CN112029756B - 一种磁性固定化脂肪酶催化合成植物甾醇酯类化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种纳米复合磁性材料固定化脂肪酶制备植物甾醇酯的方法。在磁性纳米材料四氧化三铁外表面包裹具有多糖链结构且富有丰富官能团的壳聚糖，再以具有优异柔性结构和生物相容性的双醛纤维素为大分子交联分子共价固定经离子液体型表面活性剂活化的脂肪酶。此方法制备的有机‑无机磁性纳米复合材料固定化酶具有催化活性高、分离方便且重复使用性好等特点，可用于催化植物甾醇与脂肪酸发生酯化反应制备植物甾醇酯。本发明提供了一种绿色高效的合成植物甾醇酯的新方法。
Description
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种磁性固定化脂肪酶在有机相中催化植物甾醇与脂肪酸进行酯化反应合成植物甾醇酯的方法。
背景技术
植物甾醇是一种以环戊烷全氢菲为骨架的天然化合物，具有抗氧化活性、治疗骨关节炎、降低低密度脂蛋白胆固醇吸收等特点。植物甾醇水溶性和脂溶性较差，吸收利用率低，酯化后的植物甾醇吸收利用率比游离型植物甾醇约提高了5倍，可以显著预防小鼠的高血脂症和动脉硬化，可以通过调节磷脂类和胆汁酸类的小分子代谢物含量来改善非酒精性脂肪肝(NAFLD)的发生。
目前，文献报道酶催化合成植物甾醇酯的工艺普遍存在反应时间长、酶重复使用性能差，植物甾醇酯的收率较低等问题。2016年，霍振宇等人对没食子酸植物甾醇酯的合成工艺进行研究，将Lipozyme435脂肪酶催化植物甾醇与没食子酸反应，55℃水浴震荡72h后，植物甾醇的酯化率为79.7％(王楠楠，张大准，董发才.磁性壳聚糖的制备及在脂肪酶固定的应用[J].化学研究，2017，28(02):247-53.)。2019年，周蕊等人以壳聚糖-戊二醛为载体固定褶皱假丝酵母脂肪酶，虽然脂肪酶的稳定性有所提升，但脂肪酶的重复使用性不高，循环使用4次后只保留了20％左右的初始酶活力，并且在有机溶剂中的耐受性也不高，在正庚醇中浸泡120天后固定化酶的酶活只保留32.2％(周蕊，邢炎华，王燕.以壳聚糖-戊二醛为载体柔性固定假丝酵母脂肪酶candida rugosa lipase[J].当代化工，2019，48(8):13.)。
Fe3O4磁性纳米材料具有低毒性、成熟的合成技术、良好的磁性响应能力以及易于表面修饰等特点被广泛应用于酶、蛋白、抗体和药物载体的研究。作为纤维素衍生物，双醛纤维素具有良好的生物相容性，可将其作为功能有机高分子交联剂与酶分子实现共价结合，实现酶分子的柔性固定，稳定酶分子的活性构象。表面活性剂是具有两亲结构的分子，可以呈现出特有的界面活性，从而诱导酶分子中的盖子结构打开，使底物进入酶分子催化中心，提高酶的催化活性。离子液体具有很强的溶解性，较好的稳定性和对环境友好等特点，很多种酶在离子液体中显示出了很好的活性和稳定性，其在生物催化领域成为研究热点。本发明使用离子液体型表面活性剂可以将两者的特点结合，提高酶的催化活性和稳定性。
植物甾醇酯可通过植物甾醇与脂肪酸直接酯化、与其对应的酸酐或酰氯酯化以及酯交换等四种方法制得，其中直接酯化法因其原料易得和工艺相对简单等特点在合成过程中最为常见。张硕等人在N2保护下，以摩尔比为1.8:1的油酸和豆甾醇为底物，3.0％KHSO4+1.0％ZnO催化反应，反应温度150℃，反应7小时后，植物甾醇的酯化率达到92.17％(张硕，杨亦文，邢华斌，等.复合催化剂在油酸豆甾醇酯合成中的应用[J].化工学报，2015，8(66):3078-83.)。化学法通常有90％以上的收率，反应速度快，同时也存在反应温度高，在高温下会氧化以及脱水生成副产物，且催化剂会有少量残留等问题；而酶催化法具有反应条件温和，副产物少，对环境污染小等特点，是近年来被广泛关注的一种绿色、高效的合成途径。
发明内容
本发明提供一种以Fe3O4-壳聚糖-双醛纤维素三层结构的有机-无机纳米复合材料固定离子液体型表面活性剂活化后的脂肪酶为催化剂，催化植物甾醇和脂肪酸酯化来制备植物甾醇酯。该方法可在有机相中进行，反应条件温和，植物甾醇酯收率高，固定化酶催化活性高、重复使用性能好。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：一种固定化脂肪酶催化合成植物甾醇酯的方法，所述磁性纳米复合材料固定化脂肪酶的制备方法如下：以壳聚糖包裹的磁性纳米颗粒四氧化三铁为基质材料，利用Schiff base反应与双醛纤维素反应，生成Fe3O4-壳聚糖-双醛纤维素三层结构的磁性纳米复合材料载体；添加一定浓度的离子液体型甜菜碱类表面活性剂(十二烷基甜菜碱、PEG350、PEG550中的一种或多种)到溶有脂肪酶的磷酸缓冲溶液中，超声反应后，得到表面活性剂活化后的脂肪酶混合溶液；
将磁性纳米复合材料载体加入脂肪酶混合溶液中，震荡混合后，磁性分离得到高活性、高热稳定性和高耐受性的固定化脂肪酶；在反应器中加入有机溶剂和固定化脂肪酶，加热、搅拌条件下加入脂肪酸和植物甾醇，进行酯化反应。
优选的，所述磁性纳米复合材料具体制备步骤包括：
(1)共沉淀法合成磁性纳米四氧化三铁粒子，将4～6g六水合氯化铁和5～7g四水合氯化亚铁溶于一定量的去离子水，充分震荡混合后，加入一定浓度的NaOH溶液，调pH为10，继续搅拌1.5h后进行磁分离并用去离子水洗涤至中性，45℃烘干，得到黑色固体-磁性纳米四氧化三铁粒子；
(2)将2～4g的壳聚糖加入到一定量的乙酸溶液中充分搅拌，获得均匀地壳聚糖溶液，将步骤(1)中得到的Fe3O4磁性纳米粒子加入到溶液中，超声0.5h后加入NaOH溶液调节pH至中性；磁性分离后去离子水洗涤并干燥，得到壳聚糖包裹的磁性纳米四氧化三铁粒子；
(3)将1～3g二醛纤维素溶解到一定体积的去离子水中，充分搅拌得到均匀溶液；将(2)中得到的磁性壳聚糖纳米粒子加入该溶液中，充分搅拌反应，过滤所得产物于45℃烘箱干燥，获得Fe3O4-壳聚糖-双醛纤维素的固定化酶载体。
(4)将0.5～1g脂肪酶溶于50mL的磷酸缓冲溶液中，将2％～8％浓度的甜菜碱类表面活性剂溶液加入反应烧瓶中，超声0.25h后，将磁性纳米复合材料载体加入脂肪酶混合溶液中，震荡混合后，磁性分离得到固定化脂肪酶；甜菜碱类表面活性剂分子式如下：
R＝PEG350，PEG550，CH3(CH2)11
X＝Cl,BF4，H2PO4
优选的，所述离子液体型表面活性剂为十二烷基甜菜碱、PEG350、PEG550中的一种或多种。
优选的，所述固定化的脂肪酶为褶皱假丝酵母脂肪酶，南极假丝酵母脂肪酶B，洋葱假单胞菌脂肪酶，洋葱伯克霍尔德氏菌脂肪酶或猪胰脂肪酶中的一种。
优选的，所述固定化脂肪酶催化酯化反应的脂肪酸为油酸，亚油酸，亚麻酸，棕榈酸，硬脂酸中的一种或混合脂肪酸。
优选的，所述反应的溶剂为庚烷，异辛烷，环己烷或正己烷中的一种。
优选的，所述的植物甾醇与脂肪酸的摩尔比为1:1.2～1:3。
优选的，所述的固定化脂肪酶在所述反应中添加量按底物总质量百分比为1％～20％；所述反应的反应温度为35℃～70℃；所述反应的反应时间为6h～24h。
优选的，所述离子液体型表面活性剂为摩尔比为1:1的十二烷基甜菜碱和EG550混合物，所述固定化的脂肪酶为褶皱假丝酵母脂肪酶，所述固定化脂肪酶催化酯化反应的脂肪酸为油酸，所述反应的溶剂为正己烷，所述的植物甾醇与脂肪酸的摩尔比为1:1.5，所述的固定化脂肪酶在所述反应中添加量按底物总质量百分比为5％，所述反应的反应温度为50℃。
优选的，固定化脂肪酶的回收和重复使用性，包括：
(1)外加磁场，可实现对纳米磁性固定化脂肪酶快速有效进行聚集回收；
(2)经过10次的重复使用后，纳米磁性固定化酶仍保持较好的活力，保留了初始活力的85％～95％。
所述离子液体型表面活性剂为十二烷基甜菜碱、PEG350和PEG550中的一种或多种，优选1:1的十二烷基甜菜碱和EG550混合物。
所述反应的溶剂为庚烷，异辛烷，环己烷或正己烷中的一种；优选为正己烷。
所述的植物甾醇与脂肪酸的摩尔比为1:1.2～1:3，优选1:1.5。
所述的固定化脂肪酶在所述反应中添加量按底物总质量百分比为1％～20％；优选百分比为5％。
所述反应的反应温度为35℃～70℃，优选的反应温度为50℃。
本发明的有益效果在于：
(1)磁性壳聚糖纳米材料具有低成本、低毒性、较好的生物相容性、丰富的功能团和易于快速分离回收的特点，是酶固定化的优良载体；纤维素二醛生物相容性优良，与壳聚糖一样具有丰富的羟基可与酶通过氢键结合，并且可与酶通过共价交联柔性固定于磁性壳聚糖载体。
(2)本发明中使用的表面活性剂为离子液体型，一方面可以稳定酶的活性和稳定性，另一方面可以通过界面活化作用将脂肪酶的盖子结构打开，使底物进入酶的催化中心，从而提高脂肪酶的催化活性。
(4)本发明的磁性固定化酶载体，固定化后的脂肪酶具有良好的理化稳定性，可多次重复使用。重复使用10次后仍具有较高的催化活性，酶的活力仍可保留在85％～95％，是一种高效的固定化脂肪酶。
附图说明
下面结合附图对本发明进一步说明。
图1为Fe3O4/壳聚糖的扫描电镜图
图2为Fe3O4/壳聚糖/双醛纤维素的扫描电镜图
图3为Fe3O4/壳聚糖/双醛纤维素的红外吸收光谱图
图4为植物甾醇酯的液相色谱图
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。所列的实施例仅作阐示之用，并表明本发明的精神和范围并非限于此中的细节及其修改案。
本发明所涉及的表面活性剂、双醛纤维素为实验室自制，生物酶及其他试剂均为市场购买，其中试剂均未进一步纯化；扫描电镜用于固定化载体表征；液相U3000用于植物甾醇酯的定量定性测定。
实施例1：
(1)共沉淀法合成磁性纳米四氧化三铁粒子，将4.5g六水合氯化铁和6g四水合氯化亚铁溶于90ml去离子水，在60℃，150r/min下充分震荡混合均匀后，加入一定量的2mol/L的NaOH溶液，调pH为10，继续搅拌1h后进行磁分离，去离子水洗涤至中性得到黑色固体-磁性纳米四氧化三铁粒子。
(2)将2g的壳聚糖加入到100mL的乙酸溶液中充分搅拌，获得均匀地壳聚糖溶液。将(1)中得到的Fe3O4磁性纳米粒子加入到溶液中，超声0.5h后加入NaOH溶液调节pH至7±0.5，磁性分离后去离子水洗涤并干燥，得到壳聚糖包裹的磁性纳米四氧化三铁粒子。
(3)将1.5g二醛纤维素溶解到50mL去离子水中，充分搅拌得到均匀溶液。将(2)中得到的产物加入溶液中，在600r/min震荡搅拌0.5h，过滤后的产物置于45℃烘箱干燥成膜，获得Fe3O4-壳聚糖-双醛纤维素的固定化酶载体。
将0.6g褶皱假丝酵母脂肪酶溶于45mL的磷酸缓冲溶液中，将3％浓度的表面活性剂加入反应烧瓶中，所述的表面活性剂的摩尔比为1:1的十二烷基甜菜碱和PEG550的混合物，超声0.25h后，孵育12h后，将磁性纳米复合材料载体加入脂肪酶混合溶液中，机械搅拌器搅拌混合后，磁性分离得到固定化脂肪酶。
将10mmol混合植物甾醇和12mmol油酸，加入10mL反应瓶中，然后加入3％磁性固定化脂肪酶，5mL正己烷，45℃下搅拌反应，TLC(正己烷：无水乙醚：冰醋酸，90：10：1，v/v/v)监测反应进程。6h后，外加磁场聚集回收，即可回收固定化脂肪酶。将溶液用2％碳酸氢钠进行洗涤，除去过量的油酸，浓缩回收正己烷后，残余物用少量乙醇洗涤搅拌，除去未反应的游离植物甾醇，得到目标产物。目标产物为油状液体，酯化率为96％。回收后的固定化脂肪酶连续10次投入反应中，酶仍保持初始催化活力的90％。
实施例2：
(1)共沉淀法合成磁性纳米四氧化三铁粒子，将5g六水合氯化铁和6.7g四水合氯化亚铁溶于100ml去离子水，在60℃，150r/min下充分震荡混合均匀后，加入一定量的2mol/L的NaOH溶液，调pH为10，继续搅拌1H后进行磁分离，去离子水洗涤至中性得到黑色固体-磁性纳米四氧化三铁粒子。
(2)将4g的壳聚糖加入到120mL的乙酸溶液中充分搅拌，获得均匀地壳聚糖溶液。将(1)中得到的Fe3O4磁性纳米粒子加入到溶液中，超声0.5h后加入NaOH溶液调节pH至7±0.5，磁性分离后去离子水洗涤并干燥，得到壳聚糖包裹的磁性纳米四氧化三铁粒子。
(3)将2g二醛纤维素溶解到50mL去离子水中，充分搅拌得到均匀溶液。将(2)中得到的产物加入溶液中，在600r/min震荡搅拌0.5h后，过滤后的产物置于45℃烘箱干燥成膜，获得Fe3O4-壳聚糖-双醛纤维素的固定化酶载体。
将0.9g褶皱假丝酵母脂肪酶溶于50mL的磷酸缓冲溶液中，将4％浓度的表面活性剂加入反应烧瓶中，所述的表面活性剂的摩尔比为1:1的十二烷基甜菜碱和PEG550的混合物，超声0.25h，孵育12h后，将磁性纳米复合材料载体加入脂肪酶混合溶液中，机械搅拌器搅拌混合后，磁性分离得到固定化脂肪酶。
将10mmol混合植物甾醇和15mmol油酸，加入10mL反应瓶中，然后加入5％磁性固定化脂肪酶，5mL正己烷，50℃下搅拌反应，TLC(正己烷：无水乙醚：冰醋酸，90：10：1，v/v/v)监测反应进程。8h后，外加磁场聚集回收，即可获得固定化脂肪酶。将溶液用2％碳酸氢钠进行洗涤，除去过量的油酸，浓缩回收正己烷后，残余物用少量乙醇洗涤搅拌，除去未反应的游离植物甾醇，得到目标产物。目标产物为油状液体，酯化率为98％。回收后的固定化脂肪酶连续10次投入反应中，酶仍保持初始催化活力的89％。
实施例3：
(1)共沉淀法合成磁性纳米四氧化三铁粒子，将5.3g六水合氯化铁和7g四水合氯化亚铁溶于100ml去离子水，在60℃，150r/min下充分震荡混合均匀后，加入一定量的2mol/L的NaOH溶液，调pH为10，继续搅拌1H后进行磁分离，去离子水洗涤至中性得到黑色固体-磁性纳米四氧化三铁粒子。
(2)将4g的壳聚糖加入到150mL的乙酸溶液中充分搅拌，获得均匀地壳聚糖溶液。将(1)中得到的Fe3O4磁性纳米粒子加入到溶液中，超声0.5h后加入NaOH溶液调节pH至7±0.5，磁性分离后去离子水洗涤并干燥，得到壳聚糖包裹的磁性纳米四氧化三铁粒子。
(3)将3g二醛纤维素溶解到50mL去离子水中，充分搅拌得到均匀溶液。将(2)中得到的产物加入溶液中，在600r/min震荡搅拌0.5h，过滤后的产物置于45℃烘箱干燥成膜，获得Fe3O4-壳聚糖-双醛纤维素的固定化酶载体。
将0.7g褶皱假丝酵母脂肪酶溶于50mL的磷酸缓冲溶液中，将5％浓度的表面活性剂加入反应烧瓶中，所述的表面活性剂的摩尔比为1:1的十二烷基甜菜碱和PEG550的混合物，超声0.25h，孵育12h后，将磁性纳米复合材料载体加入脂肪酶混合溶液中，机械搅拌器搅拌混合后，磁性分离得到固定化脂肪酶。
将10mmol植物甾醇和20mmol油酸，加入10mL反应瓶中，然后加入15％磁性固定化脂肪酶，5mL正己烷，60℃下搅拌反应，TLC(正己烷：无水乙醚：冰醋酸，90：10：1，v/v/v)监测反应进程。12h后，外加磁场聚集回收，即可获得固定化脂肪酶。将溶液用2％碳酸氢钠进行洗涤，除去过量的油酸，浓缩回收正己烷后，残余物用少量乙醇洗涤搅拌，除去未反应的游离植物甾醇，得到目标产物。目标产物为油状液体，酯化率为96％。回收后的固定化脂肪酶连续10次投入反应中，酶仍保持初始催化活力的91％。
实施例4：
磁性固定化载体的合成过程参考实施例1～3，将表面活性剂活化后的褶皱假丝酵母脂肪酶与磁性固定化载体混合，从而得到固定化脂肪酶。将10mmol混合植物甾醇和30mmol亚油酸，加入10mL反应瓶中，然后加入10％磁性固定化脂肪酶，5mL正己烷，55℃下搅拌反应，TLC(正己烷：无水乙醚：冰醋酸，90：10：1，v/v/v)监测反应进程。8h后，外加磁场聚集回收，即可获得固定化脂肪酶。将溶液用2％碳酸氢钠进行洗涤，除去过量的亚油酸，浓缩回收正己烷后，残余物用少量乙醇洗涤搅拌，除去未反应的游离植物甾醇，得到目标产物。目标产物为油状液体，收率为92％。回收后的固定化脂肪酶连续10次投入反应中，酶仍保持初始催化活力的91％。
实施例5：
磁性固定化载体的合成过程参考实施例1～3，将表面活性剂活化后的褶皱假丝酵母脂肪酶与磁性固定化载体机械搅拌混合，磁性分离从而得到固定化脂肪酶。将10mmol混合植物甾醇和15mmol亚麻酸，加入10mL反应瓶中，然后加入5％磁性固定化脂肪酶，5mL正己烷，45℃下搅拌反应，TLC(正己烷：无水乙醚：冰醋酸，90：10：1，v/v/v)监测反应进程。6h后，外加磁场回收，即可获得固定化脂肪酶。将溶液用2％碳酸氢钠进行洗涤，除去过量的亚麻酸，浓缩回收正己烷后，残余物用少量乙醇洗涤搅拌，除去未反应的游离植物甾醇，得到目标产物。目标产物为油状液体，收率为88％。回收后的固定化脂肪酶连续10次投入反应中，酶仍保持初始催化活力的92％。
实施例6：
磁性固定化载体的合成过程参考实施例1～3，将表面活性剂活化后的褶皱假丝酵母脂肪酶与磁性固定化载体机械搅拌混合，磁性分离得到固定化脂肪酶。将10mmol植物甾醇和30mmol硬脂酸，加入10mL反应瓶中，然后加入6％磁性固定化脂肪酶，5mL正己烷，50℃下搅拌反应，TLC(正己烷：无水乙醚：冰醋酸，90：10：1，v/v/v)监测反应进程。12h后，外加磁场回收，即可获得固定化脂肪酶。将溶液用2％碳酸氢钠进行洗涤，除去过量的硬脂酸，浓缩回收正己烷后，残余物用少量乙醇洗涤搅拌，除去未反应的游离植物甾醇，得到目标产物。目标产物为油状液体，收率为84％。回收后的固定化脂肪酶连续10次投入反应中，酶仍保持初始催化活力的88％。
实施例7：
磁性固定化载体的合成过程参考实施例1～3，将表面活性剂活化后的南极假丝酵母脂肪酶B与磁性固定化载体机械搅拌混合，磁性分离得到固定化脂肪酶。将10mmol植物甾醇和15mmol油酸，加入10mL反应瓶中，然后加入5％磁性固定化脂肪酶，5mL正己烷，50℃下搅拌反应，TLC(正己烷：无水乙醚：冰醋酸，90：10：1，v/v/v)监测反应进程。10h后，外加磁场回收，即可获得固定化脂肪酶。将溶液用2％碳酸氢钠进行洗涤，除去过量的油酸，浓缩回收正己烷后，残余物用少量乙醇洗涤搅拌，除去未反应的游离植物甾醇，得到目标产物。目标产物为油状液体，收率为94％。回收后的固定化脂肪酶连续10次投入反应中，酶仍保持初始催化活力的93％。
实施例8：
磁性固定化载体的合成过程参考实施例1～3，将表面活性剂活化后的南极假丝酵母脂肪酶B与磁性固定化载体机械搅拌混合，磁性分离得到固定化脂肪酶。将10mmol植物甾醇和20mmol油酸，加入10mL反应瓶中，然后加入10％磁性固定化脂肪酶，5mL正己烷，45℃下搅拌反应，TLC(正己烷：无水乙醚：冰醋酸，90：10：1，v/v/v)监测反应进程。12h后，外加磁场回收，即可获得固定化脂肪酶。将溶液用2％碳酸氢钠进行洗涤，除去过量的油酸，浓缩回收正己烷后，残余物用少量乙醇洗涤搅拌，除去未反应的游离植物甾醇，得到目标产物。目标产物为油状液体，收率为89％。回收后的固定化脂肪酶连续10次投入反应中，酶仍保持初始催化活力的92％。
实施例9：
磁性固定化载体的合成过程参考实施例1～3，将表面活性剂活化后的南极假丝酵母脂肪酶B与磁性固定化载体机械搅拌混合，磁性分离得到固定化脂肪酶。将10mmol植物甾醇和20mmol亚麻酸，加入10mL反应瓶中，然后加入15％磁性固定化脂肪酶，5mL正己烷，55℃下搅拌反应，TLC(正己烷：无水乙醚：冰醋酸，90：10：1，v/v/v)监测反应进程。17h后，外加磁场回收，即可获得固定化脂肪酶。将溶液用2％碳酸氢钠进行洗涤，除去过量的亚麻酸，浓缩回收正己烷后，残余物用少量乙醇洗涤搅拌，除去未反应的游离植物甾醇，得到目标产物。目标产物为油状液体，收率为86％。回收后的固定化脂肪酶连续10次投入反应中，酶仍保持初始催化活力的89％。
实施例10：
磁性固定化载体的合成过程参考实施例1～3，将表面活性剂活化后的猪胰脂肪酶与磁性固定化载体机械搅拌混合，磁性分离得到固定化脂肪酶。将10mmol植物甾醇和15mmol油酸，加入10mL反应瓶中，然后加入10％磁性固定化脂肪酶，5mL正己烷，50℃下搅拌反应，TLC(正己烷：无水乙醚：冰醋酸，90：10：1，v/v/v)监测反应进程。24h后，外加磁场回收，即可获得固定化脂肪酶。将溶液用2％碳酸氢钠进行洗涤，除去过量的油酸，浓缩回收正己烷后，残余物用少量乙醇洗涤搅拌，除去未反应的游离植物甾醇，得到目标产物。目标产物为油状液体，收率为83％。回收后的固定化脂肪酶连续10次投入反应中，酶仍保持初始催化活力的88％。
实施例11：
磁性固定化载体的合成过程参考实施例1～3，将表面活性剂活化后的猪胰脂肪酶与磁性固定化载体机械搅拌混合，磁性分离得到固定化脂肪酶。将10mmol植物甾醇和30mmol油酸，加入10mL反应瓶中，然后加入5％磁性固定化脂肪酶，5mL正己烷，35℃下搅拌反应，TLC(正己烷：无水乙醚：冰醋酸，90：10：1，v/v/v)监测反应进程。18h后，外加磁场回收，即可获得固定化脂肪酶。将溶液用2％碳酸氢钠进行洗涤，除去过量的油酸，浓缩回收正己烷后，残余物用少量乙醇洗涤搅拌，除去未反应的游离植物甾醇，得到目标产物。目标产物为油状液体，收率为78％。回收后的固定化脂肪酶连续10次投入反应中，酶仍保持初始催化活力的91％。
实施例12：
磁性固定化载体的合成过程参考实施例1～3，将表面活性剂活化后的猪胰脂肪酶与磁性固定化载体机械搅拌混合，磁性分离得到固定化脂肪酶。将10mmol植物甾醇和15mmol亚麻酸，加入10mL反应瓶中，然后加入15％磁性固定化脂肪酶，5mL正己烷，50℃下搅拌反应，TLC(正己烷：无水乙醚：冰醋酸，90：10：1，v/v/v)监测反应进程。24h后，外加磁场回收，即可获得固定化脂肪酶。将溶液用2％碳酸氢钠进行洗涤，除去过量的亚麻酸，浓缩回收正己烷后，残余物用少量乙醇洗涤搅拌，除去未反应的游离植物甾醇，得到目标产物。目标产物为油状液体，收率为80％。回收后的固定化脂肪酶连续10次投入反应中，酶仍保持初始催化活力的93％。
Claims (9)
1.一种固定化脂肪酶催化合成植物甾醇酯的方法，其特征在于，所述磁性纳米复合材料固定化脂肪酶的制备方法如下：以壳聚糖包裹的磁性纳米颗粒四氧化三铁为基质材料，利用Schiff base反应与双醛纤维素反应，生成Fe3O4-壳聚糖-双醛纤维素三层结构的磁性纳米复合材料载体；添加表面活性剂为摩尔比为1:1的十二烷基甜菜碱型离子液体和PEG550的混合物到溶有脂肪酶的磷酸缓冲溶液中，超声反应后，得到表面活性剂活化后的脂肪酶混合溶液；
将磁性纳米复合材料载体加入脂肪酶混合溶液中，震荡混合后，磁性分离得到高活性、高热稳定性和高耐受性的固定化脂肪酶；在反应器中加入有机溶剂和固定化脂肪酶，加热、搅拌条件下加入脂肪酸和植物甾醇，进行酯化反应。
2.根据权利要求1所述的磁性纳米复合材料固定化脂肪酶催化合成植物甾醇酯的方法，其特征在于，所述磁性纳米复合材料具体制备步骤包括：
（1）共沉淀法合成磁性纳米四氧化三铁粒子，将4~6 g六水合氯化铁和5~7 g四水合氯化亚铁溶于一定量的去离子水，充分震荡混合后，加入一定浓度的NaOH溶液，调pH为10，继续搅拌1.5h后进行磁分离并用去离子水洗涤至中性，45℃烘干，得到黑色固体-磁性纳米四氧化三铁粒子；
（2）将2~4 g的壳聚糖加入到一定量的乙酸溶液中充分搅拌，获得均匀地壳聚糖溶液，将步骤（1）中得到的Fe3O4磁性纳米粒子加入到溶液中，超声0.5h后加入NaOH溶液调节pH至中性；磁性分离后去离子水洗涤并干燥，得到壳聚糖包裹的磁性纳米四氧化三铁粒子；
（3）将1~3 g二醛纤维素溶解到一定体积的去离子水中，充分搅拌得到均匀溶液；将（2）中得到的磁性壳聚糖纳米粒子加入该溶液中，充分搅拌反应，过滤所得产物于45℃烘箱干燥，获得Fe3O4-壳聚糖-双醛纤维素的固定化酶载体。
（4）将0.5~1g脂肪酶溶于50mL的磷酸缓冲溶液中，将2%~8%浓度的摩尔比为1:1的十二烷基甜菜碱型离子液体和PEG550的混合物溶液加入反应烧瓶中，超声0.25h后，将磁性纳米复合材料载体加入脂肪酶混合溶液中，震荡混合后，磁性分离得到固定化脂肪酶。
3.根据权利要求1和2所述的磁性纳米复合材料固定化脂肪酶催化合成植物甾醇酯的方法，其特征在于，所述固定化的脂肪酶为褶皱假丝酵母脂肪酶，南极假丝酵母脂肪酶B，洋葱假单胞菌脂肪酶，洋葱伯克霍尔德氏菌脂肪酶或猪胰脂肪酶中的一种。
4.根据权利要求1所述的磁性纳米复合材料固定化脂肪酶催化合成植物甾醇酯的方法，其特征在于，所述固定化脂肪酶催化酯化反应的脂肪酸为油酸，亚油酸，亚麻酸，棕榈酸，硬脂酸中的一种或混合脂肪酸。
5.根据权利要求1所述的磁性纳米复合材料固定化脂肪酶催化合成植物甾醇酯的方法，其特征在于，所述反应的溶剂为庚烷，异辛烷，环己烷或正己烷中的一种。
6.根据权利要求1所述的磁性纳米复合材料固定化脂肪酶催化合成植物甾醇酯的方法，其特征在于，所述的植物甾醇与脂肪酸的摩尔比为1:1.2~1:3。
7.根据权利要求1所述的磁性纳米复合材料固定化脂肪酶催化合成植物甾醇酯的方法，其特征在于，所述的固定化脂肪酶在所述反应中添加量按底物总质量百分比为1%~20%；所述反应的反应温度为35℃~70℃；所述反应的反应时间为6h~24h。
8.根据权利要求1所述的磁性纳米复合材料固定化脂肪酶催化合成植物甾醇酯的方法，其特征在于，所述表面活性剂为摩尔比为1:1的十二烷基甜菜碱型离子液体和PEG550混合物，所述固定化的脂肪酶为褶皱假丝酵母脂肪酶，所述固定化脂肪酶催化酯化反应的脂肪酸为油酸，所述反应的溶剂为正己烷，所述的植物甾醇与脂肪酸的摩尔比为1:1.5，所述的固定化脂肪酶在所述反应中添加量按底物总质量百分比为5%，所述反应的反应温度为50℃。
9.根据权利要求1所述的磁性纳米复合材料固定化脂肪酶催化合成植物甾醇酯的方法，其特征在于，固定化脂肪酶的回收和重复使用性，包括：
（1）外加磁场，可实现对磁性纳米复合材料固定化脂肪酶快速有效进行聚集回收；
（2）经过10次的重复使用后，磁性纳米复合材料固定化酶仍保持较好的活力，保留了初始活力的85%~95%。
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