguns valores de pH. Para valores de pH próximos à 4,5 as enzimas livres e imobilizadas nos diferentes tratamentos (Col-Glu, Col-Al-Glu (120 mg) e Col-Al (120 mg)) apresentaram baixa atividade. Isso ocorreu principalmente devido ao fato que o ponto isoelétrico da β-galactosidase de K. lactis é de aproximadamente 5,42 e dessa forma, a enzima é desnaturada nessa condição de pH (Zhou e Chen, 2001).

[0067] A Figura 6 apresenta o comportamento das enzimas quando incubadas em diferentes temperaturas e no pH=7,0. Sabe-se que com o

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18/20 aumento da temperatura, a velocidade de reação também aumenta. Contudo, devido à fraca estrutura das enzimas, elas podem sofrer alterações com a elevação da temperatura causando uma redução na sua atividade catalítica (Delanoy et al., 2003).

[0068] O perfil de comportamento da enzima nas diferentes temperaturas não apresentou grande variação após o processo de imobilização. Quando incubada a 40 °C (temperatura ótima da enzima), tanto a β-galactosidase livre quanto a imobilizada no colágeno submetido aos diferentes tratamentos (Col-Glu, Col-Al-Glu (120 mg) e Col-Al (120 mg)) apresentaram aproximadamente 60% da sua atividade. Na temperatura de 50 °C foram obtidas as maiores atividades, tanto para enzima livre quanto para a imobilizada em colágeno funcionalizado por diferentes tratamentos (Col-Glu, Col-Al-Glu (120 mg) e Col-Al (120 mg)). Isso pode ser atribuído às questões difusionais, a enzima é mais facilmente distribuída pela solução em temperaturas mais elevadas. A perda de atividade observada a 60 °C pode ser atribuída à desnaturação das moléculas da enzima, resultando na ruptura das cadeias polipeptídicas (Ansari et al., 2013).

[0069] A etapa de armazenamento dos biocatalisadores em condições ideais tem uma grande importância para que possam desempenhar suas funções com a maior eficiência possível (Zanin et al., 2004). A Figura 7 apresenta os resultados da estabilidade ao armazenamento a 4 °C da β-galactosidase livre e imobilizada em colágeno funcionalizado por diferentes tratamentos (Col-Glu, Col-Al-Glu (120 mg) e Col-Al (120 mg)). Pode-se observar que após 100 dias de armazenamento as enzimas imobilizadas apresentam um comportamento muito semelhante, todas mantiveram mais de 50% da sua atividade inicial, sendo que o complexo obtido na imobilização com Col-Al-Glu foi o que apresentou maior estabilidade, retendo em torno de 60% da atividade inicial da enzima.

Ensaios de hidrólise da lactose

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19/20 [0070] Nos ensaios de hidrólise foram utilizadas 500 mg de derivado (colágeno modificado + β-galactosidase) para hidrolisar 20 mL de cada uma das soluções (lactose, permeado e soro de queijo) que foram reconstituídas a 5% (m/v) de lactose. Seguindo as quantidades utilizadas nos experimentos, para a hidrólise em 1 litro de solução contendo os mesmos 5% de lactose são necessários 25 g do derivado contendo a enzima imobilizada.

[0071] Ensaios de hidrólise da lactose (de uma solução de lactose, do permeado de soro de queijo, e do soro de queijo) pela enzima imobilizada podem ser observados nas Figuras 1, 2 e 3. Os ensaios de hidrólise foram realizados empregando a β-galactosidase imobilizada em colágeno em pó funcionalizado: com sulfato de alumínio (Col-Al), com sulfato de alumínio + glutaraldeído (Col-Al-Glu), ou com glutaraldeído (Col-Glu). A Figura 1 apresenta os resultados obtidos a partir da hidrólise da lactose de uma solução de lactose pura a 5% (m/v) empregando os três diferentes derivados. A Figura 2 demonstra os resultados de hidrólise de uma solução de permeado de soro de queijo (reconstituído a 5% (m/v) de lactose) empregando os três diferentes derivados. Na Figura 3 os resultados apresentados foram obtidos a partir da hidrólise realizada em uma solução de soro de queijo (reconstituído a 5% (m/v) de lactose) empregando os três diferentes derivados.

[0072] Observou-se que o complexo obtido a partir do tratamento do colágeno com alumínio e glutaraldeído (Col-Al-Glu) foi o que apresentou maiores valores de hidrólise, além de ter possibilitado um maior número de reusos do derivado (enzima imobilizada), quando comparado com as modificações feitas somente com alumínio (Col-Al) ou somente com glutaraldeído (Col-Glu). Isso indica que as ligações químicas entre a enzima e o colágeno formadas após esse tratamento (com alumínio e glutaraldeído (Col-Al-Glu)) resultaram em um complexo mais estável. Isso provavelmente ocorreu devido a uma combinação do efeito quelante do íon alumínio com as ligações cruzadas formadas pelo glutaraldeído.

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20/20 [0073] A matriz produzida a partir dos conhecimentos aqui revelados pode ser utilizada na forma de grânulos sendo adicionada ao meio reacional em tanques de agitação ou esses grânulos podem ser usados para preencher uma coluna, por onde passará o produto contendo o substrato a lactose que será hidrolisada.

[0074] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes, abrangidas no escopo das reivindicações anexas.

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Claims (10)

1. Reivindicações

   1. Composição catalisadora caracterizada por ser β-galactosidase imobilizada em um suporte de colágeno em pó funcionalizado.
2. 2. Composição catalisadora de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo colágeno em pó ser funcionalizado por pelo menos um composto do grupo consistido em: sais de alumínio, sais de ferro (III), ácido acético, glutaraldeído, agentes quelantes ou uma combinação destes.
3. 3. Processo de produção de composição catalisadora conforme definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado por compreender pelo menos uma etapa de funcionalização do colágeno com pelo menos um composto do grupo consistido em: sais de alumínio, sais de ferro (III), ácido acético, glutaraldeído, agentes quelantes ou uma combinação destes, e uma de etapa de fixação da β-galactosidase no colágeno.
4. 4. Processo de produção de composição catalisadora de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por compreender pelo menos uma etapa de:

   a) funcionalização do colágeno, que compreende a adição de 1 g de colágeno em pó a cada 300 ml_ de água ultrapura com pH pré-ajustado para um faixa de 1,7 a 2,0 com ácido acético;

   b) repouso em temperatura ambiente durante uma faixa de tempo entre 20 a 28 horas;

   c) adição de 3,5 mmol de A^SO^;

   d) incubação, numa faixa de temperatura de 25 a 35 °C, com agitação constante durante uma faixa de 2 a 5 horas;

   e) ajuste de pH da solução para uma faixa entre 4,0 a 4,5;

   f) incubação da mistura em uma faixa de temperatura entre 35 a 45 °C, durante uma faixa de tempo de 2 a 6 horas;

   g) separação do colágeno por centrifugação (2510 xg, 5 min);

   h) lavagem em água ultrapura.

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5. 5. Processo de produção de composição catalisadora de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por compreender pelo menos uma etapa de:

   a) funcionalização do colágeno pela adição de glutaraldeído numa concentração de 5% em peso durante uma faixa 1 a 4 horas;

   b) lavagem do colágeno usando água ultrapura seguido de lavagem com tampão fosfato 100 mM (pH 7,0);

   c) armazenamento em solução tampão fosfato 100 mM (pH 7,0);
6. 6. Processo de produção de biocatalisador de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por compreender pelo menos uma etapa de:

   a) funcionalização do colágeno pela incubação do colágeno em uma solução a 10% (m/v) de ácido acético por uma faixa de tempo entre 1 a 5 horas;

   b) centrifugação do material obtido em (a)

   c) repetição da etapa (a) e (b) por mais duas vezes;

   d) lavagem com água ultrapura seguido de lavagem com solução tampão.
7. 7. Processo de produção de composição catalisadora de acordo com qualquer uma das reivindicações de 3 a 6, caracterizado por compreender pelo menos uma etapa de:

   a) adição de 1 g de colágeno funcionalizado a cada 30 mL de solução enzimática (50 U/mL) da β-galactosidase em tampão fosfato 100 mM (pH 7,0);

   b) repouso da mistura em uma faixa de temperatura entre 2 a 6°C, por uma faixa de tempo entre 10 e 14 horas;

   c) centrifugação;

   d) centrifugação por mais três vezes com água ultrapura;

   e) centrifugação em solução tampão fosfato 100 mM (pH 7,0).
8. 8. Processo de obtenção de produtos com baixo teor de lactose caracterizado por compreender pelo menos uma etapa de contato entre pelo

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   3/3 menos uma composição catalisadora conforme definido na reivindicação 1 e pelo menos um produto alimentício compreendendo lactose.
9. 9. Processo de obtenção de produtos com baixo teor de lactose de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela composição catalisadora:

   - ser adicionada na forma de grânulos ao produto contendo lactose; ou

   - estar organizada em uma coluna, na qual passará o produto contendo lactose.
10. 10. Uso de composição catalisadora conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado por ser para diminuir o teor de lactose de um produto.

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    FIGURAS

    Ciclos

    Atividade Relativa (%)

    Col-Al Col-Al-Glu Col-Glu

    100,00

    100.00

    100,00

    43,65

    79.81

    75.83

    20,13

    54.39

    57.20

    10,54

    29.09

    30.88

    4,29

    20.52

    19.99

    3,11

    17.20

    13.43

    1,24

    14.66

    7.03

    9.98

    3.46

    7.03

    1.04

    2,37 1,30