CN101874061B - 由乳液得到的颗粒 - Google Patents
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Abstract
一种由乳液得到的颗粒包括通过交联剂交联的聚合链的格状结构和靠近和围绕所述链的填隙孔。官能团被设置在格状结构上并且蛋白质和/或改性的蛋白质能够与其反应,从而使蛋白质和/或改性的蛋白质结合到所述格状结构上并因此被固定。
Description
技术领域
本发明涉及由乳液得到的颗粒(emulsion-derived particle)。其还涉及制造该颗粒的方法。
背景技术
除了别的应用以外,包含固定化酶的颗粒通常用于生物催化作用和用于诊断学。然而,申请人注意到这种颗粒具有如其表面积不足以使酶充分固定的缺点。因此,本发明的一个目的是提供至少减轻这个缺点的颗粒和制造这种颗粒的方法,该颗粒对蛋白质具有高结合量并且能够固定蛋白质。
发明内容
因此,根据本发明的第一方面,提供了一种由乳液得到的颗粒,该颗粒包括通过交联剂交联的聚合链(polymeric strand)的格状结构、靠近和围绕所述链的填隙孔以及在所述格状结构上的官能团,并且蛋白质和/或改性的蛋白质能够与所述官能团反应从而使蛋白质和/或改性的蛋白质结合到所述格状结构上并因此被固定。
‘由乳液得到’指的是已使用乳液技术制造或形成颗粒,所述乳液技术例如但不限于,本发明的第二和第三方面的基于乳液的方法。
“改性的蛋白质”指的是用化学手段(例如加入二醛)改性的蛋白质或在基因水平(例如通过组氨酸标签(his-tag))改性的蛋白质。
因此,所述颗粒包括在聚合链或纤维上和/或者在交联剂上的官能团,该官能团可以与蛋白质和/或改性的蛋白质反应。更具体而言,所述官能团可以存在于所述链或纤维的聚合物上,并且可被选择以使可以通过改性聚合物上的官能团,从而通过共价结合、离子结合、疏水结合和亲合结合中的一种或多种将蛋白质和/或改性的蛋白质结合到聚合物上。
因此,所述颗粒可以包括至少一种通过官能团结合或键合到聚合物上的蛋白质和/或改性的蛋白质,从而被固定。所述蛋白质可为酶或酶混合物;抗体或抗体混合物;或者,抗原或抗原混合物或者任何具有功能或结构特性的其它蛋白质。因此,如需要,可以在颗粒内固定多种不同的蛋白质和/或多种不同的改性的蛋白质。当蛋白质是酶时,通过在颗粒中固定酶,所述颗粒提供了可以将酶的最适的pH转变为酸或碱区的手段。
当将蛋白质和/或改性的蛋白质共价结合到聚合物上时,例如,其可以通过环氧化物或醛与蛋白质和/或改性的蛋白质的胺基相互作用实现。
当将蛋白质和/或改性的蛋白质离子结合到聚合物上时,其可以通过聚合物上带正电荷或负电荷的官能团与蛋白质和/或改性的蛋白质上带相反电荷的氨基酸残基的离子结合实现。
当将蛋白质疏水结合到聚合物上时,其可以通过聚合物上的芳族或长链烷疏水基与蛋白质上的疏水性氨基酸的结合实现。
当将蛋白质亲合结合到聚合物上时,其可以通过亲合标记物(例如二价金属和/或抗生物素蛋白)结合组氨酸或生物素化蛋白质实现。
如需要,为了更加有效地结合蛋白质,所述颗粒自然可以包含超过一种的上述类型或范畴的官能团。
所述链或纤维的聚合物可为均聚物,并且可为聚乙烯亚胺。
所述交联剂可为戊二醛或另外的醛;环氧化物;或者,具有两个或多个官能团的任何其它合适的化合物。
所述颗粒可以包括陷入填隙孔或格状结构的空间的添加物。所述添加物可选自辅助因子、改性的辅助因子、或化学介体、磁石和/或磁性物质中。通过在颗粒中包含适合的酶和/或作为添加物的物质,可以实现用于反应中的辅助因子的连续再生,从而使反应达到平衡或完成。通过包含作为添加物的磁石或磁性物质,使用磁性分离,可以容易地实现颗粒从形成的液体介质中的回收。
根据本发明的第二方面,提供了一种制造颗粒的方法,该方法包括:
提供分散在第二液相中的第一液相的液滴的乳液,一种液相为水相而另一种液相为油相,并且水相包含溶于其中的聚合物以及溶于其中的交联剂;
使交联剂交联聚合物的链,从而形成颗粒,各颗粒包含通过交联剂交联的聚合物链的格状结构、靠近和围绕所述链的填隙孔以及在所述格状结构上的官能团,并且蛋白质和/或改性的蛋白质能够与所述官能团反应从而使蛋白质和/或改性的蛋白质结合到所述格状结构上并因此被固定。
所述第一液相可为水相,所述第二液相因此为油相,从而所述乳液为油(o)包水(w)乳液,即w/o乳液。然而,在本发明的其它实施方式中,所述乳液可为水包油(o/w)乳液、水包油包水(w/o/w)乳液或油包水包油(o/w/o)乳液。
通过将包含分散在油相中的水滴(含有溶于其中的聚合物)的第一乳液与包含分散在油相中的水滴(含有溶于其中的交联剂)的第二乳液混合可以形成所述乳液。
根据本发明的第三方面,提供了一种制造颗粒的方法,该方法包括:
提供分散在第二液相中的第一液相的液滴的第一乳液,一种液相为水相而另一种液相为油相,并且水相包含溶于其中的聚合物;
将分散在第二液相中的第一液相的液滴的第二乳液与第一乳液混合,一种液相为水相而另一种液相为油相,并且水相包含溶于其中的交联剂;
使交联剂交联聚合物的链,从而形成颗粒,各颗粒包含通过交联剂交联的聚合物链的格状结构、靠近和围绕所述链的填隙孔以及在所述格状结构上的官能团,并且蛋白质和/或改性的蛋白质能够与所述官能团反应从而使蛋白质和/或改性的蛋白质结合到所述格状结构上并因此被固定。
至少一相可包含洗涤剂或表面活性剂。表面活性剂可以选自两性离子表面活性剂、中性表面活性剂、带电荷表面活性剂和/或聚合物表面活性剂中。阴离子表面活性剂包括烷基硫酸盐(如十二烷基硫酸钠或月桂醇聚醚硫酸酯钠(sodium laureth sulphate))和烷基醚硫酸盐。阳离子表面活性剂包括西曲氯铵(centrimonium chloride)。非离子表面活性剂包括乙氧基化烷基酚,如聚氧化乙烯(10)异辛基环己基醚(Triton X100)或聚氧化乙烯(9)壬基苯基醚(壬苯醇醚-9)。两性离子或两亲型表面活性剂包括癸基甜菜碱。聚合物表面活性剂包括山梨糖醇-(环氧乙烷)80,环氧乙烷-环氧丙烷-环氧乙烷三嵌段共聚物,还称为泊洛沙姆,例如购自BASF商品名称为普卢兰尼克(Pluronic)的,以及环氧丙烷-环氧乙烷-环氧丙烷三嵌段共聚物,还称为美罗沙波(meroxapol)。
至少原则上,油相的油可为任何适合的水不混溶的有机溶剂,植物油,矿物油,煤油或原油得到的油性成分,或合成油;然而,其优选选自矿物油、石蜡和如异辛烷的溶剂中。
如上所述,所述聚合物可为聚乙烯亚胺(PEI),同时所述交联剂可为双官能或多官能醛,例如戊二醛、琥珀醛、葡聚糖醛、己二异氰酸酯和乙二醛。其它的适合的交联剂可以用于PEI或衍生PEI,或者其它的聚合物,例如异氰酸酯(包括己二异氰酸酯或二异氰酸甲苯酯,或异硫氰酸酯);环氧化物(例如2-氯甲基环氧乙烷);酐;环氧氯丙烷,1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基碳化二亚胺;氯乙酸乙酯等等。由于未反应的官能团用于固定蛋白质和/或改性的蛋白质,交联剂也可认为是用于聚合物改性或后交联改性的衍生剂(derivitisation agent)。可以使用其它的聚合物和共聚物,例如聚乙烯醇、尼龙、藻酸盐、其它的蛋白质(例如白蛋白、胶原等等)等,改性的或没有改性的。
所述方法可以包括:
将蛋白质(例如酶、抗体或抗原)和/或改性的蛋白质引入到颗粒中或颗粒上,以使蛋白质和/或改性的蛋白质与如上所述的在聚合链或纤维上和/或在交联剂上的官能团反应,从而使蛋白质和/或改性的蛋白质被结合到链或纤维的聚合物上和/或结合到交联剂上,并因此被固定。
所述方法可包括将添加物加入到其中一个相中,以使该添加物被陷入到颗粒的格状结构内。可以在将蛋白质连到格状结构之前或之后进一步加入添加物。如上所述,所述添加物可以选自辅助因子、改性的辅助因子、化学介体、磁石和/或磁性物质中。
所述方法可包括从油相中回收所述颗粒。特别是,可以用物理分离手段(如离心或过滤)进行颗粒的回收。
所述方法可以包括干燥回收的颗粒。颗粒的干燥可以包括丙酮脱水、空气干燥、喷雾干燥或优选地冷冻干燥或真空干燥。
如上所述,所述方法可以包括在颗粒干燥之前将添加物加入到回收的颗粒中,以使添加物被陷入颗粒的格状结构内。
为了实现蛋白质和颗粒的增强的稳定作用,和/或为了实现添加剂(天然或改性的辅助因子)的陷入,可以在蛋白质固定之前或之后进行干燥回收的颗粒。通过多点附着,干燥还可以导致蛋白质或改性的蛋白质的交联增强。这反过来可以增强蛋白质(例如酶)的稳定性。
设想本发明的颗粒能够具有不同的用途或应用,例如用于生物催化、基于酶的生物治疗、诊断学,以及用于结合到固体载体(如膜反应器或蛋白质固定基质)的表面,以增大其表面积。
附图说明
现将参照下列实施例和附图更加详细地描述本发明。
附图中,
图1为根据实施例1戊二醛交联的PEI的聚合物颗粒的显微镜照片,其显示PEI载体的聚合链/纤维的格状结构或网状构造骨架;
图2为显示根据实施例2漆酶结合到纤维格状结构所获得的结果,用pH分布改变校正的结合效率;
图3显示使用多种油相制造的颗粒的粒度分布(平均尺寸)分析,其中,颗粒未被干燥(湿的)、已被干燥(使用冷冻干燥),内嵌超声处理(in-lineultrasonication)(US)或在用超声处理预处理后测量;
图4显示使用多种表面活性剂制造的颗粒的粒度分布分析;其用光散射测定,或在超声处理后(US后)分析;
图5显示使用单乳液(single emulsion)制造的湿的颗粒和干的颗粒的粒度分布;结果显示重复三次实验的标准差;其用光散射测定,伴随在线超声处理(伴随US),或在样品预超声处理后(US后)分析;
图6显示在20ml体积矿物油和200ml体积矿物油制造的湿的颗粒和干的颗粒的粒度分布;
图7显示在含有或不含有作为潜在保护物的底物的情况下结合到颗粒的多种酶的活性维持;
图8显示在PEI pH为8(图8A)和11(图8B)制造的游离漆酶以及湿的和干的漆酶结合颗粒的最适温度;
图9显示在PEI pH为8和11制造的游离漆酶以及湿的和干的漆酶结合颗粒的pH稳定性(6小时);
图10A显示根据实施例14的在未经后处理的纤维格状结构或网状构造上的固定化酶和游离酶的漆酶pH分布,说明了聚乙烯亚胺(‘PEI’)浓度变化对pH分布改变的影响;
图10B显示根据实施例14在未经后处理的纤维格状结构或网状构造上的固定化酶和游离酶的漆酶pH分布,说明了戊二醛浓度变化对pH分布改变的影响;
图11A显示根据实施例14在戊二醛后处理的纤维格状结构或网状构造上的固定化酶和游离酶的漆酶pH分布,说明了PEI浓度变化对pH分布改变的影响;
图11B显示根据实施例14在戊二醛后处理的纤维格状结构或网状构造上的固定化酶和游离酶的漆酶pH分布,说明了戊二醛浓度变化对pH分布改变的影响;
图12显示了用于实验A~F的颗粒的过氧化物酶活性获得的结果。
具体实施方式
实施例1:制备由聚合链/纤维的网状构造或格状结构组成的颗粒
该方法包括油包水乳液的形成,在该油包水乳液中,使含有聚胺聚合物(聚乙烯亚胺)的乳液与另一种伯胺交联剂(戊二醛)混合。使两种试剂反应形成以微观颗粒或珠粒形式的聚合物。
化学药品
戊二醛(25%水溶液)得自Acros Organics(Geel West Zone 2,JanssenPharmaceuticalaan 3a,2440Geel,比利时)。聚乙烯亚胺(PEI)(50%水溶液,Cat.No.P-3143,Mw 750,000和Mn 60,000)得自Sigma-Aldrich(St Louis,Missouri63178)。矿物油(药用白油,48031)购自Castrol(8 Junction Avenue,Parktown,2193 Johannesburg,南非)。
制造颗粒的方法
乳液A组成
10ml矿物油(油相)
0.05ml壬苯醇醚-4(nonoxyol-4)(表面活性剂)
0.5ml聚乙烯亚胺(聚胺),(10%m/v水溶液),pH 11
使用磁力搅拌器以700rpm搅拌30min。
乳液B组成
10ml矿物油(油相)
0.05ml壬苯醇醚-4(nonoxyol-4)(表面活性剂)
0.5ml戊二醛,(25%m/v,等级II)
使用磁力搅拌器以700rpm搅拌30min。
将两种乳液(A和B)混合以使聚合物进行交联反应并且使用磁力搅拌器棒以700rpm搅拌30分钟到1小时以确保其保持乳液状态。然后,在3000rpm下使该乳液离心(在配备有JA20.1转子的Beckman-Coulter J2-21ME中,10分钟)从而回收形成的颗粒。将颗粒状物再悬浮于去离子水中,稀释至10~40ml,而后再次离心。这种冲洗处理重复两次以上。最终的上清液是澄清的。将最终的颗粒状物悬浮于10ml Tris-Cl缓冲液(0.05M,pH 8.0)中。
结果
通过离心回收来自全部乳液制品的材料并通过光学显微镜观察。格状结构形成结果示于图1,说明形成了大致球形的颗粒。
PEI:戊二醛浓度比对颗粒形成的影响
研究PEI与戊二醛的比例对颗粒形成的影响。按照表1制备样品。
通过纤维骨架格状结构或载体的冷冻干燥并称量来进行干重测定。该实验的结果列于表1中,并且说明宽范围的反应物组合形成了颗粒。
表1:用于纤维聚合骨架制造的PEI和戊二醛的数量的评价
实施例2:漆酶与PEI载体的聚合链/纤维的格状结构或网状构造骨架的结合
酶
DeniLiteTM,一种漆酶,得自Novozymes(Novozymes A/S,Krogshoejvej 36,2880 Bagsvaerd,丹麦)。
酶的洗涤
通过在100ml重蒸馏的H2O中溶解5g DeniLite II Base,同时在4℃以200rpm搅拌1小时,从DeniLiteTM中部分纯化漆酶。通过使用Beckman-Coulter J2-21ME离心机中的JA14转子在4℃在10000rpm下离心1小时移除悬浮固体。移出上清液并使用具有10kDa截留的SnakeSkinTM(Pierce)透析管在4℃透析,并换水(5l)三次。前两次在持续2小时后更换,而最后的透析持续12小时。使酶在液氮中冷冻并冻干。使用前在4℃下储存这种漆酶。
漆酶测定
在将漆酶结合到载体并且使漆酶固定在载体上后对离心的上清液进行漆酶测定以测定结合时的活性维持情况。漆酶试剂包含在100mM琥珀酸盐-乳酸盐缓冲液(pH 4.5)中的1mM的愈创木酚作为底物(Jordaan J,Pletschke B,Leukes W.2004 Purification and partial characterization of a thermostable laccasefrom an unidentified basidiomycete.Enz.Microb.Technol.34:635-641)。以消光系数为5200M-1.cm-1在450nm重复三次进行测定。使用PowerWave HTMicrotitre酶标仪进行测定。酶的一个单位定义为每分钟氧化1μmol底物所需酶的数量。
蛋白质测定
在通过用漆酶作为标准蛋白质在280nm的吸光度测定溶液中的蛋白质浓度之后进行蛋白质负载。结合的蛋白质定义为总蛋白质减去溶液中的剩余蛋白质。
酶的固定化
通过在室温下温和搅拌30分钟使酶(漆酶(1ml的10mg.ml-1溶液))结合到载体上。酶被结合到干重示于表2中的骨架上。通过在700x g离心5分钟回收结合有漆酶的颗粒。用50ml水洗涤固定化酶5次并通过上述离心回收。
将蛋白质(此时为酶(漆酶))以缓冲溶液的形式加入到PEI-戊二醛颗粒(衍生的或非衍生的)中。按照实施例1中描述的方法制备颗粒。使颗粒与蛋白质反应从而使蛋白质固定到上述聚合物上。在通过离心回收之后和在使用之前颗粒未被干燥。
将蛋白质结合到各种制成的蛋白质载体上的结果列于下表2中,而漆酶活性结果示于图2中。
结果
表2:漆酶结合到骨架载体上的效率
按照表1制备另一实验组;然而,在该实验中,将颗粒用戊二醛后处理并指定为编号二(即A2-J2)。随后,根据上述方法,使漆酶结合到颗粒。通过以700x g离心5分钟回收结合有漆酶的颗粒。
负载到聚合物载体上的酶活性结果示于图2中。
该研究表明,纤维格状结构或网状构造可用作具有高蛋白质结合量同时保持蛋白质的功能活性的蛋白质固定载体。
实施例3:使用各种油制造PEI载体的聚合链/纤维格状结构或网状构造骨架
研究乳液的油相变化的影响。通过最初制备2种单独的乳液A和B制造颗粒。
乳液A组成
10ml矿物油、石蜡油或异辛烷(油相)
0.1ml壬苯醇醚-4(nonoxyol-4)(表面活性剂)
0.5ml聚乙烯亚胺(聚胺),(10%m/v水溶液),pH 11
使用磁力搅拌器以500rpm在25℃搅拌30min。
乳液B组成
10ml油相(同上)
0.1ml壬苯醇醚-4(nonoxyol-4)(表面活性剂)
0.5ml戊二醛,(25%m/v,等级II),
使用磁力搅拌器以500rpm在25℃搅拌30min。
其后,将乳液A迅速加入到乳液B中并另外搅拌一小时(700rpm)。通过离心(3000x g,Sorvall台式离心机)10分钟接着用10ml体积的去离子水洗涤重复6次来从乳液中回收颗粒。洗涤后,用去离子水将最终的颗粒重悬浮到20ml,一半通过冷冻干燥被干燥。同时将湿的颗粒和干燥的颗粒进行粒度分布分析(Malvern Mastersizer 2000)。为了研究附聚作用的存在,在内嵌声处理(in-line sonication)之前、之中和之后,测定粒度。还测定冷冻干燥后的回收的质量。
结果
测定用不同油相(总体积各为20ml)制造的颗粒的回收的质量,用矿物油、石蜡油和异辛烷回收的颗粒的质量分别为111mg、90mg和79mg。比较在各种油相中制造的未经声处理的湿的颗粒与干的颗粒,显示对于矿物油和石蜡油样品,干燥后,平均粒度增加(图3)。尽管进行干燥步骤,在异辛烷中制造的颗粒保持相对不变。内嵌声处理和预声处理显示了在矿物油和石蜡油中制造的干燥颗粒的粒度分布的大幅度降低,说明干燥后颗粒附聚(图3),但可通过声处理分离。在矿物油和石蜡油中制成的湿的颗粒的粒度分析还显示,用声处理对颗粒进行处理其平均粒度降低,尽管比用干燥颗粒的程度小(图3)。在异辛烷中制造的颗粒不论干燥或声处理保持相对不变。
总之,可以使用各种油相来制造颗粒。可以使用不同的油相(据推测其影响乳液液滴大小)以及各种后处理技术(如干燥或声处理)来巧妙地控制它们的大小。
实施例4:使用多种表面活性剂制造PEI载体的聚合链/纤维格状结构或网状构造骨架
在颗粒的合成中,表面活性剂的种类可能具有影响。对其进行了研究。
除了仅将矿物油用作油相并变化表面活性剂的类型之外,根据实施例3制备颗粒。
结果
测定在矿物油(总体积为20ml)中用多种表面活性剂(壬苯醇醚-4、CHAPS和Triton X-10)制造的颗粒的回收质量0分别为111mg、72mg和92mg。在使用CHAPS和Triton X-100时,用不同的表面活性剂制造的颗粒干燥后显示没有实际意义上的尺寸差异(图4)。用壬苯醇醚-4作为表面活性剂制造的颗粒干燥后粒度增加了大约50%(图4)。此外,声处理后的尺寸分析显示,用全部测试的表面活性剂制造的颗粒的粒度持续减小。在已将颗粒进行声处理后,在干燥之前或之后颗粒的粒度分析是相似的。
总之,可以使用多种表面活性剂制造颗粒。而且,可用多种表面活性剂和后处理巧妙地控制粒度。
实施例5:用多种多醛作为聚合物交联剂的颗粒的合成
在颗粒的合成中使用的交联剂醛可以是多种多样的。因此,比较作为交联剂的戊二醛、葡聚糖醛和己二异氰酸。
除了以下情况:一种情况用葡聚糖醛(1ml的15mg/ml)代替戊二醛;另一种情况用0.5ml己二异氰酸酯(25%v/v)代替戊二醛,按照实施例3的方法制造颗粒。
向5ml颗粒悬浮液中加入6ml的5mg.ml-1在Tris-Cl缓冲液(0.05M,pH8.0)中的纯化的Candida antarctica脂肪酶B(CALB),将其在25℃轻轻搅拌1小时。然后,在4℃将悬浮液离心并用10ml缓冲液洗涤两次。然后将悬浮液离心并且将颗粒状物再悬浮于10ml Tris-Cl缓冲液中。使用丁酸对硝基苯酯测定悬浮液(10μl)。为了比较,使用基于丁酸对硝基苯酯的水解的测定和其随后的分光光度测定法分析,还测定10μl的0.5mg.ml-1的在Tris-Cl缓冲液(0.05M,pH 8.0)中的纯化的Candida antarctica脂肪酶B(表3)。
脂肪酶活性测定
脂肪酶的活性影响对硝基苯基酯(丁酸对硝基苯酯(PNPB))至对硝基酚和丁酸的水解。对硝基酚的释放产生黄色(用UV/Vis分光光度计在410nm测量)。重复三次测定活性。溶液的制备如下:溶液A包含溶于8ml丙-2-醇中的酶底物;而溶液B包含267mg溶于50mM Tris缓冲液(pH 8.0)中的去氧胆酸钠,接着溶解66.7mg阿拉伯胶。使用PowerWave microtitre酶标仪(BioTekInstruments),用240μl的上述溶液的1∶10(A∶B)混合物和10μl的固定化脂肪酶悬浮液溶液或游离酶,在25℃进行动态分析。
结果
表3:用多种醛交联剂制成的颗粒的比较-CALB的活性。
尽管没有使该方法最优化,但是其显示,使用一定范围的多醛化合物可以产生颗粒。
这种物质可以在0.45μm过滤器(Sartorius)上被回收并再使用,因为在重复利用5次以上时,戊二醛颗粒具有7.05U.ml-1的平均值,或者具有最初活性的81%。
使用来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens(PFL))的脂肪酶进行相似的实验。酶活性的测定使用丁酸的对硝基苯基酯(PNPB)和棕榈酸的对硝基苯基酯(PNPP)作为底物。
表4:用多种醛交联剂制成的颗粒的比较-PFL的活性
因此,可以使用多种醛来同时提供用于形成颗粒的有效交联和将蛋白质交联到颗粒上的官能团。交联剂的选择可以通过酶变性的程度或颗粒与底物和产物的可及性的程度影响酶的活性。基于酶和反应底物可以选择最佳试剂。
实施例6:使用双官能环氧化物交联剂制造颗粒
可以用其它的如双环氧化物(例如1,4-丁二醇二环氧甘油醚)的其它交联剂代替颗粒合成中使用的交联剂醛。将其以0.5ml纯度为50%、25%或12.5%v/v溶液加入(替代戊二醛)到交联剂乳液(B)中并且在40℃反应(按照实施例3)2小时。通过离心(3000x g,Sorvall RT7台式离心机)10分钟接着用10ml体积去离子水洗涤重复6次从乳液中回收颗粒。洗涤后,将最终的颗粒再悬浮到20ml的去离子水中。用12.5%或25%v/v环氧化物溶液如上制备的那些外形上几乎全部一致,而使用纯度为50%环氧化物形成的颗粒大且弥散。
使用CALB(按照前面的实施例)研究蛋白质的结合,使其透析过夜并在轻轻搅拌下与基于环氧化物的颗粒(用12.5%v/v环氧化物溶液如上制备)反应一小时。在如实施例5中所述将脂肪酶结合颗粒回收洗涤后,分析酶活性。用PNPB作为底物进行全部分析。
结果
使用丁二醇二环氧甘油醚作为交联剂导致形成直径大约为0.1mm的白色颗粒。然而,该颗粒外形上有点不规则,说明在交联或随后的清洁步骤的颗粒存在附聚。
在酶的存在下,将用12.5%v/v环氧化物溶液制造的颗粒温育过夜。这些颗粒产生的活性为0.28U.ml-1。这说明,使用环氧化物交联剂可以制造颗粒。
实施例7:在单乳液中制造的PEI载体的聚合链/纤维格状结构或网状构造骨架
可以根据需要调节用于颗粒形成的方法。例如,可以通过应用单乳液形成颗粒。
然后可以通过双注射装置注射进入混合室,在水相中同时混合聚合物和交联剂。最简单形式的这种装置可由在同一点注射到共用管的两个注射器组成。其可被直接注射到油相。例如,使用20ml矿物油(其中溶解0.2ml壬苯醇醚-4大约5分钟)和以500rpm使用磁力搅拌,评价这种设备。一个注射器包含0.5ml PEI(10%)而另一个包含0.5ml戊二醛(20%,等级II)。直接向矿物油中同时压注射器。将生成的乳液搅拌1小时而后按照实施例3回收颗粒。重复三次进行实验。将颗粒分成2等份,一份冷冻干燥(Virtis)并再悬浮至最初体积,接着用于粒度分布(Malvern Mastersizer 2000)分析。,样品用于回收质量分析。
结果
计算使用单乳液制造的颗粒的回收质量为152±12mg,比使用2乳液策略(指实施例3)获得的高大约1.4倍。
使用单乳液形成颗粒是可能的并且使用当前的制造技术使可复现的(图5)。发现颗粒的粒度分布比使用双乳液形成的那些大(图5)。显示单乳液获得的湿的和干的颗粒的尺寸分布比双乳液实验获得的那些尺寸大50~70%(图3)。
实施例8:PEI载体的网状构造或聚合链/纤维的格状结构的大规模制造
目标是10倍线性扩大颗粒制造规模并评价粒度。除了第二批包含10倍数量的所需各个组分,根据实施例3中所述的标准制造方法制备分开的两批颗粒。根据比例按照实施例3对两批进行处理以回收颗粒。
结果
计算在20ml和200ml体积的矿物油中制造的颗粒的回收质量分别为0.111g和1.11g,准确地差10倍。可以在20和200ml体积的矿物油制造颗粒,较大规模制造的颗粒的粒度比在20ml规模获得的那些的粒度始终仅小一点(图6)。有趣的是,与在较小规模的干燥颗粒相比,在较大规模制造的未经声处理的干燥颗粒的尺寸小大约50%(图6)。
基于回收质量和粒度分析,在标准条件下的颗粒的制造可放大至少10倍。
实施例9:PEI载体的网状构造或聚合链/纤维的格状结构在固定一定范围的酶类方面的应用
目的是使不同的酶结合到颗粒骨架,并计算其结合百分比以及保持的酶活性。
使用根据实施例3制造的颗粒。研究的酶为漆酶(Novozymes 51009,Myceliopthora thermophilia)、葡萄糖氧化酶(Seravac Pty Ltd,Aspergillus niger)和脂肪酶(CALB,Novozymes Candida antarctica)。对于每个实验,将5mg的各酶(0.5ml,10mg.ml-1)结合到14mg的颗粒(0.5ml,28mg.ml-1)上,伴随轻轻摇动进行2小时(25℃)。使用Allegra X22R离心机(2000x g)将每种样品离心10分钟。将颗粒连续洗涤6次,每次用2ml去离子水。混合的上清液部分用于总蛋白质分析。在含有和不含有特定底物(作为潜在保护物)的情况下各自进行各酶结合的实验。对于漆酶,市售介体Denillite II Assist(Novozymes)为潜在保护物(50μl的100mg.ml-1,pH调节至6.8),对于葡萄糖氧化酶,潜在保护物为葡萄糖(50μl的10%m/v葡萄糖一水合物),以及对于CALB,使用2-异丙基-5-甲基环己醇(薄荷醇)的8非对映异构混合物(50μl)。将颗粒再悬浮到2ml的去离子水中。测定颗粒的各酶活性。全部测定重复三次进行。
总蛋白质
使用Bio-Rad总蛋白质测定试剂盒(Cat.No.:500-0006)进行总蛋白质测定,各自使用各酶作为标准。
使用在100mM琥珀酸盐-乳酸盐缓冲液pH 4.5中的1mM 2,2’-连氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)作为底物测定漆酶活性。在420nm测量溶液的光密度。通过将20μl的样品加入到180μl的ABTS试剂中进行这些测定。活性测定如下:在25℃温育下使用PowerWave HT(BiotekInstruments)在420nm分光光度计测量。
葡萄糖氧化酶
使用辣根过氧化物酶(HRP)间接氧化邻联二茴香胺测量葡萄糖氧化酶(GOX)活性。根据Bergmeyer等人,1988提出的方法进行测定。制备下列试剂:试剂A,0.1M磷酸钾缓冲液,pH 7,包含邻联二茴香胺·2HCl(0.006%);试剂B,D-葡萄糖的10%水溶液(使用前进行变旋作用1h);试剂C,60Uml-1HRP水溶液。在测定葡萄糖氧化酶前立即分别以24∶5∶1的比例混合试剂A、B和C。该反应包含0.3ml的反应试剂并且通过加入10μl的样品开始测定。在25℃在436nm(PowerWave HT Microtitre酶标仪)动态测量反应。葡萄糖氧化酶活性的一个单位定义为在25℃和pH 7下每分钟使1微摩尔β-D-葡萄糖催化转变成葡萄糖酸内酯和H2O2的酶的量。
脂肪酶
脂肪酶的活性影响将将对硝基苯基酯水解成对硝基酚和脂肪族羧酸。对硝基酚的释放产生黄色,其用UV/Vis分光光度计在410nm测量。使用两种对硝基酚酯,对硝基苯基乙酸酯(PNPA)和对硝基苯基丁酸酯(PNPB),并且重复三次测量活性。制备溶液如下:溶液A包含溶于8ml丙-2-醇中的酶底物(11.6mg PNPA或24mg PNPP);而溶液B包含溶于50mM Tris-缓冲液(pH 8.0)中的267mg去氧胆酸钠接着66.7mg阿拉伯胶。使用PowerWave microtitre酶标仪(BioTek)℃,用240μl的上述溶液的混合物和10μl的球酶(spherezyme)或游离脂肪酶溶液在25℃进行动态分析。
结果
所有的用于结合到颗粒上的测试的酶的蛋白质负载为30%到36%(表5)。
表5:各种酶与颗粒骨架载体的结合效率
*-在酶的固定化期间加入底物以保护活性位点(参照上述方法)。
与,包含薄荷醇底物有利地保持CALB对PNPA的活性比无底物的大约高30%的活性(83%)(图7)。
漆酶、葡萄糖氧化酶和CALB都成功地结合到颗粒上并保持活性,说明一定范围的蛋白质可以以高蛋白质负载下有效地结合到颗粒上。此外,其它的酶(如辣根过氧化物酶、蛋白酶和脱氢酶)也显示了结合到颗粒上(见下列实施例)。
实施例10:PEI载体的聚合链/纤维的网状构造或格状结构;结合有多种酶的颗粒
设计实验以表明对于两种酶,超过1种酶可结合到颗粒骨架上并保持活性。选择葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶体系。
根据实施例3制造颗粒。研究的酶为葡萄糖氧化酶(Seravac Pty Ltd,Aspergillus niger)和辣根过氧化物酶(Serevac Pty Ltd)。例如,将5mg(0.5ml,10mg.ml-1)葡萄糖氧化酶和10mg的辣根过氧化物酶(1ml,10mg.ml-1)结合到28mg(1ml,28mg.ml-1)的颗粒骨架上,伴随轻轻摇动2小时(25℃)。使用Allegra X22离心机(200x g)将各样品离心10分钟。将颗粒连续洗涤6次,每次用2ml去离子水。混合的上清液部分用于总蛋白质分析。根据实施例9中的葡萄糖氧化酶的测定方法测定颗粒的活性,但是在测定试剂中不包含辣根过氧化物酶。
结果
葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶被成功地结合到颗粒骨架上并且能够以3μmol.min-1的速率转化葡萄糖(表6)。如测定检测的活性,这说明葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶都被结合并且有活性。因此,可以使用颗粒结合超过一种酶并且其中两种酶都保持活性。
表6:葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶双酶颗粒的结合效率和活性
实施例11:使用多种干燥方法制造的PEI载体的聚合链/纤维的网状构造或格状结构
目的是制造颗粒并随后使用不同的方法(如冷冻干燥、真空和丙酮干燥)使它们干燥。
如在实施例1中所述的标准条件下制造颗粒。一旦洗涤完成,通过冷冻干燥(Virtis Genesis冷冻干燥器)、使用使用真空浓缩器(配备有Savant RVT100冷阱Savant SpeedVac SC110)的真空干燥、或通过用丙酮脱水接着在25℃空气中干燥12小时干燥颗粒。由于附聚作用,丙酮干燥的颗粒不能在水性介质中被再悬浮,并因此不进一步考虑。
然而,真空干燥和冷冻干燥都是干燥颗粒的成功技术并且能够随后用于一系列的酶和蛋白质的附着(表7)。向5ml的颗粒悬浮液中加入在Tris-Cl缓冲液(0.05M,pH 8.0)中的6ml的5mg.min-1纯化的酶,在25℃轻轻搅拌1小时。然后在4℃下将悬浮液离心并用10ml缓冲液洗涤两次。然后,将悬浮液离心并在10ml Tris-Cl缓冲液(0.05M,pH 8.0)中再悬浮颗粒状物。使用Malvern Mastersizer测定粒度。
结果
表7:多种干燥处理后的平均粒度。
该实施例显示,用干燥,尤其用冷冻干燥,不会有很大程度的附聚作用。
实施例12:
在多种pH下由PEI制备的聚合链/纤维的载体的网状构造或格状结构与漆酶结合特性
测定结合后干燥对漆酶性质的作用或结合的颗粒对酶特性的作用。
根据实施例3中所述的标准制造方法制造颗粒,除了pH为11PEI(10%)制品以外,还评价了调节到pH为8的制品。其后,除了使1ml的漆酶(Novozyme 51004,50mg.ml-1)与6.25ml颗粒(16mg.ml-1)反应之外,按照实施例9所述的方法将漆酶固定到骨架上,从而每100mg的颗粒结合50mg的漆酶。用12.5ml去离子水洗涤漆酶结合颗粒并将其再悬浮到20ml的去离子水中。将颗粒分成两等份(每份10ml),将其样品冷冻干燥用于回收质量测定,并用于研究湿的和干的漆酶结合颗粒的特性。将干燥样品再悬浮到最初体积的去离子水中。所有测定重复三次。
用漆酶作为蛋白质标准,使用Bio-Rad总蛋白质测定试剂盒(Cat.No.:500-0006)测定漆酶上清液样品的总蛋白质。根据实施例9测定漆酶活性。
结果
通过冷冻干燥干燥漆酶结合颗粒显示,在pH为11下用PEI制造颗粒时达到了较高的回收质量(表8),尽管在pH为8下使用PEI制造的颗粒结合更多的漆酶蛋白质。使用pH为8PEI(16%)制造的未经冷冻干燥的颗粒达到了对ABTS的最佳活性维持,但是冷冻干燥后相同样品仅保持了3%的漆酶活性。注意到,使用pH为8PEI制造的颗粒在干燥后难以再悬浮,因此可能附聚,从而使表面积体积比(surface to area ratio)减小,因此由于在底物和产物上的扩散限制而使活性降低。对于在pH为11使用PEI产生的颗粒未观察到对活性的相同影响(表8)。
表8:在使用和不使用冷冻干燥的情况下在多种PEI pH值下制造的漆酶结合颗粒的结合效率和活性维持。
该实验表明,用在不同的pH下PEI可以制备颗粒,以及这样改变了颗粒与酶的结合性质。
实施例13:在pH为8或11下制造PEI载体的聚合链/纤维的网状构造或格状结构并冷冻干燥,漆酶与其结合的稳定性。
测定漆酶结合到在pH为8和11制造并冷冻干燥的PEI载体的聚合链/纤维的网状构造或格状结构的热稳定性和pH稳定性(如实施例12所述制造的漆酶结合颗粒)。
最适温度
使用在100mM琥珀酸盐-乳酸盐缓冲液(pH 4.5)中1mM ABTS作为底物进行游离漆酶和漆酶结合颗粒(在等值的蛋白质负载)的最适温度分布。将样品(100μl)加入到1.9ml的预平衡过的底物中以在水浴中校正温度。使用配备有Peltier温度控制器的DU800分光光度计(Beckman-Coulter,420nm)进行测定。将分光光度计设定为目标温度并在加入在水浴中平衡过的试剂之前使比色杯平衡5分钟。
pH稳定性
使用100mM琥珀酸盐-乳酸盐缓冲液(pH 4.5)中的ABTS(1mM)进行游离漆酶和漆酶结合颗粒的pH稳定性(在等值的蛋白质负载)。在pH 2.5、3和6下在Britton-Robinson通用缓冲液中温育各种漆酶样品。周期性地取出样品(20μl)并在25℃温育的情况下使用PowerWave HT(Biotek Instruments)在420nm分析(230μl测定试剂)。用于该实验的6小时的时间点示于下图9中。
结果
结果示于图8A、8B和9中。
在70℃游离(未固定)漆酶和结合到颗粒的漆酶活性最佳。然而,在90℃下与制备用于分析的样品的时间内的游离漆酶(0%活性)相比,漆酶结合颗粒显示了提高的热稳定性(55-65%活性)。在使用干燥颗粒时还有较小提高,说明采用干燥是有利的。这可能是由于移除水时形成了更多的蛋白质-颗粒连接。这反过来会增加蛋白质或酶的多点共价结合,已知其提供了更大的稳定性,例如提高的热稳定性[Improvement of enzyme activity,stability andselectivity via immobilization techniques.Mateo,C.,Palomo,J.M.,Fernandez-Lorente,G.,Guisan,J.M.,Fernandez-Lafuente,R.2007 Enzyme andMicrobial Technology 40(6),pp.1451-1463]。
还测定了在pH为2.5、3和6下的漆酶结合颗粒和游离酶的pH稳定性。在pH为2.5和pH为3下,所有漆酶结合颗粒样品保持了80-110%活性,而游离酶分别已失去了大约70和40%活性(图9)。因此固定提供了提高的pH稳定性。6小时后在pH为6下包括游离酶的所有样品都是稳定的。
因此在PEI载体的聚合链/纤维的网状构造或格状结构的颗粒上固定酶在极限pH下可提供额外的稳定性。
实施例14:固定到PEI载体的聚合链/纤维的网状构造或格状结构的酶的最适pH改变。
酶具有对于活性的最适pH。在一些情况下,酶的最适pH与反应的其它方面的最适pH不同。例如,酶底物/反应物可在另一pH下最佳溶解。另一个例子是在多步一锅法反应中使用超过一种酶,而其最适pH可能不同。因此,如果在固定期间酶的最适pH改变,这将具有商业和技术优势。因此,在固定和没有固定到颗粒上的情况下测定漆酶的最适pH。
酶测定
漆酶试剂包含调节到目标pH值的在50mM Britton-Robinson通用缓冲液中的1mM愈创木酚(Davies TJ,Banks CE,Nuthakki B,Rusling JF,France RR,Wadhawana JD,Compton RG.2002.Surfactant-free emulsion electro synthesis viapower ultrasound:electrocatalytic formation of carbon-carbon bonds.GreenChem.4:570-577)。通用缓冲液用于确保存在相同的缓冲系统并且能够在宽的pH范围内有效的缓冲。用5200M-1.cm-1的消光系数在450nm重复三次进行测定。通过实验测定固定到载体网状构造或格状结构的颗粒的漆酶以及游离酶的图谱。使用PowerWave HT Microtitre酶标仪进行测定。酶的一个单位定义为每分钟使1μmol底物氧化所需的酶的数量。
pH分布改变
因为已经知道在固定期间pH分布发生改变,所以对结合到纤维格状结构或网状构造骨架载体的漆酶进行pH分布测定。按照实施例3制造颗粒。由于戊二醛后处理的作用,还研究了戊二醛和PEI浓度的改变对最适pH改变的影响(实施例2,A2-J2)。
结果
结果示于图10A、10B、11A和11B中。
对于pH分布改变通常的趋势是向着中性到弱碱性pH。该实施例显示,通过固定到颗粒上可以改变酶的pH分布。
实施例15:PEI聚合链/纤维的网状构造或载体格状结构的多种官能性。
颗粒骨架的官能性可被改变从而显示蛋白质的基于疏水、离子和亲合结合。
通过使包含0.1ml壬苯醇醚-4和0.5ml聚乙烯亚胺溶液的10ml矿物油的乳液(pH为11)和包含0.1ml壬苯醇醚-4和0.5ml戊二醛(Sigma等级II)的10ml矿物油的乳液混合制造颗粒。在混合前,以500rpm搅动两种乳液30分钟。以500rpm搅动该混合的乳液30分钟。这样提供了未改性的如前所述通过离心回收的颗粒。
离子结合
通过用戊二醛(200μl的25%水溶液)官能化(用3x 20ml的去离子水洗涤)接着通过用乙二胺(1ml,0.33M)处理以与游离醛残基反应而在以上未改性颗粒上产生离子基团(在室温下周期性反转1小时)。将颗粒用过量的去离子水重复洗涤并通过在2000x g下离心10分钟回收。在4℃将漆酶(2.5mg)与5mg的改性颗粒温育30分钟,用周期性反转以确保适当混合。为了测定离子结合,将1.0M NaCl(作为抗衡离子)加入到漆酶结合颗粒中并通过反转混合5分钟。通过离心回收颗粒(如上所述)并测定活性。
疏水结合
通过将未改性颗粒(5mg)与环氧辛烷(0.1ml)在25℃温育4小时而将疏水基团加入到颗粒上。然后将其用过量的水反复洗涤并且通过离心回收(如上所述)。如通过在280nm测量蛋白质吸光度所测定的,疏水结合的蛋白质(荧光假单胞菌脂肪酶,5mg)可通过加入表面活性剂(1%脱氧胆酸盐)而被移除。
亲合结合
蛋白质的亲合结合示于实施例17中。
结果
离子结合
45%的加入的漆酶被结合到改性颗粒上(通过Bio-Rad蛋白质测定染料试剂方法500-0006所测定的,按照制造规程)。对于该45%的漆酶,通过加入作为抗衡离子的盐(1.0M NaCl)可以移除76.9%的漆酶。与未改性的颗粒相比,其仅结合了14%的漆酶,而通过盐溶液仅可移除其52.6%。
疏水结合
将蛋白质结合到改性颗粒上。通过加入脱氧胆酸盐移除大约28%的改性颗粒结合的蛋白质,其为结合的酶的疏水结合部分。
该实验显示,颗粒基质的官能性可被改性以实施蛋白质结合到颗粒基质的可选机制。
实施例16:介体和辅助因子的共陷入
包含的辅助因子(或改性的辅助因子或介体)使交联后辅助因子与酶供陷入。通过选择方法条件可以设置颗粒的多孔性以保持辅助因子,同时使如反应物的小分子(例如酶底物、协同底物和联产品)进出。
氨基酸脱氢酶(AADH)、甲酸脱氢酶(冷冻干燥)购自Biocatalytics(USA)。PEG 20000-NADH得自Jülich Fine Chemicals(德国)。矿物油得自Castrol(德国)。壬苯醇醚-4得自ICI(英国)。戊二醛(Glut)(25%水溶液)得自AcrosOrganics(比利时)。甲酸得自Merck(德国)。乙烯二胺(EDA)、乙烯亚胺(PEI)、3-甲基-2-氧代丁酸(2-酮缬氨酸)、DL-缬氨酸、NADH和NAD+得自Sigma-Aldrich。
通过用戊二醛交联聚乙烯亚胺(PEI)制造聚合颗粒。通过在含有200μl的预溶解的壬苯醇醚-4(在100ml烧杯中用20mm磁力搅拌器以500rpm磁力搅拌20分钟)的40ml矿物油中乳化800μl的10%PEI制备聚乙烯亚胺的一种油包水乳液。相似地,使用20%戊二醛溶液制备另一种油包水乳液。通过将戊二醛乳液加入到快速搅拌的聚乙烯亚胺乳液(700rpm)中混合两种乳液。在连续搅拌下使其反应30分钟。
通过在2000x g离心10分钟(Sorvall,RT7)回收聚合颗粒。将聚合物颗粒用45ml去离子水洗涤四次。按照前面的实施例通过离心进行洗涤过程中的回收。将产物再悬浮到10ml体积。将该溶液(1ml)等分到eppendorf管中并用于随后的实验。
制备含有10mg.ml-1的各种蛋白质的溶液(甲酸脱氢酶和缬氨酸脱氢酶)。随后混合这两种溶液(每种溶液200μl)并与聚合材料温育。将该溶液通过反转混合并使其在轻轻搅动下反应30分钟。使用下述方法对含有固定酶的颗粒进行活性测定分析。
将颗粒用去离子水洗涤,并如上所述回收。将颗粒与100μlPEG20000-NADH(得自obtained from Jülich Fine Chemicls of Jülich,德国)混合并在室温下轻轻搅动温育2小时。随后将该溶液冷冻干燥。将冷冻干燥产物用2ml的水洗涤两次并通过离心回收。使颗粒再悬浮在1ml的100mM pH为8.0的Tris-Cl缓冲液(其含有100mg赖氨酸)中从而使颗粒上的过量醛官能性淬灭,并在室温下温育1小时。将颗粒用2ml的Tris-Cl缓冲液(20mM,pH 8.0)洗涤五次。然后使用1ml的再循环试剂对将该样品进行循环能力测试。在每个循环之间将样品用2ml体积的水洗涤三次。通过如下所述的TLC和HPLC分析样品的缬氨酸生成。
使这些颗粒反应并再循环到用于随后反应的新鲜反应介质中。
再循环试剂
用于生成缬氨酸的PEG-20000-NADH再循环试剂由50mM甲酸盐(来自pH为8.0的1M甲酸钠原液)、50mM pH为8.0的Tris-Cl缓冲液、50mM酒石酸铵和10mM的2-酮缬氨酸组成。配制该试剂组合物以确保只有在PEGNADH被再循环的情况下产生缬氨酸。
分析方法
在F254硅凝胶板(Merck)上进行氨基酸TLC。使用的流动相为乙醇和冰醋酸(9∶1)。使用在丙酮中的2%的水合茚三酮溶液使氨基酸(缬氨酸)染色。在120℃加热该板直到缬氨酸(Rf0.49)和氨(Rf0.31)的适合的溶解为清楚可见的。
使用用于测定氨基酸的OPA衍化方法(邻苯二醛试剂)进行HPLC。样品在线衍生。包含缬氨酸标准。
结果
反应和再循环根据TLC数据是成功的,形成了全部连续颗粒催化反应的缬氨酸点。使用HPLC OPA方法证实并定量了阳性TLC结果,在六个连续16小时反应循环中颗粒分别将48、35、59、43、33和29%的10mM酮缬氨酸转变成缬氨酸。
该实施例显示,在酶-颗粒基质中陷入辅助因子使采用辅助因子的酶保持官能性并使陷入的辅助因子再循环。
实施例17:用PEI载体的聚合链/纤维的网状构造或格状结构对抗体的结合。
该实施例显示了抗体和/或抗原在颗粒上的结合。抗体和抗原的结合显示了通过固定抗体或抗原使颗粒亲合结合蛋白质的适合性。此外,显示了颗粒对诊断应用(如ELISA)的可能性。
聚乙烯亚胺(P3143;50%水溶液)、戊二醛等级II(G6257;25%水溶液)、矿物油(M8410)、抗原小鼠白细胞介素2(I0523-20UG;SL06092)和来自Streptomyces avidinii的标记酶链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶(S5512-250UG;SL05181)来自Sigma-Aldrich。一抗(大鼠的抗小鼠白细胞介素2(IL-2)MAB(I7663-27K1;L6080801))和二抗(大鼠的抗小鼠白细胞介素2(IL-2)生物素MAB(I7663-27M5;L6080803))来自USBiologicals。氯化钠(S7653)、二代磷酸钠(S0876)、一代磷酸钠(S0757)、过氧化氢(21676-3)、吐温20(P9416)和氢氯酸(H1758)来自Sigma-Aldrich。2,2’-连氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(10102946001)来自Roche。
颗粒制备
根据实施例2制备交联的聚乙烯亚胺颗粒,样品G。试剂的调节仅为在稀释到10%之前用HCl将聚乙烯亚胺溶液调节至pH 9。直接用标度因子4实验,从而需要20ml矿物油(其含有用800μl的各种乳化反应物溶解的200μl的NP4)。将生成的交联聚乙烯亚胺颗粒用6x 50ml的去离子水洗涤并在各洗涤步骤之间通过在5000x g下离心5分钟从矿物油中回收。随后将颗粒状物颗粒用去离子水再悬浮到10ml体积并将500μl等份用于实验A~F。
蛋白质的固定
根据下表9用字母对实验编号。按实验下栏中所示的顺序进行各种蛋白质的加入(表9)。在4℃在去离子水中进行用于各实验的第一蛋白质成分的固定1小时(顺序加入步骤1,表9),每10分钟反转样品以确保充分混合。将颗粒用3x 1ml的去离子水洗涤并如上所述进行回收。
在含有150mM氯化钠的10mM磷酸盐缓冲液pH 6.8(结合缓冲液)中进行随后的蛋白质结合,蛋白质处理(表9,行2~5)。在37℃进行结合30分钟,每5分钟反转以确保充分混合。在结合各种蛋白质后,使用温和搅动(IKAVortex Genius,设置2)10分钟,将样品用2x 1ml的含有0.05%吐温20的结合缓冲液洗涤以限制非特异性蛋白质的相互作用。通过在5000x g离心5分钟实现各连续步骤间的颗粒回收。对各种蛋白质处理步骤加入的蛋白质的数量(表9)如下:白蛋白-5mg;大鼠的抗小鼠白细胞介素2MAB(A-IL2-MA)-50μg;大鼠的抗小鼠IL2MAB生物素(B-A-IL2-MA)-25μg;白细胞介素2(IL-2)-2μg;链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(strep-perox)10μg。将这些数量的蛋白质在1ml的结合缓冲液中制备。
表9:实验A~F的蛋白质结合的顺序。
测定
过氧化物酶测定试剂包含pH为6.8的10mM磷酸盐缓冲液中(具有150mM氯化钠)的2mM ABTS和2mM过氧化氢。在30℃在420nm测量分析重复三次进行,每孔有200μl的试剂和50μl的颗粒悬浮液。
结果
在实验B中评价抗体与抗原的结合(图12)。该实验显示阳性反应,其表明一抗(A-IL2-MA)与颗粒表面成功结合,抗原(IL-2)、二抗(B-A-IL2-MA)和链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶与颗粒继续结合。这类似于在如酶标仪的孔的表面上进行的夹心酶联免疫分析(sandwich ELISA)。实验C显示,抗原可结合到颗粒表面并随后用作抗体结合的识别元件。在与各种对照相比观察时,这些实验显示颗粒可用于结合抗体或抗原。
实验A是显示二抗(B-A-IL2-MA)或链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶与固定有一抗的颗粒的非特异性结合的对照。与B相比,较低的应答说明抗原(IL-2)增强二抗与颗粒的结合。实验D和E是显示在使白蛋白猝灭后一抗(A-IL2-MA)或二抗(B-A-IL2-MA)与颗粒的非特异性结合的对照。实验F包含未处理的交联聚乙烯亚胺颗粒并用作测定对照。
该实施例说明所述颗粒是抗原或抗体适合的固定载体。通过亲合相互作用,我们进一步证明了抗体与抗原的固定,反之亦然。该实施例由此说明了所述载体用于亲合色谱和诊断学(如酶联免疫吸附测定)应用的可行性。
实施例18:向PEI载体的聚合链/纤维的网状构造或格状结构的颗粒中引入磁石。
已证明了在颗粒中包含介体和辅助因子。在该实施例中证明了颗粒中包含磁性颗粒。
颗粒制备
根据以上实施例17制备颗粒,各乳液线性放大到25ml矿物油。乳化前将磁石(250mg)引入到10%聚乙烯亚胺液体溶液(pH为9.0)中。将交联的聚乙烯亚胺颗粒用6个体积的50ml去离子水洗涤并在各洗涤步骤之间在5000x g下通过离心5分钟使其从矿物油中回收。将颗粒状物颗粒随后再悬浮到10ml体积的去离子水中,并通过与500μl的乙烯二胺反应30分钟而进行阴离子交换官能化。将球状物随后用3X 50ml等分的去离子水洗涤并如上所述通过离心回收。将最终的颗粒状物在去离子水中再悬浮到10ml并用于以下白蛋白结合实验。通过对1ml等分的10ml颗粒悬浮液冷冻干燥和称量重复三次测定颗粒的干重。
蛋白质结合和定量
通过在磁架(磁性分离架-Promega;Z5332)上磁性分离回收以上等分中的颗粒并移除液体。用Tris-Cl缓冲液(pH 7.4)(50mM)2x 2ml洗涤使颗粒平衡。将牛血清白蛋白(BSA)加入到颗粒中至终浓度为20mg.ml-1。使用持续滚动(end-over-end)混合在室温下进行离子蛋白质结合30min。将该混合物置于磁架中以使树脂在反应管的侧壁上保持磁化并从样品中移除液体。将树脂用1ml 50mM Tris-Cl(pH为7.4)洗涤5次并通过上述磁固定物回收。通过加入2个体积的500μl的1M NaCl(于50mM Tris-Cl(pH 7.4)中)从树脂中洗脱离子结合的BSA。
蛋白质定量
按照制造商的说明,使用Quant-iT测定,在Qubit荧光计(Invitrogen)上进行定量洗脱部分的蛋白质(表10)。
结果
表10:白蛋白与包含磁石的颗粒的结合(三次重复数据的平均值)。
结果显示,磁石可被引入到颗粒中并且颗粒的磁性可用于其从液体悬浮液中有效分离。此外,这些结果显示,所述载体可用作有效的离子交换树脂。在实施例中,如果用带正电荷的分子(如胺(乙烯二胺))使颗粒基质改性,则所述颗粒可用作阴离子交换树脂。使用带负电荷的分子(含有羧基的分子)会使其用作阳离子交换树脂。
该实施例进一步提供了通过使磁性颗粒包含在格状结构中的另一回收方法的实例,这会使它们通过应用磁场而被附着。
本发明的颗粒因此包括通过交联剂交联的聚合链或纤维的格状结构,以及靠近和围绕所述链的填隙孔。换句话说,本发明提供了一种纤维互相贯通的网状构造颗粒,优选地,由戊二醛交联的聚乙烯亚胺构成或制成。该颗粒可用作酶的固定化基质。
所述颗粒优选使用乳液型技术和本发明的第二和第三方面的技术制成。使用乳液型技术有利于尺寸控制(例如,颗粒表面积体积比和限定尺寸分布),还有利地允许颗粒的单步合成。该颗粒为固定提供了大的表面积并可适用于,但不限于,大底物和小底物的生物催化。这种酶的固定化基质显示出高固定效率并在固定后具有高的酶活性维持。
树枝状颗粒的纤维性质为酶结合提供了大的内部表面积。同样,当与骨架载体材料(例如PEI本身)相比时,每个酶亚单位的大量可使用的附着点为显著提高蛋白质稳定性提供了机会。这种与松散的格状结构或网状构造组合,由于大的暴露的表面积用于固定并限制了对小底物和大底物的扩散限制,而在加入生物催化剂后具有高活性与重量比。此外,如果其成为固定基质的阻碍,粒度的控制使底物的扩散限制的减小增强。
颗粒的制备方法包括在相同相中在含有或不含有交联剂的情况下使骨架载体或格状结构乳化。优选地,如上所述,使用双乳液体系来制造。在第一乳液中不包含交联剂的情况下,其可溶解在油相中,或者通过混合含有所述交联剂的第二乳液而被加入。
优选的制造方法是使一种乳液中的骨架聚合物(聚乙烯亚胺)和另一种乳液中的至少双官能化学药品(戊二醛)分别乳化。聚合物和交联剂间的自发反应导致纤维格状结构或网状构造,在这种情况下包含的过量的醛官能团,其随后用于通过胺-醛交叉反应性自发地共价连接蛋白与格状结构或载体。这种醛官能性可进一步被外推连接其它化合物,或者具有其它性质,如疏水性,从而使其应用扩大大结合更宽范围的蛋白质,如疏水蛋白质。
将蛋白质固定到基质提高了酶的溶剂稳定性、热稳定性和pH稳定性。通过在将蛋白质固定到树枝状载体后干燥该载体可以进一步提高这种稳定作用。相信,这种干燥减少了可交叉反应的化学官能团的靠近,从而引起蛋白质-骨架和骨架-骨架的进一步自发的化学偶合。此外,可以在干燥过程中将添加剂陷入到基质中,这可用于控制孔径或官能分子或添加物的陷入。用本发明的颗粒使高蛋白质负载成为可能,即较大数量的蛋白质可被负载入小颗粒体积内。
Claims (6)
1.一种由乳液得到的颗粒,其包括通过交联剂交联的聚乙烯亚胺链的格状结构、靠近和围绕所述链的填隙孔以及在所述格状结构上的官能团,并且蛋白质和/或改性的蛋白质能够与所述官能团反应从而使蛋白质和/或改性的蛋白质结合到所述格状结构上并因此被固定。
2.根据权利要求1所述的颗粒,其中,所述官能团存在于所述聚乙烯亚胺上,通过共价结合将蛋白质和/或改性的蛋白质结合到聚乙烯亚胺上。
3.根据权利要求1所述的颗粒,其包括至少一种通过官能团结合到所述格状结构上从而被固定的蛋白质和/或改性的蛋白质。
4.根据权利要求3所述的颗粒,其中,多种不同的蛋白质和/或多种不同的改性的蛋白质被固定于其中。
5.根据权利要求1所述的颗粒,其中,所述颗粒包含陷入所述格状结构内的添加物。
6.根据权利要求5所述的颗粒,其中,所述添加物选自辅助因子、改性的辅助因子、化学介体和磁性物质中。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109320972A (zh) * | 2018-09-27 | 2019-02-12 | 江南大学 | 一种多孔聚乙烯亚胺微球的制备方法 |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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CN103111247A (zh) * | 2013-02-01 | 2013-05-22 | 江南大学 | 一种聚胺基微球的制备方法 |
MX2017013620A (es) * | 2015-04-24 | 2018-07-06 | Colgate Palmolive Co | PARTíCULAS DE PROTEíNA POROSAS COMO PORTADORAS PARA ACTIVOS. |
JP2018519838A (ja) * | 2015-07-15 | 2018-07-26 | ザイムトロニクス エルエルシーZymtronix, Llc | 自動バイオナノ触媒製造 |
KR101863289B1 (ko) * | 2016-06-01 | 2018-06-01 | 한국생산기술연구원 | 이산화탄소 흡착제용 글루타르알데히드 가교된 pei 입자의 제조방법 및 이에 따라 제조한 글루타르알데히드 가교된 pei 입자 |
US20210072255A1 (en) | 2016-12-16 | 2021-03-11 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | System and method for protein corona sensor array for early detection of diseases |
US20180346648A1 (en) * | 2017-05-30 | 2018-12-06 | International Flavors & Fragrances Inc. | Branched polyethyleneimine microcapsules |
CN109355277A (zh) * | 2018-11-12 | 2019-02-19 | 南京启佑生物科技有限公司 | 一种交联固定化脂肪酶-高分子材料复合物的制备方法及其应用 |
IL290257B2 (en) | 2019-08-05 | 2023-11-01 | Seer Inc | Systems and methods for sample preparation, data generation and corona protein analysis |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0534057A1 (en) * | 1991-09-24 | 1993-03-31 | Japan Synthetic Rubber Co., Ltd. | Process for the preparation of crosslinked polymer particles |
EP1647559A1 (en) * | 2004-10-14 | 2006-04-19 | Tosoh Corporation | Crosslinked (meth) acrylamide particles, process for their production and their use |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4141857A (en) * | 1976-04-30 | 1979-02-27 | Uop Inc. | Support matrices for immobilized enzymes |
US4415663A (en) * | 1982-08-25 | 1983-11-15 | Uop Inc. | Support matrix for immobilized enzymes |
US4713333A (en) * | 1985-09-23 | 1987-12-15 | Miles Laboratories, Inc. | Immobilization of biocatalysts on granular diatomaceous earth |
DE3728772A1 (de) * | 1987-08-28 | 1989-03-09 | Hoechst Ag | Enzymreaktor mit polymerfixiertem cofaktor |
US6689615B1 (en) * | 2000-10-04 | 2004-02-10 | James Murto | Methods and devices for processing blood samples |
-
2008
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-
2015
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0534057A1 (en) * | 1991-09-24 | 1993-03-31 | Japan Synthetic Rubber Co., Ltd. | Process for the preparation of crosslinked polymer particles |
EP1647559A1 (en) * | 2004-10-14 | 2006-04-19 | Tosoh Corporation | Crosslinked (meth) acrylamide particles, process for their production and their use |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109320972A (zh) * | 2018-09-27 | 2019-02-12 | 江南大学 | 一种多孔聚乙烯亚胺微球的制备方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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